ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΤΜΗΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΓΟΝΙΔΙΑΚΩΝ ΑΛΛΑΓΩΝ ΣΤΑ ΓΟΝΙΔΙΑ NOS1 ΚΑΙ ASS1 ΣΤΗΝ ΑΥΞΗΣΗ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΗΣ ΕΜΒΡΥΙΚΗΣ ΑΙΜΟΣΦΑΙΡΙΝΗΣ ΕΛΛΗΝΩΝ ΑΣΘΕΝΩΝ ΜΕ β-μεσογειακη ΑΝΑΙΜΙΑ ΚΑΙ ΤΗΝ ΑΝΤΑΠΟΚΡΙΣΗ ΤΟΥΣ ΣΤΗΝ ΥΔΡΟΞΥΟΥΡΙΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ ΧΑΛΙΚΙΟΠΟΥΛΟΥ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΑ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΠΑΤΡΑ, ΙΟΥΛΙΟΣ

2 Επιβλέπων καθηγητής Γεώργιος Π. Πατρινός Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακευτικής Βιοτεχνολογίας και Φαρμακογενωμικής, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Τριμελής Εξεταστική Επιτροπή Γεώργιος Π. Πατρινός Αναπληρωτής Καθηγητής Φαρμακευτικής Βιοτεχνολογίας και Φαρμακογενωμικής, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Γενικής Βιολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Κωνσταντίνος Πουλάς Αναπληρωτής Καθηγητής Βιοχημείας, Τμήμα Φαρμακευτικής Πανεπιστημίου Πατρών 2

3 Ευχαριστίες Η παρούσα διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στα πλαίσια του Μεταπτυχιακού Προγράμματος στις Φαρμακευτικές Επιστήμες και την Τεχνολογία του τμήματος Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου Πατρών. Το εργαστηριακό μέρος πραγματοποιήθηκε στο Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας και Ανοσολογίας κατά τα ακαδημακαϊκά έτη , υπό την επίβλεψη του Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Πατρινού Γεώργιου. Αρχικά, θα ήθελα να ευχαριστήσω τον επιβλέποντα Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Γεώργιο Πατρινό για την ευκαιρία που μου έδωσε να εκπονήσω τη διπλωματική μου εργασία στο εργαστήριό του. Τον ευχαριστώ, επίσης, για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε. Ευχαριστίες οφείλω στον Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Φαρμακευτικής κ. Κωνσταντίνο Πουλά και στην Αναπληρώτρια Καθηγήτρια του Τμήματος Ιατρικής κα Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου για τη συμμετοχή τους στην εξεταστική επιτροπή της παρούσας εργασίας, καθώς και για την αγαστή συνεργασία τους. Ευχαριστώ, ακόμη, τη μεταδιδάκτορα Δρ. Κατσίλα Θεοδώρα για την υποστήριξή της, την άψογη συνεργασία και τις εποικοδομητικές συζητήσεις μας, τόσο στο πειραματικό, όσο και στο συγγραφικό κομμάτι κατά τη διεκπεραίωση της διπλωματικής μου εργασίας. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στις υποψήφιες διδάκτορες Γραβιά Κατερίνα και Χονδρού Βασιλική για τη σημαντική βοήθειά τους. Τέλος, θα ήθελα να ευχαριστησω όλα τα υπόλοιπα μέλη του εργαστηρίου για τη συνεργασία που είχαμε και το πολύ καλό κλίμα. Πάτρα, Ιούλιος

4 Περίληψη Οι αιμοσφαιρινοπάθειες, κυρίως η δρεπανοκυτταρική αναιμία και η β- θαλασσαιμία, συμπεριλαμβάνονται στις πιο κοινές μονονουκλεοτιδικές διαταραχές παγκοσμίως. Ο χαρακτηρισμός αρκετών μεταλλάξεων έχει συμβάλει σε μεγάλο βαθμό στην κατανόηση της μοριακής βάσης των θαλασσαιμικών συνδρόμων, ωστόσο, παραμένουν ακόμα και σήμερα βασικό πρόβλημα υγείας σε ολόκληρο τον κόσμο. Έχει παρατηρηθεί, ότι η επανεργοποίηση των γονιδίων της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) στους ενήλικες χρησιμοποιώντας φαρμακευτικά σκευάσματα, αποτελεί μια αισιόδοξη θεραπευτική προσέγγιση έναντι της β-θαλασσαιμίας. Το μόνο εγκεκριμένο φαρμακευτικό σκεύασμα από τον Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των Ηνωμένων Πολιτειών της Αμερικής (Food and Drug Administration, FDA) είναι η υδροξυουρία (HU), η οποία χρησιμοποιείται για τη βελτίωση των συμπτωμάτων της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Βέβαια, η ανταπόκριση των πασχόντων από β-θαλασσαιμία στη θεραπεία με HU ποικίλει. Xαρακτηριστικά, το 25% των ασθενών δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία. Με βάση τη μελέτη του Ma και των συνεργατών του, το 2007, επιλέχτηκαν δύο γονίδια μη συνδεδεμένα με το β-γονιδιακό τόπο, τα NOS1 και ASS1, τα οποία φαίνεται να σχετίζονται με την αύξηση των επιπέδων της HbF και την ανταπόκριση των ασθενών με δρεπανοκυτταρική αναιμία σε θεραπεία με HU. Στην παρούσα μελέτη, πιο συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η συσχέτιση των rs (NOS1), rs (ASS1) και rs (ASS1) με την αύξηση των επιπέδων της HbF ή/και με την ανταπόκριση στην HU. Σε αυτά τα πλαίσια, μελετήθηκαν πέντε πληθυσμιακές ομάδες ελληνικής καταγωγής: υγιή άτομα, πάσχοντες με μείζονα β- θαλασσαιμία, πάσχοντες με θαλασσαιμία μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων, «ανταποκρινόμενοι» στην HU και «μη ανταποκρινόμενοι» στην HU. Τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν στατιστικά σημαντική συσχέτιση των rs (ASS1) και rs (ASS1) με την ανταπόκριση στην HU σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία. Σημειώνεται πως οι εν λόγω πολυμορφισμοί βρίσκονται σε απόλυτη ανισορροπία σύνδεσης (D =1, r 2 =0,056), καθιστώντας πιθανή την ύπαρξη απλοτύπου. Σημαντικά, το εν λόγω εύρημα συνάδει με το ρόλο του ASS1 στο 4

5 βιοχημικό μονοπάτι παραγωγής του ΝΟ και του ρόλου του δεύτερου στην παραγωγή της HbF. Στον αντίποδα, ο rs (NOS1) δε φαίνεται να συσχετίζεται με την αύξηση των επιπέδων της HbF ή/ και την ανταπόκριση στην υδροξυουρία. 5

6 Abstract Hemoglobinopathies, especially sickle cell anemia and beta-thalassemia, are considered as the most common single nucleotide disorders worldwide. So far, the characterization of several mutations has contributed significantly towards the understanding of the molecular basis of thalassemia syndromes. However, great individual variability is still an important issue. In the context of therapeutic approaches, the reactivation of the fetal hemoglobin gene (HbF) in adults using pharmaceutical compositions has been characterized an optimistic and promising option. Today, hydroxyurea (HU) is the only FDA approved pharmaceutical formulation, which is used to improve the symptoms of sickle cell anemia. Of course, the patients response to treatment with HU varies greatly. Characteristically, a 25% of the patients upon HU treatment show no drug response. According to Ma et al. in 2007, two genes (namely, NOS1 and ASS1) located outside the beta-gene locus were found to be associated with increasing levels of HbF as well as HU response of patients with sickle cell anemia. Herein, we investigated the role of rs (NOS1), rs (ASS1) and rs (ASS1) in the increase of HbF levels and/ or HU response. For this, five population groups of Greek origin were studied: healthy subjects, patients with beta-thalassemia major, patients with transfusion-independent thalassemia, HU "responders" and HU "nonresponders". Our results indicate a statistically significant association of rs (ASS1) and rs (ASS1) in response to HU in patients with beta-thalassemia. A strong linkage disequilibrium holds for both SNPs (D =1, r 2 =0,056), implying a haplotype. Importantly, this finding is consistent with the role of ASS1 in the biochemical pathway of NO production and the role of NO in the production of HbF. In contrast, rs (NOS1) showed no correlation with either HbF levels or response to hydroxyurea. 6

7 Περιεχόμενα Ευχαριστίες..3 Περίληψη..4 Abstract..6 Α. Εισαγωγή.10 Α.1 Αίμα 11 Α.2 Αιμοσφαιρίνη.12 Α.2.1 Δομή της Αιμοσφαιρίνης 12 Α.2.2 Είδη Αιμοσφαιρίνης..14 Α.3 Εξελικτική πορεία της έκφρασης των γονιδίων της σφαιρίνης..14 Α.4 Δομή και οργάνωση γονιδίων αιμοσφαιρίνης..16 Α.5 Ρύθμιση έκφρασης γονιδίων σφαιρίνης 19 A.6 Γενετικοί τροποποιητές που επιδρούν στο β- γονιδιακό τόπο 22 A.7 Μονονουκλεοτιδικοί Πολυμορφισμοί (Single Nucleotides Polymorphisms- SNPs) Α.8 Αιμοσφαιρινοπάθειες.25 A.8.1 Δρεπανοκυτταρική Αναιμία (Sickle Cell Disorder- SCD)..25 A.8.2 Θαλασσαιμικά Σύνδρομα.27 Α α-θαλασσαιμία..27 A β-θαλασσαιμία 28 7

8 ι. Η μείζων β- θαλασσαιμία (Major Thalassemia).29 ιι. Η Θαλασσαιμία μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων (Non transfusion dependent thalassemia)..30 Α.9 Επανεργοποίηση της HbF ως πιθανή θεραπευτική στρατηγική..31 Α.10 Υδροξυουρία (Hydroxyurea- HU) 32 Α.11 NOS1 (Nitric oxide synthase 1)..34 Α.12 ASS1 (Argininosuccinate synthase 1).36 Α.13 Στόχος Εργασίας..38 Β. Υλικά και Μέθοδοι..39 Β.1 Δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη 40 B.2 Απομόνωση DNA (ολικό αίμα).40 Β.3 Προσδιορισμός συγκέντρωσης DNA 42 Β.4 Πολυμορφισμοί-στόχοι της παρούσας μελέτης.42 Β.5 Σχεδιασμός εκκινητών (primers)..44 Β.6 Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR)...45 Β.6.1 PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System) 48 B.6.2. PCR- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).49 Β.7 Διαδικασία και Αντιδραστήρια της PCR 51 B.8 Πρωτόκολλα κατά την εφαρμογή των PCR.51 Β.8.1 rs (NOS1).51 8

9 Β.8.2 rs (ASS1) 52 Β.8.3 rs (ASS1) 55 B.9 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης.56 Β.10 Καθαρισμός PCR-προιόντων.58 Β.11 Αλληλούχηση (sequencing) DNA κατά Sanger..59 Β.12 Στατιστική επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων 61 Β.12.1 Ισορροπία Hardy-Weinberg 61 Β.12.2 Αμφίπλευρος ακριβής έλεγχος του Fisher 63 Γ. Αποτελέσματα.65 Γ.1 Ανάλυση των πειραματικών δεδομένων 66 Γ.1.1 rs (NOS1)..66 Γ.1.2 ASS1 rs (ASS1).70 Γ.1.3 ASS1 rs (ASS1).74 Δ. Συζήτηση.79 Βιβλιογραφία 85 9

10 Α. Εισαγωγή 10

11 A.1 Αίμα Το αίμα είναι ένα σωματικό υγρό, το οποίο λειτουργεί ως «μέσο μεταφοράς» των απαραίτητων στοιχείων για τη φυσιολογική λειτουργία του οργανισμού. Μεταφέρει θρεπτικά συστατικά, ορμόνες (ρυθμιστές οργανικών λειτουργιών) και οξυγόνο από τους πνεύμονες στους ιστούς, ενώ συμμετέχει στη διαδικασία της ομοιόστασης, μεταφέροντας τη θερμότητα προς την επιφάνεια του σώματος. Από την άλλη, μεταφέρει διοξείδιο του άνθρακα από τους ιστούς προς τους πνεύμονες και καταβολικά προϊόντα προς τα όργανα απεκρίσεως. Ακόμα, συμβάλλει στην άμυνα του οργανισμού, μέσω των λευκών αιμοσφαιρίων και αντισωμάτων που εμπεριέχει. Το αίμα αποτελείται από κύτταρα τα οποία αιωρούνται στο πλάσμα. Το πλάσμα περιέχει οργανικές διαλυτές ουσίες (πρωτεΐνες), θρεπτικές ουσίες, μεταβολικά παραπροϊόντα και μεταλλικούς ηλεκτρολύτες. Τα κύτταρα του αίματος κατηγοριοποιούνται σε ερυθροκύτταρα, λευκοκύτταρα και αιμοπετάλια. Τα πιο πολυπληθή κύτταρα είναι τα ερυθροκύτταρα, τα οποία μεταφέρουν οξυγόνο στους ιστούς. Τα ερυθροκύτταρα έχουν το σχήμα αμφίκοιλου δίσκου και περιέχουν μεγάλες ποσότητες μιας πρωτείνης, της αιμοσφαιρίνης. Στην αιμοσφαιρίνη προσδένεται το οξυγόνο αλλά και το διοξείδιο του άνθρακα (σε μικρότερο βαθμό). Τα λευκοκύτταρα είναι υπεύθυνα για την προστασία του οργανισμού από μολύνσεις. Τα αιμοπετάλια, ουσιαστικά είναι άχρωμα θραύσματα κυττάρων και συμβάλλουν στην πήξη του αίματος (Vender A., 2011). Εικόνα 1: Απεικόνιση ενός ερυθροκυττάρου, ενός αιμοπεταλίου και ενός λευκοκυττάρου ( 11

12 Α.2. Αιμοσφαιρίνη Α.2.1 Δομή της Αιμοσφαιρίνης Στα τέλη του 1960, ο νομπελίστας Max Perutz και οι συνεργάτες του εξήγησαν τη συσχέτιση της λειτουργίας της αιμοσφαιρίνης με τη δομή της. Αυτή η πληροφορία οδήγησε στη διευρένηση πολλών μεταλλάξεων στα γονίδια της σφαιρίνης, που βρέθηκαν να προκαλούν αλλαγές στη λειτουργία της και συνεπώς, να διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στις αιμοσφαιρινοπάθειες. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 60 χρόνων, η μελέτη της ανθρώπινης αιμοσφαίρινης (Hemoglobin, Hb) έχει οδηγήσει στη γέννηση και ωρίμανση της μοριακής ιατρικής. Η ανθρώπινη αιμοσφαιρίνη αποτελείται από τέσσερις αλυσίδες σφαιρίνης, ανά δύο όμοιες (α- και β σφαιρίνες), οι οποίες καλούνται ομόλογες και σχηματίζουν ένα σφαιρικό τετραμερές μόριο, καθώς οι τέσσερις αυτές αλυσίδες συνδέονται μεταξύ τους και αναδιπλώνονται. Η γενική μορφή της ενήλικης αιμοσφαιρίνης είναι η α2β2 (HbA). Σε κάθε αλυσίδα σφαιρίνης είναι προσδεδεμένη σε συγκεκριμένη θέση μια προσθετική ομάδα, η αίμη (Schechter N.A., 2008; Patrinos G.P. and Antonarakis E.S., 2010). 12

13 Εικόνα 2: Η X-ray καθορισμένη δομή του μορίου της αιμοσφαιρίνης και απεικόνιση της υψηλής συγκέντρωσης της στα ερυθροκύτταρα (Schechter N.A., 2008) Η αίμη παρέχει στην αιμοσφαιρίνη την ικανότητα να προσδένει οξυγόνο και είναι υπεύθυνη για το χαρακτηριστικό κόκκινο χρώμα του αίματος. Αποτελείται από ένα κεντρικό άτομο σιδήρου και έναν πρωτοπορφυρινικό δακτύλιο. Η πρωτοπορφυρίνη αποτελείται από τέσσερις πυρρολικούς δακτυλίους. Το άτομο το σιδήρου βρίσκεται στο κέντρο της πρωτοπορφυρίνης, είναι ενωμένο με τέσσερα πυρρολικά άτομα αζώτου και σε κανονικές συνθήκες είναι στην κατάσταση οξείδωσης Fe 2+. Επίσης, το εν λόγω άτομο σιδήρου διαθέτει δυο θέσεις πρόσδεσης, την πέμπτη και έκτη θέση συναρμογής. Στην πέμπτη θέση συναρμογής προσδένεται ένας ιμιδαζολικός δακτύλιος ενός καταλοίπου ιστιδίνης και στην έκτη θέση προσδένεται το μόριο του οξυγόνου (Berg M.J., 2007). Συνεπώς, οι τέσσερις αλυσίδες σφαιρίνης και η καθεμία με την αντίστοιχη ομάδα αίμης αποτελούν το λειτουργικό μόριο της αιμοσφαιρίνης (Patrinos G.P. and Antonarakis E.S., 2010). Τα κύρια χαρακτηριστικά της δομής των σφαιρινών έχουν διατηρηθεί κατά τη διάρκεια της εξέλιξης και είναι ιδιαίτερα σημαντικά για την κατανόηση των αιμοσφαιρινοπαθειών. Το κυριότερο αφορά τη συντηρημένη τριτοταγή δομή των 13

14 πολυπεπτιδικών αλυσίδων, καθώς σχεδόν όλες οι σφαιρίνες που έχουν μελετηθεί έχουν επτά ή οκτώ έλικες. Συγκεκριμένα, στην ανθρώπινη σφαιρίνη, η α- αλυσίδα φέρει επτά α- έλικες και η β-αλυσίδα φέρει οκτώ (Thompson &Thompson, 2011). Ακόμα, οι αλυσίδες σφαιρίνης είναι είτε τύπου-α (α-like) είτε τύπου-β (β-like) και σε κάθε περίπτωση, οι αλυσίδες αυτές αποτελούνται από 141 και 146 αμινοξέα αντίστοιχα. Αλυσίδες τύπου-α είναι η ζ- και η α- σφαιρίνη, ενώ τύπου-β είναι η ε-, η γ-, η δ- και η β- σφαιρίνη.οι περισσότερες φυσιολογικές ανθρώπινες σφαιρίνες, οι οποίες εκφράζονται σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια, έχουν ίδιες α-αλυσίδες ενώ, διαφέρουν μεταξύ τους στις μη τύπου α- αλυσίδες (non-a) (Patrinos G.P. and Antonarakis E.S., 2010). Α.2.2 Είδη Αιμοσφαιρίνης Η κύρια αιμοσφαιρίνη των ενήλικων και των παιδιών είναι η αιμοσφαιρίνη τύπου Α (Hemoglobin A, HbA), η οποία αποτελείται από δυο αλυσίδες α και δυο β, έχει δηλαδή τη μορφή α2β2. Στους ενήλικες, ακόμη, συναντάται μικρή ποσότητα (<3%) της αιμοσφαιρίνης HbA2 (α2δ2). Η δ- αλυσίδα διαφέρει μόνο κατά 10 αμινοξέα από τη β- αλυσίδα. Παρούσα, επίσης, είναι και η εμβρυική αιμοσφαιρίνη HbF (α2γ2) σε μικρό ποσοστό (<2%) (Schechter N.A., 2008; Patrinos G.P. and Antonarakis E.S., 2010). Η εμβρυική αιμοσφαιρίνη είναι η κύρια αιμοσφαιρίνη του εμβρύου, η οποία αντικαθίσταται σχεδόν πλήρως από την αιμοσφαίρινη Α περίπου 6 μήνες μετά τη γέννηση. Η εμβρυική αιμοσφαιρίνη έχει μεγαλύτερη συγγένεια πρόσδεσης του οξυγόνου από την αιμοσφαιρίνη Α, οπότε παρέχεται καλύτερη πρόσβαση οξυγόνου στο νεογνό. Α.3 Εξελικτική πορεία της έκφρασης των γονιδίων της σφαιρίνης Ιδιαίτερο χαρακτηριστικό της αιμοσφαιρίνης αποτελεί η σύνθεσή της υπό διαφορετικές μορφές, ανάλογα με τα διαφορετικά στάδια της ανάπτυξης. Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι οι χρονικές μεταβολές στη σύνθεση των 14

15 σφαιρινών συνοδεύονται από αλλαγές στο όργανο στο οποίο γίνεται η ερυθροποίηση. Η αλλαγή αυτή στην έκφραση των διάφορων γονιδίων των σφαιρινών κατά την ανάπτυξη ονομάζεται «μεταστροφή σφαιρινών» (hemoglobin switching) (Thompson &Thompson, 2011). Οι βασικές θέσεις που πραγματοποιείται η ερυθροποίηση είναι ο λεκιθικός σάκος, το ήπαρ και ο σπλήνας. Εκτός από την HbA, υπάρχουν ακόμη πέντε φυσιολογικές σφαιρίνες, με τετραμερή δομή παρόμοια με αυτή της HbA. Η κάθε μια αποτελείται από δυο αλυσίδες α-σφαιρίνης ή τύπου α-σφαιρίνης και δυο αλυσίδες μη α-σφαιρίνης. Αυτές είναι η HbA2 (α2δ2), η HbF (α2γ2), η Hb Gower 1 (ζ2ε2), η Hb Gower 2 (α2ε2) και η Hb Portland (ζ2γ2). Εικόνα 3: Τύποι αιμοσφαιρίνης κατά τα διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια του ανθρώπου (Schechter N.A., 2008) Η σύνθεση των εμβρυικών σφαιρινών γίνεται στο λεκιθικό σάκο από την τρίτη έως και την όγδοη εβδομάδα της κύησης, ωστόσο, από την πέμπτη περίπου εβδομάδα, η κύρια θέση ερυθροποίησης μετατοπίζεται στο εβρυικό ήπαρ (Thompson &Thompson, 2011). Αρχικά, εκφράζονται τα γονίδια για τις ζ- και ε- αλυσίδες, οδηγώντας στο σχηματισμό των αιμοσφαιρινών Gower 1, Gower 2 και Portland. Οι αλυσίδες ζ- και ε- εξαφανίζονται ύστερα από 8-10 εβδομάδες της εμβρυονικής ζωής, καθώς τα αντίστοιχα γονίδιά τους αποσιωπώνται και ενεργοποιείται η έκφραση της γ- αλυσίδας στο ήπαρ του εμβρύου. Η κύρια αιμοσφαιρίνη του εμβρύου είναι η HbF. Υπάρχουν δυο είδη γ-αλυσίδας με αρκετές 15

16 ομοιότητες, αυτή με την αλανίνη στη θέση 136 ( Α γ) και αυτή με τη γλυκίνη στην ίδια ακριβώς θέση ( G γ) (Suzuki M.,2014; Patrinos G.P. and Antonarakis E.S., 2010). Στη συνέχεια, κοντά στη χρονική περίοδο της γέννησης, αρχίζει να μειώνεται η έκφραση της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης, ενεργοποιείται η έκφραση των γονιδίων των αλυσίδων τύπου-β και τα γονίδια της α-αλυσίδας είναι πλήρως ενεργοποιημένα. Ως εκ τούτου, μέχρι το τέλος του πρώτου χρόνου ζωής, οι σφαιρίνες HbA και HbA2 είναι κυρίαρχες (Schechter N.A., 2008). Εικόνα 4: Αναπτυξιακό διάγραμμα έκφρασης των γονιδίων των σφαιρινών στον άνθρωπο (Patrinos G.P. and Antonarakis E.S., 2010) Α.4 Δομή και οργάνωση γονιδίων αιμοσφαιρίνης Η αλυσίδα των αμινοξέων σε κάθε σφαιρινική αλυσίδα καθορίζεται από ένα συγκεκριμένο γονίδιο σφαιρίνης. Τα ανθρώπινα γονίδια σφαιρίνης είναι διαταγμένα σε πολυγονιδιακά συμπλέγματα (multigene clusters) και συγκεκριμένα στον α- και β- γονιδιακό τόπο. Τα πολυγονιαδικά αυτά συμπλέγματα εμφανίζονται ως συχνή μορφή οργάνωσης των γονιδίων θηλαστικών. 16

17 Το σύμπλεγμα των γονιδίων της α-σφαιρίνης (HBAC) εδράζεται στο 16 ο χρωμόσωμα, στη θέση p13.3(schechter N.A., 2008). Περιέχει με τη σειρά, από το 5 προς το 3 άκρο, τα γονίδια HBZ, το ψευδογονίδιο HbZP, δυο ψευδογονίδια α- σφαιρίνης HBAP2 και HBAP1, τα γονίδια HBA2, HBA1 και τέλος το γονίδιο HbQ. Εικόνα 5: Το σύμπλεγμα των γονιδίων της α-σφαιρίνης (Patrinos G.P. and Antonarakis S.E., 2010) Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 5, το γονίδιο της α-σφαιρίνης υπάρχει σε δυο αντίγραφα (HbA2,HbA1), τα οποία οδηγούν στην παραγωγή ενός ταυτόσημου πρωτεϊνικού προιόντος. Βέβαια, το HbA2 εκφράζεται πιο ισχυρά από το HbA1.Το γονίδιο HbZ είναι υπεύθυνο για την έκφραση της ζ- αλυσίδας, ενώ το HbQ, του οποίου η λειτουργία δεν είναι γνωστή, είναι υπέυθυνο για την έκφραση της θ- σφαιρινικής αλυσίδας. Το σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης (HBBC) εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 11, στη θέση p15.5 και αποτελείται από πέντε λειτουργικά γονίδια. Αυτά είναι το ΗΒΕ, το G γ- HBG2, το Α γ- HBG1, το HBD και το HBB, τα οποία είναι υπεύθυνα για την έκφραση των σφαιρινικών αλυσίδων ε-, Gγ-, Aγ-, δ- και β- αντιστοίχως. 17

18 Εικόνα 6: Το σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης (Patrinos G.P. and Antonarakis S.E., 2010) Ανάμεσα στα γονίδια που είναι υπεύθυνα για τη γ- σφαιρίνη ( G γ- HBG2, Α γ- HBG1) και του γονιδίου της δ- αλυσίδας (HBD) παρεμβάλεται ένα ψευδογονίδιο της β- αλυσίδας (HBBP). Και τα δύο πολυγονιδιακά συμπλέγματα, εκτός από τα μεταγραφόμενα γονίδια με τις εγγύς ρυθμιστικές τους αλληλουχίες, περιλαμβάνουν και ρυθμιστικές περιοχές στο 5 άκρο τους. Οι ρυθμιστικές αυτές περιοχές συμβάλουν στην υψηλή, εξειδικευμένη ανά ιστό και ελεγχόμενη έκφραση των γονιδίων σφαιρίνης. Συγκεκριμένα, το σύμπλεγμα της α-αλυσίδας φέρει μια αρκετά ευαίσθητη περιοχή, τον HS-40 ενισχυτή και το σύμπλεγμα της β- αλυσίδας φέρει μια περιοχή ελέγχου του γονιδιακού τόπου (Locus Control Region, LCR), η οποία βρίσκεται 6-22 kb ανοδικά του γονιδίου της ε-σφαιρίνης (Schechter N.A., 2008). Η κύρια ιδιότητα της LCR περιοχής έιναι η δράση της ως ισχυρό μεταγραφικό ενισχυτή και είναι εξειδικευμένη ανα ιστό έκφρασης, για αυτό η έκφραση των γονιδίων σφαιρίνης είναι περιορισμένη στα ερυθρά κύτταρα. Η LCR ορίζεται από πέντε περιοχές του DNA (5 HSs 1 to 5) οι οποίες είναι υπερευαίσθητες στο ένζυμο DNAση 1. Η δραστηριότητα του ενισχυτή στο σύμπλεγμα της β-σφαιρίνης, εντοπίζεται στις περιιοχές 5 HS2, 3, και 4, αλλά όχι στις 5 HS1 ή 5. Αυτές οι περιοχές (HSs) είναι απαραίτητες για τη διατήρηση μιας ανοιχτής χρωματινικής διαμόρφωσης στο γενετικό τόπο, που επιτρέπει την πρόσβαση των μεταγραφικών παραγόντων στις ρυθμιστικές αλληλουχίες των γονιδίων του συπλέγματος της β- σφαιρίνης. Η περιοχή LCR μαζί με τις προσδενόμενες στο DNA πρωτείνες, αλληλεπιδρά με τα γονίδια του γενετικού τόπου, σχηματίζοντας μια περιοχή, γνωστή ως κόμβο της ενεργής χρωματίνης (Active Chromatin Hub, ACH), στο πυρήνα. Στη περιοχή αυτή, λαμβάνει χώρα η έκφραση γονιδίων του συμπλέγματος. 18

19 Η διαδοχική μεταστροφή της γονιδιακής έκφρασης κατά την ανάπτυξη, οφείλεται στη διαδοχική αλληλεπίδραση του κόμβου ενεργης χρωματίνης με τα διάφορα γονίδια του συμπλέγματος καθώς αυτό μετακινείται από το γονίδιο που εντοπίζεται στο άκρο 5 προς αυτά που βρίσκονται στο 3 ( γόνιδια δ- και β- σφαιρίνης) (Thompson &Thompson, 2011; Li et al, 2002). Η διάταξη των γονιδίων και στα δύο παραπάνω συμπλέγματα από το 5 προς το 3 άκρο, είναι σχετική με τη σειρά έκφρασης των διαφορετικών τύπων αλυσίδων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του ανθρώπου. Ακόμα, όλα τα γονίδια σφαιρίνης έχουν αρκετές λειτουργικές ομοιότητες στην οργάνωσή τους. Συγκεκριμένα, τρα εξόνια είναι υπεύθυνα για τη κωδικοποίηση μιας αμινοξικής αλληλουχίας κάθε αλυσίδας σφαιρίνης. Ανάμεσα στα εξόνια, παρεμβάλονται ιντρονικές αλληλουχίες (IVS) (Schechter N.A., 2008; Patrinos G.P. and Antonarakis E.S., 2010 ; Suzuki M., 2014; Patrinos GP, 2005). Α.5 Ρύθμιση έκφρασης γονιδίων σφαιρίνης Η έκφραση των γονιδίων των σφαιρινών ρυθμίζεται, κυρίως, στο επίπεδο της μεταγραφής, από εγγύς και άπω cis- ρυθμιστικά στοιχεία. Υποκινητές, ενισχυτές και αποσιωπητικές αλληλουχίες ελέγχουν την κατάλληλη αναπτυξιακή έκφραση των μεμονωμένων γονιδίων σφαιρίνης. Κάθε κοντινό ρυθμιστικό στοιχείο (όπως ο υποκινητής, ο ενισχυτής ή ο αποσιωπητής) διαθέτει θέσεις δέσμευσης για μεταγραφικούς παράγοντες, που αλληλεπιδρούν με άλλους συμπαράγοντες, ώστε να ρυθμίσουν τη γονιδιακή έκφραση. Κάθε γονίδιο σφαιρίνης διαθέτει ένα χαρακτηριστικό μοτίβο θέσεων πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων, που αποτελείται από την αλληλουχία TATA ( TATA box ), συνοδευόμενη από δύο άλλες χαρακτηριστικές αλληλουχίες, την CCAAT ( CCAAT box ) και την CACCC ( CACCC box ). Επιπλέον, μείζονος σημασίας ρυθμιστικά στοιχεία, που εδράζονται στο 5 άκρο κάθε γονιδιακού συμπλέγματος, όπως η υπερευαίσθητη θέση HS-40 στον α-γονιδιακό τόπο και η περιοχή τοπικού ελέγχου (Locus Control Region, LCR) στο β-γονιδιακό τόπο, συνεισφέρουν στην 19

20 υψηλή, ιστο-ειδική και αναπτυξιακά ελεγχόμενη έκφραση των γονιδίων σφαιρίνης. Τα εγγύς ρυθμιστικά στοιχεία πιστεύεται ότι αλληλεπιδρούν με τις LCR, ώστε να επιτευχθεί ο έλεγχος της έκφρασης κάθε μεμονωμένου γονιδίου στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια στο κόμβο της ενεργής χρωματίνης. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, ρυθμιστικό ρόλο παίζουν και άλλοι συμπαράγοντες (GATA-1, EKLF), οι οποίοι μπορεί να αλληλεπιδρούν με την LCR. Συγκεκριμένα, GATA αλληλουχίες, οι οποίες προσδένονται σε GATA-1 ρυθμιστικές μεταγραφικές ρυθμιστικές πρωτεΐνες, έχουν βρεθεί στα γονιδιακά συμπλέγματα των σφαιρινών και εμφανίζουν ισχυρή ερυθροειδική ειδικότητα. Από την άλλη, ο EKLF/KLF-1 trans-ρυθμιστικός παράγοντας της μεταγραφής, εμφανίζει ισχυρή ειδικότητα για τη θετική ρύθμιση του γονιδίου της β-σφαιρίνης. Στην εικόνα 7, παρουσιάζεται ένα σχετικά απλό μoντέλο για τον τρόπο ρύθμισης της αναπτυξιακής έκφρασης των γονιδίων του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης, μέσω των παραπάνω αλληλεπιδράσεων. Εικόνα 7: Απλοποιημένο μοντέλο ρύθμισης της μεταγραφής των γονιδίων της β-σφαιρίνης κατά τα διάφορα στάδια ανάπτυξης ( Schechter N.A., 2008) 20

21 Έχει αποδειχτεί ότι η LCR και συγκεκριμένα, οι υπερευαίσθητες περιοχές που την αποτελούν, παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμση της διαφορετικής έφρασης των γονιδίων της β-σφαιρίνης στα διάφορα αναπτυξιακά στάδια. Αυτές οι περιοχές δρούν, είτε μόνες τους, είτε ως ομάδα, ως ένας μείζων ρυθμιστής του β-γονιδιακού τόπου. Πιστεύεται ότι κάποιες ή όλες από αυτές της περιοχές της LCR, αλληλεπιδρούν με τα γονίδια της σφαιρίνης και με κάποιο τρόπο «ανοίγουν» τη χρωματίνη, επιτρέποντας την πρόσβαση στα σχετικά τμήματα, σε μεταγραφικούς παράγοντες και σε trans-acting συμπαράγοντες. Είναι αξιοσημείωτο ότι έχει βρεθεί ένας τεράστιος αριθμός μοτίβων DNA στα συμπλέγματα σφαιρίνης, τα οποία φαίνεται πως αποτελούν θέσεις πρόσδεσης για μια ποικιλία πρωτεϊνών και συνεπώς, συμβάλλουν στην ενίσχυση ή αποσιώπηση της μεταγραφής, αποδεικνύοντας την πολυπλοκότητα του συστήματος αυτού. Μεταλλάξεις σε οποιονδήποτε από τους παραπάνω παράγοντες μπορεί να επηρεάσουν τη μεταγραφή των γονιδίων και να οδηγήσουν σε θαλασσαιμικά σύνδρομα (Schechter N.A., 2008; Patrinos GP, 2010; Ma Y. et al.,2013). Αναφέρθηκε παραπάνω ότι όλα τα γονίδια διαθέτουν συγκεκριμένο μοτίβο θέσεων πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων. Συγκεκριμένα, ο υποκινητής του HBE γονιδίου διαθέτει TATA, CCAAT και CACCC κουτιά καθώς και περιοχές πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων, όπως ο GATA-1. Οι υποκινητές των εμβρυϊκών γονιδίων (HBG1 και HBG2) φέρουν διπλό το κουτί "CCAAT". Και στους δυο υποκινητές εντοπίζονται πολλές μεταλλάξεις, κυρίως σε ρυθμιστικές αλληλουχίες και έχουν ως αποτέλεσμα τα αυξημένα ποσοστά της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης στους ενήλικες, μια κατάσταση γνωστή ως «Κληρονομική Παραμονή Εμβρυικής Αιμοσφαιρίνης» (Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin HPFH). Σχετικά με το γονίδιο HBB, ο υποκινητής είναι αντίστοιχα οργανωμένος, αν και φέρει δυο CACCC κουτιά. Από αυτά τα δύο, το πιο κοντινό κουτί στο γονίδιο είναι αυτό με τον πιο σημαντικό λειτουργικό ρόλο. Σημειώνεται, εδώ, πως οι παράγοντες GATA-1 και KLF-1 είναι οι πιο σημαντικοί ερυθροειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες που προσδένονται στον υποκινητή του γονιδίου της β-αλυσίδας. Παρόλο που οι σφαιρινικές αλυσίδες που κωδικοποιούν τα γονίδια HBB και HBD διαφέρουν μόνο 21

22 κατά 10 αμινοξέα, οι υποκινητές τους διαφέρουν σημαντικά. Αποτέλεσμα αυτού, είναι και η μειωμένη έκφραση της HBA2 αιμοσφαιρίνης (Cao and Galanello, 2010). Εικόνα 8: Απεικόνιση των cis- ρυθμιστικών στοιχείων στους υποκινητές των γονιδίων της ανθρώπινης β-τύπου σφαιρίνης ( Patrinos GP & Antonarakis E.S., 2010) A.6 Γενετικοί τροποποιητές που επιδρούν στο β- γονιδιακό τόπο Η έμφυτη ικανότητα παραγωγής της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης και η α- θαλασσαιμία είναι οι δύο κύριοι τροποποιητές της β-θαλασσαιμίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Ωστόσο, αυτοί οι τροποποιητές δεν εξηγούν την κλινική ετερογένεια της ασθένειας και για αυτό, ερευνάται η αλληλεπίδραση και επιπρόσθετων γενετικών τροποποιητών με το γονίδιο HBB και το περιβάλλον. Ακόμα, έχει παρατηρηθεί συσχέτιση ανάμεσα στην κληρονομικότητα των πολυμορφισμών που επηρεάζουν μεμονωμένα νουκλεοτίδια ή μοτίβα αυτών κοντά στο HBB και τα αυξημένα επιπέδα της HbF. Ο πιο γνωστός από αυτούς τους πολυμορφισμούς (ένας κοινός, C σε T, SNP) εντοπίζεται στη θέση -158 στον υποκινητή της Gγ σφαιρίνης και δημιουργεί την Xmn1-Gγ περιοριστική θέση (Schechter N.A., 2008). Τα cis- δραστικά στοιχεία, όπως ο παραπάνω πολυμορφισμός, αποτελούν το 10-30% αυτών που προσδίδουν ποικιλότητα χαρακτηριστικών, σε αντίθεση με αυτά 22

23 που δεν είναι συνδεδεμένα με το β-γονιδιακό τόπο (trans-δραστικά στοιχεία), όπως οι «γονιδιακοί τόποι ποσοτικών γνωρισμάτων» (Quantitative Trait Loci - QTL) στα χρωμοσώματα Xp22, 6q23, 8q11 και 2p15, οι οποίοι προσδίδουν το 50%. Ο μηχανισμός με τον οποίο αυτοί οι γονιδιακοί τόποι επιδρούν στα επίπεδα της HbF και των F-κυττάρων παραμένει άγνωστος. Μετά από έρευνες προσδιορίστηκαν τρεις κύριοι ποσοτικοί γονιδιακοί τόποι που επηρεάζουν τα επίπεδα της HbF. Σε αυτούς περιελαμβάνεται μια περιοχή του χρωμοσώματος 2 εσωτερικά του γονιδίου BCL11A, μια διαγονιδιακή περιοχή μεταξύ των γονιδίων HBSIL1 και MYB στο χρωμόσωμα 6 και τέλος, πολυμορφισμοί στο β- γονιδιακό τόπο στο χρωμόσωμα 11. Τα επίπεδα της πρωτεΐνης BCL11A φαίνεται να συσχετίζονται με το αναπτυξιακό στάδιο της έκφρασης. Συγκεκριμένα, η BCL11A δρα ως καταστολέας των γονιδίων της γ-σφαιρίνης. Τέλος, η «HBS1L-MYB διαγονιδιακή περιοχή» (HBS1L-MYB intergenic region, HMIP) στην περιοχή 6q23 επιδρά στην έκφραση των γονιδίων της εμβρυικής αιμοσφαιρίνης (Suzuki M., 2014). Στην εικόνα 9, παρουσιάζεται ένα μοντέλο αλληλεπίδρασης των παραπάνω παραγόντων κατά τη διάρκεια της έκφρασης των γονιδίων του β-γονιδιακό τόπου. Εικόνα 9: Απεικόνιση ενός μοντέλου αποσιώπησης της έκφρασης της ε- και γ-αλυσίδας (Suzuki M., 2014). 23

24 A.7 Μονονουκλεοτιδικοί Πολυμορφισμοί (Single Nucleotides Polymorphisms- SNPs) Οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί είναι μικρές σημειακές αλλαγές στην αλληλουχία του DNA. Έχει εκτιμηθεί ότι εμφανίζονται στο γονιδίωμα κατά μέσο όρο ανά βάσεις και αποτελούν το 90% περίπου των αλλαγών στην αλληλουχία του DNA (Ye S., 2001). Οι περισσότεροι από τους πολυμορφισμούς δεν επηρεάζουν την υγεία ή την ανάπτυξη ενός οργανισμού, αλλά μπορεί να είναι πολύ σημαντικοί για τη μελέτη της ανθρώπινης υγείας. Η συχνότητα εμφάνισής τους στο γονιδίωμα τους καθιστά ιδανικούς για τη μελέτη περίπλοκων ασθενειών (Brumfield T.R., 2003; Ye S., 2001). Επίσης, είναι χρήσιμοι ως γενετικοί μάρτυρες στη πληθυσμιακή γενετική, για την πιθανότητα εκδήλωσης συγκεκριμένων ασθενειών και για την απόκριση σε μια φαρμακευτική αγωγή. Η χαρτογράφηση των γονιδίων του συμπλέγματος της β-σφαιρίνης μέσω περιοριστικών ενζύμων, οδήγησε στην αναγνώριση και εύρεση πολλών μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών. Έχουν βρεθεί τουλάχιστον 17 SNPs στο σύμπλεγμα της β σφαιρίνης καθώς και στο γονίδιο HBB. Κάποιοι SNPs στο σύμπλεγμα αυτό έχουν ανιχνευτεί σε διαφορετικές ρυθμιστικές περιοχές του και συσχετίζονται με διαφορετικές μεταλλάξεις των γονιδίων HBB και HBD γονιδίου, καθώς και με διαφορετικούς φαινότυπους ως προς τη σοβαρότητα ασθενειών (όπως η β-θαλασσαιμία και η δρεπανοκυτταρική αναιμια). Τέλος, υπάρχουν συγκεκριμένα μοτίβα των SNPs σε ένα χρωμόσωμα, οι απλότυποι. Αυτοί, χρησιμοποιούνται ως διαγνωστικά εργαλεία και μόνο λίγα από αυτά μπορούν να εντοπιστούν στο γονιδίωμα διαφορετικών εθνοτήτων (Thompson &Thompson, 2011). 24

25 Α.8 Αιμοσφαιρινοπάθειες Ως αιμοσφαιρινοπάθειες αναφέρουμε μια ποικιλία κληρονομήσιμων ασθενειών, οι οποίες είναι από τα πιο συχνά και παράλληλα από τα πιο καταβλητικά προβλήματα υγείας παγκοσμίως. Είναι πιο διαδεδομένες στους πληθυσμούς Ασιατικής και Αφρικανικής καταγωγής, καθώς και σε αυτούς που ζουν στην περιοχή της Μεσογείου. Οι αιμοσφαιρινοπάθειες αποτελούν μονογονιδιακές διαταραχές και συγκεκριμένα, προκαλούνται από γενετικά ποιοτικά ή ποσοτικά ελαττώματα κατά την παραγωγή μορίων των αιμοσφαιρίνης. To 7% του πληθυσμού παγκοσμίως είναι φορέας τουλάχιστον μιας μετάλλαξης σε γονίδιο σφαιρίνης. Γενετικές παραλλαγές μπορούν να συμβούν είτε σε trans είτε σε cis περοχές στα συμπλέγματα αυτά. Στις αιμοσφαιρινοπάθειες συγκαταλέγονται η δρεπανοκυτταρική αναιμία (sickle cell disorder- SCD) και τα θαλασσαιμικά σύνδρομα (Gravia et al., 2014; Patrinos GP, 2005). A.8.1 Δρεπανοκυτταρική Αναιμία (Sickle Cell Disorder- SCD) Η δρεπανοκυτταρική αναιμία είναι μια αυτοσωμική υπολειπόμενη ασθένεια. Η ανακάλυψη από τον Linus Pauling και τους συνεργάτες του το 1949 ότι η νόσος οφείλεται στο σχηματισμό μιας ανώμαλης αιμοσφαιρίνης, οδήγησε σε πλήθος προοπτικών για τη μοριακή ιατρική. Συγκεκριμένα, η δρεπανοκυτταρική αναιμία οφείλεται στην υποκατάσταση της βαλίνης από το γλουταμινικό οξύ στο έκτο κωδικόνιο της β-σφαιρινικής αλυσίδας (Pleasants S., 2014). Στην δρεπανοκυτταρική αναιμία, ως εκ τούτου, η πλειοψηφία των ερυθροκυττάρων αποκτούν το σχήμα δρεπανιού και ημισελήνου. Αυτά τα δρεπανοκυτταρικά ερυθροκύτταρα παγιδεύονται στα μικρά αιμοφόρα αγγεία, δυσχεραίνοντας έτσι την κυκλοφορία του αίματος και επάγοντας την καταστροφή 25

26 πλήθους οργάνων. Επιπλέον, τα δρεπανοκύτταρα είναι πιο εύθραυστα από τα κανονικά κύτταρα, αιμολύονται εύκολα και έχουν μικρότερη διάρκεια ζωής, προκαλώντας σοβαρή αναιμία. Οι ασθενείς που πάσχουν από δρεπανοκυτταρική αναιμία παράγουν την αιμοσφαιρίνη HbS και χαρακτηρίζονται από έλλειψη της HbA. H μετάλλαξη που προκαλεί την ασθένεια, επηρεάζει τη διαλυτότητα και την κρυστάλλωση της αιμοσφαιρίνης υπό συνθήκες υποξίας. Οι ετεροζυγώτες ως προς την ασθένεια, παράγουν περίπου 25-40% αιμοσφαιρίνη HbS παράλληλα με την HbA και είναι κλινικά φυσιολογικοί. Ωστόσο, μπορεί να εμφανιστεί δρεπάνωση των κυττάρων των ετερόζυγων σε συνθήκες υποξίας, όπως για παράδειγμα σε μεγάλο υψόμετρο. Η παρουσία της HbF μαζί με την HbS σε ένα ερυθροκύτταρο μειώνει την έκταση της δρεπάνωσης. Η HbF μειώνει την κρυστάλλωση της HbS και συνεπώς, ασθενείς που πάσχουν από δρεπανοκυτταρική αναιμία με υψηλά επίπεδα HbF έχουν λιγότερα ή ακόμα και καθόλου συμπώματα της ασθένειας. Γενικά, παρατηρείται μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ των ποσοστών της HbF και της σοβαρότητας των συμπτωμάτων της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Επομένως, οποιοσδήποτε χειρισμός θα οδηγούσε σε αύξηση της παραγωγής της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης θα βοηθούσε στην κλινική βελτίωση της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας (Schecher N.A., 2008; Steinberg M.H.,2005). Σημαντικά, οι ετεροζυγώτες για τη δρεπανοκυτταρική αναιμία εμφανίζουν ανοχή απέναντι στην ελονοσία. Στην Αφρική, μάλιστα, η εμφάνιση του γονιδίου δρεπανοκυττάρωσης φτάνει έως και το 40% και υπάρχει συσχέτιση μεταξύ της εμφάνισης της ελονοσίας και της συχνότητας εμφάνισης του γονιδίου δρεπανοκυττάρωσης. Αυτό το γεγονός αποτελεί παράδειγμα ισορροπημένου πολυμορφισμού, καθώς ο ετεροζυγώτης προστατεύεται από την ελονοσία και δεν υποφέρει από δρεπανοκυττάρωση, ενώ ο φυσιολογικός ομοζυγώτης είναι ευάλωτος στην ελονοσία (Pleasants S., 2014). 26

27 A.8.2 Θαλασσαιμικά Σύνδρομα Ο όρος «θαλασσαιμίες» προέρχεται από την ελληνική λέξη «θάλασσα» και αναφέρεται στη Μεσόγειο Θάλασσα, καθώς εντοπίζονται σε περιοχές που περιβρέχονται από αυτήν. Οι διάφοροι τύποι θαλασσαιμίας, ανάλογα με το ποια αλυσίδα σφαιρίνης ελαττώνεται ή απουσιάζει, χαρακτηρίζονται ως θαλασσαιμίες τύπου α, β, γ, δ και δβ. Οι πιο συχνές, αλλά και οι πιο σημαντικές κλινικά είναι οι θαλασσαιμίες τύπου α και β. Οι θαλασσαιμίες χαρακτηρίζονται από αλλαγές στη σύνθεση μιας ή περισσότερων αλυσίδων αιμοσφαιρίνης. Συγκεκριμένα, δημιουργούνται από πολλές διαφορετικές μεταλλάξεις που οδηγούν στην απώλεια ή την ανώμαλη λειτουργία μίας αλυσίδας αιμοσφαιρίνης ( α- ή β-). Γενικά, η ανισορροπία στην αναλογία α:β που προκύπτει είναι υπεύθυνη για τις παθοφυσιολογικές καταστάσεις που παρατηρούνται. Η αλυσίδα που παράγεται σε φυσιολογική ποσότητα είναι σε περίσσεια. Ωστόσο, απουσία της συμπληρωματικής αλυσίδας με την οποία θα σχημάτιζε τετραμερές, η πλεονάζουσα φυσιολογική καθιζάνει στο εσωτερικό του ερυθροκυττάρου, επιφέροντας βλάβες στη μεμβράνη του. Οι θαλασσαιμίες, τέλος, χαρακτηρίζονται από υποχρωματική μικροκυτταρική αναιμία (Thomson& Thomson, 2011; Suzuki M., 2014). Α α-θαλασσαιμία Ως α- θαλασσαιμίες χαρακτηρίζονται αυτές στις οποίες ο σχηματισμός των αιμοσφαιρινών επηρεάζεται από γενετικές διαταραχές στην παραγωγή της α- σφαιρίνης. Οι πιο συχνες μορφές α- θαλασσαιμίας οφείλονται σε χρωμοσωματικά ελλείματα. Ωστόσο, εχουν ανιχνευθεί ποικίλες μεταλλάξεις που οδηγούν στην α- θαλασσαίμια και η πλειοψηφία αυτών εντοπίζονται στο HBA2 γονίδιο. Όπως είναι γνωστό, υπάρχουν τέσσερα γονίδια για την α- αλυσίδα, δύο σε κάθε χρωμόσωμα 16 (α1 και α2 ) και ως εκ τούτου, ο φυσιολογικός απλότυπος είναι: αα/αα. Η απώλεια ενός γονιδίου α- σφαιρίνης (σιωπηλός φορέας), δεν 27

28 εμφανίζει ουσιαστικά κλινικά συμπτώματα. Εάν υπάρχει, ωστόσο, έλλειψη δυο γονιδίων α- σφαιρίνης (-α/-α ή --/αα), προκύπτει ήπιας μορφής αναιμία. Στην περίπτωση, όπου λείπουν τρία γονίδια α-αλυσίδας (-α/--), προκαλείται θαλασσαιμία βαριάς μορφής και παράγεται η αιμοσφαιρίνη HbH (β4 τετραμερές). Τέλος, όταν απουσιάζει εντελώς η α- αλυσίδα, η πλειοψηφία των μορίων αιμοσφαιρίνης στα βρέφη, είναι ένα τετραμερές γ 4, γνωστή ως «Hb Bart s». Η αιμοσφαιρίνη αυτή χαρακτηρίζεται από ανικανότητα απελευθέρωσης οξυγόνου κάτω από φυσιολογικές συνθήκες στους ιστούς. Συνεπώς, τα βρέφη με βαριά α- θαλασσαιμία υποφέρουν από ενδομήτρια υποξία και γεννιούνται με έντονη συσσώρευση υγρών, μια κατάσταση γνωστή ως «εμβρυικός ύδρωπας». Αξιοσημείωτα, έχει παρατηρηθεί ότι η συνύπαρξη της α-θαλασσαιμίας με τη δρεπανοκυτταρική αναιμία χαρακτηρίζεται από ήπια συμπτώματα αναιμίας (Spritz A.R. and Forget B.G.,1983). A β-θαλασσαιμία Η β- θαλασσαιμία προκαλείται από μεταλλάξεις στο γονίδιο της β- σφαιρίνης. Σε αντίθεση με τις α-σφαιρίνες, οι β- σφαιρίνες είναι σημαντικές κατά τη μεταγεννητική περίοδο, για αυτό και τα συμπτώματα της β-θαλασσαιμίας είναι εμφανή μετά τη γέννηση. Τα άτομα που είναι ετερόζυγα για τις μεταλλάξεις στο γονίδιο της β-σφαιρίνης είναι φορείς της ασθένειας (β-thalassemia trait) σε αντίθεση με τους ομόζυγους, οι οποίοι εμφανίζουν αναιμία, υπερφόρτωση σιδήρου και χρειάζονται μεταγγίσεις αίματος. Σε αντίθεση με την α-θαλασσαιμία, στη β- θαλασσαιμία οι ελλείψεις στο γονίδιο της β-σφαιρίνης δεν είναι συχνές και κυμαίνονται από 290 bp μέχρι και μεγαλύτερες από 80 kb. Σήμερα, έχουν ανιχνευθεί περισσότερες από 200 μεταλλάξεις στο γονίδιο της β- σφαιρίνης, οι οποίες εντοπίζονται κυρίως στην περιοχή του υποκινητή, των 3 αμετάφραστων περιοχών (UTRs), των εξονίων, καθώς και σε θέσεις ματίσματος. Αποτέλεσμα αυτών των μεταλλάξεων είναι η διαταραχή διαδικασιών, όπως η μεταγραφή, η μετάφραση και η τροποποίηση του RNA στο 28

29 γονίδιο της β-σφαιρίνης, οπότε και διαταράσσεται η σύνθεση της β- σφαιρίνης (Banan M., 2013). Ανάλογα με το ρυθμό παραγωγής των β-σφαιρινών έχουμε τις εξής δυο μορφές: τη (β 0 ) όταν υπάρχει πλήρης έλλειψη παραγωγής β-αλυσίδων και τη (β + ) όταν υπάρχει μερική παραγωγή β-αλυσίδων. Βάσει αυτών, έχουν αναγνωρισθεί τρεις κλινικές και αιματολογικές συνθήκες με αυξημένη σοβαρότητα, αναφορικά με τη νόσο: οι φορείς της β- θαλασσαιμίας, τα άτομα που είναι ανεξάρτητα της μετάγγισης αίματος (non transfusion dependent thalassemia) και έκεινα που έχουν τη μείζονα θαλασσαιμία (major thalassemia). Οι φορείς, δεν εμφανίζουν συμπτώματα και έχουν συγκεκριμένα αιματολογικά χαρακτηριστικά (μείωση του όγκου των ερυθρών αιμοσφαιρίων και της περιεκτικότητα αιμοσφαιρίνης). Η μείζονα θαλασσαιμία είναι σοβαρή αναιμία και συνεπώς, κρίνεται απαραίτητη η μετάγγιση αίματος στους ασθενείς. Τέλος, η θαλασαιμία που είναι ανεξάρτητη μεταγγίσεων περιλαμβάνει μια ετερογενή ομάδα ασθενών, όπου η σοβαρότητα της πάθησης κυμαίνεται από τη μη εκδήλωση κλινικών συμπτωμάτων έως και την ανάγκη μεταγγίσεων αίματος (Cao and Galanello,2010). Η β- θαλασσαιμία χαρακτηρίζεται από διαταραχή στην παραγωγή της HbA και αυξημένα ποσοστά της HbF. Τα αυξημένα επίπεδα της εμβρϋικής αιμοσφαιρίνης δεν οφείλονται στην ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου της γ-σφαιρίνης. Αντίθετα, το γεγονός αυτό φαίνεται να σχετίζεται με την επιλεκτική επιβίωση και ίσως, την αυξημένη παραγωγή του μικρού πληθυσμού των ώριμων ερυθροκυττάρων που περιέχουν HbF. Το γονίδιο, τέλος, για τη δ-σφαιρίνη παραμένει ανέπαφο, γι αυτό και συνεχιζεται η παραγωγή της HbA2. ι. Η μείζων β- θαλασσαιμία (Major Thalassemia) Η ασθένεια εμφανίζεται, είτε σε ομοζυγωτία (β 0 β 0 ) ή (β + β + ), είτε σε συνδυασμένη ετεροζυγωτία (β 0 β + ). Συχνά, αναφέρεται και ως «αναιμία του Cooley» και προσδιορίζεται ως γενετική ανωμαλία της β-σφαιρινικής σύνθεσης. Συγκεκριμένα, οι ομοζυγώτες β 0 β 0 για την ασθένεια χαρακτηρίζονται από έλλειψη 29

30 σύνθεσης της β-σφαιρίνης (η HbA είναι απούσα), αυξημένα επίπεδα της HbF ( 95-98%) και παρουσία της HbA2 (2-5%). Στους ομοζυγώτες β + β + και στους ετεροζυγώτες β 0 β + εμφανίζεται ένα μοτίβο σύνθεσης αιμοσφαιρινών, το οποίο αποτελείται από 10-30% HbA, 70-90% HbF και 2-5% HbA2 (Cao and Galanello, 2010; Spritz and Forget, 1983 ). Τα πρώτα συμπτώματα της νόσου εμφανίζονται στα πρώτα δυο χρόνια της ζωής (6-24 μήνες). Η κλινική εικόνα των ασθενών χαρακτηρίζεται κυρίως από υστέρηση ανάπτυξης, ωχρότητα, ίκτερο και ηπατοσπληνομεγαλία και συνεπώς, απαιτείται περιοδική μετάγγιση αίματος, προκειμένου να αντιμετωπιστούν τα συμπτώματα της ασθένειας (Origa R.,2005; Cao and Galanello, 2010). Οι εν λόγω ασθενείς επιζούν, συνήθως, μέχρι την δεύτερη ή τρίτη δεκατετία της ζωής τους. ιι. Η Θαλασσαιμία μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων (Non transfusion dependent thalassemia) Οι ασθενείς με θαλασσαιμία μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων εμφανίζουν μια ετερογενή κλινική εικόνα, οφειλόμενη σε μεταλλάξεις που μπορεί να αφορούν το ένα ή και τα δύο β-γονίδια. Τα συμπτώματα είναι εμφανή κατά το πέρας της εφηβείας και νωρίς στην ενήλικη ζωή του ατόμου. Τα κυριότερα συμπτώματα αφορούν την ήπια ή μέτρια αναιμία, τη μη αποτελεσματική ερυθροποίηση, την αυξημένη απορρόφηση σιδήρου στο έντερο, την αιμόλυση, τις οστικές παραμορφώσεις, τον ίκτερο και τον τρόμο. Συνήθως οι μεταγγίσεις δεν είναι απαραίτητες ή χρειάζονται περιστασιακά (Papachatzopoulou A. et al., 2006; Galanello R. And Orega R., 2010). Η ποσότητα της αιμοσφαιρίνης κυμαίνεται ανάμεσα στα 7,7 με 11,2 g/dl (Papachatzopoulou A. et al., 2006). Γενικά, τα συμπτώματα και η κλινική εικόνα των πάσχοντων κυμαίνεται από εκείνη των φορέων της β- θαλασσαιμίας έως αυτή που έχουν οι ασθενείς με μείζονα β θαλασσαιμία ( Musallam K.M., 2012). 30

31 Α.9 Επανεργοποίηση της HbF ως πιθανή θεραπευτική στρατηγική Η επανεργοποίηση των γονιδίων της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης στους ενήλικες αποτελεί μια αισιόδοξη θεραπευτική προσέγγιση έναντι της β- θαλασσαιμίας (Patrinos G.P and Grosveld F.G, 2007). Η ιδέα για την επανεργοποίηση της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης και την αξιοποίησή της ως θεραπευτική στρατηγική στους ασθενείς με β-θαλασσαιμία, έχει τη βάση της στην επονομαζόμενη «Κληρονομική Παραμονή Εμβρυϊκής Αιμοσφαιρίνης (HPFH)». Η HPFH χαρακτηρίζεται από υψηλά ποσοστά της HbF, ακόμα και στους ενήλικες, ως αποτέλεσμα ελλείψεων στο β-γονιδιακό τόπο. Στην εν λόγω πάθηση, υπάρχουν δυο πιθανά μοντέλα για την ενεργοποίηση της γ-σφαιρίνης: α) συγκεκριμένες ελλείψεις μπορεί να οδηγήσουν σε παράθεση ενός μακρινού ενισχυτή δίπλα από τα γονίδια που κωδικοποιούν τη γ-σφαιρίνη και β) ελλείψεις δύναται να προκαλέσουν την απομάκρυνση ενός αποσιωπητικού στοιχείου των γονιδίων της γ-σφαιρίνης (Banan M., 2013). Η επαγωγή της σύνθεσης της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης αναμένεται να βελτιώσει την ανισορροπία μεταξύ των αλυσίδων (α- και μη α-τύπου) σφαιρίνης. Σήμερα, ποικίλα φαρμακευτικά σκευάσματα, επάγουν τη σύνθεση της HbF, η οποία διαφορετικά θα είχε αποσιωποιηθεί κατά το ενήλικο αιμοποιητικό στάδιο. Τα εν λόγω σκευάσματα διακρίνονται σε τρεις κατηγορίες: 1) τα παρασκευάσματα της ανθρώπινης ανασυνδυασμένης ερυθροποιητίνης (rhepo), τα οποία δρουν στα προγονικά ερυθροποιητικά κύτταρα κατά τη διαφοροποίηση, 2) τα παράγωγα μικρής-αλυσίδας των λιπαρών οξέων (βουτυρικό νάτριο), που υποκινούν την κυτταρική διαφοροποίηση και ενισχύουν τη γονιδιακή έκφραση και 3) οι χημειοθεραπευτικοί κυτταροτοξικοί παράγοντες (5-αζακυτιδίνη, υδροξυουρία), οι οποίοι πυροδοτούν τη γρήγορη αναγέννηση και το σχηματισμό των ώριμων ερυθροκυττάρων (Patrinos G.P. and Antonarakis E.S., 2010; Cao A. and Galanello R., 2010). Τα μικρής αλυσίδας λιπαρά οξέα δρουν ως αναστολείς των αποακετυλασών των ιστονών. Ωστόσο, έχουν μικρό χρόνο ημιζωής και ως εκ τούτου, απαιτείται η συνεχής ενδοφλεβική τους χορήγηση. Η 5-αζακυτιδίνη είναι αναστολέας της DNA μεθυλοτρανσφεράσης και προκαλεί υπομεθυλίωση στον υποκινητή του γονιδίου 31

32 της γ-σφαιρίνης. Μακρόχρονη χρήση της 5-αζακυτιδίνης φαίνεται να προκαλεί τοξικότητα σε καλοηθείς διαταραχές (Koren A. et al., 2008). Η αισιοδοξία της επανεργοποίησης των γονιδίων της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης αποδείχθηκε συγκρατημένη, καθώς δεν φαίνεται να υπάρχει αναλογική σχέση ανάμεσα στην επανεργοποίηση και την αύξηση των επιπέδων της HbF με την κλινική βελτίωση των ασθενών με αιμοσφαιρινοπάθειες. Μάλιστα, η κατηγοριοποίηση των ασθενών σε καλά αποκρινόμενους ή μη αποκρινόμενους δε σχετίζεται απόλυτα με την αύξηση των επιπέδων της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (Patrinos G.P. and Grosveld F.G., 2008). Α.10 Υδροξυουρία (Hydroxyurea- HU) Αρχικά, η υδροξυουρία (υδροξυκαρβαμίδη) χρησιμοποιηθήκε ως χημειοθεραπευτικός παράγοντας στη θεραπεία ασθενών με μυελο-υπερπλαστικές ασθένειες. Η χημική δομή του φαρμάκου αποδίδεται στην Εικόνα 10. Τη δεκαετία του 80, ανακαλύφθηκε ότι η HU μπορεί να επάγει την έκφραση της HbF σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Αν και ο μηχανισμός δράσης του φαρμάκου παραμένει ακόμα άγνωστος, οι πιθανοί μηχανισμοί επαγωγής της σύνθεσης HbF είναι ποικίλοι (ερυθροποιητική αναγέννηση, αυξημένη παραγωγή ερυθροποιητίνης, απόπτωση, παραγωγή νιτρικού οξέος, αυξημένη δραστηριότητα της γουανυλικής κυκλάσης, ενεργοποίηση του p38/map3k5 μονοπατιού) (Pourfarzad F.,2013). Η υδροξυουρία, επίσης, αναστέλλει τη ριβονουκλεοτιδική ρεδουκτάση, ενζύμο το οποίο είναι απαραίτητο για τη σύνθεση του DNA στα διαιρούμενα ώριμα προγονικά κύτταρα. 32

33 Εικόνα 10: Η χημική δομή της Υδροξυουρίας (HY) (Banan M., 2013) Η HU, ούσα εγκεκριμένη από Οργανισμό Τροφίμων και Φαρμάκων των Ηνωμένων Πολιτειών της Αμερικής (Food and Drug Administration, FDA) (Banan M., 2013), χρησιμοποιείται ευρέως για τη βελτίωση των συμπτωμάτων της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Σε μικρότερο βαθμό, το φάρμακο χορηγείται σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία. Σημειώνεται πως η υδροξυουρία λαμβάνεται από του στόματος, έχει μικρό κόστος και η χορήγησή της θεωρείται ανεκτή. Ωστόσο, πρόκειται για έναν κυτταροτοξικό παράγοντα, ο οποίος μπορεί να οδηγήσει σε κυτταροπενία, αύξηση βάρους, υπομαγνησαιμία και τερατογόνες καταστάσεις. Εξίσου σημαντικά, η μακρόχρονη χρήση της σε ασθενείς με SCD οδήγησε στην εμφάνιση λευχαιμίας, ελκών (πόδια) και μειωμένης σπερματογένεσης. Επίσης, αρνητικά συμπτώματα (πονοκέφαλοι, ναυτία, ζαλάδα) εμφανίζονται και σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία (Patrinos GP and Antonarakis SP, 2010). Η ανταπόκριση των ασθενών και ο βαθμός αύξησης των επιπέδων της HbF, παρουσία υδροξυουρίας ποικίλουν. Χαρακτηριστικά, το 25% των ατόμων με αιμοσφαιρινοπάθειες δεν ανταποκρίνονται στη θεραπεία με HU (Banan M., 2013). Κλινικές έρευνες μαρτυρούν ότι η αύξηση της HbF ως αποτέλεσμα της θεραπείας με HU αποτελεί κληρονομήσιμο χαρακτηριστικό. Επιπλέον, η μοριακή ρύθμιση της HbF 33

34 πραγματοποιείται μέσω πολύπλοκων αλληλεπιδράσεων cis και trans ρυθμιστικών στοιχείων στο β-γονιδιακό τόπο. Οι γενετικές παραλλαγές, τέλος, που φαίνεται να σχετίζονται με τη διαφορετική απόκριση στην υδροξυουρία, εντοπίζονται σε γονίδια που ρυθμίζουν την έκφραση της HbF, τον μεταβολισμό της HU, καθώς και τον πολλαπλασιασμό των πρόγονων ερυθροκυττάρων. Έως σήμερα έχουν βρεθεί αρκετοί πολυμορφισμοί, είτε συνδεόμενοι στο σύμπλεγμα των β-σφαιρινών, είτε όχι, οι οποίοι έχουν την ικανότητα να επηρεάζουν, τόσο την έκφραση της HbF, όσο και τη σοβαρότητα της ασθένειας (Gravia et al.,2014). Το 2007, οι Ma και συνεργάτες μελέτησαν ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία και παρατήρησαν α) ότι μια ομάδα 17 πολυμορφισμών (SNPs) σχετικών με τη σημαντική μεταβολή του % ποσοστού της HbF και β) μια ομάδα 20 πολυμορφισμών, οι οποίοι σχετίζονται σημαντικά με την μεταβολή της απόλυτης (ανά μονάδα όγκου) HbF (Ma et al.,2007). Στην πρώτη ομάδα πολυμορφισμών, εντοπίστηκαν δύο πολυμορφισμοί στο MAP3K5 γονίδιο, πέντε στο TOX, δύο στο NOS1, τρεις στο FLT1, δύο στο ARG2 και δύο στο NOS2, ενώ στη δεύτερη ομάδα μεγαλύτερη συσχέτιση βρέθηκε σε έναν πολυμορφισμό του ARG2. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι SNPs στα γονίδια ASS και ARG1 συσχετίζονται με τη μεταβολή των επιπέδων της HbF. Αντίστοιχη συσχέτιση φανηκε να υπάρχει με κάποιους SNPs στα γονίδια NOS1 και NOS2. Σε αυτό το σημείο, σημειώνεται πως η πλειοψηφία αυτών των πολυμορφισμών εντοπίζεται σε ιντρονικές ή μη μεταφραζόμενες περιοχές των παραπάνω γονιδίων (Gravia et al., 2014). Συνοψίζοντας, καθίσταται σαφές πως η δυνατότητα πρόβλεψης της ανταπόκρισης στην HU θα βοηθούσε στη βέλτιστη ταξινόμηση των ασθενών και εν τέλει, στην αποκλειστική χορήγηση του φαρμάκου σε εκείνους τους ασθενείς που επρόκειτο να ωφεληθούν από τη θεραπεία. Α.11 NOS1 (Nitric oxide synthase 1) Το γονίδιο NOS1 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 12, στην κυτταρογενετική θέση 12q24 (Shinkai T. et al., 2002). Το μέγεθος του γονιδίου είναι 150 kb και αποτελείται 34

35 από 29 εξώνια. Ακόμα, αποτελείται από ένα μη μεταφραζόμενο εξώνιο, το εξώνιο 1, το οποίο αντιγράφεται από μια από τις δώδεκα εναλλακτικές κωδικές περιοχές (Tang W., 2008). Το NOS1 είναι υπεύθυνο για την έκφραση της συνθετάσης του μονοξειδίου του αζώτου, η οποία καταλύει τη σύνθεση του μονοξειδίου του αζώτου από την L- αργινίνη. Η NOS1 είναι μια σημαντική ισομορφή και εκφράζεται ευρέως στον εγκέφαλο και το κεντρικό νευρικό σύστημα. Μάλιστα, σε αυτή την ισομορφή οφείλεται η παραγωγή του 90% του μονοξειδίου του αζώτου στο κεντρικό νευρικό σύστημα (Cui H. et al., 2010). Σημειώνεται, εδώ, πως η NOS1 εκφράζεται συνεχώς και ρυθμίζεται ενδοκυτταρικά από τη συγκέντρωση του ασβεστίου και τη καλμουδουλίνη (Dupont L.L. et al., 2014). Το μονοξεδιο του αζώτου (NO), τώρα, είναι ο πρώτος παρατηρούμενος διαβιβαστής σε μορφή αερίου, ο οποίος εμπλέκεται σε πολλά σηματοδοτικά μονοπάτια (φλεγμονή) (Dupond L.L. et al., 2014), αναστέλλει την ανάπτυξη των ερυθροειδών προγονικών κυττάρων και επιπλέον εμπλέκεται στην επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων της γ-σφαιρίνης (Εικόνα 11). Σημαντικά, έχει αναφερθεί πως η HU επάγει την παραγωγή του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ) αντιδρώντας με την αίμη των αιμοσφαιρινών ή φωσφορυλιώνοντας και ενεργοποιώντας τη NOS (Banan M., 2013; Pourfarzad F. et al.,2013). Οι SNPs rs , rs και rs του NOS1 έχουν βρεθεί να συσχετίζονται με την ανταπόκριση και αύξηση της HbF στη θεραπεία με HU (Patrinos GP anf Grosveld FG, 2007). 35

36 Εικόνα 11: Σηματοδοτικό μονοπάτι επαγωγής γ-σγαιρίνης μέσω του ΝΟ (Banan M., 2013) Α.12 ASS1 (Argininosuccinate synthase 1) Το γονίδιο ASS1 εντοπίζεται στο μεγάλο βραχίονα του χρωμοσώματος 9, στην κυτταρογενετική θέση 9q q34.12, με μέγεθος 63 kb. Διαθέτει 16 εξώνια και έχει 10 με 14 ομόλογα αντίγραφα, τα οποία θεωρούνται ψευδογονίδια και διασπείρονται σε όλο το ανθρώπινο γονιδίωμα. Ωστόσο, η αλληλουχία στο χρωμόσωμα 9, φαίνεται να είναι η μόνη λειτουργική. Ακόμα, υπάρχουν δυο διαφορετικά μετάγραφα, ανάλογα με το όργανο έκφρασης, τα οποία είναι αποτέλεσμα εναλλακτικού ματίσματος του εξωνίου 2. Η πρωτεΐνη που παράγεται είναι ένα ομοτετραμερές μόριο, αποτελούμενο από μονομερή μεγέθους 45 kd (Engel K. et al.,2008). 36

37 Το ASS1 είναι υπεύθυνο για την έκφραση της συνθετάσης του αργινινοηλεκτρικού, η οποία συμμετέχει σε ένα καταλυτικό βήμα στη βιοσυνθετική οδό της αργινίνης. Συγκεκριμένα, το εν λόγω ένζυμο καταλύει τη συμπύκνωση της κιτρουλλίνης και του ασπαρτικού οξέος σε αργινινοηλεκτρικό οξύ, το οποίο στη συνέχεια, μετατρέπεται σε αργινίνη με τη λυάση του αργινινοηλεκτρικού. Σημειώνεται, εδώ, πως η αργινίνη διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη σύνθεση της ουρίας, των πολυαμινών και του μονοξειδίου του αζώτου (ΝΟ). Η ASS1 έχει βρεθεί πως συμμετέχει στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης (απόκριση σε κυτταρικά και περιβαλλοντικά ερεθίσματα), ενώ αποτελεί ένζυμο-κλειδί στο μεταβολισμό της αργινίνης και εμπλέκεται σε διάφορους μηχανισμούς ρύθμισης τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες όσο και σε περιπτώσεις νοσημάτων. Το ένζυμο αυτό εκφράζεται σε πολλούς ιστούς και κυρίως στο ήπαρ. Τέλος, ανωμαλία στη λειτουργία του ενζύμου, οδηγεί στο μεταβολικό νόσημα «κιτρουλλιναιμία τύπου Ι» (Engel K. et al.,2008; Shiue S. et al., 2014). Στο ASS1 έχουν συσχετισθεί, σημαντικά, με την ανταπόκριση στην HU και τα επίπεδα της HbF σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία (Ma Q. et al.,2007). Η εν λόγω παρατήρηση υποδηλώνει ότι τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου διαδραματίζουν έναν προστατευτικό ρόλο στα πρόγονα ερυθροποιητικά κύτταρα προλαμβάνοντας την απόπτωση (εξαιτίας των επαγόμενων από την HU υψηλών επιπέδων ΝΟ) και αξιοποιώντας το ΝΟ σε μετέπειτα στάδια της διαφοροποίησης (Pourfarzad F. et al.,2013). 37

38 Α.13 Στόχος Εργασίας Στις μέρες μας, έχουν αναφερθεί πλήθος γενετικών παραγόντων, οι οποίοι επηρεάζουν την έκφραση της εμβρϋικής αιμοσφαιρίνης, καθώς και την κλινική σοβαρότητα της β-θαλασσαιμίας και της δρεπανοκυτταρικής αναιμίας. Μεταξύ αυτών, οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί σε γονίδια, τα οποία μπορεί να είναι συνδεδεμένα ή και όχι με το β-γονιδιακό τόπο, διαδραματίζουν βαρυσήμαντο ρόλο. Ωστόσο, δεν έχει υπάρξει άμεση συσχέτιση των αυξημένων επιπέδων της HbF με τη βελτίωση των κλινικών συμπτωμάτων των αιμοσφαιρινοπαθών, όπως και με την απόκριση στην HU ή σε οποιοδήποτε άλλο φαρμακευτικό σκεύασμα που επάγει τη παραγωγή της (Patrinos GP and Grosveld FG, 2007). Στην παρούσα μελέτη, διερευνάται η συσχέτιση των μονονουκλεοτιδικών πολυμορφισμών εντός των γονιδίων NOS1 (rs816361) και ASS1 (rs , rs ) με την αύξηση της εμβρϋικής αιμοσφαιρίνης ή/και την ανταπόκριση στη θεραπεία με υδροξυουρία σε ασθενείς με β-θαλασσαιμία στον ελληνικό πληθυσμό. Για το σκοπό αυτό, μελετήθηκαν πέντε πληθυσμιακές ομάδες: υγιή άτομα, πάσχοντες από μείζονα β-θαλασσαιμία, πάσχοντες από θαλασσαιμία ανεξάρτητη μεταγγίσεων και διπλά ετερόζυγοι για β-θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία (ανταποκρινόμενoi ή όχι στην HU). 38

39 Β. Υλικά και Μέθοδοι 39

40 Β.1 Δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη Η μελέτη αυτή περιλαμβάνει τέσσερις διαφορετικές κατηγορίες δειγμάτων γενετικού υλικού: 1. Υγιή άτομα (δείγματα μάρτυρες- controls) 2. Ασθενείς με Μείζονα β-θαλασσαιμία (β-thalassemia major) 3. Ασθενείς με θαλασσαιμία μη εξαρτώμενη μεταγγίσεων (Non transfusion dependent β-thalassemia) 4. Ασθενείς διπλά ετερόζυγοι για δρεπανοκυτταρική αναιμία και β- θαλασσαιμία που έχουν λάβει αγωγή με HU (SCD/β-thalassemia compound heterozygote) Όλα τα δείγματα προέρχονται από άτομα ελληνικής καταγωγής και συλλέχθηκαν στο Πανεπιστημιακό Γενικό Νοσοκομείο Πατρών. Στη παρούσα μελέτη, αναλύθηκαν 80 δείγματα υγιών ατόμων, 80 δείγματα β-thalassemia major, 11 δείγματα non transfusion dependent β-thalassemia και 36 δείγματα διπλά ετερόζυγων SCD/ β- thalassemia. Στους διπλά ετερόζυγους SCD/ β-thalassemia ασθενείς έλαβε χώρα φαρμακευτική αγωγή με HU. Οι ασθενείς αυτοί, ανάλογα με τα επίπεδα έκφρασης της εμβρϋικής αιμοσφαιρίνης ως αποτέλεσμα της ανταπόκρισης τους στην HU, κατηγοριοποιούνται σε «ανταποκρινόμενους» (responders) και σε «μηανταποκρινόμενους» (non responders). Οι ασθενείς με επίπεδα της HbF κάτω του 20%, θεωρούνται «μη ανταποκρινόμενοι», ενώ άνω του 20% «ανταποκρινόμενοι». Τα εν λόγω επίπεδα της HbF είναι θεραπεύσιμα και η ανάλυσή μας στηρίζεται σε αυστηρά κριτήρια (Borg J. et al., 2012). B.2 Απομόνωση DNA (ολικό αίμα) Η απομόνωση DNA από δείγματα ολικού αίματος πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του προτυποποιημένου συστήματος QIAamp Blood Midi Kit (Spin Protocol). Συγκεκριμένα, απομονώθηκε DNA από 1 ml περιφερικού ολικού αίματος, στο οποίο έχει προστεθεί αντιπηκτικό EDTA. Ο μηχανισμός με τον οποίο πραγματοποιείται η απομόνωση του DNA βασίζεται στην πρόσδεση των νουκλεικών οξέων σε στήλη 40

41 χαλαζία, σε περιβάλλον υψηλής ιοντικής ισχύος και χαμηλού ph, που δημιουργείται από την προσθήκη χαοτροπικού παράγοντα, ενώ η έκλουσή του γίνεται με ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (TE) σε ph 8.3. Τα στάδια τα οποία ακολουθήθηκαν για την απομόνωση του DNA είναι τα εξής: 1. Προσθήκη 200 μl του αντιδραστηρίου «QIAGEN protease» σε σωλήνα φυγοκέντρησης χωρητικότητας 15 ml 2. Ανάμειξη 1 ml δείγματος αίματος με 1 ml PBS (Phosphate Buffered Saline) και ανάδευση στο σωλήνα 3. Προσθήκη 2,4 ml διαλύματος AL (διάλυμα λύσης) και ανάδευση για 1 λεπτό 4. Επώαση του μείγματος στο υδατόλουτρο για 10 λεπτά στους 70 ο C 5. Προσθήκη 2 ml αιθανόλης (καθαρότητας %) στο μείγμα και ακολουθεί ανάδευση 6. Μεταφορά της μισής ποσότητας του δείγματος στην QIAmp midi spin στήλη (τοποθετημένη σε σωλήνα φυγοκέντρησης 15 ml). Φυγοκέντρηση για 3 λεπτά στα 1850 g σε θερμοκρασία δωματίου (25 ο C) 7. Απόρριψη του διηθήματος και τοποθέτηση της υπόλοιπης μισής ποσότητας του μείγματος στη στήλη και επανάληψη της φυγοκέντρησης του βήματος 6 8. Προσθήκη διαλύματος 2 ml AW1 (διάλυμα πλύσης) στη στήλη και φυγοκέντρηση στα 4500 g για 1 λεπτό 9. Προσθήκη 2 ml AW2 (διάλυμα πλύσης) διάλυμα πλύσης στη στήλη και φυγοκέντρηση στα 4500 g για 15 λεπτά 10. Τοποθέτηση της QIAmp midi spin στήλης σε ένα καθαρό σωλήνα φυγοκέντρησης χωρητικότητας 15 ml 11. Προσθήκη 300 μl διαλύματος έκλουσης ΑΕ και επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Ακολούθως πραγματοποιείται φυγοκέντρηση για 2 λεπτά στα 4500 g 12. Επανάληψη του βήματος 11 για αύξηση της τελικής συγκέντρωσης DNA 13. Συλλογή του διηθήματος που περιέχει το απομονωμένο DNA και αποθήκευση αυτού στους -20 ο C 41

42 Β.3 Προσδιορισμός συγκέντρωσης DNA Ο προσδιορισμός της συγκέντρωσης DNA των υπό ανάλυση δειγμάτων έγινε με τη χρήση της συσκευής NanoDrop. Η συσκευή αυτή είναι ένα φασματοφωτόμετρο πλήρους φάσματος, που υπολογίζει τη συγκέντρωση των νουκλεϊκών οξέων ή πρωτεϊνών σε ένα διάλυμα. Για τη σωστή χρήση της συσκευής, πρέπει πρώτα να μηδενιστεί χρησιμοποιώντας απεσταγμένο νερό (ddh2o). Στη συνέχεια, τοποθετείται μια σταγόνα DNA του δείγματος, όγκου 1μl, στην ειδική βάση της συσκευής. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων, καταγράφονται αυτόματα στον υπολογιστή που βρίσκεται συνδεδεμένος με τη συσκευή. Η φωτομέτρηση του δείγματος DNA πραγματοποιείται πρώτα, σε μήκος κύματος 260 nm και αυτόματα υπολογίζεται η συγκέντρωση του DNA. Επιπρόσθετα, πραγματοποιεί μέτρηση σε μήκος κύματος 280 nm, ώστε να υπολογισθεί η συγκέντρωση των πρωτεϊνών στο δείγμα. Ο λόγος της τιμής της οπτικής απορρόφησης (O.D.) στα 260 nm προς την τιμή της οπτικής απορρόφησης στα 280 nm εκφράζει την καθαρότητα του δείγματος DNA. Εάν ο λόγος κυμαίνεται ανάμεσα στις τιμές 1,7 με 1,9, τότε το DNA είναι καθαρό από προσμίξεις. Αντίθετα, στην περίπτωση που αυτός ο λόγος έχει τιμή μικρότερη του 1,7, τότε στο δείγμα μας υπάρχουν προσμίξεις πρωτεΐνης ή ακόμα και φαινόλης, οπότε η συγκέντρωση του DNA δε θεωρείται ακριβής. Εάν ο λόγος είναι μεγαλύτερος της τιμής 1,9, στο δείγμα μας υπάρχουν προσμίξεις RNA. Τέλος, υπολογίζεται ο λόγος 260/230 nm, για τον έλεγχο της καθαρότητας του δείγματος DNA. Για να θεωρηθεί το δείγμα DNA καθαρό πρέπει η τίμή του συγκεκριμένου λόγου να κυμαίνεται ανάμεσα στο εύρως τιμών 2-2,2. Β.4 Πολυμορφισμοί - στόχοι της παρούσας μελέτης Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν τρεις πολυμορφισμοί (ο rs του γονιδίου NOS1 και οι rs και rs του γονιδίου ASS1) και εξετάστηκε, εάν αποτελούν γενετικοί δείκτες, τόσο της ασθένειας, όσο και της ανταπόκρισης στην HU (Πίνακας 1). 42

43 Πίνακας 1: Οι υπό μελέτη πολυμορφισμοί της παρούσας εργασίας, τα γονίδια και το χρωμόσωμα στο οποίο εντοπίζονται, καθώς και η απορρέουσα νουκλεοτιδική αλλαγή Γονίδιο SNP Αλλαγή Χρωμόσωμα NOS1 rs C>G 12 ASS1 rs C>T 9 ASS1 rs G>T 9 Οι συγκεκριμένοι πολυμορφισμοί/γονίδια επιλέχτηκαν στη βάση της έρευνας του Ma Q. και των συνεργατών του, το Στην έρευνα αυτή, μελετήθηκαν 29 γονίδια και 320 πολυμορφισμοί σε 137 ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Σκοπός της μελέτης ήταν ο έλεγχος της ύπαρξης συσχετισμού ανάμεσα στους πολυμορφισμούς αυτούς και στη μεταβολή των επιπέδων της εμβρϋικής αιμοσφαιρίνης, έπειτα από χορήγηση HU για δύο χρόνια. Βρέθηκε, τελικά, ότι υπάρχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση των επιπέδων της HbF με την απόκριση στην HU, ανάμεσα σε πολλούς πολυμορφισμούς και γονίδια. Μεταξύ αυτών, ήταν τα γονίδια NOS1 και ASS1 (Πίνακας 1). Μάλιστα, η μεταβολή των απόλυτων επιπέδων της HbF συσχετίστηκε σημαντικά με τον rs του γονιδίου NOS1 σε ασθενείς με δρεπανοκυτταρική αναιμία. Ο πολυμορφισμός rs του γονιδίου NOS1 εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 12, στη θέση 12: του πρόσθιου κλώνου (Εικόνα 1). Αποτελεί έναν ιντρονικό πολυμορφισμό, ο οποίος χαρακτηρίζεται από τη νουκλεοτιδική αλλαγή C>G. Η συχνότητα εμφάνισης του στο πληθυσμό των Καυκάσιων (CEU) είναι 29% (G). Εικόνα 12: Η θέση του πολυμορφισμού rs το χρωμόσωμα 12 43

44 Στο γονίδιο ASS1, οι πολυμορφισμοί rs και rs εντοπίζονται στο χρωμόσωμα 9, στις θέσεις 9: και 9: του πρόσθιου κλωνου αντίστοιχα (Εικόνες 2 και 3). Η νουκλεοτιδική αλλαγή στον rs είναι C>T και εντοπίζεται στην 3 αμετάφραστη περιοχή, ενώ στον rs είναι G>T και αφορά ιντρόνιο του γονιδίου. Η συχνότητα εμφάνισης των εν λόγω πληθυσμών στο πληθυσμό των Καυκάσιων είναι 60% (T) και 10% (T), αντίστοιχα. Εικόνα 13: Η θέση του πολυμορφισμού rs στο χρωμόσωμα 9 Εικόνα 14: Η θέση του πολυμορφισμού rs στο χρωμόσωμα 9 Β.5 Σχεδιασμός εκκινητών (primers) Προκειμένου να πολυμερίσουμε ένα συγκεριμένο τμήμα του DNA με την εφαρμογή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), απαιτείται ο σχεδιασμός του βέλτιστου ζεύγους εκκινητών (primers). Οι εκκινητές είναι μικρά συνθετικά τμήματα DNA, συμπληρωματικά και εκλεκτικά ως προς την περιοχή στόχο του DNA. Συνοπτικά η διαδικασία που ακολουθείται για το σχεδιασμό τους είναι η παρακάτω: 1. Εντοπισμός της θέσης των πολυμορφισμών που μας ενδιαφέρουν και θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε, καθώς και της αλληλουχίας που τους περιβάλλει μέσω της βάσης δεδομένων Ensembl ( 44

45 2. Σχεδιασμός εκκινητών μέσω του υπολογιστικού προγράμματος Primer 3. Στο πρόγραμμα αυτό, μπορούμε να διερευνήσουμε/επιλέξουμε συγκεκριμένες παραμέτρους, προκειμένου να καταλήξουμε στους βέλτιστους σχεδιαστικά εκκινητές. Ενδεικτικά, οι εν λόγω παράμετροι αφορούν τη θερμοκρασία υβριδοποίησης (Tm) των εκκινητών, η οποία πρέπει να κυμαίνεται στο εύρος των C, την περιεκτικότητα σε βάσεις GC, που πρέπει να κυμαίνεται στο εύρος του 40-60% για την ισχυρή υβριδοποίηση τους, καθώς και το μέγεθος τους. 3. Έλεγχος της ειδικότητας των εκκινητών στο ανθρώπινο γονιδίωμα με χρήση του προγράμματος BLAST της βάσης δεδομένων Ensembl. Οι εκκινητές πρέπει να είναι ειδικοί για την αλληλουχία-στόχο, διαφορετικά, εάν είναι ομόλογοι για περισσότερες από μία περιοχές, η PCR δε θα έχει καλή απόδοση, ενώ θα παράγονται και μη ειδικά προϊόντα. 4. Χρήση του υπολογιστικού προγράμματος DNAMAN για να ελέγξουμε τη συμπληρωματικότητα των εκκινητών μεταξύ τους αλλά και με τον εαυτό τους (self-somplentarity). Με αυτό τον τρόπο, αποκλείεται ο σχηματισμός διμερών εκκινητών (primer dimer) που εμποδίζουν τη σωστή απόδοση της αντίδρασης. 5. Έλεγχος του πολυμεριζόμενου τμήματος για το σχηματισμό δευτεροταγών δομών, αξιοποιώντας το πρόγραμμα DINAMELT. Πρέπει να αποφεύγεται ο σχηματισμός βρόγχων και άλλων αναδιπλώσεων στα άκρα της αλληλουχίας (στις περιοχές πρόσδεσης των εκκινητών), καθώς θα παρεμποδίζεται η αποδιάταξη και ο πολυμερισμός του DNA κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Β.6 Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction PCR) Η αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης αναπτύχθηκε το 1980 από τον Kary Mullis και αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο στη βιοϊατρική έρευνα 45

46 (λειτουργική μελέτη γονιδίων, φυλλογενετικές αναλύσεις, διάγνωση κληρονομικών νοσημάτων και μολυσματικών ασθενειών). Η PCR βασίζεται στη θερμική κυκλοποίηση, (την ακριβή επανάληψη κύκλων θέρμανσης και ψύξης), κατά την οποία λαμβάνει χώρα η αποδιάταξη και ενζυμική αντιγραφή του DNA. Σημαντικός συντελεστής της αντίδρασης αποτελεί το ζεύγος των εκκινητών, καθώς, οριοθετεί την περιοχή που θα πολλαπλασιαστεί. Η μεθοδολογία της PCR στηρίζεται στην ικανότητα μιας θερμοσταθερής DNA πολυμεράσης, όπως αυτής του Thermus aquaticus (Taq πολυμεράση), να συνθέτει ένα νέο κλώνο DNA, συμπληρωματικό αυτού που χρησιμοποιείται ως μήτρα και συνεπώς, να πολλαπλασιάζει με εκθετικό τρόπο τα μόρια του DNA. Η πολυμεράση προσθέτει δεοξυνουκλεοτίδια συμπληρωματικά προς τον κλώνο-μήτρα, με κατεύθυνση 5 3. Η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε ειδικά μηχανήματα, τους θερμικούς κυκλοποιητές. Η διαδικασία της PCR συνήθως περιλαμβάνει τρία βήματα που επαναλαμβάνονται για n κύκλους, και παρουσιάζονται ακόλουθα (Εικόνα 4). Τα βήματα αυτά επαναλαμβάνονται για κύκλους και κατά τη διάρκειά τους αυξάνονται εκθετικά τα μόρια του DNA. 1. Αποδιάταξη του DNA-στόχου στους ο C 2. Πρόσδεση (υβριδισμός) των εκκινητών στις συμπληρωματικές τους ακολουθίες σε συγκεκριμένη θερμοκρασία η οποία εξαρτάται από το μήκος και την αλληλουχία των εκκινητών και ορίζεται κατά το σχεδιασμό των εκκινητών 3. Επιμήκυνση των υβριδοποιημένων εκκινητών στους 72 ο C, σχηματίζοντας τους νέους θυγατρικούς κλώνους DNA 46

47 Εικόνα 15: Σχηματικά μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης ( Στη μελέτη αυτή, ακολουθήσαμε το παρακάτω πρωτόκολλο για την ανάλυση και των τριών πολυμορφισμών του ενδιαφέροντος: C για διάστημα 2 sec C για διάστημα 0:15 sec C για διάστημα 0:15 sec C για διάστημα 0:01 sec 5. Επιστροφή στο βήμα 2 για 39 φορρές C για διάστημα 0:30 sec 7. 4 C για πάντα Συνολικά, η διαδικασία έλαβε χώρα για 40 κύκλους. Οι θερμικοί κυκλοποιητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν οι MJ Mini Personal Thermal Cycler (Biorad) και G-storm (Labtech). 47

48 Β.6.1 PCR-ARMS (Amplification Refractory Mutation System) To 1989 περιγράφηκε μια νέα εφαρμογή της PCR, γνωστή ως «σύστημα ανίχνευσης μεταλλάξεων ανθεκτικών στην ενίσχυση» (PCR-ARMS), για τη γρήγορη ανίχνευση και ανάλυση γνωστών πολυμορφισμών στο DNA. Η τεχνική αυτή στηρίζεται στην ασυμφωνία ζευγαρώματος ανάμεσα στο 3 άκρο του εκκινητή με το DNA-στόχο, η οποία εμποδίζει την επιμήκυνση από την πολυμεράση (Collins A. and Ke X., 2012). Η DNA πολυμεράση δεν έχει δράση 3 5 εξωνουκλεάσης, συνεπώς δεν έχει επιδιορθωτική ικανότητα σε περίπτωση ασυμφωνίας ζευγαρώματος. Για τη σωστή απόδοση της αντίδρασης απαιτείται πλήρης συμφωνία ανάμεσα στο 3 άκρο του εκκινητή και του στόχου. Η ενίσχυση του φυσιολογικού και όχι του μεταλλαγμένου αλληλομόρφου πραγματοποιείται με τη χρήση ενός εκκινητή συμπληρωματικού ως προς το φυσιολογικό αλληλόμορφο, ο οποίος εμφανίζει ασυμφωνία ζευγαρώματος στο 3 άκρο του, αναφορικά με το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο (Wenham R.P. et al., 1991). Καταλήγοντας, για τη διεξαγωγή μιας PCR-ARMS σχεδιάζονται τρεις εκκινητές, ένας αντίστροφος και δύο διαφορετικοί ευθείς ή ένας ευθύς και δύο διαφορετικοί αντίστροφοι, ταυτόσημοι μεταξύ τους με μόνη διαφορά το 3 τελικό νουκλεοτίδιό τους, που είναι συμπληρωματικό με ένα εκ των δύο αλληλομόρφων του SNP που εξετάζεται. Άρα, ετοιμάζονται δύο διαφορετικά μίγματα κατά τη διαδικασία και για κάθε δείγμα DNA πραγματοποιείται η αντίδραση PCR δύο φορές, προκειμένου να διαπιστωθεί για ποιο εκ των δύο αλληλομόρφων θα παραχθεί προϊόν PCR (Εικόνα 5). 48

49 Εικόνα 16: Σχηματική αναπαράσταση της PCR-ARMS ( B.6.2. PCR- RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) H PCR-RFLP χρησιμοποιήθηκε πρώτη φορά ως γενετικό εργαλείο το 1974 και χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση πολυμορφισμών που εντοπίζονται κοντά σε θέσεις αναγνώρισης περιοριστικών ενδονουκλεασών. Ουσιαστικά, η εν λόγω προσέγγιση στηρίζεται στην ικανότητα των περιοριστικών ενδονουκλεασών να αναγνωρίζουν συγκεκριμένες δίκλωνες αλληλουχίες DNA (θέσεις περιορισμού) και να κατατέμνουν κοντά ή μέσα στις αλληλουχίες αυτές, σχηματίζοντας περιοριστικά θραύσματα. Οι περιοριστικές ενδονουκλεάσες χρησιμοποιούνται για τη γονοτύπηση συγκεκριμένων αλληλουχιών μετά την κατάτμηση του PCR προϊόντος. Εάν υπάρχει κάποια αντικατάσταση βάσης στις θέσεις αναγνώρισης του ενζύμου, τότε προκύπτουν διαφορετικού μεγέθους τμήματα του PCR προϊόντος, όπως φαίνεται και στην Εικόνα 6 και με αυτό τον τρόπο πραγματοποιείται η γονοτύπηση. Η δραστικότητα των περιοριστικών ενδονουκλεασών στην αντίδραση, επηρεάζεται από ποικίλους παράγοντες, όπως έιναι το ph, η ιοντική συγκέντρωση στο 49

50 ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης (buffer) και η θερμοκρασία στην οποία λαμβάνει χώρα η αντίδραση κατάτμησης (Botstein D. et al., 1980). Η γονοτύπηση με την εφαρμογή της PCR-RFLP περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: Πολλαπλασιασμός του τμήματος DNA που περικλείει τον πολυμορφισμό με PCR Κατάτμηση των PCR προϊόντων με το κατάλληλο ένζυμο Διαχωρισμός των θραυσμάτων με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Η διαδικασία της κατάτμησης λαμβάνει χώρα στον πάγο. Η αποτελεσματικότητα της πέψης εξαρτάται από τη συγκέντρωση του PCR προϊόντος, τον τελικό όγκο της αντίδρασης, τη συγκέντρωση του ενζύμου (σε Units), τη θερμοκρασία και τη διάρκεια της κατάτμησης. Τέλος, πριν τη διαδικασία της κατάτμησης, ελέγχεται η ποιότητα των PCR προϊόντων σε πήκτωμα αγαρόζης ή πολυακρυλαμιδίου. Εικόνα 17: Παράδειγμα κατάτμησης γενωμικού DNA με το EcoRI, που έχει ως αποτέλεσμα το σχηματισμό θραυσμάτων διαφορετικού μεγέθους ( 50

51 Β.7 Διαδικασία και Αντιδραστήρια της PCR Για την PCR, χρησιμοποιήθηκε το προτυποποιημένο σύστημα (kit) KAPA2G Fast HotStart ReadyMix της εταιρίας KAPA BIOSYSTEMS. Το συγκεκριμένο kit αποτελείται από ένα έτοιμο μίγμα που περιλαμβάνει όλα τα απαραίτητα αντιδραστήρια της PCR, εκτός από τους εκκινητές και το υπόστρωμα. Συγκεκριμένα, περιέχει DNA πολυμεράση, ρυθμιστικό διάλυμα, δεοξυνουκλεοτίδια (dntps), συγκέντρωσης 0,2mM και MgCl2, συγκέντρωσης 1,5 mm. Όσον αφορά τα αναλώσιμα πλαστικά, χρησιμοποιήθηκαν σωληνάκια PCR αντίδρασης (PCR tubes) strips, 8 θέσεων, χωρητικότητας 200 μl και ακρορύγχια με φίλτρο (filter tips), με σκοπό την αποφυγή επιμολύνσεων. Απαιτείται μεγάλη προσοχή στον καθαρισμό του χώρου προετοιμασίας και των αυτόματων πιπετών PCR, που επιτυγχάνεται με τη χρήση αιθανόλης 70% και διαλύματος DNA-- ExitusPlusTM της εταιρίας Applichem (πρόκειται για ένα ειδικό καθαριστικό κατά των επιμολύνσεων από DNA και RNA). Επιπλέον, ο εργαστηριακός πάγκος προετοιμασίας των αντιδράσεων απομονώνεται χωρικά από τους χώρους όπου γίνεται διαχείριση PCR προϊόντων για αποφυγή επιμολύνσεων (3 room rule). B.8 Πρωτόκολλα κατά την εφαρμογή των PCR Β.8.1 rs (NOS1) Για τη μελέτη του πολυμορφισμού rs816361, που εντοπίζεται στο γονίδιο NOS1 και χαρακτηρίζεται από τη νουκλεοτιδική αλλαγή C>G, πραγματοποιήθηκε απλή PCR, προκειμένου να πολλαπλασιαστεί το τμήμα του DNA που μας ενδιαφέρει. Έπειτα, τα PCR προϊόντα καθαρίστηκαν και στάλθηκαν για αλληλούχηση (sequencing) κατά Sanger, για την οποία θα μιλήσουμε παρακάτω. Στον Πίνακα 2 παρουσιάζονται οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν, ενώ στον Πίνακα 3 συνοψίζεται το σύνολο των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν. 51

52 Πίνακας 2: Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον πολυμορφισμό rs Παρουσιάζεται η αλληλουχία τους, το μέγεθος του PCR προϊόντος και η βέλτιστη θερμοκρασία υβριδισμού. SNP Εκκινητές Μέγεθος PCR προϊόντος Tm rs Πρόσθιος 5..CACAGTCTTCTGGTGCCTCA bp 60 C Αντίστροφος 5..GCCGGAGTTGTGACATTTCT..3 Πίνακας 3: Σύνολο αντιδραστηρίων της PCR για τον rs Αντιδραστήρια Αρχική Τελική Όγκος (μl) συγκέντρωση συγκέντρωση 2x 1x 12.5 KAPA2G Fast ΗotStart ReadyMix Πρόσθιος εκκινητής 10μM 0,5μΜ 1,25 Αντίστροφος εκκινητής 10μΜ 0,5μΜ 1,25 DNA-στόχος 50ng/μl 50ng/μl 1 Β.8.2 rs (ASS1) Ο πολυμορφισμός rs (C>T) του γονιδίου ASS1 μελετήθηκε εφαρμόζοντας PCR-RFLP. Αρχικά έγινε πολλαπλασιασμός του DNA-στόχου και έπειτα πέψη με το ένζυμο BsaJI (New England Biolabs). Στους παρακάτω πίνακες απεικονίζονται οι εκκινητές και το σύνολο των αντιδραστηρίων που χρησιμοποιήθηκαν στην PCR. 52

53 Πίνακας 4: Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον πολυμορφισμό rs Φαίνεται η αλληλουχία τους, το μέγεθος του pcr προϊόντος που πλλαπλασιάζεται και η βέλτιστη θερμοκρασία υβριδισμού. SNP Εκκινητές Μέγεθος PCR προϊόντος Tm rs Πρόσθιος 5..GCCAAACACTTCGCTACACA bp 58 C Αντίστροφος '5..CAACAAGACAAACGCACAAGA..3' Πίνακας 5: Σύνολο αντιδραστηρίων της PCR για τον rs Αντιδραστήρια Αρχική Τελική Όγκος (μl) συγκέντρωση συγκέντρωση KAPA2G Fast ΗotStart ReadyMix 2x 1x 12.5 Πρόσθιος εκκινητής 10μM 0,5μΜ 1,25 Αντίστροφος εκκινητής 10μΜ 0,5μΜ 1,25 DNA-στόχος 50ng/μl 50ng/μl 1 Το BsaJI προέρχεται από το βακτήριο Bacillus stearothermophilus J695 και η αλληλουχία που αναγνωρίζει και κατατέμνει στο γενετικό υλικό, φαίνεται στην Εικόνα 7. 53

54 Εικόνα 18: Θέση αναγνώρισης του ενζύμου BsaJI στο γεντικό υλικό ( Οι ιδανικές συνθήκες για την πέψη του PCR προϊόντος με το παραπάνω ένζυμο φαίνονται στον Πίνακα 6. Το BsaJI ενεργοποιείται στους 60 C και ο χρόνος επώασης της αντίδρασης είναι μία ώρα. Πίνακας 6: Σύνολο αντιδραστηρίων για πέψη με το ένζυμο BsaJI Αντιδραστήρια Συγκέντρωση Όγκος (μl) BsaJI 10 Units 1 CutSmart buffer 10x 1 Pcr προϊόν 8 Τελικός όγκος 10 Το PCR προϊόν κατατέμνεται από το ένζυμο BsaJI μία μόνο φορά στη θέση 169 και αναγνωρίζει το C (αρχέγονο) αλληλόμορφο. Εάν τελικά, έχουμε το φυσιολογικό αλληλόμορφο, το ένζυμο κόβει στη θέση αναγνώρισης και προκύπτουν δύο ζώνες με μεγέθη 169bp και 44bp αντίστοιχα. Εάν υπάρχει το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο, το ένζυμο δεν κατατέμνει στη θέση αναγνώρισης, οπότε το PCR προϊόν παραμένει άκοπο (μεγέθους 213bp). 54

55 Β.8.3 rs (ASS1) Η ανάλυση του πολυμορφισμού rs (G>T) του ASS1, πραγματοποιήθηκε με εφαρμογή της PCR-ARMS. Χρησιμοποιήθηκαν λοιπόν, όπως φαίνεται και στον Πίνακα 7, δύο αντίστροφοι εκκινητές και ένας πρόσθιος, ο οποίος ήταν κοινός και για τα δύο μίγματα της αντίδρασης. Και τα δύο μίγματα περιελάμβαναν τα ίδια αντιδραστήρια εκτός από τους εκκινητές, όπου συνδυάζονταν ανά δύο, στο ένα μίγμα ο πρόσθιος εκκινητής για το ένα αλληλόμορφο και στο άλλο μίγμα ο πρόσθιος εκκινητής για το δεύτερο αλληλόμορφο, με τον αντίστροφο εκκινητή να περιλαμβάνεται και στα δύο μίγματα. Πίνακας 7: Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για τον πολυμορφισμό rs Παρουσιάζεται η αλληλουχία τους, το μέγεθος του PCR προϊόντος και η βέλτιστη θερμοκρασία υβριδισμού. SNP Εκκινητές Μέγεθος PCR προϊόντος Tm Πρόσθιος 5 CTTTGGGTTGGGGAGAGAA 3 αντίστοφος εκκινητής G 5...ACATGTTCCCCTTGTACACC...3 rs αλληλομόρφου αντίστροφος εκκινητής Τ 5 ACATGTTCCCCTTGTACACA bp 61 C αλληλομόρφου 55

56 Πίνακας 5: Σύνολο αντιδραστηρίων της PCR για τον rs Αντιδραστήρια Αρχική Τελική Όγκος (μl) συγκέντρωση συγκέντρωση KAPA2G Fast ΗotStart ReadyMix 2x 1x 12.5 Πρόσθιος εκκινητής 10μM 0,5μΜ 1,25 αντίστοφος εκκινητής G αλληλομόρφου 10μΜ 0,5μΜ 1,25 αντίστροφος εκκινητής 10μΜ 0,5μΜ 1,25 Τ αλληλομόρφου DNA-στόχος 50ng/μl 50ng/μl 1 B.9 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη μέθοδος διαχωρισμού, χαρακτηρισμού και απομόνωσης τμημάτων DNA. Η μέθοδος αυτή βασίζεται στη μετακίνηση ηλεκτρικά φορτισμένων μορίων μέσα στο πορώδες πήκτωμα που σχηματίζει η αγαρόζη, όταν πολυμεριστεί, υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου. Το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο, εξαιτίας των φωσφορικών ομάδων του σκελετού του και, συνεπώς, κινείται προς το θετικό πόλο της ηλεκτροφορητικής συσκευής. Η ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης, συνήθως, χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό τμημάτων DNA βάσει του μεγέθους τους. Τα μικρότερα κομμάτια κινούνται πιο γρήγορα από τα μεγαλύτερα μέσα στο πορώδες πήκτωμα. Η ανίχνευση των τμημάτων DNA γίνεται χρησιμοποιώντας βρωμιούχο αιθίδιο, το οποίο παρεμβάλλεται στις αύλακες της δίκλωνης αλυσίδας του DNA και φθορίζει 56

57 έπειτα από διέγερση με UV ακτινοβολία (High performance Ultraviolet Transilluminator- UUP). Για την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης γίνεται χρησιμοποιούνται τα παρακάτω αντιδραστήρια: 1. Ρυθμιστικό Διάλυμα TAE (Tris acetate EDTA) (1 ), το οποίο αραιώνεται από ρυθμιστικό διάλυμα TAE (50x). Η σύσταση του TAE (50x) αποτελείται από 242 g Tris base, 100 ml 0.5 M EDTA (ph 8.0) και απεσταγμένο H2O (dd H2O) έως τελικού όγκου 1000 ml 2. Αγαρόζη της εταιρείας BioRad (Molecular Biology Grade) 3. Βρωμιούχο αιθίδιο της εταιρίας Applichem (10 mg/ml) Προκειμένου να γίνει η ηλεκτροφόρηση χρειάζεται: 1. Ρυθμιστικό διάλυμα TAE (1 ) 2. Διάλυμα φόρτωσης/ Gel Loading Buffer (6 ) της εταιρείας NEB 3. Μάρτυρας 100 bp DNA Ladder (50μg/500ml) Το πήκτωμα αγαρόζης, ανάλογο με το μέγεθος των μορίων DNA και το σκοπό της χρήσης του, μπορεί να έχει διαφορετική περιεκτικότητα σε αγαρόζη. Για την ηλεκτροφόρηση των PCR προϊόντων, στην παρούσα εργασία, χρησιμοποιήθηκε πήκτωμα 1,5 % w/v (κυρίως για προϊόντα μεγαλύτερου μεγέθους όπως bp). Στην περίπτωση PCR προϊόντων μικρότερου μεγέθους (προϊόντα κατάτμησης με περιοριστικές ενδονουκλεάσες), προτιμάται πήκτωμα υψηλότερης περιεκτικότητας σε αγαρόζη (2% w/v), για τον καλύτερο διαχωρισμό των προϊόντων. 57

58 Β.10 Καθαρισμός PCR-προιόντων Πριν λάβει χώρα η αλληλούχηση κατά Sanger των PCR προϊόντων, είναι απαραίτητο αυτά να καθαριστούν από τα υπολείμματα αλάτων και ενζύμων, προκειμένου τα αποτελέσματα να είναι αξιόπιστα. Για τον καθαρισμό των PCR προϊόντων, χρησιμοποιήθηκε το προτυποποιημένο σύστημα NucleoSpin Gel and PCR Clean-up Kit από τη MACHEREY-NAGEL. Η διαδικασία καθαρισμού που ακολουθήθηκε ήταν η εξής: 1. Προσθήκη διαλύματος πρόσδεσης (NTI Buffer) σε διπλάσσια αναλογία από αυτή του pcr προϊόντος (20λ pcr προϊόν, 40λ ΝΤΙ buffer) 2. Μεταφορά του μείγματος σε στήλη (spin column, μια για κάθε δείγμα) 3. Φυγοκέντρηση για 30 δεύτερα σε ταχύτητα g, απόρριψη του υπερκειμένου και ελαφρό στράγγισμα σε στεγνό χαρτί 4. Προσθήκη 700μl διαλύματος πλύσης ΝΤ3 Buffer στη στήλη 5. Φυγοκέντρηση για 30 δεύτερα σε ταχύτητα g, απόρριψη του υπερκειμένου και ελαφρό στράγγισμα σε στεγνό χαρτί 6. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό στα 11,000 g 7. Μεταφορά της στήλης σε καθαρό 1,5 ml eppendorf tube και επώαση για 2 λεπτά στος 70 C 8. Προσθήκη 20μl διαλύματος έκλουσης (ΝΕ Buffer) στη στήλη και επώαση για 5 λεπτά σε θερμοκρασία 70 C 9. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε ταχύτητα g 10. Προσθήκη 20μl διαλύματος έκλουσης (ΝΕ Buffer) στη στήλη και επώαση για 1 λεπτό σε θερμοκρασία δωματίου 11. Φυγοκέντρηση για 1 λεπτό σε ταχύτητα g 12. Παραλαβή του καθαρού προϊόντος και αποθήκευσή του στους -20 ο C 58

59 Β.11 Αλληλούχηση (sequencing) DNA κατά Sanger Η μέθοδος αλληλούχησης κατά Sanger ή αλλιώς, η αλληλούχηση με διδεοξυνουκλεοτίδια χρησιμοποιείται συχνά για τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του DNA και ανακαλύφθηκε από το Fred Sanger στη δεκαετία του Και σε αυτή τη μέθοδο, έπειτα από την αποδιάταξη του DNA με θέρμανση, υβριδοποιείται ο εκκινητής που είναι συμπληρωματικός ως προς το DNA-στόχο και γίνεται επιμήκυνση παρουσία πολυμεράσης. Για κάθε πείραμα αλληλούχησης πραγματοποιούνται τέσσερις ανεξάρτητες αντιδράσεις. Σε όλες τις αντιδράσεις, πέραν του αποδιαταγμένου DNA, της πολυμεράσης, του εκκινητή και των τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων (datp, dttp, dctp, dgtp), περιλαμβάνεται και μικρή ποσότητα ενός τροποποιημένου τριφωσφορικού νουκλεοσιδίου, του διδεοκυνουκλεοτιδίου (ddntp). Τα διδεοξυνουκλεοτίδια διαφέρουν από το φυσιολογικά δεοξυνουκλεοτίδια, ως προς το ότι φέρουν στη θέση 3 της δεοξυριβόζης υδρογόνο αντί μιας υδροξυλομάδας (Εικόνα 8). Εικόνα 19: Η δομή ενός διδεοξυνουκλεοτιδίου (ddntp) ( 59

60 Σε καθεμία από τις τέσσερις αντιδράσεις προστίθεται ένα από τα τέσσερα πιθανά διδεοξυνουκλεοτίδια, τα οποία είναι σημασμένα. Οι τέσσερις αντιδράσεις διαφέρουν ως προ το ποιο ddntp διαθέτουν. Ανάλογα με το που ενσωματώνεται το κάθε ddntp, παύει η σύνθεση του DNA, λόγω της αδυναμίας της πολυμεράσης. Σχηματίζονται, λοιπόν, διαφορετικά τμήματα γενετικού υλικού, τα οποία διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθός τους με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης και με αυτοραδιογραφία προσδιορίζεται η αλληλουχία των τμημάτων. Σήμερα, η διαδικασία της αλληλούχησης έχει αυτοματοποιηθεί, καθιστώντας δυνατή την πραγματοποίηση μιας μόνο αντίδρασης, στην οποία περιέχονται και τα τέσσερα διδεοξυνουκλεοτίδια σημασμένα με διαφορετική χρωστική. Τα τμήματα του DNA που συντίθενται διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση. Στο κάτω μέρος του πηκτώματος υπάρχει μια συσκευή laser που διεγείρει τις φθορίζουσες χρωστικές και εν συνεχεία, καταγράφεται η ακτινοβολία που εκμπέμπουν. Το αποτέλεσμα αποδίδεται γραφικά ως μια σειρά έγχρωμων κορυφών που αντιστοιχούν στα διαδοχικά νουκλεοτίδια της αλληλουχίας υπό προσδιορισμό (Εικόνα 9). Η αυτοματοποίηση της διαδικασίας έχει ως αποτέλεσμα τη σημαντική επιτάχυνση της (Russell J.P.,2005). Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε στο Τμήμα Παθολογίας του Πανεπιστημίου των Ηνωμένων Αραβικών Εμιράτων σε συνεργασία με την κυρία Anne John (υπό την φροντίδα του Καθηγητή Μοριακής και Γενετικής Ιατρικής Bassam R. Ali). 60

61 Εικόνα 20: Χαρακτηριστική εικόνα χρωματογραφήματος, με κάθε βάση του DNA να απεικονίζεται και με διαφορετικό χρώμα. Β.12 Στατιστική επεξεργασία των πειραματικών δεδομένων Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων βοηθά στη σωστή αξιολόγηση των πειραματικών δεδομένων. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε έλεγχος των υπό μελέτη πληθυσμιακών ομάδων αναφορικά με τους γενετικούς τόπους του ενδιαφέροντος και την ικανοποίηση της «ισορροπίας Hardy-Weinberg». Η ικανοποίηση της «ισορροπίας Hardy-Weinberg» εξασφαλίζει την τυχαιότητα των διασταρώσεων στους πληθυσμούς μας, στον γενετικό τόπο που μελετάμε. Για αυτό, εφαρμόστηκε η δοκιμασία «chi square goodness of fit». Εάν υπάρχει ισορροπία, γίνεται περαιτέρω στατιστική ανάλυση των δεδομένων μας μέσω του αμφίπλευρου ακριβή ελέγχου του Fisher (two tailed Fisher s exact test), βάσει του μεγέθους των πληθυσμών μας. Β.12.1 «Ισορροπία Hardy-Weinberg» Η ισορροπία Hardy-Weinberg αποτελεί τη βάση της πληθυσμιακής γενετικής και πήρε το όνομα της από τα δύο άτομα που την ανακάλυψαν, ανεξάρτητα ο ένας από τον άλλον, στις αρχές του εικοστού αιώνα. Η ισοορροπία εξηγεί τη 61

62 συμπεριφορά των συχνοτήτων των αλληλομόρφων και των γονοτύπων ενός πληθυσμού, όταν τα αλληλόμορφα μεταβιβάζονται από τη μία γενιά στην επόμενη, απουσία εξελικτικών δυνάμεων. Συγκεκριμένα, πρεσβεύει το γεγονός ότι όλες οι διασταυρώσεις ενός συνόλου ατόμων ή ενός πληθυσμού είναι τυχαίες και έχουν ίσες πιθανότητες. Η απόκλιση σε έναν πληθυσμό από την ισορροπία Hardy- Weinberg έχει σημαντική εξελικτική σημασία και αποτελεί τη βάση διερεύνησης για την αποκάλυψη των εν λόγω εξελικτικών παραγόντων. Βασικές προϋποθέσεις για την ισχύ της ισορροπίας Hardy-Weinberg είναι οι παρακάτω: Το μέγεθος του πληθυσμού να είναι άπειρο. Ωστόσο, δεν χρειάζεται να είναι άπειροι σε μέγεθος οι πληθυσμοί για να επιτευχθεί μια καλή προσέγγιση των γονοτυπικών συχνοτήτων. Οι διασταυρώσεις πρέπει να είναι τυχαίες. Ουσιαστικά, οι διασταυρώσεις μεταξύ των γονοτύπων να είναι ανάλογες με τις συχνότητες των γονοτύπων σε ένα πληθυσμό. Ο πληθυσμός πρέπει να έιναι απαλλαγμένος από μεταλαγή, μετανάστευση και φυσική επιλογή. Εάν ισχύει η ισορροπία Hardy-Weinberg (ο πληθυσμός βρίσκεται σε γενετική ισορροπία), τότε οι συχνότητες των αλληλομόρφων δε μεταβάλλονται από γενιά σε γενιά και κατανέμονται ανάλογα με τις συχνότητες των γονοτύπων. Εάν p είναι η συχνότητα ενός αλληλομόρφου και q η συχνότητα του άλλου, τότε οι συχνότητες των τριών γονοτύπων δίδονται από το ανάπτυγμα του διωνύμου (p+q)2 = p 2 + 2pq + q 2, όπου p 2 η συχνότητα εμφάνισης του ενός ομοζυγώτη, 2pq η συχνότητα εμφάνισης του ετεροζυγώτη και q 2 η συχνότητα εμφάνισης του άλλου ομοζυγώτη. Ο πληθυσμός p 2 : 2pq : q 2 θεωρείται ότι βρίσκεται σε ισορροπία και οι παρατηρηθέντες ομοζυγωτικοί γονότυποι είναι ίσοι με το τετράγωνο των γονιδιακών τους συχνοτήτων. Ο έλεγχος της ισορροπίας του Hardy-Weinberg, στην παρούσα εργασία, πραγματοποιήθηκε εφαρμόζοντας τη στατιστική δοκιμασία Chi square Goodness of fit test. Για την εφαρμογή της δοκιμασίας είναι απαραίτητος ο υπολογισμός του chi-square ή c 2 ή κριτήριο χ 2 (Russell J.P., 2006; Leal M.S., 2005). 62

63 Ο έλεγχος χ 2 επιτρέπει τον υπολογισμό της απόκλισης ανάμεσα στις θεωρητικά αναμενόμενες συχνότητες και στις παρατηρούμενες. Το κριτήριο χ 2 υπολογίζεται από την εξίσωση: χ 2 = Σ(Π-Α) 2 Α όπου Π είναι οι παρατηρούμενες τιμές και Α οι θεωρητικώς αναμενόμενες τιμές. Η τιμή χ 2 υποδεικνύει για συγκεκριμένους βαθμούς ελευθερίας, την πιθανότητα (p) συμφωνίας των παρατηρούμενων με τις θεωρητικά αναμενόμενες συχνότητες. Ως επίπεδο σημαντικότητας, στην παρούσα εργασία, ορίστηκε το 5% (1 βαθμός ελευθερίας). Ως εκ τούτου, πιθανότητα μεγαλύτερη του επιπέδου σημαντικότητας σημαίνει ότι δεν υφίσταται στατιστικά σημαντική διαφορά ανάμεσα στον θεωρητικά αναμενόμενο και παρατηρούμενο πληθυσμό και συνεπώς, ο πληθυσμός για τον συγκεκριμένο γενετικό τόπο είναι σε ισορροπία Hardy Weinberg. Η τιμή του κριτηρίου χ 2 προκύπτει από το άθροισμα των επιμέρους τετραγώνων για κάθε γονότυπο. Η χ 2 κριτική τιμή που θα καθορίσει την αποδοχή ή την απόρριψη της Ηο υπόθεσης (η ισορροπία Hardy Weinberg είναι σε ισχύ) είναι ίση προς του 3,841. Β.12.2 Αμφίπλευρος ακριβής έλεγχος του Fisher Ο αμφίπλευρος ακριβής έλεγχος του Fisher είναι ένας μη παραμετρικός έλεγχος, ανεξαρτησίας και ομοιογένειας. Μέσω αυτού του ελέγχου, πραγματοποιείται η ανάλυση διακριτών δεδοµένων, όταν τα δύο ανεξάρτητα δείγµατα έχουν µικρό µέγεθος. Tα αποτελέσµατα αυτών των δειγµάτων αντιστοιχούν στη µια από τις δύο τυχαίες κατηγορίες και κάθε στοιχείο αυτών είναι δυνατό να έχει το ένα από τα δύο χαρακτηριστικά. Ο έλεγχος δεν εξετάζει μόνο την παρατηρούμενη περίπτωση, αλλά υπολογίζει και την πιθανότητα πιο ακραίων περιπτώσεων. Η τιμή p υπολογίζεται με το άθροισμα των πιθανοτήτων όλων των ακραίων περιπτώσεων και του δοσμένου πίνακα. Στην παρούσα μελέτη, αξιοποιήσαμε πίνακες μορφής 3x2 και 2x2. 63

64 Με τη χρήση του ακριβή ελέγχου του Fisher λαµβάνουµε πιο ακριβές τιμές p ( Οι υπολογισμοί έγιναν χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα in-silico.net ( 64