Immunocytochemistry. Results - Summary Graphs - Pass Rates Best Methods - Selected Images. Run 96. Assessment Dates: 5-20th January 2012

Transcript

1 Run 96 Module Modules In This Issue New Pilot Modules 8 Gastric HER2 IHC Breast HER2 ISH Technical Immunocytochemistry Results - Summary Graphs - Pass Rates Best Methods - Selected Images Assessment Dates: 5-2th January 212 Immunocytochemistry Modules Module 1 General Pathology: SMA & CK 2 Breast pathology: ER 3 Breast pathology: HER2 IHC 4 Lymphoid pathology: BCL2 & Cyclin D1 5 Neuropathology: Ki67 & EMA 6 Cytology: Melanoma & Calretinin 7A Alimentary Tract: GIST: CD117 & DOG1 In-situ Hybridisation Modules Breast: HER2 ISH Interpretive Cover Photo: Taken from Gastric IHC pre-pilot assessment showing gastric tumour from one of the distributed samples. A) 3+ complete membrane staining of high intensity and B) Area of 2+ with lower staining intensity ** Reserve The Date ** The UK NEQAS ICC & ISH Conference for Tissue Diagnostics Will Take Place on The 12-14th October 212 Windsor More information will follow soon UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent

2 General Information Data shown in this article is collated from UK NEQAS ICC & ISH and is presented and described as collected, and does not ether endorse nor denounce any particular product or method and is provided as a guide to highlight optimal and sub-optimal staining methodologies. For further information of the UK NEQAS ICC & ISH scheme, general EQA enquiries, slide returns please contact: For enquiries concerning training issues, meetings, or courses, please contact: Dr Merdol Ibrahim, Scheme Manager UK NEQAS ICC & ISH Suite 3/2 Hamilton House Mabledon Place London WC1H 9BB, UK Tel: (+44) merdol.ibrahim@ucl.ac.uk Mr Keith Miller, Scheme Director UK NEQAS ICC & ISH UCL-AD, 21 University Street, University College London London WC1E 6JJ, UK Tel: (+44) k.miller@ucl.ac.uk Director Mr Keith Miller (k.miller@ucl.ac.uk) Manager Dr Merdol Ibrahim (merdol.ibrahim@ucl.ac.uk) Deputy Director Mr Andrew Dodson (a.r.dodson@liverpool.ac.uk) Assistant Manager Ms Suzanne Parry (s.parry@ucl.ac.uk) Office Manager Mrs Ailin Rhodes (a.rhodes@ucl.ac.uk) Quality Manager Mr Neil Bilbe (n.bilbe@ucl.ac.uk) Clerical Assistant Mrs Clara Lynch (clara.lynch@ucl.ac.uk) ASSESSORS Mr C Abbott, Bristol, UK DR M Arends, Cambridge, UK Dr M Ashton-Key, Southampton, UK Mr J Askaa, Copenhagen, Denmark Dr E Baslev, Herlev, Denmark Mrs J Bell, Nottingham, UK Mr N Bilbe, London, UK Mr D Blythe, Leeds, UK Mr J Brown, London, UK Dr J Cabecadas, Lisbon, Portugal DR L Carson, Aberdeen, UK Mrs A Clayton, Preston, UK Mrs A Cramer, Manchester, UK Mr A Dodson, Liverpool, UK Mrs G Donald, Maidstone, UK Dr D Faratian, Edinburgh, UK Mr A Ferrero, Lisbon, Portugal Mr R Fincham, Cambridge, UK Mr D Fish, Reading, UK DR M Flezar, Ljubljana, Slovenia Mrs S Forrest, Liverpool, UK Dr M Franco, Lisbon, Portugal Dr I Frayling, Cardiff, Wales Ms J Freeman, London, UK Dr C Gillett, London, UK Ms J Gorst, Bucks, UK Mr J Gregory, Birmingham, UK Prof A Hanby, Leeds, UK Mr N Hand, Nottingham, UK Ms L Happerfield, Cambridge, UK Dr M Heragoda, London, UK Dr R Hunt, Stockport, UK Dr M Ibrahim, London, UK Mr P Jackson, Leeds, UK Prof B Jasani, Cardiff, UK Mrs N Johnson, Cambridge, UK Ms S Jordan, London, UK Dr J Joseph, Preston, UK Mrs M Judd, Southampton, UK Prof E Kaye, Dublin, Ireland Dr G King, Aberdeen, UK Mrs I Kirbis, Ljubljana, Slovenia Dr T Krenacs, Szeged, Hungary Dr B Lloyd, Cambridge, UK Mrs J MacMillan, Glasgow, UK Mr C Marsh, Newcastle, UK Dr P Maxwell, Belfast, UK Mr K McAllister, Dublin, Ireland Mrs H McBride, Belfast, UK Mr J McGloin, London, UK Dr S McQuaid, Belfast, UK Mr K Miller, London, UK Ms J Moorhead, London, UK Ms P Munson, London, UK Mrs L Necus, Kettering, UK Mr S Nielsen, Aalborg, Denmark Mr T O Grady, Dublin, Ireland Dr G Orchard, London, UK Ms S Parry, London, UK Dr V Phillips, Cambridge, UK Dr S Pinder, Cambridge, UK Dr E Provenzano, Cambridge, UK Mrs F Rae, Edinburgh, UK Dr B Rasmussen, Roskilde, Denmark Dr A Riley, Stirling, UK Mr G Rock, Birminghma, UK Mr J Ronan, Nottingham, UK Mr R Roque, Lisbon, UK Dr F Schmitt, Porto, Portugal Mrs J Starczynski, Birmingham, UK Mrs C Thomas, Preston, UK Mrs J Tunnicliffe, Vancouver, Canada Mrs R VanWijk, Cape town, South Africa Dr M Vyberg, Aalborg, Denmark Mr A Watson, Newcastle, UK Mrs H White, Maidstone, UK Mrs J Williams, Portsmouth, UK Ms S Wozniak, Cardiff, UK Journal layout and design prepared by UK NEQAS ICC & ISH UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 1

3 The HER2 IHC Gastric Module (Pre-pilot Results) Run 96 Merdol Ibrahim, Suzanne Parry, Jane Starczynski, Newton Wong, Bharat Jasani and Iris Nagelmeier Antigens Assessed: Tissue Sections circulated: Number of Participants Taking Part 89 HER2 IHC Composite slide consisting of: A. 3+ Intestinal Gastric carcinoma. Note: one block also had an area of 2+ membrane staining B. 2+ Intestinal Gastric carcinoma C. 1+ Intestinal Gastric carcinoma D. Negative Intestinal Gastric carcinoma Specific Guideline Used in The Assessment of Slides (Table 1): The gastric immunohistochemical results were evaluated by UK NEQAS assessors using the gastric scoring guidelines as devised by Hoffman et al., (28) and Rüschoff et al., (21) Score Surgical / resections (As used in this assessment) Biopsies (negative) 1+ (negative) 2+ (equivocal*) 3+ (positive) No staining in < 1% of tumour cells Faint barely perceptible incomplete membrane staining in >1% of cells staining Weak to moderate complete, basolateral or lateral membrane reactivity in > 1% of tumour cells Strong complete, basolateral or lateral membrane reactivity in > 1% of tumour cells No staining in any of the tumour cells Tumour cells with faint barely perceptible incomplete membrane staining, irrespective of percentage of tumour cells stained Tumour cells with weak to moderate complete, basolateral or lateral membrane reactivity irrespective of percentage of tumour cells stained Tumour cells with strong, basolateral or lateral membrane reactivity irrespective of percentage of tumour cells stained * Equivocal cases should be refluxed to ISH testing. Note: in the UK, NICE guidelines recommend that only 3+ cases are put forward for Trastuzumab treatment, see guidance.nice.org.uk/ta28 Table 1 Validation of Distributed Samples IHC Validation of Distributed Samples The NEQAS tissue sections were quality controlled prior to sending out, using the Ventana pathway 4B5 as the gold standard. However, sections were also stained using the Dako Herceptest and Leica Oracle system: Important: The Leica Oracle HER2 IHC System is not currently supported for gastric HER2 IHC and any laboratory using the kit for gastric purposes should be aware that they are doing so off label usage and would need to fully validate the Leica Oracle system prior to diagnostic use. ISH Validation of Distributed Samples The tissue was also assessed for gene expression using both FISH (Abbott Vysis) and DDISH (Ventana), and the amplified status of the tissue sections are shown below. Section Label From slide Label End Staining Pattern with Ventana 4B5 HER2 status by ISH* A 3+ Amplified (but see fig 1-4) B 2+ Amplified (but see fig 9 & 1) C 1+ Not amplified (see fig 11) D negative Not amplified (see fig 13) Table 2 UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 2

4 The HER2 IHC Gastric Module (Pre-pilot Results) Run 96 UK NEQAS Specific Scoring Criteria UK NEQAS ICC & ISH uses an EQA specific scoring criteria when scoring the tissue sections, so as to provide participants additional technical feedback, which is illustrated in the table below. Expected Score Acceptable Scores 3 3+ only (during this pre-pilot assessment scores of 3+/2+ or 2+/3+ were also accepted) or 1+/2+ or 2+/1+ 2+/3+ or 3+/2+ Description of staining Pattern used by the assessors Only a strong complete, basolateral or lateral membrane reactivity in > 1% of tumour cells is acceptable i) 1+/2+ or 2+/1+: Staining is slightly weaker than expected with membrane showing more 1+ compared to 2+ (1+/2+) or 2+ membrane staining is present but also showing 1+ staining (2+/1+). ii) 2+/3+ or 3+/2+: Staining is slightly weaker than expected with membrane showing more 2+ compared to 3+ (2+/3+) or 3+ membrane staining is present but also showing 2+ staining (3+/2+) or /1+ or 1+/ i) /1+: Staining is more towards the weaker end of 1+ staining but still acceptable. ii) 1+/: Staining is more towards the weaker end of 1+ staining but still acceptable. negative or /1+ or 1+/ /1+ or 1+/ = Cells are starting to show very weak membrane staining U /Uninterpretable Scores: Assessors may also give a score of 'U' which indicates that the cell lines / tissue sections were 'uninterpretable due to the reasons set out below. A score of U/x e.g. U/3+ or U/2+ or U/1+ or U/ indicates a borderline uninterpretable scores indicating that the staining is just about readable and further improvements are required. Table 3 Assessment Procedure Assessment is carried out around a multi-header microscope with each slide being assessed by 4 independent assessors and a microscope lead. Each of the NEQAS sections (A,B,C,D) (as well as in-house samples where submitted) are individually assessed, with each assessor providing their own interpretation, technical feedback for each of the tissue sections and an individual score for the slide overall, such that: i. Acceptable: Expected level of membrane staining and of good technical staining. Equates to a score of 3/3 ii. Borderline: Tissue is interpretable but technical improvements can be made. Equates to a score of 2/3 iii. Unacceptable: The Tissue/s are not staining as expected indicating that technical improvements are required and /or the staining is uninterpretable due to technical issues (see second table above). Equates to a score of 1/3 After each slide has been individually scored and reported, an overall pass mark is generated by adding together each of the 4 assessors marks giving a total potential score out of 12. i. Acceptable = a score of between 11-12/12 (3 or more assessors have scored the slide as acceptable). ii. Borderline = a score of between 6-1/12 (2 out of 4 assessors have scored the slide as acceptable). iii. Unacceptable = a score of <5 (3 or more assessors have scored the slide as unacceptable). General Introduction Immunohistochemical testing of HER2 status is now routinely used in breast cancer testing and is recognised as a prognostic and predictive marker, generally used alongside breast hormonal receptor markers ER/PR. Patients who are HER2 positive (IHC 3+ and IHC 2+/ISH+ ) have been shown to benefit from Herceptin (Trastuzumab) therapy and increased overall survival rate. More recently the Trastuzumab for Gastric Cancer (ToGA) study, which investigated Trastuzumab in HER2 positive advanced gastric cancer (Bang et al., 21) showed overall median survival of nearly 3 months. Similar to breast cancer, the ToGA trial showed an increased benefit from Trastuzumab treatment for patients showing 3+ IHC and IHC2+/FISH+ expression. The initial development of the HER2 scoring criteria was developed as a precursor to the ToGA trial (Hoffman et al., 28) with the study group modifying the breast HER2 IHC scoring algorithm to compensate for the incomplete membrane staining and greater tumour heterogeneity seen in gastric cancers. A different scoring system was also established for resection and core biopsies as illustrated in table 1. A more recent article by Rüschoff et al., (21) has validated the scoring procedure further with a detailed approach to stepwise HER2 IHC scoring in gastric cancers. The article also compared the Ventana 4B5 assay with the Herceptest and indicated a tendency towards higher sensitivity for 4B5 detecting positive HER2 amplification but There was no difference between both test platforms with respect to the ISH-negative cases with the one equivocal case testing negative at some sites and as positive at others. Rüschoff and colleagues also used both fluorescent (Dako pharmdx or PathVysion Vysis) and chromogen (Ventana BDISH) to confirm their IHC findings. Acceptable & Unacceptable Staining (Figs 1-13) The samples distributed consisted of a single slide of composite gastric resection tissue samples denoted A-D and arranged as follows: A. 3+ Intestinal Gastric carcinoma (Figs 1-6) B. 2+ Intestinal Gastric carcinoma (Figs 7-1) C. 1+ Intestinal Gastric carcinoma (Figs 11-12) and D. Negative Intestinal Gastric carcinoma (Fig 13). Note; although section A was a heterogeneous tumour showing 3+ and an area of 2+ membrane staining, the 2+ area was not assessed and assessment focused on the 3+ area only. Please refer to images and associated legends for further information regarding the acceptable and unacceptable range of staining patterns that were submitted for assessment. UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 3

5 The HER2 IHC Gastric Module (Pre-pilot Results) Run 96 Additional Comments a. The Ventana 4B5 did show epithelial staining (intestinal metaplasia), especially on the distributed 3+ tumour section (not illustrated) and participants were not scored down as the assessment team were aware that this is one of the staining characteristics of the Ventana 4B5 antibody and did not detract from the actual staining of the gastric cancer b. The Leica Oracle HER2 IHC System is not currently supported for gastric HER2 IHC and any laboratory using the kit for gastric purposes should be aware that they are doing so off label usage and would need to fully validate the Leica Oracle system prior to diagnostic use. Pass Rates (see fig. 14) Of the 89 participants that took part in this assessment, results from the NEQAS distributed samples showed an overall acceptable pass rate of 54%, with 17% of participants scoring a borderline pass and an unacceptable rate of 29%. The main reasons for unacceptable scores were mainly due to understaining of the 3+ or 2+ tumour sections, excessive cytoplasmic staining and excessive haematoxylin (see figs 1-13). Of the 89 participants submitting NEQAS distributed slides, 55 also submitted in-house control material, of which 29%, as with the NEQAS sections, also received an unacceptable score. The main reasons for unacceptable scores for in-house material again were due to excessive cytoplasmic staining and excessive haematoxylin, and in some cases the participants selfassessment was discordant with that of the NEQAS assessment panel, for example participant interpretation indicating a 2+ membrane score on one of the in-house tumours, compared to a 1+ interpretation by the NEQAS assessors, indicating the possibility of under staining and therefore possible misinterpretation. Methodologies (see fig. 15) The main methodology employed was the Ventana 4B5 antibody with 51% (n=45) of participants using this assay and which showed an overall acceptable rate of 76%, borderline pass rate of 11% and an unacceptable rate of 13% (6 participants). The second most common methodology was a home-brew method using the Dako polyclonal antibody (15% n=13) but which had a 69% (n=9) unacceptable rate. The Dako polyclonal was noted to be used with a full range of retrieval methods, including water bath, microwave oven and pressure cooker. However, there were laboratories who did have an acceptable pass rate (5%, n=2) who had optimised their protocols for gastric IHC testing. The third most popular method was the Dako Herceptest, with 13% (n=12) of participants using this method and which showed a good pass rate of 83% (n=1). Other methodologies employed and their pass rate can be seen further in fig 15, but it should be noted that with such small number of users of the differing methodologies it is not possible to say whether such methods/ antibodies are suitable for gastric IHC in the context of the UK NEQAS gastric assessment. Control Tissue and Recommendations In-house control slides were also requested for this module, however, it was left open for laboratories to submit the control material of their choice. For this run 54 laboratories out of 88 submitted an in-house control, of which 39/54 (72%) submitted gastric cancer control tissue, with the majority of these being composite control slides with 3+,2+ and 1+/ membrane staining. The remaining 15/54 (28%) of laboratories submitted breast control tissue as their in-house controls. Gastric controls would be the preferred tissue choice as in-house controls for this module, but it is quite understandable that laboratories may find it difficult to source good quality controls, therefore laboratories were not penalised if they had submitted breast carcinomas. Whether gastric or breast tissue is used, laboratories should still submit in-house controls showing 3+, 2+ and 1+/ levels of membrane expression. It was also noted that several laboratories also submitted a heterogeneous gastric tumour with areas of 3+ and areas of 2+ membrane expression as in-house controls, and the panel agreed that this was also acceptable as long as the participant indicated the areas of expected membrane staining. References: 1. Hofmann M, Stoss O, Shi D et al., Assessment of a HER2 scoring system for gastric cancer: results from a validation study. Histopathology (7): Rüschoff J, Dietel M, Baretton G etc al., HER2 diagnostics in gastric cancer-guideline validation and development of standardized immunohistochemical testing. Virchows Arch (3): Bang YJ, Van Cutsem E, Feyereislova A, Chung HC, Shen L, Sawaki A, Lordick F, Ohtsu A, Omuro Y, Satoh T, Aprile G, Kulikov E, Hill J, Lehle M, Rüschoff J, Kang YK; ToGA Trial Investigators. Trastuzumab in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone for treatment of HER2-positive advanced gastric or gastro-oesophageal junction cancer (ToGA): a phase 3, open-label, randomised controlled trial. Lancet (9742): UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 4

6 The HER2 IHC Gastric Module (Pre-pilot Results) Run 96 Selected Images Showing Optimal and Sub-optimal Immunostaining Fig 1. Low magnification showing the expected level of staining for the high expressing UK NEQAS distributed tumour section (section A on slide), which had an area of 3+ membrane staining (blue oval) and an area of 2+ (red circle) membrane staining. Section stained using the Ventana 4B5 antibody. Fig 2. High magnification of fig 1 (section A on slide). (A) 3+ complete membrane staining of high intensity and B) Area of 2+ staining with lower staining intensity when compared to B. Section stained using the Ventana 4B5 antibody. Fig 3. Expected level of staining of the high expressing region (3+) of the NEQAS distributed tumour section (section A on slide). A) stained with Dako Herceptest and B) stained with the CCBE356 antibody clone. Fig 4. Acceptable 2+ membrane staining found in (section A on slide). A) stained with Dako Herceptest and B) stained with the CCBE356 antibody clone. Fig 5. Very weak, unacceptable staining of UK NEQAS distributed sections (section A on slide) showing A) very weak A) 3+ and B) 2+ areas on the same slide sections. Section stained using the Leica Oracle kit. Fig 6. Unacceptable level of staining of UK NEQAS distributed 3+ expressing tumour A) section stained with SP3 antibody clone using a home-brew method B) section stained using the Ventana 4B5 antibody showing poor localisation of antibody and excessive haematoxylin staining. UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 5

7 The HER2 IHC Gastric Module (Pre-pilot Results) Run 96 Selected Images Showing Optimal and Sub-optimal Immunostaining Fig 7. Acceptable levels of staining of 2+ gastric tumour distributed by UK NEQAS (section B on slide) A) stained using the Ventana 4B5 and B) stained using the Dako Herceptest. Both examples show moderate complete and basolateral membrane staining in > 1% of tumour cells. Fig 8. Unacceptable level of staining of 2+ gastric tumour distributed by UK NEQAS (section B on slide) A) false negative staining of the 2+ tumour stained using the SP3 clone B) Excessive cytoplasmic staining making any membrane staining uninterpretable. Section stained using a homebrew method using the Dako polyclonal antibody. Fig 9. The distributed 2+ tumour section (section B on slide) showed heterogeneous staining depending on the area visualised. A) circled area in red showed B) 2+ membrane staining, with incomplete basolateral membrane staining using the Dako polyclonal antibody with a home-brew method whilst C) stained with the Ventana 4B5 clone showed 1+ staining within the same area. This difference in staining was only seen with the Dako polyclonal using the home-brew method. Fig 1. In contrast to fig 9, the same 2+ tumour section (section B on slide) in a different area A) circled in red showed B) 1+ membrane staining, with the Dako polyclonal antibody with a home-brew method whilst C) stained with the Ventana 4B5 clone showed strong 2+ basolateral membrane staining. This difference in staining was only seen with the Dako polyclonal using the home-brew method. Fig 11. Good demonstration of 1+ staining (section C on slide) from the UK NEQAS distributed section, showing incomplete membrane staining in >1% of tumour cells. Section stained using the Ventana 4B assay. Fig 12. Unacceptable demonstration of 1+ staining (section C on slide) from the UK NEQAS distributed section. There is no obvious membrane staining with excessive haematoxylin staining possibly masking the membrane staining further. Section stained using the Dako polyclonal antibody using a home-brew method. UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 6

8 The HER2 IHC Gastric Module (Pre-pilot Results) Run 96 Selected Images Showing Optimal and Sub-optimal Immunostaining Fig 13. A) Expected staining of the negative gastric tumour section distributed by UK NEQAS (section D on slide). Section stained using Ventana 4B5 assay. B) Unacceptable false positive membrane staining of the NEQAS distributed negative gastric tumour. There appears to be false 2+ membrane staining. Section stained using the Dako polyclonal antibody using a home-brew method. Fig.14 Pass Rates on NEQAS Tissue, In-house tissue and Control Cell Line Fig. 14 Graph displaying the overall assessors scores for the NEQAS distributed tissue, in-house submitted tissue and kit (control) cell lines. Overall there were 89 participants who took part and submitted slides for assessments, of these 55 also submitted in-house tissue with 9 participants also submitting kit (control) cell lines. UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 7

9 The HER2 IHC Gastric Module (Pre-pilot Results) Run 96 Fig.15 Method Used and Associated Pass Rate on NEQAS Distributed Tissue Sections Fig. 15 The graph shows that overall 64% of participants used a validated and recommended kit for testing of HER2 gastric cases. It should be noted that although the Leica Oracle (15% of users) is also a kit it has yet to be recommended (formulated?) for the commercial use in gastric testing. The main home-brew method of choice was the Dako polyclonal antibody using a variety of methods, however as the graphs show the acceptable rates were only 15%, with 69% of participants achieving an unacceptable score. There were also other home-brew methods used including, for example the CB11 clone, SP3, CBE356 which showed variable pass rates. UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 8

10 The HER2 ISH Module - Technical (pilot) Run 25 Merdol Ibrahim, Suzanne Parry and 9 Reference Centres Gene Assessed: HER2 Chromogen ISH Sections circulated: Composite block containing cell line pellets (see below) Number of Participants Taking Part 28 The Summary Box below gives details of the HER2 phenotype and genotype of the cell lines circulated for these assessments, which comprised formalin fixed and paraffin processed sections from a composite block of four human breast carcinoma cell lines. The cell lines are the same ones which are used in the HER2 IHC module (results of the HER2 IHC module can be found in this and previous issues of Immunocytochemistry; and readers may wish to consult them for further details). The sections were positioned on the microscope slide as indicated. Cell line HER2 status by IHC 1 HER2 status by FISH 2 A. SK-BR-3 3+ Amplified B. MDA-MB Borderline: Amplified to Non-Amplified C. MDA-MB Not amplified D. MDA-MB-231 negative Not amplified 1: Scored using Clinical Trials Assay system 2: FISH status as assessed by the UK NEQAS ICC & FISH reference laboratories (Bartlett et al., 27) Cell Line Positioning: Cell lines are positioned on microscope slides, as illustrated below. Any variation in this pattern is indicated on distribution of the slides Slide Label Assessment Procedure Chromogen ISH: Assessment is carried out around a multi-header microscope with each slide being assessed by 4 independent assessors and a microscope lead. Each of the NEQAS cell lines (A,B,C,D) (as well as in-house samples where submitted) are individually assessed, for the quality of ISH staining for each NEQAS cell line (or control tissue if in-house samples were submitted) and scored according to the criteria shown in the table below. Assessors do not count the HER2/CEP17 signals. The accuracy of signal enumeration is assessed in the 'interpretive' section of the HER2 ISH module. After each cell line has been individually scored and reported, an overall pass mark is generated for the slide as a whole by counting each of the assessors individual cell line scores, with the most frequently selected score (Acceptable or Borderline or Unacceptable) used as the final overall score. If there is a near even (5%)split between Acceptable and Unacceptable then a Borderline score is awarded. Individual Assessor Scores (Also Refer to Assessment Procedure text) Acceptable The cell line/s and/or in-house tissue show a good/very good standard of staining and are suitable for interpretive analyses. Borderline The cell line/s and/or in-house tissue is borderline interpretable with 2 out of the 4 assessors indicating that improvements can be made with respect for example: - Excessive / Weak Nuclear staining - Level of probe hybridisation - Excessive background staining Unacceptable The cell line/s and/or in-house tissue is unacceptable for interpretation with at least 3 out of the 4 assessors indicating that there are staining quality issues, which could be due to: - Excessive / Weak Nuclear staining - Poor probe hybridisation - Missing Her2 copy no. / CEP 17 - Excessive background staining UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 9

11 The HER2 ISH Module - Technical (pilot) Run 25 Important: If two separate slides are submitted with separate CEP17 and HER 2 copy numbers (e.g. Ventana/ Roche SISH), then the assessors regard this as a single result, and as such, combined comments are placed in a single results column. assessable, with a pass rate of 32% (21/65) on the NEQAS distributed slide and 42% (14/33) on in-house control material. The overall unacceptable rate for the NEQAS cell lines was 4% compared to 45% for the in-house tissue (see Figure 3). Assessment Procedure Fluorescent ISH: This was the first assessment for those using a fluorescent based technique. Submitted slides were batched in a randomly selected manner and sent to reference centres who had the appropriate fluorescent filter sets. Slides are assessed by a single reference centre assessor. Each of the NEQAS cell lines (A,B,C,D) (as well as in-house samples where submitted) are individually assessed for the quality of ISH staining for each NEQAS cell line (or control tissue if in-house samples were submitted), and scored according to the criteria shown in the table below. Assessors do not count the HER2/CEP17 signals. The accuracy of signal enumeration is assessed in the 'interpretive' section of the HER2 ISH module. After each cell line has been individually scored and reported, an overall pass mark is generated for the slide as a whole by counting each of the assessors individual scores for that particular cell line or in-house control, with the most frequently selected score (Acceptable or Borderline or Unacceptable) used as the final overall score. If there is a near even (5%) split between Acceptable and Unacceptable then a Borderline score is awarded. Results Summary CISH Results (Second Pilot Run) Selected images showing the acceptable and unacceptable levels of staining for the different methods are illustrated in figures Participants using chromogen based methods, showed an overall acceptable rate of 5% (16/32), on the NEQAS distributed cell lines and 63% (12/19) on in-house control material. The overall unacceptable rate for the NEQAS cell lines was 28% compared to 16% for the in-house tissue. Note that only 59% of those submitting NEQAS slides also submitted an in-house control for assessment (See Fig 1). The main methodologies used and respective pass rates are illustrated Figure 2. Note that although percentage pass rates are shown the number of participants using any one method are overall quite low, and n=1 in some methods. This pre-pilot does however show that improvement is also required in the HER2 CISH staining protocols and methodologies. The main FISH methodologies used and respective pass rates are illustrated in Figure 4 and showed that the Vysis kit was the main method of choice ( 68%, 44/65 participants). As with the CISH slides it should be noted that some methods were used by only a small proportion of participants. Comparing CISH and FISH Methods Although this pilot data appears to show higher pass rates with CISH methods compared to FISH methods, it is advisable not to over-interpret these results as we cannot be confident that fluorescent samples sent in had not degraded making some of the FISH slides uninterpretable. Please see below for further guidance on returning FISH slides for NEQAS assessments. IMPORTANT Recommendations for Returning FISH Slides for NEQAS Assessments a. Section should be mounted using a fluorescence antifade mounting media, which prevents loss/quenching of fluorescence e.g. Vectashield (Vector labs), Dako Fluorescence Mounting Medium (Dako), Fluoromount (SIGMA/Aldrich, VWR). Note: The Abbott Vysis kit already contains DAPI in phenylenediamine dihydrochloride, which is an anti fading reagent, but we have found that some laboratories also used the above mentioned mounting media. b. Seal the coverslip edges onto the slide using clear varnish or another sealing agent, which will stop the slide from drying out. c. Send back FISH slides as soon as you have finished your own interpretation. d. There is no need to send back slides packed in ice/dry ice. Please return in the slide mailer that is provided. FISH Results (First Pre-Pilot Run) Selected images showing the acceptable and unacceptable levels of staining for the different methods are illustrated in figures For this first assessment of the FISH sections 65 slides were UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 1

12 The HER2 ISH Module - Technical (pilot) Run 25 Fig. 1 Chromogen ISH Overall Pass Rates Fig. 2 Chromogen ISH: Pass Rate related to Methods 32 Participants submitted slides for the CISH technical assessments of which 19 (61%)submitted an in-house control. UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 11

13 The HER2 ISH Module - Technical (pilot) Run 25 Fig. 3 Fluorescent ISH Overall Pass Rates Fig. 4 Fluorescent ISH Pass Rate related to Methods There were 68 submissions for NEQAS cell line FISH slides but only 65 slides were assessable, due to 3 broken slides. O the 68 that submitted NEQAS HER2 FISH cell lines, 33 (51%) submitted an in-house control. Important: there appeared to be a high fail rate on the Vysis kit but it was noted that this could have been due to loss of fluorescence signal whilst transporting and storing slides. Please see section Recommendations for Returning FISH Slides for NEQAS Assessments. UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 12

14 The HER2 ISH Module - Technical (pilot) Run 25 How to Use this Report to Compare NEQAS Cell Line Technical & Interpretive Results: Once you have your results for both the Interpretive and Technical HER2 ISH modules, use both results to troubleshoot whether there are interpretive and/or technical issues with your ISH methodology. The table below shows a brief troubleshooting guide, which we hope will assistant you further. UK NEQAS ICC & ISH recommends that laboratories should continually monitor their performance to make sure that both technical and interpretive results are frequently audited. Interpretive Result Appropriate or Acceptable Appropriate or Acceptable Interpretive & Technical Troubleshooting Guide Technical Result (pre-pilot module) Acceptable The cell lines show a good standard of staining and have been interpreted correctly Appropriate or Acceptable Unacceptable Acceptable The cell lines show a good standard of staining BUT there appears to be issues with interpretation i.e. HER2 copy number and/or CEP17 overestimated/underestimated. Borderline Unacceptable Recommend that scoring/counting criteria is reviewed The cell lines are of borderline acceptability for staining quality. Recommend that technical method (kit/assay) is further optimised. Unacceptable Borderline The technical staining can be improved as this may be effecting interpretation. Recommend that technical method (kit/assay) is optimised (or where relevant a standardised kit is used as per instructions) as interpretation, may be effected by the borderline quality of staining. The cell lines are unacceptable for interpretation and caution should be taken when interpreting from these slides. Recommend that technical method (kit/assay) is optimised (or where relevant a standardised kit is used as per instructions) as interpretation, although appears correct, may lead to incorrect interpretation of clinical cases Unacceptable Unacceptable The cell lines are unacceptable for technical staining and interpretation. Reporting from such cases is very likely to lead to incorrect interpretation of clinical cases. If there is persistent underperformance: - seek assistance from kit/assay manufacturer - seek assistance from UK NEQAS or colleagues - re-validate protocol (retrospectively and prospectively) - review scoring criteria - Send clinical cases to a reference centre to confirm your results UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 13

15 The HER2 ISH Module - Technical (pilot) Run 25 Selected CHROMOGEN Based Images From Assessed slides Ventana Inform SISH Ventana SISH Fig 5. Acceptable Her2 copy no. in the NEQAS amplified 3+ cell line. The signals are strong and appear as large and small clusters. Fig 6. Acceptable CEP17 in the NEQAS amplified 3+ cell line, showing strong, distinct probe signals in the nuclei. Fig 7. Acceptable Her2 copy no. in the NEQAS non-amplified 1+ cell line, showing strong and discrete signals at the expected level of copies per cell. Fig 8. Acceptable CEP17 in the NEQAS non-amplified 1+ cell line. The nuclei show strong and distinct probe signals. Fig 9. Acceptable Her2 copy no. in the NEQAS equivocal 2+ cell line. The signals are strong and discrete with the expected level of copies per nuclei. Fig 1. Unacceptable Her2 copy no. in the NEQAS equivocal 2+ cell line. (Compare to Fig5). The slide is uninterpretable due to the inappropriate non-specific silver Fig 11. Borderline pass CEP17 in the NEQAS distributed equivocal 2+ cell line. (Compare to Figs 6 & 8). Although the Ch17 is present, the signals are weak. Fig 12. Acceptable example of an in house amplified control section, showing strong small and large clusters of Her2 copy no. signals UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 14

16 The HER2 ISH Module - Technical (pilot) Run 25 Selected CHROMOGEN Based Images From Assessed slides Ventana Inform DDISH Ventana DDISH Fig 13. Acceptable pattern of staining in the NEQAS amplified 3+ cell line. The distinct Her2 SISH and Ch17 red ISH signals are demonstrated clearly. The Her2 copy no. signals appear as large and small clusters. Fig 14. Acceptable pattern of staining in the NEQAS equivocal 2+ cell line, showing strong, distinct Her2 and Ch17 signals with the expected level of copies per cell. Fig 15. Acceptable pattern of staining in the NEQAS non-amplified 1+ cell line. The Her2 and Ch17 signals are strong and clear. The expected level of copies per nuclei are demonstrated. Fig 16. Acceptable pattern of staining in the NEQAS distributed negative cell line, showing strong distinct Her2 and Ch17 signals visible as 1-2 copies per cell. Fig 17. Unacceptable staining in the NEQAS amplified 3+ cell line. Although the nuclei appear to demonstrate the expected level of amplification, the Ch17 signals have leached. The slide is therefore unquantifiable. Fig 18. Borderline pass staining in the NEQAS 2+ cell line. Although the Her2 and Ch17 signals are visible, leaching of the Ch17 signal makes the signal difficult to read. Fig 19. Unacceptable staining in the NEQAS non-amplified 1+ cell line. The signals are unreadable and the cells exhibit damaged morphology. This is likely to be caused by excessive pre-treatment. Fig 2. Unacceptable staining in the NEQAS amplified 3+ cell line. The slide shows cellular morphology damage and signals are barely visible. This is most likely caused by excessive pre-treatment.. Fig 21. Acceptable pattern of staining demonstrated in an amplified inhouse control section. The Her2 SISH clusters are strong, and the 1-2 Ch17 Red signals are demonstrated. Fig 22. Acceptable pattern of staining demonstrated in normal internal control cells seen within the submitted in-house amplified slide shown in Fig 21. Fig 23. Acceptable pattern of staining demonstrated in an in-house control section, showing strong Her2 SISH clusters and clear Ch17 red signals as 1-2 copies per cell. UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 15

17 The HER2 ISH Module - Technical (pilot) Run 25 Selected CHROMOGEN Based Images From Assessed slides Invitrogen (Spot-Light) Fig 24.Unacceptable staining in the NEQAS amplified 3+ cell line. The Her2 copy no. is unreadable due to non-specific staining within the nuclei. Fig 25.Unacceptable staining in the NEQAS non-amplified 1+ cell line. The nuclear signal appears to be nonspecific rather than hybridised HER2 copy no. making the cells unreadable. Fig 26. Unacceptable staining in the NEQAS negative cell line, showing an unreadable Her2 copy no. and nuclear morphology damage. Zytovision (ZytoDot 2C) Fig 27. Unacceptable staining in the NEQAS non-amplified 1+ cell line. The Her2 copy no. is unreadable with cellular morphology damage. The counterstain is also extremely weak. Fig 28. Unacceptable staining of the participant s in-house control section. The slide is unreadable as it is very difficult to discern whether the Her2 copy no. is real or actually nonspecific staining. The cells also show morphology damage. Fig 29. Unacceptable staining in a participant s in-house amplified control section. Although the Cep17 signals are clear, the Her2 copy no. is unreadable and the slide is therefore unquantifiable. UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 16

18 The HER2 ISH Module - Technical (pilot) Run 25 Selected Fluorescence Based Images From Assessed slides Fig 3. Acceptable pattern of staining in the NEQAS amplified 3+ cell line. The Her2 (red) and Cep17 (green) signals are bright and clearly demonstrated. The Her2 signals are of the expected level of copies per cell. Fig 31. Acceptable pattern of staining in the NEQAS non-amplified 1+ cell line, showing bright distinct Her2 and Cep17 signals present at the expected level. Fig 32. Excellent example of an in house control, submitted from the same laboratory as the slide seen in Fig 31. The optimal staining correlates well with that seen in the NEQAS cell line. Fig 33. Borderline pass in the NEQAS distributed 2+ cell line. Although both the Her2 and Cep17 signals are present, they are very weak. (Compare to the intensity of signals seen in Figs 3-32). Fig 34. NEQAS amplified 3+ cell line. Both the Her2 and Cep17 signals are demonstrated. However the CEP17 signal is large and fragmented with some smaller cep17 signals. Fig 35. Unacceptable staining in the NEQAS non-amplified 1+ cell line. The main problem appears to be under-digestion of the slide. Fig 36. Unacceptable staining in the NEQAS amplified 3+ cell line. Although the nuclei appear to demonstrate the expected level of amplification, there is no Cep17 signal. The slide is therefore unquantifiable. Fig 37. Excellent example of an in house control. Both the Her2 (red) and Cep17 (green) signals are bright and clearly demonstrated. Fig 38. Unacceptable staining in the NEQAS 2+ cell line, showing excessive background and nonspecific red and green fluorescence outside of the nucleus. Fig 39. Unacceptable staining demonstrated in the in- house section submitted from the same laboratory shown in Fig 38. The background and non-specific staining correlates with that seen in the NEQAS cell line. Fig. 4 Unacceptable staining in the NEQAS 3+ amplified cell line. The section is unreadable due to excessive background staining and nuclear morphology damage. Fig 41. Unacceptable staining demonstrated in the in- house section submitted from the same laboratory shown in Fig 4. The non-specific staining and nuclear morphology damage correlates with that seen in the NEQAS cell line. UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 17

19 The General Pathology Module Run 96 Julie Williams and Perry Maxwell Gold Standard Second Antibody Antigens Assessed: SMA CK Tissue Sections circulated: Appendix & Leiomyosarcoma Stomach & Normal Tonsil Number of Registered Participants: 365 Summary Graphs - Pass Rate Tables Best Method - Selected Images UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 18

20 ΡΥΝ 96 ΓΕΝΕΡΑΛ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ 1.Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ ΣΜΑ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ αππενδιξ σεχτιον, σηοωινγ στρονγ σταινινγ οφ τηε σµοοτη µυσχλε λαψερσ ιν τηε µυσχυλαρισ προπρια ανδ µυσχυαλρισ µυχοσαε. Τηε σεχτιον αλσο σηοωσ σταινινγ οφ τηε δελιχατε φιβρεσ ανδ α χλεαν βαχκγρουνδ. Σταινεδ ωιτη ακο 1Α4 αντιβοδψ, 1:2, υσινγ τηε ακο ΠΤ λινκ, αυτοσταινερ ανδ ΦΛΕΞ δετεχτιον κιτ. Φιγ2.Ηιγη µαγνιφιχατιον ϖιεω οφ τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ αππενδιξ σεχτιον σηοων ιν Φιγ1. Τηε στρονγ χψτοπλασµιχ σταινινγ ιν τηε µυσχυλαρισ προπρια οφ τηε σµοοτη µυσχλε λαψερ (Α) ανδ τηε σταινινγ οφ τηε δελιχατε φιβρεσ (Β) αρε δεµονστρατεδ µορε χλεαρλψ. Φιγ 3.Συβ οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ ΣΜΑ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ αππενδιξ σεχτιον, σηοωινγ ωεακ σταινινγ τηρουγηουτ τηε σεχτιον (χοµπαρε το Φιγ1). Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο 1Α4 αντιβοδψ, 1:25, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ, ΧΧ1 µιλδ ανδ ιςιεω δετεχτιον κιτ Φιγ4.Ποορ σταινινγ ωιτη ΣΜΑ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ αππενδιξ σεχτιον, σηοωινγ νον σπεχιφιχ σταινινγ οφ λψµπηοχψτεσ ανδ επιτηελιαλ χελλσ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο 1Α4 αντιβοδψ, 1:2, ον τηε ςεντανα ισχοϖερψ ΞΤ, ΧΧ1 στανδαρδ ανδ ισχοϖερψ δετεχτιον κιτ. Φιγ5.Τωο εξαµπλεσ οφ ΣΜΑ σταινινγ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ λειοµψοσαρχοµα τυµουρ. (Α) δεµονστρατεσ οπτιµαλ ιντενσε ωελλ λοχαλισεδ χψτοπλασµιχ σταινινγ, ωηερεασ τηε σταινινγ ιν (Β) ισ τοο ωεακ. Βοτη σεχτιονσ σταινεδ ωιτη ακο 1Α4 αντιβοδψ, υσινγ τηε ακο ΠΤ λινκ, αυτοσταινερ ανδ ΦΛΕΞ κιτ. Ηοωεϖερ, Αβ διλυτιον φορ (Β) ωασ 1:5, ανδ1:2 φορ (Α) Φιγ6.Γοοδ εξαµπλε οφ αν ιν ηουσε αππενδιξ χοντρολ σεχτιον σταινεδ ωιτη ΣΜΑ, σηοωινγ στρονγ σπεχιφιχ σταινινγ ωιτη α χλεαν βαχκγρουνδ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο 1Α4 αντιβοδψ, 1:25, υσινγ τηε ΠΤ Λινκ, αυτοσταινερ ανδ ΦΛΕΞ δετεχτιον κιτ. Πριντεδ ατ 14:42 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

21 ΡΥΝ 96 ΓΕΝΕΡΑΛ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ7.Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ ΠΑΝ ΧΚ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ στοµαχη σεχτιον, σηοωινγ στρονγ, διστινχτ χψτοπλασµιχ σταινινγ ιν τηε γλανδσ. Σηοων το α βεττερ αδϖανταγε ιν τηε ηιγη ποωερ ϖιεω (Β). Σεχτιον σταινεδ ωιτη τηε ακο ΜΝΦ116 αντιβοδψ, 1:75, νο πρετρεατµεντ ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ανδ ιςιεω δετεχτιον κιτ. Φιγ8.Ποορ δεµονστρατιον οφ ΠΑΝ ΧΚ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ στοµαχη σεχτιον. Τηε σταινινγ ισ πατχηψ ανδ ωεακ ανδ δοεσ νοτ χοµπλετε τηε δεπτη οφ τηε επιτηελιαλ λαψερ (χοµπαρε το Φιγ7). Σεχτιον σταινεδ ωιτη τηε ακο ΜΝΦ116 αντιβοδψ, 1:1, υσινγ τηε ακο ΠΤ λινκ, αυτοσταινερ ανδ ΦΛΕΞ δετεχτιον κιτ. Φιγ9.Εξχελλεντ δεµονστρατιον οφ ΠΑΝ ΧΚ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ τονσιλ σεχτιον, σηοωινγ στρονγ διστινχτ χψτοπλασµιχ σταινινγ τηρουγηουτ τηε εντιρε σθυαµουσ επιτηελιαλ λαψερ. Σηοων το α βεττερ αδϖανταγε ιν τηε ηιγη ποωερ ϖιεω (Α ). Σεχτιον σταινεδ ωιτη τηε ακο ΜΝΦ116 αντιβοδψ, 1:75, νο πρετρεατµεντ ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ανδ ιςιεω δετεχτιον κιτ. Φιγ1.Συβ οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ ΠΑΝ ΧΚ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ τονσιλ σεχτιον. Τηε σταινινγ ισ ωεακ ανδ ινχοµπλετε τηρουγηουτ τηε επιτηελιαλ λαψερ (χοµπαρε το Φιγ9). Σεχτιον σταινεδ ωιτη τηε ακο ΜΝΦ116 αντιβοδψ, 1:1, υσινγ τηε ακο ΠΤ λινκ, αυτοσταινερ ανδ ΦΛΕΞ δετεχτιον κιτ. Φιγ11.Ποορ δεµονστρατιον οφ ΠΑΝ ΧΚ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ τονσιλ σεχτιον. Τηε σταινινγ ισ τοο στρονγ ανδ τηερε ισ α χονσιδεραβλε αµουντ οφ βαχκγρουνδ ανδ νον σπεχιφιχ σταινινγ.τηισ ισ µοστ λικελψ χαυσεδ βψ εξχεσσιϖε αντιγεν ρετριεϖαλ. Σταινεδ ωιτη Λειχα ΑΕ1/ΑΕ3 αντιβοδψ, 1:2, πρε τρεατεδ ον τηε Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ2 3 µινσ. Φιγ12.Γοοδ εξαµπλε οφ αν ιν ηουσε χοντρολ σταινεδ ωιτη ΠΑΝ ΧΚ, σηοωινγ στρονγ, διστινχτ χψτοπλασµιχ σταινινγ ιν τηε βρεαστ χαρχινοµα (Α) ανδ τονσιλ (Β) σεχτιονσ συβµιττεδ ον τηε σαµε σλιδε. Σεχτιονσ σταινεδ ωιτη Μεναρινι ΑΕ1/ΑΕ3 αντιβοδψ, 1:1, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ, ΧΧ1 στανδαρδ ανδ ιςιεω δετεχτιον κιτ. Πριντεδ ατ 14:42 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ, 212 2

22 Ρυν 96 ΓΕΝΕΡΑΛ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε 12 ΡΥΝ 96Α Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 12 ΡΥΝ 96Β Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) ον ιν ηουσε Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 5 = (%) 5 = (%) 1 6 = (%) 7 = 1 (%) 1 6 = (%) 7 = 1 (%) νο. οφ ρετυρνσ = 5 (1%) 9 = 3 (1%) 1 = 1 (3%) 11 = 14 (4%) 12 = 38 (11%) 13 = 2 (6%) 14 = 24 (7%) νο. οφ ρετυρνσ = 2 (1%) 9 = 3 (1%) 1 = 9 (3%) 11 = 5 (1%) 12 = 25 (7%) 13 = 25 (7%) 14 = 38 (11%) 15 = 46 (13%) 15 = 4 (11%) 2 16 = 15 (29%) 17 = 59 (16%) 2 16 = 116 (33%) 17 = 53 (15%) 18 = 26 (7%) 18 = 25 (7%) = 4 (1%) 2 = 3 (1%) = 9 (3%) 2 = 3 (1%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 197 (55%) 16 2 = 26 (58%) = 9 (25%) = 13 (29%) 1 12 = 62 (17%) 1 12 = 39 (11%) 9 = 9 (3%) 9 = 6 (2%) Μεδιαν = 13.5 Μεδιαν = ΡΥΝ 96Χ Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 16 ΡΥΝ 96 Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) ον ιν ηουσε Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 5 = (%) 6 = (%) 14 5 = (%) 6 = (%) 8 7 = (%) 8 = 11 (3%) 12 7 = (%) 8 = 2 (1%) νο. οφ ρετυρνσ = 11 (3%) 1 = 1 (3%) 11 = 17 (5%) 12 = 49 (14%) 13 = 41 (11%) 14 = 2 (6%) νο. οφ ρετυρνσ = 4 (1%) 1 = 3 (1%) 11 = 14 (4%) 12 = 18 (5%) 13 = 27 (8%) 14 = 2 (6%) 2 15 = 37 (1%) 16 = 82 (23%) 17 = 37 (1%) 18 = 23 (6%) = 44 (12%) 16 = 146 (41%) 17 = 52 (15%) 18 = 17 (5%) = 12 (3%) 2 = 9 (3%) = 5 (1%) 2 = 3 (1%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 163 (45%) 16 2 = 223 (63%) = 98 (27%) = 91 (26%) 1 12 = 76 (21%) 1 12 = 35 (1%) 9 = 22 (6%) 9 = 6 (2%) Μεδιαν = 14. Μεδιαν = 14. Πριντεδ ατ 15:33 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

23 Ρυν 96 ΓΕΝΕΡΑΛ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΑΝΤΙΒΟ ΙΕΣ ΑΝ ΟΤΗΕΡ ΤΕΧΗΝΙΧΑΛ ΠΑΡΑΜΕΤΕΡΣ ΕΜΠΛΟΨΕ ΒΨ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ ΙΝ ΤΗΕ ΓΕΝΕΡΑΛ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ ΜΟ ΥΛΕ Τηε φολλοωινγ ταβλεσ ρεχορδ τηε νυµβερ οφ παρτιχιπαντσ (Ν) υσινγ εαχη πριµαρψ αντιβοδψ. Τηε περχενταγε (%) ρεφερσ το τηε προπορτιον οφ τηεσε παρτιχιπαντσ αχηιεϖινγ αχχεπταβλε σταινινγ (α σχορε >12/2) ον ΥΚ ΝΕΘΑΣ σεχτιονσ. Γενεραλ Πατηολογψ Ρυν: 96 Γενεραλ Πατηολογψ Ρυν: 96 Πριµαρψ Αντιβοδψ : Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) Αντιβοδψ εταιλσ Ν % Α. Μεναρινι ΜΠ 1Χ/Πξ (1Α4) 1 Α. Μεναρινι ΜΥ 128 ΥΧ (ΙΑ4) 2 1 Βιογενεσισ 19Μ ΣΜΑ (1Α4) 1 1 Χελλ Μαρθυε 21Μ (Χλονε ΗΗΦ35) 1 1 Χελλ Μαρθυε 22Μ (Χλονε 1Α4) 9 67 ακο Μ635 ΣΜΑ (Χλονε ΗΗΦ35) 2 5 ακο Μ851 ΣΜΑ (Χλονε 1Α4) ακο ΡΤΥ (Χλονε 1Ρ611) 7 86 Λειχα/Νοϖοχαστρα ΠΑ943 (ασµ 1) 9 1 Νοϖοχαστρα ΝΧΛ ΣΜΑ (ασµ 1) Νοϖοχαστρα ΡΤΥ ΣΜΑ (ασµ 1) 6 83 Σιγµα ΙΜΜΗ2 1ΚΤ (1Α4) 14 1 Τηερµο Σχιεντιφιχ/Νεοµαρκερσ ΜΣ 113 Π (1Α4) 3 1 Τηερµο Σχιεντιφιχ/Νεοµαρκερσ ΜΣ 742 Σ (ΗΗΦ35) 1 ςεχτορ ςπ Σ281 ΣΜΑ (ασµ 1) 2 1 ςεντανα (ΗΥΧ1 1) ςεντανα (1Α4) 2 7 ςεντανα (ΗΗΦ35) 4 1 Πριµαρψ Αντιβοδψ : Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) Αντιβοδψ εταιλσ Ν % Α.Μεναρινι ΜΥ71 ΥΧ (ΑΕ1ΑΕ3) 2 1 Βεχτον ιχκινσον (ΧΑΜ5.2) 1 ΒιοΓενεξ ΜΥ71 ΥΧ (ΑΕ1/ΑΕ3) 3 33 Χελλ Μαρθυε ΑΕ1/ΑΕ3 313Μ 5 8 Χηεµιχον ΜΑΒ 3412 (ΑΕ1/ΑΕ3) 3 1 Βιοσψστεµσ ΑΕ1/ΑΕ3 ΜΟΒ Βιοσψστεµσ ΜΝΦ116 ΜΟΒ ακο ΦΛΕΞ ΡΤΥ ΑΕ1/ΑΕ3 ΙΡ ακο Μ 3515 (ΑΕ1/ΑΕ3) ακο Μ821(ΜΝΦ116) ακο Ν159 (ΑΕ1/ΑΕ3) 5 8 ακο Πολψχλοναλ Ζ622 1 Ινϖιτρογεν ΠΑΝ ΑΕ1/ΑΕ Λειχα Μυλτι Χλονε ΑΕ1/ΑΕ3 ΠΑ Μενοπατη ΠΑΝ ΑΕ1/ΑΕ3 ΜΠ Νοϖοχαστρα ΝΧΛ ΑΕ1 ΑΕ Νοϖοχαστρα ΝΧΛ ΠΑΝ ΧΚ 3 67 Νοϖοχαστρα ΡΤΥ ΑΕ1 ΑΕ3 1 Οτηερ Σιγµα Χ2562 (Παν ΧΚ) 1 ςεχτορ Λαβσ Χλονεσ 5 3+ΛΠ34 ςπ Χ421 1 ςεχτορ Λαβσ Μυλτι Χλονε Χ 11 ςπ Χ ςεντανα (ΑΕ1ΑΕ3) 5 6 ςεντανα (ΑΕ1ΑΕ3) Ζψµεδ (ΑΕ1/ΑΕ3) 3 33 Ζψτοµεδ ΠΑΝ ΑΕ1/ΑΕ3 ΜΣΚ Πριντεδ ατ 15:33 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

24 Ρυν 96 ΓΕΝΕΡΑΛ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε Γενεραλ Πατηολογψ Ρυν: 96 Γενεραλ Πατηολογψ Ρυν: 96 Ηεατ Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) Ν % Ν % Βιοχαρε εχλοακινγ Χηαµβερ ακο Πασχαλ ακο ΠΤΛινκ Λαβ ϖισιον ΠΤ Μοδυλε Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ Μιχροωαϖε Οϖεν ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Οτηερ Πρεσσυρε Χοοκερ Πρεσσυρε Χοοκερ ιν Μιχροωαϖε Οϖεν 2 1 Στεαµερ ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Εξτενδεδ) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ςεντανα Βενκ ΧΧ1# (8µινσ) ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Σταν.) ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1# (8µινσ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Εξτενδεδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1# (8µινσ) Ωατερ βατη 68 ΟΧ Ωατερ βατη ΟΧ Ενζψµε Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) Ν % Ν % ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ Προτεασε 5 1 ακο Προτεασε (Σ219) 1 ακο Προτεινασε Κ (κ1492) 1 1 ακο Προτεινασε Κ (Σ32) 8 75 Μεναρινι προτεασε ΞΞλς (Π838) 1 1 ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Οτηερ Σιγµα χηψµοτρψπσιν (Χ4129) ΣΙΓΜΑ Προτεινασε ςβσ Βονδ Ενζψµε ςβσ Βονδ Ενζψµε ςεντανα Προτεασε ςεντανα Προτεασε 1 (76 218) Πριντεδ ατ 15:33 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

25 Ρυν 96 ΓΕΝΕΡΑΛ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε Γενεραλ Πατηολογψ Ρυν: 96 Γενεραλ Πατηολογψ Ρυν: 96 ετεχτιον Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) Ν % Ν % Α Μενερινι Πολψµερ (ΜΠ ΞΧΠ) ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ Βιοχαρε πολψµερ (Μ4Υ534) ΒιοΓενεξ ΣΣ Πολψµερ (Θ 42 ΨΙΚΕ) ΒιοΓενεξ ΣΣ Πολψµερ (Θ 43 ΞΑΚΕ) ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ ( Κ8/1) ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12) ακο Ενϖισιον ΗΡΠ/ ΑΒ ( Κ57) ακο Ενϖισιον+ ΗΡΠ µουσε Κ44/5/6/ ακο ρβ α µο Ιγ (Ε354) ακο ΡΕΑΛ ΗΡΠ/ ΑΒ (Κ51 ) Ι Λαβσ ΣΣ Σψστεµ ΗΡΠ (Ι ΣΤ17) 1 Λαβςισιον Υλτραςισιον ΛΠ ΗΡΠ (ΤΛ 125 ΗΛϑ) Λαβςισιον Υλτραςισιον ΛΠ ΗΡΠ (ΤΣ 125 Η ) Λαβςισιον Υλτραςισιον ΟΝΕ Πολψµερ ( ΤΛ 12/5 Η ϑ/τ Λειχα Βονδ Πολψµερ εφινε ( Σ9713) Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98) ΜεναΠατη Ξ Χελλ Πλυσ (ΜΠ ΞΧΠ) Νονε ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Νοϖοχαστρα Νοϖολινκ Π Σ (ΡΕ7 14/15/28/29 Κ) Οτηερ Ποωερ ςισιον ΠςΒ999 ΗΡΠ 1 1 ςεχτορ Ελιτε ΑΒΧ (ΠΚ 612) 1 1 ςεχτορ Ελιτε ΑΒΧ Κιτ (ΠΚ 72) ςεχτορ Ελιτε Υνιϖερσαλ ΑΒΧ (ΠΚ 62) ςεχτορ ΙµµΠΡΕΣΣ Υνιϖερσαλ (ΜΠ 75) ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Χηροµογεν Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) Ν % Ν % Α. Μεναρινι Λιθυιδ Σταβλε ΑΒ κιτ ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ ΑΒ (Θ 43) ΒιοΓενεξ Λιθυιδ ΑΒ (ΗΚ153 5Κ) ΒιοΓενεξ λιθυιδ ΒΑ (ΗΚ 124 7Κ) 1 1 ακο ΑΒ Κ ακο ΑΒ Λιθυιδ (Κ3465) 2 1 ΑΚΟ ΑΒ ακο ΑΒ+ Λιθυιδ (Κ3468) ακο ΑΒ+ ΡΕΑΛ ετεχτιον (Κ51) ακο Ενςισιον Πλυσ κιτσ ακο ΦΛΕΞ ΑΒ ακο ΡΕΑΛ Ενςισιον Κ57 ΑΒ ακο ΡΕΑΛ Κ51 ΑΒ Λαβςισιον (ΤΑ 125 Η ) Λαβςισιον ΑΒ µεναπατη ξχελλ κιτ ΑΒ (ΜΠ 86) Οτηερ Σιγµα ΑΒ ( 5637) Σιγµα ΑΒ ( 595) ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ςεχτορ ΑΒ (ΣΚ 41) 1 1 ςεντανα ΑΒ ςεντανα ιϖιεω ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ ςισιον ΒιοΣψστεµσ Βονδ Ξ ΑΒ Ζψµεδ ΑΒ Πλυσ Κιτ 1 1 Γενεραλ Πατηολογψ Ρυν: 96 Αυτοµατιον Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) Ν % Ν % ΒιοΓενεξ ΓενοΜΞ 6ι ΒιοΓενεξ Οπτιµαξ ακο Αυτοσταινερ ακο Αυτοσταινερ Λινκ ακο Αυτοσταινερ πλυσ ακο Αυτοσταινερ Πλυσ Λινκ ακο ΤεχηΜατε Λαβςισιον Αυτοσταινερ Λειχα Βονδ Μαξ Λειχα Βονδ Ξ Λειχα Βονδ ΙΙΙ Μεναρινι Ιντελλιπατη ΦΛΞ Νονε (Μανυαλ) Οτηερ Σηανδον Σεθυενζα ςεντανα Βενχηµαρκ ςεντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα ΝεξΕΣ Πριντεδ ατ 15:33 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

26 Ρυν 96 ΓΕΝΕΡΑΛ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 16/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ851 ΣΜΑ (Χλονε 1Α4), 6 Μινσ, 37 Χ ιλυτιον 1: 5 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) Χηροµογεν: ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ ετεχτιον: ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Πρεδιλυτεδ Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) Μετηοδ 2 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ851 ΣΜΑ (Χλονε 1Α4), 3 Μινσ, 2 Χ ιλυτιον 1: 4 Αυτοµατιον: ακο Αυτοσταινερ ακο ΦΛΕΞ+ κιτ Μαιν Βυφφερ: ακο ΦΛΕΞ ωαση βυφφερ ακο ΠΤΛινκ, Βυφφερ: ΑΚΟ Ηιγη πη ΑΡ σολυτιον ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ακο ΦΛΕΞ ΑΒ, 2 Χ., Τιµε 1: 5 Μινσ, Τιµε 2: 5 Μινσ ετεχτιον: Νονε Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) Μετηοδ 3 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 2/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ851 ΣΜΑ (Χλονε 1Α4), 28 Μινσ, 25 Χ ιλυτιον 1: 1 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3), ΠΗ: 7.6 ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Στανδαρδ), ΠΗ: 9 Χηροµογεν: ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ, 25 Χ., Τιµε 1: 5 Μινσ, Τιµε 2: 5 Μινσ ετεχτιον: Σµοοτη Μυσχλε Αχτιν (ΣΜΑ) Μετηοδ 4 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 18/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Λειχα/Νοϖοχαστρα ΠΑ943 (ασµ 1), 2 Μινσ, 25 Χ Πρεδιλυτεδ Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98), 25 Χ., Τιµε 1: 1 Μινσ ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98), 8 Μινσ, 25 Χ Πρεδιλυτεδ Πριντεδ ατ 15:33 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

27 Ρυν 96 ΓΕΝΕΡΑΛ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 16/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ 3515 (ΑΕ1/ΑΕ3), 6 Μινσ, 37 Χ ιλυτιον 1: 1 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Στανδαρδ) Χηροµογεν: ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ ετεχτιον: ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) Μετηοδ 2 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 18/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ821(ΜΝΦ116), 32 Μινσ ιλυτιον 1: 75 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα ιςιεω Κιτ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Προτεασε 1 (76 218) ιγεστιον Τιµε ΝΕΘΑΣ: 1 Μινσ. Ιν Ηουσε: 1 Μινσ Χηροµογεν: ςεντανα ΑΒ ετεχτιον: ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) Πρεδιλυτεδ Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) Μετηοδ 3 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 18/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ςεντανα (ΑΕ1ΑΕ3), 8 Μινσ Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Προτεασε ιγεστιον Τιµε ΝΕΘΑΣ: 8 Μινσ Χηροµογεν: ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ ετεχτιον: ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Παν ΧΚ (Βροαδ σπεχτρυµ ΧΚ) Μετηοδ 4 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 2/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ςεντανα (ΑΕ1ΑΕ3) Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Προτεασε 1 (76 218) Χηροµογεν: ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ ετεχτιον: ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Πριντεδ ατ 15:33 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

28 The Breast Hormonal Receptor Module Run 96 Suzanne Parry and Merdol Ibrahim Antigens Assessed: Oestrogen Receptors (ER) Tissue Sections circulated: Sections from a composite block (see table below) Number of Registered Participants: 332 Circulated Tissue The table below left shows the staining characteristics of the tissue sections circulated during Run96, which composed of three infiltrating ductal carcinomas (IDCs) with differing levels of receptor expression, along with three ER control cell lines (see photograph below right). The staining of the tumours were characterised using the 6F11 antibody clone. Note: Only the breast tissue cases were used to gauge the participants overall performance. Cell lines were used for validation purposes only. Tissue Sections % positivity Staining Intensity Allred / Quick Score A. IDC 85-95% High 7-8 B. IDC 5-75% Medium to high 4-6 C. IDC % Negative* Cell Lines A >8% High 7-8 B 3-35% High 6 C % Negative General Guideline Used in The Assessment of Slides SCORE Slide not returned by Participant. STAINING PATTERN 1 or 2 Staining of considerably fewer nuclei than expected in one or more of the distributed tissue sections, or inappropriate staining of nuclei in cells not expected to stain. 3 Staining of 1% or greater of tumour nuclei in each of the positive tumour sections, though substantially less than expected to stain, or staining is weaker than expected. 4 or 5 Demonstration of the expected proportion of nuclei stained in the invasive tumours, with roughly the expected staining intensity. Marks are also deducted when correct clinical interpretation of staining may be hindered due to factors such as: - False positive / false negative / non-specific or inappropriate staining - Excessive cytoplasmic or diffuse nuclear staining - Excessively strong or weak haematoxylin counterstain. - Excessive Antigen retrieval resulting in morphological damage - Poor quality/inadequate choice of in-house control tissue ( poor/inadequate fixation, damaged cell morphology, over retrieval etc) In-house Tissue Recommendations & Assessment Participants in-house control tissue MUST consist of composite breast tissue (cell line controls are an acceptable alternative), placed onto a single slide as outlined below i. >8% tumour positivity with high intensity (Allred/Quick score 7-8) ii. 3-7% tumour positivity with low-moderate intensity (Allred/Quick score 4-6) iii. Negative tumour, with normal positively stained glands (Allred/Quick score <1) Participants are requested to stain their own In-house control and submit at least two unstained sections from the same tissue block, thus allowing the organising laboratory to stain the same case. The subsequent comparison of the staining achieved by the participant and organising laboratories on the Inhouse sections, allowed for a more accurate assessment of the staining quality present. Participants NOT using a composite control and/or NOT sending in unstained sections are assessed a maximum score of a 'borderline' pass (1-12/2). UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 27

29 The Breast Hormonal Receptor Module Run 96 Introduction Oestrogen receptor alpha (ER- ) plays a vital role in both the prognosis and predictive response of patient who may be considered for hormone therapy 3 Following the work of Harvey and colleagues 1, immunohistochemistry has now become the recognised gold standard for determining patient ER status. It is therefore crucial that not only the antibodies are correctly validated prior to patient-tissue use, but also proper control tissues are used to gauge the sensitivity of the test. Furthermore, in the UK, the NHS Breast Screening Programme ( recommends the Quick score (Allred) 1,2 to semi quantify the proportion and intensity of nuclear staining, thus further standardising the scoring criteria. ER Cell Lines For this assessment ER expressing cell lines were also incorporated alongside the tissue sections. The cell lines were however not used as part of the assessment procedure but data was collected on their staining pattern in order to validate their usability for possible future NEQAS ER/PR assessments. The cell lines were kindly prepared and donated by Dako and consisted of; a) CAMA-1 (human breast carcinoma) ER positive cell line, b) HT-29 (human colon cancer) ER negative cell lines, and c) a mixture of CAMA-1 and HT-29 to provide a pseudo-mid expressing cell line For the UK NEQAS assessment the team of assessors gauge the sensitivity and specificity of the participants submitted stained slides and score them according to the expected level of staining that can be achieved using the 6F11 antibody clone on the same composite tissue sent out to the participants. Assessment Results Features of optimal immunostaining (figs 1-4) Staining of the expected proportion of invasive tumour nuclei with the anticipated staining intensity Intense nuclear staining of the appropriate distribution in normal glands Cytoplasmic staining not excessive No background staining of connective tissues or inappropriately localised staining Features of sub-optimal immunostaining (figs 5-7) Relatively weak nuclear staining of the receptor positive tumours Excessive cytoplasmic staining Excessive background staining of connective tissue elements Inappropriate staining of some cells e.g. lymphocytes, fibroblasts NEQAS Slide Results The overall pass rate on NEQAS sections was 65% (scores of 13-2/2) for participants as a whole, with a failure rate of 9% (28 participants). The main reason for failure during this assessment was due to false positive staining of the negative ER expressing tissue section (section C) (see fig. 5A). The false positive staining was also mirrored in the negative cell line (Fig 5B), which further indicated the false positive nature of the staining. Furthermore, the false negative staining was quite evident in the 6F11 antibody clone. It is however, difficult to say where the issue lay so participants are strongly encouraged to properly control the staining of their clinical cases. These finding indicate the necessity of good quality control tissue of known levels of expression (high, medium and negative) so both the sensitivity and specificity of the ER IHC staining can be adequately monitored 4,5. A new antibody was also noted during this assessment, namely the Dako EP1 clone, with 3 participants now appearing to use it in their everyday repertoire. Two out of the 3 participants showed the expected level of staining using this antibody clone. The EP1 antibody is recommended to be used with a high ph antigen retrieval. It should also be noted that during this assessment participants unstained in-house controls were also stained using the Dako EP1 clone and showed a good level of staining. But again further data has yet to be collected on this EP1 clone and participants are advised to carry out a proper validation prior to introducing it into their everyday laboratory practice. In-house Tissue Results Participants submitted in-house control material showed an overall pass rate of 58%, with a borderline pass rate of 37%. The main reasons behind the borderline scores were mainly due to participants not submitting the required high, mid and negative ER expressing tumours. As discussed above, good quality control material is paramount to gauging both the sensitivity and specificity of ER staining and can be used to trouble shoot where in the staining methodology the problem may be. References 1. Jennet M. Harvey, Gary M. Clark, C. Kent Osborne, and D. Craig Allred (1999) Estrogen Receptor Status by Immunohistochemistry Is Superior to the Ligand-Binding Assay for Predicting Response to Adjuvant Endocrine Therapy in Breast Cancer J Clin Oncol 17: Robin Leake, Diana Barnes, Sarah Pinder, Ian Ellis, Liz Anderson, Tom Anderson, Ruth Adamson, Tony Rhodes, Keith Miller and Rosemary Walker (2) J. Clin. Pathol. 2: Fisher B, Costantino J, Redmond C, Poisson R, Bowman D, Couture J, Dimitrov NV, Wolmark N, Wickerham DL, Fisher ER, et al. (1989) A randomized clinical trial evaluating tamoxifen in the treatment of patients with node-negative breast cancer who have estrogenreceptor-positive tumors. N Engl J Med 1989: Ibrahim M, Dodson A, Barnett S, Fish D, Jasani B, Miller K. (28) Potential for false-positive staining with a rabbit monoclonal antibody to progesterone receptor (SP2): findings of the UK National External Quality Assessment Scheme for Immunocytochemistry and FISH highlight the need for correct validation of antibodies on introduction to the laboratory. Am J Clin Pathol. 129: Rhodes A, Jasani B, Balaton, et al. (21) Study of interlaboratory reliability and reproducibility of estrogen and progesterone receptor assays in Europe: documentation of poor reliability and identification of insufficient microwave antigen retrieval time as a major contributory element of unreliable assays. Am J Clin Pathol 21: UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 28

30 ΡΥΝ 96 ΒΡΕΑΣΤ ΣΤΕΡΟΙ ΗΟΡΜΟΝΕ ΡΕΧΕΠΤΟΡ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ 1. Οϖερϖιεω οφ οπτιµαλλψ σταινεδ ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ σεχτιονσ, σηοωινγ Α) ηιγη εξπρεσσινγ τυµουρ Β) µιδ εξπρεσσινγ τυµουρ ανδ Χ) νεγατιϖε τυµουρ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη Νοϖοχαστρα 6Φ11, 1:5 φορ 15 µινυτεσ, υσινγ βονδ ΜΑΞ ΕΡ2 ΙΙ αντιγεν ρετριεϖαλ (2 µινσ). Φιγ 2. Γοοδ δεµονστρατιον οφ ΕΡ ιν τηε µιδ εξπρεσσινγ ΥΚ ΝΕΘΑΣ τυµουρ σεχτιον, σηοωινγ ωελλ λοχαλισεδ ΕΡ εξπρεσσιον οφ ϖαρψινγ ιντενσιτψ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ςεντανα ΣΠ1 πρε διλυτεδ αντιβοδψ, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ, υσινγ ΧΧ1 στανδαρδ ρετριεϖαλ. Φιγ 3. ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ νεγατιϖε ΕΡ σεχτιον, σηοωινγ λαχκ οφ ΕΡ σταινινγ ωιτηιν τηε τυµουρ χελλσ ανδ αν οϖεραλλ χλεανλψ λαβελλεδ τισσυε σεχτιον. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ςεντανα ΣΠ1 πρε διλυτεδ αντιβοδψ, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ, υσινγ ΧΧ1 στανδαρδ ρετριεϖαλ. Φιγ 4. ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ χοντρολ χελλ λινεσ σηοωινγ τηε εξπεχτεδ λεϖελσ οφ σταινινγ. Α) ηιγη εξπρεσσινγ χελλ λινε (Αλλρεδ 7 8) Β) Μιδ εξπρεσσινγ χελλ λινε σηοωινγ α µιξτυρε οφ ηιγη ανδ νεγατιϖε χελλ λινεσ (1:2) (Αλλρεδ 5 6) ανδ Χ) Νεγατιϖε χελλ λινε (σεε ιντροδυχτιον φορ φυρτηερ δεταιλσ). Σεχτιον σταινεδ ωιτη ςεντανα ΣΠ1 πρε διλυτεδ αντιβοδψ, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ Φιγ 5. Υναχχεπταβλε λεϖελ οφ σταινινγ οφ ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ Α) νεγατιϖε τισσυε σεχτιον ανδ Β) αδϕοινινγ νεγατιϖε χελλ λινε φροµ τηε σαµε σλιδε. Βοτη σεχτιονσ σηοω φαλσε ποσιτιϖε σταινινγ ανδ α βαχκγρουνδ χψτοπλασµιχ βλυση. Σεχτιον σταινεδ ωιτη Νοϖοχαστρα 6Φ11 χλονε, διλυτεδ 1:5 φορ 3 µινσ., υσινγ Βονδ Μαξ ΕΡ2 ρετριεϖαλ φορ 3 µινσ. Φιγ 6. Υναχχεπταβλε λεϖελ οφ σταινινγ οφ ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ Α) µιδ εξπρεσσινγ τυµουρ σταινινγ µυχη λοωερ τηαν εξπεχτεδ αλονγ ωιτη αδϕαχεντ Β) ηιγη εξπρεσσινγ χελλ λινε, αλσο σηοωινγ ωεακερ τηαν εξπεχτεδ λεϖελ οφ σταινινγ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο ΕΠ1 χλονεσ, διλυτεδ 1:1, ινχυβατιον 15 µινσ, υσινγ Λειχα Βονδ Μαξ ΕΡ1 ρετριεϖαλ φορ 2 µινυτεσ. Πριντεδ ατ 14:26 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

31 ΡΥΝ 96 ΒΡΕΑΣΤ ΣΤΕΡΟΙ ΗΟΡΜΟΝΕ ΡΕΧΕΠΤΟΡ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ 7. Υναχχεπταβλε λεϖελ οφ σταινινγ οφ ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ Α) νεγατιϖε τισσυε σεχτιον ανδ αδϕαχεντ Β) νεγατιϖε χελλ λινε φροµ τηε σαµε σλιδε. Α) Πατχηψ νυχλεαρ σταινινγ οφ τηε νεγατιϖε τισσυε σεχτιον ανδ Β) µεµβρανε λικε σταινινγ οφ τηε νεγατιϖε χελλ λινε, ωιτη νο αππαρεντ νυχλεαρ λοχαλισατιον οφ τηε αντιβοδψ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη Αβχαµ 1666 (ΣΠ1 χλονε), διλυτεδ 1:5, Πριντεδ ατ 14:26 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ, 212 3

32 Ρυν 96 ΒΡΕΑΣΤ ΣΤΕΡΟΙ ΗΟΡΜΟΝΕ ΡΕΧΕΠΤΟΡ Μοδυλε 5 ΡΥΝ 96Ε Οεστρογεν ρεχεπτορσ ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ ΑΛΛ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 5 = (%) 24 ΡΥΝ 96Ε Οεστρογεν ρεχεπτορσ ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ ΥΚ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 5 = (%) 4 6 = 1 (%) 7 = 2 (1%) 2 6 = (%) 7 = 1 (1%) 8 = 11 (3%) 8 = 5 (3%) νο. οφ ρετυρνσ = 14 (4%) 1 = 17 (5%) 11 = 14 (4%) 12 = 49 (15%) 13 = 28 (9%) 14 = 19 (6%) 15 = 42 (13%) νο. οφ ρετυρνσ = 1 (6%) 1 = 8 (5%) 11 = 1 (6%) 12 = 23 (14%) 13 = 15 (9%) 14 = 8 (5%) 15 = 23 (14%) 1 16 = 47 (15%) 17 = 26 (8%) 4 16 = 14 (9%) 17 = 13 (8%) 18 = 34 (1%) 18 = 21 (13%) = 18 (6%) 2 = 2 (1%) = 12 (7%) 2 = 1 (1%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 127 (39%) 16 2 = 61 (37%) = 89 (27%) = 46 (28%) 1 12 = 8 (25%) 1 12 = 41 (25%) 9 = 28 (9%) 9 = 16 (1%) Μεδιαν = 13. Μεδιαν = ΡΥΝ 96Φ Οεστρογεν ρεχεπτορσ ον ιν ηουσε Σεχτιονσ ΑΛΛ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 5 = (%) 6 = (%) 4 35 ΡΥΝ 96Φ Οεστρογεν ρεχεπτορσ ον ιν ηουσε Σεχτιονσ ΥΚ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 5 = (%) 6 = (%) 8 7 = (%) 8 = 6 (2%) 3 7 = (%) 8 = 2 (1%) νο. οφ ρετυρνσ = 1 (3%) 1 = 11 (3%) 11 = 13 (4%) 12 = 96 (3%) 13 = 15 (5%) 14 = 2 (6%) νο. οφ ρετυρνσ = 3 (2%) 1 = 6 (4%) 11 = 5 (3%) 12 = 37 (23%) 13 = 7 (4%) 14 = 11 (7%) 2 15 = 29 (9%) 16 = 39 (12%) 17 = 38 (12%) 18 = 26 (8%) = 16 (1%) 16 = 21 (13%) 17 = 26 (16%) 18 = 2 (12%) = 14 (4%) 2 = 4 (1%) = 8 (5%) 2 = 2 (1%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 121 (38%) 16 2 = 77 (47%) = 64 (2%) = 34 (21%) 1 12 = 12 (37%) 1 12 = 48 (29%) 9 = 16 (5%) 9 = 5 (3%) Μεδιαν = 14. Μεδιαν = 14. Πριντεδ ατ 14:27 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

33 Ρυν 96 ΒΡΕΑΣΤ ΣΤΕΡΟΙ ΗΟΡΜΟΝΕ ΡΕΧΕΠΤΟΡ Μοδυλε ΑΝΤΙΒΟ ΙΕΣ ΑΝ ΟΤΗΕΡ ΤΕΧΗΝΙΧΑΛ ΠΑΡΑΜΕΤΕΡΣ ΕΜΠΛΟΨΕ ΒΨ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ ΙΝ ΤΗΕ ΒΡΕΑΣΤ ΣΤΕΡΟΙ ΗΟΡΜΟΝΕ ΡΕΧΕΠΤΟΡ ΜΟ ΥΛΕ Τηε φολλοωινγ ταβλεσ ρεχορδ τηε νυµβερ οφ παρτιχιπαντσ (Ν) υσινγ εαχη πριµαρψ αντιβοδψ. Τηε περχενταγε (%) ρεφερσ το τηε προπορτιον οφ τηεσε παρτιχιπαντσ αχηιεϖινγ αχχεπταβλε σταινινγ (α σχορε >12/2) ον ΥΚ ΝΕΘΑΣ σεχτιονσ. Βρεαστ Στεροιδ Ηορµονε Ρεχεπτορ Ρυν: 96 Βρεαστ Στεροιδ Ηορµονε Ρεχεπτορ Ρυν: 96 Πριµαρψ Αντιβοδψ : Οεστρογεν ρεχεπτορσ Αντιβοδψ εταιλσ Ν % Α.Μεναρινι ΜΥ 272 (1 5) 1 1 Αβχαµ αβ1666 (ΣΠ1) 1 ακο (ΕΠ1) ΙΡ ακο (ΕΠ1) Μ ακο ΦΛΕΞ (1 5) ΙΡ/ΙΣ657 2 ακο ΙΡ151 Αυτοσταινερ Λινκ (ΣΠ1) 4 1 ακο Μ3634 (ΣΠ1) ακο Μ747 ΕΡ (1 5) 15 6 ακο Ν1575 (1 5) 1 ακο Πηαρµ ξ (Αυτοσταινερ κιτ) Κ471 1 ακο ΡΤΥ ΙΡ151 (ΣΠ1) 2 1 ακο ΣΚ31 πηαρµ Ξ κιτ (Λινκ) (1 5 + ΕΡ 2 123) 1 1 Λειχα Βονδ ΠΑ151 (6Φ11) Μεναπατη ΜΠ 93 ΧΜ Νοϖοχαστρα ΝΧΛ ΕΡ 6Φ11 (6Φ11) 4 65 Νοϖοχαστρα ΝΧΛ ΕΡ 6Φ11/ Νοϖοχαστρα ΝΧΛ Λ ΕΡ 6Φ Νοϖοχαστρα ΡΤΥ ΕΡ 6Φ Τηερµο Φισηερ/ Νεοµαρκερσ ΡΜ 911 Σ (ΣΠ1) 3 67 ςεχτορ ΧΒ11 ςπ Χ ςεχτορ ςπ Ε613/4 (6Φ11) 15 6 ςεντανα ΕΡ (6Φ11) 3 33 ςεντανα (6Φ11) 1 1 ςεντανα (ΣΠ1) 58 9 ςεντανα (ΣΠ1) Αυτοµατιον Οεστρογεν ρεχεπτορσ Ν % ΒιοΓενεξ ΓενοΜΞ 6ι 1 ΒιοΓενεξ Οπτιµαξ 2 5 ακο Αυτοσταινερ 1 8 ακο Αυτοσταινερ Λινκ ακο Αυτοσταινερ πλυσ ακο Αυτοσταινερ Πλυσ Λινκ 6 83 Λαβςισιον Αυτοσταινερ Λειχα Βονδ Μαξ Λειχα Βονδ ΙΙΙ Μεναρινι Ιντελλιπατη ΦΛΞ 6 5 Νονε (Μανυαλ) 1 5 Οτηερ 5 8 Σηανδον Σεθυενζα 4 75 ςεντανα Βενχηµαρκ ςεντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ Πριντεδ ατ 14:27 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

34 Ρυν 96 ΒΡΕΑΣΤ ΣΤΕΡΟΙ ΗΟΡΜΟΝΕ ΡΕΧΕΠΤΟΡ Μοδυλε Βρεαστ Στεροιδ Ηορµονε Ρεχεπτορ Ρυν: 96 Βρεαστ Στεροιδ Ηορµονε Ρεχεπτορ Ρυν: 96 Ηεατ Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Οεστρογεν ρεχεπτορσ Ν % Βιοχαρε εχλοακινγ Χηαµβερ 7 86 ακο Πασχαλ 6 33 ακο ΠΤΛινκ 5 62 Λαβ ϖισιον ΠΤ Μοδυλε 1 6 Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ Μιχροωαϖε Οϖεν 1 6 ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ 1 1 Οτηερ 8 63 Πρεσσυρε Χοοκερ Στεαµερ 1 ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Εξτενδεδ) 5 1 ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Στανδαρδ) 2 85 ςεντανα Βενκ ΧΧ1# (8µινσ) 3 67 ςεντανα Βενκ ΧΧ2 (µιλδ) 1 ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Μιλδ) 9 78 ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Σταν.) 9 78 ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Εξτενδεδ) 7 71 ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ2 (Σ) 1 1 Ωατερ βατη ΟΧ 3 1 Ενζψµε Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Οεστρογεν ρεχεπτορσ Ν % ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ 5 1 ακο Προτεασε (Σ219) 1 1 ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Οτηερ 1 1 Τρψπσιν ιφχο 1 1 ςβσ Βονδ Ενζψµε 1 1 Πριντεδ ατ 14:27 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

35 Ρυν 96 ΒΡΕΑΣΤ ΣΤΕΡΟΙ ΗΟΡΜΟΝΕ ΡΕΧΕΠΤΟΡ Μοδυλε Βρεαστ Στεροιδ Ηορµονε Ρεχεπτορ Ρυν: 96 Βρεαστ Στεροιδ Ηορµονε Ρεχεπτορ Ρυν: 96 ετεχτιον Οεστρογεν ρεχεπτορσ Ν % Α Μενερινι Πολψµερ (ΜΠ ΞΧΠ) 1 1 ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ ΣΣ Πολψµερ (Θ 43 ΞΑΚΕ) 3 67 ακο Α ςανχε ΗΡΠ (Κ468/9) 1 ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ ( Κ8/1) 8 63 ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12) ακο Ενϖισιον ΗΡΠ/ ΑΒ ( Κ57) 7 57 ακο Ενϖισιον+ ΗΡΠ µουσε Κ44/5/6/ ακο ρβ α µο Ιγ (Ε354) 1 1 ακο ΡΕΑΛ ΗΡΠ/ ΑΒ (Κ51 ) 4 25 Λαβςισιον Υλτραςισιον ΛΠ ΗΡΠ (ΤΣ 125 Η ) 1 1 Λαβςισιον Υλτραςισιον ΟΝΕ Πολψµερ ( ΤΛ 12/5 Η ϑ/τ 2 Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98) ΜεναΠατη Ξ Χελλ Πλυσ (ΜΠ ΞΧΠ) 6 5 Νονε 3 67 ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ 2 1 Νοϖοχαστρα Νοϖολινκ Π Σ (ΡΕ7 14/15/28/29 Κ) 4 25 Οτηερ 16 5 ςεχτορ Ελιτε ΑΒΧ Κιτ (ΠΚ 72) 1 1 ςεχτορ ΙµµΠΡΕΣΣ Υνιϖερσαλ (ΜΠ 75) 1 1 ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Χηροµογεν Οεστρογεν ρεχεπτορσ Ν % Α. Μεναρινι Λιθυιδ Σταβλε ΑΒ κιτ 2 1 ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ ΑΒ (Θ 43) 2 1 ΒιοΓενεξ Λιθυιδ ΑΒ (ΗΚ153 5Κ) 1 ακο ΑΒ Κ ΑΚΟ ΑΒ ακο ΑΒ+ Λιθυιδ (Κ3468) 6 5 ακο ΑΒ+ ΡΕΑΛ ετεχτιον (Κ51) 1 ακο Ενςισιον Πλυσ κιτσ 5 6 ακο ΦΛΕΞ ΑΒ ακο ΡΕΑΛ Ενςισιον Κ57 ΑΒ 8 63 ακο ΡΕΑΛ Κ51 ΑΒ 3 33 µεναπατη ξχελλ κιτ ΑΒ (ΜΠ 86) 7 57 Οτηερ Σιγµα ΑΒ ( 5637) 1 1 Σιγµα ΑΒ ( 595) 1 1 ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ςεντανα ΑΒ 7 1 ςεντανα ιϖιεω 2 9 ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ ςισιον ΒιοΣψστεµσ Βονδ Ξ ΑΒ 3 33 Πριντεδ ατ 14:27 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

36 Ρυν 96 ΒΡΕΑΣΤ ΣΤΕΡΟΙ ΗΟΡΜΟΝΕ ΡΕΧΕΠΤΟΡ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ Οεστρογεν ρεχεπτορσ Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 18/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 18/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ςεχτορ ςπ Ε613/4 (6Φ11), 4 Μινσ, 37 Χ ιλυτιον 1: 5 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3), ΠΗ: 7.4 ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ, 37 Χ., Τιµε 1: 8 Μινσ ετεχτιον: ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5), 8 Μινσ, 37 Χ Πρεδιλυτεδ Οεστρογεν ρεχεπτορσ Μετηοδ 2 Παρτιχιπαντ σχορεδ 18/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 2/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο ΙΡ151 Αυτοσταινερ Λινκ (ΣΠ1), 2 Μινσ, 21 Χ Πρεδιλυτεδ Αυτοµατιον: ακο Αυτοσταινερ Λινκ 48 ακο ΦΛΕΞ+ κιτ Μαιν Βυφφερ: ακο ΦΛΕΞ ωαση βυφφερ ακο ΠΤΛινκ, Βυφφερ: ΑΚΟ ΗΙΓΗ ΠΗ ΤΡΣ Χηροµογεν: ακο ΦΛΕΞ ΑΒ, 21 Χ., Τιµε 1: 5 Μινσ, Τιµε 2: 5 Μινσ ετεχτιον: ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12), 2 Μινσ, 21 Χ Πρεδιλυτεδ Οεστρογεν ρεχεπτορσ Μετηοδ 3 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 18/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Νοϖοχαστρα ΝΧΛ Λ ΕΡ 6Φ11, 44 Μινσ, 37 Χ ιλυτιον 1: 3 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα ιςιεω Κιτ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ςεντανα ιϖιεω, 37 Χ., Τιµε 1: 8 Μινσ ετεχτιον: ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) Πρεδιλυτεδ Οεστρογεν ρεχεπτορσ Μετηοδ 4 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 19/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ςεντανα (ΣΠ1), 32 Μινσ, 37 Χ Πρεδιλυτεδ Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Μιλδ) Χηροµογεν: ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ ετεχτιον: ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Πρεδιλυτεδ Πριντεδ ατ 14:27 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

37 The Breast HER2 ICC Module Run 96 Merdol Ibrahim, Suzanne Parry and Keith Miller Antigens Assessed: HER2 Tissue Sections circulated: Composite cell lines (see table below) Number of Registered Participants: 29 Specific Guideline Used in The Assessment of Slides: The immunohistochemical results were evaluated by UK NEQAS assessors scoring independently using an adapted method initially devised by the Clinical Trials Assay. Due to the nature of cell lines, overall percentage staining criteria can not be accurately applied to cell when scoring cell lines. Communication with Leica Microsystems, with whom UK NEQAS ICC & ISH developed the cell lines, indicate that expected level of membrane staining for a given cell line may range from 3-9% from the viable cell line population. For this reason when cutting sections, every 5th section is stained as a reference point to gauge the expected level of staining throughout the cell block/s. The table below demonstrates the staining patterns looked for in cell lines and in-house tissue sections during assessments. Score Assessment of Cell Line Staining Pattern Assessment of In-house tissue sections 3+ Strong complete cell membrane staining Strong complete cell membrane staining in >3% of tumour cells 2+ Weak to moderate complete cell membrane staining Weak to moderate complete cell membrane staining in >1% of tumour cells 1+ Faint barely perceptible incomplete membrane staining Faint barely perceptible incomplete membrane in >1% of cells staining negative No staining in the control cell line No staining in the control cell line. UK NEQAS Specific Scoring Algorithm: UK NEQAS ICC & ISH devised an EQA specific algorithm for scoring both cell lines and tissue sections, so as to provide participants additional technical feedback. As well as taking into account the expected range (3-9% see above) of cell line membrane staining, the acceptable staining levels of each of the cell lines are as follows: Table below illustrates the expected level of staining for each of the circulated breast carcinoma cell lines along with the UK NEQAS scoring criteria used in assessments ONLY. Cell line Score Acceptable level/s of staining during assessments Description of staining Pattern used by the assessors SK-BR only The 3+ cell line has a wide threshold of complete membrane staining showing strong staining. Only this level of membrane staining is deemed acceptable for this cell line.. MDA-MB or 1+/2+ or 2+/3+ or 2+/1+ or 3+/2+ i) 1+/2+ or 2+/1+: Staining is slightly weaker than expected with membrane showing more 1+ compared to 2+ (1+/2+) or 2+ membrane staining is present but also showing 1+ staining (2+/1+). ii) 2+/3+ or 3+/2+: Staining is slightly weaker than expected with membrane showing more 2+ compared to 3+ (2+/3+) or 3+ membrane staining is present but also showing 2+ staining (3+/2+). MDA-MB or /1+ or 1+/ i) /1+: Staining is more towards the weaker end of 1+ staining but still acceptable. ii) 1+/: Staining is more towards the weaker end of 1+ staining but still acceptable. MDA-MB-231 negative or /1+ or 1+/ /1+ or 1+/ = Cells are starting to show very weak membrane staining U /Uninterpretable Scores Assessors may also give a score of 'U' which indicates that the cell lines / tissue sections were 'uninterpretable due to the reasons set out below. A score of U/x e.g. U/3+ or U/2+ or U/1+ or U/ indicates a borderline uninterpretable scores indicating that the staining is just about readable and further improvements are required. Cell Line FISH Scores: The NEQAS cell lines are also FISHed as part of the HER2 ISH module, and the table below shows the HER2 FISH ratio ranges provided by the UK NEQAS reference centres for Run 24 of the HER2 ISH assessments. Cell line Score HER2 gene:ch17 ratio range HER2 status by FISH* SK-BR Amplified MDA-MB Borderline: Amplified to Amplified MDA-MB Not amplified MDA-MB-231 negative Not amplified UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 37

38 The Breast HER2 ICC Module Run 96 Cell Line Positioning: Cell lines are positioned on microscope slides, as illustrated below. Any variation in this pattern is indicated on distribution of the slides HER2 HER2 immunohistochemistry has been routinely used as a predictive marker in breast cancer for more than 1 years. Patients with HER2 positive tumours generally have a poor overall prognosis. However, patients with metastatic disease showed an improved rate of survival when the humanized monoclonal antibody trastuzumab (Herceptin) was given alone or added with chemotherapy treatment (Slamon et al., 1998). Herceptin, in the metastatic setting was made available in the UK in 2 by the UK National Institute for Clinical Excellence (NICE). In 25, Herceptin in the adjuvant setting was also shown to be effective in primary breast cancers by reducing the risk of recurrence and mortality (see articles by Wolff et al., (26) and Walker et al., (28) for further commentary and citations), and in 26 NICE approved primary breast screening for HER2. In the UK alone this has resulted in approximately 4, breast cancers per year being tested for HER2. With so many more cases now being tested worldwide, it is imperative that correct protocols and methodologies are followed and adhered to. The UK NEQAS HER2 IHC module assesses the technical quality of staining achieved by laboratories and provides feedback to laboratories to help improve the analytical phase of patient diagnosis. appropriate invasive control material, to submit DCIS tissue showing differing levels of membrane staining as an acceptable alternative. Laboratories must indicate on their datasheet which component of the tumour they have scored otherwise the invasive component (if present) will be assessed. References 1. Slamon D, Leyland-Jones B, Shak S, et al. Addition of Herceptin (humanised anti-her2 antibody) to first line chemotherapy for (HER2+/MBC) markedly increases anticancer activity: a randomised, multinational controlled phase III trial. Proc ASCO 1998;17:98a. 2. Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland-Jones B, et al: Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 353: , Bartlett JM, Ibrahim M, Jasani B, et al. External quality assurance of HER2 FISH testing: results of a UK NEQAS pilot scheme. J Clin Pathol 27 6(7): Walker RA, Bartlett JM, Dowsett M, Ellis IO, Hanby AM, Jasani B, Miller K, Pinder SE. HER2 testing in the UK: further update to recommendations. J Clin Pathol (7): Wolff AC, Hammond MEH, Schwartz JN, et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol 27;25:1 28. Two recommended HER2 testing guidelines are: 1. The ASCO/CAP guidelines by Wolff et al., (26) and 2. UK updated guidelines by Walker et al., (28). Both provide invaluable guidelines covering interpretation, tissue fixation and antibody validation. The article by Walker et. al., also provides guidelines on the minimum number of tests per year, (25 for HER2 IHC and 1 HER2 ISH) that labs should be testing in order to provide a robust HER2 IHC service. Participants who continue to have difficulty in producing acceptable staining results should be aware that the members of staff at UK NEQAS are always willing to assist any laboratory that is struggling to meet the required standard of HER2 immunostaining, and would be happy to receive request for assistance via in the first instance (see front of journal for contact details). In-house Control Tissue Recommendations Correct choice of in-house control tissue and good morphological preservation is paramount to gauge the sensitivity of the HER2 test, which can have an impact on clinical interpretation. UK NEQAS ICC & ISH therefore recommends the following: In-house control tissue (or cell lines) must include 3+,2+ and 1+/ invasive breast cancer cases. However, it has become quite apparent that as patient tumour size and respective biopsies become smaller laboratories may be having difficulty finding appropriate invasive control material. It is therefore acceptable, if laboratories are having problems in finding UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 38

39 ΡΥΝ 96 ΒΡΕΑΣΤ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ1.Οπτιµαλ σταινινγ οφ τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χελλ λινε ΣΚ ΒΡ3 (3+), σηοωινγ στρονγ µεµβρανε σταινινγ, ωηιχη ισ χοµπλετελψ χιρχυµφερεντιαλ, ωιτη µινιµαλ χψτοπλασµιχ σταινινγ. Σταινεδ ωιτη ςεντανα 4Β5 πρεδιλυτεδ αντιβοδψ, ον τηε Βενχηµαρκ ΞΤ, ΧΧ1 µιλδ ανδ Υλτραϖιεω δετεχτιον κιτ. Φιγ2.Οπτιµαλ σταινινγ οφ τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χελλ λινε ΣΚ ΒΡ3 (3+), σηοωινγ στρονγ χοµπλετε µεµβρανε σταινινγ. Τηερε ισ α σµαλλ ποπυλατιον οφ δεαδ χελλσ ωηιχη αρε ιγνορεδ δυρινγ τηε ασσεσσµεντσ. Σεχτιον σταινεδ υσινγ τηε ακο Ηερχεπτ κιτ, πρε τρεατµεντ χαρριεδ ιν τηε ωατερ βατη (95 98 Χ) φορ 4 µινσ. Φιγ3.Τωο εξαµπλεσ οφ ιναππροπριατε σταινινγ οφ τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χελλ λινε ΣΚ ΒΡ3 (3+). Βοτη πανελσ σηοω εξχεσσιϖε νον σπεχιφιχ χψτοπλασµιχ σταινινγ χαυσεδ βψ εξχεσσιϖε αντιγεν ρετριεϖαλ. (Α) σταινεδ ωιτη ςεντανα 4Β5, ΧΧ1 στανδαρδ ανδ ιςιεω κιτ. (Β) σταινεδ ωιτη ακο ΧερΒ2 πολψ, 1:9, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ, ΧΧ1 µιλδ ανδ Υλτραϖιεω κιτ. Φιγ4.Οπτιµαλ σταινινγ οφ τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χελλ λινε Μ Α ΜΒ 453 (2+), σηοωινγ χοµπλετε µεµβρανε σταινινγ ιν τηε µαϕοριτψ οφ χελλσ, ωιτη λεσσ ιντενσιϖε σταινινγ τηαν τηατ σεεν ωιτη τηε 3+ χελλ λινε. Σεχτιον σταινεδ υσινγ τηε Λειχα Οραχλε ΧΒ11 ον τηε ΒονδΜαξ ωιτη ΕΡ1 ανδ Ρεφινε κιτ. Φιγ5.Οπτιµαλ σταινινγ οφ τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χελλ λινε Μ Α ΜΒ 453 (2+), σηοωινγ χοµπλετε µεµβρανε σταινινγ ιν τηε µαϕοριτψ οφ χελλσ, ωιτη λεσσ ιντενσιϖε σταινινγ τηαν τηατ σεεν ωιτη τηε 3+ χελλ λινε. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ςεντανα 4Β5 πρεδιλυτεδ αντιβοδψ, ον τηε Βενχηµαρκ ΞΤ, ΧΧ1 µιλδ ανδ Υλτραϖιεω δετεχτιον κιτ. Φιγ6.Τωο εξαµπλεσ οφ ιναππροπριατε σταινινγ οφ τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χελλ λινε Μ Α ΜΒ 453 (2+). (Α) σηοωσ στρονγ χοµπλετε µεµβρανε σταινινγ, ωηιχη ισ φαρ τοο ιντενσε φορ α 2+, σταινεδ υσινγ Λειχα Οραχλε ΧΒ11 ωιτη ΕΡ1 25 µινσ. (Β) σηοωσ εξχεσσιϖε νον σπεχιφιχ χψτοπλασµιχ σταινινγ χαυσεδ βψ εξχεσσιϖε αντιγεν ρετριεϖαλ, σταινεδ ωιτη ακο ΧερΒ2 πολψ, ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ. Πριντεδ ατ 13:37 ον Φριδαψ, 3 Φεβρυαρψ,

40 ΡΥΝ 96 ΒΡΕΑΣΤ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ7.Οπτιµαλ σταινινγ οφ τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χελλ λινε Μ Α ΜΒ 175 (1+), σηοωινγ αχιναρ χλυµπσ ωιτη βοτη φινε µεµβρανε ανδ χοαρσε λυµιναλ σταινινγ. Ιτ ισ ονλψ τηε φινε µεµβρανε σταινινγ τηατ ισ ασσεσσεδ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη τηε ακο Ηερχεπτ κιτ, πρε τρεατµεντ χαρριεδ ουτ ιν τηε ωατερ βατη (95 98 Χ) φορ 4 µινσ. Φιγ8.Οπτιµαλ σταινινγ οφ τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χελλ λινε Μ Α ΜΒ 175 (1+). Παρτιαλ µεµβρανε ισ οβσερϖεδ ωιτη λεσσ τηαν 1% οφ χελλσ σηοωινγ χοµπλετε µεµβρανε σταινινγ. Σεχτιον σταινεδ υσινγ τηε Λειχα Οραχλε ΧΒ11 ον τηε ΒονδΜαξ ωιτη ΕΡ1 ανδ Ρεφινε κιτ. Φιγ9.Ιναππροπριατε σταινινγ οφ αν ιν ηουσε 1+ σεχτιον, σηοωινγ τισσυε µορπηολογψ δαµαγε. Τηε ΝΕΘΑΣ 1+ χελλ λινε (ινσερτ) συβµιττεδ φροµ τηισ Λαβ χορρελατεσ ωελλ. Τηισ ισ µοστ λικελψ χαυσεδ βψ εξχεσσιϖε αντιγεν ρετριεϖαλ. Σεχτιονσ σταινεδ ωιτη Νοϖοχαστρα ΧΒ11 αντιβοδψ, 1:6, πρε τρεατεδ υσινγ α πρεσσυρε χοοκερ, δετεχτιον ωιτη τηε Νοϖολινκ πολψµερ κιτ. Φιγ1.Ιναππροπριατε σταινινγ οφ τηε ιν ηουσε 2+ σεχτιον (Α). (Σαµε λαβ ασ ιν Φιγ 9). Τηε ΝΕΘΑΣ 2+ χελλ λινε (Β) συβµιττεδ φροµ τηισ Λαβ χορρελατεσ ωελλ, σηοωινγ µορπηολογψ δαµαγε χαυσεδ βψ εξχεσσιϖε αντιγεν ρετριεϖαλ. Φιγ11.Ιναππροπριατε σταινινγ σεεν ιν τηε συβµιττεδ ιν ηουσε 3+ (Α) ανδ τηε ΝΕΘΑΣ 3+χελλ λινεσ (Β) σηοω α στρονγ χορρελατιον. Βοτη δεµονστρατε εξχεσσιϖε νον σπεχιφιχ χψτοπλασµιχ σταινινγ χαυσεδ βψ οϖερ αντιγεν ρετριεϖαλ, ανδ αλσο εξχεσσιϖε χουντερσταιν. Σταινεδ ωιτη ςεντανα 4Β5 Χονφιρµ, ον τηε Βενχηµαρκ ΞΤ, ΧΧ1 µιλδ ανδ Υλτραϖιεω δετεχτιον κιτ. Φιγ12.Γοοδ εξαµπλε οφ αν ιν ηουσε χοµποσιτε χοντρολ: (Α) 3+: ιντενσε, χρισπ µεµβρανε σταινινγ (Β) 2+: ωεακ το µοδερατε µεµβρανε σταινινγ (Χ) 1+ : ωεακ ανδ παρτιαλ µεµβρανε σταινινγ, ανδ ( ) νεγατιϖε τυµουρ ρεµαινσ υνσταινεδ. Σεχτιονσ σταινεδ ωιτη ςεντανα 4Β5 πατηωαψ, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ, ΧΧ1 µιλδ ανδ Υλτραϖιεω δετεχτιον κιτ. Πριντεδ ατ 13:37 ον Φριδαψ, 3 Φεβρυαρψ, 212 4

41 Ρυν 96 ΒΡΕΑΣΤ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Μοδυλε Ρυν 96 ΗΕΡ2 ον ΝΕΘΑΣ Χελλ Λινεσ ΑΛΛ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ Ρυν 96 ΗΕΡ2 ον ΝΕΘΑΣ Χελλ Λινεσ ΥΚ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ Νο. οφ Ρετυρνσ Νο. οφ Ρετυρνσ Αχχεπταβλε ΒορδερΛινε Ιναππροπριατε Αχχεπταβλε ΒορδερΛινε Ιναππροπριατε Αχχεπταβλε = 143 (61%) παρτιχιπαντσ ΒορδερΛινε = 37 (16%) παρτιχιπαντσ Ιναππροπριατε = 56 (24%) παρτιχιπαντσ Αχχεπταβλε = 59 (87%) παρτιχιπαντσ ΒορδερΛινε = 6 (9%) παρτιχιπαντσ Ιναππροπριατε = 3 (4%) παρτιχιπαντσ Ρυν 96 ΗΕΡ2 ΙΗΧ ον ιν ηουσε τισσυε σεχτιονσ ΑΛΛ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ Ρυν 96 ΗΕΡ2 ΙΗΧ ον ιν ηουσε τισσυε σεχτιονσ ΥΚ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ Νο. οφ Ρετυρνσ 6 4 Νο. οφ Ρετυρνσ Αχχεπταβλε ΒορδερΛινε Ιναππροπριατε Αχχεπταβλε ΒορδερΛινε Ιναππροπριατε Αχχεπταβλε = 1 (43%) παρτιχιπαντσ ΒορδερΛινε = 6 (26%) παρτιχιπαντσ Ιναππροπριατε = 7 (3%) παρτιχιπαντσ Αχχεπταβλε = 38 (57%) παρτιχιπαντσ ΒορδερΛινε = 17 (25%) παρτιχιπαντσ Ιναππροπριατε = 12 (18%) παρτιχιπαντσ Φορ Ινηουσε ασσεσσορ µακε α χοµβινεδ δεχισιον ασ το τηε αχχεπταβιλιτψ βασεδ υπον τηε φολλοωινγ: α) Ιν ηουσε χοντρολ τισσυε µυστ ινχλυδε 3+,2+ ανδ 1+/ ινϖασιϖε βρεαστ χανχερ χασεσ (νοτ ΧΙΣ). β) Τισσυε φιξατιον, πρεσερϖατιον οφ µορπηολογψ, αντιγεν ρετριεϖαλ, χουντερσταιν ετχ ισ αλσο βε τακεν ιντο χονσιδερατιον ωηεν σχορινγ. Πριντεδ ατ 1:22 ον Ωεδνεσδαψ, 8 Φεβρυαρψ,

42 Ρυν 96 ΒΡΕΑΣΤ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Μοδυλε ΑΝΤΙΒΟ ΙΕΣ ΑΝ ΟΤΗΕΡ ΤΕΧΗΝΙΧΑΛ ΠΑΡΑΜΕΤΕΡΣ ΕΜΠΛΟΨΕ ΒΨ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ ΙΝ ΤΗΕ ΒΡΕΑΣΤ ΗΕΡ2 ΙΧΧ ΜΟ ΥΛΕ Τηε φολλοωινγ ταβλεσ ρεχορδ τηε νυµβερ οφ παρτιχιπαντσ (Ν) υσινγ εαχη πριµαρψ αντιβοδψ. Τηε περχενταγε (%) ρεφερσ το τηε προπορτιον οφ τηεσε παρτιχιπαντσ αχηιεϖινγ αχχεπταβλε σταινινγ (α σχορε οφ Αχχεπταβλε ορ Βορδερλινε). Βρεαστ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Ρυν: 96 Βρεαστ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Ρυν: 96 Πριµαρψ Αντιβοδψ : 96Ε1 Αντιβοδψ εταιλσ Ν % Χελλ Μαρθυε ΧΜΑ 61 (ΧΒ11) 1 ακο Α485 Χ ερβ 2 (πολψ) ακο ΗερχεπΤεστ Κ524 (πολψ) 1 9 ακο ΗερχεπΤεστ Κ527 (πολψ) ακο Λινκ ΗερχεπΤεστ ΣΚ1 (πολψ) Ινϖιτρογεν 817 (ΧΒ11) 1 Λαβϖισιον / Νεοµαρκερσ ΡΜ 913 (ΣΠ3) 3 Λειχα Οραχλε ΗΕΡ2 Βονδ ΙΗΧ (ΧΒ11) 29 9 Νοϖοχαστρα ΝΧΛ ΧΒ11 (ΧΒ11) 1 Νοϖοχαστρα ΝΧΛ Λ ΧΒ11 (ΧΒ11) 7 43 Νοϖοχαστρα ΝΧΛ Λ ΧΒΕ356 (1Α7) 2 5 ςεχτορ ΧΒ11 ςπ Χ38 3 ςεντανα Χονφιρµ 79/ (4Β5) ςεντανα Πατηωαψ 79 1 (4Β5) ςεντανα Πατηωαψ (4Β5) 6 9 Αυτοµατιον 96Ε1 Ν % ακο Αυτοσταινερ 3 67 ακο Αυτοσταινερ Λινκ ακο Αυτοσταινερ πλυσ 8 88 ακο Αυτοσταινερ Πλυσ Λινκ 7 1 Λαβςισιον Αυτοσταινερ 2 Λειχα Βονδ Μαξ Λειχα Βονδ ΙΙΙ Νονε (Μανυαλ) Οτηερ 5 6 Σηανδον Σεθυενζα 2 1 ςεντανα Βενχηµαρκ 5 6 ςεντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα ΝεξΕΣ 2 1 Βρεαστ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Ρυν: 96 Βρεαστ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Ρυν: 96 96Ε1 Ηεατ Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Ν % ακο ΠΤΛινκ Λαβ ϖισιον ΠΤ Μοδυλε 5 4 Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ2 3 1 Μιχροωαϖε Οϖεν 5 2 ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ 3 67 Οτηερ 2 5 Πρεσσυρε Χοοκερ 4 75 Στεαµερ 2 5 ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Στανδαρδ) 1 7 ςεντανα Βενκ ΧΧ1# (8µινσ) 4 5 ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Σταν.) 1 1 ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Εξτενδεδ) 1 1 ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1# (8µινσ) 1 1 Ωατερ βατη ΟΧ Ε1 Ενζψµε Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Ν % ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ακο Προτεασε (Σ219) 1 1 ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Πριντεδ ατ 1:22 ον Ωεδνεσδαψ, 8 Φεβρυαρψ,

43 Ρυν 96 ΒΡΕΑΣΤ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Μοδυλε Βρεαστ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Ρυν: 96 Βρεαστ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Ρυν: 96 96Ε1 ετεχτιον Ν % ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ακο ΗερΧεπ Τεστ (Κ524) ακο ΛΣΑΒ Υνιϖερσαλ/ΗΡΠ ( Κ673/4/5) 1 ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ ( Κ8/1) 1 4 ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12) 2 5 ακο Ενϖισιον ΗΡΠ/ ΑΒ ( Κ57) 3 ακο ΗερΧεπ Τεστ (Κ525) 1 1 ακο ΗερΧεπ Τεστ Αυτο ρ (Κ527) 1 9 ακο ΗερΧεπ Τεστ Αυτο ρ (ΣΚ1) 15 8 ακο ΛΣΑΒ+ σψστεµ ΗΡΠ (Κ679) 1 ακο ρβ α µο Ιγ (Ε354) 1 Λαβςισιον Υλτραςισιον ΛΠ ΗΡΠ (ΤΣ 125 Η ) 1 Λαβςισιον Υλτραςισιον ΟΝΕ Πολψµερ ( ΤΛ 12/5 Η ϑ/τ 1 Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98) Νονε 2 1 ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ 5 8 Νοϖοχαστρα Νοϖολινκ Π Σ (ΡΕ7 14/15/28/29 Κ) 4 75 Οτηερ ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Ε1 Χηροµογεν Ν % Α. Μεναρινι Λιθυιδ Σταβλε ΑΒ κιτ 1 1 ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ακο ΑΒ Κ ΑΚΟ ΑΒ ακο ΑΒ+ Λιθυιδ (Κ3468) 3 33 ακο Ενςισιον Πλυσ κιτσ 2 5 ακο ΦΛΕΞ ΑΒ 2 6 ακο ΡΕΑΛ Ενςισιον Κ57 ΑΒ 3 Λαβςισιον ΑΒ 1 Οτηερ Σιγµα ΑΒ ( 5637) 1 Σιγµα ΑΒ ( 595) 1 ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ςεντανα ΑΒ 6 67 ςεντανα ιϖιεω 7 71 ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ ςισιον ΒιοΣψστεµσ Βονδ Ξ ΑΒ 2 1 Ζψµεδ ΑΒ 1 Πριντεδ ατ 1:22 ον Ωεδνεσδαψ, 8 Φεβρυαρψ,

44 Ρυν 96 ΒΡΕΑΣΤ ΗΕΡ2 ΙΧΧ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ 96 ΗΕΡ2 ΙΗΧ Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ Αχχεπταβλε (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ Αχχεπταβλε (χοντρολ σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ςεντανα Πατηωαψ (4Β5), 14 Μινσ, 37 Χ Πρεδιλυτεδ Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Μιλδ) ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ετεχτιον: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ 96 ΗΕΡ2 ΙΗΧ Μετηοδ 2 Παρτιχιπαντ σχορεδ Αχχεπταβλε (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ Αχχεπταβλε (χοντρολ σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Λινκ ΗερχεπΤεστ ΣΚ1 (πολψ), 3 Μινσ, 22 Χ Πρεδιλυτεδ Αυτοµατιον: ακο Αυτοσταινερ Λινκ 48 ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: ακο ΦΛΕΞ ωαση βυφφερ, ΠΗ: 7.6 ακο ΠΤΛινκ, Βυφφερ: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ Χηροµογεν: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ, 22 Χ., Τιµε 1: 1 Μινσ ετεχτιον: ακο ΗερΧεπ Τεστ Αυτο ρ (ΣΚ1), 3 Μινσ, 22 Χ Πρεδιλυτεδ 96 ΗΕΡ2 ΙΗΧ Μετηοδ 3 Παρτιχιπαντ σχορεδ Αχχεπταβλε (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ Αχχεπταβλε (χοντρολ σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ςεντανα Πατηωαψ (4Β5), 32 Μινσ, 37 Χ Πρεδιλυτεδ Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα ιςιεω Κιτ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3), ΠΗ: 7.6 ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) Χηροµογεν: ςεντανα ιϖιεω ετεχτιον: ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) 96 ΗΕΡ2 ΙΗΧ Μετηοδ 4 Παρτιχιπαντ σχορεδ Αχχεπταβλε (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ Αχχεπταβλε (χοντρολ σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Λειχα Οραχλε ΗΕΡ2 Βονδ ΙΗΧ (ΧΒ11), 3 Μινσ, 21 Χ Πρεδιλυτεδ Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ Μαξ ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ1 Χηροµογεν: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ, 21 Χ., Τιµε 1: 1 Μινσ ετεχτιον: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ Πριντεδ ατ 1:22 ον Ωεδνεσδαψ, 8 Φεβρυαρψ,

45 The Lymphoma Module Run 96 David Blythe Suzanne Parry and Merdol Ibrahim Gold Standard Second Antibody Antigens Assessed: BCL2 Cyclin D1 Tissue Sections circulated: Tonsil & Follicular Lymphoma Mantle Cell Lymphoma & Reactive Tonsil Number of Registered Participants: 24 Summary Graphs - Pass Rate Tables Best Method - Selected Images UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 45

46 ΡΥΝ 96 ΛΨΜΠΗΟΜΑ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ F e e e χψτοπλασµιχ σταινινγ οφ τηε περιπηεραλ Β χελλσ ανδ ανδ περι ανδ ιντρα φολλιχυλαρ Τ χελλσ. (Α ) ηιγη ποωερ ϖιεω. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο 124 αντιβοδψ, 1:2, ον τηε Λειχα ΒονδΜαξ, ΕΡ2 ανδ Ρεφινε δετεχτιον κιτ. Φιγ2.Ποορ δεµονστρατιον οφ ΒΧλ2 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ τονσιλ σεχτιον (Χοµπαρε το Φιγ 1). Τηε µαϕοριτψ οφ χελλσ εξπεχτεδ το σταιν αρε νοτ δεµονστρατεδ. Τηε ηιγη ποωερ ϖιεω (Β) σηοωσ τηατ τηε χελλσ τηατ ηαϖε σταινεδ αρε ϖερψ ωεακ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο 124 αντιβοδψ, 1:1, ον τηε Ve e, ΧΧ1 µιλδ ανδ ιvιεω δετεχτιον κιτ. F! e e " # χρισπ σταινινγ οφ τυµουρ χελλσ (Α). Τηε ηιγη ποωερ ϖιεω (Β) δεµονστρατεσ τηε ωελλ λοχαλισεδ χψτοπλασµιχ σταινινγ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο 124 αντιβοδψ, 1:1, υσινγ τηε ακο ΠΤ Λινκ, " e Fa e e Φιγ4.Συβ οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ ΒΧλ2 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ φολλιχυλαρ λψµπηοµα (χοµπαρε το Φιγ 1). Χελλσ εξπεχτεδ το σταιν αρε δεµονστρατεδ βυτ τηε σταινινγ ισ ωεακ. (Β) ηιγη ποωερ ϖιεω. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο 124 αντιβοδψ, 1:1, ον τηε Ve e, ΧΧ1 µιλδ ανδ ιvιεω δετεχτιον κιτ. Φιγ5.Συβ οπτιµαλ σταινινγ οφ ΒΧλ2 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ τονσιλ σεχτιον, σηοωινγ εξχεσσιϖε βαχκγρουνδ ανδ ιναππροπριατε νον σπεχιφιχ σταινινγ. Σεχτιον σταινεδ ακο 124 αντιβοδψ, 1:5, ep e e e e" e e " e $ e pe %# e e e Φιγ6.G e& e ' "e τονσιλ σεχτιον σταινεδ ωιτη ΒΧλ2. Ινσερτ (Β) σηοωσ τηε στρονγ ωελλ λοχαλισεδ σταινινγ οφ τηε περιπηεραλ Β ανδ Τ χελλσ το α βεττερ αδϖανταγε. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο 124 αντιβοδψ, 1:2, ον τηε Λειχα ΒονδΜαξ, ΕΡ2 ανδ Ρεφινε δετεχτιον κιτ. Πριντεδ ατ 14:31 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

47 ΡΥΝ 96 ΛΨΜΠΗΟΜΑ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ7.Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Χψχλιν 1 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ ρεαχτιϖε τονσιλ. Βοτη τηε σθυαµουσ επιτηελιαλ ανδ σχαττερεδ ενδοτηελιαλ χελλσ σηοω µοδερατε το στρονγ σταινινγ νυχλεαρ ανδ ωεακ ιντρα χψτοπλασµιχ σταινινγ. (Β) Ηιγη ποωερ ϖιεω. Σεχτιον σταινεδ ωιτη Νεοµαρκερσ ΣΠ4 αντιβοδψ, 1:5, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ, ΧΧ1 στανδαρδ, ανδ Υλτραϖιεω κιτ. Φιγ8. Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Χψχλιν 1 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ µαντλε χελλ λψµπηοµα (ΜΧΛ), σηοωινγ µοδερατε το στρονγ σταινινγ οφ ϖιρτυαλλψ αλλ τηε τυµουρ χελλσ (Α). Τηε ηιγη ποωερ ϖιεω (Β) δεµονστρατεσ τηε διστινχτ νυχλεαρ σταινινγ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη τηε ςεχτορ ΣΠ4 αντιβοδψ, 1:25, υσινγ τηε ακο ΠΤ Λινκ, αυτοσταινερ ανδ ΦΛΕΞ δετεχτιον κιτ. )*+,-./1234* :;4<64*2: 2= >?@7*: AB *: 4C9 DE HIJK. <96@4*L9 42:;*7 M@2536<9 42 )*+NO- PC9 56Q2<*4? 9R39@ ;46*: 6<9 2:7? S96T7? 8952:;4<6498 2< :24 ;46*: Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο ΧΣ 6 αντιβοδψ, 1:2, υσινγ τηε ακο ΠΤ Λινκ, αυτοσταινερ ανδ )UIW 8949@4*2: T*4- Φιγ1.Συβ οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Χψχλιν 1 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ ΜΧΛ (χοµπαρε το Φιγ8). Τηε µαϕοριτψ οφ χελλσ εξπεχτεδ το σταιν αρε δεµονστρατεδ βυτ τηε σταινινγ ισ ωεακ. (Β) Ηιγη ποωερ ϖιεω. Σεχτιον σταινεδ ωιτη Νεοµαρκερσ ΣΠ4 αντιβοδψ, 1:3, πρε τρεατεδ ιν τηε µιχροωαϖε ανδ υσινγ τηε (εχτορ Ελιτε ΑΒΧ κιτ. Φιγ11.Ποορ δεµονστρατιον οφ Χψχλιν 1 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ ρεαχτιϖε τονσιλ σεχτιον, σηοωινγ ιναππροπριατε νον σπεχιφιχ σταινινγ ιν τηε γερµιναλ χεντρε. Σεχτιον σταινεδ ωιτη τηε (εντανα ΣΠ4 πρε διλυτεδ αντιβοδψ ον τηε (εντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ, ΧΧ1 στανδαρδ, ανδ Υλτραϖιεω κιτ. Φιγ12.X228 9R = 6: Y*: C2/;9Z χοντρολ σταινεδ ωιτη Χψχλιν 1, σηοωινγ στρονγ διστινχτ σταινινγ ιν τηε λψµπη νοδε (Α) ανδ ΜΧΛ (Β) σεχτιονσ συβµιττεδ ον τηε σαµε σλιδε. Σεχτιονσ σταινεδ ωιτη Νεοµαρκερσ ΣΠ4 αντιβοδψ, 1:5, ον τηε (9:46:6 [9:@C56<T WP, ΧΧ1 µιλδ ανδ ι(ιεω δετεχτιον κιτ. Πριντεδ ατ 14:31 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

48 Ρυν 96 ΛΨΜΠΗΟΜΑ Μοδυλε 45 ΡΥΝ 96Λ ΒΧΛ2 ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = 1 (%) 8 ΡΥΝ 96Μ ΒΧΛ2 ον ιν ηουσε Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 4 5 = (%) 6 = (%) 7 5 = (%) 6 = (%) νο. οφ ρετυρνσ = 2 (1%) 8 = 9 (4%) 9 = 2 (1%) 1 = 4 (2%) 11 = 9 (4%) 12 = 41 (18%) 13 = 14 (6%) 14 = 18 (8%) νο. οφ ρετυρνσ = (%) 8 = 2 (1%) 9 = 3 (1%) 1 = 3 (1%) 11 = 9 (4%) 12 = 21 (9%) 13 = 18 (8%) 14 = 16 (7%) 1 15 = 24 (1%) 16 = 37 (16%) 2 15 = 18 (8%) 16 = 76 (33%) 5 17 = 39 (17%) 18 = 21 (9%) 1 17 = 37 (16%) 18 = 16 (7%) = 12 (5%) 2 = 1 (%) = 9 (4%) 2 = 5 (2%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 11 (47%) 16 2 = 143 (61%) = 56 (24%) = 52 (22%) 1 12 = 54 (23%) 1 12 = 33 (14%) 9 = 14 (6%) 9 = 5 (2%) Μεδιαν = 13. Μεδιαν = ΡΥΝ 96Ν Χψχλιν 1 ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 7 ΡΥΝ 96Π Χψχλιν 1 ον ιν ηουσε Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = 2 (1%) 5 = (%) 5 = (%) 4 6 = (%) 7 = 3 (1%) 6 6 = (%) 7 = 1 (%) νο. οφ ρετυρνσ = 11 (5%) 9 = 7 (3%) 1 = 4 (2%) 11 = 2 (1%) 12 = 22 (1%) 13 = 6 (3%) 14 = 19 (8%) 15 = 18 (8%) νο. οφ ρετυρνσ = 5 (2%) 9 = 1 (%) 1 = 3 (1%) 11 = 9 (4%) 12 = 25 (11%) 13 = 18 (8%) 14 = 19 (8%) 15 = 25 (11%) 1 16 = 48 (21%) 17 = 25 (11%) 18 = 16 (7%) 1 16 = 61 (27%) 17 = 32 (14%) 18 = 1 (4%) = 22 (1%) 2 = 25 (11%) = 9 (4%) 2 = 5 (2%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 136 (6%) 16 2 = 117 (52%) = 43 (19%) = 62 (28%) 1 12 = 28 (12%) 1 12 = 37 (16%) 9 = 21 (9%) 9 = 9 (4%) Μεδιαν = 13.5 Μεδιαν = 13. Πριντεδ ατ 15:41 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

49 Ρυν 96 ΛΨΜΠΗΟΜΑ Μοδυλε ΑΝΤΙΒΟ ΙΕΣ ΑΝ ΟΤΗΕΡ ΤΕΧΗΝΙΧΑΛ ΠΑΡΑΜΕΤΕΡΣ ΕΜΠΛΟΨΕ ΒΨ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ ΙΝ ΤΗΕ ΛΨΜΠΗΟΜΑ ΜΟ ΥΛΕ Τηε φολλοωινγ ταβλεσ ρεχορδ τηε νυµβερ οφ παρτιχιπαντσ (Ν) υσινγ εαχη πριµαρψ αντιβοδψ. Τηε περχενταγε (%) ρεφερσ το τηε προπορτιον οφ τηεσε παρτιχιπαντσ αχηιεϖινγ αχχεπταβλε σταινινγ (α σχορε >12/2) ον ΥΚ ΝΕΘΑΣ σεχτιονσ. Λψµπηοµα Ρυν: 96 Λψµπηοµα Ρυν: 96 Πριµαρψ Αντιβοδψ : ΒΧΛ2 Αντιβοδψ εταιλσ Ν % Β ΒΧΛ2 (124) 1 1 Βιογενεξ ΜΥ 287 ΥΧ (1) 1 1 Χελλ µαρθυε ΧΜΧ329 (124) 4 25 ακο ΦΛΕΞ ΙΡ614 (124) ακο Μ887 (124) ακο Μ887 (124) Λαβϖισιον/Νεοµαρκερσ ΜΣ 123 Π (1/ 5) 3 33 Λειχα ΡΤΥ (ΒΧλ2/1/ 5) ΠΑ Λειχα/Νοϖοχαστρα ΝΧΛ ΒΧλ 2 (ΒΧλ2/1/ 5) Λειχα/Νοϖοχαστρα ΝΧΛ ΒΧλ (3.1) 9 89 Μεναπατη (1/ 5) ΜΠ Νοϖοχαστρα ΝΧΛ Λ βχλ 2 (βχλ2/1/ 5) 9 89 Οτηερ 2 5 Σχψτεκ (124) Α24 1 ςεχτορ ςπβ21 (ΒΧλ2/1/ 5) 1 1 ςεντανα (124) ςεντανα (ΣΠ66) ςεντανα (124) Ζψµεδ (1) 1 Πριµαρψ Αντιβοδψ : Χψχλιν 1 Αντιβοδψ εταιλσ Ν % Βιοχαρε Μεδιχαλ Π236Β 1 1 Χελλ Μαρθυε (ΡΒΤ14) ΧΡΧ ακο ( ΧΣ 6) Μ ακο (ΕΠ12) Μ ακο (ΣΠ4) Μ ακο ΦΛΕΞ ΡΤΥ (ΣΠ4) ΙΡ ακο ΡΤΥ (ΕΠ12) ΙΡ83/ΙΣ ακοχψτοµατιον Μ7155 ( Χ5 6) 1 Λαβ ςισιον/τηερµο Σχι ΜΣ 21Π ( ΧΣ 6) 1 1 Λαβςισιον/Τηερµο Σχι (ΣΠ4) ΡΜ Λειχα/Νοϖο (Π2 11Φ11) ΝΧΛ Χψχλιν 1 ΓΜ ΧΕ Λειχα/Νοϖο ΡΤΥ (Π2 11Φ11) ΝΧΛ ΡΤΥ Χψχλιν Μεναπατη (ΣΠ4) ΜΠ ΝεοΜαρκερσ/Τηερµο Σχι (ΕΠΡ2241ΙΗΧ) ΡΜ Οτηερ 3 67 ςεχτορ ρβµ ςπ ΡΜ3 (ΣΠ4) 4 1 ςεχτορ ςπ Χ394 (Π2 11Φ11) 1 ςεντανα (ΣΠ4 Ρ) ςεντανα ρβµ (ΣΠ4) 3 77 Πριντεδ ατ 15:41 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

50 Ρυν 96 ΛΨΜΠΗΟΜΑ Μοδυλε Λψµπηοµα Ρυν: 96 Λψµπηοµα Ρυν: 96 Ηεατ Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ ΒΧΛ2 Χψχλιν 1 Ν % Ν % Βιοχαρε εχλοακινγ Χηαµβερ ακο Πασχαλ ακο ΠΤΛινκ Λαβ ϖισιον ΠΤ Μοδυλε Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ1 1 1 Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ Μιχροωαϖε Οϖεν ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ 1 Οτηερ Πρεσσυρε Χοοκερ Πρεσσυρε Χοοκερ ιν Μιχροωαϖε Οϖεν 1 1 Στεαµερ 2 5 ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Εξτενδεδ) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Εξτεν.) ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Μιλδ) 1 1 ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Σταν.) ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ2 (Μιλδ) 1 ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ2# (8µινσ) 1 1 ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Εξτενδεδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1# (8µινσ) 1 1 Ωατερ βατη ΟΧ Ενζψµε Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ ΒΧΛ2 Χψχλιν 1 Ν % Ν % ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ Προτεασε 1 1 ακο Προτεασε (Σ219) 1 1 ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Οτηερ 1 ςβσ Βονδ Ενζψµε 1 1 ςεντανα Προτεασε Πριντεδ ατ 15:41 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ, 212 5

51 Ρυν 96 ΛΨΜΠΗΟΜΑ Μοδυλε Λψµπηοµα Ρυν: 96 Λψµπηοµα Ρυν: 96 ετεχτιον ΒΧΛ2 Χψχλιν 1 Ν % Ν % Α Μενερινι Πολψµερ (ΜΠ ΞΧΠ) 1 1 ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΧαρτα (ΒΧΑ ΗΠ 54 ΥΣ) 1 1 ΒιοΓενεξ ΣΣ Πολψµερ (Θ 42 ΨΙΚΕ) ακο Α ςανχε ΗΡΠ (Κ468/9) 1 ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ ( Κ8/1) ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12) ακο Ενϖισιον ΗΡΠ/ ΑΒ ( Κ57) ακο Ενϖισιον+ ΗΡΠ µουσε Κ44/5/6/ ακο ρβ α µο Ιγ (Ε354) 1 1 ακο ΡΕΑΛ ΗΡΠ/ ΑΒ (Κ51 ) Λαβςισιον Υλτραςισιον ΛΠ ΗΡΠ (ΤΛ 125 ΗΛϑ) Λαβςισιον Υλτραςισιον ΛΠ ΗΡΠ (ΤΣ 125 Η ) Λαβςισιον Υλτραςισιον ΟΝΕ Πολψµερ ( ΤΛ 12/5 Η ϑ/τ Λειχα Βονδ Πολψµερ εφινε ( Σ9713) Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98) ΜεναΠατη Ξ Χελλ Πλυσ (ΜΠ ΞΧΠ) Νονε ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Νοϖοχαστρα Νοϖολινκ Π Σ (ΡΕ7 14/15/28/29 Κ) Οτηερ Ποωερ ςισιον ΠςΒ999 ΗΡΠ 1 1 ςεχτορ Ελιτε ΑΒΧ Κιτ (ΠΚ 72) ςεχτορ ΙµµΠΡΕΣΣ Υνιϖερσαλ (ΜΠ 75) ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) ςεντανα Οπτιςιεω Κιτ (76 7) ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Χηροµογεν ΒΧΛ2 Χψχλιν 1 Ν % Ν % ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ Λιθυιδ ΑΒ (ΗΚ153 5Κ) 1 1 ακο ΑΒ Κ ακο ΑΒ+ Λιθυιδ (Κ3468) ακο ΑΒ+ ΡΕΑΛ ετεχτιον (Κ51) ακο Ενςισιον Πλυσ κιτσ ακο ΦΛΕΞ ΑΒ ακο ΡΕΑΛ Ενςισιον Κ57 ΑΒ ακο ΡΕΑΛ Κ51 ΑΒ Λαβςισιον ΑΒ µεναπατη ξχελλ κιτ ΑΒ (ΜΠ 86) ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ 1 Οτηερ Σιγµα ΑΒ ( 5637) Σιγµα ΑΒ ( 595) ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ςεχτορ ΑΒ (ΣΚ 41) 1 1 ςεντανα ΑΒ ςεντανα ιϖιεω ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ ςισιον ΒιοΣψστεµσ Βονδ Ξ ΑΒ Λψµπηοµα Ρυν: 96 Αυτοµατιον ΒΧΛ2 Χψχλιν 1 Ν % Ν % ΒιοΓενεξ ΓενοΜΞ 6ι ΒιοΓενεξ Οπτιµαξ 1 ακο Αυτοσταινερ ακο Αυτοσταινερ Λινκ ακο Αυτοσταινερ πλυσ ακο Αυτοσταινερ Πλυσ Λινκ ακο ΤεχηΜατε Λαβςισιον Αυτοσταινερ Λειχα Βονδ Μαξ Λειχα Βονδ Ξ Λειχα Βονδ ΙΙΙ Μεναρινι Ιντελλιπατη ΦΛΞ Νονε (Μανυαλ) Οτηερ Σηανδον Σεθυενζα ςεντανα Βενχηµαρκ ςεντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ Πριντεδ ατ 15:41 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

52 Ρυν 96 ΛΨΜΠΗΟΜΑ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ ΒΧΛ2 Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 18/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ887 (124), 3 Μινσ, ΡΟΟΜ Χ ιλυτιον 1: 1/5 Αυτοµατιον: ακο Αυτοσταινερ Λινκ 48 ακο ΦΛΕΞ+ κιτ Μαιν Βυφφερ: ακο ΦΛΕΞ ωαση βυφφερ, ΠΗ: 7.6 ακο ΠΤΛινκ, Βυφφερ: ΦΛΕΞ ΤΡΣ ΗΙΓΗ, ΠΗ: 9 Χηροµογεν: ακο Ενςισιον Πλυσ κιτσ, ΡΟΟΜ Χ., Τιµε 1: 5 Μινσ, Τιµε 2: 5 Μινσ ετεχτιον: ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12), 15 Μινσ, ΡΟΟΜ Χ Πρεδιλυτεδ ΒΧΛ2 Μετηοδ 2 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 19/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο ΦΛΕΞ ΙΡ614 (124), 15 Μινσ Πρεδιλυτεδ Αυτοµατιον: ακο Αυτοσταινερ Λινκ 48 ακο ΦΛΕΞ+ κιτ Μαιν Βυφφερ: ακο ΦΛΕΞ ωαση βυφφερ ακο ΠΤΛινκ Χηροµογεν: ακο ΦΛΕΞ ΑΒ ετεχτιον: ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12) ΒΧΛ2 Μετηοδ 3 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ887 (124), 3 Μινσ, 22 Χ ιλυτιον 1: 15 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ Μαξ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ2 Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98), 22 Χ., Τιµε 2: 1 Μινσ ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98), 15 Μινσ, 22 Χ Πρεδιλυτεδ ΒΧΛ2 Μετηοδ 4 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Λειχα/Νοϖοχαστρα ΝΧΛ ΒΧλ (3.1), 32 Μινσ, 37 Χ ιλυτιον 1: 15 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Εξτενδεδ) ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ ετεχτιον: ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5), 12 Μινσ, 37 Χ Πρεδιλυτεδ Πριντεδ ατ 15:41 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

53 Ρυν 96 ΛΨΜΠΗΟΜΑ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ Χψχλιν 1 Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 19/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο (ΣΠ4) Μ3635, 25 Μινσ, 22 Χ ιλυτιον 1: 25 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ Μαξ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ2 Χηροµογεν: ςεχτορ ΑΒ (ΣΚ 41), 22 Χ., Τιµε 2: 1 Μινσ ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98), 15 Μινσ, 22 Χ Πρεδιλυτεδ Χψχλιν 1 Μετηοδ 2 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 2/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ΝεοΜαρκερσ/Τηερµο Σχι (ΕΠΡ2241ΙΗΧ) ΡΜ 2113, 32 Μινσ, 37 Χ ιλυτιον 1: 5 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ, 37 Χ., Τιµε 1: 12 Μινσ, Τιµε 2: 12 Μινσ ετεχτιον: ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5), 8 Μινσ, 37 Χ Πρεδιλυτεδ Χψχλιν 1 Μετηοδ 3 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 19/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ΝεοΜαρκερσ/Τηερµο Σχι (ΕΠΡ2241ΙΗΧ) ΡΜ 2113, 3 Μινσ, 2 Χ ιλυτιον 1: 1/5 Αυτοµατιον: ακο Αυτοσταινερ Λινκ 48 ακο ΦΛΕΞ+ κιτ Μαιν Βυφφερ: Τρισ Βυφφερεδ Σαλινε (ΤΒΣ), ΠΗ: 7.6 ακο ΠΤΛινκ, Βυφφερ: ακο Ηιγη πη ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ακο ΦΛΕΞ ΑΒ, 2 Χ., Τιµε 1: 5 Μινσ, Τιµε 2: 5 Μινσ ετεχτιον: ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12), 15 Μινσ, 2 Χ Χψχλιν 1 Μετηοδ 4 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 2/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο ( ΧΣ 6) Μ7155, 6 Μινσ, ΡΤ Χ ιλυτιον 1: 25 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ2 Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98), ΡΤ Χ., Τιµε 1: 1 Μινσ ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98), 1 Μινσ, ΡΤ Χ Πρεδιλυτεδ Πριντεδ ατ 15:41 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

54 The Neuropathology Module Run 96 Neil Bilbe, Robert Fincham and Stephen McQuaid Gold Standard Second Antibody Antigens Assessed: Ki-67/MIB-1 EMA Tissue Sections circulated: Glioblastoma & Meningioma Meningioma Number of Registered Participants: 64 Summary Graphs - Pass Rate Tables Best Method - Selected Images UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 54

55 ΡΥΝ 96 ΝΕΥΡΟΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ 1.Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Κι 67 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ γλιοβλαστοµα σεχτιον (Α,Β), σηοωινγ στρονγ ωελλ λοχαλισεδ, νυχλεαρ σταινινγ ωιτη α χλεαν βαχκγρουνδ. Σεχτιον σταινεδ υσινγ τηε Λειχα ΜΜ1 αντιβοδψ, ωιτη νο πρε τρεατµεντ ον τηε Λειχα ΒονδΜαξ, ΕΡ2 ανδ Ρεφινε δετεχτιον κιτ. Φιγ2.Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Κι 67 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ σεχτιονσ οφ µενινγιοµα (Α) ανδ γλιοβλαστοµα (Β). Τηε νυχλεαρ σταινινγ ισ ιντενσε ανδ ωελλ λοχαλισεδ, ωιτη τηε εξπεχτεδ νυµβερσ οφ χελλσ σταινινγ ιν εαχη τισσυε. Σεχτιον σταινεδ ωιτη Βιοχαρε πολψχλοναλ αντιβοδψ, 1:3, ωιτη νο πρε τρεατµεντ ον τηε ςεντανα ΥΛΤΡΑ, ΧΧ1 στανδαρδ ανδ Υλτραϖιεω δετεχτιον κιτ. Φιγ3.Συβ οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Κι 67 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ µενινγιοµα (Α) ανδ γλιοβλαστοµα (Β) σεχτιονσ (χοµπαρε το Φιγ2). Σεχτιονσ σηοω ωεακ σταινινγ ιν λεσσ τηαν τηε εξπεχτεδ περχενταγε οφ χελλσ. Βοτη σεχτιονσ σταινεδ ωιτη τηε ακο ΜΙΒ 1 αντιβοδψ, υσινγ τηε ΠΤ Λινκ, αυτοσταινερ ανδ ΦΛΕΞ κιτ. (Α) ωιτη α πρε διλυτεδ αντιβοδψ ανδ (Β) υσινγ α διλυτιον οφ 1:1. Φιγ4.Συβ οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Κι 67 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ σεχτιονσ οφ µενινγιοµα (Α) ανδ γλιοβλαστοµα (Β), σηοωινγ ιναππροπριατε νον σπεχιφιχ βαχκγρουνδ σταινινγ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο ΜΙΒ 1 αντιβοδψ, 1:1, ωιτη νο πρε τρεατµεντ ον τηε Λειχα ΒονδΜαξ, ΕΡ2 ανδ Ρεφινε δετεχτιον κιτ. Φιγ5.Τωο εξαµπλεσ οφ ποορλψ χουντερσταινεδ ΥΚ ΝΕΘΑΣ γλιοβλαστοµα σεχτιονσ. Αλτηουγη τηε Κι 67 σταινινγ ισ αχχεπταβλε, (Α) σηοωσ εξχεσσιϖε χουντερσταιν, ωηιλε (Β) ηασ ϖερψ λιττλε/νο χουντερσταιν ατ αλλ. Φιγ6. Γοοδ εξαµπλε οφ αν ιν ηουσε χοντρολ σεχτιον σταινεδ ωιτη Κι 67, σηοωινγ ιντενσε ωελλ λοχαλισεδ, νυχλεαρ σταινινγ ανδ α χλεαν βαχκγρουνδ. Σηοων το βεττερ αδϖανταγε ιν τηε ηιγη ποωερ ινσετ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο ΜΙΒ 1 αντιβοδψ, 1:25, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ Υλτρα, ΧΧ1 στανδαρδ ανδ Υλτραϖιεω δετεχτιον κιτ. Πριντεδ ατ 14:34 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

56 ΡΥΝ 96 ΝΕΥΡΟΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ 7.Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ ΕΜΑ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ µενινγιοµα, σηοωινγ στρονγ ωελλ λοχαλισεδ, χψτοπλασµιχ σταινινγ τηρουγηουτ τηε σεχτιον ωιτη α χλεαν βαχκγρουνδ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη τηε ακο Ε29 αντιβοδψ, 1:3, ον τηε Λειχα Βονδ ΙΙΙ, ΕΡ1 ανδ Ρεφινε δετεχτιον κιτ. Φιγ 8.Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ ΕΜΑ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ µενινγιοµα. Αλµοστ αλλ οφ τηε χελλσ σηοω στρονγ χψτοπλασµιχ σταινινγ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο Ε29 πρεδιλυτεδ αντιβοδψ, υσινγ τηε ΠΤ Λινκ, αυτοσταινερ ανδ ΦΛΕΞ δετεχτιον κιτ. Φιγ9.Συβ οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ ΕΜΑ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ µενινγιοµα, σηοωινγ ϖερψ ωεακ, ϖιρτυαλλψ νεγατιϖε σταινινγ (χοµπαρε το Φιγσ 7&8). Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο Ε29, 1:1, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ, ΧΧ1 στανδαρδ ανδ Υλτραϖιεω δετεχτιον κιτ. Φιγ1. Συβ οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ ΕΜΑ ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ µενινγιοµα. Τηε σταινινγ ισ πατχηψ ανδ ϖερψ ωεακ ιν αρεασ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο Ε29, 1:1, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ, ΧΧ1 στανδαρδ ανδ Υλτραϖιεω δετεχτιον κιτ. Φιγ11. bbo f}]h~kf bc ]_ ^_ dbgsf µενινγιοµα χοντρολ σεχτιον, σηοωινγ στρονγ χψτοπλασµιχ, πρεδοµιναντλψ µεµβρανουσ σταινινγ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο 4Χ4 αντιβοδψ, υσινγ τηε ΠΤ ^_nx ]g\bs\]^_fi ]_o uƒ of\fj\^b_ n^\q Φιγ12.Γοοδ εξαµπλε οφ αν ιν ηουσε µεταστατιχ βραιν τυµουρ, σηοωινγ σπεχιφιχ χψτοπλασµιχ s\]^_^_` bc \df \ghbgi jfkks l^\d ] jkf]_ m]jn`ibg_oq rfj\^b_ s\]^_fo l^\d t]nb uvwx yzv{{x νο πρετρεατµεντ, ανδ υσινγ τηε ακο Ενϖισιον δετεχτιον κιτ. Πριντεδ ατ 14:34 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

57 Ρυν 96 ΝΕΥΡΟΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε 2 ΡΥΝ 96Γ Κι 67 / ΜΙΒ1 ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 2 ΡΥΝ 96Η Κι 67 / ΜΙΒ1 ον ιν ηουσε Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 5 = (%) 5 = (%) 16 6 = (%) 7 = 1 (2%) 16 6 = (%) 7 = (%) 8 = (%) 8 = (%) νο. οφ ρετυρνσ = (%) 1 = (%) 11 = (%) 12 = 4 (6%) 13 = 2 (3%) νο. οφ ρετυρνσ = (%) 1 = (%) 11 = (%) 12 = (%) 13 = 1 (2%) 14 = 3 (5%) 14 = 3 (5%) 4 15 = 9 (14%) 16 = 18 (29%) 4 15 = 7 (11%) 16 = 13 (21%) 17 = 1 (16%) 17 = 19 (31%) 18 = 11 (17%) 18 = 13 (21%) = 3 (5%) 2 = 2 (3%) = 6 (1%) 2 = (%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 44 (7%) 16 2 = 51 (82%) = 14 (22%) = 11 (18%) 1 12 = 4 (6%) 1 12 = (%) 9 = 1 (2%) 9 = (%) Μεδιαν = 15.5 Μεδιαν = 16. ΡΥΝ 96ϑ Επιτηελιαλ Μεµβρανε Αντιγεν (ΕΜΑ) ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ 12 Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) ΡΥΝ 96Κ Επιτηελιαλ Μεµβρανε Αντιγεν (ΕΜΑ) ον ιν ηουσε Σεχτιονσ 2 Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 5 = (%) 5 = (%) 1 6 = (%) 7 = 1 (2%) 16 6 = (%) 7 = (%) 8 = 1 (2%) 8 = (%) νο. οφ ρετυρνσ = 2 (3%) 1 = (%) 11 = 1 (2%) 12 = 5 (8%) 13 = 7 (11%) 14 = 5 (8%) 15 = 8 (13%) νο. οφ ρετυρνσ = (%) 1 = (%) 11 = (%) 12 = 1 (2%) 13 = 1 (2%) 14 = 1 (2%) 15 = 7 (11%) 2 16 = 11 (17%) 17 = 4 (6%) 4 16 = 18 (29%) 17 = 19 (31%) 18 = 6 (1%) 18 = 9 (15%) = 6 (1%) 2 = 6 (1%) = 6 (1%) 2 = (%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 33 (52%) 16 2 = 52 (84%) = 2 (32%) = 9 (15%) 1 12 = 6 (1%) 1 12 = 1 (2%) 9 = 4 (6%) 9 = (%) Μεδιαν = 14. Μεδιαν = 15.5 Πριντεδ ατ 15:47 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

58 Ρυν 96 ΝΕΥΡΟΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΑΝΤΙΒΟ ΙΕΣ ΑΝ ΟΤΗΕΡ ΤΕΧΗΝΙΧΑΛ ΠΑΡΑΜΕΤΕΡΣ ΕΜΠΛΟΨΕ ΒΨ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ ΙΝ ΤΗΕ ΝΕΥΡΟΠΑΤΗΟΛΟΓΨ ΜΟ ΥΛΕ Τηε φολλοωινγ ταβλεσ ρεχορδ τηε νυµβερ οφ παρτιχιπαντσ (Ν) υσινγ εαχη πριµαρψ αντιβοδψ. Τηε περχενταγε (%) ρεφερσ το τηε προπορτιον οφ τηεσε παρτιχιπαντσ αχηιεϖινγ αχχεπταβλε σταινινγ (α σχορε >12/2) ον ΥΚ ΝΕΘΑΣ σεχτιονσ. Νευροπατηολογψ Ρυν: 96 Νευροπατηολογψ Ρυν: 96 Πριµαρψ Αντιβοδψ : Κι 67 / ΜΙΒ1 Αντιβοδψ εταιλσ Ν % ακο ΦΛΕΞ ΡΤΥ (ΜΙΒ1) ΙΡ ακο Μ724 (ΜΙΒ1) Λειχα/Νοϖοχαστρα (ΜΜ1) ΝΧΛ Κι67 ΧΕ 6 83 Λειχα/Νοϖοχαστρα ΡΤΥ (Κ2) ΠΑ Λειχα/Νοϖοχαστρα ΡΤΥ (ΜΜ1) ΠΑ ΝεοΜαρκερσ/Τηερµο Σχι (ΣΠ6) ΡΜ Οτηερ 1 1 Σιγµα (ΠΠ 67) Π ςεντανα (Κ2) ςεντανα ΡΤΥ (3 9) Πριµαρψ Αντιβοδψ : Επιτηελιαλ Μεµβρανε Αντιγεν (ΕΜΑ) Αντιβοδψ εταιλσ Ν % Βιοχαρε (ΜΧ 5) ΧΜ 143 (ΜΧ 5) 1 1 ακο (4Χ4) Μ ακο (Ε29) Ν ακο (Ε29) Μ ακο ΦΛΕΞ ΡΤΥ (Ε29) ΙΡ Λειχα/Νοϖοχαστρα (ΓΠ1.4) ΝΧΛ ΕΜΑ 4 1 Λειχα/Νοϖοχαστρα ΡΤΥ (ΓΠ1.4) ΠΑ Νεοµαρκερ/Τηερµο Σχι (ΓΠ1.4) Αβ 2 ΜΣ ςεντανα (Ε29) Νευροπατηολογψ Ρυν: 96 Νευροπατηολογψ Ρυν: 96 Ηεατ Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Επιτηελιαλ Μεµβρανε Κι 67 / ΜΙΒ1 Ν % Ν % Βιοχαρε εχλοακινγ Χηαµβερ ακο ΠΤΛινκ Λαβ ϖισιον ΠΤ Μοδυλε 1 1 Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ1 3 1 Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ Μιχροωαϖε Οϖεν ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ 5 2 Οτηερ Πρεσσυρε Χοοκερ ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Εξτενδεδ) 1 1 ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ςεντανα Βενκ ΧΧ2 (Εξτενδεδ) 1 1 ςεντανα Βενκ ΧΧ2 (Στανδαρδ) 1 1 ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Εξτεν.) 1 1 ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Σταν.) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) Ενζψµε Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Επιτηελιαλ Μεµβρανε Κι 67 / ΜΙΒ1 Ν % Ν % ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ ςβσ Βονδ Ενζψµε Πριντεδ ατ 15:47 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

59 Ρυν 96 ΝΕΥΡΟΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε Νευροπατηολογψ Ρυν: 96 Νευροπατηολογψ Ρυν: 96 ετεχτιον Επιτηελιαλ Μεµβρανε Κι 67 / ΜΙΒ1 Ν % Ν % ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ ΣΣ Πολψµερ (Θ 42 ΨΙΚΕ) 1 1 ΒιοΓενεξ ΣΣ Πολψµερ (Θ 43 ΞΑΚΕ) 1 1 ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ ( Κ8/1) ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12) ακο Ενϖισιον ΗΡΠ/ ΑΒ ( Κ57) ακο ΡΕΑΛ ΗΡΠ/ ΑΒ (Κ51 ) 1 1 Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98) ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Οτηερ ςεχτορ Ελιτε Υνιϖερσαλ ΑΒΧ (ΠΚ 62) ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Χηροµογεν Επιτηελιαλ Μεµβρανε Κι 67 / ΜΙΒ1 Ν % Ν % ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ Λιθυιδ ΑΒ (ΗΚ153 5Κ) 1 1 ΒιοΓενεξ λιθυιδ ΒΑ (ΗΚ 124 7Κ) 1 1 ακο ΑΒ+ ΡΕΑΛ ετεχτιον (Κ51) ακο Ενςισιον Πλυσ κιτσ ακο ΦΛΕΞ ΑΒ Οτηερ Σιγµα ΑΒ ( 5637) ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ςεντανα ΑΒ 1 1 ςεντανα ιϖιεω ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ Νευροπατηολογψ Ρυν: 96 Αυτοµατιον Επιτηελιαλ Μεµβρανε Κι 67 / ΜΙΒ1 Ν % Ν % ΒιοΓενεξ ΓενοΜΞ 6ι ακο Αυτοσταινερ Λινκ ακο Αυτοσταινερ πλυσ 1 ακο Αυτοσταινερ Πλυσ Λινκ Λειχα Βονδ Μαξ Λειχα Βονδ Ξ Λειχα Βονδ ΙΙΙ Μεναρινι Ιντελλιπατη ΦΛΞ Νονε (Μανυαλ) Οτηερ ςεντανα Βενχηµαρκ ςεντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ Πριντεδ ατ 15:47 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

60 Ρυν 96 ΝΕΥΡΟΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ Κι 67 / ΜΙΒ1 Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ724 (ΜΙΒ1), 15 Μινσ, ΡΤ Χ ιλυτιον 1: 2 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ2, ΠΗ: 9 Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98), ΡΤ Χ., Τιµε 1: 1 Μινσ ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98), 8 Μινσ, ΡΤ Χ Πρεδιλυτεδ Κι 67 / ΜΙΒ1 Μετηοδ 2 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Λειχα/Νοϖοχαστρα (ΜΜ1) ΝΧΛ Κι67 ΧΕ, 15 Μινσ, 25 Χ ιλυτιον 1: 1 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ2 Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98), 8 Μινσ, 25 Χ Κι 67 / ΜΙΒ1 Μετηοδ 3 Παρτιχιπαντ σχορεδ 18/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 19/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ724 (ΜΙΒ1), 3 Μινσ, ΡΟΟΜ Χ ιλυτιον 1: 1/5 Αυτοµατιον: ακο Αυτοσταινερ Λινκ 48 ακο ΦΛΕΞ+ κιτ Μαιν Βυφφερ: ακο ΦΛΕΞ ωαση βυφφερ, ΠΗ: 7.6 ακο ΠΤΛινκ, Βυφφερ: ΦΛΕΞ ΤΡΣ ΗΙΓΗ, ΠΗ: 9 ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ακο Ενςισιον Πλυσ κιτσ, ΡΟΟΜ Χ., Τιµε 1: 5 Μινσ, Τιµε 2: 5 Μινσ ετεχτιον: ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12), 3 Μινσ, ΡΟΟΜ Χ Πρεδιλυτεδ Κι 67 / ΜΙΒ1 Μετηοδ 4 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ςεντανα ΡΤΥ (3 9) , 16 Μινσ, 36 Χ Πρεδιλυτεδ Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3), ΠΗ: 7.4 ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Μιλδ), Βυφφερ: Υλτρα ΧΧ1 (Χατ:95 224), ΠΗ: 8 Χηροµογεν: ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ, ΠΗ: 7, 37 Χ., Τιµε 1: 8 Μινσ ετεχτιον: ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5), 16 Μινσ, 37 Χ Πρεδιλυτεδ Πριντεδ ατ 15:47 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ, 212 6

61 Ρυν 96 ΝΕΥΡΟΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ Επιτηελιαλ Μεµβρανε Αντιγεν (ΕΜΑ) Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο (Ε29) Μ613, 15 Μινσ, 25 Χ ιλυτιον 1: 2 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ2 Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98), 8 Μινσ Επιτηελιαλ Μεµβρανε Αντιγεν (ΕΜΑ) Μετηοδ 2 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Λειχα/Νοϖοχαστρα ΡΤΥ (ΓΠ1.4) ΠΑ35, 15 Μινσ Πρεδιλυτεδ Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ Μαξ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ1 Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98) Πρεδιλυτεδ Επιτηελιαλ Μεµβρανε Αντιγεν (ΕΜΑ) Μετηοδ 3 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 19/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο (Ε29) Μ613, 15 Μινσ ιλυτιον 1: 1 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ1 Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98), Τιµε 1: 1 Μινσ ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98) Επιτηελιαλ Μεµβρανε Αντιγεν (ΕΜΑ) Μετηοδ 4 Παρτιχιπαντ σχορεδ 18/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Λειχα/Νοϖοχαστρα (ΓΠ1.4) ΝΧΛ ΕΜΑ, 32 Μινσ, 36 Χ ιλυτιον 1: 1:1 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Σταν.), Βυφφερ: ΧΧ1 ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ετεχτιον: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ Πριντεδ ατ 15:47 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

62 The Cytology Module Run 96 Anthony Watson and Irena Kirbis Gold Standard Second Antibody Antigens Assessed: Melanoma Calretinin Tissue Sections circulated: Number of Registered Participants: 77 Human melanoma cell line (SK- MEL28) & human breast carcinoma cell line (MCF-7) Effusion containing mesothelial, lymphocytes and histocytes Summary Graphs - Pass Rate Tables Best Method - Selected Images UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 62

63 ΡΥΝ 96 Τ ˆ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ1. Ž š Œ Ÿ Œ Œ šž Α ον τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χψτοσπιν. (Α,Β) σηοω στρονγ Š Œ Ž Œ šÿ Œ šž Œ šžž œ Žš ž ŸŒ ŒŒ Žš šž Œ νυχλεαρ χουντερ σταιν. Σταινεδ ωιτη ακο Α13 αντιβοδψ, 1:5, υσινγ τηε ακο ΠΤ Λινκ, Œ šÿ ª«ž Φιγ2.Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ ΗΜΒ45 ον τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χψτοσπιν. (Α,Β) σηοω στρονγ Š Œ Ž Œ šž Œ šžž œ Žš ž ŸŒ ŒŒ Žš šž Œ νυχλεαρ χουντερ σταιν. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο ΗΜΒ45 αντιβοδψ, 1:5, νο πρε τρεατµεντ ον τηε š š œ Ÿž Τ ωιτη τηε ι ιεω δετεχτιον κιτ. Φιγ3.Συβ οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Μελαν Α ον τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χψτοσπιν. (Χοµπαρε το Φιγ 1) (Α,Β) Αλλ χελλσ εξπεχτεδ το σταιν αρε δεµονστρατεδ βυτ τηε σταινινγ ισ ωεακ. Τηε χουντερσταιν ισ Ž Œ š š š š Œ š œš š Œ Š š œ š œš ª œœ Φιγ1, ηοωεϖερ, τηε διλυτιον υσεδ ωασ τοο ηιγη ατ 1:1. Φιγ4.Συβ οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Σ 1 ον τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χψτοσπιν. Τηε εξαµπλε σηοωσ νον σπεχιφιχ εξχεσσιϖε βαχκγρουνδ σταινινγ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο πολψχλοναλ αντιβοδψ, 1:4, νο πρε τρεατµεντ ον τηε š š œ Ÿž Τ ωιτη τηε ι ιεω δετεχτιον κιτ. Φιγ5. ŒŒ š Žš Œ ± œœ š² χοντρολ φορ ΗΜΒ45 (µαλιγναντ µελανοµα σµεαρ), σηοωινγ στρονγ χψτοπλασµιχ σταινινγ οφ τηε τυµουρ χελλσ ωιτη α χλεαν βαχκγρουνδ ανδ γοοδ λεϖελ οφ Žš Ÿ Œ šÿ³ š Œ š œ šžž Ÿ š µ ¹º Œ Ÿš³ Ÿš š ϖισυαλισεδ υσινγ τηε ακο Ενϖισιον δετεχτιον κιτ.» Ž š Œ Ÿ Œ Œ ŽŸš š Œ œš ¼½ ¾«À Š Œ Áœš š Žš œœ στρονγ χψτοπλασµιχ σταινινγ ιν τηε τυµουρ χελλσ ωιτη α χλεαν βαχκγρουνδ ανδ γοοδ λεϖελ οφ νυχλεαρ χουντερσταιν. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο ΑΚ Χαλρετ 1 αντιβοδψ, 1:5, νο πρε τρεατµεντ υσινγ τηε š š œ Ÿž Τ ανδ Υλτραϖιεω δετεχτιον κιτ. ÂÃÄÅÆÇÈ ÉÆ ÊËÌÍÎ ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

64 ΡΥΝ 96 ÏÐΤÑÒÑÓÐ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ7.Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Χαλρετενιν ον τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χψτοσπιν, σηοωινγ στρονγ χψτοπλασµιχ σταινινγ ιν τηε τυµουρ χελλσ ανδ ρεαχτιϖε µεσοτηελιαλ χελλσ ωιτη α χλεαν βαχκγρουνδ ανδ γοοδ λεϖελ οφ νυχλεαρ χουντερσταιν. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο ΑΚ Χαλρετ 1 αντιβοδψ, 1:5, νο πρε τρεατµεντ υσινγ τηε ακο αυτοσταινερ ανδ ΦΛΕΞ κιτ. Φιγ8.Συβ οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Χαλρετενιν ον τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ χψτοσπιν. Τηε εξαµπλε σηοωσ ωεακ ανδ διφφυσε σταινινγ οφ τηε τυµουρ χελλσ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη τηε Χελλ Μαρθυε πολψ αντιβοδψ, ον τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ΧΧ1 8 µινσ ανδ Υλτραϖιεω δετεχτιον κιτ. î ÙïãðááÚ ÝñÖéòÜÝ áó ÖØ ô Ø æáâôýõ χοντρολ φορ Χαλρετενιν. Τηε πλευραλ εφφυσιον σηοωσ σπεχιφιχ χψτοπλασµιχ σταινινγ, α γοοδ λεϖελ οφ νυχλεαρ χουντερσταιν ανδ α χλεαν βαχκγρουνδ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη τηε Νοϖοχαστρα 5Α5 αντιβοδψ, νο πρε τρεατµεντ ανδ υσινγ τηε öεχτορ Ελιτε ΑΒΧ δετεχτιον κιτ. Φιγ1.Γοοδ εξαµπλε οφ αν ιν ηουσε χοντρολ φορ Χαλρετενιν (Α,Β), σηοωινγ στρονγ χψτοπλασµιχ ÔÕÖ Ø ØÙ ÖØÚ Ö ÛÜÝÖØ ÞÖÛßÙàáâØÚã äýûõ áø ÔÕÖ ØÝÚ å Õæ ÕæÝ çèéýú ÖØÕ ÞáÚèê ëìëííê Øá πρε τρεατµεντ ανδ υσινγ τηε Λειχα ΒονδΜαξ ανδ Ρεφινε δετεχτιον κιτ. øùúûüý þû ÿp ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

65 Ρυν 96 ΧΨΤΟΛΟΓΨ Μοδυλε 16 ΡΥΝ 96Ρ Σ1/ ΗΜΒ45 / Μελαν Α ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 32 ΡΥΝ 96Σ Σ1/ ΗΜΒ45 / Μελαν Α ον ιν ηουσε Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 14 5 = (%) 6 = (%) 28 5 = (%) 6 = (%) 12 7 = 1 (1%) 8 = (%) 24 7 = (%) 8 = 1 (1%) νο. οφ ρετυρνσ = 4 (5%) 1 = 2 (3%) 11 = 3 (4%) 12 = 8 (11%) 13 = 3 (4%) 14 = 3 (4%) νο. οφ ρετυρνσ = (%) 1 = (%) 11 = (%) 12 = (%) 13 = 5 (7%) 14 = 6 (8%) 4 15 = 4 (5%) 16 = 13 (17%) 8 15 = 9 (12%) 16 = 29 (4%) 2 17 = 15 (2%) 4 17 = 14 (19%) 18 = 7 (9%) 18 = 4 (5%) = 8 (11%) 2 = 5 (7%) = 5 (7%) 2 = (%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 48 (63%) 16 2 = 52 (71%) = 1 (13%) = 2 (27%) 1 12 = 13 (17%) 1 12 = (%) 9 = 5 (7%) 9 = 1 (1%) Μεδιαν = 14. Μεδιαν = ΡΥΝ 96Τ Χαλρετινιν ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = 1 (1%) 24 ΡΥΝ 96Υ Χαλρετινιν ον ιν ηουσε Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 5 = (%) 5 = (%) 16 6 = (%) 7 = (%) 2 6 = 1 (1%) 7 = (%) 8 = (%) 8 = 3 (4%) νο. οφ ρετυρνσ = (%) 1 = 1 (1%) 11 = (%) 12 = 3 (4%) 13 = 5 (7%) 14 = 2 (3%) 15 = 9 (12%) νο. οφ ρετυρνσ = 2 (3%) 1 = 1 (1%) 11 = 2 (3%) 12 = 1 (1%) 13 = 1 (1%) 14 = 4 (5%) 15 = 8 (11%) 4 16 = 13 (17%) 17 = 12 (16%) 4 16 = 23 (31%) 17 = 18 (24%) 18 = 18 (24%) 18 = 5 (7%) = 8 (11%) 2 = 3 (4%) = 3 (4%) 2 = 2 (3%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 54 (72%) 16 2 = 51 (69%) = 16 (21%) = 13 (18%) 1 12 = 4 (5%) 1 12 = 4 (5%) 9 = 1 (1%) 9 = 6 (8%) Μεδιαν = 15. Μεδιαν = 13.5 Πριντεδ ατ 14:3 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

66 Ρυν 96 ΧΨΤΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΑΝΤΙΒΟ ΙΕΣ ΑΝ ΟΤΗΕΡ ΤΕΧΗΝΙΧΑΛ ΠΑΡΑΜΕΤΕΡΣ ΕΜΠΛΟΨΕ ΒΨ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ ΙΝ ΤΗΕ ΧΨΤΟΛΟΓΨ ΜΟ ΥΛΕ Τηε φολλοωινγ ταβλεσ ρεχορδ τηε νυµβερ οφ παρτιχιπαντσ (Ν) υσινγ εαχη πριµαρψ αντιβοδψ. Τηε περχενταγε (%) ρεφερσ το τηε προπορτιον οφ τηεσε παρτιχιπαντσ αχηιεϖινγ αχχεπταβλε σταινινγ (α σχορε >12/2) ον ΥΚ ΝΕΘΑΣ σεχτιονσ. Χψτολογψ Ρυν: 96 Χψτολογψ Ρυν: 96 Πριµαρψ Αντιβοδψ : Σ1/ ΗΜΒ45 / Μελαν Α Αντιβοδψ εταιλσ Ν % Βιογενεξ Μελαν Α (ΜΑΡΤ 1) (Α13) ΑΜ361/ΜΥ Χελλ Μαρθυε ΧΜΑ71 (ΗΜΒ45) 1 1 ακο ΦΛΕΞ ΡΤΥ Μελαν Α (Α13) ΙΡ ακο Μ634 (ΗΜΒ45) ακο Μ7196 (Α13 Μελαν Α) ακο Ζ311 (Σ1) 9 56 Νοϖοχαστρα/Λειχα ΝΧΛ ΗΜΒ45 (ΗΜΒ45) 2 1 Νοϖοχαστρα/Λειχα ΝΧΛ ΜΕΛΑΝ Α (Μελαν Α) 9 78 Νοϖοχαστρα/Λειχα ΝΧΛ ΡΤΥ ΜελανΑ(Α13) ΠΑ Νοϖοχαστρα/Λειχα ΝΧΛ Σ1π (Σ1) 2 5 Οτηερ 2 1 ςεντανα ΗΜΒ ςεντανα Μελαν Α (ΜΑΡΤ 1) ςεντανα Σ1 (4Χ4.9) Πριµαρψ Αντιβοδψ : Χαλρετινιν Αντιβοδψ εταιλσ Ν % Χελλ Μαρθυε ΧΜΧ759 χαλρετινιν 1 Χελλ Μαρθυε 232Α ακο ΙΡ ακο Μ7245 Χαλρετινιν 17 1 Ινϖιτρογεν Λαβϖισιον ΡΜ 9113 χαλρετινιν 1 1 Νοϖοχαστρα ΝΧΛ ΧΑΛΡΕΤ (5Α5) Νοϖοχαστρα/Λειχα ΝΧΛ Λ ΧΑΛΡΕΤ Νοϖοχαστρα/Λειχα ΡΤΥ Χαλρετινιν (5Α5) 4 75 Οτηερ 1 1 ςεχτορ ςπ Χ36 χαλρετινιν 4 1 ςεντανα Χαλρετινιν 4 75 ςεντανα Ζψµεδ Χαλρετινιν Χψτολογψ Ρυν: 96 Χψτολογψ Ρυν: 96 Πριµαρψ Αντιβοδψ : Σ1/ ΗΜΒ45 / Μελαν Α Πριµαρψ Αντιβοδψ : Χαλρετινιν Αντιγεν Ρετριεϖαλ Ν % Αντιγεν Ρετριεϖαλ Ν % ΨΕΣ ΨΕΣ 15 2 ΝΟ ΝΟ 61 8 Βρεακδοων οφ παρτιχιπαντσ ρεπορτινγ ΨΕΣ Ν Βρεακδοων οφ παρτιχιπαντσ ρεπορτινγ ΨΕΣ Ν Ηεατ Μεδιατεδ Ηεατ Μεδιατεδ Ενζψµε Ενζψµε Βοτη 12 Βοτη 15 Νοτ Σπεχιφιεδ Νοτ Σπεχιφιεδ Χψτολογψ Ρυν: 96 Χψτολογψ Ρυν: 96 Ηεατ Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Ηεατ Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Χψτολογψ Ρυν: 96 Χψτολογψ Ρυν: 96 Ενζψµε Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Ενζψµε Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Πριντεδ ατ 14:3 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

67 Ρυν 96 ΧΨΤΟΛΟΓΨ Μοδυλε Χψτολογψ Ρυν: 96 Χψτολογψ Ρυν: 96 ετεχτιον Χαλρετινιν Σ1/ ΗΜΒ45 / Μελαν Α Ν % Ν % ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ ΗΡΠ (ΗΚ 519 6Κ) 1 1 ΒιοΓενεξ ΣΣ Πολψµερ (Θ 43 ΞΑΚΕ) ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ ( Κ8/1) ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12) ακο Ενϖισιον ΗΡΠ/ ΑΒ ( Κ57) ακο Ενϖισιον+ ΗΡΠ µουσε Κ44/5/6/ ακο ΡΕΑΛ ( Κ55) 1 1 Λαβςισιον Υλτραςισιον ΛΠ ΗΡΠ (ΤΣ 125 Η ) 1 1 Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98) Νονε 1 1 Οτηερ Ποωερ ςισιον ΠςΒ999 ΗΡΠ ςεχτορ Ελιτε ΑΒΧ (ΠΚ 612) ςεχτορ Ελιτε Υνιϖερσαλ ΑΒΧ (ΠΚ 62) ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Χηροµογεν Χαλρετινιν Σ1/ ΗΜΒ45 / Μελαν Α Ν % Ν % Α. Μεναρινι Λιθυιδ Σταβλε ΑΒ κιτ 1 1 ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ ΑΒ (Θ 43) ΒιοΓενεξ Λιθυιδ ΑΒ (ΗΚ153 5Κ) 1 1 ακο ΑΒ Λιθυιδ (Κ3465) 1 1 ακο ΑΒ+ Λιθυιδ (Κ3468) ακο ΑΒ+ ΡΕΑΛ ετεχτιον (Κ51) ακο Ενςισιον Πλυσ κιτσ ακο ΦΛΕΞ ΑΒ ακο ΡΕΑΛ Ενςισιον Κ57 ΑΒ ακο ΡΕΑΛ Κ55 Αλκαλινε πηοσπηατασε Οτηερ Σιγµα ΑΒ ( 4168) Σιγµα ΑΒ ( 4293) Σιγµα ΑΒ ( 5637) ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ςεντανα ΑΒ ςεντανα Ενηανχεδ Αλκ. Πηοσ. Ρεδ ετεχτιον Κιτ ςεντανα ιϖιεω ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ Χψτολογψ Ρυν: 96 Αυτοµατιον Χαλρετινιν Σ1/ ΗΜΒ45 / Μελαν Α Ν % Ν % ΒιοΓενεξ ΓενοΜΞ 6ι ΒιοΓενεξ Οπτιµαξ ακο Αυτοσταινερ ακο Αυτοσταινερ Λινκ ακο Αυτοσταινερ πλυσ ακο Αυτοσταινερ Πλυσ Λινκ Λαβςισιον Αυτοσταινερ 1 1 Λειχα Βονδ Μαξ Λειχα Βονδ ΙΙΙ Νονε (Μανυαλ) ςεντανα Βενχηµαρκ ςεντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα ΝεξΕΣ Πριντεδ ατ 14:3 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

68 Ρυν 96 ΧΨΤΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ Σ1/ ΗΜΒ45 / Μελαν Α Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ7196 (Α13 Μελαν Α), 4 Μινσ ιλυτιον 1: 1:5 Αυτοµατιον: ακο Αυτοσταινερ Λινκ 48 ακο ΦΛΕΞ+ κιτ Μαιν Βυφφερ: ακο ΦΛΕΞ ωαση βυφφερ ακο ΠΤΛινκ, ΠΗ: 9 Χηροµογεν: ακο ΦΛΕΞ ΑΒ, 21 Χ., Τιµε 1: 5 Μινσ, Τιµε 2: 5 Μινσ ετεχτιον: ακο Ενϖισιον+ ΗΡΠ µουσε Κ44/5/6/7, 2 Μινσ, 21 Χ Πρεδιλυτεδ Σ1/ ΗΜΒ45 / Μελαν Α Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 16/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ7196 (Α13 Μελαν Α), 3 Μινσ, 23 Χ ιλυτιον 1: 1:1 Αυτοµατιον: Νονε (Μανυαλ) ακο ΦΛΕΞ+ κιτ Μαιν Βυφφερ: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ, 23 Χ., Τιµε 1: 1 Μινσ, Τιµε 2: 1 Μινσ ετεχτιον: ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12), 3 Μινσ, 23 Χ Πρεδιλυτεδ Σ1/ ΗΜΒ45 / Μελαν Α Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 19/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ634 (ΗΜΒ45), Ρτ. Χ ιλυτιον 1: 1 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ1 Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ετεχτιον: Σ1/ ΗΜΒ45 / Μελαν Α Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 18/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ634 (ΗΜΒ45), 32 Μινσ, 37 Χ Πρεδιλυτεδ ιλυτιον 1: 5 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ςεντανα ιςιεω Κιτ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) Χηροµογεν: ςεντανα ιϖιεω ετεχτιον: ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) Πριντεδ ατ 14:3 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

69 Ρυν 96 ΧΨΤΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ Χαλρετινιν Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ7245 Χαλρετινιν, 32 Μινσ, 37 Χ ιλυτιον 1: 5 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Μιλδ) ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ετεχτιον: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ Χαλρετινιν Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Νοϖοχαστρα ΝΧΛ ΧΑΛΡΕΤ (5Α5), 15 Μινσ, 25 Χ ιλυτιον 1: 25 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ1 Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98), 8 Μινσ, 25 Χ Χαλρετινιν Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 2/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ςεντανα Χαλρετινιν, 2 Μινσ, 37 Χ Πρεδιλυτεδ Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα ιςιεω Κιτ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ςεντανα ΑΒ ετεχτιον: ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) Χαλρετινιν Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 16/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Μ7245 Χαλρετινιν, 3 Μινσ, 23 Χ ιλυτιον 1: 1:4 Αυτοµατιον: Νονε (Μανυαλ) ακο ΦΛΕΞ+ κιτ Μαιν Βυφφερ: ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Χηροµογεν: ακο Ενςισιον Πλυσ κιτσ, 23 Χ., Τιµε 1: 1 Μινσ, Τιµε 2: 1 Μινσ ετεχτιον: ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12), 3 Μινσ, 23 Χ Πρεδιλυτεδ Πριντεδ ατ 14:3 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

70 The Alimentary Tract Module: CD117 & DOG1 Run 96 Merdol Ibrahim and Suzanne Parry Gold Standard Antigens Assessed: CD117 DOG1 Second Antibody (optional) Tissue Sections circulated: GIST + Tonsil + Desmoid GIST + Tonsil + Desmoid Number of Registered Participants: 222 Gold Standard - CD117 CD117 (c-kit) is a transmembrane tyrosine kinase growth factor receptor involved in cell differentiation and is expressed by melanocytes, mast cells and interstitial cells of cajal. CD117 is also expressed in gastrointestinal stromal tumors (GIST). Until recently, patients with GIST faced a limited choice of treatment regimes, which included radiotherapy and surgery, with limited success. However, Glivec (imatinib), which was originally developed for chronic myeloid leukaemia (CML), has proved effective in the targeted treatment of GISTs, by directly inhibiting the action of CD117. Tissue Distribution Circulated tissue comprised of GIST, appendix and a desmoid tumour, which participants requested to stain the samples using their normal protocol, whether with or without heat mediated antigen retrieval. Features of optimal immunostaining (see Fig2 1, 3-6) Good localisation of CD117 to cells of the GIST Good localisation of CD117 to mast cells Good localisation of CD117 to interstitial cells of Cajal No staining of desmoid tumour Features of sub-optimal immunostaining (see Figs 2A & B) Weak and Patchy Staining of the tumour cells of the GIST Little or no staining of the Mast Cells Excessive background / non specific staining Second Antibody - DOG1 Discovered on GIST 1 (DOG1) antibody was initially described in 24 4 and has now started to be recognized as a more specific marker of GISTs than CD117 4,5,6. A recent study has shown DOG1 sensitivity of 99% and found to be strong and easier to interpret than CD The groups also showed that seven CD117 negative GIST cases were found to be DOG1 positive, and six of the tumours had PDGFRA mutations. Furthermore, DOG1 is not expressed in Kaposi sarcomas of the GI tract which have been shown to stain for CD In more cases, combined CD117 and DOG1 immunohistochemistry has been suggested as a sufficient panel to confirm diagnosis, with CD117 and DOG1 negative cases tested further with a panel of antibodies including SMA, desmin, S1 and molecular analysis, should be considered 6. Features of sub-optimal immunostaining (see Figs 8B & 11) Weak and Patchy Staining of the tumour cells of the GIST Note: Mast cells are not stained with DOG-1 References 1. Cordless et al., Biology of Gastrointestinal Stromal Tumours. J Clin Oncol 24, 22(18): Blay et al., Consensus meeting for the management of gastrointestinal stromal tumors. Report of the GIST Consensus Conference of 2-21 March 24, under the auspices of ESMO. Ann Oncol 25 6: Parfitt JR, Rodriguez-Justo M, Feakins R, Novelli MR (28) Gastrointestinal Kaposi's sarcoma: CD117 expression and the potential for misdiagnosis as gastrointestinal stromal tumour. Histopathology 28, 52: West RB, Corless CL, Chen X et al. The novel marker, DOG1, is expressed ubiquitously in gastrointestinal stromal tumors irrespective of KIT or PDGFRA mutation status. Am. J. Pathol. 24; 65; Espinosa I, Lee CH, Kim MK et al. A novel monoclonal antibody against DOG1 is a sensitive and specific marker for gastrointestinal stromal tumors. Am. J. Surg. Pathol. 28; 32; Novelli M, Rossi S, Rodriguez-Justo M, Taniere P, Seddon B, Toffolatti L, Sartor C, Hogendoorn PC, Sciot R, Van Glabbeke M, Verweij J, Blay JY, Hohenberger P, Flanagan A, Dei Tos AP. DOG1 and CD117 are the antibodies of choice in the diagnosis of gastrointestinal stromal tumours. Histopathology 21, 57(2): Parfitt JR, Rodriguez-Justo M, Feakins R, Novelli MR. Gastrointestinal Kaposi s sarcoma: CD117 expression and the potential for misdiagnosis as gastrointestinal stromal tumour. Histopathology 28; 52; Tissue Distribution Circulated tissue were from sequential sections used for the CD117 distribution as show above and comprised of GIST, appendix and a desmoid tumour. Features of optimal immunostaining (see Figs 7,8A,9,1 & 12) Good localisation of DOG1 to cells of the GIST Good localisation of DOG1 to interstitial cells of Cajal No staining of desmoid tumour UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 7

71 ΡΥΝ 96 ΑΛΙΜΕΝΤΑΡΨ ΤΡΑΧΤ ΠΑT Y Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ1.Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ Χ 117 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ ΓΙΣΤ σεχτιον, σηοωινγ ιντενσε ωελλ λοχαλισεδ πρεδοµιναντλψ µεµβρανουσ ανδ χψτοπλασµιχ σταινινγ. Σταινεδ ωιτη ακο Α452 πολψ αντιβοδψ, 1:12, πρε τρεατεδ ιν τηε πρεσσυρε χοοκερ ανδ ϖισυαλισεδ υσινγ τηε Ενϖισιον δετεχτιον κιτ. Φιγ2.Τωο εξαµπλεσ οφ ποορλψ δεµονστρατεδ Χ 117 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ ΓΙΣΤ σεχτιον (Χοµπαρε το Φιγ1). (Α) σηοωσ ϖερψ ωεακ σταινινγ, ανδ (Β) σηοωσ ωεακ, διφφυσε σταινινγ. (Α) σταινεδ ωιτη ακο Α452 πολψ αντιβοδψ, 1:12, υσινγ τηε Λαβϖισιον ΠΤ µοδυλε ανδ ακο ΦΛΕΞ κιτ. (Β) σταινεδ ωιτη Νοϖοχαστρα Τ595 αντιβοδψ, 1:1, ον τηε Λειχα Βονδ ΙΙΙ, ΕΡ1 ανδ Ρεφινε κιτ. Φιγ3.Γοοδ δεµονστρατιον οφ µαστ χελλσ ωιτη Χ 117 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ ΙΧΧ διστριβυτεδ αππενδιξ σεχτιον αφτερ ηεατ ρετριεϖαλ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο Α452 πολψ αντιβοδψ, 1:4, υσινγ τηε ακο ΠΤ Λινκ ανδ ΦΛΕΞ κιτ. F!"# $ αππενδιξ σεχτιον σταινεδ ωιτη Χ 11%. Τηε Χαϕαλ χελλσ σηοω στρονγ διστινχτ σταινινγ ανδ τηε σµοοτη µυσχλε ρεµαινσ υνσταινεδ ανδ χλεαν. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο Α452 πολψ αντιβοδψ, 1:5, ον τηε Λειχα Βονδ ΙΙΙ, ΕΡ1 ανδ Ρεφινε κιτ. Φιγ5.Εξπεχτεδ δεµονστρατιον οφ Χ 11% ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ ΙΧΧ διστριβυτεδ δεσµοιδ σεχτιον. Τηε µαστ χελλσ σηοω στρονγ µεµβρανουσ σταινινγ, ωηιλε τηε δεσµοιδ τυµουρ ισ νεγατιϖε. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ακο Α452 πολψ αντιβοδψ, 1:4, ον τηε Λειχα Βονδ Μαξ, ΕΡ2 ανδ Ρεφινε κιτ. Φιγ6. E E & χοντρολ σεχτιον, σηοωινγ γοοδ δεµονστρατιον οφ Χ 11%+ $#Τ αλονγ ωιτη µαστ χελλσ ιν αδϕαχεντ νορµαλ τισσυε. Σταινεδ ωιτη ακο Α452 πολψ αντιβοδψ, 1:4, υσινγ τηε V e' (), ΧΧ1 µιλδ ανδ Υλτραϖιεω δετεχτιον κιτ. Πριντεδ ατ 14:4 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

72 ΡΥΝ 96 ΑΛΙΜΕΝΤΑΡΨ ΤΡΑΧΤ ΠΑ*,-.-/ Μοδυλε Σελεχτεδ Ιµαγεσ σηοωινγ Οπτιµαλ ανδ Συβ οπτιµαλ Ιµµυνοσταινινγ Φιγ7.Οπτιµαλ δεµονστρατιον οφ ΟΓ 1 ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ ΓΙΣΤ σεχτιον, σηοωινγ ιντενσε ωελλ λοχαλισεδ χψτοπλασµιχ ανδ µεµβρανουσ σταινινγ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη τηε Λειχα Κ9 αντιβοδψ, 1:25, ον τηε Λειχα Βονδ ΙΙΙ, ΕΡ2 ανδ Ρεφινε κιτ. Φιγ8. εµονστρατιον οφ ΟΓ 1 ν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ διστριβυτεδ ΓΙΣΤ σεχτιον. (Α) σηοωσ γοοδ στρονγ σταινινγ, χοµπαρεδ το τηε συβ οπτιµαλ ωεακ σταινινγ σηοων ιν (Β). (Α & Β) βοτη σταινεδ ωιτη τηε Λειχα Κ9 αντιβοδψ, 1:1. (Α) υσινγ τηε πρεσσυρε χοοκερ ανδ ΒιοΓενεξ πολψµερ κιτ, ανδ (Β) υσινγ τηε ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ, ΧΧ1 µιλδ ανδ Υλτραϖιεω κιτ :;8<=>?@>38< 8A >B: C:DD= 8A G@H@D 3< >B: ;I=CID@?3= J?8J?3@ 8A >B: KL MNOQR =:C>38< =>@3<:9 U3>B WX7Z[6 \B: G@H@D C:DD= =B8U =>?8<4 93=>3<C> >B: =;88>B ;I=CD:?:;@3<= CD:@<6 R:C>38< =>@3<:9 U3>B >B: s:3c@ [`bc_ ον τηε Λειχα Βονδ ΙΙΙ, ΕΡ2 ανδ Ρεφινε κιτ. Φιγ1.Εξπεχτεδ ΟΓ 1 εξπρεσσιον ιν τηε ΥΚ ΝΕΘΑΣ ΙΧΧ διστριβυτεδ δεσµοιδ σεχτιον. Βοτη τηε µαστ χελλσ ανδ δεσµοιδ τυµουρ αρε νεγατιϖε. Τηε σεχτιον ισ χλεαν ωιτη µινιµαλ νον σπεχιφιχ βαχκγρουνδ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη Λειχα Κ9 αντιβοδψ, 1:2, ον τηε Λειχα ΒονδΜαξ, ΕΡ1 ανδ Ρεφινε κιτ. Φιγ116RI]Z8J>3;@D 9:;8<=>?@>38< 8A WX7Z[ 3< >B: KL MNOQR SGG 93=>?3]I>:9 9:=;839 =:C>38< (Χοµπαρε το Φιγ1). Αλτηουγη τηε τυµουρ ανδ αλλ οτηερ χελλσ αρε νεγατιϖε ασ εξπεχτεδ, τηε σεχτιον σηοωσ σοµε νον σπεχιφιχ ιναππροπριατε βαχκγρουνδ σταινινγ. Σεχτιον σταινεδ ωιτη ιαγνοµιχσ πολψ αντιβοδψ, 1:1, υσινγ τηε ακο ΠΤ 2sNj i3>. Φιγ =>@3<3<4 9:;8<=>?@>:9 d3< B8I=:f 7SRΤ χοντρολ σεχτιον, σηοωινγ ιντενσε ωελλ D8C@D3=:9 ;:;]?@<8I= =>@3<3<46 R:C>38< =>@3<:9 U3>B s:3c@ [`[ll_ υσινγ τηε g:<>@<@ h:<cb;@?i j\, ΧΧ1 µιλδ ανδ Υλτραϖιεω κιτ. Πριντεδ ατ 14:4 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

73 Ρυν 96 ΑΛΙΜΕΝΤΑΡΨ ΤΡΑΧΤ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε 28 ΡΥΝ 96ς Χ 117 ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 28 ΡΥΝ 96Ω Χ 117 ον ιν ηουσε Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 24 5 = (%) 6 = (%) 24 5 = (%) 6 = (%) 7 = 1 (1%) 7 = (%) 2 8 = 6 (6%) 2 8 = (%) νο. οφ ρετυρνσ = (%) 1 = 3 (3%) 11 = 2 (2%) 12 = 11 (11%) 13 = 6 (6%) νο. οφ ρετυρνσ = (%) 1 = (%) 11 = (%) 12 = 6 (6%) 13 = 2 (2%) 8 14 = 7 (7%) 15 = 21 (21%) 8 14 = 4 (4%) 15 = 9 (9%) 4 16 = 26 (25%) 17 = 12 (12%) 4 16 = 27 (26%) 17 = 25 (24%) 18 = 5 (5%) 18 = 2 (19%) = 2 (2%) 2 = (%) = 7 (7%) 2 = 3 (3%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 45 (44%) 16 2 = 82 (8%) = 34 (33%) = 15 (15%) 1 12 = 16 (16%) 1 12 = 6 (6%) 9 = 7 (7%) 9 = (%) Μεδιαν = 13.5 Μεδιαν = ΡΥΝ 96ςβ ΟΓ1 ον ΝΕΘΑΣ Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 35 ΡΥΝ 96Ωβ ΟΓ1 ον ιν ηουσε Σεχτιονσ Ινδιϖιδυαλ 4 = (%) 5 = (%) 5 = 1 (1%) 2 6 = (%) 7 = (%) 3 6 = (%) 7 = (%) νο. οφ ρετυρνσ = (%) 9 = 1 (2%) 1 = 1 (2%) 11 = (%) 12 = 2 (3%) 13 = 5 (8%) 14 = 2 (3%) 15 = 6 (9%) νο. οφ ρετυρνσ = (%) 9 = (%) 1 = (%) 11 = 1 (1%) 12 = 2 (3%) 13 = 3 (4%) 14 = 2 (3%) 15 = 7 (1%) 4 16 = 23 (35%) 17 = 13 (2%) 18 = 4 (6%) 5 16 = 31 (46%) 17 = 7 (1%) 18 = 8 (12%) = 8 (12%) 2 = 1 (2%) = 5 (7%) 2 = (%) Συµµαρψ Συµµαρψ 16 2 = 49 (74%) 16 2 = 51 (76%) = 13 (2%) = 12 (18%) 1 12 = 3 (5%) 1 12 = 3 (4%) 9 = 1 (2%) 9 = 1 (1%) Μεδιαν = 15. Μεδιαν = 14.5 Πριντεδ ατ 15:22 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

74 Ρυν 96 ΑΛΙΜΕΝΤΑΡΨ ΤΡΑΧΤ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΑΝΤΙΒΟ ΙΕΣ ΑΝ ΟΤΗΕΡ ΤΕΧΗΝΙΧΑΛ ΠΑΡΑΜΕΤΕΡΣ ΕΜΠΛΟΨΕ ΒΨ ΠΑΡΤΙΧΙΠΑΝΤΣ ΙΝ ΤΗΕ ΑΛΙΜΕΝΤΑΡΨ ΤΡΑΧΤ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ ΜΟ ΥΛΕ Τηε φολλοωινγ ταβλεσ ρεχορδ τηε νυµβερ οφ παρτιχιπαντσ (Ν) υσινγ εαχη πριµαρψ αντιβοδψ. Τηε περχενταγε (%) ρεφερσ το τηε προπορτιον οφ τηεσε παρτιχιπαντσ αχηιεϖινγ αχχεπταβλε σταινινγ (α σχορε >12/2) ον ΥΚ ΝΕΘΑΣ σεχτιονσ. Αλιµενταρψ Τραχτ Πατηολογψ Ρυν: 96 Αλιµενταρψ Τραχτ Πατηολογψ Ρυν: 96 Πριµαρψ Αντιβοδψ : Χ 117 Αντιβοδψ εταιλσ Ν % Χελλ Μαρθυε 117Ρ/Σ ξξ (ΨΡ145) 2 1 ακο Α452 (ρβ πολψ) ιαγνοστιχ Βιοσψστεµσ (ΡΠ63) 1 Νοϖοχαστρα ΝΧΛ Χ 117 (Τ595) 2 5 Νοϖοχαστρα ΝΧΛ χκιτ (Τ595) 1 1 Νοϖοχαστρα ΝΧΛ Λ Χ 117 (Τ595) 1 Νοϖοχαστρα ΡΤΥ Χ 117 (Τ595) 1 ςεντανα (ρβ πολψ) 1 1 ςεντανα (9.7) 3 67 Πριµαρψ Αντιβοδψ : ΟΓ1 Αντιβοδψ εταιλσ Ν % Αβχαµ ΤΜΕΜ16Α (αβ53212) 1 1 Χελλ Μαρθυε 244Ρ 17/18 (ΣΠ31) 5 1 ιαγνοστιχ Βιοσψστεµσ ΡΜΑΒ31 1 ιαγοµιχσ (ρβ πολψ) 1 Λειχα ΝΧΛ Λ ΟΓ 1 (Κ9) Λειχα ΠΑ219 (Κ9) 6 1 Σπρινγ Βιοσχιενχεσ Μ331 (ρβ πολψ) 1 1 Σπρινγ Βιοσχιενχεσ Μ3311 (ΣΠ31) 1 1 ςεντανα (ΣΠ31) Αλιµενταρψ Τραχτ Πατηολογψ Ρυν: 96 Αλιµενταρψ Τραχτ Πατηολογψ Ρυν: 96 Ηεατ Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Χ 117 ΟΓ1 Ν % Ν % Βιοχαρε εχλοακινγ Χηαµβερ 1 1 ακο ΠΤΛινκ Λαβ ϖισιον ΠΤ Μοδυλε 3 67 Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ Λειχα ΒονδΜαξ ΕΡ Μιχροωαϖε Οϖεν 2 5 ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ 6 33 Οτηερ Πρεσσυρε Χοοκερ ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Εξτενδεδ) 1 1 ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ςεντανα Βενκ ΧΧ2 (µιλδ) 2 1 ςεντανα Βενκ ΧΧ2 (Στανδαρδ) 1 ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Μιλδ) 4 75 ςεντανα Βενκ ΥΛΤΡΑ ΧΧ1 (Σταν.) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Εξτενδεδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Μιλδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1# (8µινσ) 1 1 Ωατερ βατη ΟΧ 1 1 Ενζψµε Μεδιατεδ Ρετριεϖαλ Χ 117 ΟΓ1 Ν % Ν % ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ Πριντεδ ατ 15:22 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

75 Ρυν 96 ΑΛΙΜΕΝΤΑΡΨ ΤΡΑΧΤ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε Αλιµενταρψ Τραχτ Πατηολογψ Ρυν: 96 Αλιµενταρψ Τραχτ Πατηολογψ Ρυν: 96 ετεχτιον Χ 117 ΟΓ1 Ν % Ν % ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ ΣΣ Πολψµερ (Θ 42 ΨΙΚΕ) 1 1 ΒιοΓενεξ ΣΣ Πολψµερ (Θ 43 ΞΑΚΕ) 1 1 ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ ( Κ8/1) ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12) ακο Ενϖισιον ΗΡΠ/ ΑΒ ( Κ57) Λαβςισιον Υλτραςισιον ΟΝΕ Πολψµερ ( ΤΛ 12/5 Η ϑ/τ 1 Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98) ΝΟΤ ΑΠΠΛΙΧΑΒΛΕ 1 1 Νοϖοχαστρα Νοϖολινκ Π Σ (ΡΕ7 14/15/28/29 Κ) Οτηερ Ποωερ ςισιον ΠςΒ999 ΗΡΠ ςεχτορ Ελιτε ΑΒΧ Κιτ (ΠΚ 72) 1 1 ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5) Χηροµογεν Χ 117 ΟΓ1 Ν % Ν % ΑΣ ΠΕΡ ΚΙΤ ΒιοΓενεξ Λιθυιδ ΑΒ (ΗΚ153 5Κ) 1 1 ΒιοΓενεξ λιθυιδ ΒΑ (ΗΚ 124 7Κ) 1 1 ακο ΑΒ+ Λιθυιδ (Κ3468) 1 1 ακο Ενςισιον Πλυσ κιτσ ακο ΦΛΕΞ ΑΒ ακο ΡΕΑΛ Ενςισιον Κ57 ΑΒ Λαβςισιον ΑΒ 1 Οτηερ Σιγµα ΑΒ ( 5637) ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) ςεντανα ιϖιεω ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ Αλιµενταρψ Τραχτ Πατηολογψ Ρυν: 96 Αυτοµατιον Χ 117 ΟΓ1 Ν % Ν % ΒιοΓενεξ ΓενοΜΞ 6ι ακο Αυτοσταινερ ακο Αυτοσταινερ Λινκ ακο Αυτοσταινερ πλυσ ακο Αυτοσταινερ Πλυσ Λινκ Λαβςισιον Αυτοσταινερ 3 67 Λειχα Βονδ Μαξ Λειχα Βονδ ΙΙΙ Νονε (Μανυαλ) ςεντανα Βενχηµαρκ ςεντανα Βενχηµαρκ ΥΛΤΡΑ ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ Πριντεδ ατ 15:22 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

76 Ρυν 96 ΑΛΙΜΕΝΤΑΡΨ ΤΡΑΧΤ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ Χ 117 Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 19/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 2/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Α452 (ρβ πολψ) ιλυτιον 1: 5 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ1 Χηροµογεν: ετεχτιον: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98) Πρεδιλυτεδ Χ 117 Μετηοδ 2 Παρτιχιπαντ σχορεδ 18/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 19/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Α452 (ρβ πολψ), 3 Μινσ, ρτ Χ ιλυτιον 1: 1 Αυτοµατιον: ακο Αυτοσταινερ Λινκ 48 ακο ΦΛΕΞ+ κιτ Μαιν Βυφφερ: ακο ΦΛΕΞ ωαση βυφφερ ακο ΠΤΛινκ, ΠΗ: 9 Χηροµογεν: ακο ΦΛΕΞ ΑΒ ετεχτιον: ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12), 3 Μινσ, ρτψ Χ Χ 117 Μετηοδ 3 Παρτιχιπαντ σχορεδ 18/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 19/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Α452 (ρβ πολψ), 15 Μινσ, 37 Χ ιλυτιον 1: 2 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ2 Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98), ΡΤ Χ., Τιµε 1: 1 Μινσ ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98), 8 Μινσ, ΡΤ Χ Πρεδιλυτεδ Χ 117 Μετηοδ 4 Παρτιχιπαντ σχορεδ 18/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: ακο Α452 (ρβ πολψ) ιλυτιον 1: 4 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα ιςιεω Κιτ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3) ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) Χηροµογεν: ετεχτιον: ςεντανα ιϖιεω ςεντανα ιςιεω σψστεµ (76 91) Πριντεδ ατ 15:22 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

77 Ρυν 96 ΑΛΙΜΕΝΤΑΡΨ ΤΡΑΧΤ ΠΑΤΗΟΛΟΓΨ Μοδυλε ΒΕΣΤ ΜΕΤΗΟ Σ ΟΓ1 Μετηοδ 1 Παρτιχιπαντ σχορεδ 18/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 19/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Λειχα ΝΧΛ Λ ΟΓ 1 (Κ9) ιλυτιον 1: 2 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959) Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ2 Χηροµογεν: ετεχτιον: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98) Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98) Πρεδιλυτεδ ΟΓ1 Μετηοδ 2 Παρτιχιπαντ σχορεδ 18/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 17/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Λειχα ΝΧΛ Λ ΟΓ 1 (Κ9), 3 Μινσ, ρτ Χ ιλυτιον 1: 1 Αυτοµατιον: ακο Αυτοσταινερ Λινκ 48 ακο ΦΛΕΞ+ κιτ Μαιν Βυφφερ: ακο ΦΛΕΞ ωαση βυφφερ ακο ΠΤΛινκ, Βυφφερ: ηιγη, ΠΗ: 9 Χηροµογεν: ακο ΦΛΕΞ ΑΒ ετεχτιον: ακο Ενςισιον ΦΛΕΞ+ ( Κ82/12), 3 Μινσ, ρτ Χ ΟΓ1 Μετηοδ 3 Παρτιχιπαντ σχορεδ 2/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 18/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Λειχα ΝΧΛ Λ ΟΓ 1 (Κ9), 15 Μινσ, 22 Χ ιλυτιον 1: 5 Αυτοµατιον: Λειχα Βονδ ΙΙΙ ςβσ ΒονδΜΑξ Ρεφινε ΚΙΤ Μαιν Βυφφερ: Βονδ Ωαση Βυφφερ (ΑΡ959), ΠΗ: 7.5 Λειχα Βονδ ΙΙΙ ΕΡ2, Βυφφερ: Βονδ Επιτοπε Ρετριεϖαλ Βυφφερ 2, ΠΗ: 8.8 Χηροµογεν: ςβσ Βονδ Πολψµερ Ρεφινε κιτ ( Σ98), 22 Χ., Τιµε 1: 1 Μινσ, Τιµε 2: 1 Μινσ ετεχτιον: Λειχα Βονδ Πολψµερ Ρεφινε ( Σ98), 8 Μινσ, 22 Χ Πρεδιλυτεδ ΟΓ1 Μετηοδ 4 Παρτιχιπαντ σχορεδ 18/2 (ΥΚ ΝΕΘΑΣ Σλιδε) ανδ 19/2 (Ιν Ηουσε σλιδε) υσινγ τηισ µετηοδ. Πριµαρψ Αντιβοδψ: Σπρινγ Βιοσχιενχεσ Μ331 (ρβ πολψ), 32 Μινσ, ΡΤ Χ ιλυτιον 1: 1:5 Αυτοµατιον: ςεντανα Βενχηµαρκ ΞΤ ςεντανα Υλτραςιεω ΑΒ Μαιν Βυφφερ: ςεντανα ρεαχτιον βυφφερ (95 3), ΠΗ: 7.4 ςεντανα Βενκ ΞΤ ΧΧ1 (Στανδαρδ) Χηροµογεν: ςεντανα Υλτραϖιεω ΑΒ, ΡΤ Χ., Τιµε 1: 8 Μινσ, Τιµε 2: 4 Μινσ ετεχτιον: ςεντανα Υλτραςιεω Κιτ (76 5), 16 Μινσ, 37 Χ Πρεδιλυτεδ Πριντεδ ατ 15:22 ον Τηυρσδαψ, 2 Φεβρυαρψ,

78 The HER2 ISH Module - Interpretive Run 25 Merdol Ibrahim, Suzanne Parry and 9 Reference Centres Gene Assessed: HER2 Sections circulated: Composite block containing cell line pellets (see below) Number of Registered Participants: 152 The Summary Box below gives details of the HER2 phenotype and genotype of the cell lines circulated for these assessments, which comprised of formalin fixed and paraffin processed sections from a composite block of four human breast carcinoma cell lines. The cell lines are the same ones which are used in the HER2 IHC module (results of the HER2 IHC module can be found in this and previous issues of Immunocytochemistry; and readers may wish to consult them for further details). The sections were positioned on the microscope slide as indicated. Cell line HER2 status by IHC 1 HER2 status by FISH 2 SK-BR-3 3+ Amplified MDA-MB Borderline: Amplified to Amplified MDA-MB Not amplified MDA-MB-231 negative Not amplified 1: Scored using Clinical Trials Assay system 2: FISH status as assessed by the UK NEQAS ICC & FISH reference laboratories (Bartlett et al., 27) AN IMPORTANT NOTE ABOUT THE TYPES OF PREPARATIONS WHICH ARE ASSESSED IN THIS MODULE Although this module has been up until this time entitled HER2 FISH, the organizers would like to make it clear that the submission of results from slides stained using chromogenic in-situ hybridisation (CISH) and silver in-situhybridisation (SISH) are equally acceptable, and are welcomed. Copy number data produced from slides stained using this approach will be assessed in a similar way to that produced by single colour FISH users i.e. against the copy number data produced by the reference centres. Cell Line Positioning: Cell lines are positioned on microscope slides, as illustrated below. Any variation in this pattern is indicated on distribution of the slides Slide Label Introduction After successful conclusion of the pilot phase we are pleased to announce that this is now a full UK NEQAS module. The results of the first pilot and a three year follow-up have now been published [1,2]. Furthermore, the scheme has allowed multiple ring studies to be undertaken and have allowed new methodologies, for example the Ventana silver ISH (SISH) [3], Kreatech FISH probes [4] and the Ventana Dual ISH (BDISH) [5] to be analysed. With the growing importance of colourimetric assays, both chromogenic and silver based in situ detection systems, the scheme has changed from a FISH to an ISH based scheme, where all molecular in situ assays for HER2 gene copy/amplification determination are included. This move reflects an ongoing development in chromogenic assay systems which it is envisaged will lead to a wider uptake of these assays within the diagnostic community. For UK laboratories carrying out diagnostic HER2 ISH testing participation is therefore mandatory under Clinical Pathology Accreditation (UK), and National Quality Assurance Advisory Panel (NQAAP) regulations. It should also be emphasised that the scheme remains very-much open to non-uk laboratories as an aid to monitoring and improving performance. Recommendations Diagnostic testing recommendations for HER2 ISH was originally published by Walker et at [6] but a more recent publication covering recommendations for both breast and gastric in-situ hybridisation methods is now available [7]. Assessment of Slides (rationale behind the adopted scoring system) Cell lines were selected to cover the critical diagnostic interval for the HER2 FISH test, where gene amplification is recognised if the ratio of HER2 signals to Chromosome 17 signals exceeds 2.. Previous evidence suggests that inter-observer error in scoring FISH signals can be controlled within 1% for both HER2 and other solid tissue analyses (Bartlett et al., 21, Bartlett, 25 for review). This results in a small population of cases (<2.% of cases, unpublished observations; FISH used as frontline test) where the result reported lies within a 1% range of the diagnostic interval, i.e. between 1.8 and 2.2. Whilst this compares favourably with the approximately 15% of cases reported as borderline by immunohistochemistry it UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 78

79 The HER2 ISH Module - Interpretive Run 25 How the scoring system works Schematic representation of the scoring system; the example illustrated uses the Reference Centre set of HER2/Ch17 ratios obtained for the SK-BR3 cell line at run 4. In this case the lowest ratio obtained by a Reference Centre was 3.19, and the highest 4.1; participants submitting ratios within this range were judged to have achieved an appropriate result (score = 3). The lower cut-off for acceptable ratios (score = 2) was calculated as 3.19 minus 1% of 3.19, that is 2.87; and the upper cut-off was calculated as 4.1 plus 1% of 4.1, that is Participants who submitted ratios out-with these 1% cut-offs were judged to have achieved an inappropriate and received a score of 1. Except in the case of the MDA-MB-453 cell line, misdiagnosis (amplified reported as nonamplified, and visa versa) resulted in a score of. Superscript notation and abbreviation used in figure: * = does not apply to results obtained for MDA-MB-453 cell line; RC = Reference Centre. highlights the need to rigorously control scoring approaches. Data suggest that allowing variation to increase by 5% (to 15%) would double the number of equivocal cases (to 4%) and allowing an increase to 2% variation at the diagnostic interval would lead to a four-fold increase in equivocal cases (Bartlett unpublished observations). These observations underpin the approach taken in assessing participants results. For each cell line, participants scored 3 points if the result reported fell within the range observed by the reference laboratories. These reference laboratory results already reflect the acceptable observer variation of 1% for inter-observer variation in scoring discussed above since they are collated from seven different laboratories, each of which presents two scores (up to 14 observations per cell line per assessment). Thus results must fall within this range to be regarded as appropriate. For each cell line participants scored 2 points if results lay within a further 1% of the range of results observed by the reference centres. These results reflect a band approximating to the 2% variation described above. Such results reflect acceptable performance with the potential for improvement. For results, which lay out with this second band of variation one point was given, representing inappropriate performance. For such specimens it is important to note that despite the correct diagnosis being given in many cases, a degree of variation >2% from the accepted result is indicative of a high degree of potential for error in diagnosis. In cases where results were not only deviating to this degree from the accepted result but were also misdiagnosed (e.g. where a non-amplified case is reported as amplified) a score of was recorded in recognition of the negative impact this has on the laboratories likely performance on diagnostic samples. Please note the following important rider: for the MDA-MB-453 cell line, where borderline results are often obtained and lie within the 2% margin-for-error described above, such results are NOT regarded as misdiagnoses for the purpose of this scheme. References 1. Bartlett JMS, Ibrahim M, Jasani B, et al. (27) External quality assurance of HER2 FISH testing: Results of a UK NEQAS pilot scheme. J Clin Pathol; 6: Bartlett JM, Ibrahim M, Jasani B, Morgan JM, Ellis I, Kay E, Connolly Y, Campbell F, O'Grady A, Barnett S, Miller K. (29) External quality assurance of HER2 FISH and ISH testing: three years of the UK national external quality assurance scheme. Am J Clin Pathol; 131: Bartlett JM, Campbell FM, Ibrahim M, Wencyk P, Ellis I, Kay E, Connolly Y, O'Grady A, Di Palma S, Starczynski J, Morgan JM, Jasani B, Miller K. (29) Chromogenic in situ hybridization: a multicenter study comparing silver in situ hybridization with FISH. Am J Clin Pathol; 132: Bartlett JM, Campbell FM, Ibrahim M, Thomas J, Wencyk P, Ellis I, Kay E, Connolly Y, O'Grady A, Barnett S, Starczynski J, Cunningham P, Miller K. (21) A UK NEQAS ICC and ISH multicentre study using the Kreatech Poseidon HER2 FISH probe: intersite variation can be rigorously controlled using FISH. Histopathology; 56: Bartlett JM, Campbell FM, Ibrahim M, O'Grady A, Kay E, Faulkes C, Collins N, Starczynski J, Morgan JM, Jasani B, Miller K. (211) A UK NEQAS ISH multicenter ring study using the Ventana HER2 dual-color ISH assay. Am J Clin Pathol; 135: Walker RA, Bartlett JM, Dowsett M, Ellis IO, Hanby AM, Jasani B, M i l l e r K, Pinder SE. (28) HER2 testing in the UK: further update to recommendations. J Clin Pathol; Bartlett JM, Starczynski J, Atkey N, Kay E, O'Grady A, Gandy M, Ibrahim M, Jasani B, Ellis IO, Pinder SE, Walker RA. (211) HER2 testing in the UK: r recommendations for breast and gastric in-situ hybridisation methods. J Clin Pathol; 64: UK NEQAS ICC & ISH. No part of this document can be copied or used without prior written consent 79