UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA FACULTATEA DE MEDICINĂ VETERINARĂ DUMA MIHAELA REZUMAT TEZĂ DE DOCTORAT STUDII DE LABORATOR PRIVIND SISTEMUL NERVOS CENTRAL LA OVINE, ÎN SCOP DE SUPRAVEGHERE ŞI DIAGNOSTIC AL BOLILOR CU LOCALIZARE NERVOASĂ CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC Prof. Univ. Dr. Dr. H.C. ALECSANDRU IOAN BABA Membrul titular al Academiei de Ştiinţe Agricole şi Silvice CLUJ-NAPOCA -2011- [249]
Rezumat Factorii de ordin infecţios, traumatic, toxic sau degenerativ din alte organe induc fie leziuni patognomonice în structurile sistemului nervos central (exemplu: rabia, scrapia), fie modificări ale organizării cito-histologice complexe a ţesutului nervos şi determină apariţia unor procese patologice caracterizate, în special, prin modificări la nivelul neuronilor şi la nivelul elementelor celulare gliale ca leziuni asociate, cu semnificaţie diagnostică în coroborare cu datele epizootologice şi alte investigaţii de laborator. Prin examen histopatologic se urmăreşte punerea în evidenţă a modificărilor structurale esenţiale sub aspect morfologic şi histologic, în vederea identificării mecanismelor generatoare de tulburări la nivel local şi impactul acestora asupra întregului organism, corelând manifestările clinice ale animalului bolnav (când acestea au fost surprinse) cu leziunile decelate. Modificările structurale evidenţiate la nivel macroscopic şi microscopic stau la baza interpretării leziunilor produse de agenţii patogeni sau vulneranţi, ierarhizând contribuţia lor la dezvoltarea leziunilor în dinamică sau prin efect cumulativ când acesta există. Formele nervoase sunt semnalate frecvent la ovine, dar în acelaşi timp sunt foarte uniforme ca manifestare clinică şi morfopatologică. Pentru acest motiv, cercetarea modificărilor histopatologice ale sistemului nervos central în vederea stabilirii frecvenţei, localizărilor preferenţiale, tipului lezional predominant sau descoperirii unor leziuni specific etiologice, au importanţă practică în stabilirea diagnosticului diferenţial. Encefalopatiile spongiforme transmisibile, alături de altă zoonoză majoră cu localizare nervoasă la ovine, rabia, sunt bolile pentru care sunt prevăzute investigaţii de laborator obligatorii ale sistemului nervos central la ovine în cadrul Programul acţiunilor de supraveghere, prevenire, control şi eradicare a bolilor la animale, a celor transmisibile de la animale la om, elaborat de Autoritatea Naţională Sanitară Veterinară Bucureşti. [250]
Din 1990 până în prezent, Comisia Europeană a adoptat o serie de măsuri de protecţie a sănătăţii umane şi animale de riscul de contaminare cu encefalopatii spongiforme transmisibile (EST). Aceste măsuri au avut la bază dispoziţiile de salvgardare ale directivelor privind măsurile de control veterinar. Având în vedere magnitudinea riscului pe care îl reprezintă anumite forme de EST, Comisia prevede programe de monitorizare sporită pentru caprine şi ovine, în urma detectării cazurilor de encefalopatie spongiformă bovină (ESB) la o capră în 2005 şi a trei cazuri neobişnuite de EST la oi, cazuri pentru care nu putea fi exclusă ESB. Structura cercetărilor. Teza cuprinde un număr de 248 pagini şi este structurată în conformitate cu prevederile legale actuale; în conţinutul acesteia sunt inserate un număr de 121 figuri (imagini, grafice, diagrame) şi 23 de tabele. În partea I sunt prezentate cele mai importante şi concludente date din literatura de specialitate referitoare la aspecte histologice, fiziologice, citopatologice ale țesutului nervos şi aspecte referitoare la encefalopatiile spongiforme transmisibile la rumegătoarele mici etiologia prionică, patogeneză, diagnostic clinic şi de laborator. În partea a II-a sunt prezentate cercetările proprii ce au vizat studii de laborator pentru monitorizarea scrapiei (capitolul II.1), studiul histopatologic (capitolul II.2) al sistemului nervos central efectuat pe un număr determinat de probe de creier, în vederea identificării de modificări/leziuni ale ţesutului nervos, altele decât cele specifice encefalopatiilor spongiforme transmisibile şi, în final, confirmarea a două focare de scrapie (capitolul II.3). Partea bibliografică cuprinde un număr de 201 titluri de lucrări ştiinţifice din literatura de specialitate autohtonă şi străină. Studii de laborator pentru monitorizarea scrapiei În capitolul II.1. sunt evaluate rezultatele investigaţiilor de laborator în direcţia scrapiei şi sunt comparate metodele de diagnostic între ele sub aspectul sensibilităţii şi specificităţii, respectiv decelarea şi cuantificarea acumulărilor de proteină prionică anormală PrP res rezistentă la proteinaza K în ţesutul nervos, prin teste imunoenzimatice şi evidenţierea prezenţei/absenţei leziunilor provocate de convertirea PrP în PrP res şi acumularea acesteia, prin examene histopatologice. [251]
Studiul a avut în vedere testele de laborator la care au fost supuse probele de creier de ovine pentru supravegherea şi/sau monitorizarea formelor de encefalopatii spongiforme transmisibile la rumegătoarele mici, în judetul Cluj între anii 2004-2010. Pe parcursul anilor luaţi în studiu a fost examinat un număr total de 1540 ovine, cu respectarea grupelor ţintă stabilite de prevederile legislaţiei referitoare la EST. Astfel, un număr de 610 probe au provenit de la ovine moarte, 594 probe de la ovine sacrificate de urgenţă (în această categorie înscriindu-se şi ovinele sacrificate în scop de confirmare de diagnostic sau ca urmare a necesităţii eliminării din efectiv, cum este cazul celor cu diagnostic de epididimită infecţioasa, maedi-visna), iar un număr de 336 probe au provenit de la ovine clinic sănătoase sacrificate pentru consum uman (sacrificare tradiţională pentru consum familial). Urmărind precizările tehnice ale Programului pentru eradicarea şi monitorizarea encefalopatiilor spongiforme transmisibile, în cazul probelor de creier recoltate de la animalele moarte şi de la animalele sacrificate de urgenţă (cu excepţia celor improprii procesării histologice) s-a efectuat atât screening-ul rapid, cât şi examenul histologic, conform procedurii specifice. Screening-ul rapid s-a făcut utilizând metoda BIO-RAD TeSeE, metodă validată în laboratorul de histopatologie al LSVSA Cluj şi acreditată de către Organismul Naţional de Acreditare din România (RENAR.). Este o metodă imunoenzimatică ce utilizează 2 anticorpi monoclonali şi permite determinarea calitativă a proteinei anormale prionice PrP res rezistentă la proteinaza K, în ţesutul nervos central, după denaturarea şi concentrarea proteinelor. Histopatologic, pentru fiecare probă s-au examinat în total câte 20 de secţiuni din bulb rahidian, protuberanţă anullară, mezencefal cu zona de colliculus anterior, cerebel, cortex cerebral şi măduva rahidiană din zona cervicală, procesate prin tehnica la parafină şi colorate Hematoxilină Eozină. Astfel, din totalul de 1540 probe de creier supuse examinarii prin teste rapide, un număr total de 541 au fost supuse şi examenului histopatologic pentru evidenţierea leziunilor caracteristice scrapiei, după cum urmează: 330 probe de creier prelevate de la cadavre (ovine moarte în ferme, gospodăriile populaţiei, pe păşune, în timpul transportului, în abator, sau în cazul unor accidente, indiferent de natura acestora), 208 [252]
probe creier prelevate de la ovine sacrificate de urgenţă (ovine la care examenul clinic ante-mortem a stabilit prezenţa unor manifestări nervoase sau faptul că nu se pot deplasa, stau culcate, incapabile să se ridice sau să meargă fără asistenţă; ovine identificate de medicul oficial în abator la inspecţia ante-mortem cu semne clinice de boală, indiferent de natura bolii: boli infecţioase, medicale etc ) şi un număr de 3 probe creier recoltate de la ovine sacrificate pentru consum uman (familial). Din totalul de 1540 teste imunoenzimatice, 1527 teste au prezentat densităţile optice mai mici decât valoarea prag (cut-off-ul), înregistrând deci rezultate negative la prima testare. Un număr de 13 teste au prezentat iniţial densităţi optice situate chiar sub valoarea prag şi au fost retestate în duplicat pornind de la omogenatul iniţial. Pentru toate cele 13 cazuri rezultatele au fost negative pentru ambele duplicate. În cazul celor 541 probe de creier procesate histopatologic prin tehnica la parafină nu s-au evidenţiat leziuni specifice encefalopatiilor spongiforme transmisibile, în niciunul din fragmentele de ţesut nervos examinate. În urma acestor examene (screening rapid, examene histopatologice) s-a stabilit că probele de creier analizate în perioada 2004-2010 proveneau de la ovine libere de encefalopatii spongiforme transmisibile (scrapie clasică, scrapie atipică). Studiu histopatologic În capitolul II.2. sunt prezentate rezultatele unui studiu histopatologic al sistemului nervos central pe un număr determinat de probe de creier (100) prelucrate histologic pentru monitorizarea scrapiei, urmărind analiza incidenţei modificărilor / leziunilor (altele decât cele specifice EST) în sistemul nervos central la categoriile ţintă de ovine examinate, clasificarea acestora în funcţie de caracteristicile histologice predominante, realizarea unei ierarhizări comparative, evaluarea repartiţiei şi frecvenţei leziunilor microscopice în diferitele segmente de ţesut nervos examinate, stabilirea unei corelaţii între modificările/leziunile identificate şi starea de sănătate sau/şi existenţa unor leziuni la distanţă. Studiul a identificat modificări/leziuni de diferite tipuri ale ţesutului nervos la 73% din cazurile examinate, grupate în funcţie de predominanţa aspectelor histopatologice degenerative, vasculare, reacţii celulare neinflamatorii/inflamatorii. [253]
Sintetic, rezultatele examinării microscopice au identificat modificări degenerative ale corpului celulei nervoase (modificări ale nucleului, citoplasmei), tulburări vasculare (edem, congestii, hemoragii, proliferări ale celulelor endoteliale, tromboze vasculare), reacţii celulare (infiltraţii cu mononucleare, infiltraţii cu granulocite, proliferări ale celulelor gliale, ale macrofagelor, prezenţa celulelor gigante), prezenţa incluziilor virale, imagini de moarte celulară (tigroliză, satelitoză, neuronofagie), tulburări metabolice cu acumulare de pigment melanic, prezenţa granuloamelor de tip parazitar. Realizând o ierarhizare descrescândă a tipurilor de modificări/leziuni din diferitele segmente de sistem nervos central pentru cele 100 cazuri analizate au fost constatate următoarele: Cele mai numeroase leziuni au fost cele de tip vascular, rezultatul examinării microscopice fiind un total de 177, din care imaginile de edem au fost întâlnite de 84 de ori, congestiile de 53 de ori, hemoragiile de 8 ori; au fost surprinse 29 de imagini cu proliferări ale celulelor endoteliului vascular şi 3 imagini de tromboză vasculară. În ierarhie urmează modificările degenerative ale pericarionilor cu un număr total de 93 de imagini, de tip cromatolitic (45 imagini care frecvent au putut fi interpretate ca indicator al unor degenerescenţe nespecifice combinate cu pierderea afinităţii tinctoriale), degenerescenţe granulare şi vacuolare (31) şi atrofie neuronală cu pierderea volumului citoplasmatic şi reducerea în volum (17). Reacţiile celulare au fost surprinse în număr total de 84 şi au constat în infitraţii cu mononucleare (37), infiltraţii cu granulocite neutrofile (16), gliocitoză (14), inifiltraţii cu eozinofile (13), proliferări ale macrofagelor (2), prezenţa celulelor gigante (2). Incluziile virale au fost surprinse de 2 ori, situate intracitoplasmatic. Au fost surprinse 28 de imagini de moarte celulară cu satelitoză (11), neuronofagie (9), tigroliză (8). Acumularea de pigment melanic a fost surprinsă de 3 ori la nivelul leptomeningelui. Analizând repartizarea tipurilor de modificări/leziuni pe categorii de ovine, la ovinele moarte şi la cele sacrificate de urgenţă care reprezintă 97% din materialul de studiu, au rezultat următoarele: [254]
La ambele categorii de ovine au predominat leziunile de tip vascular, urmate de modificările degenerative ale pericarionilor. În cazul probelor de creier provenite de la ovinele sacrificate de urgenţă s-au înregistrat reacţii celulare pentru toate tipurile celulare (mononucleare, granulocite neutrofile, celule gliale, eozinofile). Prezenţa celulelor macrofage şi a celulelor gigante de tip parazitar a fost surprinsă în aceeaşi măsură pentru ambele categorii. Imaginile de moarte celulară au fost mai frecvent întâlnite la sacrificările de urgenţă, comparativ cu preparatele histologice provenite de la cadavre. Acumularea de pigment melanic a fost întâlnită la preparatele histologice de la cadavre, dar nu a fost întâlnită la preparatele obţinute de la ovinele sacrificate de urgenţă. Granuloamele parazitare au fost întâlnite în egală măsură la cele două categorii de ovine. În cazul examinării preparatelor histologice provenite de la ovinele sacrificate pentru consum uman, s-au întâlnit: imagini de tip cromatolitic (2), congestii (2), infiltraţii cu mononucleare (2), edem (1), satelitoză (1), melanoză (1). Evaluarea statistică privind incidenţa localizării principalelor tipuri de leziuni microscopice în segmentele de sistem nervos central examinate a relevat următoarele: Modificările degenerative ale pericarionului au afectat în primul rând bulbul rahidian (22,31%), apoi, aproximativ în egală măsură, cortexul cerebral (19,83%), cerebelul (19%), puntea (18,18%) şi tuberculii cvadrigemeni (16,53%). Într-o măsură mult mai redusă au fost afectaţi neuronii din hipocamp sau măduva rahidiană cervicală. Se constată o incidenţă mai crescută a leziunilor neinflamatorii, constând în edem, congestii, hemoragii, cu precădere în zona tuberculilor cvadrigemeni (29,37%), bulbului (22,03%), cerebelului (19,21%), cortexului cerebral (12,99%,) şi punţii (11,30%), în timp ce preponderenţa acestora este mult mai mică în măduva rahidiană cervicală (3,38%) şi hipocamp (1,69%). În cazul leziunilor inflamatorii bulbul rahidian a fost cel mai afectat, în proporţie de 34,14%, apoi tuberculii cvadrigemeni, în proporţie de 24,39%, cortexul cerebelos şi cortexul cerebral în proporţie de 19,31%, respectiv, 12,50%, În procent mult mai redus au fost sediul leziunilor inflamatorii, hipocampul cu 4,55%, măduva rahidiană şi puntea cu câte 3,41% şi 2,27%. [255]
Depunerea de pigment melanic a fost identificată în 100% din cazuri cu localizare în leptomeningele cerebelului şi al emisferelor cerebrale. Nu există diferenţe semnificative statistic sub raportul frecvenţei cu care se localizează modificările/leziunile în segmentele de ţesut nervos examinate. Bulbul rahidian şi tuberculii cvadrigemeni sunt segmentele afectate în cea mai mare măsură, în timp ce hipocampul şi măduva rahidiană sunt afectate în cea mai mică măsură. Cortexul cerebral şi cerebelul sunt sediul modificărilor aproximativ cu aceeaşi frecvenţă. În punte se remarcă prezenţa modificărilor degenerative ale pericarionilor şi a leziunilor neinflamatorii şi într-o măsură mult mai mică se produc leziuni inflamatorii. Leziunile de tip vascular au predominat la 41% din cazuri, urmate în ierarhie de leziunile inflamatorii, cu un procent de 16%. În această categorie s-au încadrat inflamaţiile de natură parazitară (8%), inflamaţiile de natură bacteriană (6%) şi inflamaţiile de natură virală (2%). La 11% din cazuri au fost identificate modificări a căror etiologie nu a putut fi precizată şi care au fost atribuite unor afecţiuni şi stări patologice la nivelul unor organe viscerale, de natură metabolică, infecţioasă şi/sau parazitară. A fost observată acumularea de pigment melanic în 3% din cazuri şi modificări ale lichidului cefalo-rahidian în 2% din cazuri. Nu s-au observat modificări ale ţesutului nervos în segmentele de sistem nervos central examinate în 27% din cazuri. Edemul neinflamator a fost diagnosticat ca modificare predominantă la 37 de cazuri şi a constat în imagini de lărgire a spaţiului Wircoff-Robin, uneori cu prezenţa unui lichid slab colorat, cu aspect vacuolar; capilarele sau arteriolele aveau lumenul redus datorită transsudatului. Baza edemului vasogenic o reprezintă lezionarea endoteliului vascular, cu o severitate care permite creşterea permeabilităţii vasculare. Fluidul se dispersează între celule, ca răspuns la presiunea hidrostatică de la nivelul circulaţiei cerebrale şi a celei de la nivelul altor ţesuturi S-au constatat diferenţe de susceptibilitate la edem, între materia cenuşie şi cea albă, iar vulnerabilitatea diferitelor zone cu materie cenuşie sau albă a fost, de asemenea, diferită şi a constat în imagini de edem intracelular tradus prin hipertrofia astrocitelor, acompaniată uneori de reacţia oligodendrocitelor de la nivelul materiei albe (nucleu mărit, mai puţin dens, hipocrom); edem vasogenic (intercelular) fără modificări majore la [256]
nivelul substanţei cenuşii, dar materia albă, care oferă o rezistenţă mai scăzută la trecerea fluidului de edem, apare texturată, cu aspect vacuolar. Frecvent, s-a constatat edem sub epiteliul canalului ependimar, celulele epiteliale fiind invadate de lichid, nucleul celulelor împins spre polul apical, uneori chiar picnotic; alteori, celulele epiteliale erau desprinse, iar substanţa nervoasă limitrofă avea aspect spongios. Cerebelul, mai cu seamă în zona celulelor Purkinje, a fost sediul unui edem ce disloca şi compresa celulele. Adesea edemul a fost acompaniat de o discretă gliocitoză şi/sau limfocitoză. Hemoragiile au predominat la 4 cazuri, fiind întâlnite aspecte de hemoragii prin diapedeză, fără specificitate în distribuţia topografică, cu eritrocitele rămase în spaţiul perivascular, însoţite sau nu de hipertrofia celulelor endoteliale şi a nucleilor, dar şi hemoragii per rexis cu localizare bilaterală şi simetrică în cortexul cerebral. La două dintre aceste cazuri examenul bacteriologic a fost pozitiv pentru Clostridium spp., iar un caz prezenta infestaţie masivă cu larve de Oestrus ovis ajunse eratic în circulaţia craniană. Imaginile de edem şi hemoragii nu au fost însoţite de modificări de tip inflamator. S-a acordat atenţie deosebită leziunilor inflamatorii ale sistemului nervos central, foarte importante pentru patologia veterinară deoarece majoritatea lor sunt fatale şi pentru că examenul histologic trebuie să orienteze sau să stabilească diagnosticul etiologic. Inflamaţiile parazitare au reprezentat jumătate (50%) din leziunile inflamatorii identificate. Inflamaţiile bacteriene au fost diagnosticate ca şi inflamaţii listerelice în proporţie de 25% şi inflamaţii purulente de alt tip 12,5%. Inflamaţiile virale au fost identificate în proporţie de 12,5% şi au avut etiologie rabică. Diagnosticarea histopatologică a encefalitelor parazitare s-a corelat, în cazul a 6 ovine sacrificate de urgenţă, cu semnalarea tulburărilor nervoase de focar cu învârtiri în manej şi tulburări de echilibru ca urmare a compresiunii exercitate în emisferele cerebrale, respectiv în cerebel sau în bulbul rahidian. Tabloul morfopatologic a fost în raport cu stadiul evolutiv al bolii, prezentând un polimorfism accentuat. Am identificat prezenţa infiltratului de tip neutrofilic şi eozinofilic; în plus, la două dintre cazuri, granuloame parazitare cu celule gigante, reacţie [257]
vasculo-conjunctivă şi macrofage cu citoplasmă spumoasă, fiind surprinse şi resturi de paraziţi; 3 dintre cazuri au fost diagnosticate ca encefalite parazitare de migrare, cu focare neregulate de necroză, infiltraţie eozinofilică; la 2 cazuri encefalita parazitară a fost acompaniată de leptomeningită eozinofilică. Leziunile produse de paraziţi au fost întâlnite în bulb, tuberculii cvadrigemeni, cortexul cerebral, punte, hipocamp şi măduva rahidiană cervicală. La 2 ovine moarte, documentele sanitar veterinare insoţitoare nu au precizat simptomatologie nervoasă, probele de creier fiind procesate doar pentru monitorizarea scrapiei, deşi studiul histopatologic a evidenţiat leziuni în stadii avansate, soldate cu dezvoltarea celulelor gigante, multinucleate, cu citoplasma axată pe masa de detritus şi încărcată de vacuole şi resturi tisulare, precum şi prezenţa de trombi parazitari. Encefalitele de natură bacteriană au reprezentat 37,5% din leziunile inflamatorii, din care, 25% au fost identificate ca fiind de natură listerelică. La o ovină fără semne clinice, sacrificată pentru consum uman inflamaţia a fost predominant monocitară, ceea ce denotă un stadiu acut al infecţiei care, în mod logic, ar fi trebuit să fie însoţit de simptomatologie nervoasă. Bulbul rahidian prezenta perivascularită monocitară sub formă de manşoane groase, iar în cerebel s-a identificat focar masiv şi infiltraţie difuză, intensă de limfocite, edem în neuropil şi perivascular, neuronoliză, perivascularită monocitară. La ovinele sacrificate de urgenţă deoarece prezentau clinic poziţii anormale ale capului, leziunile au fost localizate la nivelul bulbului rahidian şi cerebelului şi au constat în focare de necroză de lichefiere, cu prezenţa constantă a infiltratului neutrofilic, monocitar şi a manşoanelor perivasculare limfohistiocitare. Un procent de 12,5% din inflamaţiile de natură bacteriană au fost observate la ovine sacrificate de urgenţă (2 cazuri) şi au fost encefalite purulente, cu infiltraţie masivă cu granulocite neutrofile, leptomeningită şi prezenţa de bacterii dispuse în cuiburi, cu localizare în bulbul rahidian la un caz şi în cerebel la cel de-al doilea caz; în ambele cazuri examenul bacteriologic a fost pozitiv pentru tulpini β-hemolitice de E. Coli. Stadiul infiltrativ cu caracter de exudat purulent s-a corelat cu durata bolii, ambele cazuri diagnosticate clinic manifestându-se prin simptomatologie nervoasă şi decubit prelungit. [258]
Diagnosticul de encefalită virală respectiv, rabie a fost stabilit la 2 cazuri care au prezentat simptomatologie nervoasă şi care au fost sacrificate de urgenţă. În ambele cazuri, pe lângă encefalita limfohistiocitară, au fost identificaţi corpusculii Babeş Negri. Leziunile alterative şi de proliferare celulară au fost de intensitate moderată comparativ cu manifestările clinice. Encefalitele nespecifice au fost descrise la 5 ovine sacrificate de urgenţă şi la 6 ovine moarte, cu intensitate puţin relevantă şi au fost considerate ca fiind asociate unor stări de boală cu localizări în alte organe. Au fost identificate modificări degenerative ale pericarionilor (imagini de nuclei poziţionaţi excentric, cromatoliză periferică şi/sau central cu evidenţierea granulelor Nissl, picnoză, rexă şi liză neuronală cu modificări la nivelul astrocitelor şi endoteliilor capilare din vecinătatea neuronilor afectaţi) din bulbul rahidian, tuberculii cvadrigemeni, cortexul cerebral şi cerebelos, proliferări gliale, neuronofagie cu fagocite microgliale adunate în jurul fragmentelor degenerate ale corpilor neuronali, edem perivascular şi/sau în substanţa nervoasă, hemoragii prin diapedeză, prezenţa infiltratului eozinofilic în lumenul capilarelor şi arteriolelor. Melanoza a fost surprinsă la 2 cadavre şi la o ovină sacrificată pentru consum uman. Depunerea de pigment melanic s-a manifestat într-o manieră analogă cu alte boli de depozitare lizozomală, o membrană limitatoare bine definită nefiind evidentă şi a fost identificată in leptomeningele cerebelului şi al emisferelor cerebrale; la un caz melanocitele au fost prezente si perivascular; la niciunul dintre cazuri nu s-au identificat melanocite în substanţa nervoasă. La 2 cadavre am constatat o creştere a lichidului cefalorahidian, tradus prin dilatarea aqveductului, uneori asociat cu edemul substanţei nervoase limitrofe. În sinteză, cele mai afectate de modificările/leziunile ţesutului nervos au fost ovinele moarte, respectiv 40 de cazuri, apoi ovinele sacrificate de urgenţă, 31 de cazuri, iar dintre ovinele sacrificate pentru consum uman, deşi au fost identificate 2 cazuri cu leziuni, trebuie subliniat numărul extrem de mic de examene histopatologice efectuate la această categorie de ovine şi anume, 3. Mai mult, cele trei cazuri au fost procesate histologic în scopul obţinerii unor preparate de ţesut nervos de referinţă pentru examinarea microscopică, ele fiind recepţionate în laboratorul de morfopatologie cu [259]
documente însoţitoare care atestau starea de clinic sănătos, sacrificate pentru consum uman, iar capetele au fost dirijate pentru screening rapid prin test imunoenzimatic. Modificări/leziuni în ţesutul nervos au fost diagnosticate la ovine sacrificate de urgenţă care nu au manifestat simptomatologie nervoasă sau modificări macroscopice ale sistemului nervos central şi la ovine clinic sănătoase sacrificate pentru consum. Studiul histopatologic a scos în evidenţă o incidenţă mai ridicată a modificărilor/leziunilor sistemului nervos central faţă de cazuistica clinică; acestea sunt frecvent întâlnite la ovine, de multe ori evoluând asimptomatic sau semnele clinice sunt puţin evidente, ceea ce duce la nesemnalarea lor de către proprietar sau chiar de către medicii veterinari. Prezenţa modificărilor/leziunilor asociate din sistemul nervos central cu leziuni primare din alte ţesuturi şi organe arată că bariera hematoencefalică există, dar nu pentru orice stare patogenă din organism. Confirmarea a două focare de scrapie Din totalul de 158 probe creier examinate în anul 2011 prin testul imunoenzimatic BIO-RAD, un procent de 39,24%, adică un număr de 62 de probe au fost procesate şi histologic pentru evidenţierea leziunilor specifice encefalopatiilor spongiforme transmisibile (scrapie clasică, scrapie atipică). Diagnosticarea primelor cazuri pozitive de scrapie în Laboratorul de Morfopatologie specializat pentru Diagnosticul Encefalopatiilor Spongiforme transmisibile din LSVSA Cluj, în anul 2011, a fost motivaţia continuării cercetărilor privind formele de encefalopatii spongiforme transmisibile la rumegătoarele mici. În capitolul II.3 sunt prezentate rezultatele evaluării protocolului de diagnostic adoptat în cele 2 cazuri pozitive, reprezentante a 2 categorii ţintă, rezultatele comparării performanţelor testelor de laborator efectuate la aceste cazuri pozitive, precum şi aspecte epidemiologice ale scrapiei în judeţul Cluj, în contextul evoluţiei acestei boli pe teritoriul României. Categoriile ţintă reprezentate de cele 2 cazuri pozitive au fost ovinele clinic sănătoase sacrificate pentru consum uman şi ovinele sacrificate de urgenţă în urma examenului clinic la care s-a constatat simptomatologie nervoasă cu ataxie, anteropulsie [260]
cu sprijinul capului de diferite obiecte, tremor generalizat, torticolis, prurit accentuat automutilant la nivelul membrelor superioare, ataxie, bruxism, slăbire progresivă, decubit. Ca urmare a încadrării în cele 2 categorii ţintă, conform protocolului obligatoriu de lucru, s-a procedat la prelevarea diferită de probe şi direcţionarea pentru investigaţii de laborator. De la ovina cu simptomatologie nervoasă a fost prelevat creierul în întregime după decalotare, iar protocolul de lucru a constat în prelevarea eşantionului de ţesut nervos din regiunea obex pentru screening rapid scrapie prin test imunoenzimatic; fragmente punte, cortex cerebral, cerebel pentru examen histopatologic scrapie, fragmente trunchi cerebral (ţesut nefixat, conservat prin congelare) pentru testul de confirmare Western Blot şi fragmente din punte pentru imunohistochimie scrapie. De la ovina clinic sănătoasă a fost recoltat trunchiul cerebral prin tehnica foramen magnum şi s-au prelevat: eşantion de ţesut nervos din regiunea obex pentru test imunoenzimatic scrapie şi fragmente trunchi cerebral pentru testul de confirmare Western Blot. Testul de confirmare Western Blot s-a realizat prin digestia proteinei prionice celulare (PrP c ), urmată de purificarea şi concentrarea PrP res specifică de boală. Detecţia PrP res s-a efectuat prin migrare electroforetică urmată de imunoblotare. Testul de imunohistochimie scrapie s-a realizat pe secţiunile histologice permanente folosind un anticorp monoclonal cu specificitate înalta pentru PrP res - anticorp primar monoclonal pe şoarece antiprp SC. Testele imunoenzimatice au avut ca rezultat la testarea iniţială, pentru ambele probe, valori ale densităţilor optice peste valoarea prag (cut-off-ul), rezultând rapoarte mari în favoarea densităţilor optice înregistrate de probele în cauză, comparativ cu cutoff-ul (OD/C.OFF- 1.768/0.218 cazul cu simptomatologie nervoasă; 1.692/0.220 cazul fără semne clinice). Pentru verificarea acurateţii rezultatelor obţinute, pornind de la omogenatul iniţial, s-au retestat ambele probe prin test imunoenzimatic, în duplicat. La cazul cu simptomatologie nervoasă valoarea densităţilor optice a fost cu mult peste valoarea prag, rezultând rapoarte over în favoarea densităţilor optice înregistrate ale probei, comparativ [261]
cu cut-off-ul (3.601, 3.634/0.219). S-au obţinut densităţi optice peste valoarea prag (cutoff-ul) şi la cazul fără semne clinice (1.670, 2.306/0.220). Rezultatele obţinute, au fost interpretate ca pozitive pentru scrapie. Valoarea foarte mare a densităţilor optice obţinute la eşantioanele de ţesut nervos prelevate de la cazul cu simptomatologie nervoasă se datorează cantităţii mult mai crescute de PrP res detectată în ţesutul nervos, comparativ cu cantitatea de PrP res prezentă în ţesutul nervos la cazul fără semne clinice. Obţinerea densităţilor optice cu valoare mare, peste valoarea prag, la ovina clinic sănătoasă, sacrificată pentru consum uman, demonstrează sensibilitatea şi specificitatea testului imunoenzimatic de screening rapid în detecţia proteinei prionice anormale PrP res în ţesutul nervos infectat. Pentru ambele probe, imunoblotarea a dus la obţinerea profilelor specifice cu prezenţa unei pete mari doar pe banda corespunzătoare proteinelor cu greutate moleculară de 27-30 kda, prezente în proba tratată cu proteinază K. Profilele rezultate prin migrare electroforetică, urmată de imunoblotare, demonstrează digestia PrP c şi transformarea proteinei prionice specifice de boală într-un fragment rezistent la proteinază, cu masă moleculară redusă prin îndepartarea capătului amino-terminal al proteinei; cele 2 benzi superioare corespund formelor mono şi di-glicozilate (27-30 kda), iar banda inferioară corespunde formei neglicozilate. Examinarea histopatologică a identificat prezenţa de vacuolizări specifice localizate în pericarionul neuronilor şi în neuropilul substanţei cenuşii, cu distribuţie simetrică, bilaterală. Pericarionii s-au prezentat destinşi de una sau mai multe vacuole, rotunde sau ovale, cu contur net şi regulat care fuzionează, rezultând aspectul spongiform al materiei cenuşii. S-au întâlnit şi imagini de necroză neuronală, neuroni cu nuclei picnotici, citoplasmă omogenă, intens eozinofilă, discretă proliferare glială, precum şi depuneri de amiloid perivascular; nu s-au observat reacţii inflamatorii. Nucleul dorsal al vagului s-a dovedit a fi sediu de elecţie pentru vacuolizările specifice. Evidenţierea leziunilor demonstrează că pătrunderea prionilor în sistemul nervos central este urmată de convertirea proteinei normale PrP c, produsă de neuroni şi celule gliale, în PrP sc şi acumularea acesteia, urmată apoi de modificările histopatologice caracteristice, responsabile de tulburările clinice. [262]
Imunohistochimia efectuată la cazul cu simptomatologie nervoasă, în secţiunile histologice realizate din fragmentele de trunchi cerebral a identificat depozite punctiforme, în granule de PrP res, dispuse arbitrar, în mai multe focare sau difuze în neuropil şi pericarioni, cu o intensitate şi distribuţie a imunoreactivităţii diferite. Analiza rezultatelor demonstrează sensibilitatea şi specificitatea testului imunoenzimatic de screening rapid în detecţia proteinei prionice anormale PrP res în ţesutul nervos infectat, prin detectarea bolii la ovina clinic sănătoasă, sacrificată pentru consum uman şi că există corelaţie între cantitatea de proteină prionică anormală PrP res acumulată în ţesutul nervos şi declanşarea semnelor clinice, fapt evidenţiat de valoarea foarte mare a densităţilor optice obţinute la eşantioanele de ţesut nervos prelevate de la cazul cu simptomatologie nervoasă, comparativ cu cele obţinute la cazul fără semne clinice. Studiul a scos în evidenţă că scrapia poate evolua şi în absenţa semnelor clinice ceea ce înseamnă că infecţiile prionice oculte la animale sunt mult mai răspândite decât cazurile clinice cunoscute. Având în vedere că diagnosticarea cazului pozitiv la ovinele sacrificate pentru consum uman s-a făcut în cadrul monitorizării de rutină, subliniază importanţa acesteia. Concluzii generale 1. Studiul histopatologic, soldat cu depistarea de modificări/leziuni ale sistemului nervos central la 73% din cazurile examinate, scoate în evidenţă importanţa examinării acestui ţesut cu mai mare atenţie, atât macroscopic, cât şi prin prelevare de probe pentru studiu histopatologic în vederea identificării leziunilor primare, dar şi a celor asociate. 2. Modificări/leziuni în ţesutul nervos au fost diagnosticate la ovine sacrificate de urgenţă care nu au manifestat simptomatologie nervoasă sau modificări macroscopice ale sistemului nervos central şi la ovine clinic sănătoase sacrificate pentru consum uman. 3. Factorii de ordin infecţios, traumatic, toxic sau degenerativ din alte organe induc modificări ale organizării cito-histologice complexe a ţesutului nervos cu apariţia [263]
unor procese patologice, demonstrând că bariera hematoencefalică există, dar nu pentru orice stare patogenă din organism. 4. Identificarea encefalitelor purulente la ovine sacrificate pentru consum ridică probleme cu grave implicaţii pentru sănătatea publică prin consumul de produse obţinute de la astfel de animale. Prezenţa coloniilor bacteriene în structurile sistemului nervos central atrage atenţia asupra necesităţii completării investigaţiilor obligatorii pentru acest ţesut cu investigaţii histologice/bacteriologice efectuate mai des decât până în prezent. 5. Din evaluarea statistică a incidenţei modificărilor/leziunilor în diferitele segmente de sistem nervos central rezultă importanţa practică a obligativităţii examinării microscopice a trunchiului cerebral, nu numai pentru evidenţierea prezenţei/absenţei leziunilor specifice encefalopatiilor spongiforme transmisibile. 6. Ar fi oportună revizuirea circumstanţelor în care examenul histopatologic este prevăzut ca examen obligatoriu în cadrul Programului acţiunilor de supraveghere, prevenire, control şi eradicare a bolilor la animale, a celor transmisibile de la animale la om. 7. Diagnosticarea cazului pozitiv de scrapie la ovina sacrificată pentru consum uman, în condiţiile unui număr în creştere de probe recoltate de la această categorie ţintă, este un argument pentru monitorizarea sporită a ovinelor sacrificate în sistem tradiţional, în condiţiile în care, structura sectorului ovinelor în România are specificul său. 8. Fără a considera analiza situaţiei infecţiei prionice în judeţul Cluj un studiu epidemiologic de anvergură, se deduc câteva aspecte utile, în condiţiile în care, la ora actuală, foaia de parcurs pentru encefalopatii spongiforme transmisibile a Comisiei Europene stabileşte că unul dintre obiectivele strategice este revizuirea măsurilor de eradicare în ce ceea priveşte rumegătoarele de talie mică, ţinând cont de instrumentele de diagnosticare existente şi asigurând nivelul de protecţie al consumatorului. [264]