ΜΕΛΕΤΗ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΠΟΛΥΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ ΜΕ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΥΣ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΤΟΜΕΑΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΚΑΙ ΠΡΟΛΗΠΤΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΟΥ ΝΟΣΟΚΟΜΕΙΟΥ ΑΧΕΠΑ ΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΣΚΟΥΡΑ ΛΕΜΟΝΙΑ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2013-14 Αρ. ιατριβής: 3683 ΜΕΛΕΤΗ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΠΟΛΥΑΝΘΕΚΤΙΚΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ ΜΕ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΕΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟ ΟΥΣ ΜΕΛΕΤΗΣ ΓΕΩΡΓΙΟΣ ΙΑΤΡΟΣ ΒΙΟΠΑΘΟΛΟΓΟΣ Ι ΑΚΤΟΡΙΚΗ ΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΟ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ-ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2013 1

Η ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ε. ΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ν. ΒΑΒΑΤΣΗ- ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΟΜΟΤΙΜΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Μ. ΕΞΗΝΤΑΡΗ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΠΙΤΡΟΠΗ Ε. ΙΖΑ-ΜΑΤΑΥΤΣΗ, ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ν. ΒΑΒΑΤΣΗ- ΧΡΙΣΤΑΚΗ, ΟΜΟΤΙΜΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Μ. ΕΞΗΝΤΑΡΗ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Ν. ΜΑΛΙΣΙΟΒΑΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Α. ΚΑΡΑΓΙΑΝΝΗΣ, ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ Λ. ΣΚΟΥΡΑ, ΕΠΙΚΟΥΡΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Σ. ΜΕΤΑΛΛΙ ΗΣ, ΕΠΙΚΟΥΡΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ «Η έγκρισις της ιδακτορικής ιατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης, δεν υποδηλοί αποδοχήν των γνωµών του συγγραφέως». (Νόµος 5343/32, άρθρ. 202 και ν. 1268/82, άρθρ. 50 8) 2

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΠΡΟΕ ΡΟΣ ΤΟΥ ΤΜΗΜΑΤΟΣ ΑΛΕΞΑΝ ΡΟΣ-ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ. ΓΑΡΥΦΑΛΛΟΣ 3

Στη Μαρία, το Γιάννη και τη ήµητρα 4

ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ΙΑΤΡΙΚΩΝ ΟΡΩΝ AAC AIM AmpC ANT APH ATCC CCCP CFU CLSI DDD DDST EARS-NET EDTA ERIC PCR ESBL EUCAST FIM GES GIM IBC IMP KPC LPS MALDI-TOF MBL Mex MIC MFP NDM Opr OXA PBP PCR PER RND SDS-PAGE SHV SIM SPM TEM VEB VIM Aminoglycoside acetyl-transferase Australian imipenemase Amplicon C (Ambler class C beta-lactamase) Aminoglycoside nucleotidyl-transferase Aminoglycoside phosphoryl-transferase American type culture collection Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone Colony forming units Clinical and laboratory standards institute Defined daily doses Double disc synergy test European antimicrobial resistance surveillance system network Ethylenediaminetetraacetic acid Enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR Extended spectrum beta-lactamase European committee on antimicrobial susceptibility testing Florence imipenemase Guiana extended spectrum German imipenemase Integron-borne cefalosporinase Active on imipenem Klebsiella pneumoniae carbapenemase Lipopolysaccharide Matrix assisted laser desorbtion ionization- time of flight Metallo-beta-lactamase Multidrug efflux system Minimum inhibitory concentration Membrane fusion protein New Delhi metallo-beta-lactamase Outer membrane protein Oxacillinase (Ambler class D beta-lactamase) Penicillin binding protein Polymerase chain reaction Pseudomonas aeruginosa extended-spectrum RND-1 Resistance nodulation division Sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel electrophoresis Sulfhydryl variable Seoul imipenemase Sao Paolo metallo-beta-lactamase Temonieras Vietnamese extended-spectrum beta-lactamase Verona imipenemase 5

6

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ 11 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 13 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 15 2. PSEUDOMONAS AERUGINOSA 15 2.1. Ονοµατολόγια 15 2.2. οµικά χαρακτηριστικά και βιοχηµικές ιδιότητες 16 2.3. Λοιµογόνοι παράγοντες 17 2.4. Λοιµώξεις από P. aeruginosa 17 2.5. Αντοχή στα αντιβιοτικά και αντιψευδοµοναδιακή χηµειοθεραπεία 18 2.6. Βιολογικό Υµένιο και Quorum Sensing System 21 2.7. Ανάπτυξη πολυανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa 21 3. β-λακταμικα ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ 22 3.1. Κατάταξη των β-λακταµικών αντιβιοτικών 22 4. ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ 24 4.1. Ιµιπενέµη 24 4.2. Πανιπενέµη 25 4.3. Μεροπενέµη 25 4.4. Βιαπενέµη 26 4.5. Ερταπενέµη 27 4.6. οριπενέµη 27 4.7. Τεµπιπενέµη 28 4.8 Ορισµός ορίων ευαισθησίας της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες 29 5. ΑΝΤΟΧΗ ΤΗΣ P. AERUGINOSA ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ 30 5.1. Ενζυµικοί µηχανισµοί 30 5.1.1. Καρµπαπενεµάσες τάξης B κατά Ambler (MBLs) 33 5.1.2. Καρµπαπενεµάσες τάξης Α κατά Ambler 35 5.1.3. β-λακταµάσες τάξης C κατά Ambler (Κεφαλοσπορινάσες) 37 5.1.4. Καρµπαπενεµάσες τάξης D κατά Ambler 38 5.2. Μη ενζυµικοί µηχανισµοί 38 5.2.1. Μειωµένη έκφραση ή απώλεια της πορίνης ΟprD 38 5.2.2. Υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής 39 6. ΜΕΘΟ ΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ 42 6.1. Ανίχνευση ενζυµικών µηχανισµών 42 6.1.1. Φαινοτυπική ανίχνευση Μεταλλο-β-λακταµασών 42 6.1.2. Φαινοτυπική ανίχνευση Ευρέως Φάσµατος β-λακταµασών 45 6.1.3. Φαινοτυπική ανίχνευση επαγώγιµων AmpC β-λακταµασών 46 7

6.1.4. Άλλες φαινοτυπικές δοκιµασίες ανίχνευσης β-λακταµασών 48 6.1.5. Εµπορικά tests ανίχνευσης καρµπαπενεµασών 52 6.1.6. Μοριακή ανίχνευση β-λακταµασών 53 6.2. Ανίχνευση µειωµένης έκφρασης της πορίνης OprD 55 6.3. Aνίχνευση υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής 57 6.3.1. Φαινοτυπική ανίχνευση υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής 57 6.3.2. Μοριακή ανίχνευση υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής 58 7. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ P. AERUGINOSA ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΕΛΛΑ Α ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΠΕΡΙΟ Ο ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ 59 8. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ P. AERUGINOSA ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ ΚΑΙ ΑΝΑΛΩΣΗ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΩΝ ΣΤΟ Γ.Ν.Θ. ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ 65 ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 67 9. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 69 9.1. είγµα 69 9.1.1. Αντιµικροβιακή αντοχή των στελεχών της µελέτης 76 9.2. Προσδιορισµός της MIC ιµιπενέµης και µεροπενέµης µε τη µέθοδο 83 των µικροαραιώσεων σε ζωµό 9.3. ιενέργεια φαινοτυπικών δοκιµασιών ανίχνευσης 83 καρµπαπενεµασών 9.4. Ανίχνευση καρµπαπενεµασών µε µοριακές µεθόδους 84 9.5. Ανίχνευση υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής µε 87 δοκιµασία CCCP 9.6. Ανίχνευση απώλειας της πορίνης OprD µε SDS-PAGE 87 9.7. Ανίχνευση ύπαρξης επαγώγιµης AmpC β-λακταµάσης µε D-Test 88 9.8. Έλεγχος κλωνικής συγγένειας VIM-2 θετικών στελεχών µε ERIC 2 88 9.9. Στατιστική επεξεργασία 89 9.9.1. Σύγκριση των δειγµάτων ως προς τους µηχανισµούς αντοχής που ανιχνεύθηκαν 89 9.9.2. Προσδιορισµός MIC 50 και MIC 90 90 9.9.3. Υπολογισµός γεωµετρικού µέσου όρου των τιµών των MICs 90 90 9.9.4. Υπολογισµός ανάλωσης καρµπαπενεµών κατά τη χρονική περίοδο αποµόνωσης των στελεχών της µελέτης 10. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 91 10.1. MIC ιµιπενέµης και µεροπενέµης 91 10.2. Παραγωγή καρµπαπενεµασών 97 10.3. Υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής και απώλεια πορίνης 107 OprD 10.4. Επαγώγιµη AmpC β-λακταµάση 114 10.5. Αποτελέσµατα ERIC 2 PCR 120 10.6. Συγκεντρωτική µελέτη µηχανισµών αντοχής που ανιχνεύθηκαν 121 10.7. Αποτελέσµατα στατιστικής επεξεργασίας 127 11. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 132 8

12. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 139 13. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 141 14. SUMMARY 143 15. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 145 9

10

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η Pseudomonas aeruginosa είναι ένας ευκαιριακά παθογόνος για τον άνθρωπο µικροοργανισµός, ο οποίος αποτελεί τα τελευταία χρόνια ένα από τα σηµαντικότερα αίτια νοσοκοµειακών λοιµώξεων. Ο µικροοργανισµός αυτός διαθέτει µηχανισµούς ενδογενούς αντοχής στα αντιβιοτικά ενώ παράλληλα έχει την ικανότητα να αποκτά νέους µηχανισµούς αντοχής µέσω µεταφερόµενων γενετικών στοιχείων. Από τα β-λακταµικά αντιβιοτικά, οι καρµπαπενέµες µε σηµαντική αντιψευδοµοναδική δράση είναι πολύτιµες για την εµπειρική χηµειοθεραπεία των λοιµώξεων από P. aeruginosa. Η ανάπτυξη αντοχής στελεχών P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες πραγµατοποιείται µέσω συνδυασµού µηχανισµών, όπως η ελαττωµένη έκφραση πορινών, η υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής, η υπερπαραγωγή β-λακταµασών τύπου AmpC και η παραγωγή καρµπαπενεµασών που συνήθως οφείλεται στην πρόσληψη πλασµιδίων ή ιντεγκρονίων. Η παρούσα µελέτη αποτελεί συνέχεια και εξέλιξη της µεταπτυχιακής διατριβής µε τίτλο «ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΑΣΩΝ ΣΕ ΠΟΛΥΑΝΘΕΚΤΙΚΑ ΣΤΕΛΕΧΗ PSEUDOMONAS AERUGINOSA ΜΕ ΤΗ ΧΡΗΣΗ ΜΟΡΙΑΚΩΝ ΤΕΧΝΙΚΩΝ» που εκπονήθηκε το 2010 µε την ίδια τριµελή επιτροπή στα πλαίσια του Προγράµµατος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Ιατρική Ερευνητική Μεθοδολογία» της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτέλειου Πανεπιστηµίου Θεσσαλονίκης. Στη νέα µελέτη συµπεριλήφθηκαν επιπλέον 140 στελέχη P. aeruginosa και ελέγχθηκαν 3 ακόµη µηχανισµοί αντοχής στις καρµπαπενέµες εκτός από την παραγωγή καρµπαπενεµασών. Τα συνολικά 180 στελέχη χωρίστηκαν σε δύο οµάδες µε βάση την χρονική περίοδο της αποµόνωσης τους και πραγµατοποιήθηκαν συγκρίσεις µεταξύ των µηχανισµών που ανευρέθησαν αλλά και µεταξύ συνδυασµών µηχανισµών αντοχής στις δύο οµάδες. Τα αποτελέσµατα της εργαστηριακής έρευνας συσχετίστηκαν µε την ανάλωση καρµπαπενεµών στο νοσοκοµείο και µε τα ποσοστά αποµόνωσης ανθεκτικών στις καρµπαπενέµες στελεχών P. aeruginosa τόσο στο Ιπποκράτειο Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης όσο και στον Ελλαδικό χώρο γενικότερα. Με το πέρας της πραγµατοποίησης της, νιώθω την ανάγκη να ευχαριστήσω θερµά την επιβλέπουσά µου καθηγήτρια κ. Ευδοξία ίζα- Ματαυτσή για την εµπιστοσύνη προς το πρόσωπό µου και την αµέριστη και διαρκή συµπαράστασή της. Ευχαριστώ επίσης τα µέλη της τριµελούς επιτροπής, την οµότιµη καθηγήτρια κ. Νόρµα Βαβάτση-Χριστάκη και την επίκουρη καθηγήτρια κ. Μαρία Εξηντάρη, καθώς και τα µέλη της επταµελούς επιτροπής, καθηγητή κ. Νικόλαο Μαλισιόβα, καθηγητή κ. Αστέριο Καραγιάννη, επίκουρη καθηγήτρια κ. Λεµονιά Σκούρα και επίκουρο καθηγητή κ. Συµεών Μεταλλίδη για τα εποικοδοµητικά σχόλια και τον συµβουλευτικό τους ρόλο. Ευχαριστώ την επιστηµονική µου συνεργάτιδα κ. Έφη Πρωτονοταρίου, τους εξαίρετους συναδέλφους κ. Ευφροσύνη Σιάνου και κ. Εγκίν Τζαµπάζ, τον αναπληρωτή καθηγητή Βιοχηµείας κ. Κωνσταντίνο Χαΐτογλου και τον αναπληρωτή καθηγητή Μικροβιολογίας κ. Σπύρο Πουρνάρα για τη µεταλαµπάδευση τεχνογνωσίας και επιστηµονικής γνώσης. Οφείλω ακόµη να ευχαριστήσω τη µεγάλη µου δασκάλα της Μικροβιολογίας, το πρότυπο επαγγελµατισµού και διευθύντρια µου στο Ιπποκράτειο Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης κ. ανάη Σοφιανού για την απόλυτη στήριξή της στην συγκεκριµένη µελέτη. Ιδιαιτέρως τέλος, ευχαριστώ τους γονείς και την οικογένεια µου για την δική τους µεγάλη προσπάθεια στη διαµόρφωση της επαγγελµατικής µου πορείας. 11

12

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 13

14

1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η Pseudomonas aeruginosa είναι ένας ευκαιριακά παθογόνος για τον άνθρωπο µικροοργανισµός, ο οποίος αποτελεί εδώ και πολλά χρόνια ένα από τα σηµαντικότερα αίτια νοσοκοµειακών λοιµώξεων. Ο µικροοργανισµός αυτός διαθέτει µηχανισµούς ενδογενούς αντοχής στα αντιβιοτικά ενώ παράλληλα έχει την ικανότητα να αποκτά νέους µηχανισµούς αντοχής µέσω µεταφερόµενων γενετικών στοιχείων. Από τα β-λακταµικά αντιβιοτικά, οι καρµπαπενέµες µε σηµαντική αντιψευδοµοναδική δράση είναι πολύτιµες για την εµπειρική αντιµικροβιακή χηµειοθεραπεία των λοιµώξεων από P. aeruginosa. Η ανάπτυξη αντοχής στελεχών P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες πραγµατοποιείται µέσω µηχανισµών, όπως η παραγωγή καρµπαπενεµασών η οποία συνήθως οφείλεται στην πρόσληψη πλασµιδίων ή ιντεγκρονίων, η ελαττωµένη έκφραση πορινών, η υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής και η υπερπαραγωγή β-λακταµασών τύπου AmpC. Η P. aeruginosa είναι ένα πανταχού παρόν βακτηρίδιο. Λόγω της ικανότητάς της να χρησιµοποιεί πολλές οργανικές ουσίες ως πηγές C και N και να επιζεί σε ευρύ φάσµα θερµοκρασιών (4-42 o C) αναπτύσσεται στο έδαφος, τις οργανικές ύλες, τα φυτά και το νερό. Στους χώρους του νοσοκοµείου δύναται να ανεβρεθεί σε περιοχές µε υγρασία όπως νεροχύτες, τουαλέτες, επιφάνειες εργασίας, µηχανήµατα αναπνευστικής υποστήριξης, άνθη και τρόφιµα. Είναι επίσης πιθανό να αποικίσει κατακεκλιµένους ή περιπατητικούς ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς καθώς και ένα µικρό ποσοστό φυσιολογικών ατόµων. 2. PSEUDOMONAS AERUGINOSA 2.1. Ονοµατολόγια Η ονοµασία Pseudomonas aeruginosa (Ψευδοµονάς η πυοκυανική) αντικατοπτρίζει ορισµένα χαρακτηριστικά του µικροοργανισµού. Η λέξη Pseudomonas αποτελείται από τις Pseudo και monas και σηµαίνει ψευδής µονάδα. Aeruginosa (ae και rugine) σηµαίνουν παλαιά σκουριά και αναφέρονται στην πρασινίζουσα σκουριά του χαλκού µε την οποία προσοµοιάζεται το πράσινο χρώµα των αποικιών του µικροοργανισµού 1. Ο χρωµατισµός αυτός των αποικιών οφείλεται στη συνδυασµένη παραγωγή των χρωστικών πυοκυανίνη 2 (pyocyanine) και πυοβερδίνη 3 (pyoverdine). Αν και η λατινική λέξη verdine αναφέρεται στο πράσινο, επί απουσίας της πυοκυανίνης, η πυοβερδίνη έχει κίτρινο χρώµα. Επιπλέον, το πύο που παράγεται σε λοίµωξη από P. aeruginosa έχει υποκυανίζουσα χροιά και για το λόγο αυτό ονοµάστηκε «βακτήριο του κυανού πύου» ή «ψευδοµονάς η πυοκυανική» 1. 15

2.2. οµικά χαρακτηριστικά και βιοχηµικές ιδιότητες Η P. aeruginosa είναι ένα µικρών διαστάσεων (1,5-3 µm µήκος και 0,5 µm πλάτος περίπου) Gram αρνητικό αερόβιο βακτηρίδιο 1. Το σώµα του είναι ευθύ ή ελαφρώς κεκαµένο, διατάσσεται κατά µόνας ή κατά ζεύγη και κινείται µε µία ή περισσότερες πολικές βλεφαρίδες 4. Ορισµένα στελέχη, συνήθως σε ασθενείς µε κυστική ίνωση, διαθέτουν άφθονο πολυσακχαριδικό έλυτρο 5. Στην επιφάνεια φέρει φίµπριες οι οποίες διευκολύνουν την προσκόλλησή της στα επιθηλιακά κύτταρα του ξενιστή 6. Η P. aeruginosa είναι αζυµωτικό βακτηρίδιο, δε διασπά δηλαδή κανένα σάκχαρο αναεροβίως. Αεροβίως διασπά τη γλυκόζη όχι όµως και τη γαλακτόζη. Είναι οξειδάση θετικό, καταλάση θετικό, ινδόλη αρνητικό, ερυθρό του µεθυλίου αρνητικό. Στον Πίνακα 1 αναγράφονται οι ιδιότητες της P. aeruginosa όπως προέκυψαν από τη µελέτη 201 νοσοκοµειακών στελεχών Αµερικανικής µελέτης 7. Πίνακας 1. Iδιότητες της P. aeruginosa σε δείγµα νοσοκοµειακών στελεχών (n=201) 7. οκιµασία % θετικών στελεχών Οξειδάση 99 Ανάπτυξη σε MacConkey 100 Cetrimide 94 6% NaCl 65 42 o C 100 Αναγωγή νιτρικών 98 Παραγωγή αερίου από νιτρικά 93 Παραγωγή πυοβερδίνης 65 ιυδρολάση της αργινίνης 100 Αποκαρβοξυλάση της λυσίνης 0 Αποκαρβοξυλάση της ορνιθίνης 0 Υδρόλυση Ουρία 57 Ζελατίνη 82 Ακετυλαµίδιο 100 Εσκουλίνη 0 Starch 0 Παραγωγή οξέως από διάσπαση Γλυκόζης 97 Ξυλόζης 90 Λακτόζης 0 Σουκρόζης 0 Μαλτόζης 0 Μαννιτόλης 70 Κιτρικά Simmons 95 16

2.3. Λοιµογόνοι παράγοντες Η παθογόνος δράση της P. aeruginosa είναι πολυπαραγοντική καθώς εµπλέκονται σε αυτή δοµικά στοιχεία του βακτηρίου, τοξίνες και ένζυµα. Με τις προσκολλητίνες των φιµπριών επιτυγχάνεται η πρόσδεσή της στα κύτταρα του ξενιστή ενώ το πολυσακχαριδικό έλυτρο, εκτός από τη συµβολή του στην πρόσδεση στα επιθηλιακά κύτταρα και την τραχειοβρογχική βλεννίνη, προστατεύει τον µικροοργανισµό από τη φαγοκυττάρωση και τη δράση των αντιβιοτικών 8. Ο λιποπολυσακχαριτης (LPS) της εξωτερικής µεµβράνης προκαλεί έντονη ανοσιακή απάντηση στον ξενιστή λειτουργώντας ως υπεραντιγόνο 9. Ο LPS αποτελείται από έναν ολιγοσακχαριδικό πυρήνα συνδεδεµένο µε επαναλαµβανόµενα σάκχαρα, που αποτελούν το αντιγόνο-ο, και µε το λιπίδιο Α το οποίο έχει ιδιότητες ενδοτοξίνης. Όταν απελευθερωθεί στην κυκλοφορία µετά από λύση του βακτηρίου µπορεί να προκαλέσει πυρετό, διάρροια ακόµη και σηπτική καταπληξία. Ένας από τους σηµαντικότερους λοιµογόνους παράγοντες της P. aeruginosa είναι η εξωτοξίνη Α 10 η οποία δρα όπως η διφθεριδική τοξίνη του Corynebacterium diphtheriae, αν και διαφέρει από αυτή δοµικά. Η εξωτοξίνη Α αναστέλλει την επιµήκυνση των πολυπεπτιδικών αλυσίδων στα ευκαρυωτικά κύτταρα διακόπτοντας τη σύνθεση των πρωτεϊνών. Προκαλεί µε το µηχανισµό αυτό βλάβες στους µολυσµένους ιστούς όπως τη νέκρωση των εγκαυµατικών ιστών, τις χρόνιες πνευµονικές λοιµώξεις και τη βλάβη του κερατοειδή επί οφθαλµικών λοιµώξεων. Οι εξωτοξίνες S και T που δρουν ως ριβοσυλοτρανσφεράσες του ADP προκαλούν αναδιάταξη της ακτίνης και διευκολύνουν την εισβολή και εξάπλωση του βακτηρίου στους ιστούς 11. Οι ελαστάσες Las A (πρωτεάση σερίνης) και Las B (µεταλλοπρωτεάση ψευδαργύρου) δρουν συνεργητικά επιτυγχάνοντας τη διάσπαση των ιστών που περιέχουν ελαστίνη καθώς και των συστατικών του συµπληρώµατος 12. Επιπλέον, από την παραγωγή αντισωµάτων κατά των Las A και Las B προκαλείται δηµιουργία και εναπόθεση ανοσοσυµπλεγµάτων. Η P. aeruginosa παράγει ακόµη αιµολυσίνες (φωσφολιπάση C, ραµνολιπίδια), αλκαλική πρωτεάση, εντεροτοξίνη, εστεράση, DNAση και κοαγκουλάση 1. 2.4. Λοιµώξεις από P. aeruginosa Συχνές είναι οι πνευµονικές λοιµώξεις. Η µόλυνση του πνεύµονα από P. aeruginosa δύναται να εξελιχθεί από απλό αποικισµό ή καλοήθη τραχειοβρογχίτιδα έως και βαριά νεκρωτική βρογχοπνευµονία 13. Ιδιαίτερη κατηγορία συνιστούν οι ασθενείς µε κυστική ίνωση στους οποίους η εκρίζωση της P. aeruginosa είναι εξαιρετικά δύσκολη 14. Άλλοι παράγοντες που ευνοούν την εγκατάσταση της P. aeruginosa στους πνεύµονες νοσηλευόµενων ασθενών είναι η εκτεταµένη χορήγηση αντιβιοτικών και η χρήση µηχανηµάτων υποστήριξης της αναπνοής. Συνηθισµένη επίσης θεωρείται η θυλακίτιδα του δέρµατος και οι λοιµώξεις των νυχιών µετά από εµβάπτιση σε µολυσµένο νερό 15. Οι µολύνσεις των εγκαυµάτων από P. aeruginosa παρουσιάζουν µεγάλη επικινδυνότητα καθώς µπορεί να οδηγήσουν µέχρι και σε σήψη 16. 17

Από τις ωτικές λοιµώξεις, συχνότερη είναι η έξω ωτίτιδα (αυτί του κολυµβητή), παρατηρούνται όµως και η κακοήθης έξω ωτίτιδα σε διαβητικούς ασθενείς καθώς και η χρόνια µέση ωτίτιδα από P. aeruginosa 17. Οι οφθαλµικές λοιµώξεις αποτελούν συνέπεια τραυµατισµού του κερατοειδή και έκθεσης του σε µολυσµένο νερό 18. Τα κερατοειδικά έλκη που προκαλούνται θέτουν σε κίνδυνο την όραση. Για το λόγο αυτό, η θεραπεία η οποία συχνά έχει απογοητευτικά αποτελέσµατα, απαιτείται να είναι άµεση και κυρίως αποτελεσµατική. Ουρολοιµώξεις από P. aeruginosa εγκαθίστανται κυρίως σε νοσηλευόµενους ασθενείς µε χρόνια αντιµικροβιακή αγωγή και σε αυτούς που φέρουν µόνιµους ουροκαθετήρες 19. Η µικροβιαιµία από P. aeruginosa είναι αδύνατο να διακριθεί κλινικά από αυτές που προκαλούνται από άλλα Gram αρνητικά βακτηρίδια, εµφανίζει όµως υψηλότερη θνητότητα. Το γεγονός αυτό οφείλεται αφενός στην αυξηµένη εγγενή λοιµογονικότητα της P. aeruginosa και αφετέρου στην τάση της να προσβάλλει κυρίως τους ήδη ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς 20. Άλλες λοιµώξεις που αφορούν την P. aeruginosa 21 είναι οι λοιµώξεις του γαστρεντερικού σωλήνα, του κεντρικού νευρικού συστήµατος και η ενδοκαρδίτιδα της τριγλώχινος βαλβίδας σε χρήστες ενδοφλέβιων ναρκωτικών. 2.5. Αντοχή στα αντιβιοτικά και αντιψευδοµοναδιακή χηµειοθεραπεία Η εξωτερική µεµβράνη των Gram-αρνητικών βακτηρίων αποτελεί εµπόδιο για την είσοδο µεγάλων υδρόφιλων µορίων στο εσωτερικό του κυττάρου. Η αλληλεπίδραση των αµινογλυκοσιδών και της κολιστίνης µε λιποπολυσακχαρίτες της εξωτερικής µεµβράνης επιτρέπει την είσοδο αυτών των ουσιών στον περιπλασµατικό χώρο, ενώ τα β-λακταµικά και οι κινολόνες περνούν µέσω ειδικών πορινών. Οι πορίνες των Gramαρνητικών διακρίνονται σε µη ειδικές, οι οποίες επιτρέπουν τη δίοδο σχεδόν όλων των υδρόφιλων µορίων και σε ειδικές, οι οποίες επιτρέπουν την είσοδο συγκεκριµένων µορίων µόνο. Αν και τα περισσότερα Gram-αρνητικά εκφράζουν πολλές µη ειδικές και λίγες ειδικές πορίνες, στην P. aeruginosa συµβαίνει ακριβώς το αντίθετο µε αποτέλεσµα να εκφράζονται κυρίως ειδικές πορίνες στην εξωτερική της µεµβράνη 22,23. Η P. aeruginosa διαθέτει επιπλέον δύο ακόµη βασικούς µηχανισµούς ενδογενούς αντοχής στα αντιβιοτικά. Εκφράζει µία χρωµοσωµατική επαγώγιµη AmpC β- λακταµάση 24,25 η οποία παρέχει αντοχή στην αµπικιλλίνη, την αµοξικιλλίνη, την αµοξικιλλίνη-κλαβουλανικό οξύ και τις κεφαλοσπορίνες µηδέ εξαιρουµένης και της κεφτριαξόνης 26. ιαθέτει επίσης αρκετά και σηµαντικά συστήµατα ενεργητικής εκροής 27-32. Παρόλα αυτά, ορισµένα αντιβιοτικά υπερνικούν τους συγκεκριµένους µηχανισµούς ενδογενούς αντοχής της P. aeruginosa και κατ επέκταση χρησιµοποιούνται στην κλινική πράξη για την αντιµετώπιση των λοιµώξεων που προκαλεί (Πίνακας 2). Σε αυτά ανήκουν οι ευρέως φάσµατος πενικιλλίνες (πιπερακιλλίνη και τικαρκιλλίνη), ορισµένες ευρέως φάσµατος κεφαλοσπορίνες (κεφταζιδίµη και κεφεπίµη), οι καρµπαπενέµες, οι µονοµπακτάµες (αζτρεονάµη), οι φθοριοκινολόνες (σιπροφλοξασίνη, λεβοφλοξασίνη), οι αµινογλυκοσίδες (γενταµικίνη, τοµπραµυκίνη, αµικασίνη) και η 18

κολιστίνη που, αν και παρουσιάζει νευρο- και ωτοτοξικότητα 33, χρησιµοποιείται τα τελευταία χρόνια έναντι ανθεκτικών σε όλες τις άλλες κατηγορίες στελεχών 34-36. Πίνακας 2. Αντιβιοτικά που χρησιµοποιούνται ευρέως για την αντιµετώπιση λοιµώξεων από P. aeruginosa. Κατηγορία αντιβιοτικού Μηχανισµός δράσης Πενικιλλίνες Αναστολή σύνθεσης κυτταρικού τοιχώµατος Πενικιλλίνη/Αναστολέας Αναστολή σύνθεσης β-λακταµασών κυτταρικού τοιχώµατος Κεφαλοσπορίνες Αναστολή σύνθεσης κυτταρικού τοιχώµατος Μονοµπακτάµες Αναστολή σύνθεσης κυτταρικού τοιχώµατος Καρµπαπενέµες Αναστολή σύνθεσης κυτταρικού τοιχώµατος Παραδείγµατα αντιβιοτικών Τικαρκιλλίνη Πιπερακιλλίνη Τικαρκιλλίνη/Κλαβουλανικό Πιπερακιλλίνη/Ταζοµπακτάµη Κεφταζιδίµη Κεφεπίµη Αζτρεονάµη Ιµιπενέµη Μεροπενέµη οριπενέµη Κινολόνες ιακοπή σύνθεσης DNA Σιπροφλοξασίνη Αµινογλυκοσίδες Παρεµπόδιση σύνθεσης πρωτεϊνών Λεβοφλοξασίνη Γενταµικίνη Τοµπραµυκίνη Αµικασίνη Εκτός από την ενδογενή αντοχή, αναπτύσσεται και επίκτητη, η οποία προκαλείται από: (α) µεταλλάξεις που οδηγούν σε υπερέκφραση ενός προϋπάρχοντος µηχανισµού αντοχής ή στην αλλαγή του στόχου δράσης του φαρµάκου και (β) πρόσληψη εξωγενούς γενετικού υλικού µε µεταφερόµενα γενετικά στοιχεία, όπως συµβαίνει στην περίπτωση των µεταφερόµενων β-λακταµασών (Πίνακας 3). Πίνακας 3. Γενικοί µηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στα αντιβιοτικά. Αντοχή έναντι β-λακταµικών Κινολονών Αµινογλυκοσιδών Πολυµυξινών Μηχανισµοί Ενδογενείς β-λακταµάσες Μεταφερόµενες β-λακταµάσες Ενεργητική εκροή ιαταραχή διαπερατότητας της κυτταροπλασµατικής µεµβράνης Αλλαγή του στόχου δράσης Ενεργητική εκροή Τροποποιητικά ένζυµα αµινογλυκοσιδών Ενεργητική εκροή 16S rrna µεθυλάσες Τροποποίηση του LPS Μεταλλάξεις στις τοποϊσοµεράσες ΙΙ και IV παρέχουν αντοχή στις κινολόνες 37,38. Μείωση της διαπερατότητας του κυτταρικού τοιχώµατος που οφείλεται σε µεταλλάξεις οδηγεί σε ελαττωµένη είσοδο στο βακτηριακό κύτταρο των καρµπαπενεµών και των αµινογλυκοσιδών. Η µειωµένη διαπερατότητα είναι ένας από τους βασικούς 19

µηχανισµούς ανάπτυξης αντοχής στις αµινογλυκοσίδες 39 µαζί µε τη λειτουργία των αντλιών ενεργητικής εκροής 40,41 και την απενεργοποίηση του φαρµάκου από ένζυµα που κωδικοποιούνται στο χρωµόσωµα ή σε πλασµίδια 42. Τα ένζυµα αυτά ονοµάζονται ακετυλ-τρανφεράσες (AAC), νουκλεοτιδυλ-τρανσφεράσες (ANT) και φωσφορυλτρανσφεράσες (APH) και απενεργοποιούν τις αµινογλυκοσίδες µέσω ακετυλίωσης, αδενυλίωσης και φωσφορυλίωσης αντίστοιχα 43,44 (Πίνακας 4). Πίνακας 4.Τροποποιητικά ένζυµα αµινογλυκοσιδών που έχουν ανεβρεθεί σε στελέχη P. aeruginosa 36,42-44. Κατηγορία Ακετυλτρανσφεράσες (AAC) Νουκλεοτιδυλτρανσφεράσες (ANT) Φωσφορυλτρανσφεράσες (APH) Οικογένεια Υποοικογένεια Υποστρώµατα ενζύµων AAC(3 ) I Γενταµικίνη II Γενταµικίνη Τοµπραµυκίνη III Γενταµικίνη Τοµπραµυκίνη IV Γενταµικίνη VI Γενταµικίνη Τοµπραµυκίνη AAC(6 ) I Τοµπραµυκίνη Αµικασίνη II Γενταµικίνη Τοµπραµυκίνη ANT(2 ) Ι Γενταµικίνη Τοµπραµυκίνη ΑΝΤ(4 ) IIa Τοµπραµυκίνη Αµικασίνη IIb Τοµπραµυκίνη Αµικασίνη ΑΝΤ(3 ) Στρεπτοµυκίνη APH(3 ) ΙΙ Καναµυκίνη Νεοµυκίνη IIb Καναµυκίνη IIb-like Αµικασίνη (ελαφρώς) VI Αµικασίνη Ισεπαµυκίνη APH(2 ) Γενταµικίνη Τοµπραµυκίνη Η αντοχή στην κολιστίνη οφείλεται πιθανότατα σε µεταβολές στη δοµή της κυτταρικής µεµβράνης. Αν και η αντοχή στο αντιβιοτικό αυτό είναι σπάνια 45-48, παρουσιάζει ωστόσο αυξητικές τάσεις τα τελευταία χρόνια ιδίως σε ασθενείς µε κυστική ίνωση που λαµβάνουν κολιστίνη σε εισπνεόµενη µορφή 49. 20

2.6. Βιολογικό Υµένιο και Quorum Sensing System Η ικανότητα δηµιουργίας βιολογικού υµενίου 50 προστατεύει ορισµένα στελέχη P. aeruginosa από τη δράση των ανοσιακών µηχανισµών και των αντιβιοτικών 51. Λοιµώξεις από στελέχη που σχηµατίζουν βιολογικό υµένιο είναι εξαιρετικά δύσκολο να εκριζωθούν ειδικά σε ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς καθώς συχνά δεν απαντούν στη θεραπεία µε αντιβιοτικά. Πρόσφατη µελέτη σε ουδετεροπενικά ποντίκια έδειξε ότι απαιτουνται µεγαλύτερες δόσεις κολιστίνης και περισσότερος χρόνος θεραπείας µε ιµιπενέµη για την αντιµετώπιση πνευµονικής λοιµωξης από P. aeruginosa που παράγει βιολογικό υµένιο σε σχέση µε λοιµώξεις από στελέχη που δεν παράγουν 52. ιάφοροι µηχανισµοί έχουν προταθεί για το σχηµατισµό του βιολογικού υµενίου στην P. aeruginosa. Σηµαντικό ρόλο για τη µετάπτωση από την πλαγκτονική µορφή στην έκφραση του φαινοτύπου παραγωγής βιολογικού υµενίου φαίνεται πως παίζει το σύστηµα Quorum Sensing 53 το οποίο ελέγχει την έκφραση ορισµένων γονιδίων µέσω διακυτταρικής επικοινωνίας που επιτυγχάνεται µε την παραγωγή και έκκριση µορίων µικρού µεγέθους. Ο έλεγχος της γονιδιακής έκφρασης επιτρέπει ακόµη στην P. aeruginosa να προσαρµόζεται στις περιβαλλοντικές προκλήσεις καθώς το σύστηµα Quorum Sensing αλληλεπιδρά µε σήµατα του περιβάλλοντος όπως για παράδειγµα την αλλαγή από αερόβιες σε αναερόβιες συνθήκες. 2.7. Ανάπτυξη πολυανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa Η αποµόνωση πολυανθεκτικών (ανθεκτικών σε τρεις ή περισσότερες κατηγορίες αντιµικροβιακών) στελεχών P. aeruginosa αποτελεί ένα παγκόσµιο φαινόµενο ανησυχητικών διαστάσεων 54-56. Το 2003 αναφέρθηκε σηµαντική διαφορά στα ποσοστά εµφάνισης πολυανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa (από 3% έως 50%) µεταξύ των Ευρωπαϊκών χωρών 57. Το 2005 τονίστηκε η ταχεία αύξηση της αποµόνωσης πολυανθεκτικών στελεχών (35%) στη Λατινική Αµερική 58. Η αύξηση του αντίστοιχου ποσοστού στις Ηνωµένες Πολιτείες Αµερικής ήταν από 4% σε 14% µεταξύ 1993 και 2002. Τα αντιβιοτικά στα οποία παρουσιάστηκαν υψηλότερα ποσοστά αντοχής την περίοδο εκείνη ήταν η σιπροφλοξασίνη, η ιµιπενέµη, η τοµπραµυκίνη και η αζτρεονάµη 59. Θεµελιώδη ρόλο στην ανάπτυξη της πολυανθεκτικότητας φαίνεται πως παίζουν τα συστήµατα ενεργητικής εκροής 60,61 όπως το MexAB-OprM το οποίο εκφράζεται διαρκώς στην P. aeruginosa. Μετάλλαξη του γονιδίου mexr οδηγεί σε υπερέκφραση των αντλιών ενεργητικής εκροής µε αποτέλεσµα τη σηµαντική αύξηση των MICs πολλών αντιβιοτικών 62,63. Τέτοιου είδους µεταλλάξεις συµβαίνουν συχνότερα σε καταστάσεις στις οποίες ευνοείται η ύπαρξη υψηλών βακτηριακών συγκεντρώσεων όπως η χρόνια πνευµονική λοίµωξη. Σε µελέτη ασθενών µε κυστική ίνωση που είχαν λάβει σιπροφλοξασίνη βρέθηκε ότι το 80% των αποµονωθέντων στελεχών παρουσίαζε υπερέκφραση των αντλιών ενεργητικής εκροής 64. Υπερέκφραση των αντλιών αυτών παρατηρήθηκε και µε τη χρήση αντισηπτικών 65, ενώ εξαιρετικά ανησυχητική θεωρείται η ανεύρεση µεταφερόµενου πλασµιδίου που φέρει γονίδια ανάπτυξης αντοχής µέσω του ίδιου µηχανισµού σε στελέχη του περιβάλλοντος 66. 21

3. β-λακταμικα ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΑ Τα β-λακταµικά αντιβιοτικά χαρακτηρίζονται από την παρουσία ενός τετραµελούς β-λακταµικού δακτυλίου που περιέχει άζωτο, και έχουν την ικανότητα να δρουν στο κυτταρικό τοίχωµα των µικροβίων αναστέλλοντας το σχηµατισµό του 67. Η ιδιότητά αυτή καθώς και η δοµή του µορίου τους τα διαχωρίζει από τις άλλες οµάδες αντιµικροβιακών φαρµάκων. β-λακταμικοσ ΑΚΤΥΛΙΟΣ Είναι κυρίως βακτηριοκτόνα µε χρονοεξαρτώµενη δράση ενώ τα περισσότερα αποβάλλονται αναλλοίωτα στα ούρα και για το λόγο αυτό είναι κατάλληλα για τη θεραπεία, εκτός των άλλων, και των ουρολοιµώξεων. Οι β-λακτάµες εµφανίζουν υψηλό θεραπευτικό δείκτη. Οι κύριες ανεπιθύµητες ενέργειες τους οφείλονται σε αλλεργικές αντιδράσεις, η πιο συχνή από τις οποίες είναι το ερυθηµατώδες κηλιδοβλατιδώδες εξάνθηµα µε κνησµό. Τα αντιβιοτικά αυτά σπανίως προκαλούν αφυλαξία ενώ θεωρούνται ασφαλή για χρήση και στην εγκυµοσύνη. 3.1. Κατάταξη των β-λακταµικών αντιβιοτικών Οι β-λακτάµες περιλαµβάνουν τέσσερις υποκατηγορίες: τις πενικιλλίνες, τις κεφαλοσπορίνες, τις µονοµπακτάµες και τις καρµπαπενέµες. Οι πενικιλλίνες αποτελούνται από ένα β-λακταµικό δακτύλιο µαζί µε ένα πενταµελή θειαζολιδικό δακτύλιο. Με τροποποίηση της πλευρικής αλυσίδας στη θέση 6 του β-λακταµικού δακτυλίου προκύπτουν διαφορετικές πενικιλλίνες οι οποίες εµφανίζουν ποικίλες αντιβακτηριακές και φαρµακολογικές ιδιότητες. Υπάρχουν τέσσερις κατηγορίες πενικιλινών: οι φυσικές πενικιλλίνες, οι αντισταφυλοκοκκικές πενικιλλίνες, οι αµινοπενικιλλίνες και οι αντιψευδοµοναδικές πενικιλλίνες (τικαρκιλλίνη, πιπερακιλλίνη). 22

Οι κεφαλοσπορίνες αποτελούνται από ένα β-λακταµικό δακτύλιο και ένα εξαµελή διυδροθειαζονικό δακτύλιο. Οι διαφορετικές κεφαλοσπορίνες προκύπτουν από υποκαταστάσεις πλευρικών αλυσίδων στη θέση 7 του β-λακταµικού δακτυλίου και στη θέση 3 του διυδροθειαζονικού δακτυλίου. Οι κεφαλοσπορίνες διαιρούνται σε πρώτης (πχ κεφαλοτίνη), δεύτερης (πχ κεφακλόρη), τρίτης (πχ κεφταζιδίµη) και τέταρτης (πχ κεφεπίµη) γενεάς µε βάση το αντιµικροβιακό τους φάσµα, ενώ πρόσφατα αναπτύχθηκε η κεφτοβιµπρόλη 68 η οποία χαρακτηρίζεται ως κεφαλοσπορίνη πέµπτης γενεάς. Οι µονοµπακτάµες αποτελούνται από ένα β-λακταµικό δακτύλιο ενωµένο µε µια σουλφονική οµάδα. Ο κύριος εκπρόσωπος της κατηγορίας αυτής είναι η αζτρεονάµη. ΑΖΤΡΕΟΝΑΜΗ Οι καρµπαπενέµες αποτελούνται από ένα β-λακταµικό δακτύλιο και ένα πενεµικό δακτύλιο. Η κατηγορία αυτή περιγράφεται πιο αναλυτικά στη συνέχεια. 23

4. ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ Οι καρµπαπενέµες αποτελούν σηµαντικούς αντιµικροβιακούς παράγοντες µε δράση έναντι πολλών µικροβίων συµπεριλαµβανοµένης και της P. aeruginosa. Όπως όλα τα β-λακταµικά αντιβιοτικά, οι καρµπαπενέµες είναι εκλεκτικοί αναστολείς της σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώµατος, οι οποίοι δρουν µέσω της δέσµευσης ειδικών πρωτεϊνών της κυτταρικής µεµβράνης, των πενικιλλοδεσµευτικών πρωτεϊνών (Penicillin Binding Proteins-PBPs). Οι πιο ευρέως χρησιµοποιούµενες στην κλινική πράξη είναι η ιµιπενέµη, η µεροπενέµη, πιο πρόσφατα στην Ευρώπη και τη Β. Αµερική η ερταπενέµη, και από το 2008 εγκρίθηκε από τον Ευρωπαϊκό Οργανισµό Φαρµάκων και η δοριπενέµη. Στην Ασία χρησιµοποιούνται επίσης η πανιπενέµη και η βιαπενέµη ενώ αναπτύχθηκε και η µοναδική από του στόµατος χορηγούµενη καρµπαπενέµη, η τεµπιπενέµη. Τα αντιβιοτικά αυτά εµφανίζουν αξιοσηµείωτη σταθερότητα ενάντια στη δράση των β- λακταµασών, και γενικά έχουν µεγαλύτερο εύρος δράσης συγκριτικά µε άλλα β- λακταµικά 69. 4.1. Ιµιπενέµη Η ιµιπενέµη είναι ένα δικυκλικό β-λακταµικό και διακρίνεται από τα άλλα β- λακταµικά για το ευρύ της αντιµικροβιακό φάσµα 70. Η ιµιπενέµη καταστρέφεται από τη διυδροπεπτιδάση Ι της ψηκτροειδούς παρυφής του σπειράµατος των νεφρών και για το λόγο αυτό χορηγείται σε συνδυασµό µε την σιλαστατίνη, που είναι αναστολέας της νεφρικής διυδροπεπτιδάσης Ι και έχει συµβατές φαρµακοκινητικές ιδιότητες µε την ιµιπενέµη. Η ιµιπενέµη συνδέεται εκλεκτικά µε τις PBPs και το αντιµικροβιακό της φάσµα περιλαµβάνει όλα σχεδόν τα συνήθη Gram θετικά και Gram αρνητικά παθογόνα βακτήρια 70. εν απορροφάται όταν χορηγείται από το στόµα και γι αυτό δίδεται µόνο ενδοφλεβίως ή ενδοµυϊκά. ΙΜΙΠΕΝΕΜΗ Η απορρόφησή της µετά από ενδοµυική χορήγηση είναι 60-75% ενώ αυτή της σιλαστατίνης φτάνει το 95-100%. Η ιµιπενέµη συνδέεται µε τα λευκώµατα σε ποσοστό 20% και η σιλαστατίνη σε ποσοστό 40% 71. 24

Ο χρόνος ηµίσειας ζωής και για τις δύο ανέρχεται σε 1 ώρα όταν χορηγείται ενδοφλεβίως και 2-3 ώρες όταν δίδεται ενδοµυικά. Λόγω του σχετικά βραχέως χρόνου ηµίσειας ζωής το φάρµακο πρέπει να χορηγείται ανά 8ωρο ή 6ωρο. Η διάχυση της ιµιπενέµης στους ιστούς και τα βιολογικά υγρά όπως ο σίελος, τα πτύελα, το πλευριτικό υγρό, το αρθρικό υγρό και τα οστά είναι ικανοποιητική 72. εν εµφανίζει υψηλά επίπεδα στη χολή και δεν παρουσιάζει εντερο-ηπατικό κύκλο, γεγονός που εξηγεί γιατί παρά το ευρύ της φάσµα επηρεάζει ελάχιστα την εντερική χλωρίδα. Η δίοδος της στο εγκεφαλονωτιαίο υγρό (ΕΝΥ) αυξάνεται επί φλεγµονής των µηνίγγων. Αποβάλλεται µε σπειραµατική διήθηση ενώ ο βαθµός σωληναριακής απέκκρισης της είναι πολύ µικρός. 4.2. Πανιπενέµη Η πανιπενέµη αναπτύχθηκε και κυκλοφόρησε το 1993 στην Ιαπωνία. Πρόκειται για ένα αντιβιοτικό µε ιδιότητες αντίστοιχες µε αυτές της ιµιπενέµης το οποίο συγχορηγείται µε την ουσία µπεταµιπρόν που δρα ως αναστολέας της νεφρικής διυδροπεπτιδάσης Ι 73. ΠΑΝΙΠΕΝΕΜΗ Το αντιβιοτικό αυτό δεν χρησιµοποιείται σε άλλες χώρες εκτός της Ιαπωνίας, της Κίνας και της Κορέας. 4.3. Μεροπενέµη Η µεροπενέµη έχει παρόµοιο µηχανισµό δράσεως µε την ιµιπενέµη (σύνδεση µε τις PBPs, και κυρίως µε τις PBP2), διαφέρει όµως στο ότι είναι ανθεκτική στη διυδροπεπτιδάση Ι του νεφρικού σπειράµατος και δεν χρειάζεται συγχορήγηση µε τη σιλαστατίνη. Επιπλέον εµφανίζει µεγαλύτερη διεισδυτικότητα στο µικροβιακό κύτταρο της P. aeruginosa από την ιµιπενέµη, διότι διέρχεται ταχύτερα µέσω της πορίνης OprD. Η µεροπενέµη είναι πιο δραστική έναντι των Gram αρνητικών µικροοργανισµών συγκριτικά µε την ιµιπενέµη, υπολείπεται όµως ως προς τη δραστικότητα έναντι των 25

Gram θετικών κόκκων. Όπως και η ιµιπενέµη, χορηγείται µόνο παρεντερικά, καθώς δεν απορροφάται από το γαστρεντερικό βλεννογόνο. ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗ Ο όγκος κατανοµής (Vd) σε ενήλικες είναι 0,3 L/Kg και στα παιδιά 0,4-0,5 L/Kg 74. Συνδέεται µε πρωτεΐνες του ορού σε ποσοστό 2% και µεταβολίζεται στο ήπαρ σε ανενεργείς µορφές. Ο χρόνος ηµίσειας ζωής της µεροπενέµης σε υγιείς ενήλικες είναι 1-1,5 ώρες ενώ χρειάζεται προσαρµογή της δόσεως επί νεφρικής ανεπάρκειας. Με τιµές κάθαρσης κρεατινίνης 30-80 ml/min ο χρόνος ηµίσειας ζωής είναι 1,9-3,3 ώρες και µε τιµές 2-30 φτάνει τις 3,8-5,7 ώρες. Η αποβολή της δεν επηρεάζεται από την ηπατική ανεπάρκεια και δε χρειάζεται προσαρµογή της δόσης σε κιρρωτικούς ασθενείς. Κατά την αιµοκάθαρση αποβάλλεται µε επακόλουθο να χρειάζεται χορήγηση µιας δόσεως µετά το πέρας της. Παρουσιάζει καλή διαπερατότητα σε ιστούς και σωµατικά υγρά όπως τα οστά, το αρθρικό υγρό, τη χολή και το σίελο, ενώ διαπερνά τις µήνιγγες και είναι δυνατόν να επιτευχθούν στο ΕΝΥ επίπεδα 1-5 µg/ml. 4.4. Βιαπενέµη Η βιαπενέµη χαρακτηρίζεται από µεγάλο εύρος δράσης κυρίως κατά των αναερόβιων µικροοργανισµών, υψηλού βαθµού χηµική σταθερότητα και αντίσταση στη καταστροφή από τη νεφρική διυδροπεπτιδάση Ι. Η στερεοχηµική της δοµή είναι όµοια µε της ιµιπενέµης µε τη διαφορά της ύπαρξης µιας µεθυλικής οµάδας στη θέση 1Β 75. ΒΙΑΠΕΝΕΜΗ 26

Το αντιβιοτικό αυτό αναπτύχθηκε στην Ιαπωνία και δεν διατίθεται στην Ευρώπη και την Αµερική. 4.5. Ερταπενέµη Η ερταπενέµη είναι µια νεότερη καρµπαπενέµη που χαρακτηρίζεται από παρατεταµένο χρόνο ηµίσειας ζωής (3,6-4 ώρες) και εξελίχθηκε µε σκοπό την εφάπαξ ηµερησία χορήγησή της για τη θεραπεία των λοιµώξεων της κοινότητας. ΕΡΤΑΠΕΝΕΜΗ Είναι και αυτή ανθεκτική στη δράση της διυδροπεπτιδάσης Ι και µπορεί να χορηγηθεί ενδοφλεβίως ή ενδοµυϊκά 76. Είναι πιο αποτελεσµατική επί των εντεροβακτηριοειδών από την ιµιπενέµη και τη µεροπενέµη, όµως δεν είναι ή είναι ελάχιστα δραστική έναντι στελεχών P. aeruginosa και Acinetobacter spp., ευαίσθητων στις άλλες καρµπαπενέµες. Το γεγονός αυτό θεωρείται ότι οφείλεται στο µεγάλο µέγεθος του µορίου της ερταπενέµης το οποίο δεν διαπερνά εύκολα τις πορίνες των αζυµωτικών βακτηρίων καθώς και σε υψηλού βαθµού συγγένεια του προς τις αντλίες ενεργητικής εκροής 77. Έχει Vd 0,2 L/Kg σε παιδιά 3 µηνών-12 ετών, 0,16 L/Kg σε παιδιά 13-17 ετών και 0,12 L/Kg σε ενήλικες. Συνδέεται µε λευκωµατίνη σε ποσοστό 85-95%. Αποβάλλεται κατά 80% στα ούρα, κυρίως µε σπειραµατική διήθηση και κατά 10% στα κόπρανα. Το υπόλοιπο ποσοστό υδρολύεται σε ανενεργούς µεταβολίτες. 4.6. οριπενέµη Η δοριπενέµη είναι µία ευρέως φάσµατος καρµπαπενέµη που χρησιµοποιείται για τη θεραπεία της νοσοκοµειακής πνευµονίας, των επιπλεγµένων ενδοκοιλιακών λοιµώξεων και των επιπλεγµένων ουρολοιµώξεων 78. Όπως όλες οι καρµπαπενέµες, είναι και αυτή ενέσιµη και δραστική έναντι πολλών αερόβιων και αναερόβιων Gram θετικών και Gram αρνητικών βακτηρίων. Συγκριτικά µε τα άλλα αντιβιοτικά της κατηγορίας, η δοριπενέµη βρέθηκε να έχει καλύτερη αντιψευδοµοναδική δράση από την ιµιπενέµη και το ίδιο καλή µε τη µεροπενέµη 77. 27

ΟΡΙΠΕΝΕΜΗ Αν και σε σχετική µελέτη η δοριπενέµη φαίνεται να είναι πιο ισχυρή in vitro έναντι της P. aeruginosa από τις άλλες καρµπαπενέµες 79, εντούτοις τα στελέχη P. aeruginosa που έχουν αναπτύξει αντοχή στις καρµπαπενέµες και κυρίως αυτά που φέρουν µεταφερόµενες καρµπαπενεµάσες είναι ανθεκτικά σε όλα τα αντιβιοτικά της κατηγορίας 46. Για το λόγο αυτό η παραµονή της δοριπενέµης ως αποτελεσµατικού αντιψευδοµοναδιακού παράγοντα είναι άρρηκτα συνδεδεµένη µε αυτήν των άλλων καρµπαπενεµών και εξαρτάται από την επιτυχία ή όχι της προσπάθειας περιορισµού των ανθεκτικών στις καρµπαπενέµες στελεχών 80. Έχει Vd 16,8 L και συνδέεται µε τις πρωτεΐνες του ορού σε ποσοστό 8-9%. Ο χρόνος ηµίσειας ζωής της είναι 1 ώρα. Απεκκρίνεται κατά 70% αναλλοίωτη στα ούρα και 15% ως δοριπενέµη Μ1 (ανενεργός µεταβολίτης που προκύπτει από τη δράση της διυδροπεπτιδάσης Ι). Στα κόπρανα εµφανίζεται σε ποσοστό <1%. 4.7. Τεµπιπενέµη Η τεµπιπενέµη είναι η νεότερη καρµπαπενέµη και αναπτύσσεται όπως και η πανιπενέµη και η βιαπενέµη στην Ιαπωνία. Πρόκειται για την ενεργό µορφή της ουσίας tebipenem pivoxil και προκύπτει µε την προσθήκη µιας νέας πλευρικής αλυσίδας στη θέση 2C του µορίου της βιαπενέµης 81. ΤΕΜΠΙΠΕΝΕΜΗ Η τεµπιπενέµη είναι η καρµπαπενέµη µε την υψηλότερη βιοδιαθεσιµότητα και διαφέρει από όλες τις άλλες στο ότι µπορεί να χορηγηθεί από το στόµα. Παρά τα πλεονεκτήµατα που εµφανίζει, η τεµπιπενέµη δεν δρα ενάντια στην P. aeruginosa πιθανότατα εξ αιτίας του µεγάλου µεγέθους του µορίου της. 28

4.8. Ορισµός ορίων ευαισθησίας της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες Τα όρια ευαισθησίας των µικροοργανισµών στα αντιµικροβιακά καθορίζονται στην Ευρώπη και την Αµερική από την EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) και το CLSI (Cinical and Laboratory Standards Institute) αντίστοιχα. Τα όρια ευαισθησίας της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες που ίσχυαν µέχρι το 2011 φαίνονται στον Πίνακα 5. Μέχρι τη χρονιά εκείνη το CLSI 82, σε αντίθεση µε την EUCAST 83, δεν είχε ορίσει όρια ευαισθησίας για τη δοριπενέµη. Πίνακας 5. Όρια ευαισθησίας ιµιπενέµης, µεροπενέµης και δοριπενέµης κατά CLSI και EUCAST έως και το 2011. MIC: Minimum Inhibitory Concentration (Ελάχιστη ανασταλτική συγκέντρωση). Ως µέθοδος αναφοράς για τον προσδιορισµό της MIC θεωρείται η µέθοδος των µικροαραιώσεων σε ζωµό. Η διάµετρος της άλω αναστολής αναφέρεται στη µέθοδο διάχυσης χάρτινων δίσκων (Kirby-Bauer).S: sensitive, I: intermediate, R: resistant. 2011 CLSI EUCAST MIC (mg/l) Άλως αναστολής (mm) MIC (mg/l) Άλως αναστολής (mm) S I R δίσκος S I R S I R δίσκος S I R IMP 4 8 16 10µg 16 14-15 13 4 >8 10µg 20 <17 MEM 4 8 16 10µg 16 14-15 13 2 >8 10µg 24 <18 DOR - - - - - - 1 >4 10µg 22 <17 Το 2012 τα όρια του CLSI αυστηροποιήθηκαν 84 ενώ, η EUCAST ανακοίνωσε µία µόνο τροποποίηση στην αξιολόγηση της άλω αναστολής της δοριπενέµης µε τη µέθοδο της διάχυσης δίσκων 85 (Πίνακας 6). Πίνακας 6. Όρια ευαισθησίας ιµιπενέµης, µεροπενέµης και δοριπενέµης κατά CLSI και EUCAST από το 2012. Τονίζονται οι αλλαγές σε σχέση µε το 2011. 2012 CLSI EUCAST MIC (mg/l) Άλως αναστολής (mm) MIC (mg/l) Άλως αναστολής (mm) S I R δίσκος S I R S I R δίσκος S I R IMP 2 4 8 10µg 19 16-18 15 4 >8 10µg 20 <17 MEM 2 4 8 10µg 19 16-18 15 2 >8 10µg 24 <18 DOR 2 4 8 10µg 19 16-18 15 1 >4 10µg 25 <19 29

5. ΑΝΤΟΧΗ ΤΗΣ P. AERUGINOSA ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ Η ευρεία χρήση των καρµπαπενεµών έχει οδηγήσει τα τελευταία χρόνια στην ανάπτυξη ανθεκτικών στα αντιβιοτικά αυτά στελεχών P. aeruginosa ανά τον κόσµο 86. Η αντοχή της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες οφείλεται σε ενζυµικούς και σε µη ενζυµικούς µηχανισµούς 87. 5.1. Ενζυµικοί µηχανισµοί Οι β-λακταµάσες είναι ένζυµα που υδρολύουν τα β-λακταµικά αντιβιοτικά και αποτελούν τον κυριότερο µηχανισµό ανάπτυξης αντοχής των Gram αρνητικών βακτηρίων. Τα ένζυµα αυτά, κατατάσσονται βάσει δύο χαρακτηριστικών: της µοριακής τους δοµής και της λειτουργίας τους (Πίνακας 7) (Οι β-λακταµάσες που έχουν βρεθεί σε P. aeruginosa φαίνονται στον Πίνακα 8). Η κατάταξη µε βάση τη µοριακή δοµή (κατά Ambler) στηρίζεται στη γνώση της αλληλουχίας των αµινοξέων κάθε ενζύµου και στην οµολογία που εµφανίζουν διαφορετικά ένζυµα µεταξύ τους. Με τον τρόπο αυτό, οι β- λακταµάσες κατηγοριοποιούνται στις τάξεις A, C και D, οι οποίες φέρουν σερίνη στο ενεργό τους κέντρο και στις β-λακταµάσες τάξης B οι οποίες έχουν Zn 2+ στο ενεργό τους κέντρο και είναι γνωστές ως µεταλλο-β-λακταµάσες (MBLs) 88. Η λειτουργία των β-λακταµασών καθορίζεται από τα επίπεδα υδρόλυσης που επιτυγχάνουν σε ένα ευρύ φάσµα β-λακταµικών υποστρωµάτων, καθώς και από την επιδεκτικότητα τους στη δράση των αναστολέων των β-λακταµασών. Η λειτουργική κατάταξη (κατά Bush) διαχωρίζει τις β-λακταµάσες σε τέσσερις κατηγορίες (1 έως 4) 89. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι κεφαλοσπορινάσες, των οποίων η δράση δεν αναστέλλεται από το κλαβουλανικό οξύ, και στη δεύτερη οι πενικιλλινάσες, οι κεφαλοσπορινάσες και οι ευρέως φάσµατος β-λακταµάσες, των οποίων η δράση αναστέλλεται (πλήρως ή ασθενώς) από τους αναστολείς των β-λακταµασών. Τα µεταλλο-ένζυµα αποτελούν την τρίτη κατηγορία της κατάταξης κατά Bush, και υδρολύουν τις πενικιλλίνες, τις κεφαλοσπορίνες και τις καρµπαπενέµες και δεν αναστέλλονται παρά ελάχιστα από τους αναστολείς των β-λακταµασών. Στην τέταρτη κατηγορία τέλος, κατατάσσονται κάποιες σπάνιες πενικιλλινάσες οι οποίες δεν αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ. Αν και όλες οι MBLs υδρολύουν τις καρµπαπενέµες, εν τούτοις ο βαθµός της υδρόλυσης αυτής ποικίλει. Έτσι, η λειτουργική ταξινόµηση επεκτείνεται περαιτέρω µε βάση την υδρόλυση που επιτυγχάνει το κάθε ένζυµο στις καρµπαπενέµες και σε άλλα β- λακταµικά υποστρώµατα. Στην οµάδα 3α ανήκουν οι MBLs µε ευρύ φάσµα δράσεως. Στην 3b κατατάσσονται τα ένζυµα που εµφανίζουν δράση κυρίως καρµπαπενεµάσης και στην 3c τα ένζυµα εκείνα που υδρολύουν τις καρµπαπενέµες σε µικρό βαθµό συγκριτικά µε τα άλλα β-λακταµικά. Σε µοριακό επίπεδο, διακρίνονται τρεις ακόµη υποκατηγορίες ενζύµων της τάξης Β κατά Ambler. Στην υποτάξη Β1 (ευρύ φάσµα δράσης), η θέση 1 της σύνδεσης Zn 2+ αποτελείται από τρεις ιστιδίνες (His-116, His-118, His-196) και η θέση 2 από His-263, Cys-221 και Asp-120. Οι MBLs που πληρούν αυτά τα κριτήρια είναι οι IMP, VIM, GIM, SPM-1 και SIM-1. Στην υποτάξη Β2 η θέση 2 παραµένει ίδια ενώ στη θέση 1 η His-116 έχει αντικατασταθεί από Asp. Τα ένζυµα αυτά υδρολύουν µόνο τις 30

καρµπαπενέµες και δρουν µε ένα µόριο Zn 2+. Η σύνδεση και δεύτερου µορίου Zn 2+ έχει ως αποτέλεσµα την αναστολή δράσης τους. Χαρακτηριστικό ένζυµο της κατηγορίας αυτής είναι το SFH-1 της Serratia fonticola. Πίνακας 7. Κατάταξη β-λακταµασών 88,89. Ambler Bush Λειτουργικά χαρακτηριστικά β-λακταµικά υποστρώµατα Α 2a Πενικιλλινάσες περιορισµένου φάσµατος Πενικιλλίνες Gram θετικών βακτηρίων. Αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ. 2b Πενικιλλινάσες µε πιο ευρύ φάσµα κυρίως Πενικιλλίνες Gram αρνητικών βακτηρίων (TEM-1, TEM- Κεφαλοσπορίνες 2, SHV-1). Αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ. 2be 2br 2c 2e 2f B(1,2,3) 3a ESBLs. Αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ. Β-λακταµάσες που δεν αναστέλλονται από τους αναστολείς. Καρµπαπενικιλλινάσες που αναστέλλονται ασθενώς από το κλαβουλανικό οξύ. Κεφαλοσπορινάσες που αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ. Καρµπαπενεµάσες σερίνης που αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ. Μεταλλο-β-λακταµάσες που υδρολύουν όλα τα β-λακταµικά εκτός από τις µονοµπακτάµες. εν αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ. Πενικιλλίνες Ευρέως φασµατος κεφαλοσπορίνες Μονοµπακτάµες Πενικιλλίνες Πενικιλλίνες Καρµπαπενικιλλίνες Κεφαλοσπορίνες Πενικιλλίνες Κεφαλοσπορίνες Μονοµπακτάµες Καρµπαπενέµες Πενικιλλίνες Κεφαλοσπορίνες Καρµπαπενέµες 3b Ένζυµα µε δράση κυρίως καρµπαπενεµάσης Πενικιλλίνες Κεφαλοσπορίνες Καρµπαπενέµες 3c Ένζυµα µε µικρό βαθµό υδρόλυσης των καρµπαπενεµών C 1 Κεφαλοσπορινάσες που δεν αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ. D 2d Οξακιλλινάσες που αναστέλλονται ασθενώς από το κλαβουλανικό οξύ. - 4 Σπάνιες πενικιλλινάσες οι οποίες δεν αναστέλλονται από το κλαβουλανικό οξύ. Πενικιλλίνες Κεφαλοσπορίνες Καρµπαπενέµες Κεφαλοσπορίνες Πενικιλλίνες Οξακιλλίνες (Ορισµένες έχουν πιο ευρύ φάσµα) Πενικιλλίνες 31

Στην υποτάξη Β3, η θέση σύνδεσης Zn 2+ 1 είναι όµοια µε αυτήν της Β1, ενώ η Cys-221 της θέσης 2 έχει αντικατασταθεί από His. Τα ένζυµα τάξης Β3 υδρολύουν κυρίως κεφαλοσπορίνες και καρµπαπενέµες. Το µοναδικό έως τώρα ένζυµο της κατηγορίας είναι το L1 της S. maltophilia. Όπως και οι υπόλοιπες β-λακταµάσες, έτσι και οι MBLs µπορούν να διαχωριστούν σε χρωµοσωµατικές και σε πλασµιδιακές. Οι χρωµοσωµικές βρίσκονται συνήθως σε στελέχη του περιβάλλοντος και εικάζεται ότι η αιτία της ύπαρξης τους είναι ότι επιτελούν πιθανότατα κάποια άγνωστη ακόµη φυσιολογική κυτταρική λειτουργία. Οι πρώτες που ανακαλύφθηκαν είναι η BC II του Bacillus cereus 90 και η L1 της S. maltophilia 91. Πίνακας 8. β-λακταµάσες που έχουν ανευρεθεί σε στελέχη P. aeruginosa 36,95-109,114-136. Τάξη κατά Κατηγορία Ένζυµα Ambler κατά Bush A 2b TEM-1, -2, -90, -110, SHV-1 2be PER-1, -2 VEB-1, -2, -3 TEM-4, -21, -24, -42, -116 SHV-2a, -5, -12 GES/IBC-1, -2, -5, -8, -9 BEL LBT 802 CTXM-1, -2, -43 2c PSE-1 (CARB-2), PSE-4 (CARB-1), CARB-3, CARB-4, CARB-like, AER-1 2f KPC-2, -5 B 3 IMP-1, -4, -6, -7, -9, -10, -12, -13, -15, -16, -18, -22 VIM-1, -2, -3, -4, -5, -7, -8, -11, -13, -15, -16, -17, -18 SPM-1 GIM-1 AIM-1 NDM-1 FIM-1 C 1 AmpC D 2d OXA-1, -2, -3, -4, -5, -7, -9, -10, -12, -13, -20, -21, -30, -40, -46, -50, -198 LCR-1 NPS-1 Οι πλασµιδιακές MBLs είναι κλινικά πιο σηµαντικές γιατί έχουν τη δυνατότητα να µετακινούνται µέσω µεταθετών γενετικών στοιχείων 92. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τους τύπους IMP, VIM και GIM µεταφέρονται µε ιντεγκρόνια 93 τάξης 1 ως γονιδιακές κασέτες, αν και γονίδια IMP έχουν βρεθεί και σε ιντεγκρόνια τάξης 3. Οι γονιδιακές 32

κασέτες φέρουν και άλλα γονίδια τα οποία παρέχουν αντοχή στα β-λακταµικά καθώς και στις αµινογλυκοσίδες. Για να πραγµατοποιηθεί η µεταφορά τους σε έναν άλλο µικροοργανισµό απαιτείται η συνδροµή µεγαλύτερων µεταφερόµενων στοιχείων, όπως τα τρανσποζόνια και τα πλασµίδια. Έτσι, τα περισσότερα γονίδια που κωδικοποιούν MBLs έχουν βρεθεί σε πλασµίδια 120 έως 180 kb. Εξαίρεση σε αυτό φαίνεται να αποτελεί το γονίδιο bla SPM-1, το οποίο µαζί µε τα γειτονικά του γονίδια, συνιστούν µία µεταφερόµενη νησίδα παθογονικότητας που βρέθηκε σε ένα πλασµίδιο µεγέθους180 kb περίπου. Οι νησίδες παθογονικότητας αποτελούν διακριτά γενετικά στοιχεία ενός µεγάλου αριθµού παθογόνων, τα οποία κωδικοποιούν λοιµογόνους παράγοντες που απουσιάζουν από τα µη παθογόνα στελέχη του ιδίου ή στενά συγγενικών ειδών και αποκτώνται µε οριζόντια γονιδιακή µεταφορά. Στον Πίνακα 8 αναγράφονται οι β- λακταµάσες που έχουν ανευρεθεί σε στελέχη P. aeruginosa ανά τον κόσµο. Οι σπουδαιότερες β-λακταµάσες που αφορούν την ανάπτυξη αντοχής της P. aeruginosa αναφέρονται παρακάτω. 5.1.1. Καρµπαπενεµάσες τάξης B κατά Ambler (MBLs) Οι MBLs υδρολύουν όλα τα β-λακταµικά εκτός από την αζτρεονάµη. Τα γονίδια που τις κωδικοποιούν βρίσκονται στο χρωµόσωµα ή σε πλασµίδια, και µεταφέρονται µε ιντεγκρόνια ως γονιδιακές κασέτες. Τα στελέχη που παράγουν MBLs είναι συχνά πολυανθεκτικά, διότι στα ίδια ιντεγκρόνια βρίσκονται γονίδια αντοχής και σε άλλες τάξεις αντιβιοτικών 94. Οι καρµπαπενεµάσες της τάξης Β θεωρούνται κλινικά οι πιο σηµαντικές και ταξινοµούνται σε οκτώ τύπους: IMP, VIM, SPM, GIM, SIM, ΑΙΜ, NDM και FIM. IMP (active on imipenem) (1-44, www.lahey.org/studies/other.asp#table1) Η IMP-1 ήταν το πρώτο ένζυµο που βρέθηκε να παρέχει επίκτητη αντοχή στις καρµπαπενέµες, και αναφέρθηκε το 1991 στην Ιαπωνία 95. Έκτοτε έχουν βρεθεί και άλλα µέλη της οικογένειας των ενζύµων IMP (IMP-1, -4, -7, -9, -10, -11, -12, -13, -15, -16, - 18, -22) που παρέχουν αντοχή στις καρβαπενέµες σε στελέχη P. aeruginosa. Μετά το 2000 παρατηρείται διασπορά IMP αλλά και VIM σε όλες τις ηπείρους 96. VIM (Verona integron-encoded metallo-β-lactamase) (1-39) Η VIM-1 αποµονώθηκε για πρώτη φορά στη Βερόνα της Ιταλίας το 1997 σε στελέχη P. aeruginosa 97. Η οικογένεια των ενζύµων VIM περιλαµβάνει 39 µέλη, εκ των οποίων η VIM-2 φαίνεται να είναι η πιο συχνή παγκοσµίως. Στην Ελλάδα ενδηµούν οι VIM-1 98, - 2 99, -4 100 και -17 101. SPM-1 (Sao Paolo metallo-β-lactamase) Αποµονώθηκε για πρώτη φορά το 2002 στο Σάο Πάολο της Βραζιλίας 102 σε στελέχη P. aeruginosa και έκτοτε προκάλεσε νοσοκοµειακές λοιµώξεις µε υψηλή θνητότητα στη χώρα αυτή. Το 2010 η SPM-1 βρέθηκε στη Βασιλεία της Ελβετίας σε στελέχη P. aeruginosa που αποµονώθηκαν από ασθενή µε προηγούµενη νοσηλεία σε νοσοκοµείο της Βραζιλίας 103. 33

GIM-1 (German imipenemase) Αποµονώθηκε στη Γερµανία 104 το 2002 σε στελέχη P. aeruginosa και εµφανίζει 30% οµολογία µε τις VIM, 43% οµολογία µε τις IMP και 29% οµολογία µε την SPM. Μετά το 2002 δεν υπήρξε άλλη αναφορά για την P. aeruginosa. SIM-1 (Seoul imipenemase) Πρόκειται για µια οικογένεια MBLs, η οποία βρέθηκε στην Κορέα 105 το 2005. Η αναφορά αυτή δεν αφορούσε στελέχη P. aeruginosa, αλλά 7 στελέχη Acinetobacter spp. που παρήγαγαν την SIM-1. AIM-1 (Australian imipenemase) Η µοναδική αναφορά για την ΑΙΜ-1 καρµπαπενεµάση έγινε το 2007 από την Αυστραλία για στελέχη P. aeruginosa 106 και έκτοτε παραµένει η µοναδική παγκοσµίως. NDM (New Delhi Metallo-β-lactamase) (1-10) Βρέθηκε για πρώτη φορά το 2008 σε στέλεχος K. pneumoniae που αποµονώθηκε από Σουηδό ασθενή Ινδικής καταγωγής µε ουρολοίµωξη ύστερα από ταξίδι του στο Νέο ελχί. 107 Το γονίδιο NDM-1 στην συγκεκριµένη περίπτωση ήταν µεταφερόµενο µέσω ιντεγκρονίου και βρέθηκε επίσης σε πλασµίδιο στελέχους E. coli από τα κόπρανα του ίδιου ασθενούς. Το στέλεχος K. pneumoniae ήταν ευαίσθητο µόνο στην κολιστίνη ενώ το στέλεχος E. coli εµφάνιζε ευαισθησία επιπλέον στην αζτρεονάµη, την κεφεπίµη και τη σιπροφλοξασίνη. Η πρώτη αναφορά εύρεσης NDM-1 σε P. aeruginosa έγινε από τη Σερβία το 2011 108. FIM-1 (Florence imipenemase) Η FIM-1 αποτελεί τη νεότερη µεταλλο-β-λακταµάση. Αποµονώθηκε στη Φλωρεντία της Ιταλίας το 2013 από πολυανθεκτικό κλινικό στέλεχος P. aeruginosa που είχε µολύνει µεταµοσχευµένο ασθενή 109. Το νέο ένζυµο ανήκει στη µοριακή υποτάξη Β1, δεν υδρολύει την αζτρεονάµη, είναι µεταφερόµενο και εµφανίζει υψηλότερη οµολογία αµινοξέων µε τα NDM τύπου ένζυµα. ιασπορά των MBLs Μετά το 2000 παρατηρείται διασπορά IMP αλλά και VIM σε όλες τις ηπείρους 110 ενώ η παρουσία της SPM-1 σε στελέχη P. aeruginosa ανθεκτικά στις καρµπαπενέµες σε νοσοκοµεία της Βραζιλίας άγγιξε το 20%. Η αρχική εξάπλωση των MBLs έγινε πιθανότατα µεταξύ στελεχών P. aeruginosa και επεκτάθηκε αργότερα στα εντεροβακτηριακά. IMP έχουν βρεθεί επιπλέον σε στελέχη Pseudomonas putida, Serratia marcescens, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Achromobacter xylosoxidans, Alcaligenes xylosoxidans, Alcaligenes faecalis, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Providencia rettgeri, Acinetobacter lwoffi και Shigella flexneri. Ένζυµα της οικογένειας VIM έχουν ανιχνευτεί, εκτός από την P. aeruginosa, και σε Achromobacter xylosoxidans, Pseudomonas putida, Escherichia coli, Klebsiella 34

pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Enterobacter cloacae, Serratia marcescens, Pseudomonas stutzeri, Citrobacter freundii και Pseudomonas fluorescens. Στελέχη εντεροβακτηριακών που φέρουν το γονίδιο NDM-1 και είναι ευαίσθητα µόνο στην κολιστίνη και την τιγεκυκλίνη έχουν εξαπλωθεί στην Ινδία και το Πακιστάν ενώ πολυάριθµα στελέχη βρέθηκαν και στη Μεγάλη Βρετανία 111 κυρίως εξ αιτίας ιατρικού τουρισµού και ταξιδιωτών από την ινδική χερσόνησο. Εκτός από τα γένη K. pneumoniae, E. coli και P. aeruginosa, η NDM καρµπαπενεµάση έχει βρεθεί στα είδη Citrobacter freundii, Enterobacter cloacae και Morganella morganii. Μηχανισµός δράσης των MBLs Οι β-λακταµάσες υδρολύουν τον αµιδικό δεσµό C-N του β-λακταµικού δακτυλίου των β-λακταµικών αντιβιοτικών 112. Οι MBLs ειδικότερα, επιτυγχάνουν την υδρόλυση αυτή µέσω του µορίου Zn 2+ που βρίσκεται στο ενεργό τους κέντρο. Ο Zn 2+ προκαλεί πόλωση του αµιδικού δεσµού 113 ο οποίος στη συνέχεια διασπάται µε τη βοήθεια ενός ΟΗ που φέρεται συνδεδεµένο µε το µόριο του Zn 2+. Το γεγονός ότι ο Zn 2+ είναι απαραίτητος για την ενζυµική τους λειτουργία καθιστά τις ουσίες που δεσµεύουν το µέταλλο αυτό (EDTA και µερκαπτοπροπιονικό οξύ) ιδιαίτερα χρήσιµες στην ανίχνευση των MBLs. Παρά το γεγονός ότι οι MBLs παρουσιάζουν µεταξύ τους οµολογία αµινοξέων µέχρι και λιγότερο από 25%, εντούτοις έχουν όλες κοινή αββα τριτοταγή δοµή και η τρισδιάστατη διαµόρφωση του ενεργού τους κέντρου είναι ίδια. Επιπλέον, η πλαστικότητα του ενεργού αυτού κέντρου επιτρέπει τη χρήση πολλών β-λακταµικών ως υποστρώµατων και αποτελεί την εξήγηση της ευρύτητας του φάσµατος των β- λακταµασών της τάξης Β. Σε αντίθεση µε τις β-λακταµάσες σερίνης, δε σχηµατίζουν σταθερά παράγωγα ενζύµου-υποστρώµατος και δεν αδρανοποιούνται από τη προσθήκη αναστολέων όπως το κλαβουλανικό οξύ και η σουλµπακτάµη. Έτσι, οι MBLs υδρολύουν όλα τα β-λακταµικά αντιβιοτικά εκτός από την αζτρεονάµη. 5.1.2. Καρµπαπενεµάσες τάξης Α κατά Ambler Στην τάξη Α κατά Ambler κατατάσσονται οι εκτεταµένου φάσµατος β- λακταµάσες (Extended Spectrum Beta-Lactamases, ESBLs). Ως ESBLs χαρακτηρίζονται οι β-λακταµάσες που έχουν τη δυνατότητα να υδρολύουν εκτός των άλλων και τις κεφαλοσπορίνες ευρέως φάσµατος. Από την κατηγορία αυτή δύο ένζυµα (KPC και GES/IBC) έχουν επίσης και δράση καρµπαπενεµάσης. Το ενεργό κέντρο των ESBLs 35

περιέχει σερίνη και διασπά τον αµιδικό δεσµό C-N του β-λακταµικού δακτυλίου καταλύοντας την ίδια χηµική αντίδραση µε αυτή των MBLs µε τη διαφορά ότι στη συγκεκριµένη περίπτωση δεν υπάρχει ιόν µετάλλου για να προκαλέσει πόλωση του αµιδικού δεσµού. Τα ένζυµα της τάξης Α κατά Ambler αναστέλλονται από τους αναστολείς των β- λακταµασών, όπως το κλαβουλανικό οξύ και η ταζοµπακτάµη, γεγονός που καθιστά χρήσιµη τη διενέργεια του double-disk synergy test (DDST) κατά την ανίχνευσή τους. KPC (Klebsiella pneumoniae carbapenemase) (1-15) Οι β-λακταµάσες τύπου KPC υδρολύουν σε µεγάλο βαθµό την ιµιπενέµη, και δεν χρειάζονται επιπρόσθετους µηχανισµούς ώστε να προσδώσουν αντοχή στις καρµπαπενέµες. Επιπλέον, δεν επηρεάζονται παρά ελάχιστα από αναστολείς των β- λακταµασών και είναι µεταφερόµενες µέσω πλασµιδίου. Η πρώτη αναφορά για την ύπαρξη KPC-2 σε ανθεκτικά στις καρµπαπενέµες στελέχη P. aeruginosa έγινε από την Κολοµβία 114 και έκτοτε το πρόβληµα παραµένει εντοπισµένο στη Λατινική Αµερική 115. GES/IBC (Guiana extended spectrum) / (Integron-borne cefalosporinase) (1-23) Τα µέλη της οικογένειας β-λακταµασών GES/IBC δεν απαντώνται συχνά. Οι πρώτες αναφορές έγιναν το 2000 για την IBC-1 σε στέλεχος E. cloacae στην Ελλάδα 116 και GES-1 στη Γαλλική Γουιάνα 117. Για την P. aeruginosa έχουν αναφερθεί η GES-2 118 στη Νότιο Αφρική και η IBC-2 στην Ελλάδα 119. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τα συγκεκριµένα ένζυµα βρίσκονται σε πλασµίδια, ως γονιδιακές κασσέτες σε ιντεγκρόνια τάξης 1. Τα ένζυµα της οικογένειας GES/IBC έχουν πολύ µικρότερη δραστικότητα σε σχέση µε τις χρωµοσωµατικές β-λακταµάσες τάξης Α. Μπορούν όµως να γίνουν κλινικά σηµαντικά σε συνδυασµό µε τη µειωµένη διαπερατότητα της εξωτερικής µεµβράνης και την υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής στην P. aeruginosa. Άλλες β-λακταµάσες τάξης Α στην P. aeruginosa Τύποι TEM (Temonieras) (1-211) και SHV (Sulfhydryl variable) (1-177) Η ΤΕΜ-1 ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά σε E. coli από έλληνα ασθενή ονόµατι Τεµονιέρας και είχε δράση πενικιλλινάσης 120. Έκτοτε ένζυµα της οικογένειας ΤΕΜ εξαπλώθηκαν σε άλλα εντεροβακτηριακά καθώς και σε άλλα Gram αρνητικά βακτήρια. Σήµερα υπάρχουν καταγεγραµµένα 211 ένζυµα τύπου ΤΕΜ και ειδικά στην P. aeruginosa έχουν βρεθεί οι ΤΕΜ-4, -21, -24 και -42. 36

Οι ESBLs της οικογένειας SHVείναι λιγότερες (SHV-2 έως SHV-177) ενώ η SHV-1 121 που είναι χρωµοσωµατικής προέλευσης και υδρολύει την πενικιλλίνη G, αµινοπενικιλλίνη, καρβοπενικιλλίνη και κεφαλοσπορίνες 1 ης γενεάς συνδέεται συνήθως µε την K. pneumoniae. Στην Ελλάδα έχει αναφερθεί η SHV-5 σε επτά στελέχη P. aeruginosa µεταξύ 1998-2002 στην Αθήνα 122. H SHV-2a έχει βρεθεί στη Γαλλία και η SHV-12 στην Ταϋλάνδη 123. Οι τύποι ΤΕΜ και SHV έχουν σηµαντικές δοµικές και λειτουργικές οµοιότητες, ενώ, απαιτούνται µόνο λίγες (1 έως 4) υποκαταστάσεις αµινοξέων ώστε να µετατραπεί µία ΤΕΜ ή SHV πενικιλλινάση σε ESBL. Αν και τα αµινοξέα που υποκαθίστανται δεν εµπλέκονται άµεσα στην υδρόλυση του β-λακταµικού δακτυλίου, οι υποκαταστάσεις προκαλούν χωροταξικές αλλαγές στο ενεργό κέντρο ευνοώντας την υδρόλυση νεότερων κεφαλοσπορινών (συνήθως το ενεργό κέντρο διευρύνεται ώστε να υποδέχεται τις µεγάλες πλευρικές αλυσίδες των κεφαλοσπορινών). Τα γονίδια που κωδικοποιούν ESBLs τύπου ΤΕΜ και SHV βρίσκονται σε πλασµίδια τα οποία είναι συνήθως συζευκτικά και φέρουν πρόσθετα γονίδια αντοχής. PER (P. aeruginosa extended-spectrum RND-1) (1-7) Η PER-1 περιγράφηκε για πρώτη φορά ως ένζυµο χρωµοσωµιακής προέλευσης το 1992 σε P. aeruginosa που αποµονώθηκε από το ουροποιητικό σύστηµα τούρκου ασθενούς που νοσηλεύτηκε στο Παρίσι 124. Αργότερα αποδείχθηκε πως το γονίδιο blaper-1 είναι µεταφερόµενο µέσω πλασµιδίου στο γένος αυτό 125. Μετέπειτα µελέτες έδειξαν πως το γονίδιο που κωδικοποιεί την PER-1 ήταν ευρέως διαδεδοµένο στην Τουρκία και βρισκόταν στο 11% των στελεχών P. aeruginosa και στο 43% των στελεχών A. baumannii 126. Εκτός από τα δύο κυρίως γένη παθογόνων αζυµωτικών βακτηρίων η PER- 1 έχει βρεθεί και σε εντεροβακτηριακά εκτός όµως της K. pneumoniae. Μέχρι σήµερα έχουν βρεθεί επτά µέλη της οικογένειας PER τα οποία δεν σχετίζονται δοµικά µε τα ένζυµα τύπου TEM και SHV. VEB (Vietnamese extended-spectrum beta-lactamase) (1-9) H VEB-1 ενδηµεί σε ορισµένες περιοχές της Νότιο-Ανατολικής Ασίας. Το γονίδιο blaveb-1 βρέθηκε αρχικά σε E. coli που αποµονώθηκε από βιετναµέζο ασθενή το 1999 127 και την ίδια χρονιά σε δύο στελέχη P. aeruginosa από την Ταυλανδη 128. Έκτοτε, η VEB-1 β-λακταµάση έχει βρεθεί σε διάφορα γένη Gram αρνητικών στις ίδιες περιοχές καθώς και σποραδικά στο Κουβέιτ 129, την Ινδία 130 και τη Γαλλία 131. Συνολικά έχουν καταγραφεί επτά µέλη της ενζυµικής οικογένειας VEB. 5.1.3. β-λακταµάσες τάξης C κατά Ambler (Κεφαλοσπορινάσες) Η P. aeruginosa παράγει ένζυµα τάξης C κατά Ambler (AmpC) και για το λόγο αυτό εµφανίζει ενδογενή αντοχή στις αµινοπενικιλλίνες και στις περιορισµένου φάσµατος κεφαλοσπορίνες. Ο συνδυασµός όµως υπερέκφρασης AmpC κεφαλοσπορινασών µε µειωµένη διαπερατότητα εξωτερικής µεµβράνης και υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής µπορεί να οδηγήσει ακόµη και σε αντοχή στις καρµπαπενέµες 132. Το γεγονός αυτό καταδεικνύει ότι αρκετές AmpC κατέχουν ενδογενή, αλλά µικρής ισχύος ικανότητα υδρόλυσης των καρµπαπενεµών. Παρ όλα αυτά, οι AmpC δεν θεωρούνται καρµπαπενεµάσες. 37

Ιδιαίτερο ενδιαφέρον εξάλλου, παρουσιάζει η ύπαρξη επαγώγιµων AmpC β- λακταµασών σε στελέχη P. aeruginosa, η οποία δύναται να περιπλέξει τη θεραπευτική διαδικασία, καθώς η παραγωγή των ενζύµων αυτών επάγεται από συγκεκριµένα β- λακταµικά αντιβιοτικά µεταξύ των οποίων είναι και η ιµιπενέµη. Επιπλέον, στα στελέχη αυτά είναι δυνατό να συµβούν µεταλλάξεις σε ρυθµιστικά τµήµατα γονιδίων οδηγώντας σε σταθερή υπερπαραγωγή των AmpC β-λακταµασών 133. 5.1.4. Καρµπαπενεµάσες τάξης D κατά Ambler Στην τάξη D κατά Ambler ανήκουν οι οξακιλλινάσες (1-363), ορισµένες εκ των οποίων παρέχουν κάποιου βαθµού αντοχή στις καρµπαπενέµες. Τα ένζυµα αυτά συνδράµουν στην ανάπτυξη αντοχής στις καρµπαπενέµες, σε συνδυασµό µε άλλους µηχανισµούς (µειωµένη διαπερατότητα και/ή ενεργητική εκροή). Οι ΟΧΑ β-λακταµάσες µε δράση καρµπαπενεµάσης που έχουν αναφερθεί για την P. aeruginosa είναι οι ΟΧΑ- 40 134, -50 135 και -198 136. 5.2. Μη ενζυµικοί µηχανισµοί 5.2.1. Μειωµένη έκφραση ή απώλεια της πορίνης ΟprD Η πορίνη OprD είναι µια πρωτεΐνη της εξωτερικής µεµβράνης (outer membrane protein- OMP) (Εικόνα 1), µοριακής µάζας 48 kda (Πίνακας 8), γνωστή και ως D2 πορίνη. Εικόνα 1. Θέση της πορίνης OprD στην εξωτερική µεµβράνη της P. aeruginosa (Πηγή: Protein Data Bank Japan, pdbj.org/eprots/index_en.cgi?pdb%3a2odj). 38

Πίνακας 8. Βασικές πορίνες της εξωτερικής µεµβράνης της P. aeruginosa 36,137,138. Πορίνη Μοριακή Μάζα (kda) Γνωστή λειτουργία OprD 48 ίοδος καρµπαπενεµών OprF 38 Αδιευκρίνιστη OprM 50 Μέλος συστήµατος εκροής OprN 50 Μέλος συστήµατος εκροής OprJ 54 Μέλος συστήµατος εκροής TonB 37 Άγνωστη Η OprD είναι µία ειδική πορίνη η τρισδιάστατη δοµή της οποίας (Εικόνα 2) την καθιστά δίαυλο των καρµπαπενεµών και κυρίως της ιµιπενέµης. Η απώλεια της, που πιθανόν οφείλεται σε µετάλλαξη του γονιδίου OprD που την κωδικοποιεί, προκαλεί αντοχή στην ιµιπενέµη. Στελέχη µε απώλεια της πορίνης OprD παρουσιάζουν µειωµένη επιδεκτικότητα και στη µεροπενέµη, ενώ τα άλλα β-λακταµικά δεν επηρεάζονται. Η µείωση της έκφρασης ή η απώλεια της πορίνης OprD συµβαίνει συχνά κατά τη διάρκεια της θεραπείας µε ιµιπενέµη 137,138. Εικόνα 2. Τρισδιάστατη απεικόνιση της δοµής της OprD στην οποία διακρίνεται ο δίαυλος εισόδου στον περιπλασµατικό χώρο της P. aeruginosa (Πηγή: Protein Data Bank Japan, pdbj.org/eprots/index_en.cgi?pdb%3a2odj). 5.2.2. Υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής Τα συστήµατα αντλιών ενεργητικής εκροής (multidrug efflux systems-mex) αποτελούν έναν εξαιρετικά σηµαντικό µηχανισµό ανάπτυξης αντοχής κατά των αντιβιοτικών για την P. aeruginosa 139-142. Τα συστήµατα MexAB-OprM και MexXY- OprM σε συνδυασµό µε τη µειωµένη διαπερατότητα της εξωτερικής µεµβράνης προσφέρουν ενδογενή αντοχή σε πολλά αντιβιοτικά. Η υπερέκφραση των δυο προαναφερθέντων συστηµάτων ως συνέπεια µεταλλάξεων, καθώς και η έκφραση τεσσάρων ακόµη, των MexCD-OprJ, MexEF- OprN, MexJK-OprM και MexVW-OprM, παρέχουν επιπλέον επίκτητη αντοχή στην P. aeruginosa. Εκτός από τα αντιβιοτικά, οι αντλίες ενεργητικής εκροής αποβάλλουν από το βακτηριακό κύτταρο χρωστικές, αναστολείς του µεταβολισµού, οργανικούς διαλύτες και µόρια που εµπλέκονται στην επικοινωνία µεταξύ των κυττάρων. 39

Η εκροή αντιβιοτικών αφορά τις κινολόνες, τις αντιψευδοµοναδικές πενικιλλίνες, τις κεφαλοσπορίνες, τις αµινογλυκοσίδες και τις καρµπαπενέµες- κυρίως τη µεροπενέµη (Πίνακας 9). Οι αντλίες ενεργητικής εκροής κατατάσσονται σε διαφορετικές κατηγορίες από τις οποίες οι RND (Resistance-nodulation-division) ως συχνότερα απαντούµενες, έχουν κλινική σηµασία και έχουν περιγραφεί καλύτερα για την P. aeruginosa 143. Τα συστήµατα αυτά καταλύουν την εκροή των αντιβιοτικών χρησιµοποιώντας ενέργεια που προέρχεται από την ταυτόχρονη µεταφορά πρωτονίων. Αν και η ακριβής δοµή των αντλιών RND δεν έχει διευκρινιστεί πλήρως, εντούτοις θεωρείται ότι αποτελούνται από έναν µεταφορέα πρωτονίων της κυτταρικής µεµβράνης, µια περιπλασµατική πρωτεΐνη (Membrane fusion protein-mfp) και µια πρωτεΐνη-δίαυλο της εξωτερικής µεµβράνης, έτσι ώστε να είναι δυνατή η µεταφορά του αντιβιοτικού από το κυτταρόπλασµα στο εξωτερικό του κυττάρου (Εικόνα 3). Πίνακας 9. Βασικά συστήµατα αντλιών ενεργητικής εκροής της P. aeruginosa 27-32,36. Σύστηµα Οικογένεια αντλιών Υποστρώµατα MexAB-OprM Resistance Nodulation Division (RND) Κινολόνες Αµινογλυκοσίδες β-λακταµικά Τετρακυκλίνη Τιγεκυκλίνη MexCD-OprJ MexEF-OprN MexXY-OprM Resistance Nodulation Division (RND) Resistance Nodulation Division (RND) Resistance Nodulation Division (RND) Χλωραµφαινικόλη Κινολόνες β-λακταµικά Τετρακυκλίνη Τιγεκυκλίνη Χλωραµφαινικόλη Ερυθροµυκίνη Κινολόνες β-λακταµικά Τετρακυκλίνη Τιγεκυκλίνη Χλωραµφαινικόλη Κινολόνες Αµινογλυκοσίδες β-λακταµικά Τετρακυκλίνη Τιγεκυκλίνη Χλωραµφαινικόλη AmrAB-OprA Resistance Nodulation Division Αµινογλυκοσίδες (RND) PmpM Multidrug And Toxic compound Κινολόνες Extrusion (MATE) Mef(A) Major Facilitator Superfamily (MFS) Μακρολίδες ErmE PAF Small Multidrug Resistance (SMR) Αµινογλυκοσίδες 40

Εικόνα 3. οµή της αντλίας MexAB-OprM (Πηγή: www.funpecrp.com.br/gmr/year2003/ vol1-2/pdf/sim0002.pdf). 41

6. ΜΕΘΟ ΟΙ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗΣ ΜΗΧΑΝΙΣΜΩΝ ΑΝΤΟΧΗΣ ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ 6.1. Ανίχνευση ενζυµικών µηχανισµών Η ανίχνευση των β-λακταµασών αποτελεί σηµαντικό βήµα στην πρόληψη της περαιτέρω εξάπλωσής τους. Για το σκοπό αυτό εφαρµόζονται φαινοτυπικές δοκιµασίες της κλινικής µικροβιολογίας και στη συνέχεια, όπου είναι εφικτό, ακολουθεί η διερεύνηση τους µε µοριακές τεχνικές (PCR και αλληλούχηση νουκλεοτιδίων). 6.1.1. Φαινοτυπική ανίχνευση Μεταλλο-β-λακταµασών EDTA TEST 144 : Το EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) είναι ένα πολυαµινοκαρβοξυλικό οξύ, άχρωµο και διαλυτό στο νερό του οποίου η χρησιµότητα έγκειται στην ιδιότητά του να δεσµεύει ιόντα µετάλλων. EDTA Χάρη στην ιδιότητα αυτή, το EDTA χρησιµοποιείται σε πολλούς τοµείς όπως η βιοµηχανία, η γεωργία και η ιατρική. Στη µοριακή βιολογία και τη βιοχηµεία βρίσκει εφαρµογή στην απενεργοποίηση µεταλλο-ενζύµων, όπως οι MBLs, δεσµεύοντας το απαραίτητο για τη λειτουργία τους µέταλλο. Για τη διενέργεια του EDTA test προετοιµάζεται εναιώρηµα του µικροοργανισµού (0.5 McFarland) και απλώνεται σε Mueller-Hinton άγαρ µε τη χρήση αποστειρωµένου βαµβακοφόρου στειλεού. 42

Στο τρυβλίο τοποθετούνται ένας χάρτινος δίσκος ιµιπενέµης και ένας χάρτινος δίσκος κεφταζιδίµης. Πάνω και κάτω από τους δίσκους των αντιβιοτικών τοποθετούνται δίσκοι από διηθητικό χαρτί εµβαπτισµένοι σε διάλυµα EDTA (Εικόνα 4) Εικόνα 4. Σχηµατική αναπαράσταση διενέργειας του EDTA test (Οµιλία: Μελέτης Γ. «Μηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες» 30/01/2012, Πανεπιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ, Μετεκπαιδευτικά µαθήµατα εργαστηρίων Μικροβιολογίας και Βιοχηµείας). Το τρυβλίο επωάζεται για 24 ώρες σε θερµοκρασία 37 o C οπότε και ακολουθεί η αξιολόγηση του τεστ. Θετικό θεωρείται το τεστ όταν γύρω από τους δίσκους των αντιβιοτικών σχηµατιστεί άλως αναστολής δίκην κλειδαρότρυπας εξ αιτίας της απενεργοποίησης της MBL από το EDTA (Εικόνα 5). 43

Εικόνα 5. Αποτελέσµατα EDTA test. (+): Θετικό, (-): Αρνητικό (Φωτογραφία από τα πειράµατα της παρούσας µελέτης). 44

6.1.2. Φαινοτυπική ανίχνευση Ευρέως Φάσµατος β-λακταµασών DOUBLE-DISC SYNERGY TEST: Για την φαινοτυπική διερεύνηση της παραγωγής β-λακταµασών των οποίων η δράση αναστέλλεται από το κλαβουλανικό οξύ, και κυρίως των ευρέως φάσµατος β-λακταµασών, χρησιµοποιείται το Double-Disk Synergy Test (DDST). ΚΛΑΒΟΥΛΑΝΙΚΟ ΟΞΥ Για τη διενέργεια του DDST προετοιµάζεται εναιώρηµα του µικροοργανισµού (0.5 McFarland) και απλώνεται σε Mueller-Hinton άγαρ µε ενσωµατωµένη κλοξακιλλίνη για την εξουδετέρωση της δράσης των AmpC β-λακταµασών 145. Στο κέντρο του τρυβλίου τοποθετείται ένας χάρτινος δίσκος αµοξικιλλίνης/κλαβουλανικού (20 µg αµοξικιλλίνη + 10 µg κλαβουλανικό οξύ) και περιφερικά τοποθετούνται δίσκοι κεφταζιδίµης, ιµιπενέµης, κεφτριαξόνης, κεφοταξίµης, αζτρεονάµης και κεφεπίµης (Εικόνα 6). Εικόνα 6. Σχηµατική αναπαράσταση διενέργειας του DDST (Οµιλία: Μελέτης Γ. «Μηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες» 30/01/2012, Πανεπιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ, Μετεκπαιδευτικά µαθήµατα εργαστηρίων Μικροβιολογίας και Βιοχηµείας). 45

Το τρυβλίο επωάζεται για 24 ώρες σε θερµοκρασία 37 o C πριν από την αξιολόγηση του τεστ. Θετικό θεωρείται το τεστ όταν η άλως αναστολής γύρω από κάποιον από τους δίσκους των αντιβιοτικών εµφανίσει σαφή αύξηση προς τον δίσκο αµοξικιλλίνης/κλαβουλανικού (Εικόνα 7). Εικόνα 7. Αποτελέσµατα DDST. (+): Θετικό, (-): Αρνητικό (Φωτογραφία από τα πειράµατα της παρούσας µελέτης). 6.1.3. Φαινοτυπική ανίχνευση επαγώγιµων AmpC β-λακταµασών D-TEST: Ενοφθαλµίζεται εναιώρηµα 0,5 McFarland του µικροοργανισµού σε Mueller- Hinton άγαρ. Εν συνεχεία τοποθετείται ένας δίσκος ιµιπενέµης στο κέντρο του τρυβλίου ο οποίος χρησιµεύει ως επαγωγέας για την παραγωγή AmpC β-λακταµασών. Έχει βρεθεί ότι ειδικότερα για την P. aeruginosa η χρήση δίσκων κεφταζιδίµης και ταζοµπακτάµης ως υποστρωµάτων προσδίδει 100% ευαισθησία και ειδικότητα στη δοκιµασία 133. Συνεπώς, δίσκοι των δύο αυτών β-λακταµικών τοποθετούνται κατά προτίµηση περιφερικά του δίσκου της ιµιπενέµης (Εικόνα 8). 46

Εικόνα 8. Σχηµατική αναπαράσταση διενέργειας του D-test (Οµιλία: Μελέτης Γ. «Μηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες» 30/01/2012, Πανεπιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ, Μετεκπαιδευτικά µαθήµατα εργαστηρίων Μικροβιολογίας και Βιοχηµείας). Η δοκιµασία θεωρείται θετική όταν η άλως αναστολής ενός εκ των υποστρωµάτων εµφανίζει µειωµένη διάµετρο προς τον δίσκο του επαγωγέα (Εικόνα 9). Εικόνα 9. Θετικό (+) αποτέλεσµα D-test (Φωτογραφία από τα πειράµατα της παρούσας µελέτης). 47

Η απόδοση της δοκιµασίας περιορίζεται στις περιπτώσεις που το στέλεχος εµφανίζει πολύ υψηλού βαθµού ανθεκτικότητα έναντι των β-λακταµικών υποστρωµάτων ώστε να µην υπάρχει άλως αναστολής ή να µην είναι αξιολογήσιµη η πιθανή µείωση της διαµέτρου της προς τον δίσκο της ιµιπενέµης. Προβλήµατα αυτού του είδους είναι δυνατό να υπάρξουν σε περιπτώσεις στελεχών µε πολλαπλούς µηχανισµούς αντοχής ή σε στελέχη που παράγουν καρµπαπενεµάσες. 6.1.4. Άλλες φαινοτυπικές δοκιµασίες ανίχνευσης β-λακταµασών Εκτός από αυτές που προαναφέρθηκαν, ορισµένες ακόµη φαινοτυπικές δοκιµασίες είναι χρήσιµες κατά περίπτωση για την ανίχνευση καρµπαπενεµασών σε µικροοργανισµούς που παρουσιάζουν αντοχή στις καρµπαπενέµες. BORONIC ACID TEST 146-148 και COMBINATION MEROPENEM DISC TEST: Η δοκιµασία βορονικού οξέος (αναστολέας της KPC και β-λακταµασών τάξης Α και C) ΦΑΙΝΥΛ-ΒΟΡΟΝΙΚΟ ΟΞΥ προτείνεται για τη φαινοτυπική ανίχνευση στελεχών µε KPC καθώς είναι πιο απλή στην εκτέλεση της από το DDST και εµφανίζει λιγότερα ψευδώς θετικά αποτελέσµατα λόγω ύπαρξης άλλων ESBLs ή AmpC β-λακταµασών. Για τη διενέργεια της, προετοιµάζεται εναιώρηµα 0,5 McFarland του µικροοργανισµού και ενοφθαλµίζεται σε Mueller-Hinton άγαρ. Στο τρυβλίο τοποθετούνται δύο δίσκοι µεροπενέµης και στον έναν από αυτούς προστίθενται 20 µl βορονικού οξέως (Εικόνα 10). Η δοκιµασία θεωρείται θετική όταν η άλως αναστολής του δίσκου µεροπενέµης στον οποίο έχει προστεθεί βορονικό είναι µεγαλύτερη ( > 5 mm) από την άλω αναστολής του δίσκου στον οποίο δεν έχει προστεθεί ο αναστολέας (Εικόνα 11). 48

Εικόνα 10. Σχηµατική αναπαράσταση διενέργειας του boronic acid test (Οµιλία: Μελέτης Γ. «Μηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες» 30/01/2012, Πανεπιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ, Μετεκπαιδευτικά µαθήµατα εργαστηρίων Μικροβιολογίας και Βιοχηµείας). Εικόνα 11. Αποτελέσµατα boronic acid test. (+): Θετικό, (-): Αρνητικό (Οµιλία: Μελέτης Γ. «Μηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες» 30/01/2012, Πανεπιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ, Μετεκπαιδευτικά µαθήµατα εργαστηρίων Μικροβιολογίας και Βιοχηµείας). 49

Το combination meropenem disc test αποτελεί συνδυασµό των EDTA Test και Boronic Acid Test σε ένα τρυβλίο (Εικόνα 12). Εικόνα 12. Σχηµατική αναπαράσταση διενέργειας του combination meropenem disc test (Οµιλία: Μελέτης Γ. «Μηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες» 30/01/2012, Πανεπιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ, Μετεκπαιδευτικά µαθήµατα εργαστηρίων Μικροβιολογίας και Βιοχηµείας). Με τη δοκιµασία αυτή είναι δυνατό να ανιχνευθεί φαινοτυπικά σε ένα στέλεχος η ταυτόχρονη παραγωγή της KPC και µιας µεταλλο-β-λακταµάσης (Εικόνα 13). Τέτοια στελέχη έχουν περιγραφεί στην Ελλάδα µόνο για την K. pneumoniae 149 και είναι πολύ σπάνια για την P. aeruginosa παγκοσµίως 150,151. Εικόνα 13. Αποτελέσµατα combination meropenem disc test. Το στέλεχος 1 δεν παράγει καρµπαπενεµάσες, το στέλεχος 2 παράγει MBL, το στέλεχος 3 παράγει KPC και τα στελέχη 4 και 5 παράγουν MBL και KPC ταυτόχρονα (Οµιλία: Μελέτης Γ. «Μηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες» 30/01/2012, Πανεπιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ, Μετεκπαιδευτικά µαθήµατα εργαστηρίων Μικροβιολογίας και Βιοχηµείας). 50

HODGE TEST 152 : Είναι η δοκιµασία που προτείνεται από το CLSI για τη διερεύνηση παραγωγής καρµπαπενεµασών σε κλινικά στελέχη. Εµπεριέχει όµως ένα σηµαντικό µειονέκτηµα καθώς δεν είναι σε θέση να διαχωρίζει µεταξύ διαφορετικής κατηγορίας ενζύµων. Για τη διενέργεια της, ενοφθαλµίζεται εναιώρηµα 0,5 McFarland πρότυπου στελέχους E. coli ATCC 25922, το οποίο είναι εξ ορισµού ευαίσθητο στις καρµπαπενέµες, σε Mueller-Hinton άγαρ. Τοποθετείται ένας δίσκος µεροπενέµης και στη συνέχεια επιστρώνονται 3-5 αποικίες του προς διερεύνηση στελέχους όπως φαίνεται στην Εικόνα 14. Εικόνα 14. Σχηµατική αναπαράσταση διενέργειας του Hodge test (Οµιλία: Μελέτης Γ. «Μηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες» 30/01/2012, Πανεπιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ, Μετεκπαιδευτικά µαθήµατα εργαστηρίων Μικροβιολογίας και Βιοχηµείας). Παραµόρφωση της άλω αναστολής γύρω από το εξεταζόµενο βακτήριο είναι ενδεικτική για παραγωγή καρµπαπενεµάσης (Εικόνα 15). Εικόνα 15. Αποτελέσµατα Hodge test. (+): Θετικό, (-): Αρνητικό, (+/-) Αµφίβολο (Οµιλία: Μελέτης Γ. «Μηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες» 30/01/2012, Πανεπιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ, Μετεκπαιδευτικά µαθήµατα εργαστηρίων Μικροβιολογίας και Βιοχηµείας). 51

Το βασικό πλεονέκτηµα του Hodge Test είναι ότι επιτρέπει τον ταυτόχρονο έλεγχο περισσοτέρων του ενός στελεχών στο ίδιο τρυβλίο (Εικόνα 16). Εικόνα 16. Αποτελέσµατα Hodge test σε τρία στελέχη ταυτόχρονα. (+): Θετικό, (-): Αρνητικό (Οµιλία: Μελέτης Γ. «Μηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες» 30/01/2012, Πανεπιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ, Μετεκπαιδευτικά µαθήµατα εργαστηρίων Μικροβιολογίας και Βιοχηµείας). 6.1.5. Εµπορικά tests ανίχνευσης καρµπαπενεµασών Η σπουδαιότητα των καρµπαπενεµασών σε κλινικό επίπεδο και η ραγδαία εξάπλωσή τους οδήγησαν στην παρασκευή ορισµένων εµπορικών τεστ που ως στόχο έχουν την απλούστευση της διαδικασίας ανίχνευσης των ενζύµων αυτών. Εξυπακούεται βέβαια πως το κόστος διεξαγωγής των εµπορικών δοκιµασιών είναι αρκετά πιο υψηλό. E-TEST MBL 153 : Τα E-tests αποτελούν µια ευρέως διαδεδοµένη µέθοδο προσδιορισµού της MIC στα εργαστήρια κλινικής Μικροβιολογίας. Πρόκειται για ταινίες µε αυξανόµενη συγκέντρωση αντιβιοτικού που τοποθετούνται σε τρυβλίο στο οποίο έχει ενοφθαλµιστεί το προς διερεύνηση στέλεχος από εναιώρηµα 0,5 McFarland. Η MIC ορίζεται στη συγκέντρωση εκείνη του αντιβιοτικού όπου σταµατά η ελλειπτικού σχήµατος άλως αναστολής. Το E-test MBL αποτελείται από δύο µέρη. Στο ένα περιέχει ιµιπενέµη σε αυξανόµενες συγκεντρώσεις και στο άλλο ιµιπενέµη σε αυξανόµενες συγκεντρώσεις µαζί µε EDTA. Σε περίπτωση στελέχους που παράγει µεταλλο-β-λακταµάση, η ελλειπτική άλως αναστολής είναι πολύ µεγαλύτερη στην πλευρά της ταινίας που περιέχει το EDTA όπως και η MIC που διαβάζει ο παρατηρητής (Εικόνα 17). 52

Εικόνα 17. Θετικό E-test MBL (Πηγή: http://jcm.asm.org/content/40/8/2755/f1.large. jpg). KPC CHROMAGAR 154 : Τα χρωµογόνα υλικά πρωτοεµφανίστηκαν το 1990 και βασίζονται στην ενσωµάτωση χρωµογόνων υποστρωµάτων τα οποία υδρολύονται από συγκεκριµένα ένζυµα που παράγονται από κάποιους συγκεκριµένους µικροοργανισµούς µε αποτέλεσµα να προκύπτουν χρωµατισµένες αποικίες. Ιδανικά, τα υπόλοιπα µικρόβια παρεµποδίζονται από κάποια ουσία (συνήθως αντιβιοτικό) ή σχηµατίζουν άχρωµες αποικίες ή σχηµατίζουν αποικίες διαφορετικού χρώµατος. Το KPC Chromagar περιέχει ενσωµατωµένη καρµπαπενέµη και σε αυτό προκύπτουν αποικίες διαφορετικού χρώµατος για ανθεκτικά στελέχη Pseudomonas spp, E. coli και Klebsiella spp. Τα ανθεκτικά Enterobacter spp και Citrobacter spp έχουν το ίδιο χρώµα µε αυτό των αποικιών Klebsiella spp. Το χρωµογόνο αυτό άγαρ παρασκευάστηκε για την ανίχνευση στελεχών που παράγουν καρµπαπενεµάσες στα κόπρανα όµως, παρά το όνοµα του, ανιχνεύει εξίσου και τα στελέχη που παράγουν µεταλλο-β-λακταµάσες. 6.1.6. Μοριακή ανίχνευση β-λακταµασών POLYMERASE CHAIN REACTION: Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυµεράσης (polymerase chain reaction, PCR), είναι µια σύγχρονη µέθοδος για τη δηµιουργία αντιγράφων συγκεκριµένων τµηµάτων DNA, σε αριθµό ώστε αυτά να είναι ανιχνεύσιµα 155. Η PCR είναι µία µοριακή τεχνική η οποία προσφέρει ειδικότητα για κάθε ενζυµική οικογένεια. Επιπλέον, µε την PCR είναι δυνατή η επεξεργασία πολλών δειγµάτων ταυτόχρονα. Απαιτεί βέβαια τη γνώση και τη χρήση των κατάλληλων εκκινητών (primers) για κάθε προς ανίχνευση ένζυµο, ενώ δεν είναι σε θέση να διακρίνει επαρκώς τα ξεχωριστά ένζυµα της κάθε οικογένειας, καθώς και τα νέα ένζυµα που ενδεχοµένως να υπάρχουν σε κάποιο στέλεχος. Για το λόγο αυτό, συχνά η PCR δεν αρκεί για να ολοκληρωθεί η ανίχνευση και σε ορισµένες περιπτώσεις, χρειάζεται να γίνει επιπλέον και αλληλούχηση νουκλεοτιδίων. Αρχικά γίνεται αποµόνωση του γενετικού υλικού από τα βακτηριακά στελέχη και προετοιµάζεται το διάλυµα που περιέχει το υπό εξέταση δείγµα, την Taq πολυµεράση, νουκλεοτίδια, ιόντα µαγνησίου και τους εκκινητές. Ακολουθεί ενίσχυση του γονιδίου που κωδικοποιεί το προς διερεύνηση ένζυµο σε θερµικό κυκλοποιητή. Η διαδικασία αυτή ακολουθεί τα εξής στάδια: Στο πρώτο στάδιο, αυξάνεται η θερµοκρασία στους 94 96 C για 1-9 λεπτά, και αρχίζουν οι κύκλοι της PCR, αρχικά µε το πρώτο στάδιο της αποδιάταξης (denaturation) της διπλής έλικας του DNA (94-98 C για 20-40 δευτερόλεπτα). Κατά το δεύτερο στάδιο η θερµοκρασία µειώνεται στους 50 65 C για 20-40 δευτερόλεπτα, και πραγµατοποιείται η υβριδοποίηση (annealing) των εκκινητών 53

στις µονές πλέον αλυσίδες του DNA. Η θερµοκρασία υβριδοποίησης (annealing temperature, Ta) είναι κατά 5 C χαµηλότερη από τη θερµοκρασία αποδιάταξης των εκκινητών (melting temperature, Tm) που χρησιµοποιούνται. Κατά το τρίτο στάδιο της επιµήκυνσης (elongation), (70-75 C για 0,5-3 λεπτά), η Taq πολυµεράση συνθέτει συµπληρωµατικές αλυσίδες, χρησιµοποιώντας ως µήτρα τις µονές αλύσους του DNA που προέκυψαν κατά το στάδιο της αποδιάταξης, και ξεκινώντας από τους εκκινητές που υβριδίστηκαν στο αµέσως προηγούµενο στάδιο. Τα στάδια της αποδιάταξης, υβριδοποίησης και επιµήκυνσης συνιστούν ένα κύκλο της αντίδρασης. Μετά από ν παρόµοιους κύκλους προκύπτουν 2 ν αντίγραφα του προς ανίχνευση τµήµατος του DNA του βακτηρίου. Το τελικό στάδιο πραγµατοποιείται στους 70-74 C για 5-15 λεπτά και αποσκοπεί στην πλήρη επιµήκυνση όλων των υπολειπόµενων µονών αλυσίδων. Ακολουθεί ηλεκτροφόρηση των προϊόντων της PCR σε γέλη αγαρόζης µε την προσθήκη βρωµιούχου αιθιδίου. Η οπτικοποίηση του αποτελέσµατος γίνεται σε θάλαµο ακτινών UV όπου, οι ζώνες που προκύπτουν από την ηλεκτροφόρηση καθίστανται ορατές χάρη στην παρουσία του βρωµιούχου αιθιδίου. Σε περίπτωση θετικού αποτελέσµατος, το προϊόν της PCR είναι δυνατό να αλληλουχηθεί ώστε να καθοριστεί η ακριβής αλληλουχία των βάσεων του και να συγκριθεί µε τις ήδη γνωστές αλληλουχίες γονιδίων που κωδικοποιούν β-λακταµάσες. SEQUENCING 156 : Η αλληλούχηση (sequencing) πραγµατοποιείται σήµερα σε αυτόµατους αναλυτές (DNA sequencers). Η πιο συχνά εφαρµοζόµενη µέθοδος βασίζεται στην τεχνική τερµατισµού αλυσίδων DNA µε σηµασµένα νουκλεοτίδια. Κατ αυτήν, χρησιµοποιείται ειδικός εκκινητής για το προϊόν της PCR που θα αλληλουχηθεί. Ξεκινώντας από το σηµείο υβριδισµού αυτού του εκκινητή µε τη µία αλυσίδα του DNA, πραγµατοποιείται σύνθεση συµπληρωµατικής αλυσίδας από ελεύθερα νουκλεοτίδια σε τέσσερα διαφορετικά σωληνάρια. Σε κάθε ένα από τα σωληνάρια έχει προστεθεί, εκτός από τα τέσσερα είδη νουκλεοτιδίων (δεοξυνουκλεοτίδια-dntps) που αντιστοιχούν στις τέσσερις αζωτούχες βάσεις, και ένα ακόµη το οποίο είναι διδεοξυνουκλεοτίδιο (ddntp). Το νουκλεοτίδιο αυτό είναι σηµασµένο µε φθοριόχρωµα και εφόσον συνδεθεί στη νέα αλυσίδα, παρεµποδίζει την περαιτέρω επέκτασή της. Κάθε σωληνάριο περιέχει διδεοξυνουκλεοτίδια που φέρουν µόνο µία από τις τέσσερις αζωτούχες βάσεις (αδενίνη, θυµίνη, κυτοσίνη, γουανίνη) και διαφορετική από αυτήν που φέρουν τα διδεοξυνουκλεοτίδια των υπολοίπων τριών σωληναρίων. Με τον τρόπο αυτό, µε το πέρας της διαδικασίας, σε κάθε σωληνάριο βρίσκονται διαφορετικού µεγέθους τµήµατα DNA που έχουν ως κοινό χαρακτηριστικό το ότι η αλληλουχία τους τερµατίζει µε το ίδιο γνωστό νουκλεοτίδιο. Στη συνέχεια, πραγµατοποιείται παράλληλη ηλεκτροφόρηση των προϊόντων των τεσσάρων σωληναρίων όπου τα τµήµατα DNA µεταναστεύουν ανάλογα µε το µέγεθος τους. Από τα δεδοµένα της ηλεκτροφόρησης, του φθορισµού από τα σηµασµένα διδεοξυνουκλεοτίδια και µε τη χρήση κατάλληλου λογισµικού, προκύπτει τελικά η ακριβής αλληλουχία των βάσεων του προς διερεύνηση DNA. KPC MICROARRAYS 157 : Οι µικροσυστοιχίες DNA είναι συστήµατα που περιλαµβάνουν µικροσκοπικά πλακίδια (chips) στα οποία βρίσκονται ακινητοποιηµένα τµήµατα DNA µε συγκεκριµένη αλληλουχία βάσεων (probes) ικανά να υβριδιστούν υπό κατάλληλες συνθήκες µε συµπληρωµατικά τµήµατα DNA (cdna). Η τεχνολογία αυτή βρίσκει εφαρµογή στην ανίχνευση γονιδίων γενικά, πρόσφατα δε και στην ανίχνευση του 54

γονιδίου που κωδικοποιεί την παραγωγή της KPC. Παρά το υψηλό τους κόστος, οι µικροσυστοιχίες ενδέχεται να παίξουν σηµαντικό ρόλο στο µέλλον όσον αφορά την ανίχνευση καρµπαπενεµασών ή και άλλων γονιδίων αντοχής σε παθογόνα βακτήρια. 6.2. Ανίχνευση µειωµένης έκφρασης ή απώλειας της πορίνης ΟprD Φαινοτυπικά, αντοχή της P. aeruginosa στην ιµιπενέµη και ευαισθησία στην κεφταζιδίµη και πιπερακιλλίνη-ταζοµπακτάµη είναι ενδεικτική απώλειας της ΟprD, διότι η απώλεια της συγκεκριµένης πορίνης δεν παρέχει αντοχή στα άλλα β-λακταµικά εκτός από τις καρµπαπενέµες. Βέβαια, τα κριτήρια αυτά δεν είναι δυνατό να εφαρµοστούν για στελέχη µε πολλαπλούς µηχανισµούς αντοχής. ΑΝΟΣΟΑΠΟΤΥΠΩΣΗ: Η µέθοδος αναφοράς για τον έλεγχο της έκφρασης της ΟprD, όπως και για όλα τα µόρια πρωτεϊνικής φύσεως, είναι η µέθοδος ανοσοαποτύπωσης (Western blot). Κατ αυτήν, πραγµατοποιείται ταυτοποίηση µιας από τις διαχωρισµένες µε ηλεκτροφόρηση πρωτεΐνες ενός µείγµατος πρωτεϊνών µε τη χρήση ειδικού για την εκάστοτε πρωτεΐνη αντισώµατος σε φύλλο νιτροκυτταρίνης 158. Το αντίσωµα είναι συζευγµένο µε ραδιενεργό ισότοπο ή µε ανιχνεύσιµο ένζυµο ή µε κάποια φθορίζουσα χρωστική. Αν και εξαιρετικά ακριβής, η Western blot είναι ιδιαίτερα χρονοβόρος µέθοδος και απαιτεί τη χρήση ειδικών αντισωµάτων που, στην περίπτωση της ΟprD, δεν είναι άµεσα διαθέσιµα. SDS-PAGE: Ευρύτερα εφαρµοσµένη για την ανίχνευση της έκφρασης της ΟprD είναι η τεχνική της κάθετης SDS ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαµιδίου (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electroforesis ή SDS-PAGE) 100. Έπειτα από κατάλληλη φυγοκέντρηση εναιωρήµατος του µικροοργανισµού, οι κυτταροπλασµατικές µεµβράνες διαχωρίζονται και το µείγµα των πρωτεϊνών ηλεκτροφορείται σε γέλη πολυακρυλαµίδης παράλληλα µε τα ανάλογα δείγµατα ελέγχου (Εικόνα 18). Οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται µετακινούµενες διαµέσου του πορώδους υλικού, στα άκρα του οποίου έχει εφαρµοστεί ένα ηλεκτρικό πεδίο, κινούµενες µε διαφορετικές ταχύτητες λόγω των διαφορών στο σχήµα και το µέγεθός τους. Κατά την SDS-PAGE η παρουσία του δωδεκυλοθειικού νατρίου (SDS) καθιστά όλες τις πρωτεΐνες αρνητικά φορτισµένες οπότε και ο διαχωρισµός τους γίνεται αποκλειστικά µε βάση το µέγεθός τους. REVERSE TRANSCRIPTASE REAL TIME PCR: Εναλλακτικά ως προς τις τεχνικές πρωτεωµικής ανάλυσης, έχει χρησιµοποιηθεί µε καλά αποτελέσµατα η PCR ανάστροφης τρανσκριπτάσης πραγµατικού χρόνου (Reverse Transcriptase real time PCR) 132. Ως τεχνική, αποτελεί παραλλαγή της PCR πραγµατικού χρόνου (real time PCR) που µε τη σειρά της είναι παραλλαγή της απλής PCR. Κατά τη real time PCR, τα προϊόντα δεν ανιχνεύονται µετά το τέλος της αντίδρασης, αλλά σε πραγµατικό χρόνο ενόσο αυτή πραγµατοποιείται. Αυτό επιτυγχάνεται είτε µε τη χρήση µη ειδικών φθοριοχρωµάτων που συνδέονται µε δίκλωνο DNA (SYBR Green) είτε µε ειδικούς DNA-ανιχνευτές (probes) µε συγκεκριµένη αλληλουχία (ειδική για το προς ανίχνευση γονίδιο) και σηµασµένους µε φθορίζουσα ουσία. Παραδείγµατα τέτοιων ανιχνευτών είναι οι TaqMan probes, Molecular Beacons και Scorpions. Ένα επιπλέον πλεονέκτηµα της real time PCR 55

όµως, είναι το γεγονός ότι τα αποτελέσµατά της είναι ποσοτικά και όχι µόνο ποιοτικά όπως είναι της κλασικής PCR καθώς, ο αριθµός των αντιγράφων DNA που προκύπτουν από την αντίδραση είναι ανάλογος της αρχικής ποσότητας του προς ανίχνευση γονιδίου στο αρχικό µείγµα. Κατά την Reverse Transcriptase real time PCR πραγµατοποιείται ένα επιπλέον βήµα πριν από την έναρξη της real time PCR. Με τη χρήση της ανάστροφης τρανσκριπτάσης, το mrna µεταγράφεται σε συµπληρωµατικό DNA (complementary DNA ή cdna). Στη συνέχεια, το cdna υπόκειται σε real time PCR µε ειδικούς εκκινητές και έτσι, το τελικό αποτέλεσµα είναι ανάλογο της ποσότητας του προς ανίχνευση mrna στο αρχικό µείγµα. Εποµένως, µε την τεχνική αυτή ποσοτικοποιούνται τα µόρια mrna που προορίζονται για τη µετάφραση της γενετικής πληροφορίας του γονιδίου που είναι υπεύθυνο για τη σύνθεση της πορίνης ΟprD. Η PCR ανάστροφης τρανσκριπτάσης πραγµατικού χρόνου είναι µέθοδος ταχεία και αξιόπιστη, έχει όµως ως µειονέκτηµα το υψηλό κόστος. Εικόνα 18. Συσκευή κάθετης ηλεκτροφόρησης σε πηκτή πολυακρυλαµίδης (Φωτογραφία από τα πειράµατα της παρούσας µελέτης). 56

6.3. Ανίχνευση υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής Τα συστήµατα αντλιών ενεργητικής εκροής δρουν χάρη στη συντονισµένη δράση πρωτεϊνικών µορίων και ως εκ τούτου η Western blotting αποτελεί την ιδανική µέθοδο προσδιορισµού της έκφρασής τους. Επειδή όµως και σε αυτή την περίπτωση ισχύουν οι ίδιοι περιορισµοί µε αυτούς του προσδιορισµού της έκφρασης της πορίνης ΟprD, πρακτικά υιοθετούνται το φαινοτυπικό CCCP TEST και οι µέθοδοι ανίχνευσης DNA. 6.3.1. Φαινοτυπική ανίχνευση υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής CCCP TEST 159 : Το CCCP (Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone) είναι ένας αναστολέας της λειτουργίας των αντλιών ενεργητικής εκροής που µπορεί να προστεθεί στο θρεπτικό υλικό κατά την παρασκευή του. CCCP Για τη διενέργεια του CCCP TEST προετοιµάζονται τρυβλία Mueller-Hinton άγαρ µε ενσωµατωµένο CCCP. Το κάθε προς εξέταση στέλεχος ενοφθαλµίζεται (εναιώρηµα 0.5 McFarland) σε ένα τρυβλίο Mueller-Hinton άγαρ µε ενσωµατωµένο CCCP καθώς και σε ένα τρυβλίο Mueller-Hinton άγαρ χωρίς CCCP. Σε κάθε ένα από τα τρυβλία τοποθετείται ένας δίσκος µεροπενέµης (Εικόνα 19). Ακολουθεί επώαση για 24 ώρες σε θερµοκρασία 37 o C και στη συνέχεια αξιολογείται η πιθανή ύπαρξη διαφοράς στην άλω αναστολής γύρω από τον δίσκο µεροπενέµης. Η δοκιµασία θεωρείται θετική όταν η άλως αναστολής γύρω από το δίσκο µεροπενέµης έχει µεγαλύτερη διάµετρο στο τρυβλίο µε CCCP από αυτήν στο τρυβλίο στο οποίο δεν έχει προστεθεί ο αναστολέας των αντλιών (Εικόνα 20). 57

Εικόνα 19. Σχηµατική αναπαράσταση διενέργειας του CCCP test (Οµιλία: Μελέτης Γ. «Μηχανισµοί αντοχής της P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες» 30/01/2012, Πανεπιστηµιακό Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης ΑΧΕΠΑ, Μετεκπαιδευτικά µαθήµατα εργαστηρίων Μικροβιολογίας και Βιοχηµείας). Εικόνα 20. Αποτελέσµατα CCCP test. (+): Θετικό, (-): Αρνητικό (Φωτογραφία από τα πειράµατα της παρούσας µελέτης). 6.3.2. Μοριακή ανίχνευση υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής Η ύπαρξη των γονιδίων που κωδικοποιούν τις MexAB-OprM και MexXY- OprM µπορεί να ελεγχθεί µε απλή PCR χρησιµοποιώντας του κατάλληλους εκκινητές για τα γονίδια mexb και mexy αντίστοιχα. Η υπερέκφραση όµως των αντλιών ενεργητικής εκροής επιβεβαιώνεται µε PCR ανάστροφης τρανσκριπτάσης πραγµατικού χρόνου η οποία δείχνει την ύπαρξη αλλά και τη ποσοτική έκφραση µορίων mrna που προέρχονται από τα συγκεκριµένα γονίδια 160,161. 58

7. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ P. AERUGINOSA ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ ΣΤΗΝ ΕΥΡΩΠΗ ΚΑΙ ΤΗΝ ΕΛΛΑ Α ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΠΕΡΙΟ Ο ΤΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Το Ευρωπαϊκό Σύστηµα Επιτήρησης Αντιµικροβιακής Αντοχής (European Antimicrobial Resistance Surveillance System- EARSS ΝΕΤ) είναι ένα διεθνές δίκτυο που από το 1998 συλλέγει και καταγράφει επίσηµα δεδοµένα σχετικά µε την αντιµικροβιακή αντοχή στις χώρες που συµµετέχουν σε αυτό. Το 2005 η P. aeruginosa εντάχθηκε στους µικροοργανισµούς των οποίων η αντιµικροβιακή αντοχή καταγράφεται από το EARSS NET 162 δίνοντας ιδιαίτερη έµφαση στην εµφάνιση αντοχής στις καρµπαπενέµες. Την εξαετία 2005-2010 ο µέσος όρος ανίχνευσης ανθεκτικών στις καρµπαπενέµες στελεχών στο σύνολο των χωρών που συµµετέχουν στο EARSS NET κυµάνθηκε µεταξύ 22-24% επί του συνόλου των αποµονώσεων P. aeruginosa (Εικόνα 21). Εικόνα 21. Ποσοστά αντοχής στις καρµπαπενέµες επί των αποµονωθέντων στελεχών P. aeruginosa στο σύνολο των Ευρωπαϊκών χωρών που συµµετείχαν στο EARSS NET από το 2005 έως το 2010 (Πηγή: EARSS NET). Η Ελλάδα κατέχει την πρώτη θέση στους καταλόγους του EARSS NET 163,164 όσον αφορά τόσο την αντοχή στις καρµπαπενέµες όσο και την αποµόνωση πολυανθεκτικών στελεχών (ανθεκτικών σε τρεις ή περισσότερες κατηγορίες αντιµικροβιακών) µε ποσοστά αρκετά µεγαλύτερα από τον µέσο όρο του συνόλου των χωρών (Εικόνες 22-25). Αναγνωρίζοντας την επιτακτική ανάγκη για λήψη µέτρων περιορισµού της διασποράς των ανθεκτικών στις καρµπαπενέµες παθογόνων, το Κέντρο Ελέγχου και Πρόληψης Νοσηµάτων (ΚΕΕΛΠΝΟ) έθεσε σε εφαρµογή από το Νοέµβριο του 2010 το εθνικό σχέδιο δράσης «Προκρούστης» µε κύριους στόχους: α. τη συστηµατική επιτήρηση των λοιµώξεων από τρία πολυανθεκτικά Gram-αρνητικά βακτήρια (Klebsiella spp, Acinetobacter spp, Pseudomonas spp), µε αντοχή στις καρµπαπενέµες, µέσω της υποχρεωτικής δήλωσής τους στο ΚΕΕΛΠΝΟ, για τον 59

υπολογισµό και τη διαχρονική παρακολούθηση της επίπτωσης των λοιµώξεων αυτών στα ελληνικά νοσοκοµεία. β. την εφαρµογή µέτρων ελέγχου λοιµώξεων, µε έµφαση στην τήρηση των αρχών νοσηλείας σε συνθήκες µόνωσης (µονόκλινοι θάλαµοι ή συν-νοσηλεία) και στη συστηµατική εφαρµογή της υγιεινής των χεριών και των προφυλάξεων επαφής. 60

Εικόνα 22. Αντοχή % στις καρµπαπενέµες στην P. aeruginosa ανά χώρα τα έτη 2006-2009. NL: Ολλανδία, ΝΟ: Νορβηγία, SE: Σουηδία, Fl: Φινλανδία, UK: Μεγάλη Βρετανία, CY: Κύπρος, ΙΕ: Ιρλανδία, ΑΤ: Αυστρία, DE: Γερµανία, DK: ανία, ES: Ισπανία, PT: Πορτογαλία, ΕΕ: Εσθονία, Sl: Σλοβενία, FR: Γαλλία, ΜΤ: Μάλτα, LU: Λουξεµβούργο, PL: Πολωνία, HU: Ουγγαρία, CZ: Τσεχία, ΙΤ: Ιταλία, EL: Ελλάδα. (Πηγή: EARSS NET). NL NO SE Fl UK CY IE AT DE ES PT EE Sl FR MT PL HU CZ IT EL Στελέχη P. aeruginosa µε αντοχή στις καρµπαπενέµες (%) 61

Εικόνα 23. Αντοχή % στις καρµπαπενέµες στην P. aeruginosa ανά χώρα τα έτη 2007-2010. NL: Ολλανδία, ΝΟ: Νορβηγία, SE: Σουηδία, Fl: Φινλανδία, UK: Μεγάλη Βρετανία, CY: Κύπρος, ΙΕ: Ιρλανδία, ΑΤ: Αυστρία, DE: Γερµανία, DK: ανία, ES: Ισπανία, PT: Πορτογαλία, ΕΕ: Εσθονία, Sl: Σλοβενία, FR: Γαλλία, ΜΤ: Μάλτα, LU: Λουξεµβούργο, PL: Πολωνία, HU: Ουγγαρία, CZ: Τσεχία, ΙΤ: Ιταλία, EL: Ελλάδα. (Πηγή: EARSS NET). NO NL DK SE IE UK Fl DE AT PT CZ ES FR Sl EE IT MT PL HU LT CY EL Στελέχη P. aeruginosa µε αντοχή στις καρµπαπενέµες (%) 62

Εικόνα 24. Ποσοστά % πολυανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa ανά χώρα τα έτη 2006-2009. NL: Ολλανδία, ΝΟ: Νορβηγία, SE: Σουηδία, Fl: Φινλανδία, UK: Μεγάλη Βρετανία, CY: Κύπρος, ΙΕ: Ιρλανδία, ΑΤ: Αυστρία, DE: Γερµανία, DK: ανία, ES: Ισπανία, PT: Πορτογαλία, ΕΕ: Εσθονία, Sl: Σλοβενία, FR: Γαλλία, ΜΤ: Μάλτα, LU: Λουξεµβούργο, PL: Πολωνία, HU: Ουγγαρία, CZ: Τσεχία, ΙΤ: Ιταλία, EL: Ελλάδα. (Πηγή: EARSS NET). SE NO UK NL IE Fl AT EE DE CY Sl PT ES LU FR MT HU PL IT CZ EL Πολυανθεκτικά στελέχη P. aeruginosa (%) 63

Εικόνα 25. Ποσοστά % πολυανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa ανά χώρα τα έτη 2007-2010. NL: Ολλανδία, ΝΟ: Νορβηγία, SE: Σουηδία, Fl: Φινλανδία, UK: Μεγάλη Βρετανία, CY: Κύπρος, ΙΕ: Ιρλανδία, ΑΤ: Αυστρία, DE: Γερµανία, DK: ανία, ES: Ισπανία, PT: Πορτογαλία, ΕΕ: Εσθονία, Sl: Σλοβενία, FR: Γαλλία, ΜΤ: Μάλτα, LU: Λουξεµβούργο, PL: Πολωνία, HU: Ουγγαρία, CZ: Τσεχία, ΙΤ: Ιταλία, EL: Ελλάδα. (Πηγή: EARSS NET). SE NO NL DK UK IE Fl LU AT Sl DE LT ES PT CY FR HU IT PL MT CZ EL Πολυανθεκτικά στελέχη P. aeruginosa (%) 64

8. ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ P. AERUGINOSA ΜΕ ΑΝΤΟΧΗ ΣΤΙΣ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΕΣ ΚΑΙ ΑΝΑΛΩΣΗ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΩΝ ΣΤΟ Γ.Ν.Θ. ΙΠΠΟΚΡΑΤΕΙΟ Το Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης Ιπποκράτειο είναι ένα τριτοβάθµιο νοσοκοµειακό ίδρυµα 1024 κλινών στο οποίο νοσηλεύονται ασθενείς από τη Θεσσαλονίκη και την υπόλοιπη βόρεια Ελλάδα. Πρόκειται για το µεγαλύτερο νοσοκοµείο της περιοχής των Βαλκανίων στο οποίο κατά τη διάρκεια της µελέτης λειτουργούσαν: Μονάδα Εντατικής Θεραπείας (ΜΕΘ), Κλινική Μεταµοσχεύσεων, 4 Παθολογικές Κλινικές, Καρδιολογική Κλινική, Νεφρολογική Κλινική, Νευρολογική Κλινική, 3 Χειρουργικές Κλινικές, Νευροχειρουργική Κλινική, Ορθοπεδική Κλινική, 4 Γυναικολογικές Κλινικές, Ουρολογικό, Οφθαλµολογικό και Ωτορινολαρυγγολογικό τµήµα, ΜΕΘ Παίδων, Ογκολογική Κλινική Παίδων, Χειρουργική Παίδων, 2 Παιδιατρικές και 2 Νεογνολογικές Κλινικές. Στο νοσοκοµείο αυτό εµφανίζονται τα τελευταία χρόνια υψηλά επίπεδα αντιµικροβιακής αντοχής (σε όλα τα αντιµικροβιακά συµπεριλαµβανοµένων των καρµπαπενεµών) κυρίως στην K. pneumoniae 165-167 αλλά και σε άλλους παθογόνους µικροοργανισµούς. Ο συνολικός αριθµός των αποµονωθέντων στελεχών P. aeruginosa και τα ποσοστά αντοχής στις καρµπαπενέµες καταγράφηκαν από το 2003 έως το 2010 και είναι ανάλογα µε τα συνολικά ποσοστά της Ελλάδας σύµφωνα µε το EARS NET (Πίνακας 10 και Εικόνα 26). Πίνακας 10. Ποσοστά ανθεκτικών στελεχών P. aeruginosa στην ιµιπενέµη και τη µεροπενέµη στο Ιπποκράτειο Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης τη χρονική περίοδο 2003-2010 σύµφωνα µε τα αρχεία του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου του Νοσοκοµείου. ΕΤΟΣ ΣΥΝΟΛΙΚΟΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΑΠΟΜΟΝΩΘΕΝΤΩΝ ΣΤΕΛΕΧΩΝ % ΑΝΘΕΚΤΙΚΑ ΣΤΗΝ ΙΜΙΠΕΝΕΜΗ % ΑΝΘΕΚΤΙΚΑ ΣΤΗ ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗ 2003 721 34 ΧΩΡΙΣ ΣΤΟΙΧΕΙΑ 2004 840 35 ΧΩΡΙΣ ΣΤΟΙΧΕΙΑ 2005 745 39 34 2006 890 43 37 2007 907 39 36 2008 844 37 33 2009 934 37 34 2010 928 40 34 Επιπλέον, η συνολική ανάλωση καρµπαπενεµών µε αντιψευδοµοναδική δράση στο Γενικό Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης Ιπποκράτειο την περίοδο 2003-2010 ήταν υψηλή. Η ακριβής ανάλωση της κάθε καρµπαπενέµης ανά έτος όπως καταγράφηκε από τη στατιστική υπηρεσία του νοσοκοµείου φαίνεται στον Πίνακα 11. 65

Εικόνα 26. Γραφική αναπαράσταση του % ποσοστού αντοχής στελεχών P. aeruginosa στις καρµπαπενέµες την περίοδο 2003-2010. Πίνακας 11. Ανάλωση καρµπαπενεµών µε αντιψευδοµοναδική δράση και ηµέρες νοσηλείας ανά έτος στο Ιπποκράτειο Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης. ΕΤΟΣ ΗΜΕΡΕΣ ΝΟΣΗΛΕΙΑΣ ΙΜΙΠΕΝΕΜΗ 500 mg/vial ΠΟΣΟΤΗΤΑ ΑΝΑΛΩΣΗΣ ΦΑΜΑΚΟΥ (ΦΙΑΛΙ ΙΑ) ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗ ΜΕΡΟΠΕΝΕΜΗ 500 mg/vial 1gr/vial ΟΡΙΠΕΝΕΜΗ 500 mg/vial 2003 264.763 19.019 497 3.185 0 2004 255.139 19.918 1.119 4.532 0 2005 242.660 16.756 1.321 6.624 0 2006 244.785 16.307 1.597 9.127 0 2007 238.887 15.213 2.086 8.045 0 2008 234.117 15.444 2.085 10.269 0 2009 223.809 13.696 2.311 8.054 55 2010 218.716 8.165 2.535 5.980 377 66

ΕΙ ΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 67

68

9. ΥΛΙΚΟ ΚΑΙ ΜΕΘΟ ΟΙ 9.1. είγµα Το δείγµα της µελέτης αποτέλεσαν 180 στελέχη P. aeruginosa πολυανθεκτικά και ανθεκτικά στις καρµπαπενέµες που αποµονώθηκαν στο Ιπποκράτειο Νοσοκοµείο Θεσσαλονίκης από 4/1/2003 έως 13/1/2011. 30 από αυτά τα στελέχη αποµονώθηκαν µεταξύ 4/1/2003 και 4/3/2006 (δείγµα 2003-2006) ενώ τα υπόλοιπα 150 αποµονώθηκαν την περίοδο 14/11/2008-13/1/2011 (δείγµα 2008-2011). Τα στελέχη αποµονώθηκαν από καλλιέργειες διαφόρων υλικών που προέρχονταν από διαφορετικά τµήµατα του Νοσοκοµείου (Πίνακες 13-18). Πιο συγκεκριµένα, τα στελέχη του δείγµατος προέρχονται από: 55 καλλιέργειες βρογχικών εκκρίσεων, 33 καλλιέργειες ούρων, 27 αιµοκαλλιέργειες, 27 καλλιέργειες υλικού τραύµατος, 18 καλλιέργειες πτυέλων, 3 καλλιέργειες υλικού αποστήµατος, 1 καλλιέργεια εγκεφαλονωτιαίου υγρού, 2 καλλιέργειες φαρυγγικού επιχρίσµατος, 4 καλλιέργειες κεντρικού φλεβικού καθετήρα (ΚΦΚ), 2 καλλιέργειες υλικού κατακλίσεων, 3 καλλιέργειες ωτικών εκκρίσεων, 2 καλλιέργειες περιτοναϊκού υγρού, 1 καλλιέργεια ασκητικού υγρού, 1 καλλιέργεια πλευριτικού υγρού και 1 καλλιέργεια οφθαλµικού επιχρίσµατος (Πίνακας 12). Τα δείγµατα αυτά προήλθαν κατά 44,45% από τις Μονάδες Εντατικής Θεραπείας (ενηλίκων και παίδων), κατά 36,11% από τον Παθολογικό και 19,44% από τον Χειρουργικό Τοµέα. Τα στελέχη διατηρήθηκαν σε βαθιά κατάψυξη (- 70 o C) σε διάλυµα γλυκερόλης από τη στιγµή της αποµόνωσής τους και για όλη τη διάρκεια της µελέτης. Πίνακας 12. Κλινικά δείγµατα από τα οποία αποµονώθηκαν τα στελέχη της µελέτης. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΡΙΘΜΟΣ ΠΟΣΟΣΤΟ Βρογχικών εκκρίσεων 55 30,55% Ούρων 33 18,33% Αίµατος 27 15% Υλικού τραύµατος 27 15% Πτυέλων 18 10% Κεντρικού φλεβικού καθετήρα 4 2,22% Ωτικών εκκρίσεων 3 1,66% Υλικού αποστήµατος 3 1,66% Υλικού κατακλίσεων 2 1,11% Φαρυγγικού επιχρίσµατος 2 1,11% Περιτοναϊκού υγρού 2 1,11% Ασκητικού υγρού 1 0,55% Εγκεφαλονωτιαίου υγρού 1 0,55% Πλευριτικού υγρού 1 0,55% Οφθαλµικού επιχρίσµατος 1 0,55% ΣΥΝΟΛΟ 180 100% 69

Πίνακας 13. εδοµένα αποµόνωσης των στελεχών του δείγµατος 2003-2006 (στελέχη 1-30). ΜΕΘ: Μονάδα Εντατικής Θεραπείας, ΒΠ: Β Παθολογική, Π: Παθολογική, ΒΠΡΧ: Β Προπεδευτική Χειρουργική, ΒΠΠ: Β Προπεδευτική Παθολογική, ΑΠ: Α Παθολογική, ΝΧ: Νευροχειρουργική, ΓΠ : Γ Παιδιατρική, ΟΡΘ: Ορθοπαιδική, ΕΧ: Ε Χειρουργική. ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΥΛΙΚΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΕΤΟΣ 1 Ούρα ΜΕΘ 4/1 2003 2 Ούρα ΒΠ 26/3 2003 3 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 22/6 2003 4 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 31/7 2003 5 Αίµα Π 8/8 2003 6 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 26/8 2003 7 Υλ. τραύµατος ΒΠΡΧ 1/11 2003 8 Αίµα ΒΠ 6/11 2003 9 Ούρα Π 14/11 2003 10 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 12/11 2003 11 Υλ. τραύµατος ΒΠΡΧ 19/11 2003 12 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 11/12 2003 13 Αίµα ΜΕΘ 5/2 2004 14 Αίµα ΜΕΘ 25/2 2004 15 Ούρα ΑΠ 21/9 2004 16 Αίµα ΝΧ 18/1 2005 17 Πτύελα ΓΠ 23/2 2005 18 Υλ. τραύµατος ΟΡΘ 9/3 2005 19 Πτύελα ΓΠ 18/3 2005 20 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 24/5 2005 21 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 25/5 2005 22 Πτύελα ΑΠ 28/5 2005 23 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 31/5 2005 24 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 11/8 2005 25 Πτύελα ΒΠΠ 11/8 2005 26 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 9/9 2005 27 Ούρα ΒΠ 8/9 2005 28 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 23/11 2006 29 Υλ. τραύµατος ΝΧ 29/1 2006 30 Υλ. τραύµατος ΕΧ 4/3 2006 70

Πίνακας 14. εδοµένα αποµόνωσης των στελεχών του δείγµατος 2008-2011 (στελέχη 31-60). ΜΕΘ: Μονάδα Εντατικής Θεραπείας, ΒΠ: Β Παθολογική, Π: Παθολογική, ΒΠΡΧ: Β Προπεδευτική Χειρουργική, ΒΠΠ: Β Προπεδευτική Παθολογική, ΓΠ : Γ Παιδιατρική, ΟΡΘ: Ορθοπαιδική, ΕΧ: Ε Χειρουργική, ΜΕΘΠ : Μονάδα Εντατικής Θεραπείας Παίδων. ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΥΛΙΚΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΕΤΟΣ 31 Ούρα ΒΠ 14/11 2008 32 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 18/11 2008 33 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 19/11 2008 34 Πτύελα ΓΠ 19/11 2008 35 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 21/11 2008 36 Ασκητικό υγ. ΒΠΡΧ 21/11 2008 37 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 21/11 2008 38 Υλ. τραύµατος ΕΧ 25/11 2008 39 Αίµα ΜΕΘ 26/11 2008 40 Ούρα ΒΠΠ 27/11 2008 41 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 28/11 2008 42 Πτύελα ΓΠ 28/11 2008 43 Αίµα ΜΕΘ 2/12 2008 44 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 3/12 2008 45 Υλ. τραύµατος ΒΠΡΧ 4/12 2008 46 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 10/12 2008 47 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 10/12 2008 48 Υλ. τραύµατος ΜΕΘ 10/12 2008 49 Αίµα ΜΕΘ 17/12 2008 50 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 17/12 2008 51 Πτύελα ΒΠ 17/12 2008 52 Ούρα ΒΠ 29/12 2008 53 Αίµα ΜΕΘ 30/12 2008 54 Ούρα ΒΠ 19/12 2008 55 Πτύελα ΜΕΘΠ 29/12 2008 56 Αίµα Π 9/1 2009 57 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 12/1 2009 58 Ούρα ΒΠ 12/1 2009 59 Ούρα ΒΠΠ 13/1 2009 60 Υλ. τραύµατος ΟΡΘ 15/1 2009 71

Πίνακας 15. εδοµένα αποµόνωσης των στελεχών του δείγµατος 2008-2011 (στελέχη 61-90). ΚΦΚ: Κεντρικός Φλεβικός Καθετήρας, ΜΕΘ: Μονάδα Εντατικής Θεραπείας, ΒΠ: Β Παθολογική, Π: Παθολογική, ΒΠΡΧ: Β Προπεδευτική Χειρουργική, ΒΠΠ: Β Προπεδευτική Παθολογική, ΓΠ : Γ Παιδιατρική, ΕΧ: Ε Χειρουργική, ΜΕΘΠ : Μονάδα Εντατικής Θεραπείας Παίδων, ΑΧ: Α Χειρουργική, Π ΟΓΚΟΛ: Παιδοογκολογική, ΝΧ: Νευροχειρουργική. ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΥΛΙΚΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΕΤΟΣ 61 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 15/1 2009 62 Κατακλίσεις ΒΠ 16/1 2009 63 Υλ. τραύµατος ΜΕΘ 20/1 2009 64 Περιτον. υγρό ΜΕΘΠ 20/1 2009 65 Ούρα Π 21/1 2009 66 ΚΦΚ ΜΕΘ 27/1 2009 67 Απόστηµα ΑΧ 29/1 2009 68 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 3/2 2009 69 Πτύελα ΓΠ 3/2 2009 70 Βρογχικό έκκρ. Π ΟΓΚΟΛ 4/2 2009 71 Ούρα ΜΕΘ 5/2 2009 72 Υλ. τραύµατος ΜΕΘ 6/2 2009 73 Αίµα ΝΧ 9/2 2009 74 Ωτικό έκκρ. ΓΠ 9/2 2009 75 Υλ. τραύµατος ΒΠΡΧ 12/2 2009 76 Περιτον. υγρό ΒΠΡΧ 12/2 2009 77 Υλ. τραύµατος ΕΧ 12/2 2009 78 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 3/3 2009 79 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 4/3 2009 80 Πτύελα ΓΠ 11/3 2009 81 Οφθαλµικό έκκρ. Π 11/3 2009 82 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘΠ 17/3 2009 83 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘΠ 17/3 2009 84 Πτύελα ΓΠ 18/3 2009 85 Ούρα ΒΠΠ 19/3 2009 86 Βρογχικό έκκρ. ΓΠ 24/3 2009 87 Πτύελα ΓΠ 26/3 2009 88 Αίµα ΜΕΘ 1/4 2009 89 Φαρυγγικό έκκρ. ΒΠ 3/4 2009 90 Αίµα ΜΕΘ 3/4 2009 72

Πίνακας 16. εδοµένα αποµόνωσης των στελεχών του δείγµατος 2008-2011 (στελέχη 91-120). ΚΦΚ: Κεντρικός Φλεβικός Καθετήρας, ΕΝΥ: Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό, ΜΕΘ: Μονάδα Εντατικής Θεραπείας, ΒΠ: Β Παθολογική, Π: Παθολογική, ΒΠΡΧ: Β Προπεδευτική Χειρουργική, ΒΠΠ: Β Προπεδευτική Παθολογική, ΓΠ : Γ Παιδιατρική, ΕΧ: Ε Χειρουργική, ΑΠ: Α Παθολογική, ΟΡΘ: Ορθοπαιδική, ΝΧ: Νευροχειρουργική. ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΥΛΙΚΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΕΤΟΣ 91 Πτύελα ΓΠ 7/4 2009 92 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 8/4 2009 93 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 9/4 2009 94 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 9/4 2009 95 Ούρα Π 13/4 2009 96 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 14/4 2009 97 Υλ. τραύµατος ΕΧ 15/4 2009 98 ΚΦΚ ΜΕΘ 22/4 2009 99 Ούρα ΒΠ 24/4 2009 100 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 30/4 2009 101 ΚΦΚ ΜΕΘ 30/4 2009 102 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 30/4 2009 103 Υλ. τραύµατος ΒΠΡΧ 30/4 2009 104 ΕΝΥ ΝΧ 7/4 2009 105 Αίµα ΜΕΘ 7/4 2009 106 Ούρα ΑΠ 19/4 2009 107 Ούρα ΒΠΠ 22/4 2009 108 Πτύελα ΓΠ 9/6 2009 109 Υλ. τραύµατος ΜΕΘ 9/6 2009 110 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 15/6 2009 111 Υλ. τραύµατος ΒΠΡΧ 30/6 2009 112 Ούρα ΟΡΘ 2/7 2009 113 Αίµα Π 6/7 2009 114 Υλ. τραύµατος ΕΧ 21/7 2009 115 Ούρα ΑΠ 13/8 2009 116 Υλ. τραύµατος ΜΕΘ 24/8 2009 117 Υλ. τραύµατος ΝΧ 26/8 2009 118 Αίµα ΒΠΡΧ 26/8 2009 119 Ούρα ΒΠ 28/8 2009 120 Ούρα ΒΠ 29/10 2009 73

Πίνακας 17. εδοµένα αποµόνωσης των στελεχών του δείγµατος 2008-2011 (στελέχη 121-150). ΜΕΘ: Μονάδα Εντατικής Θεραπείας, ΒΠ: Β Παθολογική, Π: Παθολογική, ΒΠΡΧ: Β Προπεδευτική Χειρουργική, ΒΠΠ: Β Προπεδευτική Παθολογική, ΓΠ : Γ Παιδιατρική, ΕΧ: Ε Χειρουργική, ΑΠ: Α Παθολογική, ΟΡΘ: Ορθοπαιδική, ΝΧ: Νευροχειρουργική, ΜΕΘΠ : Μονάδα Εντατικής Θεραπείας Παίδων, ΜΤΧ: Κλινική Μεταµοσχεύσεων. ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΥΛΙΚΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΕΤΟΣ 121 Ούρα ΑΠ 30/10 2009 122 Ούρα ΒΠ 30/10 2009 123 Ούρα ΑΠ 30/10 2009 124 Ούρα ΟΡΘ 3/11 2009 125 Ούρα ΑΠ 10/11 2009 126 Ούρα ΒΠΠ 25/11 2009 127 Αίµα ΑΠ 27/11 2009 128 Υλ. τραύµατος ΒΠΡΧ 5/12 2009 129 Ούρα Π 11/12 2009 130 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 16/12 2009 131 Υλ. τραύµατος ΝΧ 5/1 2010 132 Ούρα ΒΠ 12/1 2010 133 Πτύελα ΓΠ 15/1 2010 134 Αίµα ΜΕΘ 18/1 2010 135 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘΠ 21/1 2010 136 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘΠ 11/2 2010 137 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘΠ 11/2 2010 138 Βρογχικό έκκρ. ΕΧ 1/3 2010 139 Αίµα ΜΕΘ 1/3 2010 140 Φαρυγγικό έκκρ. ΓΠ 3/3 2010 141 Πτύελα ΓΠ 3/3 2010 142 Αίµα ΝΧ 27/3 2010 143 Υλ. τραύµατος ΜΤΧ 19/4 2010 144 Υλ. τραύµατος ΜΤΧ 30/4 2010 145 Υλ. τραύµατος ΟΡΘ 4/5 2010 146 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 7/6 2010 147 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 7/6 2010 148 Πτύελα ΓΠ 7/6 2010 149 Πλευριτικό υγ. ΒΠΠ 8/6 2010 150 Αίµα ΒΠΠ 22/6 2010 74

Πίνακας 18. εδοµένα αποµόνωσης των στελεχών του δείγµατος 2008-2011 (στελέχη 151-180). ΚΦΚ: Κεντρικός Φλεβικός Καθετήρας, ΜΕΘ: Μονάδα Εντατικής Θεραπείας, ΒΠ: Β Παθολογική, Π: Παθολογική, ΒΠΠ: Β Προπεδευτική Παθολογική, ΓΠ : Γ Παιδιατρική, ΕΧ: Ε Χειρουργική, ΑΠ: Α Παθολογική, ΑΧ: Α Χειρουργική, ΝΧ: Νευροχειρουργική, ΜΕΘΠ : Μονάδα Εντατικής Θεραπείας Παίδων. ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΥΛΙΚΟ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΗΜΕΡΟΜΗΝΙΑ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗΣ ΕΤΟΣ 151 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 22/6 2010 152 Απόστηµα ΒΠΠ 9/7 2010 153 Ούρα ΜΕΘ 9/7 2010 154 Αίµα ΜΕΘ 21/8 2010 155 Αίµα ΒΠΠ 21/8 2010 156 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 4/9 2010 157 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 19/9 2010 158 Ωτικό έκκρ. ΓΠ 19/9 2010 159 Αίµα ΜΕΘ 8/10 2010 160 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 8/10 2010 161 Ούρα ΒΠ 19/10 2010 162 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘΠ 19/10 2010 163 Αίµα Π 19/10 2010 164 Ωτικό έκκρ. ΓΠ 15/10 2010 165 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 20/10 2010 166 Υλ. τραύµατος ΑΧ 4/10 2010 167 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 19/10 2010 168 Αίµα ΝΧ 22/10 2010 169 Ούρα ΑΠ 25/10 2010 170 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 25/10 2010 171 Υλ. Τραύµατος ΝΧ 3/11 2010 172 Αίµα Π 5/11 2010 173 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 5/11 2010 174 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 31/12 2010 175 ΚΦΚ ΜΕΘ 1/1 2011 176 Αίµα ΜΕΘ 3/1 2011 177 Βρογχικό έκκρ. ΜΕΘ 3/1 2011 178 Αίµα ΜΕΘ 4/1 2011 179 Απόστηµα ΕΧ 4/1 2011 180 Κατακλίσεις ΒΠΠ 13/1 2011 75

9.1.1. Αντιµικροβιακή αντοχή των στελεχών της µελέτης Ο αρχικός έλεγχος ευαισθησίας στα αντιβιοτικά (προσδιορισµός MIC και χρήση ορίων ευαισθησίας κατά CLSI) έγινε µε το αυτόµατο σύστηµα VITEK 2 (biomerieux, France) και σύµφωνα µε το πάνελ αντιβιοτικών που χρησιµοποιούνταν σε κάθε χρονική περίοδο για την P. aeruginosa. Τα στελέχη της περιόδου 2003-2006 ελέγχθηκαν κατά την αποµόνωσή τους έναντι των εξής αντιµικροβιακών: αµικασίνη, αµοξικιλλίνη/κλαβουλανικό, κεφαλοτίνη, κεφοταξίµη, κεφοξιτίνη, κεφταζιδίµη, σιπροφλοξασίνη, γενταµικίνη, ιµιπενέµη, ναλιδιξικό οξύ, νετιλµυκίνη, νιτροφουραντοΐνη, νορφλοξασίνη, οφλοξασίνη, πιπερακιλλίνη/ταζοµπακτάµη, τικαρσιλλίνη, τικαρσιλλίνη/κλαβουλανικό, τοµπραµυκίνη, τριµεθοπρίµη/ σουλφαµεθοξαζόλη και κεφακλόρη (Πίνακας 20). Τα στελέχη της περιόδου 2008-2011 ελέγχθηκαν για ύπαρξη αντοχής σε: αµικασίνη, αζτρεονάµη, κεφεπίµη, κεφταζιδίµη, σιπροφλοξασίνη, κολιστίνη, γενταµικίνη, ιµιπενέµη, ισεπαµυκίνη, µεροπενέµη, µινοκυκλίνη, πεφλοξασίνη, πιπερακιλλίνη, πιπερακιλλίνη/ταζοµπακτάµη, τικαρσιλλίνη, τικαρσιλλίνη/κλαβουλανικό, τοµπραµυκίνη, τριµεθοπίµη/σουλφαµεθοξαζόλη (Πίνακες 21-25). Τα ποσοστά ευαισθησίας των στελεχών στα αντιβιοτικά φαίνονται στον Πίνακα 19. Πίνακας 19. Ποσοστά ευαίσθητων στελεχών του δείγµατος στα αντιµικροβιακά (τονίζονται οι καρµπαπενέµες). ΑΝΤΙΒΙΟΤΙΚΟ ΕΥΑΙΣΘΗΤΑ ΣΤΕΛΕΧΗ (%) 2003-2006 2008-2011 ΣΥΝΟΛΟ Ιµιπενέµη 0 0 0 Μεροπενέµη 1,33 Μινοκυκλίνη 1,35 Τριµεθοπίµη/Σουλφαµεθοξαζόλη 3,33 1,33 1,66 Αζτρεονάµη 4,69 Τικαρσιλλίνη 3,33 2,7 2,77 Τικαρσιλλίνη/Κλαβουλανικό οξύ 3,33 2,7 2,77 Ισεπαµυκίνη 12,32 Πεφλοξακίνη 11,64 Σιπροφλοξασίνη 13,33 14 13,96 Κεφταζιδίµη 20 14 15 Κεφεπίµη 9,39 Τοµπραµυκίνη 16,66 14,66 15 Αµικασίνη 20 20 20 Γενταµικίνη 23,3 23,3 23,3 Πιπερακιλλίνη 44,52 Πιπερακιλλίνη/Ταζοµπακτάµη 74 60,95 63 Κολιστίνη 94,63 Αµοξικιλλίνη/Κλαβουλανικό 0 Κεφαλοτίνη 3,33 Κεφοταξίµη 0 Κεφοξιτίνη 0 Κεφακλόρη 0 Ναλιδιξικό Οξύ 0 Νετιλµυκίνη 6,66 Νιτροφουραντοΐνη 0 Νορφλοξασίνη 13,33 Οφλοξασίνη 13,33 76

Πίνακας 20. Ευαισθησία των στελεχών του δείγµατος στα αντιβιοτικά (στελέχη 1-30, περιόδου 2003-2006). AN: Αµικασίνη, AMC: Αµοξικιλλίνη/Κλαβουλανικό, CFLTN: Κεφαλοτίνη, CFTXME: Κεφοταξίµη, CFXTIN: Κεφοξιτίνη, CAZ: Κεφταζιδίµη, CIP: Σιπροφλοξασίνη, GEN: Γενταµικίνη, IMP: Ιµιπενέµη, NA: Ναλιδιξικό οξύ, NET: Νετιλµυκίνη, NIT: Νιτροφουραντοΐνη, NOR: Νορφλοξασίνη, OFL: Οφλοξασίνη, PIPTAZ: Πιπερακιλλίνη/ Ταζοµπακτάµη, TIC: Τικαρσιλλίνη, TICCLAC: Τικαρσιλλίνη/Κλαβουλανικό, TOB: Τοµπραµυκίνη, TRIMSULF: Τριµεθοπρίµη/Σουλφαµεθοξαζόλη, CEC: Κεφακλόρη. Στέλεχος AN AMC CFLTN CFTXME CFXTIN CAZ CIP GEN IMP NA 1 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 2 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 3 R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R 4 R R R R R R R S R R I R I R R R R R R R 5 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 6 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 7 R R R R R I R R R R R R R R S R R R R R 8 R R R R R I R S R R I R R R S R R R R R 9 R R R R R R R R R R R R R R R R R R R R 10 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 11 R R R R R R R R R R I R R R S R R R R R 12 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 13 R R R R R I R R R R R R R R I R R R R R 14 S R R R R R R S R R I R R R R R R S R R 15 R R R R R R R R R R R R R R I R R R R R 16 R R R R R R R R R R R R R R I R R R R R 17 S R R R R R S R R R R R S S S R R R R R 18 S R R R I S S S R R S R S S S R R S R R 19 R R R R R S S S R R S R S R S R R S R R 20 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 21 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 22 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 23 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 24 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 25 S R R R R S R S R R R R R R S S S S R S 26 S R R R R R S S R R R R S S S R R S R R 27 R R R R R R R R R R R R R R S R R R R R 28 R R I R R S R R R I R R R R - R R R R - 29 S R S R R S R R R R R R R S - R R I R - 30 R I R R R S R R R R R R R R - R R R R - NET NIT NOR OFL PIPTAZ TIC TICCLAC TOB TRIMSULF CEC 77

Πίνακας 21. Ευαισθησία των στελεχών του δείγµατος στα αντιβιοτικά (στελέχη 31-60, περιόδου 2008-2011). AN: Αµικασίνη, AZT: Αζτρεονάµη, CEF: Κεφεπίµη, CAZ: Κεφταζιδίµη, CIP: Σιπροφλοξασίνη, COL: Κολιστίνη, GEN: Γενταµικίνη, IMP: Ιµιπενέµη, ISE: Ισεπαµυκίνη, MER: Μεροπενέµη, MIN: Μινοκυκλίνη, PEF: Πεφλοξασίνη, PIP: Πιπερακιλλίνη, PIPTAZ: Πιπερακιλλίνη/Ταζοµπακτάµη, TIC: Τικαρσιλλίνη, TICCLAC: Τικαρσιλλίνη/Κλαβουλανικό οξύ, TOB: Τοµπραµυκίνη, TRIMSULF: Τριµεθοπίµη/ Σουλφαµεθοξαζόλη. Στέλεχος AN AZT CEF CAZ CIP COL GEN IMP ISE 31 S I S I R S S R R R R R S S R R I R 32 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 33 R I R S R S R I R R R R R R R R R R 34 I R R R S S R R R R R S R R R R S R 35 R R R S R S R I R R R R R R R R R R 36 R R R R R S R I R R R R R S R R R R 37 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 38 I R R R R S R I R R R R R S R R R R 39 R I I I R S R R R R R R S S R R R R 40 R I I I R S R R R R R R S S R R R R 41 R R R R R S R R R R R R R R R R R R 42 R R R R R S I R R R R R R R R R R R 43 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 44 R I I R R S R R R R R R S S R R R R 45 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 46 R I R S R S R R R R R R R R R R R R 47 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 48 R I I I R S S R R R R R S S R R R R 49 R I I I R S S R R R R R S S R R R R 50 R I R R R S S R R R R R S S R R R R 51 S I I R S S S R S R R S S S R R S R 52 R I R R R S S R R R R R R S R R R R 53 R I R R R S I R R R R R S S R R R R 54 R I I R R S S R R I R R S S R R R R 55 I R R R R S I R R R R R R R R R I R 56 R I I I R S R R R R R R S S R R R R 57 R R R R R S R I R R R R R R R R R R 58 R I R S R S R I R R R R R R R R R R 59 I R R R R S R I S R R R R R R R R R 60 R I R R R R R R R R R R S S R R R R MER MIN PEF PIP PIP TAZ TIC TIC CL AC TOB TRIM SULF 78

Πίνακας 22. Ευαισθησία των στελεχών του δείγµατος στα αντιβιοτικά (στελέχη 61-90, περιόδου 2008-2011). AN: Αµικασίνη, AZT: Αζτρεονάµη, CEF: Κεφεπίµη, CAZ: Κεφταζιδίµη, CIP: Σιπροφλοξασίνη, COL: Κολιστίνη, GEN: Γενταµικίνη, IMP: Ιµιπενέµη, ISE: Ισεπαµυκίνη, MER: Μεροπενέµη, MIN: Μινοκυκλίνη, PEF: Πεφλοξασίνη, PIP: Πιπερακιλλίνη, PIPTAZ: Πιπερακιλλίνη/Ταζοµπακτάµη, TIC: Τικαρσιλλίνη, TICCLAC: Τικαρσιλλίνη/Κλαβουλανικό οξύ, TOB: Τοµπραµυκίνη, TRIMSULF: Τριµεθοπίµη/ Σουλφαµεθοξαζόλη. Στέλεχος AN AZT CEF CAZ CIP COL GEN IMP ISE 61 S R R R R S R I R R R R R S R R R R 62 S - R R R S R I R R R R R S R R R R 63 R I I I R S S R R R R R S S R R R R 64 R I R R R S I R R I R R S S R R R R 65 R I R I R S I R R R R R S S R R R R 66 S S S S S S S R S R R S S S S S S R 67 R I R R R S R R R R R R R R R R R R 68 R I I R R S S R R R R R S S R R R R 69 S R R R S S R R R R R S R R I R S S 70 R R R R R R R I R R R R R R R R R R 71 R I S I R S S R R R R R S S R R R R 72 R I I I R S S R R R R R S S R R R R 73 R I S S R S R R R R R R S S S S R R 74 S I I R S S R R S I R S S S R R R R 75 S R R R R S R I R R R R R S R R R R 76 S R R R R S R I R R R R R S R R R R 77 S R R R R S R I R R R R R S R R R R 78 R I R R R S R R R R R R S S R R R R 79 R I R S R S R I R R R R R R R R R R 80 I R I I S S R I R S R S S S R R R R 81 R I R R R S R R R R R R S S R R R R 82 R R R I R S R I R R R R R R R R R R 83 R R I I I R I R R R S I R S R R I R 84 R S I S S S R I R R R S R S R R R R 85 S I I S R S R R S R R R R R R R R R 86 R R R S R S R R R R R R R R R R R R 87 R - I I R - I R - - R - - - - - S R 88 R I I R R S I R R I R R S S R R R R 89 S R S S I R R R R R R R R S S S R R 90 R I R R R S S R R R R R R S R R R R MER MIN PEF PIP PIP TAZ TIC TIC CL AC TOB TRIM SULF 79

Πίνακας 23. Ευαισθησία των στελεχών του δείγµατος στα αντιβιοτικά (στελέχη 91-120, περιόδου 2008-2011). AN: Αµικασίνη, AZT: Αζτρεονάµη, CEF: Κεφεπίµη, CAZ: Κεφταζιδίµη, CIP: Σιπροφλοξασίνη, COL: Κολιστίνη, GEN: Γενταµικίνη, IMP: Ιµιπενέµη, ISE: Ισεπαµυκίνη, MER: Μεροπενέµη, MIN: Μινοκυκλίνη, PEF: Πεφλοξασίνη, PIP: Πιπερακιλλίνη, PIPTAZ: Πιπερακιλλίνη/Ταζοµπακτάµη, TIC: Τικαρσιλλίνη, TICCLAC: Τικαρσιλλίνη/Κλαβουλανικό οξύ, TOB: Τοµπραµυκίνη, TRIMSULF: Τριµεθοπίµη/ Σουλφαµεθοξαζόλη. Στέλεχος AN AZT CEF CAZ CIP COL GEN IMP ISE 91 R R R R S S - R - R R R - - - - S - 92 R I I R R S S R R R R R S S R R R R 93 R I I R R S I R R R R R R S R R R R 94 R I R R R S R R R R R R S S R R R R 95 R I R R R S S R R R R R R S R R R R 96 R I I R R S S R R R R R S S R R R R 97 S I S I R S S R R R R R S S R R R R 98 R I R R R S I R R R R R S S R R R R 99 R R R R R S R R R R R R R S R R R R 100 S R R R R S R I R R R R R S R R R R 101 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 102 S R I R R S I R R R R R R R R R S R 103 R R R I R S R R R R R R R R R R R R 104 S R R R R S I R S R R R R R R R I R 105 S R R R R S R R S R R R R R R R I R 106 S R R R R S R I R R R R R S R R R R 107 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 108 - - - R - S R R - R - - - - - - - R 109 R I R R S S R R R R R S R R R R R R 110 R - I R R S R R R R R R S S R R R R 111 R I I R R S I R R I R R S S R R R R 112 R I I R R S R R R R R R S S R R R R 113 R I S S S R R I R R R S R R R R R R 114 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 115 R R R R R S R R R R R R R R R R R R 116 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 117 R R R R R S R I R R R R R R R R R R 118 R I R S R S R R R R R R R R R R R R 119 R I I R R S I R R R R R S S R R R R 120 R I I R R S I R R I R R S S R R R R MER MIN PEF PIP PIP TAZ TIC TIC CL AC TOB TRIM SULF 80

Πίνακας 24. Ευαισθησία των στελεχών του δείγµατος στα αντιβιοτικά (στελέχη 121-150, περιόδου 2008-2011). AN: Αµικασίνη, AZT: Αζτρεονάµη, CEF: Κεφεπίµη, CAZ: Κεφταζιδίµη, CIP: Σιπροφλοξασίνη, COL: Κολιστίνη, GEN: Γενταµικίνη, IMP: Ιµιπενέµη, ISE: Ισεπαµυκίνη, MER: Μεροπενέµη, MIN: Μινοκυκλίνη, PEF: Πεφλοξασίνη, PIP: Πιπερακιλλίνη, PIPTAZ: Πιπερακιλλίνη/Ταζοµπακτάµη, TIC: Τικαρσιλλίνη, TICCLAC: Τικαρσιλλίνη/Κλαβουλανικό οξύ, TOB: Τοµπραµυκίνη, TRIMSULF: Τριµεθοπίµη/ Σουλφαµεθοξαζόλη. Στέλεχος AN AZT CEF CAZ CIP COL GEN IMP ISE 121 R R R R R S R R R R R R R R R R R R 122 R I I S R S R R R S R R R R R R R R 123 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 124 S S S S S S S R S S R S S S S S S R 125 R R S I R S S R R R R R R R R R R R 126 R I I I R S S R R R R R S S R R R R 127 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 128 R I I I R S S R R R R R S S R R R R 129 S I I S S S I R R R R S S S S S S R 130 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 131 R I I I R S S R R R R R S S R R R R 132 R I R R R S S R R R R R R R R R R R 133 R R I S S S I R R R R S R R R R S R 134 - S R R R S R R - - - - - - - - - - 135 S R I I S S S R S R R S R R R R S R 136 R I R R R S S R R R R R R R R R R R 137 S I I S S S S R S R R I S S R R S R 138 R R R R R S R R R R R R R R R R R R 139 R R R R R S R I R R R R R R R R R R 140 I I S S R S R R I I R R R R R R S R 141 R S R S S S R I R R R S R R R R R R 142 R R R R R S I R R R R R R R R R R R 143 R I I R R S I R R R R R R S R R R R 144 R I I R R S I R R R R R R S R R R R 145 S I I I S S S R S I R S R R S S S R 146 R I R R R S S R R R R R R S R R R R 147 R I I I R S I R R R R R R S R R R R 148 S R I R S S R R R R R R R R R R R R 149 R I I I R S S R R R R R S S R R R R 150 S S S S S S S R S S R S R S R R S R MER MIN PEF PIP PIP TAZ TIC TIC CL AC TOB TRIM SULF 81

Πίνακας 25. Ευαισθησία των στελεχών του δείγµατος στα αντιβιοτικά (στελέχη 151-180, περιόδου 2008-2011). AN: Αµικασίνη, AZT: Αζτρεονάµη, CEF: Κεφεπίµη, CAZ: Κεφταζιδίµη, CIP: Σιπροφλοξασίνη, COL: Κολιστίνη, GEN: Γενταµικίνη, IMP: Ιµιπενέµη, ISE: Ισεπαµυκίνη, MER: Μεροπενέµη, MIN: Μινοκυκλίνη, PEF: Πεφλοξασίνη, PIP: Πιπερακιλλίνη, PIPTAZ: Πιπερακιλλίνη/Ταζοµπακτάµη, TIC: Τικαρσιλλίνη, TICCLAC: Τικαρσιλλίνη/Κλαβουλανικό οξύ, TOB: Τοµπραµυκίνη, TRIMSULF: Τριµεθοπίµη/ Σουλφαµεθοξαζόλη. Στέλεχος AN AZT CEF CAZ CIP COL GEN IMP ISE 151 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 152 R R R R R R R I R R R R R R R R R R 153 R R R R R R I R R R R R R R R R R R 154 R S I R R - - R R R R - - - - - - - 155 R I I R R S I R R R R R R R R R R R 156 S R S R R S S R S R R I S S R R S R 157 S R I I S S R R S R R R I I R R S R 158 R R I I I R I R R R S I R R R R I S 159 R I R R R S S R R R R R R R R R R R 160 R I R R R S R R R R R R R R R R R R 161 R I R S I S R R R R R R R R R R R R 162 S R S I R S I R S R R R S S R R S R 163 R I I I R S R R R R R R R S R R R R 164 S R R R S S S R S R R S R R R R S R 165 R I R R R S I R R R R R R R R R R R 166 R I I I R S R R R R R R R R R R R R 167 R I I I R S R R R R R R R R R R R R 168 R I I I R S R R R R R R R R R R R R 169 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 170 R I R R I S R R R R R R S S R R R R 171 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 172 R I I I R S I R R R R R R S R R R R 173 R R S S R S S R R R R R S S R R R R 174 R R R R R S R R S R R R S S R R S R 175 R I R R R S I R R R R R R R R R R R 176 I R I R S S R R R R R R S S R R S R 177 R I I I R S R R R R R R R R R R R R 178 R I I R R S S R S R R R S S R R S R 179 R I I I R S I R R R R R S S R R R R 180 R I R I R S R I R I R R R R R R R R MER MIN PEF PIP PIP TAZ TIC TIC CL AC TOB TRIM SULF 82

9.2. Προσδιορισµός της MIC ιµιπενέµης και µεροπενέµης µε τη µέθοδο των µικροαραιώσεων σε ζωµό Για τον προσδιορισµό της MIC των στελεχών της µελέτης µε τη µέθοδο των µικροαραιώσεων σε ζωµό, 168 προετοιµάστηκαν αποστειρωµένα σωληνάρια µε 50 µl θρεπτικό ζωµό (Cation adjusted Mueller-Hinton 2 Broth) και συγκεντρώσεις αντιβιοτικού 0 (ως control ελέγχου ανάπτυξης), 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128 και 256 mg/l. Για κάθε ένα στέλεχος, προστέθηκαν 50µl ζωµού (Mueller-Hinton Broth) µε 10 6 Colony Forming Units (CFU)/ml βακτηρίων που προέρχονταν από λογαριθµική φάση ανάπτυξης υγρής καλλιέργειας (3 ώρες επώασης σε 37 ο C). Η συγκέντρωση 10 6 CFU/ml επιτεύχθηκε µε την πραγµατοποίηση κατάλληλων αραιώσεων ξεκινώντας από αρχικό εναιώρηµα θολερότητας 0,5 MacFarland που αντιστοιχεί σε συγκέντρωση 1,5x10 8 CFU/ml περίπου. Τα σωληνάρια επωάστηκαν για 18 ώρες σε θερµοκρασία 37 ο C. Ως MIC ορίστηκε η ελάχιστη συγκέντρωση του αντιβιοτικού κατά την οποία παρατηρήθηκε αναστολή της ανάπτυξης του µικροοργανισµού µε γυµνό µάτι. Το πρότυπο στέλεχος Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 84,168,169 χρησιµοποιήθηκε ως control ελέγχου της µεθόδου (MIC ιµιπενέµης 1-4 mg/l, MIC µεροπενέµης 0,25-1 mg/l). Οι µικροαραιώσεις σε ζωµό αποτελούν τη µέθοδο αναφοράς για τον προσδιορισµό της MIC και παρέχουν σαφώς µεγαλύτερη ακρίβεια σε σχέση µε το Vitek 2 καθώς το αυτόµατο σύστηµα προσδιορίζει την MIC έως συγκέντρωση αντιβιοτικού 16 mg/l. Για το λόγο αυτό, για τη συνέχιση της παρούσας µελέτης, και όπου υπήρξε απόκλιση, ελήφθησαν υπ όψη οι τιµές MIC που προέκυψαν µε τη µέθοδο αναφοράς. 9.3. ιενέργεια φαινοτυπικών δοκιµασιών ανίχνευσης καρµπαπενεµασών Όλα τα στελέχη υποβλήθησαν σε EDTA TEST για τη φαινοτυπική διερεύνηση της παραγωγής µεταλλο-β-λακταµασών (καρµπαπενεµάσες τάξης Β κατά Ambler) και σε DDST για τη φαινοτυπική διερεύνηση της παραγωγής καρµπαπενεµασών τάξης Α κατά Ambler. Για τη διενέργεια του EDTA TEST επιστρώθηκε εναιώρηµα 0,5 MacFarland του µικροοργανισµού σε τρυβλίο Mueller-Hinton agar και χρησιµοποιήθηκαν δισκία ιµιπενέµης και κεφταζιδίµης καθώς και δίσκοι διηθητικού χαρτιού εµβαπτισµένοι σε διάλυµα EDTA. Μετά από επώαση 24 ωρών στους 37 ο C, η δοκιµασία θεωρήθηκε θετική στην περίπτωση σχηµατισµού της χαρακτηριστικής άλω αναστολής δίκην κλειδαρότρυπας. Για τη διενέργεια του DDST προετοιµάστηκαν τρυβλία Mueller-Hinton agar µε ενσωµατωµένη κλοξακιλλίνη σε συγκέντρωση 200µg/ml (προσθήκη διαλύµατος 1 ml που περιέχει 80 mg κλοξακιλλίνης σε 399 ml Mueller-Hinton agar σε υγρή φάση). Σε αυτά επιστρώθηκε εναιώρηµα 0,5 MacFarland του µικροοργανισµού και χρησιµοποιήθηκαν δισκία αµοξικιλλίνης/κλαβουλανικού, ιµιπενέµης, κεφταζιδίµης, κεφτριαξόνης, κεφοταξίµης, κεφεπίµης και αζτρεονάµης. Τα τρυβλία επωάστηκαν για 24 ώρες σε 37 ο C και η δοκιµασία θεωρήθηκε θετική στις περιπτώσεις που παρατηρήθηκε 83

αύξηση της άλω αναστολής ενός εκ των δίσκων των αντιβιοτικών προς τον κεντρικό δίσκο αµοξικιλλίνης/κλαβουλανικού. 9.4. Ανίχνευση καρµπαπενεµασών µε µοριακές µεθόδους Τα στελέχη µε θετικό EDTA TEST θεωρήθηκε ότι παράγουν µεταλλο-βλακταµάση και ελέγχθηκαν µε PCR για τα γονίδια VIM-1, VIM-2, IMP και NDM-1. Η επιλογή βασίστηκε στο ότι γονίδια τύπου VIM ενδηµούν στον ελλαδικό χώρο ενώ γονίδια τύπου IMP έχουν βρεθεί συχνά σε στελέχη P. aeruginosa ανά τον κόσµο αν και όχι στην Ελλάδα. Η επιλογή για το NDM-1 γονίδιο έγινε λόγω της κοντινής ως προς την Ελλάδα µοναδικής ανεύρεσής του σε P. aeruginosa (Σερβία). Τα στελέχη µε θετικό DDST θεωρήθηκε ότι πιθανώς να παράγουν β-λακταµάση τάξης Α κατά Ambler και για το λόγο αυτό ελέγχθηκαν αρχικά για τις µοναδικές καρµπαπενεµασες αυτής της κατηγορίας (KPC και GES/IBC) και στη συνέχεια για τα γονίδια TEM και SHV λόγω αυξηµένης συχνότητας ανίχνευσής τους στην Ελλάδα. Τα στελέχη ανακαλλιεργήθηκαν σε αιµατούχο άγαρ και µετά από 18 ώρες επώασης σε 37 ο C προετοιµάστηκε εναιώρηµα για το κάθε προς εξέταση στέλεχος (1 αποικία µικροοργανισµού σε 100 µl PCR water). 2 µl από το εναιώρηµα αυτό προστέθηκαν σε 23 µl από το Master Mix της αντίδρασης (αντιδραστήρια Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Η σύσταση του Master Mix που χρησιµοποιήθηκε ήταν: 2,5 µl 10xPCR Buffer ανά στέλεχος 1µl MgCl 2 50ml/M ανά στέλεχος 0,5µl dntps 10µM ανά στέλεχος 1µl Primers F 10µΜ ανά στέλεχος 1µl Primers R 10µΜ ανά στέλεχος 0,15 µl Taq πολυµεράση ανά στέλεχος Συµπλήρωµα µε PCR water µέχρι τελικού όγκου 25 x αριθµό στελεχών Κατά την παρασκευή του Master Mix υπολογιζόταν κάθε φορά ένα επιπλέον στέλεχος πέρα από αυτά που συµµετείχαν στην αντίδραση ώστε να προβλεφθούν πιθανές απώλειες κατά την τεχνική διαδικασία. Οι εκκινητές και οι συνθήκες των PCRs που πραγµατοποιήθηκαν ήταν: 1. PCR για VIM-1 Εκκινητές 170 : F 5 -GTTAAAAGTTATTAGTAGTTTATTG-3 R 5 -CTACTCGGCGACTGAGC-3 94 o C X 3 min 94 o C X 1 min 55 o C X 1 min 72 o C X 2 min 72 o C X 7 min 35 κύκλοι 84

2. PCR για VIM-2 Εκκινητές 170 : F 5 -ATGTTCAAACTTTTGAGTAAG-3 R 5 -CTACTCAACGACTGAGCG-3 94 o C X 5 min 94 o C X 40 sec 60 o C X 40 sec 72 o C X 70 sec 72 o C X 5 min 35 κύκλοι 3. PCR για IMP Εκκινητές 171 : F 5 -CTACCGCAGCAGAGTCTTTG-3 R 5 -AACCAGTTTTGCCTTACCAT-3 94 o C X 5 min 94 o C X 1 min 55 o C X 1 min 72 o C X 2 min 72 o C X 7 min 25 κύκλοι 4. PCR για NDM-1 Εκκινητές 172 : F 5 -GGTTTGGCGATCTGGTTTTC-3 R 5 -CGGAATGGCTCATCACGATC-3 94 o C X 5 min 94 o C X 40 sec 55 o C X 40 sec 72 o C X 1 min 72 o C X 5 min 35 κύκλοι 5. PCR για KPC Εκκινητές 102 : F 5 -ATGTCACTGTATCGCCGTCT-3 R 5 -TTTTCAGAGCCTTACTGCCC-3 95 o C X 5 min 94 o C X 45 sec 53 o C X 45 sec 72 o C X 1 min 72 o C X 10 min 35 κύκλοι 85

6. PCR για GES/IBC Εκκινητές 173 : F 5 -CCCCAAGGAGAGATCGTCG-3 R 5 -GTAATCTCTCTCCTGGGCTT-3 94 o C X 5 min 94 o C X 25 sec 52 o C X 40 sec 72 o C X 50 sec 72 o C X 6 min 30 κύκλοι 7. PCR για TEM Εκκινητές 174 : F 5 -ACATGGGGGATCATGTAACT-3 R 5 -GACAGTTACAATGCTTACT-3 94 o C X 5 min 94 o C X 30 sec 42 o C X 1 min 72 o C X 2 min 72 o C X 7 min 30 κύκλοι 8. PCR για SHV Εκκινητές 174 : F 5 -ATGCGTTATATTCGCCTGTG-3 R 5 -AGCGTTGCCAGTGCTCGATG-3 94 o C X 5 min 95 o C X 30 sec 58 o C X 1 min 72 o C X 2 min 72 o C X 5 min 30 κύκλοι Μετά το πέρας κάθε επι µέρους αντίδρασης ακολουθούσε ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης µε προσθήκη βρωµιούχου αιθιδίου και οπτικοποίηση του αποτελέσµατος σε πηγή ακτίνων UV. Από το σύνολο των PCR που διενεργήθηκαν, θετικά αποτελέσµατα προέκυψαν µόνο µε τη χρήση των primers VIM-2. Τα συγκεκριµένα προϊόντα στάλθηκαν στη Macrogen Κορέας (Macrogen Inc., GeumCheon-Gu, Seoul, Republic of South Korea) όπου και έγινε αλληλούχηση. Τα αποτελέσµατα της αλληλούχησης συγκρίθηκαν µε την κατατεθειµένη στη Genebank αλληλουχία του γονιδίου VIM-2. Για τη σύγκριση αυτή χρησιµοποιήθηκε το λογισµικό BioEdit. 86

9.5. Ανίχνευση υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής µε δοκιµασία CCCP Για τη διενέργεια του CCCP TEST προετοιµάστηκαν τρυβλία Mueller-Hinton agar µε ενσωµατωµένο CCCP σε συγκέντρωση 12,5 µm και το κάθε ένα στέλεχος της µελέτης ενοφθαλµίστηκε από εναιώρηµα 0,5 MacFarland σε ένα τρυβλίο µε και σε ένα τρυβλίο χωρίς ενσωµατωµένο CCCP 159. Σε όλα τα τρυβλία τοποθετήθηκε ένας δίσκος µεροπενέµης και ακολούθησε επώαση για 24 ώρες σε 37 o C. Η δοκιµασία θεωρήθηκε θετική στις περιπτώσεις που η άλως αναστολής του δίσκου µεροπενέµης ήταν µεγαλύτερη στο τρυβλίο µε CCCP σε σχέση µε το τρυβλίο που δεν περιείχε αναστολέα των αντλιών ενεργητικής εκροής. 9.6. Ανίχνευση απώλειας της πορίνης OprD µε SDS-PAGE Όλα τα στελέχη της µελέτης ανακαλλιεργήθηκαν σε ζωµό Mueller-Hinton και κατά τη λογαριθµική φάση ανάπτυξης υποβλήθηκαν σε φυγοκέντρηση σε 7000g για 10 min σε θερµοκρασία δωµατίου. Το ίζηµα αναδιαλύθηκε σε 500µl διάλυµα 10mM Tris HCl ph 8,0 το οποίο φυγοκεντρήθηκε σε 3700g για 10 min στους 4 o C και το ίζηµα αναδιαλύθηκε εκ νέου σε 500µl του ίδιου διαλύµατος. Ακολούθησε θραύση των κυττάρων σε sonicator (4 φορές x 60 sec µε παύσεις του ενός min). Για να απορριφθούν τα κύτταρα που παρέµειναν ακέραια έγινε φυγοκέντρηση (3700g x 15 min στους 4 o C) και κρατήθηκε το υπερκείµενο. Αυτό υποβλήθηκε σε υπερφυγοκέντρηση ώστε να καθιζάνουν οι κυτταρικές µεµβράνες (20.000g x 45 min στους 4 o C). Το ίζηµα αναδιαλύθηκε σε 500µl διάλυµα Tris 100. Η ποσότητα πρωτεΐνης του κάθε δείγµατος µετρήθηκε φωτοµετρικά µε ELISA (µέθοδος BCA-Bicinchoninic Acid) και υπολογίστηκε ο όγκος του διαλύµατος στον οποίο περιέχονται 30µg πρωτεΐνης. Ο όγκος αυτός του διαλύµατος έµεινε να παγώσει στους -4 o C και τα παγωµένα δείγµατα συµπυκνώθηκαν σε συµπυκνωτή ώστε να αποµονωθεί καθαρή πρωτεΐνη. Η πρωτεΐνη που αποµονώθηκε, διαλύθηκε σε 10µl απιονισµένου νερού. Στο τελικό διάλυµα προστέθηκαν 20µl sample buffer πριν την ηλεκτροφόρηση σύµφωνα µε τις οδηγείες της κατασκευάστριας εταιρίας (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Sample buffer 3,55 ml απιονισµένο νερό 1,25 ml Tris-HCl 0,5M ph 6,8 2,5 ml glycerol 2,0 ml SDS 10% 0,2 ml bromophenol blue 0,5% Πριν τη χρήση, έγινε ανάµειξη 950 µl του διαλύµατος µε 50 µl β-µερκαπταιθανόλη Η ηλεκτροφόρηση έγινε σε πηκτή πολυακρυλαµίδης (stacking gel και resolving gel) µε την εξής σύσταση: Stacking Gel 87

6,1 ml απιονισµένο νερό 1,3 ml acrylamide/bis 2,5 ml Tris-HCl 0,5M ph 6,8 0,1 ml SDS 10% 50 µl APS (Ammonium Persulfate) 10% 10 µl TEMED Resolving Gel 4,1 ml απιονισµένο νερό 3,3 ml acrylamide/bis 2,5 ml Tris-HCl 1,5M ph 8,8 0,1 ml SDS 10% 50 µl APS 10% 5 µl TEMED Πριν την ηλεκτροφόρηση, έγινε βρασµός των δειγµάτων στους 100 o C για 5 min. Ως θετικό control χρησιµοποιήθηκε στέλεχος P. aeruginosa ευαίσθητο στις καρµπαπενέµες 100 που αποµονώθηκε στο Ιπποκράτειο Γ.Ν.Θ. (MIC ιµιπενέµης 1, MIC µεροπενέµης 0,25). Στελέχη µε απώλεια της πορίνης θεωρήθηκαν εκείνα που δεν εµφάνισαν ζώνη στα 48 kda σε αντίθεση µε το θετικό control. Για τον προσδιορισµό των µοριακών βαρών χρησιµοποιήθηκε ladder της κατασκευάστριας εταιρίας (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). 9.7. Ανίχνευση ύπαρξης επαγώγιµης AmpC β-λακταµάσης µε D-Test Για τη διενέργεια του D-Test ενοφθαλµίστηκε εναιώρηµα 0,5 MacFarland από το κάθε στέλεχος σε τρυβλίο Mueller-Hinton agar και χρησιµοποιήθηκε ένας δίσκος ιµιπενέµης ως επαγωγέας και δίσκοι πιπερακιλλίνης/ταζοµπακτάµης και κεφταζιδίµης ως υποστρώµατα. Μετά επώαση 24 ωρών στους 37 o C, η δοκιµασία θεωρήθηκε θετική στις περιπτώσεις µείωσης της διαµέτρου της άλω αναστολής ενός εκ των υποστρωµάτων στον χώρο µεταξύ αυτού και του δίσκου της ιµιπενέµης. Στα στελέχη µε θετικό D-Test ακολούθησε επιβεβαίωση της υπερέκφρασης AmpC µέσω της σύγκρισης της άλω αναστολής δίσκου κεφταζιδίµης σε τρυβλίο Mueller-Hinton χωρίς κλοξακιλλίνη και σε τρυβλίο µε ενσωµατωµένη κλοξακιλλίνη 175 η οποία χρησίµευσε για να ανασταλεί η δράση της AmpC β-λακταµάσης 176. 9.8. Έλεγχος κλωνικής συγγένειας VIM-2 θετικών στελεχών µε ERIC 2 PCR 21 από τα VIM-2 θετικά στελέχη της µελέτης τυποποιήθηκαν µε ERIC 2 PCR 177 ώστε να διαπιστωθεί η πιθανή εξάπλωση της µεταφερόµενης καρµπαπενεµάσης µεταξύ διαφορετικών κλώνων P. aeruginosa στο νοσοκοµείο. 88

Τα στελέχη ανακαλλιεργήθηκαν σε αιµατούχο άγαρ και µετά από 18 ώρες επώασης σε 37 ο C προετοιµάστηκε εναιώρηµα για το κάθε προς εξέταση στέλεχος (1 αποικία µικροοργανισµού σε 100 µl PCR water). Ακολούθησε βρασµός στους 100 o C για 20 min και φυγοκέντρηση στις 10.800 στροφές για 12 min. 2 µl από το υπερκείµενο προστέθηκαν σε 24 µl από το Master Mix της αντίδρασης. Η σύσταση του Master Mix που χρησιµοποιήθηκε ήταν η εξής: 2,5µl 10xPCR Buffer ανά στέλεχος 1µl MgCl 2 50ml/M ανά στέλεχος 0,5µl dntps 10µM ανά στέλεχος 0,5µl Primer ERIC2 ανά στέλεχος 0,1 µl Taq πολυµεράση ανά στέλεχος Συµπλήρωµα µε PCR water µέχρι τελικού όγκου 25µl ανά στέλεχος Κατά την παρασκευή του Master Mix υπολογιζόταν κάθε φορά ένα επιπλέον στέλεχος πέρα από αυτά που συµµετείχαν στην αντίδραση ώστε να προβλεφθούν πιθανές απώλειες κατά την τεχνική διαδικασία. Ο εκκινητής και οι συνθήκες PCR ήταν οι εξής: PCR για ERIC 2 Εκκινητής 178 : 5 -AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3 94 o C X 6 min 94 o C X 1 min 45 o C X 1 min 72 o C X 5 min 72 o C X 10 min 32 κύκλοι Μετά το πέρας της αντίδρασης έγινε ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης µε προσθήκη βρωµιούχου αιθιδίου, οπτικοποίηση και σύγκριση του µεγέθους των ζωνών των προϊόντων της PCR. 9.9. Στατιστική επεξεργασία 9.9.1. Σύγκριση των δειγµάτων ως προς τους µηχανισµούς αντοχής που ανιχνεύθηκαν Οι συγκρίσεις µεταξύ των δειγµάτων έγιναν µε τη δοκιµασία χ 2 (Pearson Chi-Square) µε διόρθωση συνέχειας του Yates (continuity correction) σε περίπτωση τετράπτυχων πινάκων και µε την ακριβή δοκιµασία του Fisher (Fisher s Exact Test) για τις περιπτώσεις που παραβιάζονται οι προϋποθέσεις χρήσης του χ 2. Οι δοκιµασίες πραγµατοποιήθηκαν µε το στατιστικό λογισµικό πακέτο SPSS 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). 89

9.9.2. Προσδιορισµός MIC 50 και MIC 90 Ως MIC 50 και MIC 90 ορίζονται οι συγκεντρώσεις αντιβιοτικού που αναστέλλουν την ανάπτυξη του 50% και του 90% αντίστοιχα των στελεχών ενός δείγµατος. Για να υπολογιστούν οι MIC 50 και MIC 90 των δειγµάτων 2003-2006 και 2008-2011, οι τιµές των αποτελεσµάτων του προσδιορισµού των MICs διαχωρίστηκαν σε 100 ίσα µέρη (percentiles) µε τη χρήση του στατιστικού λογισµικού πακέτου SPSS 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). Ως MIC 50 ορίστηκε η τιµή του πεντηκοστού και ως MIC 90 η τιµή του ενενηκοστού εκατοστιµόριου. Στον υπολογισµό δεν συµπεριλήφθηκαν τα στελέχη 80, 89, 141 και 166 τα οποία αποδείχτηκε ότι δεν είχαν αντοχή στις καρµπαπενέµες µε τη µέθοδο των µικροαραιώσεων σε ζωµό. 9.9.3. Υπολογισµός γεωµετρικού µέσου όρου των τιµών των MICs Ο γεωµετικός µέσος είναι ένα περιγραφικό στατιστικό µέγεθος που χρησιµοποιείται σε σύγχρονες µελέτες για την περιγραφή ενός συνόλου τιµών MICs 179. Ορίζεται ως η νιωστή ρίζα του γινοµένου ν τιµών MICs (όπου ν= ο αριθµός των στελεχών του κάθε δείγµατος). Για την παρούσα µελέτη χρησιµοποιήθηκε ειδικό ελεύθερο λογισµικό διαθέσιµο στο διαδίκτυο (geometric mean calculator). Στον υπολογισµό του γεωµετρικού µέσου όρου δεν συµπεριλήφθηκαν τα στελέχη 80, 89, 141 και 166. 9.9.4. Υπολογισµός ανάλωσης καρµπαπενεµών κατά την χρονική περίοδο αποµόνωσης των στελεχών της µελέτης Ο υπολογισµός της ανάλωσης καρµπαπενεµών έγινε µε τη χρήση του δείκτη DDD/1000 pt-days (Defined Daily Doses/1000 patient-days, καθορισµένες ηµερήσιες δόσεις/1000 ηµέρες νοσηλείας. Ως DDD ορίζεται η υποτιθέµενη µέση ηµερήσια δόση ενός φαρµάκου που χορηγείται για την κύρια ένδειξή του σε ενήλικες 180 και σύµφωνα µε τον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας είναι 2gr για την ιµιπενέµη και τη µεροπενέµη και 1,5gr για τη δοριπενέµη (www.whocc.no/atc_ddd_index). 90

10. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 10.1. MIC ιµιπενέµης και µεροπενέµης Τα αποτελέσµατα του προσδιορισµού της MIC ιµιπενέµης και µεροπενέµης στα στελέχη της µελέτης φαίνονται στους Πίνακες 26-31. Πίνακας 26. Αποτελέσµατα προσδιορισµού της MIC ιµιπενέµης και µεροπενέµης µε τη µέθοδο των µικροαραιώσεων σε ζωµό και µε το αυτόµατο σύστηµα Vitek 2 (στελέχη 1-30, περιόδου 2003-2006). Στέλεχος MIC Vitek Ιµιπενέµης (mg/l) MIC broth Ιµιπενέµης (mg/l) MIC Vitek Μεροπενέµης (mg/l) MIC broth Μεροπενέµης (mg/l) 1 16 8-2 2 >16 32-32 3 >16 4-4 4 >16 64-64 5 >16 128-64 6 >16 4-8 7 16 8-8 8 >16 128-128 9 16 8-8 10 >16 16-8 11 >16 32-8 12 >16 4-2 13 >16 16-32 14 >16 8-2 15 >16 32-32 16 >16 128-64 17 >16 128-64 18 >16 64-32 19 >16 128-64 20 >16 128-64 21 >16 128-64 22 >16 64-32 23 >16 128-32 24 8 4-4 25 8 4-4 26 >16 64-32 27 >16 128-128 28 >16 4-4 29 >16 4-4 30 >16 128-128 91

Πίνακας 27. Αποτελέσµατα προσδιορισµού της MIC ιµιπενέµης και µεροπενέµης µε τη µέθοδο των µικροαραιώσεων σε ζωµό και µε το αυτόµατο σύστηµα Vitek 2 (στελέχη 31-60, περιόδου 2008-2011). Στέλεχος MIC Vitek Ιµιπενέµης (mg/l) MIC broth Ιµιπενέµης (mg/l) MIC Vitek Μεροπενέµης (mg/l) MIC broth Μεροπενέµης (mg/l) 31 >16 256 >16 >256 32 >16 256 >16 >256 33 8 16 >16 16 34 >16 16 >16 16 35 8 8 >16 16 36 8 8 >16 8 37 >16 32 >16 32 38 4 8 >16 32 39 >16 16 >16 16 40 >16 128 >16 128 41 >16 8 >16 8 42 >16 16 >16 16 43 >16 64 >16 32 44 >16 16 >16 16 45 >16 64 >16 64 46 >16 16 >16 16 47 >16 64 >16 64 48 >16 128 >16 64 49 >16 128 >16 128 50 >16 128 >16 64 51 >16 16 >16 8 52 >16 64 >16 64 53 >16 64 >16 64 54 >16 128 8 4 55 >16 16 >16 16 56 >16 128 >16 128 57 8 8 >16 16 58 8 8 >16 16 59 8 8 >16 16 60 >16 64 >16 32 92

Πίνακας 28. Αποτελέσµατα προσδιορισµού της MIC ιµιπενέµης και µεροπενέµης µε τη µέθοδο των µικροαραιώσεων σε ζωµό και µε το αυτόµατο σύστηµα Vitek 2 (στελέχη 61-90, περιόδου 2008-2011). Στέλεχος MIC Vitek Ιµιπενέµης (mg/l) MIC broth Ιµιπενέµης (mg/l) MIC Vitek Μεροπενέµης (mg/l) MIC broth Μεροπενέµης (mg/l) 61 8 8 8 8 62 8 8 8 8 63 >16 64 >16 64 64 >16 256 8 256 65 >16 64 >16 64 66 >16 16 >16 8 67 >16 256 >16 64 68 >16 16 >16 16 69 >16 16 >16 16 70 4 16 >16 32 71 >16 64 >16 32 72 >16 256 >16 128 73 >16 16 >16 8 74 >16 4 8 0.5 75 8 8 >16 32 76 4 8 >16 32 77 8 8 >16 32 78 >16 256 >16 128 79 8 16 >16 32 80 8 2 1 1 81 >16 256 >16 64 82 8 8 >16 32 83 >16 16 >16 16 84 8 8 >16 8 85 >16 8 >16 8 86 >16 8 >16 32 87 >16 8 4 4 88 >16 64 8 8 89 >16 2 >16 0.5 90 >16 16 >16 16 93

Πίνακας 29. Αποτελέσµατα προσδιορισµού της MIC ιµιπενέµης και µεροπενέµης µε τη µέθοδο των µικροαραιώσεων σε ζωµό και µε το αυτόµατο σύστηµα Vitek 2 (στελέχη 91-120, περιόδου 2008-2011). Στέλεχος MIC Vitek Ιµιπενέµης (mg/l) MIC broth Ιµιπενέµης (mg/l) MIC Vitek Μεροπενέµης (mg/l) MIC broth Μεροπενέµης (mg/l) 91 >16 16 4 4 92 >16 128 >16 64 93 >16 128 >16 64 94 >16 128 >16 64 95 >16 128 >16 64 96 >16 128 >16 64 97 >16 128 >16 32 98 >16 128 >16 32 99 >16 128 >16 32 100 8 8 >16 32 101 >16 128 >16 32 102 >16 128 >16 32 103 >16 16 >16 16 104 >16 16 >16 16 105 >16 16 >16 16 106 8 8 >16 32 107 >16 128 >16 32 108 8 8 4 4 109 >16 256 >16 128 110 >16 128 >16 64 111 >16 64 8 8 112 >16 256 >16 64 113 8 8 >16 4 114 >16 128 >16 32 115 >16 4 >16 16 116 >16 128 >16 32 117 8 8 >16 16 118 >16 128 >16 64 119 >16 128 >16 32 120 >16 64 8 8 94

Πίνακας 30. Αποτελέσµατα προσδιορισµού της MIC ιµιπενέµης και µεροπενέµης µε τη µέθοδο των µικροαραιώσεων σε ζωµό και µε το αυτόµατο σύστηµα Vitek 2 (στελέχη 121-150, περιόδου 2008-2011). Στέλεχος MIC Vitek Ιµιπενέµης (mg/l) MIC broth Ιµιπενέµης (mg/l) MIC Vitek Μεροπενέµης (mg/l) MIC broth Μεροπενέµης (mg/l) 121 >16 16 >16 16 122 >16 4 4 2 123 >16 16 >16 16 124 >16 8 4 2 125 >16 64 >16 64 126 >16 128 >16 32 127 >16 128 >16 128 128 >16 64 >16 64 129 >16 32 >16 4 130 >16 128 >16 32 131 >16 128 >16 32 132 >16 16 >16 16 133 >16 16 >16 4 134 >16 256 >16 128 135 >16 16 >16 32 136 >16 256 >16 64 137 >16 8 >16 16 138 >16 64 >16 64 139 8 4 >16 16 140 >16 8 8 2 141 8 0.5 >16 0.5 142 >16 16 >16 16 143 >16 64 >16 64 144 >16 128 >16 128 145 >16 8 8 4 146 >16 128 >16 128 147 >16 128 >16 64 148 >16 16 >16 4 149 >16 256 >16 128 150 >16 8 4 2 95

Πίνακας 31. Αποτελέσµατα προσδιορισµού της MIC ιµιπενέµης και µεροπενέµης µε τη µέθοδο των µικροαραιώσεων σε ζωµό και µε το αυτόµατο σύστηµα Vitek 2 (στελέχη 151-180, περιόδου 2008-2011). Στέλεχος MIC Vitek Ιµιπενέµης (mg/l) MIC broth Ιµιπενέµης (mg/l) MIC Vitek Μεροπενέµης (mg/l) MIC broth Μεροπενέµης (mg/l) 151 >16 16 >16 16 152 8 4 >16 8 153 >16 128 >16 128 154 >16 256 >16 64 155 >16 128 >16 32 156 >16 8 >16 16 157 >16 4 >16 16 158 >16 16 >16 16 159 >16 128 >16 128 160 >16 >256 >16 128 161 >16 128 >16 32 162 >16 128 >16 128 163 >16 128 >16 32 164 >16 4 >16 0.5 165 >16 128 >16 128 166 2 0.5 >16 1 167 4 4 >16 8 168 >16 128 >16 64 169 >16 128 >16 32 170 >16 16 1 4 171 >16 128 >16 32 172 >16 128 >16 32 173 >16 16 >16 8 174 >16 16 >16 8 175 >16 128 >16 64 176 >16 16 >16 8 177 >16 32 >16 16 178 >16 8 >16 8 179 >16 128 >16 32 180 4 4 4 4 96

Τα αποτελέσµατα του Vitek 2 (µε βάση τα οποία έγινε η αρχική επιλογή των στελεχών) συγκρίθηκαν µε εκείνα της µεθόδου αναφοράς (µικροαραιώσεις σε ζωµό) µε τη χρήση διεθνώς αποδεκτών µεγεθών σύγκρισης 181 που ορίζονται ως ακολούθως: Categorical agreement (CA): το ποσοστό των στελεχών που κατατάσσονται στην ίδια κατηγορία (S, I, R) και από τις δύο µεθόδους, Very Major Errors (VME): οι περιπτώσεις στις οποίες η µέθοδος αναφοράς έδειξε αντοχή και το VITEK 2 ευαισθησία, Major Errors (ME): περιπτώσεις στις οποίες το στέλεχος αναφέρεται ως ευαίσθητο από τη µέθοδο αναφοράς και ανθεκτικό από το VITEK 2, minor Errors (me): η ύπαρξη διαφοράς κατά µία κατηγορία µεταξύ των µεθόδων, Essential Agreement (EA): το ποσοστό των περιπτώσεων κατά τις οποίες παρατηρήθηκε ±1 αραίωση διαφορά στον προσδιορισµό των MICs µεταξύ των δύο µεθόδων. Τα αποτελέσµατα της σύγκρισης φαίνονται στον Πίνακα 32. Οι διαφορές που παρατηρήθηκαν οφείλονται κατά κύριο λόγο σε υπερεκτίµηση της τιµής της MIC από το αυτόµατο σύστηµα (για την ιµιπενέµη 65/69 περιπτώσεις 94,2% και για τη µεροπενέµη 58/60 περιπτώσεις 96,66%) παρά σε υποεκτίµηση της (για την ιµιπενέµη 4/69 περιπτώσεις 5,8% και για τη µεροπενέµη 2/60 περιπτώσεις 3,33%). Τέλος, παρατηρήθηκε ότι σε τέσσερις περιπτώσεις το VΙΤΕΚ 2 ανέφερε αντοχή στις καρµπαπενέµες ενώ η µέθοδος αναφοράς έδειξε ευαισθησία (στελέχη 80, 89, 141 και 166). Πίνακας 32. Σύγκριση αποτελεσµάτων προσδιορισµού των MICs ιµιπενέµης και µεροπενέµης µε Vitek 2 και µικροαραιώσεις σε ζωµό. Μέγεθος σύγκρισης MIC ιµιπενέµης MIC µεροπενέµης CA 88,9% 91,3% VME 1,1% 0% ΜE 6,1% 2% me 11,6% 14,6% EA 88,8% 83,3% 10.2. Παραγωγή καρµπαπενεµασών Από τον φαινοτυπικό έλεγχο παραγωγής καρµπαπενεµασών στο δείγµα 2003-2006 (Πίνακας 33) προέκυψαν 15 EDTA θετικά (ποσοστό 50%) και 3 DDST θετικά στελέχη (ποσοστό 10%). Ένα από τα στελέχη (στέλεχος 23) ήταν θετικό και στις δύο φαινοτυπικές δοκιµασίες ταυτόχρονα. Αντίστοιχα, στο δείγµα 2008-2011 υπήρξαν 72 EDTA θετικά (48%) και 8 DDST θετικά (5,3%) στελέχη (Πίνακες 34-38). Όλα τα EDTA θετικά στελέχη είχαν θετική PCR µε εκκινητές για το γονίδιο VIM-2 (Εικόνα 27) και αρνητική µε εκκινητές για τα γονίδια VIM-1, IMP και NDM-1 (Πίνακες 33-38). Από την αλληλούχηση των προϊόντων της PCR που διενεργήθηκε χρησιµοποιώντας τους εκκινητές VIM-2 προέκυψε ότι η αλληλουχία τους συµπίπτει µε εκείνη του γονιδίου VIM-2 (Εικόνα 29). Ο µοριακός έλεγχος για τα γονίδια που κωδικοποιούν καρµπαπενεµάσες τάξης Α κατά Ambler (KPC και GES/IBC) στα DDST θετικά στελέχη ήταν αρνητικός (Εικόνα 28). Στη συνέχεια πραγµατοποιήθηκε έλεγχος µε εκκινητές για τα γονίδια TEM και SHV στα ίδια στελέχη. Τα 3 DDST θετικά στελέχη του δείγµατος 2003-2006 µεταξύ των 97

οποίων και το στέλεχος 23 έφεραν το γονίδιο SHV (Πίνακας 33). Όλα τα υπόλοιπα στελέχη ήταν αρνητικά για TEM και SHV β-λακταµάσες. Εικόνα 27. Αποτελέσµατα PCR για το γονίδιο VIM-2. Εικόνα 28. Αποτελέσµατα PCR για το γονίδιο KPC. 98

Εικόνα 29. Αλληλούχηση γονιδίου VIM-2. 99

Τα αναλυτικά αποτελέσµατα του φαινοτυπικού και µοριακού ελέγχου παραγωγής καρµπαπενεµασών στα δείγµατα 2003-2006 και 2008-2011 φαίνονται στους Πίνακες 33-38. 100

Πίνακας 33. Αναλυτικά αποτελέσµατα φαινοτυπικού και µοριακού ελέγχου παραγωγής καρµπαπενεµασών (στελέχη 1-30, περιόδου 2003-2006). ΣΤΕΛΕΧΟΣ EDTA DDST ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΑΣΗ Ή ΑΛΛΗ β-λακταμαση ΠΟΥ ΑΝΙΧΝΕΥΘΗΚΕ ΜΕ PCR 1 - - 2 - + SHV 3 - - 4 + - VIM-2 5 + - VIM-2 6 - - 7 - - 8 + - VIM-2 9 - - 10 - - 11 + - VIM-2 12 - - 13 - - 14 - - 15 - + SHV 16 + - VIM-2 17 + - VIM-2 18 + - VIM-2 19 + - VIM-2 20 + - VIM-2 21 + - VIM-2 22 + - VIM-2 23 + + VIM-2, SHV 24 - - 25 - - 26 + - VIM-2 27 + - VIM-2 28 - - 29 - - 30 + - VIM-2 ΣΥΝΟΛΟ 2003-2006 15/30 (50%) 3/30 (10%) VIM-2: 15/30 (50%), SHV: 3/30 (10%) 101

Πίνακας 34. Αναλυτικά αποτελέσµατα φαινοτυπικού και µοριακού ελέγχου παραγωγής καρµπαπενεµασών (στελέχη 31-60, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ EDTA DDST ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΑΣΗ Ή ΑΛΛΗ β-λακταμαση ΠΟΥ ΑΝΙΧΝΕΥΘΗΚΕ ΜΕ PCR 31 + - VIM 2 32 + - VIM 2 33 - - 34 - - 35 - - 36 - - 37 - - 38 - + 39 - - 40 + - VIM 2 41 - - 42 - - 43 + - VIM 2 44 - - 45 + - VIM 2 46 - - 47 + - VIM 2 48 + - VIM 2 49 + - VIM 2 50 + - VIM 2 51 + - VIM 2 52 + - VIM 2 53 + - VIM 2 54 + - VIM 2 55 - - 56 + - VIM 2 57 - - 58 - - 59 - - 60 + - VIM 2 102

Πίνακας 35. Αναλυτικά αποτελέσµατα φαινοτυπικού και µοριακού ελέγχου παραγωγής καρµπαπενεµασών (στελέχη 61-90, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ EDTA DDST ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΑΣΗ Ή ΑΛΛΗ β-λακταμαση ΠΟΥ ΑΝΙΧΝΕΥΘΗΚΕ ΜΕ PCR 61 - + 62 - - 63 + - VIM 2 64 + - VIM 2 65 + - VIM 2 66 - - 67 + - VIM 2 68 - - 69 - - 70 - - 71 + - VIM 2 72 + - VIM 2 73 - - 74 - - 75 - + 76 - + 77 - + 78 + - VIM 2 79 - - 80 - - 81 + - VIM 2 82 - - 83 - - 84 - - 85 - - 86 - - 87 - - 88 + - VIM 2 89 - - 90 - - 103

Πίνακας 36. Αναλυτικά αποτελέσµατα φαινοτυπικού και µοριακού ελέγχου παραγωγής καρµπαπενεµασών (στελέχη 91-120, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ EDTA DDST ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΑΣΗ Ή ΑΛΛΗ β-λακταμαση ΠΟΥ ΑΝΙΧΝΕΥΘΗΚΕ ΜΕ PCR 91 - - 92 + - VIM 2 93 + - VIM 2 94 + - VIM 2 95 + - VIM 2 96 + - VIM 2 97 + - VIM 2 98 + - VIM 2 99 + - VIM 2 100 - + 101 + - VIM 2 102 - - 103 - - 104 - - 105 - - 106 - + 107 + - VIM 2 108 - - 109 + - VIM 2 110 - - 111 + - VIM 2 112 + - VIM 2 113 - - 114 + - VIM 2 115 - - 116 + - VIM 2 117 - - 118 + - VIM 2 119 + - VIM 2 120 + - VIM 2 104

Πίνακας 37. Αναλυτικά αποτελέσµατα φαινοτυπικού και µοριακού ελέγχου παραγωγής καρµπαπενεµασών (στελέχη 121-150, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ EDTA DDST ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΑΣΗ Ή ΑΛΛΗ β-λακταμαση ΠΟΥ ΑΝΙΧΝΕΥΘΗΚΕ ΜΕ PCR 121 - - 122 - - 123 - - 124 - - 125 + - VIM 2 126 + - VIM 2 127 + - VIM 2 128 + - VIM 2 129 - - 130 + - VIM 2 131 + - VIM 2 132 - - 133 - - 134 + - VIM 2 135 - - 136 + - VIM 2 137 - - 138 + - VIM 2 139 - - 140 - - 141 - - 142 - - 143 + - VIM 2 144 + - VIM 2 145 - - 146 + - VIM 2 147 + - VIM 2 148 - - 149 + - VIM 2 150 - - 105

Πίνακας 38. Αναλυτικά αποτελέσµατα φαινοτυπικού και µοριακού ελέγχου παραγωγής καρµπαπενεµασών (στελέχη 151-180, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ EDTA DDST ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΑΣΗ Ή ΑΛΛΗ β-λακταμαση ΠΟΥ ΑΝΙΧΝΕΥΘΗΚΕ ΜΕ PCR 151 - - 152 - - 153 + - VIM 2 154 + - VIM 2 155 + - VIM 2 156 - - 157 - - 158 - - 159 + - VIM 2 160 + - VIM 2 161 + - VIM 2 162 + - VIM 2 163 + - VIM 2 164 - - 165 + - VIM 2 166 - - 167 - - 168 + - VIM 2 169 + - VIM 2 170 - - 171 + - VIM 2 172 + - VIM 2 173 - - 174 - - 175 + - VIM 2 176 + - VIM 2 177 - - 178 - - 179 + - VIM 2 180 - + ΣΥΝΟΛΟ 2008-2011 72/150 (48%) 8/150 (5,3%) VIM-2: 72/150 (48%) 106

10.3. Υπερέκφραση αντλιών ενεργητικής εκροής και απώλεια της πορίνης OprD Από τη διενέργεια του CCCP test προέκυψαν 4 θετικά στελέχη στο δείγµα 2003-2006 (ποσοστό 13,33%) και 35 θετικά στελέχη στο δείγµα 2008-2011 (ποσοστό 24%) ενώ, µε την SDS-PAGE βρέθηκαν 20 στελέχη µε έλλειψη OprD (Εικόνα 30) στο δείγµα 2003-2006 (ποσοστό 66,66%) και 91 στελέχη µε έλλειψη της πορίνης στο δείγµα 2008-2011 (62,3%). Εικόνα 30. Αποτελέσµατα SDS-PAGE για τον έλεγχο απώλειας της πορίνης OprD. Το στέλεχος αριστερά εκφράζει κανονικά την πορίνη ενώ το στέλεχος δεξιά εµφανίζει απώλεια της OprD. Αναλυτικά τα αποτελέσµατα της διενέργειας του CCCP test και της κάθετης ηλεκτροφόρησης των πρωτεϊνών της εξωτερικής µεµβράνης σε πηκτή πολυακρυλαµίδης φαίνονται στους Πίνακες 39-44. 107

Πίνακας 39. Αποτελέσµατα ανίχνευσης υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής µε CCCP test και απώλειας πορίνης OprD µε SDS-PAGE (στελέχη 1-30, περιόδου 2003-2006). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΕΝΕΡΓΗΤΙΚΗ ΕΚΡΟΗ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΩΝ (CCCP TEST) ΑΠΩΛΕΙΑ ΠΟΡΙΝΗΣ OprD (SDS-PAGE) 1 - + 2 - + 3 + - 4 - - 5 - + 6 - + 7 - + 8 + - 9 - - 10 - + 11 - - 12 + + 13 - - 14 - - 15 + - 16 - - 17 - - 18 - + 19 - - 20 - - 21 - - 22 - + 23 - + 24 - + 25 - + 26 - + 27 - - 28 - + 29 - + 30 - - ΣΥΝΟΛΟ 2003-2006 4/30 (13,3%) 15/30 (50%) 108

Πίνακας 40. Αποτελέσµατα ανίχνευσης υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής µε CCCP test και απώλειας πορίνης OprD µε SDS-PAGE (στελέχη 31-60, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΕΝΕΡΓΗΤΙΚΗ ΕΚΡΟΗ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΩΝ (CCCP TEST) ΑΠΩΛΕΙΑ ΠΟΡΙΝΗΣ OprD (SDS-PAGE) 31 + - 32 + - 33 - + 34 - + 35 - - 36 - + 37 + + 38 + - 39 - + 40 + - 41 - + 42 - + 43 - + 44 - + 45 - - 46 - + 47 - - 48 - + 49 - - 50 - + 51 - + 52 - - 53 - - 54 - + 55 + - 56 + - 57 + - 58 - - 59 + - 60 - + 109

Πίνακας 41. Αποτελέσµατα ανίχνευσης υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής µε CCCP test και απώλειας πορίνης OprD µε SDS-PAGE (στελέχη 61-90, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΕΝΕΡΓΗΤΙΚΗ ΕΚΡΟΗ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΩΝ (CCCP TEST) ΑΠΩΛΕΙΑ ΠΟΡΙΝΗΣ OprD (SDS-PAGE) 61 - + 62 - + 63 + - 64 + - 65 - - 66 - + 67 - + 68 - + 69 - + 70 + - 71 - + 72 + + 73 + + 74 - + 75 + - 76 + - 77 + - 78 + + 79 + - 80 - - 81 - + 82 - - 83 - - 84 - - 85 - - 86 + - 87 - + 88 - + 89 - - 90 + - 110

Πίνακας 42. Αποτελέσµατα ανίχνευσης υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής µε CCCP test και απώλειας πορίνης OprD µε SDS-PAGE (στελέχη 91-120, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΕΝΕΡΓΗΤΙΚΗ ΕΚΡΟΗ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΩΝ (CCCP TEST) ΑΠΩΛΕΙΑ ΠΟΡΙΝΗΣ OprD (SDS-PAGE) 91 - + 92 - + 93 + + 94 - + 95 - + 96 - + 97 - + 98 - + 99 + + 100 + - 101 - + 102 - + 103 - + 104 - + 105 - + 106 - - 107 - + 108 - + 109 - + 110 - + 111 - + 112 - + 113 - + 114 - + 115 - - 116 - + 117 - - 118 - + 119 - + 120 + + 111

Πίνακας 43. Αποτελέσµατα ανίχνευσης υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής µε CCCP test και απώλειας πορίνης OprD µε SDS-PAGE (στελέχη 121-150, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΕΝΕΡΓΗΤΙΚΗ ΕΚΡΟΗ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΩΝ (CCCP TEST) ΑΠΩΛΕΙΑ ΠΟΡΙΝΗΣ OprD (SDS-PAGE) 121 - + 122 + + 123 - + 124 + + 125 - - 126 + + 127 + - 128 - - 129 + + 130 + + 131 - + 132 - + 133 - + 134 - - 135 - - 136 - + 137 - - 138 - - 139 - + 140 - + 141 - - 142 - - 143 - - 144 - - 145 - - 146 - + 147 - + 148 - + 149 - + 150 - + 112

Πίνακας 44. Αποτελέσµατα ανίχνευσης υπερέκφρασης αντλιών ενεργητικής εκροής µε CCCP test και απώλειας πορίνης OprD µε SDS-PAGE (στελέχη 151-180, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΕΝΕΡΓΗΤΙΚΗ ΕΚΡΟΗ ΚΑΡΜΠΑΠΕΝΕΜΩΝ (CCCP TEST) ΑΠΩΛΕΙΑ ΠΟΡΙΝΗΣ OprD (SDS-PAGE) 151 - - 152 - - 153 - - 154 - + 155 - + 156 - - 157 - - 158 - - 159 - - 160 - + 161 - + 162 + - 163 - + 164 - + 165 - - 166 - - 167 + - 168 - + 169 - + 170 - + 171 - + 172 - + 173 - + 174 + + 175 - + 176 - + 177 + + 178 - - 179 - + 180 - + ΣΥΝΟΛΟ 2008-2011 35/150 (23,3%) 91/150 (60,7%) 113

10.4. Επαγώγιµη AmpC β-λακταµάση Από τη διενέργεια του D-test (Πίνακες 45-50) προέκυψαν 15 θετικά για το δείγµα 2003-2006 (ποσοστό 50%) και 77 θετικά για το δείγµα 2008-2011 (ποσοστό 51,33%). Στο σύνολο, η πιο συχνή συνέργεια που παρατηρήθηκε ήταν µεταξύ κεφταζιδίµηςιµιπενέµης (48/92, ποσοστό 52,17%) ενώ, συνέργεια και των δύο υποστρωµάτων µε τον επαγωγέα υπήρξε σε 39 από τις 92 περιπτώσεις (ποσοστό 42,4%). Συνέργεια της πιπερακιλλίνης-ταζοµπακτάµης µε την ιµιπενέµη χωρίς συνέργεια κεφταζιδίµηςιµιπενέµης παρατηρήθηκε σε λίγες περιπτώσεις (5/92, ποσοστό 5,43%). Πίνακας 45. Αποτελέσµατα διερεύνησης ύπαρξης επαγώγιµης AmpC β-λακταµάσης µε D-test (στελέχη 1-30, περιόδου 2003-2006). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΘΕΤΙΚΟ D-TEST ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ TZP-IMP ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP-TZP 1 + + 2 3 + + 4 5 + + 6 + + 7 + + 8 + + 9 + + 10 + + 11 12 + + 13 + + 14 + + 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 + + 25 + + 26 27 28 + + 29 + + 30 ΣΥΝΟΛΟ 2003-2006 15/30 (50%) 9 0 6 114

Πίνακας 46. Αποτελέσµατα διερεύνησης ύπαρξης επαγώγιµης AmpC β-λακταµάσης µε D-test (στελέχη 31-60, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΘΕΤΙΚΟ D-TEST ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP 31 32 33 + + 34 35 + + 36 37 + + 38 39 40 + + 41 42 43 + + 44 + + 45 + + 46 47 + + 48 + + 49 + + 50 + + 51 + + 52 + + 53 + + 54 55 56 + + 57 58 + + 59 + + 60 + + ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ TZP-IMP ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP-TZP 115

Πίνακας 47. Αποτελέσµατα διερεύνησης ύπαρξης επαγώγιµης AmpC β-λακταµάσης µε D-test (στελέχη 61-90, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΘΕΤΙΚΟ D-TEST ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ TZP-IMP ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP-TZP 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 + + 72 + + 73 74 75 76 77 78 + + 79 + + 80 81 + + 82 + + 83 + + 84 + + 85 + + 86 + + 87 + + 88 + + 89 90 116

Πίνακας 48. Αποτελέσµατα διερεύνησης ύπαρξης επαγώγιµης AmpC β-λακταµάσης µε D-test (στελέχη 91-120, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΘΕΤΙΚΟ D-TEST ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ TZP-IMP ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP-TZP 91 92 + + 93 + + 94 + + 95 + + 96 + + 97 98 99 100 + + 101 102 103 + + 104 105 106 + + 107 108 + + 109 110 111 + + 112 + + 113 + + 114 115 + + 116 117 + + 118 + + 119 120 117

Πίνακας 49. Αποτελέσµατα διερεύνησης ύπαρξης επαγώγιµης AmpC β-λακταµάσης µε D-test (στελέχη 121-150, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΘΕΤΙΚΟ D-TEST ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ TZP-IMP ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP-TZP 121 122 + + 123 124 + + 125 126 127 + + 128 129 + + 130 131 132 + + 133 + + 134 + + 135 + + 136 + + 137 + + 138 139 140 + + 141 142 + + 143 144 145 + + 146 + + 147 148 149 150 + + 118

Πίνακας 50. Αποτελέσµατα διερεύνησης ύπαρξης επαγώγιµης AmpC β-λακταµάσης µε D-test (στελέχη 151-180, περιόδου 2008-2011). ΣΤΕΛΕΧΟΣ ΘΕΤΙΚΟ D-TEST ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ TZP-IMP ΣΥΝΕΡΓΕΙΑ CAZ-IMP-TZP 151 + + 152 + + 153 + + 154 155 156 + + 157 + + 158 + + 159 160 + + 161 162 + + 163 164 + + 165 166 167 + + 168 + + 169 170 + + 171 172 173 + + 174 + + 175 + + 176 + + 177 178 + + 179 180 ΣΥΝΟΛΟ 2008-2011 77/150 (51,3%) 39 5 33 119

10.5. Αποτελέσµατα ERIC 2 PCR Από τη σύγκριση των αποτελεσµάτων των ηλεκτροφόρησεων της ERIC 2 PCR (Εικόνα 31) µεταξύ 21 στελεχών που παρήγαγαν VIM-2 καρµπαπενεµάση προέκυψαν 7 διαφορετικά προφίλ γεγονός που καταδεικνύει την διασπορά του υπεύθυνου γονιδίου µεταξύ διαφορετικών κλώνων P. aeruginosa στο περιβάλλον του νοσοκοµείου. Εικόνα 31. Αποτελέσµατα ηλεκτροφορήσεων ERIC 2 PCR (διαφορετικά προφίλ, Α: 4, 18, 22, 27, 40, 53, 71, 78, Β: 94, 107, 120, Γ: 116, 130, : 138, 176, Ε: 144, Ζ: 149, 153, 160, Η: 163, 171). 120