ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ Νικόλας Νικολαΐδης MD, PhD Επιστημονικός Συνεργάτης Τμήμα Ενδοκρινολογίας, Μεταβολισμού και Διαβήτη Α Παιδιατρική Κλινική Πανεπιστημίου Αθηνών Νοσοκομείο Παίδων «Η Αγία Σοφία»
ΕΙΔΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗΣ ΕΠΙΚΟΙΝΩΝΙΑΣ
ΔΟΜΗ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ NH2- IMMUNOGENIC DBD H LBD -COOH ΠΡΟΣΔΕΣΗ ΣΤΟ DNA Cys Cys Cys Cys Cys Zn Cys Cys Zn Cys ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ AF-1 AF-2 ΔΙΜΕΡΙΣΜΟΣ
ΥΠΕΡΟΙΚΟΓΕΝΕΙΑ ΠΥΡΗΝΙΚΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ NR Superfamily NR1 NR2 NR3 NR4 NR5 NR6 TRs, PPARs, LXRs, RARs, RORs, FXR, VDR, PXR, CAR, RORs, Rev-Erbs (heme), EcR (insects) RXRs COUP-TF TR2 TR4 HNF4 ERs PR AR GR MR Nurr77 (NR4A1,NGF1B), Nurr-1 (NR4A2), NOR-1 (NR4A3) FTZ-F1 SF1 Dax GCNF1 (mouse) ERs PR MR GR AR Female sexual development Female reproduction Homeostasis Stress response Male sexual development Reproduction (Water, Electrolytes) Immune response Reproduction
ΥΠΟΔΟΧΕΙΣ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ A/B C D E 100 100 919 har 80 53 933 hpr 77 50 777 hgr 77 52 984 hmr 51 20 595 herα 56 22 530 herβ
ΒΙΟΣΥΝΘΕΣΗ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ Cholesterol scc 17α-Hydroxylase Pregnenolone 17-OH Pregnenolone 17,20-Lyase DHEA 17β-HSD Androstenediol 3β-HSD 3β-HSD 3β-HSD 3β-HSD 17α-Hydroxylase 17,20-Lyase 17β-HSD Progesterone 17-OH Progesterone A Testosterone 21-Hydroxylase 21-Hydroxylase Aromatase Aromatase Deoxucorticosterone 11-Deoxycortisol Estrone 17β-HSD Estradiol 11β-Hydroxylase 11β-Hydroxylase Corticosterone Cortisol 18-Hydroxylase 18-OH Corticosterone 18-OH Dehydrogenase Aldosterone
ΕΞΕΛΙΞΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ (I) Baker ME. Mol Cell Endocrinol 2004; 215(1-2): 55-62
ΕΞΕΛΙΞΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ (II) Thornton JW. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98(10): 5671-5676
ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ
ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ (I) Ανοσοφθορισμός Ag Ag
ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ (I) Ανοσοφθορισμός Razandi M et al. Mol Cell Biol 2010; 30(13): 3249-3261
ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ (II) Υποκυτταρική Κλασμάτωση-Διαχωρισμός Εκχυλισμάτων
ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ (II) Υποκυτταρική Κλασμάτωση-Στύπωμα κατά Western
ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ (III) Διαμόλυνση Κυττάρων με Πλασμίδια GFP (Green Fluorescent Protein)
ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ (III) Διαμόλυνση HeLa με Πλασμίδια GFP-hGRαWT Μετατόπιση στον πυρήνα μετά από ενεργοποίηση 0 min 3 min 6 min 9 min 12 min 15 min
ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΗ ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ
ΜΕΜΒΡΑΝΙΚΟΣ ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΟΙΣΤΡΟΓΟΝΩΝ Caveolin PAT FVCLKSIIL merα PI3K MAPK GOLGI Pedram A. et al. J Biol Chem 2007; 282(31): 22278-22288
ΕΝΤΟΠΙΣΗ ΤΟΥ hgrα ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ Matthews L. et al. PLoS One 2011; 6(7): e22289
ΔΙΑΣΥΝΟΜΙΛΙΑ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΤΕΡΟΕΙΔΩΝ ΟΡΜΟΝΩΝ D Uva G and Lauriola M. Semin Cell Dev Biol 2016; 50: 143-152
Selective Estrogen Receptor Modulators (SERMs) 17-β Estradiol Tamoxifen Toremifene Raloxifene Riggs BL and Hartmann LC. N Engl J Med 2003; 348: 618-629
ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙΔΗ CRH ACTH Lungs Brain Immune System Kidney Liver Heart Muscle Adipose Tissue Bone Nicolaides NC et al. Introduction to Translational Cardiovascular Research 2015: 91-107
ΥΠΟΔΟΧΕΑΣ ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙΔΩΝ ΓΟΝΙΔΙΟ ΚΑΙ ΙΣΟΜΟΡΦΕΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Human GR Gene ATG TGA, a TGA, β 1 2 3 4 5 6 7 8 9α 9ß ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΟ ΜΑΤΙΣΜΑ ΕΞΟΝΙΟΥ 9α/β cdna GRa 1 2 3 4 5 6 7 8 9α cdna GRβ 1 2 3 4 5 6 7 8 9β GRα-A DBD HR 1 77 262 420 480 LBD 777 GRβ-A DBD HR 1 77 262 420 480 LBD 742 ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΕΣ ΘΕΣΕΙΣ ΕΝΑΡΞΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ GRα-B GRα-C1 GRα-C2 GRα-C3 GRα-D1 GRα-D2 GRα-D3 27 27 GRβ-B 86 GRβ-C1 90 GRβ-C2 98 GRβ-C3 316 GRβ-D1 331 GRβ-D2 336 GRβ-D3 86 90 98 316 331 336 Chrousos GP and Kino T. Science STKE 2005: pe48
ΔΟΜΗ ΥΠΟΔΟΧΕΑ ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙΔΩΝ hgrα A/B C D E NH2- IMMUNOGENIC DBD H LBD -COOH 1 420 488 527 777 Cys Cys Cys Cys H12 Zn Zn Cys Cys Cys Cys H6 ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ H11 AF-1 77 262 H5 H9 AF-2 526 556 H8753 768 H10 H7 ΜΕΤΑΝΑΣΤΕΥΣΗ H4 NL1 NL2 479 506 526 777 ΔΙΜΕΡΙΣΜΟΣ 456 777 ΠΡΟΣΔΕΣΗ ΣΕ HSPs 568 653
ΜΕΤΑΓΩΓΗ ΣΗΜΑΤΟΣ ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙΔΩΝ GR GR HSPs FKBP HSPs GR MAPK PI 3 K GR cpla 2 α enos L-Arginine NO BMAL1 CLOCK GR GR GR A GR A GR GR GR GR TF GR Nicolaides NC et al. Hormones 2016; 15(1): 23-34
ΜΗ ΓΕΝΩΜΙΚΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙΔΩΝ CH 2 OH C O HO CH 3 OH CH 3 O Υπόφυση Ιππόκαμπος Καρδιαγγειακό Ανοσοποιητικό TCR FYN LCK PI 3 K enos TCR Signaling ACTH L-Arginine NO Hammes SR and Levin ER. Endocr Rev 2007; 28(7): 726-741
ΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ ΤΩΝ ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙΔΩΝ Enzymatic Ligand Activation/Inactivation Ligand Availability Agonist, Antagonist Turn on System Excretion of Ligand from Intracellular Space Chromatin Modulators HMG proteins SWI/SNF DRIP/TRAP Subcellular Localization and Shuttling Heat Shock Proteins 14-3-3 Proteins Importins Transcriptional Regulators Elongation Factors RNPII Coactivators Chromatin Structure CBP/p300 and ReceptorModifications p160 s Methylation Acetylation Co-repressors GRα and GRβ N-terminal Isoforms 16 Monomers and 256 Combinations of Homo- or Hetero- Complexes Ubiquitination Sumoylation CREB NF-κB AP-1 General Transcription Other Transcription Proteasomal Factors Factors Degradation Nitrosylation Phosphorylation Acetylation FoxOHNF4 COUP-TFII Receptor Modification Chrousos GP and Kino T. Science STKE 2005: pe48
ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙΔΗ ΚΑΙ ΟΜΟΙΟΣΤΑΣΗ Homeostatic effect Allostasis (Cacostasis) Deficiency Eustasis Optimum Allostasis (Cacostasis) Excess Homeostatic system activity Nicolaides NC et al. Hormones 2016; 15(1): 23-34
ΣΥΝΔΡΟΜΟ ΓΕΝΙΚΕΥΜΕΝΗΣ ΑΝΤΙΣΤΑΣΗΣ ΣΤΑ ΓΛΥΚΟΚΟΡΤΙΚΟΕΙΔΗ (ΣΥΝΔΡΟΜΟ «ΧΡΟΥΣΟΣ») Σπάνια, οικογενής ή σποραδική κατάσταση, η οποία χαρακτηρίζεται από γενικευμένη αντίσταση των ιστών-στόχων στα γλυκοκορτικοειδή Αυξημένες συγκεντρώσεις κορτιζόλης και ACTH Κιρκάδιος ρυθμός και ανταπόκριση στα στρεσογόνα ερεθίσματα Αντίσταση του άξονα ΥΥΕ στην καταστολή με δεξαμεθαζόνη Ευρύ κλινικό φάσμα Charmandari E. Horm Res Paediatr 2011; 76(3): 145-155
ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑ Normal Chrousos syndrome CRH/AVP CRH/AVP Depression Anxiety ACTH ACTH Deoxycorticosterone Corticosterone Androgens Cortisol Deoxycorticosterone Corticosterone Hypertension Hypokalemic Alkalosis Androgens Cortisol Ambiguous genitalia, Virilization, Precocious Puberty, Acne, Hirsutism, Oligoamenorrhea, Decreased Fertility Nicolaides NC and Charmandari E. Eur J Clin Invest 2015; 45(5): 504-14
ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΣΤΟ ΓΟΝΙΔΙΟ hgr (NR3C1) 1667C>T T556I 1676T>A I559N 1712T>C V571A 1724T>G V575G 1762_1763insTTAC H588L dela Splice 2015T>C L627P 1922A>T D641V 2035G>A G679S 2141G>A R714Q 2177A>G H726R 2185G>A V729I 2209T>G F737L 2241T>G I747M 2318T>C L773P 2bp del 2318, 2319 1 2 3 4 5 6 7 8 9α 9β 1268T>C V423A 1405C>T R469X 1429C>A R477S 1429C>T R477C 1430G>A R477H 1433A>G Y478C
ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ ΠΕΡΙΣΤΑΤΙΚΟΥ Αγόρι, ηλικίας 9 ετών Κόπωση, άγχος, υπέρταση υπό αγωγή Φ/E: Υπέρταση (160/90 mm Hg) Χωρίς συνοδό σημειολογία συνδρόμου Cushing Ενδοκρινολογικός Έλεγχος: Κορτιζόλη ορού 08:00h: 42,4 μg/dl (Φ.Τ.: 5-25 μg/dl) ACTH πλάσματος 08:00h: 208,6 pg/ml (Φ.Τ.: 9-52 pg/ml) Τεστοστερόνη: 11 ng/dl (Φ.Τ.: 3-10 ng/dl) Ελεύθερη Κορτιζόλη Ούρων: 137,6 μg/m 2 /24h (16-125 μg/m 2 /24h) DST: Μη Καταστολή άξονα ΥΥΕ Roberts ML et al. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98: E790 E795
ΑΛΛΗΛΟΥΧΗΣΗ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ hgr Αντικατάσταση T C στο νουκλεοτίδιο 1268 Αντικατάσταση Val Ala στο αμινοξύ 423 V423A G C H S Y A G K I R E V D R D L I K S T I N (424) V C C (438) (463) G R N DC C (473) P Zn Zn L S G A (421) p C (441) A CK M K P A R V F K R A V E G Q H N Y L C C (476) F R Y R (457) C K L Q A G M N Roberts ML et al. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98: E790 E795
ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΡΑΣΗΣ hgrαv423a Ενεργοποίηση γονιδίων-στόχων Αρνητική επικρατούσα δράση Πρόσδεση με δεξαμεθαζόνη Μετατόπιση hgrα στον πυρήνα Αλληλεπίδραση με συνενεργοποιητές Πρόσδεση στο DNA Δομική Βιολογία
ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ CV-1 cells (embryonic African green monkey kidney cells) f1 Ori RSV LacZ GRα f1 Ori MMTV LacZ Luc f1 Ori RSV LacZ Ren Ori Ori Ori Amp Amp Amp prshgrα pmmtv-luc prl-sv RSV promoter GRα cdna MMTV promoter Firefly Luciferase cdna RSV Renilla Luciferase promoter cdna
ΔΙΑΜΟΛΥΝΣΗ ΜΕ ΚΑΤΙΟΝΙΚΑ ΣΩΜΑΤΙΑ RSV LacZ GRα f1 Ori Ori + + + + + + Lipofectamine + + + + + + + + + + + + Lipofectamine + + + + + + + + GRα + + + + Lipofectamine + + + + + + Amp prshgrα + + + + + + + + + + + Lipofectamine + + + + + + + Lipofectamine + + + + + + Ενδοκυττάρωση
ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ CV-1 cells (embryonic African green monkey kidney cells) Dex MMTV promoter Firefly Luciferase cdna MMTV promoter Firefly Luciferase cdna MMTV promoter Firefly Luciferase cdna RLU Dex
ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ Relative Luciferase Activity 2.0 1.5 1.0 0.5 0 CV-1 MMTV GRα WT GRα V423A ** ** ** Relative Luciferase Activity 1,6 1,2 0,8 0,4 Dexamethasone (-) Dexamethasone (+) CV-1 MMTV 0-12 -10-8 -6-5 Dexamethasone Concentration (log M) 0 GRα WT GRα V423A 1 1 1 1 1 0 1 3 6 10 Roberts ML et al. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98: E790 E795
ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΠΡΟΣΔΕΣΗΣ ΣΤΗ ΔΕΞΑΜΕΘΑΖΟΝΗ WT V423A Kd=6.0±0.6nM Kd=6.7±0.8nM Roberts ML et al. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98: E790 E795
ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗΣ ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ
ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ ΤΟΥ GFP-hGRαWT 0 min 3 min 6 min 9 min 12 min 15 min Roberts ML et al. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98: E790 E795
ΜΕΤΑΤΟΠΙΣΗ ΣΤΟΝ ΠΥΡΗΝΑ ΤΟΥ GFP-hGRαV423A 0 min 6 min 12 min 18 min 24 min 36 min Roberts ML et al. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98: E790 E795
ΔΟΚΙΜΑΣΙΕΣ GST-Pull Down GRIP1 hgrαv423a NRB / AF2 C-terminal / AF1 WT V423A Dexamethasone Input - + Input - + GRIP1 (1-1462) GRIP1 (740-1217) GRIP1 (559-774) Roberts ML et al. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98: E790 E795
ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΧΡΩΜΑΤΙΝΗΣ A GILZ GREs B G6Pase GREs Enrichment vs. Input * Enrichment vs. Input ** hgrα WT V423A WT V423A ChIP anti-gra Dexamethasone (-) Dexamethasone (+) IgG hgrα WT V423A WT V423A ChIP anti-gra IgG Dexamethasone (-) Dexamethasone (+) Roberts ML et al. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98: E790 E795
ΔΟΜΙΚΗ ΒΙΟΛΟΓΙΑ hgrαv423a GRα WT DBD GRα V423A DBD R477 V423 C441 V423 Zn C424 R477 A423 water C441 A423 Cys C424 421, 423, 438, 441 Zn structural water Roberts ML et al. J Clin Endocrinol Metab 2013; 98: E790 E795
ΜΟΡΙΑΚΟΙ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΔΡΑΣΗΣ ΤΟΥ hgrαv423α HSPs HSPs FKBP FKBP HSPs WT HSPs V423A WT V423A GRIP1 GRIP1 GRIP1 GRIP1 WT WT WT p65 p50 V423A V423A X X X X Nicolaides NC et al. Hormones 2016; 15(1): 23-34
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΣΥΝΔΡΟΜΟ «ΧΡΟΥΣΟΣ» Σπάνια, οικογενής ή σποραδική κατάσταση, η οποία χαρακτηρίζεται από γενικευμένη αντίσταση των ιστών-στόχων στα γλυκοκορτικοειδή Αυξημένες συγκεντρώσεις κορτιζόλης και ACTH Ευρύ κλινικό φάσμα Αντίσταση του άξονα ΥΥΕ στην καταστολή με δεξαμεθαζόνη Μεταλλάξεις στο γονίδιο NR3C1 Μελέτη των μοριακών μηχανισμών δράσης των μεταλλαγμένων υποδοχέων με την εφαρμογή μεθόδων μοριακής και δομικής βιολογίας
See what everyone else has seen but think what no one else has thought Anonymous