Συσχέτιση της έκφρασης ιστικής τρανσγλουταμινάσης με κλινικούς και μοριακούς προγνωστικούς παράγοντες σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού

Συσχέτιση της έκφρασης ιστικής τρανσγλουταμινάσης με κλινικούς και μοριακούς προγνωστικούς παράγοντες σε ασθενείς με καρκίνο του μαστού Ε.Ξυδάκης*, Ε.Κυπαρίδου #, Α.Αθανασιάδης $, Μ.Παπαδάκου*, Α.Οικονομίδου*, Γ.Πανάγος* Β Τμήμα Παθολογίας Ογκολογίας* και Παθολογοανατομικό Τμήμα #, Ογκολογικό Νοσοκομείο Κηφισιάς «Οι Άγιοι Ανάργυροι» Ογκολογικό Τμήμα, Νομαρχιακό Περιφερειακό Γενικό Νοσοκομείο Λάρισας $ Η ιστική τρανσγλουταμινάση (TTG) είναι ένζυμο που φυσιολογικά εκφράζεται από τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα μακροφάγα και τους σκελετικούς μυς. Αποτελεί μέλος μιας οικογένειας ενζύμων (τρανσγλουταμινάσες TG), το γονίδιο της οποίας στον άνθρωπο εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 2q12 (1). Τα διάφορα μέλη της οικογένειας των TG φαίνεται ότι διαφέρουν βιοχημικά και ανοσολογικά και εμπλέκονται σε διαφορετικές βιολογικές λειτουργίες. Έτσι, η plasma transgloutaminase αποτελεί τον παράγοντα πήξεως XIII, η keratinocyte transglutaminase αποτελεί παράγοντα διαφοροποίησης των κερατινοκυττάρων και η TTG σύμφωνα με τις μέχρι τώρα μελέτες φαίνεται να εμπλέκεται τόσο στην επανορθωτική διαδικασία (διαδικασίας επούλωσης) των ιστών συμβάλλοντας στον σχηματισμό σταθερής εξωκυττάριας ουσίας (extracellular matrix εξωκυττάριο στρώμα), όσο και στην λειτουργία του προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου, σχηματίζοντας ένα αδιάλυτο πρωτεϊνικό περίβλημα στα κύτταρα που υφίστανται προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (2, 3). Ρυθμίζει επίσης τις αλληλοεπιδράσεις κυττάρων κυττάρων και κυττάρων στρώματος επιδρώντας σε κυτοκίνες και πρωτεάσες του στρώματος και της κυτταρικής μεμβράνης (π.χ. μετατρέπει τον αδρανή TGF-β σε ενεργό, διασυνδέει την ελαφίνη και μετατρέπει το πλασμινογόνο σε λειτουργική πλασμίνη) (4, 5, 6). Η σχέση της TTG με λειτουργίες όπως η απόπτωση, η ισχυροποίηση της εξωκυττάριας ουσίας και οι συνδέσεις κυττάρου προς κύτταρο ή κυττάρου προς στρώμα οδήγησαν σε μελέτη του ρόλου της στην καρκινογένεση, την διήθηση του στρώματος από τα νεοπλασματικά κύτταρα, την φαρμακοαντοχή και την μεταστατική ικανότητα των νεοπλασμάτων. Πολλές πειραματικές εργασίες με καλλιεργημένα φυσιολογικά ή νεοπλασματικά κύτταρα και πειραματόζωα ενίσχυσαν την αρχική υπόθεση ότι η TTG εμπλέκεται στους παραπάνω μηχανισμούς (7, 8, 9, 1, 11). Στον καρκίνο του μαστού έχει παρατηρηθεί σημαντικά αυξημένη έκφραση της TTG σε σύγκριση με τον φυσιολογικό μαζικό ιστό, γεγονός που είναι υπαινικτικό ενός σημαντικού ρυθμιστικού ρόλου της στην ανάπτυξη και την μετάστασή του (12, 13). Στην δική μας εργασία η έκφραση της TTG συσχετίσθηκε με την έκφραση άλλων προγνωστικών μορίων του καρκίνου του μαστού όπως οι ορμονικοί υποδοχείς (οιστρογονικοί και προγεστερονικοί), το αντι-αποπτωτικό μόριο Bcl-2, το c-erbb-2, το ογκοκατασταλτικό μόριο p53, το ένζυμο καθεψίνη- D και ο παράγοντας πολλαπλασιασμού Ki-67. Παράλληλα, αναζητήθηκε συσχέτιση της έκφρασης της TTG με κλινικούς παράγοντες όπως το στάδιο της νόσου (μέγεθος πρωτοπαθούς εστίας, διήθηση λεμφαδένων), ο βαθμός κακοήθειας, η συνολική επιβίωση, το ποσοστό υποτροπών και ο ελεύθερος υποτροπής/προόδου νόσου χρόνος. Υ λ ι κ ό κ α ι μ έ θ ο δ ο ι Το υλικό της μελέτης απετέλεσαν 43 ασθενείς με καρκίνο μαστού ηλικίας από 28 μέχρι 81 χρόνων (μέση τιμή 51,5, διάμεση τιμή 63, σταθερή απόκλιση 12,68). Τρεις άρρωστοι ήσαν άνδρες και 4 γυναίκες (πίνακας 1). Σε 39 αρρώστους (38 γυναίκες και 1 άνδρα) επανεξετάσθηκε αρχειακό υλικό από τον πρωτοπαθή όγκο και προσδιορίσθηκε η έκφραση των μορίων που προαναφέραμε (TTG, Bcl-2, c-erbb-2, p53, καθεψίνη-d, Ki-67, ER, PR). Σε 4 αρρώστους είτε το υλικό (κύβοι παραφίνης αρχείου) ήταν ανεπαρκές για επανεξέταση είτε δεν υπήρχαν διαθέσιμα επαρκή κλινικά στοιχεία. 1

Πίνακας 1. Δημογραφικά, και κλινικά χαρακτηριστικά των αρρώστων Άρρωστοι (συνολικά) 43 (3,4 ) Αξιολογήσιμοι άρρωστοι 39 (1,38 ) Μέση ηλικία (διακύμανση) 51,5 (28 81) Ιστολογικός τύπος Πορογενές διηθητικό 27 Λοβιακό διηθητικό 8 Φλεγμονώδες πορογενές διηθητικό 2 Σωληνώδες 1 Πορογενές βλεννώδες 1 Βαθμός κακοήθειας 1 2 2 23 3 14 Μέγεθος πρωτοπαθούς όγκου Τ1 1 Τ2 21 Τ3 5 Τ4 3 Διήθηση λεμφαδένων μασχάλης Ν 15 Ν1 12 Ν2 9 Ν3 1 Νχ 2 Στάδιο I 6 II 15 III 1 IV 8 Το υλικό αρχείου, πλακίδια και κύβοι παραφίνης, επανεξετάσθηκε και επαναπροσδιορίσθηκε ο τύπος του όγκου, ο βαθμός κακοήθειας και η συνύπαρξη με το διηθητικό καρκίνωμα ενδοπορικού (in situ) στοιχείου. Σε τομές παραφίνης πάχους 3 4 μικρών προσδιορίστηκε με ανοσοϊστοχημική μέθοδο (enhanced polymer DAKO EnVision System) η έκφραση της TTG με μονοκλωνικό αντίσωμα (clone CUB742) της DAKO και τα αποτελέσματα ταξινομήθηκαν όπως φαίνεται στον πίνακα 2, όπου 1 σταυρός σημαίνει ασθενή έκφραση, οι 2 μέτρια και οι 3 έντονη έκφραση της πρωτεΐνης. Περιπτώσεις όπου η TTG εκφραζόταν μόνο στα αγγεία θεωρήθηκαν αρνητικές. Σε αντίθεση οι περιπτώσεις όπου υπήρχε έκφραση είτε στο στρώμα είτε στα νεοπλασματικά κύτταρα θεωρήθηκαν θετικές. Πίνακας 2. Έκφραση της TTG στο υλικό της μελέτης Έκφραση TTG Στρώμα Νεοπλασματικά κύτταρα Στρώμα ή και Νεοπλασματικά κύτταρα 17 15 6 1 7 7 6 2 6 12 14 3 9 5 13 Θετική χρώση 22 24 33 Αρνητική χρώση 17 15 6 Με την ίδια ανοσοϊστοχημική τεχνική έγινε και ο προσδιορισμός των υπολοίπων δεικτών τα αποτελέσματα του οποίου φαίνονται στον πίνακα 3. Χρησιμοποιήθηκαν μονοκλωνικά και πολυκλωνικά αντισώματα της εταιρείας DAKO και βαθμολογήθηκαν με βάση την ένταση και την έκταση της χρώσης σε ελαφρά, μέτρια και έντονα θετικές. Ειδικότερα η εκτίμηση της χρώσης για το 2

c-erbb-2 έγινε με βάση την ένταση και το πάχος της χρώσης της κυτταρικής μεμβράνης, την πληρότητα του δακτυλίου αυτής και το ποσοστό των κυττάρων στα οποία εκφραζόταν. Πίνακας 3. Έκφραση των μοριακών δεικτών (ER, PR, c-erbb-2, p53, Bcl-2, Ki-67, Cathepsine-D) στο υλικό της μελέτης Έκφραση ER PR c-erbb-2 P53 Bcl-2 Ki-67 Cathepsine D 18 19 15 19 17 2 4 1 1 2 6 3 4 13 23 2 7 8 4 6 6 14 3 3 13 1 14 11 12 1 9 Θετική χρώση 21 2 18 2 22 37 35 Αρνητική χρώση 18 19 21 19 17 2 4 ER+ ή PR+ 23 Α π ο τ ε λ έ σ μ α τ α Σε ότι αφορά την κατανομή της χρώσης τα αποτελέσματά μας είναι ανάλογα με αυτά της βιβλιογραφίας. Έτσι, θετική έκφραση της TTG παρατηρήθηκε σε όλες τις περιπτώσεις στα μικρά και τα μεγάλα αγγεία (εικόνα 1), σε 11 περιπτώσεις είχαμε θετικό αποτέλεσμα μόνο στα κύτταρα του στρώματος και σε 9 περιπτώσεις η χρώση αφορούσε μόνο νεοπλασματικά κύτταρα (εικόνα 2) ενώ σε 13 περιπτώσεις αφορούσε τόσο σε κύτταρα του στρώματος όσο και σε νεοπλασματικά κύτταρα (εικόνα 3). Εικόνα 1. TTG x25 έκφραση στα αγγεία Εικόνα 2. TTG x25 έκφραση στα νεοπλασματικά κύτταρα Εικόνα 3. TTG x25 έκφραση στα νεοπλασματικά κύτταρα και το στρώμα Εικόνα 4. TTG x25 ενδοπορικό και διηθητικό στοιχείο Σε όλες τις περιπτώσεις που συνυπήρχε ενδοπορικό in situ στοιχείο τα νεοπλασματικά κύτταρα 3

του in situ ήταν αρνητικά για TTG ακόμα και όταν τα διηθητικά στοιχεία ή το γύρω στρώμα ήταν θετικά (εικόνα 4) και αυτό το εύρημα είναι συμβατά με την βιβλιογραφία (12). Όπως φαίνεται στον πίνακα 2 ασθενή έκφραση του TTG στο στρώμα, τα νεοπλασματικά κύτταρα ή αμφότερα είχαν 6 άρρωστοι, μέτρια έκφραση είχαν 14 και έντονη έκφραση είχαν 13 άρρωστοι. Δεκαεπτά άρρωστοι δεν εξέφραζαν TTG στο στρώμα και 15 άρρωστοι δεν εξέφραζαν TTG στα νεοπλασματικά κύτταρα, ενώ μόνο 6 άρρωστοι δεν εξέφραζαν TTG στο στρώμα και τα νεοπλασματικά κύτταρα. Η κλινική πορεία των αρρώστων ανάλογα με την έκφραση της TTG φαίνεται στον πίνακα 4. Οι 16 από τους 33 αρρώστους με έκφραση της TTG στο στρώμα ή και στα νεοπλασματικά κύτταρα (48,5%) υπετροπίασαν 14,6 μήνες (4 ως 36) από την διάγνωση και οι 1 από αυτούς (3,3%) κατέληξαν στους 29,3 μήνες (9 ως 54). Η μέση συνολική επιβίωση όσων υπετροπίασαν ήταν 3,8 μήνες (9 ως 64+) ενώ στην ομάδα των μη υποτροπιασάντων ήταν 41,2 μήνες (2+ ως 82+). Στην ομάδα των αρρώστων δίχως έκφραση του TTG το ποσοστό υποτροπών ήταν 83,3% και το ποσοστό θανάτων 66,7%. Ο μέσος χρόνος ως την υποτροπή ή την πρόοδο της νόσου ήταν 16,8 μήνες ( ως 35) και η μέση συνολική επιβίωση ήταν 25,7 μήνες (3 ως 38) ενώ 1 άρρωστος με χαμηλό στάδιο νόσου (ΙΙ) και χαμηλό βαθμό κακοήθειας (grade 2) δεν έχει ακόμη υποτροπιάσει στους 56 μήνες. Πίνακας 4. Ελεύθερη προόδου νόσου/υποτροπής επιβίωση και συνολική επιβίωση ανάλογα με την έκφραση TTG Υποτροπή Χρόνος ως την υποτροπή (μήνες) Θάνατοι Συνολική επιβίωση (μήνες) Με υποτροπή Δίχως υποτροπή 48,5 14,6 (4-36) 3,3 3,8 (9-64) 41,2 (2-82) 83,3 16,9 (-35) 66,7 25,6 (3-38) +26, +56 TTG 1+ 43,8 11,1 (6-23) 25, 29,2 (6-23) 43, (17-71) TTG 2+ 47,1 12,9 (4-23) 29,4 33,5 (4-23) 46,6 (23-82) TTG 3+ 6, 17,3 (4-36) 33,3 32,4 (4-36) 33,5 (2-71) Οι διαφορές ως προς τον ελεύθερο υποτροπής/προόδου της νόσου χρόνο ανάλογα με την έκφραση της TTG στο στρώμα και τα νεοπλασματικά κύτταρα εμφανίζονται στο διάγραμμα 1. Η ανάλυση των δεδομένων ανάλογα με τον βαθμό της έκφρασης της TTG (πίνακας 4) αναδεικνύει την τάση αυξήσεως του ελεύθερου υποτροπής/προόδου της νόσου χρόνου ενώ στους υπόλοιπους παράγοντες (ποσοστό υποτροπών, ποσοστό θανάτων, συνολική επιβίωση) δεν αναδεικνύονται σαφείς τάσεις. Η σύγκριση της έκφρασης της TTG με την έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων (ER) αναδεικνύει ότι το σύνολο των ER θετικών όγκων εκφράζουν και την TTG. Η ανάλυση των κλινικών δεδομένων (διάγραμμα 2) αναδεικνύει ότι στην ομάδα των ER αρνητικών αρρώστων η έκφραση της TTG βελτιώνει την ελεύθερη υποτροπής/προόδου νόσου επιβίωσης, την συνολική επιβίωση και το ποσοστό υποτροπών (πίνακας 5). ER+ ER+ ER ER Πίνακας 5. Ελεύθερη προόδου νόσου/υποτροπής επιβίωση και συνολική επιβίωση ανάλογα με τους ορμονικούς υποδοχείς και την έκφραση TTG Υποτροπή Χρόνος ως την υποτροπή (μήνες) Θάνατοι Συνολική επιβίωση (μήνες) Με υποτροπή Δίχως υποτροπή 38,1 19,1 (8-36) 23,8 33,3 (14-37) 43,1 (2-82) NA NA NA NA NA 66,6 1, (4-23) 41,7 28,2 (9-54) 35, (17-44) 83,3 16,9 (-35) 66,7 25,7 (3-38) +26, +56 4

1,9,8 cells+ stroma+ cellsstroma+cells+ stroma- stroma-cells-,7,5,3,2,1 1 13 25 37 49 61 73 Μήνες ως την υποτροπή ή την πρόοδο νόσου Διάγραμμα 1. Καμπύλες ελεύθερης υποτροπής/προόδου νόσου επιβίωσης ανάλογα με την έκφραση της TTG 1,8 ER+() ER- ER- ER-TTG-,2 1 13 25 37 49 61 73 85 Μήνες ως την υποτροπή ή την πρόοδο της νόσου Διάγραμμα 2. Καμπύλες ελεύθερης υποτροπής/προόδου νόσου επιβίωσης ανάλογα με την έκφραση ER και TTG Η σύγκριση της έκφρασης της TTG με την έκφραση του c-erbb-2 (εικόνα 5) αναδεικνύει ότι η απουσία έκφρασης του c-erbb-2 σχετίζεται με μικρότερο ποσοστό υποτροπών και θανάτων (55,6% vs 41,2% και 38,9 vs 23,5% αντίστοιχα) ενώ οι χρόνοι (ελεύθερης υποτροπής/προόδου της νόσου, επιβίωσης όσων υποτροπιάζουν και επιβίωσης όσων δεν έχουν υποτροπιάσει) είναι ελαφρά 5

μεγαλύτεροι στην ομάδα δίχως έκφραση του c-erbb-2. Στην ομάδα όπου η TTG δεν εκφράζεται η απουσία έκφρασης και του c-erbb-2 οδηγεί σε μικρά βελτίωση των ποσοστών υποτροπών και θανάτων αφενός και ικανή επιμήκυνση των χρόνων αφετέρου (πίνακας 6). Εικόνα 5. c-erbb-2 x25 Εικόνα 6. Bcl-2 x 25 Πίνακας 6. Ελεύθερη προόδου νόσου/υποτροπής επιβίωση και συνολική επιβίωση ανάλογα με την έκφραση του c-erbb-2 και του TTG c-erbb-2+ c-erbb-2+ c-erbb-2 c-erbb-2 Υποτροπή Χρόνος ως την υποτροπή (μήνες) Θάνατοι Συνολική επιβίωση (μήνες) Με υποτροπή Δίχως υποτροπή 55,6 13,5 (4-36) 38,9 29,4 (9-54) 35,9 (2-82) 1, 11,6 (-23) 1, 18, (3-33), 41,2 17,4 (9-35) 23,5 34,6 (14-44) 48,5 (17-71) 75, 2,3 (12-35) 5, 3,9 (28-38) 56+ 1,9 cerb+ TTG-cErb+ cerb- TTG-cErb-,8,7,5,3,2,1 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 Μήνες ως την υποτροπή ή την πρόοδο της νόσου Διάγραμμα 3. Καμπύλες ελεύθερης υποτροπής/προόδου νόσου επιβίωσης ανάλογα με την έκφραση c-erbb -2 και TTG Η ανάλυση των κλινικών δεδομένων ανάλογα με την έκφραση του c-erbb (διάγραμμα 3) αναδεικνύει ότι επί παρουσίας έκφρασης TTG στο στάδιο ΙΙΙ ο ελεύθερος υποτροπής χρόνος 6

βελτιώνεται. Στα λοιπά υποσύνολα οι μικροί αριθμοί των αρρώστων δεν επιτρέπουν την διαμόρφωση τάσεων. Η σύγκριση της έκφρασης της TTG με την έκφραση του Bcl-2 (εικόνα 6) αναδεικνύει ότι η παρουσία έκφρασης του Bcl-2 μειώνει κατά 1 περίπου ποσοστιαίες μονάδες τα ποσοστά υποτροπών και θανάτων (5% vs 58,8% και 31,8% vs 41,2% αντίστοιχα) ενώ παράλληλα αυξάνει τον χρόνο ως την υποτροπή/πρόοδο της νόσου, την επιβίωση των υποτροπιασάντων και την επιβίωση όσων δεν έχουν ακόμη υποτροπιάσει ( 17,9 vs 12,2 μήνες, 32,2 vs 24,2 μήνες και 45,6 vs 26,2 μήνες αντίστοιχα) (πίνακας 7). Η ανάλυση των κλινικών δεδομένων (διάγραμμα 4) αναδεικνύει ότι η έκφραση του Bcl-2 βελτιώνει την ελεύθερη υποτροπής/προόδου νόσου επιβίωσης επί παρουσίας έκφρασης TTG τόσο στο σύνολο όσο και στα υποσύνολα με καλή και κακή διαφοροποίηση του όγκου (χαμηλής και υψηλής κακοήθειας). 1,8 BCL2+ BCL2- BCL2+Gr1+2 BCL2+Gr3 BCL2-Gr1+2 BCL2-Gr3,2 1 13 25 37 49 61 73 Μήνες ως την υποτροπή ή την πρόοδο της νόσου Διάγραμμα 4. Καμπύλες ελεύθερης υποτροπής/προόδου νόσου επιβίωσης ανάλογα με την έκφραση Bcl-2 και TTG 1,9,8 I&II TTG-I&II III TTG-III IV TTG-IV,7,5,3,2,1 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 Μήνες ως την υποτροπή ή την πρόοδο της νόσου Διάγραμμα 5. Καμπύλες ελεύθερης υποτροπής/προόδου νόσου επιβίωσης ανάλογα με το 7

στάδιο της νόσου κατά την διάγνωση και την έκφραση TTG Η ανάλυση των κλινικών δεδομένων ανάλογα με το στάδιο της νόσου στο χρόνο της αρχικής διάγνωσης (διάγραμμα 5) αναδεικνύει ότι επί παρουσίας έκφρασης TTG στο στάδιο ΙΙΙ ο ελεύθερος υποτροπής χρόνος βελτιώνεται. Στα λοιπά υποσύνολα οι μικροί αριθμοί των αρρώστων δεν επιτρέπουν την διαμόρφωση τάσεων. Στην ομάδα των αρρώστων με νόσο σταδίου I και II όλοι οι άρρωστοι πλην ενός ενεφάνιζαν έκφραση της TTG. Τα ποσοστά υποτροπών και θανάτων ήταν 28,6 και 23,8 αντίστοιχα και ο ένας άρρωστος που δεν εκφράζει TTG δεν έχει ακόμη υποτροπιάσει (πίνακας 8). I-II I-ΙΙ ΙΙΙ ΙΙΙ IV IV Πίνακας 8. Ελεύθερη προόδου νόσου/υποτροπής επιβίωση και συνολική επιβίωση ανάλογα με το στάδιο της νόσου κατά τη διάγνωση και την έκφραση του TTG Υποτροπή Χρόνος ως την υποτροπή (μήνες) Θάνατοι Συνολική επιβίωση (μήνες) Με υποτροπή Δίχως υποτροπή 3, 21,6 (6-36) 25, 3, (9-44) 44,2 (15-82),* NA,* NA 56+ 62,5 11, (4-16) 25, 34,5 (33-36) 27,2 (2-44) 1, 23, 14 5, 33, 26+ NA 1, 9,8 (6-13) 6, 24,6 (11-54) NA 1,, 12, 35 1, 23,1 (3-38) NA Η έκφραση του TTG στους 5 από τους 8 αρρώστους με στάδιο IV συνδέεται με μικρότερο ποσοστό θανάτων (6% vs 1%) και με κατά τι μεγαλυτέρα συνολική επιβίωση (24,6 μήνες vs 23 μήνες) (πίνακας 8). Στην ομάδα με νόσο σταδίου III TTG εξέφραζε το 8% των αρρώστων. Και οι 2 άρρωστοι που δεν εξέφραζαν TTG έχουν υποτροπιάσει στους 14 και 23 μήνες αντίστοιχα και ο ένας έχει ήδη καταλήξει στους 53 μήνες ενώ ο άλλος ζει 26 μήνες από την διάγνωση. Οι 5 από τους 8 άρρωστους με έκφραση του TTG (62,5%) υπετροπίασαν στους 1,9 μήνες και οι 2 (25%) κατέληξαν στους 33 και 36 μήνες από την διάγνωση. Η μέση επιβίωση για τους υποτροπιάσαντες ήταν 34,5 μήνες ενώ οι 3 άρρωστοι που δεν έχουν υποτροπιάσει ζουν 2+, 35+ και 44+ μήνες. Από τους λοιπούς μοριακούς προγνωστικούς παράγοντες 2 άρρωστοι εξέφραζαν το p53, όλοι πλην 2 εξέφραζαν το ki-67 και όλοι πλην 4 εξέφραζαν την καθεψίνη D (πίνακας 3). Εικοσιεπτά άρρωστοι είχαν ένα τουλάχιστον καλό προγνωστικό παράγοντα (ER, PR, Bcl-2) και οι 23 από αυτούς εξέφραζαν TTG. Η έκφραση TTG οδηγεί σε μικρότερα ποσοστά υποτροπών και θανάτων (43,5% vs 8% και 26,1% vs 6% αντίστοιχα), παρόμοιο ελεύθερο υποτροπής/προόδου της νόσου χρόνο και αυξημένη επιβίωση όσων υποτροπίασαν (33,1 μήνες vs 24,7 μήνες) (πίνακας 9). Στην ομάδα που δεν είχε κανένα καλό προγνωστικό παράγοντα 2 από τους 12 αρρώστους δεν εξέφραζαν TTG. Η ανάλυση των κλινικών δεδομένων ανάλογα με την έκφραση ή όχι της TTG δεν αναδεικνύει διάφορο συμπεριφορά του νεοπλάσματος (5% υποτροπές και παρόμοιοι χρόνοι και στις 2 υποομάδες). Η ανάλυση των κλινικών δεδομένων ανάλογα με την παρουσία ενός τουλάχιστον καλού προγνωστικού παράγοντα στο χρόνο της αρχικής διάγνωσης (διάγραμμα 6) αναδεικνύει ότι επί παρουσίας έκφρασης TTG ο ελεύθερος υποτροπής χρόνος βελτιώνεται στην υποομάδα των αρρώστων με ένα τουλάχιστον καλό προγνωστικό παράγοντα. Στην υποομάδα δίχως ένα τουλάχιστον καλό προγνωστικό παράγοντα οι μικροί αριθμοί αρρώστων δεν επιτρέπουν την επιβεβαίωση της τάσεως αυτής. 8

1,9,8 Good TTG-Good NonGood TTG-NonGood,7,5,3,2,1 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 57 61 65 69 73 77 81 85 Μήνες ως την υποτροπή ή την πρόοδο της νόσου Διάγραμμα 6. Καμπύλες ελεύθερης υποτροπής/προόδου νόσου επιβίωσης ανάλογα με την παρουσία ενός τουλάχιστον καλού προγνωστικού παράγοντα κατά την διάγνωση και την έκφραση TTG Πίνακας 9. Ελεύθερη προόδου νόσου/υποτροπής επιβίωση και συνολική επιβίωση ανάλογα με την παρουσία ενός τουλάχιστον καλού προγνωστικού παράγοντα (1κππ) και την έκφραση του TTG 1κππ+ 1κππ+ 1κππ 1κππ Σ υ ζ ή τ η σ η Υποτροπή Χρόνος ως την υποτροπή (μήνες) Θάνατοι Συνολική επιβίωση (μήνες) Με υποτροπή Δίχως υποτροπή 41,7 17, (4-36) 25, 36,1 (14-54) 45,1 (2-82) 1, 18, (-35) 75, 24,8 (3-38) ΝΑ 6, 1 (6-23) 4, 21,9 (9-44) 35, (17-44) 5, 12 5, 28 56+ Παρά το γεγονός ότι από πολλές ομάδες ερευνητών έχει αναγνωρισθεί ότι η TTG παρουσιάζει αυξημένη έκφραση στον καρκίνο του μαστού, ο ακριβής της ρόλος στην βιολογία του δεν έχει ακόμη διευκρινισθεί (12, 13). Στην προσιτή σε μας βιβλιογραφία βρήκαμε ελάχιστες μελέτες της έκφρασης της TTG στον ανθρώπινο καρκίνο του μαστού, και σ αυτές γίνεται κυρίως εκτίμηση του τρόπου κατανομής της χρώσης στους ιστούς (νεοπλασματικά κύτταρα, στρώμα, κλπ), διερεύνηση της αξιοπιστίας του ανοσοϊστοχημικού προσδιορισμού της TTG σε σχέση με άλλες μεθόδους, και του είδους των κυττάρων στα οποία γίνεται η παραγωγή της. Σε καμία από τις εργασίες αυτές δεν γίνεται αναφορά στην πιθανή σχέση της έκφρασης της TTG με την πρόγνωση ή συσχέτισή της με άλλους αναγνωρισμένους προγνωστικούς παράγοντες. Αντίθετα, υπάρχουν μελέτες που αποδίδουν προγνωστική αξία στην αυξημένη έκφραση της TTG σε κύτταρα γλοιωμάτων (14), αξία δείκτου αποτελεσματικότητος της ορμονοθεραπείας στον καρκίνο του προστάτη (15), πιθανή αξία δείκτου πρόβλεψης κινδύνου για την ανάπτυξη μη μικροκυτταρικού 9

καρκίνου του πνεύμονα (16), και πιθανού δείκτη διηθητικής εξέλιξης στο καρκίνωμα της ουροδόχου κύστεως (17). Σε κάθε περίπτωση τονίζεται η σημασία του ρόλου της TTG στην διήθηση του στρώματος, στην μεταστατική διαδικασία, στον αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο και την φαρμακοαντοχή (7). Ακόμη, σε μερικές από τις μελέτες αυτές γίνεται συσχέτιση της έκφρασης της TTG με την έκφραση του Bcl-2. Αναφέρεται μάλιστα αντίστροφη σχέση ανάμεσα στους δύο δείκτες (14) κάτι που δεν αποδείχθηκε στο δικό μας υλικό, αν και υπάρχει η τάση όγκοι που εκφράζουν έντονα Bcl-2 να είναι αρνητικοί για TTG. Στο δικό μας υλικό, από τα ευρήματά μας φαίνεται ότι η έκφραση της TTG είναι συχνότερη σε περιπτώσεις με παράταση της επιβίωσης ακόμα και όταν η νόσος είναι προχωρημένη κατά τη διάγνωση ή υπάρχουν μεταστάσεις. Η ικανότητα της TTG να ισχυροποιεί το στρώμα γύρω από τα νεοπλασματικά κύτταρα δημιουργώντας σταθερούς δεσμούς μεταξύ των πρωτεϊνών του στρώματος εξηγεί την ευνοϊκή της επίδραση στις περιπτώσεις με μικρό στάδιο νόσου ενώ η ευεργετική της δράση στην αποπτωτική διαδικασία ερμηνεύει την παράταση της επιβίωσης των ασθενών με προχωρημένη ή μεταστατική νόσο. Στην πρώτη περίπτωση η TTG καθυστερεί την ανάπτυξη του όγκου και την διείσδυση νεοπλασματικών κυττάρων στα αγγεία ενώ στη δεύτερη διευκολύνει την αποπτωτική δράση της θεραπείας είτε αυτή είναι χημειοθεραπεία είτε ακτινοθεραπεία. Η συχνή συνέκφραση της TTG με δυσμενείς κατά τα άλλα δείκτες όπως το p53, το Ki-67 και το c- ErbB-2 εξηγείται με βάση αυτή την τελευταία σχέση της TTG με την αποπτωτική λειτουργία δεδομένου ότι: 1) το p53 είναι γνωστό ότι σχετίζεται επίσης με την απόπτωση, 2) το Ki-67 σημαίνει πληθυσμούς που πολλαπλασιάζονται με ταχείς ρυθμούς και είναι επομένως ασταθείς και με υψηλότερους ρυθμούς απόπτωσης αλλά και πιο ευαίσθητοι στην χημειοθεραπεία, 3) το c-erbb-2 σαν δείκτης υπάγεται στην ομάδα των δυσμενών προγνωστικών δεικτών. επί θετικότητος του c- ErbB-2 σε αρρώστους με μεταστατική νόσο η ειδική θεραπεία με το μονοκλωνικό αντίσωμα πιθανώς ευνοείται όταν συνεκφράζεται η TTG στον ίδιο κυτταρικό πληθυσμό. Σε ότι αφορά στο Bcl-2, που έχει τοποθετηθεί στους ευνοϊκούς προγνωστικούς δείκτες αν και η δράση του είναι αντιαποπτωτική, φαίνεται ότι σύμφωνα με τα ευρήματά μας η παρουσία του σημαίνει την παράταση του μέχρι την υποτροπή χρόνου. Αυτό μπορεί πιθανώς να αποδοθεί στο γεγονός ότι σε πολύ μεγάλο ποσοστό Bcl-2 εκφράζουν όγκοι με υψηλή διαφοροποίηση (52% στο δικό μας υλικό) ενώ αντίθετα όγκοι χαμηλής διαφοροποίησης εκφράζουν Bcl-2 σπανιότερα (35% στο δικό μας υλικό). Το γεγονός ότι ο αριθμός των ασθενών μας είναι μικρός για να δημιουργηθούν μεγάλες ομοιογενείς ομάδες από πλευράς σταδίου νόσου, βαθμού κακοήθειας, θεραπευτικής αντιμετώπισης κλπ δεν μας επιτρέπει να εφαρμόσουμε στατιστική ανάλυση που να αποδεικνύει την αρχική μας υπόθεση. Παρόλα αυτά, η εμφανής τάση αυξημένης επιβίωσης, αυξημένης ελεύθερης προόδου νόσου επιβίωσης και μειωμένου ποσοστού υποτροπών στις ομάδες με αυξημένη έκφραση TTG που παρατηρείται στα δεδομένα μας μας ενθαρρύνουν να συνεχίσουμε την έρευνά μας σε μεγαλύτερο αριθμό περιστατικών. Β ι β λ ι ο γ ρ α φ ί α 1. Gentile V, Davies PS, Baldini A: The human tissue transgloutaminase gene maps on chromosome 2q12 by in situ fluorescence hybridization. Genomics 1994;2:295-297 2. Aeschlimann D, Paulsson M: Cross-linking of laminin-nidogen complexes by tissue transglutaminase. J Biol Chem 1991;266:1538 3. Fesus L, Tghomazy V, Falus A: Induction and activation of tissue transgloutaminase during programmed cell death. FEBS 1987;224:14-18 4. Kojima S, Nara K, Rifkin DB: Requirement for transgloutaminase in the activation of latent transforming growth factor-beta in bovine endothelial cells. J Cell Biol 1993;121:439-448 5. Nara K, Ito S, Ito T et al: Elastase inhibitor elafin is a new type of proteinase inhibitor which has a transgloutaminase-mediated anchoring sequence termed cementoin. J Biochem (Tokyo) 1994;115:441-448 6. Bendixen E, Borth W, Harpel PC: Transglutaminase catalyse cross-linking of plasminogen to fibronectin and human endothelial cells. J Biol Chem 1993;268:21962-21967 7. Melta K: High levels of transgloutaminase expression in doxorubicin-resistant human breast 1

carcinoma cells. Int J Cancer 1994;58:4-46 8. Knight GR, Rees RC, Elliot BM, Griffin M: The existence of an inactive form of transgloutaminase within metastasizing tumors. Biochim Biophys Acta 199;153:13-2 9. Knight GR, Rees RC, Griffin M: Apoptosis: a potential role for cytosolic transgloutaminase and its importance in tumor progression. Biochim Biophys Acta 1991;196:312-318 1. Benitati S, Abbruzzese A, Cardinali M: Differences in the post-translational modification of proteins by polyamines between weakly and highly metastatic B16 melanoma cells. Int J Cancer 1993;53:792-797 11. Haroon ZA, Lai TS, Hettasch JM et al: Tissue transgloutaminase is expressed as a host response to tumor invasion and inhibits tumor growth. Lab Invest 1999;79:1679-1686 12. Hettasch JM, Bandarenko N, Burchette JL et al: Tissue transgloutaminase expression in human breast cancer. Lab Invest 1996;75:637-645 13. Grigoriev MY, Suspitsin EN, Togo AV et al: Tissue transgloutaminase expression in breast carcinomas. J Exp Clin Cancer Res 21;2:265-268 14. Iwaki T, Miyazono M, Hitosumatsu T, Tateishi J: An Immunohistochemical study of tissue transgloutaminase in gliomas with reference to their cell dying processes. Am J Pathol 1994;145:776-781 15. Rittmaster R, Thomas L, Wright AS et al: The utility of tissue transgloutaminase as a marker of apoptosis during treatment and progression of prostate cancer. J Urol 199;162:2165-2169 16. Zhang H, Yousem S, Franklin WA et al: Differentiation and programmed cell death-related intermediate biomarkers for the development of non-small cell lung cancer: a pilot study. Human Pathol 1998;29:965-971 17. Hager H, Jensen PH, Hamilton-Dutoit S et al: Expression of tissue transgloutaminase in human bladder carcinoma. J Pathol 1997;183:398-43 Π ε ρ ί λ η ψ η Σε 43 ασθενείς με καρκίνο του μαστού μελετήθηκε ανοσοϊστοχημικώς, σε μονιμοποιημένο σε παραφίνη νεοπλασματικό ιστό, η έκφραση της ιστικής τρανσγλουταμινάσης (tissue transgloutaminase - TTG). Παράλληλα προσδιορίστηκαν οι ορμονικοί υποδοχείς, η c-erbb-2, η p53, η bcl-2, το Ki-67 και η cathepsine-d. Από τους 39 ασθενείς που αξιολογήθηκαν, οι 38 ήσαν γυναίκες, με μέση ηλικία 59 έτη. Τριάντα ένας ασθενείς είχαν πορογενές και 8 είχαν λοβιακό καρκίνωμα. Καλά ή μέτρια διαφοροποιημένο όγκο είχαν 25 ασθενείς ενώ πτωχά διαφοροποιημένο όγκο 14 ασθενείς. Πρώιμη νόσο (στάδια Ι ή ΙΙ) είχαν 21 ασθενείς και τοπικά προχωρημένη ή μεταστατική νόσο (στάδια ΙΙΙ ή IV) είχαν 18 ασθενείς. Συμμετοχή των μασχαλιαίων λεμφαδένων και/ ή μακρινές μεταστάσεις είχαν 25 ασθενείς. Είκοσι επτά ασθενείς είχαν τουλάχιστον ένα ευνοϊκό μοριακό προγνωστικό παράγοντα ενώ 38 ασθενείς είχαν τουλάχιστον ένα δυσμενή προγνωστικό παράγοντα. Χημειοθεραπεία χορηγήθηκε σε 35 ασθενείς. Από το σύνολο των 39 ασθενών έχουν υποτροπιάσει 21 ασθενείς, με μέσο χρόνο μέχρι την υποτροπή 23,5 μήνες. Είκοσι πέντε ασθενείς βρίσκονται εν ζωή και ο μέσος χρόνος επιβίωσης είναι 35,3 μήνες. Από τους 25 ασθενείς με λεμφαδενικές και/ή μακρινές μεταστάσεις έκφραση TTG διαπιστώθηκε σε 16 και έκφραση bcl-2 σε 13 ασθενείς. Σε 4 ασθενείς δεν εκφράζονταν ούτε TTG ούτε bcl-2, ενώ σε 8 ασθενείς εκφράζονταν και οι δύο δείκτες. Όσον αφορά τους 14 ασθενείς χωρίς λεμφαδενικές ή μακρινές μεταστάσεις, έκφραση TTG διαπιστώθηκε σε 13 και έκφραση bcl-2 σε 9 ασθενείς. Σε έναν ασθενή δεν εκφράζονταν ούτε TTG ούτε bcl-2, ενώ σε 9 ασθενείς εκφράζονταν και οι δύο δείκτες. Η ανάλυση αυτών των υπο-ομάδων παρέχει επαρκείς ενδείξεις ότι η έκφραση της TTG συσχετίζεται με παράταση της επιβίωσης τόσο στους ασθενείς με πρώιμη όσο και στους ασθενείς με τοπικά προχωρημένη ή μεταστατική νόσο, ενώ η έκφραση της bcl-2 σχετίζεται με παράταση του χρόνου μέχρι την υποτροπή ειδικά στους ασθενείς με τοπικά προχωρημένη ή μεταστατική νόσο. Παρόμοια, η συσχέτιση της TTG με την παρουσία δυσμενών προγνωστικών παραγόντων επιβεβαιώνει την ευνοϊκή επίδραση της έκφρασης TTG στην συνολική επιβίωση σε όλες τις υπο-ομάδες. Συμπερασματικά, τα αποτελέσματα της μελέτης μας υποδηλώνουν ότι η έκφραση TTG σε καρκίνο του μαστού συνιστά έναν ευνοϊκό προγνωστικό παράγοντα για την επιβίωση, πιθανά επειδή σημαίνει κυτταρικούς πληθυσμούς ευπαθείς στην αποπτωτική δράση της χημειοθεραπείας. 11