Encimska kinetika govori o hitrosti encimske reakcije

Transcript

1 Encimska kinetika govori o hitrosti encimske reakcije uvod encimska kinetika po Michaelisu in Mentenovi kinetika večsubstratnih encimskih reakcij kinetika alosteričnih encimov encimska inhibicija

2 Kako encimi delujejo? nekatalizirana kemijska reakcija S P substrat produkt encimsko katalizirana kemijska reakcija E + S ES EP E + P E encim S substrat, P produkt ES kompleks encim-substrat EP kompleks encim-produkt POZOR, to nista aktivirana kompleksa!

3 Substrat, vezan na aktivno mesto encima Encim predstavlja za molekule, ki reagirajo (substrate), specifično okolje, reakcija poteče na aktivnem mestu encima; aktivno mesto je navadno le manjši del encima!

4 Hitrost (v) reakcije S P določa hitrostna konstanta k, to pa DG v = k [S] v = k [S 1 ] [S 2 ] k reakcija S P k reakcija S 1 + S 2 P k Boltzmannova konstanta (n.r/n A ; n = št. molov, R = plinska konstanta, N A = Avogadrova konstanta) h Planckova konstanta DG aktivacijska energija (aktivacijska prosta entalpija) R, T konstanti

5 Primerjava nekatalizirane in katalizirane reakcije Nekatalizirana reakcija S P Ravnotežje K Večja aktivacijska energija Manjša reakcijska hitrost Reakcijski mehanizem preko prehodnega stanja P S Katalizirana z encimom E + S ES EP E + P Ravnotežje K Manjša aktivacijska energija Večja reakcijska hitrost Reakcijski mehanizem preko drugih reakcijskih intermediatov in prehodnih stanj P S Aktivacijska energija ΔG # določa hitrost reakcije Katalizatorji pospešijo hitrost reakcije (znižajo aktivacijsko energijo), ne spremenijo pa ravnotežja reakcije!

6 S P E + S ES EP E + P DG o ΔG o = ΔG o = - RT ln K ΔG # < ΔG # v > v

7 S P E + S ES ES 1 ES 2 EP E + P - če je reakcija sestavljena iz zaporedja več reakcij, hitrost celotne reakcije določa najpočasnejša stopnja (največja aktivacijska energija) rate limiting step - energijske bariere so ključnega pomena za življenje če jih ne bi bilo, bi se makromolekule spontano razgrajevale v osnovne gradnike... - med evolucijo (zelo dolg čas!) so se razvili encimi, ki selektivno znižujejo aktivacijsko bariero

8 ES - komplementarnost substrata z vezavnim mestom na encimu: šibke interakcije so optimizirane v prehodnem stanju Emil Fischer 1894 E in S - ključ v ključavnico Inducirano prilagajanje encima substratu in substrata encimu Encim je komplementaren reakcijskemu prehodnemu stanju Primer: encim dihidrofolatna reduktaza; NADP+ (rdeče) in tetrahidrofolat (rumeno) sta substrata. Aktivacijska energija se zniža zaradi sproščene vezavne energije ob nastanku šibkih interakcij med encimom in substratom

9 Imaginarni encim, ki katalizira prelom kovinske palice S S P

10 Peptidaza prime substrat (dipeptid) z najmanj tremi šibkimi vezmi, mu vsili novo konformacijo v kateri je peptidna vez že natrgana (prehodno stanje!) ENCIM VODA (S 2 ) SUBSTRAT (S 1 ) S 1 + S 2 P 1 + P 2

11 Encimska kinetika Obravnava hitrost, s katero se spreminjajo reaktanti v produkte S P Hitrost podaja spremembo koncentracije substrata/produkta v časovni enoti (mol/s) v = -d(s)/dt = d(p)/dt Hitrost encimske reakcije je merilo za aktivnost encima; enote za aktivnost: U = 1μmol/min ali katal (kat) = 1mol/s Specifična aktivnost encimskega pripravka: hitrost na št. encimskih enot/mg proteina, npr. μmol/min/mg

12 Koncentracija substrata vpliva na začetno hitrost encimske reakcije S P v = Δ(P)/Δt koncentracija substrata se s časom spreminja začetna hitrost (v o ) je hitrost v času t = 0 in je karakteristična za reakcijo S 4 > S 3 > S 2 > S 1

13 ODVISNOST ZAČETNE HITROSTI (v 0 ) OD KONCENTRACIJE SUBSTRATA [S]. POZOR: TO STA DVA RAZLIČNA GRAFA!

14 Vpliv koncentracije substrata na začetno hitrost encimske reakcije maksimalna hitrost V max Graf ustreza enačbi: a morajo biti izpolnjeni določeni pogoji! Enačba se imenuje po Michaelisu in Mentenovi, ki sta jo prva izpeljala (članek 1912). Michaelisova konstanta K m

15 Saturacijska kinetika (hidroliza ecetilholina)

16 Odvisnost začetne hitrosti v 0 od koncentracije substrata S (v 0 =k.[s] n ) V 0 =k[s] 1 1. red reakcije V 0 =k[s] 0 0. red reakcije

17 Vpliv koncentracije substrata začetno hitrost encimske reakcije Enačba po Michaelisu in Mentenovi Predpostavke pri izpeljavi in namen - koncept začetne hitrosti: v začetku je koncentracija P zanemarljivo majhna, ni reakcije P S (k -2 = 0) - razgradnja ES določa hitrost celotne reakcije v 0 = k 2 [ES] - encim ima eno samo aktivno mesto, če pa jih je več, so ta neodvisna - (E) o << (S) o NAMEN: ker je težko izmeriti [ES] (v 0 = k 2 ([ES])), določimo K m in V max ter z njima okarakteriziramo encimsko aktivnost

18 Michaelis-Mentenova kinetika S P Ključnega pomena za encimsko katalizo je nastanek kompleksa ES L. Michaelis in M. Menten 1912 hitra reverzibilna stopnja v 0 = k 2.[ES] počasna reverzibilna stopnja, razpad ES določa hitrost celotne reakcije Z večanjem koncentracije S se vse več encima nahaja v obliki kompleksa ES, encim postaja nasičen s substratom, zato saturacijska kinetika! (ES) je konstantna po času, stacionarno stanje steady state

19 Spremembe koncentracije [S], [P], [E], [ES] s časom K P S v 0 = k 2.[ES]

20 v 0 = k 2.[ES] hitrost nastanka ES = hitrost razpada ES = V stacionarnem stanju sta ti dve hitrosti enaki! Michaelisova konstanta K m

21 Michaelis-Mentenova enačba K m

22 Odvisnost začetne hitrosti od koncentracije substrata grafična določitev konstant K m in V max [S] << K m

23 Transformacija Michaelisove enačbe v dvojno recipročno enačbo (Lineweaver-Burk) Dvojni recipročni diagram, 1/V 0 proti 1/[S], uporaben za določitev V max in K m

24 Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov K m k cat k cat /K m

25 Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov, K m V max, K m eksperimentalno določimo če merimo v o! = K d VELJA: - velika K m majhna afiniteta encima do substrata - majhna K m velika afiniteta encima do substrata K m - odraža afiniteto encima do substrata - odraža fiziološke razmere - za mnoge encime valja: K m [S] fiziol.

26 Vrednosti K m nekaterih encimov in substratov

27 Pomen K m v fiziologiji primer: občutljivost Azijcev na alkohol Japonci in Kitajci dosežejo isti učinek alkohola (vazodilatacija, pospešen ritem srca...) že pri nižji koncentraciji zaužitega alkohola kot Evropejci Reakcije razgradnje alkohola CH 3 CH 2 OH + NAD + CH 3 CHO + H + + NADH alkoholna dehidrogenaza CH 3 CHO + NAD + CH 3 COOH + H + + NADH aldehidna dehidrogenaza Azijci imajo aldehidno dehidrogenazo z višjim K m (aldehid v krvi dolgo kroži po telesu); izoencim! Izoemcimi: katalizirajo isto reakcijo (isti substrat), različne pa so molekulske lastnosti encimov: različna encimska aktivnost (k kat in K m ), različna molekulska masa (M r ). Genski zapis je drugačen, zato druga sekvenca!

28 Izražanje in primerjava katalitične učinkovitosti različnih encimov, k kat V max = k 2.[E] t V max = k kat.[e] t ; v k ES k kat = k najpočasnejše stopnje! (v smeri, ki daje produkt!) k kat - pretvorbeno število: št. molekul substrata, ki se pretvori v produkt na eni molekuli encima v enoti časa (encim je nasičen s substratom) 0 kat

29 Kinetična učinkovitost encimov: pretvorbeno število (turnover number), k kat Slabost izražanje encimske učinkovitosti s K m ali k kat : ni upoštevana neencimska reakcija, ni informacije za koliko encim pospeši reakcijo

30 Najboljši način za izražanje encimske aktivnosti: k kat /K m

31 Alosterični proteini (encimi) Alosterični proteini (encimi) sestojijo iz več podenot (multimerni proteini) in imajo več vezavnih mest (za substrat in/ali modulator) Alosterični proteini (podenote) zavzamejo različne konformacije Konformacijsko spremembo (prehod v manj ali bolj aktivno obliko) povzroči modulator (ligand, pri encimih tudi S) Modulatorji so ali inhibitorji ali aktivatorji Če je normalni ligand obenem modulator homotropična modulacija (O 2 na Hb, substrat pri encimu) ; če je modulator druga molekula heterotropična modulacija Mnogi alosterični proteini imajo več modulatorjev obenem gre za heterotropične in homotropične modulatorje Vezava liganda na multimerni protein (O 2 na Hb, S na encimu) je kooperativna vezava vezava enega liganda vpliva na afiniteto drugih vezavnih mest (O 2 je ligand in pozitivni homotropični aktivator Hb, S deluje enako pri alosteričnem encimu) Za kooperativno vezavo je značilna sigmoidna krivulja Sigmoidna krivulja omogoča občutjiv odgovor na majhne spremembe koncentracije liganda v okolju

32 Hb (2D5Z.pdb)

33 Prehod Hb iz T (deoksi) v R (oksi) konformacijo vezava O 2 konformacija T konformacija R

34 2 modela za pretvorbo neaktivne v aktivno obliko proteina po kooperativni vezavi liganda; pri encimih je ligand kar S (L = S) (a) Usklajen model: vse podenote so v isti konformaciji, bodisi bodisi (b) Skupni model: vsaka podenota je lahko ali v eni ali v drugi konformaciji, ali

35 Saturacijske krivulje Mb in Hb Vezava O 2 na Mb in Hb Vezava O 2 na R, T in naravni Hb

36 Kinetika alosteričnih encimov analogija s Hb sigmoidna krivulja alosterični encim (več soodvisnih aktivnih mest) hiperbolična krivulja- Michaelis-Mentenov encim (eno samo aktivno mesto ali več neodvisnih mest) homotropična alosterija! v 0 k kat ES ES Y E t Y 1 K' n S ' S n K

37 Dve vrsti modulatorjev alosteričnih encimov heterotropična alosterija! modulatorji vplivajo na K m S modulatorji vplivajo na V max S M M

38 Bi(več)substratne reakcije (velikanska večina je takih!) S 1 + S 2 P 1 + P 2 Primer: prenos funkcionalne skupine (fosforilne, amino...) z enega substrata na drug substrat ATP + D-glukoza ADP + D-glukoza-6-fosfat ATP + D-fruktoza ADP + D-fruktoza-6-fosfat ak 1 + ketokislina 2 ketokoslina 1 + ak 2

39 Prenos fosforilne skupine z enega na drug substrat S 1 + S 2 P 1 + P 2 ATP + D-glukoza ADP + D-glukoza-6-fosfat ATP + D-fruktoza ADP + D-fruktoza-6-fosfat

40 Transaminacija: encim transaminaza (koencim piridoksalfosfat) prenos aminske skupine Glutamat/piruvat transaminaza (GPT) Glutamat/oksaloacetat transaminaza (GOT) -R = -CH 3 -R, -CH 2 -COOH

41 Primer: Prenos NH 2 skupine z enega na drug substrat Koencim: piridiksal-fosfat Proces: TRANSAMINACIJA Encimi: TRANSAMINAZE H 2 N- + O= H 2 N- + O=

42 Mehanizem encimsko kataliziranih bisubstratnih reakcij Encimske reakcije, ki vključujejo ternarni kompleks Encimske reakcije, pri katerih ne nastaja ternarni kompleks (ping-pong mehanizem)

43 Kako ugotoviti mehanizem bisubstratnih reakcij? Kinetična analiza bisubstratnih reakcij (dvojni recipročni diagram) potek reakcije preko ternarnega komleksa ping-pong mehanizem

44 Na encimsko aktivnost vplivajo zunanje razmere V max, K m eksperimentalno določimo V max, K m karakteristični za encim V max, K m spreminjata se z zunanjimi razmerami: - ph - temperatura - ionska moč

45 Vpliv ph na encimsko aktivnost (v 0 ) pepsin glukoza-6-fosfataza

46 Peptidaza prime substrat (dipeptid) z najmanj tremi šibkimi vezmi, mu vsili novo konformacijo v kateri je peptidna vez že natrgana (prehodno stanje!)

47 kumulativni vpliv Vpliv ph na encime je navadno kompleksen primer kimotripsin vpliv na k kat vpliv na afiniteto E do S (K M )

48 Vpliv ph in temperature na encimsko aktivnost (V)