Jure Stojan in Marko Goličnik Medicinska fakulteta

Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo, 2015/16 Program: Laboratorijska biomedicina Predmet: MOLEKULARNA ENCIMOLOGIJA Jure Stojan in Marko Goličnik Medicinska fakulteta Prof. dr. Matjaž Zorko do generacije 2013/14

Struktura predmeta: predavanja vaje seminarji Urnik Program Vaje Seminarji Kolokviji Izpit http://ibk.mf.uni-lj.si/teaching/lab_medicina

MOLEKULARNA ENCIMOLOGIJA PROGRAM PREDAVANJ 2015/16 DATUM OBLIKA POUKA (P = predavanje, V = vaje) PROSTOR 1. 10. / 15.00 četrtek P1 (MG): proteinska narava encimov, struktura, stabilnost in fleksibilnost, konformacijske spremembe, koncept aktivnega mesta, klasifikacija MF:LP 8. 10. / 15.00 četrtek P2 (JS): encimska kataliza (kovalentna, acido-bazna, s približanjem in orientiranjem), termodinamične osnove encimske katalize, časovni potek encimske reakcije, začetna hitrost MF:LP VAJE 13. 10. / 08.00 torek V1 (JS+MG): specifična aktivnost alkalne fosfataze razdelitev seminarjev MF:IBK vajalnica 15. 10. / 15.00 četrtek P3 (MG): vplivi na hitrost encimske reakcije, vpliv substrata na hitrost encimske reakcije (Michaelisova kinetika), ravnotežno in stacionarno stanje MF:LP 22. 10. / 15.00 četrtek P4 (JS): hitra kinetika in nastajanje ravnotežnih in stacionanih stanj, vrste inhibicije (reverzibilna, ireverzibilna), matematično modeliranje encimskih reakcij (holinesteraza in tubokurarin oz. eserin) MF:LP VAJE 27. 10. / 08.00 torek V2 (JS+MG): začetna hitrost, K m, V max, k kat razdelitev seminarjev MF:IBK vajalnica K 29. 10. / 15.00 četrtek 5. 11. / 15.00 četrtek Integracija 1 + kolokvij 1 (MG) P5 (JS): molekulski mehanizem encimske reakcije (kimotripsin, acetilholinesteraza), alosterični pojavi, alosterija, kooperativnost, kinetika, matematične osnove, molekulski modeli, pseudokooperativnost MF:LP MF:LP VAJE 10. 11. / 08.00 torek V3 (JS+MG): hitra kinetika in modeliranje - demonstracija MF:IBK vajalnica 12. 11. / 15.00 četrtek P6 (JS): primeri alosteričnih encimov (PFK, CAT, ATC) MF:LP 19. 11. / 15.00 četrtek P7 (MG): klasifikacija encimov in primeri delovanja značilnih predstavnikov posameznih encimskih razredov MF:LP K IZPIT S 26. 11. / 15.00 četrtek 3. 12. / 15.00 četrtek 8. 12 / 15.00 torek 10. 12. / 15.00 četrtek P8 (MG): uporaba encimologije v kliniki (diagnostika, terapija, encimi kot tarče zdravil) in biotehnologiji (mikroorganizmi, imobilizirani encimi, kat. protitelesa) Integracija 2 + kolokvij 2 (JS) S1 (JS+MG) S2 (JS+MG) MF:LP MF:LP MF:LP MF:LP januar 2015 izpit (1. rok) po razporedu MF:IBK februar 2015 izpit (2. rok) po razporedu MF:IBK junij 2015 izpit (3. rok) po razporedu MF:IBK september 2015 izpit (4. rok) po razporedu MF:IBK

KJE JE KAJ: VAJE PREDAVANJA, SEMINARJI VAJE

Predavanje 1: STRUKTURA PROTEINOV IN NJEN POMEN ZA DELOVANJE ENCIMOV Marko Goličnik Medicinska fakulteta GLEJ: http://ibk.mf.uni-lj.si/teaching/lab_medicina/default.html marko.golicnik@mf.uni-lj.si

MOLEKULARNA ENCIMOLOGIJA Encimi so biološki katalizatorji: Skrbijo za dovolj veliko hitrost kemičnih reakcij. Pomembno sodelujejo pri regulaciji bioloških procesov. Omogočajo črpanje energije in njeno porabo v organizmih. V klinični biokemiji so pomembni markerji in reagenti. Po kemijski strukturi: PROTEINI in RNA (klasični encimi in ribocimi). Ribocimi so izredno pomembni pri zorenju mrna in pri sintezi proteinov Vse druge procese (reakcije) katalizirajo klasični encimi več 10.000 različnih PROTEINOV (~75.000 v človeku). ZATO MORAMO POZNATI STRUKTURO PROTEINOV!

PROTEINE SESTAVLJAJO AMINOKISLINE (AK) Glavne lastnosti (20 standardnih) aminokislin - klasifikacija AK - velikost - naboj - polarnost - hidrofobnost - aromatske AK - 3D-konfiguracija AK in optična aktivnost a C-atom Ta del je enak! Le po R se razlikujejo! L-AMINOKISLINA PAZI: več 100 nestandardnih AK (post-transl. modif. & D-AK)!

Hidrofilne (polarne) AK: - nenabit radikal nabit radikal

Hidrofobne (nepolarne) AK: aromatske posebne

PROSTA AMINOKISLINA R AMINOKISLINA (AK) R = AK radikal (stranska veriga) R 1 -COOH + H 2 N-R 2 R 1 -CONH-R 2 + H 2 O AMINOKISLINA V PROTEINU N R 3 C AK ostanek (residue) = AK H 2 O

Velikost AK-ostanka: 100-130 Da (110 Da), a nekaj izjem! AK ostanek (residue) AK radikal (stranska veriga) dodaj 18 (H 2 O) za maso AK! odštej 56 za maso R (stranske verige)!

Velikost je pomembna pri zamenjavah aminokislin!

N R 3 C NABOJ: Odvisen od pk a vrednosti (25 C) in ph Samo R, N- and C- konci so pomembni pri proteinih Aminokislina a-cooh a-nh 3 + R Alanin 2.3 9.9 Glicin 2.4 9.8 Fenilalanin 1.8 9.1 Serin 2.1 9.2 Valin 2.3 9.6 Asparaginska k. 2.0 10.0 3.9 Glutaminska k. 2.2 9.7 4.3 Histidin 1.8 9.2 6.0! Cistein 1.8 10.8 8.3 Tirosin 2.2 9.1 10.9! Lizin 2.2 9.2 10.8 Arginin 1.8 9.0 12.5

Aromatske AK (Phe, Tyr, Trp) velike resonanca: -OH v Tyr bolj kisla polarnost: posebne interakcije (kation p) absorbirajo UV svetlobo

3D STRUKTURA AK DOLOČA 3D STRUKTURO PROTEINOV POMEMBNO ZA PREPOZNAVANJE: E-S, E-I, R-H, Ag-Ab rotacija linearno polarizirane svetlobe (a = [a].l.c) D,L-system Posebne funkcije! STANDARD!

Bliskovit in strahovito poenostavljen pregled proteinske sinteze DNA primarni transkript (pre-mrna) pre-mrna se procesira v mrna mrna je zapis za I. str. proteinov v katero se povežejo AK s peptidno vezjo (I. struktura = zaporedje AK) nekatere AK se modificirajo 1D 3D strukturo (II., III. in IV. (?) struktura) kontrola kvalitete delovanja

Shema sinteze proteinov Transkripcija (prepis DNA mrna) nukleotidi v nukleotide pre-mrna Zorenje mrna Translacija (prevod mrna protein) Nukleotidi v aminokisline mrna Postranslacijske modifikacije AK (samo evkarionti) Nastanek peptidne vezi: R 1 -COOH + H 2 N-R 2 R 1 -CONH-R 2 + H 2 O

Post-translacijske modifikacije spremenijo sekvenco, ali odstranijo nezaželene dele proteina, vpeljejo nove funkcionalne skupine in imajo tudi regulatorno vlogo. Pomembne modifikacije: proteolitično procesiranje = izrezovanje delov proteinske verige spremembe N- in C-koncev glikozilacija (pripenjanje sladkorjev) pripenjanje lipidov sulfatiranje g-karboksi-glutaminska kislina hidroksilacija fosforilacija ADP-ribozilacija disulfidni mostički pripenjanje funkcionalnih skupin

Proteolitično procesiranje: aktivacija encimov Namen: encim postane aktiven tam kjer deluje in ne na mestu sinteze! Značilno predvsem za prebavne encime.

Pripenjanje lipidov: interakcija z membrano, 3D struktura

Pripenjanje malih funkcionalnih skupin vodi v spremembo 3D strukture in aktivnosti fosforilacija g-karboksi-glutamat metilacija sulfatiranje hidroksilacija

Nastanek disulfidne vezi: stabilizacija 3D-strukture

Primarna struktura = sekvenca aminokislin PO 4 3- peptidne vezi 1 2 3 4 5 Ser Gly Tyr Ala Leu S G Y A L Oštevilčenje od N-konca do C-konca! Sekvenco lahko določimo neposredno iz proteina ali posredno iz mrna ali DNA.

S poravnavo proteinskih sekvenc določamo sorodnost med vrstami, pa tudi funkcijo neznanih proteinov.

Samosestavljanje polipeptidne verige: od primarne do terciarne (kvartarnarne) strukture

ŠIBKE INTERAKCIJE odboj pri dotiku van der Waalsove interakcije elektrostatske interakcije R 1 -COO - H 3 N + -R 2 vodikova vez hidrofobne interakcije ion - p interakcije (aromatske AK) CH 3 -CH 2 -CH 3 CH 3 -CH 2 -CH 3 Vse te šibke interakcije so med AK radikali, H-vezi pa tudi med CO in HN- v peptidni vezi.

Peptidna vez R 1 -COOH + H 2 N-R 2 R 1 -CONH-R 2 + H 2 O Delna dvojna vez, zato 6 atomov v isti ravnini! Velika večina peptidnih vezi je v trans konfiguraciji. IZJEMA: v zavojih ob Pro je približno 6% peptidnih vezi cis

Polipeptidna veriga v iztegnjeni konformaciji POZOR: OMEJENA GIBLJIVOST ZARADI OMEJITEV V VRTLJIVOSTI OKROG PEPTIDNE VEZI.

Dihedralna kota Φ (fi) in Ψ (psi) Začetni položaj: Φ = Ψ = 0 stopinj Ta položaj je le teoretičen in v resnici ni mogoč!

C=O in N-H, ki sta povezana z vodikovo vezjo, sta udeležena v dveh različnih peptidnih vezeh 5 AK narazen. desnosučna a-vijačnica N vodikova vez med AK i in AK i+4 O H C RADIKALI (niso prikazani) MOLIJO VEN!

b struktura (antiparalelna) b struktura (paralelna)

Nagubani list je pogosto zvit in podprt z vijačnicami. N-t. C-t. C-t. N-t.

Povezave verig v nagubanem listu ANTIPARALELNA PARALELNA zavoj

β-zavoji RAZLIKA!

Zanke: Ω zanka je navadno iz 40 do 54 AK (citokrom c) Ω Ni nujno, da so vsi deli proteina v eni od teh II. struktur NEUREJENA II. STRUKTURA

TERCIARNA STRUKTURA GLOBULARNIH PROTEINOV Vsi encimi so globularni proteini. Pet različnih prikazov terciarne strukture mioglobina. III. struktura: zvitje v nativno konformacijo vse vrste II. strukture so običajno vključene (tudi neurejena struktura) III. strukturo vzdržujejo številne šibke interakcije med AK ostanki III. struktura je stabilna a fleksibilna poznati III. strukturo pomeni poznati položaj vseh atomov v prostoru (3D)

Fotografija lis na filmu po uklonu rentgenskih žarkov skozi kristal Mb. Protein moramo najprej očistiti, nato kristalizirati in skozi kristal spustiti rentgenske žarke, ki se na atomih zaradi elektronov uklonijo. Analiza uklonskih slik nam da elektronsko gostoto na določeni globini kristala. Iz tega določijo položaj vsakega atoma v proteinu.

Zemljevid elektronske gostote proteina z AK ostanki.

Struktura proteina (Src protein SH3 domena) dobljena z 2D protonsko NMR; vidijo se področja večje fleksibilnosti. Trp Phe Tyr

Ena podenota encima gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze iz Bacillusa stearothermophilusa. POZOR: Kombinacija različnih II. struktur. Jasno se vidita dve domeni (ena rdeče in druga zelene barve), ki ju lahko ločimo s prekinitvijo ene vezi v verigi, ki povezuje domeni (glej puščico).

Kvartarna struktura hemoglobina.

Glutamin-sintetaza (Salmonella typhimurium).

človek ZAKAJ KVARTARNA STRUKTURA? - VARNOST (Hb: 2a+2b, 2 različna gena) - ALOSTERIČNI EFEKTI (regulacija Hb, alosterični encimi) - POVEČANA & LOKALIZIRANA KONCENTRACIJA AKTIVNIH MEST (AChE) - MULTIFUNKCIONALNI PROTEINI: maščobnokislinska sintetaza: 7 aktivnih mest z različnimi funkcijami: bakterija gliva

Voda je integralni del proteinske strukture in pomembno prispeva k njeni stabilnosti.

Zvijanje proteinov preučujemo tako, da jih razvijemo (denaturiramo), nato pa opazujemo ponovno zvijanje. Denaturanti, ph, T in visok P porušijo strukturo. Proces je lahko reverzibilen.

Zakaj denaturacija: toplota (visoka temperatura): neposreden vnos energije ekstremni ph: ionizacija le v razvitem stanju (premik ravnotežja); elektrostatski odboji na površini proteina; porušenje ionskih interakcij. denaturanti (urea, gvanidinijev klorid): preferenčna vezava deli proteina se raje vežejo z denaturantom kot med seboj (vpliv na H-vezi in hidrofobne interakcije!)

Prerez skozi 3D energijski profil zvijanja proteina. Nativna struktura ima najmanjšo energijo (prosto entalpijo G), povsem razvit protein pa ima največjo energijo (G) in tudi največjo entropijo (S), ker je ta struktura najbolj neurejena. A POZOR, TOPILO!!! G G maksimalna, S maksimalna prispevek vezi G=H-T.S Prispevek (ne)urejenosti G minimalna, S minimalna

Šaperoni pomagajo proteinom pri zvijanju in skušajo ponovno zviti razvite proteine.

Premikanje domen v plašču šaperona pomaga pri zvijanju proteinske verige, ki je v notranjosti. Konformacijske spremembe omogoča hidroliza ATP.

Nekateri proteini so namerno nestabilni (vsaj lokalno); to omogoča: konformacijske spremembe prilagoditve pri vezavi na druge molekule (interakcije protein - protein in protein -nukleinska kislina) transkripcijski faktor (P. Wright, Scripps)

Metabolično obračanje proteinov: Proteini živijo v celici različno dolgo. Npr.: razpolovni čas encimov v jetrih je od 0.2 do 150 ur. Pravilo N-konca: Razpolovni čas proteinov je povezan s strukturo N-terminalne AK: Za proteine z N-terminalnimi Met, Ser, Ala, Thr, Val ali Gly je razpolovni čas večji od 20 ur. Za proteine z N-terminalnimi Phe, Leu, Asp, Lys ali Arg je razpolovni čas 3 min ali manj. Pravilo PEST: proteini, ki imajo veliko Pro (P), Glu (E), Ser (S) ali Thr (T) se hitreje razgradijo kot drugi proteini.

Selektivno razgradnjo proteinov uravnavajo znotrajcelični in zunajcelični signali. Eden od njih je vezava ubikvitina (majhen protein) na za razgranjo namenjen (predvsem delno razvit) protein. Razgradnja ubikvitiniranih proteinov poteka v proteasomih. signalna sekvenca Primarna struktura za razgradnjo namenjenega proteina H 2 N veriga ubikvitinov COO Veriga 4 ali več ubikvitinov usmeri protein v razgradnjo. ubikvitin PDB 1TBE

a b b a 20 S Proteasom (kvasovka) v zaprtem stanju dva pogleda PDB 1JD2 Proteasom je velik kompleks. Jedro ima 4 obroče (2 α in 2 β), vsak je iz 7 proteinov, znotraj pa je votlina kjer se razgrajujejo ubikvitirani proteini. Po 3 podenote v β obročih so proteolitični encimi.

Kontrola kvalitete proteinske sinteze Proteasomi prepoznajo in razgrajujejo poli-ubikvitinirane proteine, ki so celici lastni. Nekateri celici lastni proteini se le mono-ubikvitinirajo; ti verjetno doživijo razgradnjo v lizosomih. Lizosomi so organeli, ki vsebujejo proteolitične encime (katepsine); namenjeni so razgradnji predvsem izvenceličnih proteinov (v celico pridejo z endocitozo). Oba sistema sta potrebna za odstranjevanje izrabljenih in napačno zvitih ali razvitih proteinov. Okrog 50 % vseh sintetiziranih proteinov se takoj razgradi! VSE KAR SMO POVEDALI O ZGRADBI, ZVIJANJU IN RAZGRADNJI PROTEINOV VELJA SEVEDA TUDI ZA ENCIME IN JIM OMOGOČA NJIHOVO DELOVANJE!

Kako encimi delujejo? nekatalizirana reakcija S P substrat produkt encimsko katalizirana reakcija Med katalizo encim E specifično veže substrat S, ga pomaga spremeniti v produkt P, encim pa se nespremenjen odcepi. Tako se lahko ponovno in večkrat uporabi. Med tem procesom se tvori kratko živeči kompleks ES (in drugi kompleksi, npr. EP). E + S ES EP E + P E encim S substrat, P produkt ES kompleks encim-substrat EP kompleks encim-produkt POZOR, nista aktivirana kompleksa!

Encimi so bio-katalizatorji, ki zmanjšajo aktivacijsko energijo reakcije (S 1 + S 2 )

S P E + S ES EP E + P DG o ΔG o = ΔG o = - RT ln K ΔG # < ΔG # v > v

Substrat se veže na aktivno mesto, ki je navadno le manjši del pravilno 3D-oblikovane encimske molekule. Tu vidimo pomen III. In IV. proteinske strukture encima. Neaktivni del encima je veliko večji od aktivnega mesta, a je potreben, da se aktivno mesto pravilno oblikuje in za mnoge druge funkcije, med drugim za kompenzacijo konformacijskih sprememb med katalizo in za interakcije z drugimi molekulami, s katerimi se omogoča in regulira aktivnost (koencimi, modulatorji in drugi proteini). Encim predstavlja specifično okolje za molekulo substrata.

Nastanek kompleksa encim substrat omogoča geometrijska in fizikalnokemijska komplementarnost encima in substrata. Skupine na substratu in v aktivnem mestu encima si ustrezajo tako, da se lahko medsebojno povežejo. Koncept aktivnega mesta Fischerjev koncept: popolno ustrezanje substrata in encima. To ni realistično, ker bi to stabiliziralo osnovno stanje substrata in ta bi teže prešel v prehodno stanje.

Za razlikovanje enantiomerov mora imeti encim vsaj tri specifična mesta za vezavo substrata. R

Peptidaza veže substrat (dipeptid) s tremi šibkimi vezmi, vsili substratu novo konformacijo, kar destabilizira peptidno vez (prehodno stanje!) ENCIM VODA (S 2 ) SUBSTRAT (S 1 ) S 1 + S 2 P 1 + P 2 Koshlandov koncept: encim le delno ustreza substratu, a se oba prilagodita pri tem encim vsili substratu konformacijo prehodnega stanja v kateri se ta najbolje veže na encim in se zaradi tega laže (in tudi hitreje) pretvori v produkt!

V aktivnem mestu pridejo zaradi III. strukture skupaj AK, ki so navadno v I.strukturi med seboj precej oddaljene. Struktura tripsina Katalitična triada Namen: aktivacija Ser (OH) N 1 7 His 57 Asp 102 Ser 195 245 C

KOENCIMI IN PROSTETIČNE SKUPINE (nastanejo iz vitaminov), ZAGOTOVIJO DODATNE FUNKCIONALNE SKUPINE PREKURZOR (VITAMIN) SKUPINA PRENOSA KOENCIM/PROST. SK. tiamin (vitamin B1) aldehidna skupina tiamin pirofosfat riboflavin (vitamin B2) elektroni in protoni flavin mononukleotid FMN, FAD nikotinska kislina (niacin) hidridni ion (H - ) nikotinamid adenin dinukleotid NAD pantotenska kislina in druge molekule acilne skupine koencim A piridoksin (vitamin B6) amino skupine piridoksal fosfat vitamin B12 H-atomi in alkilne skupine (ciano)kobalamin biotin CO 2 (-COOH) biocitin folna kislina skupine z enim C-atomom tetrahidrofolna kislina lipojska kislina elektroni in acilne skupine lipojska kislina

KOENCIMI Se sprehajajo med encimi in nanje niso trajno vezani Na enem E sprejmejo neko skupino ali molekulo, na drugem jo oddajo Tako povezujejo različne encime v kompleksne večstopenjske procese in prenašajo skupine ali molekule med različnimi substrati A-x CoE KOFAKTORJI x = skupina, ki se prenaša B-x A-x PROSTETIČNE SKUPINE So trajno vezani na določen encim, ki ga nikoli ne zapustijo Na istem E sprejmejo neko skupino ali molekulo od enega S in jo oddajo drugemu S Tudi povezujejo večstopenjske procese, a običajno sodelujejo z omejenim številom substratov PSk E B-x E 1 E 2 A CoE-x B A PSk-x E B Kofaktorji so lahko tudi le ustrezni kovinski ioni (cink, magnezij, baker itd) APOENCIM predstavlja le proteinski del, HOLOENCIM pa celoten aktivni encim; tj. proteinski del + kofaktor.

PREKURZOR (VITAMIN) SKUPINA PRENOSA KOENCIM pantotenska kislina in druge molekule acilne skupine koencim A R-COOH + HS- R-CO-S- Vir: vsaka hrana; dnevna priporočena količina: 4-7 mg. Pomanjkanja niso nikoli opazili, s težavo se ga da umetno izzvati v strogo nadzorovanih eksperimentalnih razmerah.

PREKURZOR (VITAMIN) SKUPINA PRENOSA KOENCIM (PROST. SK.) riboflavin (vitamin B2) elektroni in protoni FMN, FAD! 2 e - in 2 H +! Vir: meso, jetra, jajca, mleko; dnevna priporočena količina: 1,5 mg Pomanjkanje: prizadete sluznice in koža, anemija - posebno pri alkoholikih in pri novorojenčkih s hiperbilirubinemijo, ki so pod osvetljevalno terapijo (razgradnja bilirubina in riboflavina).

PREKURZOR (VITAMIN) SKUPINA PRENOSA KOENCIM nikotinska kislina (niacin) hidridni ion (H - ) NAD -OH 2 e - in 1 H + = H - = hidridni ion! Vir: meso, jetra, kvas, semena; dnevna priporočena količina: 15-20 mg (tudi neuč. sinteza iz Trp). Pomanjkanje (koruza!): pelagra - prizadeta je koža, v resnejši obliki pa dermatitis, diareja in demenca (lahko tudi ireverzibilna). V razvitem svetu redka.

PREKURZOR (VITAMIN) SKUPINA PRENOSA PROSTETIČNA SKUPINA biotin karboksilna skupina biocitin (kovalentno vezan na Lys)

2. predavanje termodinamske in kinetične osnove katalize encimska kataliza časovni potek encimske reakcije začetna hitrost