Δ. ΣΙΔΕΡΗΣ. Ειδικά κεφάλαια βιοχημείας

Transcript

1 Δ. ΣΙΔΕΡΗΣ Ειδικά κεφάλαια βιοχημείας

2 Έλεγχος της γονιδιακή έκφρασης

3 Γονιδιακή έκφραση στους προκαρυωτικούς και ευκαρυωτικούς οργανισμούς.

4 Το κύτταρο μπορεί να ρυθμίσει τη σύνθεση των πρωτεϊνών ελέγχοντας: 1. Πότε και πόσο συχνά ένα συγκεκριμένο γονίδιο μεταγράφεται. (μεταγραφικός έλεγχος). 2. Πώς το πρωτογενές RNA μετάγραφο συρράπτεται. (έλεγχος της ωρίμανσης του RNA). 3. Ποια από τα ώριμα mrnas θα περάσουν από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. (έλεγχος της μεταφοράς του RNA). 4. Ποια από τα κυτταροπλασματικά mrnas θα μεταφραστούν στα ριβοσώματα. (μεταφραστικός έλεγχος). 5. Την αποικοδόμηση επιλεγμένων μορίων mrna στο κυτταρόπλασμα. (έλεγχος της αποικοδόμησης του mrna). 6. Την εκλεκτική ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση των πρωτεϊνικών μορίων πού έχουν ήδη συντεθεί. (έλεγχος της ενεργότητας της πρωτεΐνης).

5 Τα επίπεδα έκφρασης των πρωτεϊνών σε κύτταρα Θηλαστικών αποδίδονται κατά 40% σε ρύθμιση σε επίπεδο mrna Α) Ρύθμιση της μεταγραφής Β) Ρύθμιση της αποικοδόμησης

6 H αποικοδόμηση του RNA Όλα τα μόρια RNA τελικά αποικοδομούνται, τα συστατικά τους ανακυκλώνονται Η ενδοκυτταρική συγκέντρωση κάθε RNA καθορίζεται από το ισοζύγιο μεταξύ του ρυθμού σύνθεσης και του ρυθμού αποικοδόμησης. Σε όλους τους οργανισμούς που έχουν μελετηθεί, ανεξάρτητα από το Βασίλειο στο οποίο ανήκουν, η αποικοδόμηση μορίων RNA είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την κυτταρική επιβίωση.

7 Ριβονουκλεάσες Οι ριβονουκλεάσες είναι οι κύριοι καταλύτες του RNA καταβολισμού και συμμετέχουν σε ένα μεγάλο πλήθος διαφορετικών διεργασιών τόσο σε φυσιολογικές όσο και σε παθολογικές καταστάσεις. Λειτουργούν κυρίως ως: Παράγοντες ωρίμανσης μορίων RNA από πρόδρομα μόρια μεγαλύτερου μήκους Συστατικά συμπλεγμάτων ποιοτικού ελέγχου των RNA ώστε να αποικοδομούνται τα ελαττωματικά μόρια Μηχανισμοί προστασίας έναντι εισβολής ιικών RNA και μεταθετών στοιχείων Μόρια σηματοδότησης μονοπατιών μεταγωγής σήματος που ελέγχουν την γονιδιακή έκφραση σε μεταμεταγραφικό επίπεδο Εξωκυττάρια ένζυμα που αποικοδομούν το RNA της τροφής

8 Ριβονουκλεάσες Οι ριβονουκλεάσες είναι μια εξαιρετικά ετερογενής ομάδα ενζύμων με κοινό χαρακτηριστικό την αποικοδόμηση RNA. Ως προς την υποστρωματική τους εξειδίκευση μπορούν να ταξινομηθούν σε τρεις κύριες κατηγορίες 1) Τις ενδοριβονουκλεάσες που διασπούν μόρια RNA σε εσωτερικές θέσεις, 2) Τις 5 εξωνουκλεάσες και 3) Τις 3 εξωνουκλεάσες που καταλύουν την αποικοδόμηση RNA από το 5 και 3 άκρο του μορίου αντίστοιχα

9 Stoecklin G, Muhlemann O (2013) Εμπλοκή των ριβονουκλεασών σε κυτταρικές διαδικασίες Ποιοτικός έλεγχος των RNAs Άμυνα έναντι εισβολής ξένου RNA Ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης

10 H αποικοδόμηση του RNA Η αποικοδόμηση των ενδοκυττάριων RNAs καταλύεται από περισσότερες από 30 οικογένειες ριβονουκλεασών. Υπολογίζεται ότι ο συνολικός αριθμός ριβονουκλεασών είναι 24 στην E.coli, 25 στον B. subtilis, τουλάχιστον 34 στον S.cerevisiae και περισσότερες από 60 στον άνθρωπο. Πολλά από τα ένζυμα αυτά είναι ομόλογα, άλλα από αυτά καταλύουν τις ίδιες αντιδράσεις ενώ ορισμένα από αυτά εντοπίζονται σε συγκεκριμένους οργανισμούς ή ακόμη και σε ιστούς ή αναπτυξιακά στάδια.

11 Χαρακτηριστικά των μονοπατιών αποικοδόμησης RNA Ίσως το πιο αξιοσημείωτο χαρακτηριστικό των μηχανισμών RNA αποικοδόμησης είναι η πολύ υψηλή αποδοτικότητά τους. Σε ζυμομύκητες με μεταλλαγμένα ριβοσωμικά συστατικά και ως εκ τούτου αδυναμία σύνθεσης ριβοσωμάτων, τα pre-rrnas αποικοδομούνται χωρίς καν να είναι δυνατή η in vitro ανίχνευση ενδιάμεσων προϊόντων: RNA μόρια μήκους χιλιάδων βάσεων απλά εξαφανίζονται σε μερικά δευτερόλεπτα παρά την τεράστια αφθονία τους.

12 Εξελικτικές πιέσεις που πιθανώς οδήγησαν σε υψηλή αποδοτικότητα 1. Ανάγκη άμεσης αποικοδόμησης μικρών μορίων RNA (όπως mirnas, sirnas και pirnas) τα οποία επηρεάζουν την γονιδιακή έκφραση (και όχι μόνο) μέσω μίας πληθώρας μηχανισμών: αποφυγή λανθασμένης συσσώρευσης ενεργών RNA μορίων 2. Η συσσώρευση RNA μορίων μπορεί να εμποδίσει την αντιγραφή του DNA σχηματίζοντας RNA-DNA υβρίδια 3. Οι πρωτεΐνες που δεσμεύουν RNA βρίσκονται σε χαμηλά επίπεδα συνεπώς τα RNA μόρια ανταγωνίζονται για την δέσμευσή τους σε αυτές 4. Ανάπτυξη μηχανισμών ταχείας αποικοδόμησης με σκοπό την καταστολή έκφρασης ιικών μορίων RNA

13 Χαρακτηριστικά των μονοπατιών αποικοδόμησης RNA Πλεονασμός: διαφορετικά ένζυμα στον ίδιο οργανισμό έχουν την ίδια ριβονουκλεολυτική ενεργότητα Τα περισσότερα γονιδιώματα οργανισμών κωδικοποιούν την σύνθεση μεγάλου αριθμού ριβονουκλεασών, συχνά με επικαλυπτόμενες ενεργότητες. Με ορισμένες σημαντικές εξαιρέσεις, η μετάλλαξη που οδηγεί σε απώλεια ενεργότητας μιας μόνο ριβονουκλεάσης συνήθως δεν οδηγεί σε σημαντική αποσταθεροποίηση των μηχανισμών αποικοδόμησης σε ευκαρυωτικά ή προκαρυωτικά κύτταρα. Το γεγονός αυτό δείχνει ότι το ίδιο RNA μπορεί να αποτελεί ταυτόχρονα στόχο για περισσότερες ριβονουκλεάσες. Αυτό το χαρακτηριστικό αυξάνει σημαντικά την αποδοτικότητα και την δυναμική των μονοπατιών αποικοδόμησης.

14 Χαρακτηριστικά των μονοπατιών αποικοδόμησης RNA Πολλαπλές λειτουργίες: Ορισμένες ριβονουκλεάσες δηλαδή μπορούν είτε να διασπούν μερικώς είτε πλήρως τα RNA-στόχους, εμφανίζοντας λεπτές δυνατότητες εξειδίκευσης ανάλογα με το υπόστρωμα στο οποίο δεσμεύονται. Η πολλαπλή δραστικότητα και η ειδικότητα που χαρακτηρίζει πολλές ριβονουκλεάσες έχει ιδιαίτερη σημασία στους μηχανισμούς εντοπισμού και αποικοδόμησης ελαττωματικών RNAs, καθώς και συμπλόκων RNA πρωτεϊνών. Αυτή η ειδικότητα συχνά επιτυγχάνεται από πρωτεϊνικούς ή άλλης φύσης συμπαράγοντες, ορισμένοι από τους οποίους έχουν ταυτοποιηθεί και ο ρόλος τους στις διαδικασίες αποικοδόμησης έχει προσδιοριστεί. Συμπαράγοντες που ρυθμίζουν την αποικοδόμηση μορίων RNA: 1. Ένζυμα, όπως RNA ελικάσες και RNA πολυμεράσες 2. Μικρά ρυθμιστικά μόρια RNA 3. Πρωτεΐνες συνοδοί

15 Κατηγορίες αντιδράσεων διάσπασης RNA Η διάσπαση των μορίων RNA πραγματοποιείται στα πλαίσια ενός μεγάλου αριθμού κυτταρικών λειτουργιών. Ωστόσο, όλες οι ενδοκυττάριες αντιδράσεις διάσπασης μορίων RNA υπάγονται σε μία από τις επόμενες γενικότερες κατηγορίες: 1. Αντιδράσεις επεξεργασίας και τροποποίησης (processing) 2. Αντιδράσεις αποικοδόμησης μορίων RNA που δεν είναι πλέον χρήσιμα για το κύτταρο 3. Αντιδράσεις ποιοτικού ελέγχου και διάσπασης ελαττωματικών μορίων RNA

16 Αποικοδόμηση πλεοναζόντων μορίων RNA: Η ρύθμιση της αποικοδόμησης των μορίων mrnas αποτελεί έναν από τους κυριότερους μηχανισμούς ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης. Ομοίως, τα περισσότερα χαρακτηρισμένα μικρά ρυθμιστικά RNAs υφίστανται συνεχή αποικοδόμηση προκειμένου να επιτυγχάνεται η αυστηρή ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης των mrna στόχων. Αντιδράσεις ποιοτικού ελέγχου: Τα μονοπάτια επιτήρησης μορίων RNA φαίνεται να αναγνωρίζουν και να διασπούν όλες τις ομάδες ευκαρυωτικών RNAs και συμπλόκων RNA-πρωτεϊνών απομακρύνοντας τα ελαττωματικά προϊόντα. Η μελέτη των αντίστοιχων μηχανισμών είναι σημαντικά δυσκολότερη επειδή σπάνια υφίσταται in vivo συσσώρευση ελαττωματικών προϊόντων.

17 Αποικοδόμηση των ευκαρυωτικών mrnas 1. Γενικά μονοπάτια αποικοδόμησης των mrnas - Σημαντικός ρόλος στην ρύθμιση των γενικών επιπέδων έκφρασης σε επίπεδο RNA 2. Εξειδικευμένα μονοπάτια αποικοδόμησης mrnas - Ρύθμιση αποικοδόμησης mrna ως απόκριση σε ερεθίσματα: ορμόνες, στάδιο του κυτταρικού κύκλου, μόλυνση από ιούς, διαφοροποίηση, διαθεσιμότητα θρεπτικών, καταπόνηση 3. Αποικοδόμηση ελαττωματικών μορίων mrna - Μηχανισμός ποιοτικού ελέγχου για την απομάκρυνση μηνυμάτων που δεν μεταφράζονται σωστά 4. Σωμάτια επεξεργασίας (P bodies)

18 Η ωρίμανση προσδίδει σταθερότητα στο mrna 1. Προσθήκη του 5 καλύματος και πρόσδεση του CBC (Cap binding complex) Nucleus Cytoplasm 2. Προσθήκη της 3 poly(a) ουράς και πρόσδεση PABP (polya binding proteins) 3. Κυκλοποίηση του mrna μετά τον πρώτο κύκλο μετάφρασης μέσω αλληλεπίδρασης του eif4g και της PABP Goldstrohm & Wickens (2008) Nat Rev Mol Cell Biol 9:337

19 H αποικοδόμηση του RNA Η δομή ενός τυπικού μορίου mrna περιλαμβάνει στους προκαρυωτικούς και στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς στοιχεία που αναστέλλουν την δράση ριβονουκλεασών και άλλα που την επάγουν. Έτσι κάθε μόριο mrna έχει συγκεκριμένη διάρκεια ζωής που καθορίζεται από την αλληλουχία του και από το περιβάλλον στο οποίο βρίσκεται.

20 Μέσος χρόνος ημιζωής mrna: E. coli: 4 min (2-10 min) Ζυμομύκητας: Άνθρωπος: 22 min (4-40 min) 10 hours ( hours)

21 Πειραματικός προσδιορισμός της σταθερότητας mrna Ανάλυση κατά Northern του ACT1 mrna Και μιας μεταλλαγμένης μορφής του (tpa1δ) Αναστολή μεταγραφής 1. Καταστολή της μεταγραφής: κυρίως με προσθήκη ακτινομυκίνης D σε κύτταρα θηλαστικών Χρόνος (m) WT tpa Απομόνωση mrna σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα μετά την καταστολή της μεταγραφής % ACT Χρόνος (m) t 1/2 = tpa1 24 min t 1/2 = wild type 12 min Keeling et al. (2006) Mol Cell Biol 26: Προσδιορισμός των επιπέδων έκφρασης του mrna-στόχου στα συγκεκριμένα διαστήματα: ανάλυση κατά Northern ή Real time PCR 4.Γραφική απεικόνιση των επιπέδων αποικοδόμησης σε λογαριθμικό χαρτί. Η κλίση αντιστοιχεί στον ρυθμό αποικοδόμησης και προσδιορίζεται ο χρόνος ημιζωής για κάθε mrna.

22 Τα mrnas αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες και σχηματίζουν mrnps Τα mrnas αλληλεπιδρούν με έναν συνεχώς μεταβαλλόμενο πληθυσμό πρωτεϊνών καθ όλη τη διάρκεια του κύκλου ζωής τους, προσδίδοντάς τους συγκεκριμένες ιδιότητες. Στα κύτταρα εκφράζεται ένας μεγάλος αριθμός πρωτεϊνών που προσδένονται σε RNA (RNA-binding proteins: RBPs) οι περισσότερες από τις οποίες δεν έχουν χαρακτηριστεί.

23 Το κύριο μονοπάτι αποικοδόμησης ευκαρυωτικών mrnas m7gppp AAAAAAAAAAAAAAAA Αποαδενυλίωση Σύμπλεγμα αποαδενυλασών m7gppp AAA Απομάκρυνση καλύματος Decapping enzyme (σύμπλοκο DCP1) AAA Εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση Διάσπαση του mrna

24 Τα κύρια μονοπάτια αποικοδόμησης ευκαρυωτικών mrnas

25 Στα θηλαστικά η αποαδενυλίωση πραγματοποιείται σε δύο διακριτές φάσεις Muhlemann (2005) Nat Struct Mol Biol 12:1024

26 Ο μηχανισμός αποαδενυλίωσης 1) PAN σύμπλοκο: -Πρώτη φάση -αργή διάσπαση - Αποτελείται από PAN2 (καταλυτική) και PAN3 (ρυθμιστική) υπομονάδα. Επάγεται από την PABP - Δρα και σε πυρηνικά RNA 2) CCR4/NOT σύμπλοκο: - Δεύτερη φάση - Ταχεία αποικοδόμηση - Αναστέλλεται από PABΡ - Δρα σε συνδυασμό με άλλες πρωτεΐνες αλλά και ως μεταγραφικός παράγοντας Parker & Song (2004) Nat Struct Mol Biol 11:121 3) PARN σύμπλοκο: - Εξειδικευμένη αποαδενυλίωση συγκεκριμένων mrnas μέσω AU στοιχείων.

27 Η αποαδενυλίωση συνδέεται με τη λήξη της μετάφρασης Hosoda et al (2003) JBC 278:38287 Ο παράγοντας λήξης erf3 είναι μία GTPάση που επάγει τη λήξη της μετάφρασης Το αμινοτελικό άκρο του erf3 αλληλεπιδρά με το καρβοξυτελικό άκρο της PΑΒΡ απομακρύνοντας την από την poly(a) ουρά. Η poly(a) ουρά δεν προστατεύεται πλέον και εκτίθεται στην δράση των αποαδενυλασών αποσταθεροποιώντας έτσι το mrna.

28 Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, (2013) Η απομάκρυνση της poly(a) ουράς αρχικά πραγματοποιείται από την poly(a) nuclease 2 (PAN2) PAN3 αποαδενυλάση που επηρεάζεται από την PABP. Εν συνεχεία, η αποαδενυλίωση προχωρά από το σύμπλοκο CCR4 NOT, το οποίο αναστέλλεται από την PABP, αλλά επηρεάζεται με ειδικό για κάθε mrna- τρόπο από trans-acting πρωτεΐνες που δεσμεύονται στην (3 UTR). Από τη στιγμή που οι εναπομείναντες αδενίνες φτάσουν τις 12 ή λιγότερες, οι PABP δεν μπορούν να συγκατηθούν και η αποικοδόμηση προχωρά είτε 3 5 εξωνουκλεολυτικά από το σύμπλοκο του εξοσώματος, ή συνηθέστερα μέσω της πρόσδεσης του PAT1 LSM1 LSM7 συμπλόκου, το οποίο επάγει την απομάκρυνση του καπέλου από την decapping protein 1 (DCP1) DCP2 και ακολούθως την 5 3 εξωνουκλεολυτική διάσπαση από την XRN1.

29 Ο ρυθμός αποαδενυλίωσης ενός αγγελιοφόρου RNA (mrna) σε κύτταρα θηλαστικών προσδιορίζεται από μια σειρά ρυθμιστικών παραγόντων

30 2 η Διάλεξη

31 Αποικοδόμηση των ευκαρυωτικών mrnas 1. Γενικά μονοπάτια αποικοδόμησης των mrnas - Σημαντικός ρόλος στην ρύθμιση των γενικών επιπέδων έκφρασης σε επίπεδο RNA 2. Εξειδικευμένα μονοπάτια αποικοδόμησης mrnas - Ρύθμιση αποικοδόμησης mrna ως απόκριση σε ερεθίσματα: ορμόνες, στάδιο του κυτταρικού κύκλου, μόλυνση από ιούς, διαφοροποίηση, διαθεσιμότητα θρεπτικών, καταπόνηση 3. Αποικοδόμηση ελαττωματικών μορίων mrna - Μηχανισμός ποιοτικού ελέγχου για την απομάκρυνση μηνυμάτων που δεν μεταφράζονται σωστά 4. Σωμάτια επεξεργασίας (P bodies)

32 Τα κύρια μονοπάτια αποικοδόμησης ευκαρυωτικών mrnas

33 Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, (2013) Η απομάκρυνση της poly(a) ουράς αρχικά πραγματοποιείται από την poly(a) nuclease 2 (PAN2) PAN3 αποαδενυλάση που επηρεάζεται από την PABP. Εν συνεχεία, η αποαδενυλίωση προχωρά από το σύμπλοκο CCR4 NOT, το οποίο αναστέλλεται από την PABP, αλλά επηρεάζεται με ειδικό για κάθε mrna- τρόπο από trans-acting πρωτεΐνες που δεσμεύονται στην (3 UTR). Από τη στιγμή που οι εναπομείναντες αδενίνες φτάσουν τις 12 ή λιγότερες, οι PABP δεν μπορούν να συγκατηθούν και η αποικοδόμηση προχωρά είτε 3 5 εξωνουκλεολυτικά από το σύμπλοκο του εξωσώματος, ή συνηθέστερα μέσω της πρόσδεσης του PAT1 LSM1 LSM7 συμπλόκου, το οποίο επάγει την απομάκρυνση του καπέλου από την decapping protein 1 (DCP1) DCP2 και ακολούθως την 5 3 εξωνουκλεολυτική διάσπαση από την XRN1.

34 Ένζυμα απομάκρυνσης καλύμματος Dcp1 Hedls - Dcp2 = καταλυτική υπομονάδα - Dcp1 = ενεργοποιεί την Dcp2 - Hedls = ενεργοποιεί επίσης την Dcp2 στα θηλαστικά Ζυμομύκητας Dcp2 Άνθρωπος Simon et al. (2006) TIBS 31:241 - Dcp2 εμφανίζει ιστοειδικό πρότυπο έκφρασης - Ένα ακόμη ένζυμο, το Nudt16, ανιχνεύθηκε στο κυτταρόπλασμα των θηλαστικών Nudt16 Τα Nudt16 και Dcp2 φαίνεται να δρουν το καθένα σε συγκεκριμένους πληθυσμούς μεταγράφων. Taylor & Peculis (2008) NARS 36:6021

35 Το εξώσωμα Είναι ένα μεγάλο πρωτεϊνικό σύμπλοκο με ενεργότητα 3 5 εξωνουκλεάσης που περιέχει τουλάχιστον 10 πρωτεΐνες και συμμετέχει: Στην πλήρη αποικοδόμηση των φυσιολογικών mrnas στο κυτταρόπλασμα Στην απομάκρυνση ελαττωματικών mrnas Στην τροποποίηση συγκεκριμένων RNAs στον πυρήνα

36 Υπομονάδες του πυρήνα: απαραίτητες Rrp4 Rrp40 Csl4 Rrp41/Ski6 Rrp42 Rrp43 Rrp44/Dis3 Rrp45 Rrp46 Mtr3 Η δομή του εξωσώματος Σχετιζόμενες υπομονάδες: Mtr4 Απαραίτητη ΑΤΡ-εξαρτώμενη ελικάση Ski2 Μη-απαραίτητη ΑΤΡ-εξαρτώμενη ελικάση Ski3 Μη-απαραίτητη TPR επαναλήψεις Ski8 Μη-απαραίτητη WD επαναλήψεις Ski7 Μη-απαραίτητη GTPάση Parker & Song (2004) Nat Struct Mol Biol 11:121

37 Cell, doi: /j.tibs Available online 9 September 2008

38 Αναγνώριση υποστρώματος από ευκαρυωτικά εξωσώματα Cell, doi: /j.tibs Available online 9 September 2008

39

40 O κύκλος ζωής του mrna στο κυτταρόπλασμα. 1. Δέσμευση της poly(a)-binding πρωτεϊνης (Pab1) και της cap-binding πρωτεϊνης (eif-4e) στο mrna. 2. Η αλληλεπίδραση αυτή δημιουργεί μια κλειστή δομή έναρξης της μετάφρασης που στρατολογεί τους παράγοντες eif- 4G, eif-3 και eif-4a και διευκολύνει την πρόσδεση της 60S υπομονάδας. 3. Η λήξη της μετάφρασης επάγεται με την πρόσδεση του erf-1 στο κωδικόνιο λήξης, γεγονός που έχει ως αποτέλεσμα την αλληλεπίδρασή του με τον παράγοντα erf-3 και την της poly(a)-binding πρωτεϊνης (Pab1).

41 6 O κύκλος ζωής του mrna στο κυτταρόπλασμα. 4. Κατά τη διάρκεια των συνεχών κύκλων μετάφρασης του mrna, η poly(a) ουρά μειώνεται σταδιακά με την 3 5 εξωνουκλεολυτική δράση της CCR4-NOT, με αποτέλεσμα την απομάκρυνση των poly(a)-binding πρωτεϊνών (Pab1) και τη διατάραξη του κλειστού συμπλόκου. 5. Η διατάραξη αυτή εκθέτει τη δομή του καπέλου στα «decapping ένζυμα» Dcp1 και Dcp2, η δράση των οποίων διευκολύνεται από το σύμπλοκο Lsm1-7-Pat1-Dhh1, μετά την απομάκρυνση του eif-4ε. 6. Το mrna οδηγείται σε αποικοδόμηση είτε με την 5 3 εξωνουκλεολυτική δράση της Xrn1, είτε με την 3 5 εξωνουκλεολυτική δράση του «εξωσώματος».

42 Σύνοψη αποικοδόμησης mrna στους Ευκαρυωτικούς PAN2-PAN3 PABP-εξαρτώμενη poly-a νουκλεάση, 60-80nt CCR4-NOT 9 πρωτεΐνες Δράση εξωνουκλεάσης στα συστατικά Ccr4 και Caf1 Αναστέλλεται από την PABP Dcp1/2 Ένζυμο απομεθυλίωσης Διμερές XRN1 Εξωριβονουκλεάση 5 3 αποικοδόμηση Εξώσωμα Πολυπρωτεϊνικό σύμπλοκο με δράση 3 5 εξωνουκλεάσης PARN Αποαδενυλάση που επάγεται από το κάλυμμα Αναστέλλεται από πρωτεΐνες που προσδένονται στο κάλυμμα Κύριο ένζυμο αποαδενυλίωσης των μητρικών mrnas σε ωοκύτταρα Xenopus και σε διάφορες κυτταρικές σειρές

43 Τρόποι αποικοδόμησης του mrna H σταδιακή απομάκρυνση της poly(a) ουράς, οδηγεί στη διάσπαση της δομής του καπέλου από το ένζυμο Decapping.To γεγονός αυτό δεν επιτρέπει στο mrna να μεταφραστεί και το οδηγεί στο τέλος της «λειτουργικής του ζωής». Στη συνέχεια το mrna υφίσταται εξωνουκλεολυτική διάσπαση από το 5 άκρο του ή/και από το 3 άκρο του.

44 Στον Saccharomyces cerevisiae, παρατηρείται αποικοδόμηση ανεξάρτητη της αποαδενυλίωσης που απαιτεί την στρατολόγηση του μηχανισμού decapping. Η πρωτεϊνη Rps28B αλληλεπιδρά με τον ενισχυτή decapping Εdc3, προκειμένου να στρατολογηθούν τα ένζυμα Dcp1 και Dcp2 και να προκληθεί το decapping. Στη συνέχεια, το mrna αποικοδομείται με τη δράση της Χrn1.

45 Μια ειδική ενδοριβονουκλεάση διασπά το mrna, και σηματοδοτεί την περαιτέρω αποικοδόμησή του, με τη στρατολόγηση του εξωσώματος και την 5 3 εξωνουκλεολυτική δράση της XRN1. Η πρόσβαση της ενδονουκλεάσης στο mrna εξασφαλίζεται με την απομάκρυνση ειδικών πρωτεϊνών (stabilizer protein) που συνδέονται σε συγκεκριμένες αλληλουχίες το mrna.

46 Ρυθμιστικές mrna αλληλουχίες Η αποικοδόμηση των mrnas επάγεται ή αναστέλλεται μέσω της δέσμευσης ειδικών πρωτεϊνών που προσδένονται σε RNA και στρατολογούν ή καταστέλλουν τη δράση των ριβονουκλεασών.

47 Αλληλουχίες πλούσιες σε AU (ARE: AU-Rich Elements) Αλληλουχίες που επηρεάζουν την σταθερότητα των mrna που τις φέρουν Απαντώνται συνήθως στην 3 UTR mrna που ρυθμίζονται αυστηρά π.χ. για την σύνθεση κυτταροκινών, πρωτο-ογκογονιδίων και μεταγραφικών παραγόντων Συνηθέστερη η πενταμερής αλληλουχία AUUUA διάφορες τάξεις υπάρχουν, η ευρύτερη αλληλουχία επηρεάζει την σταθερότητα του mrna. Δρουν προσελκύοντας πρωτεΐνες που δρουν ρυθμιστικά και επάγουν ή καταστέλουν τους μηχανισμούς αποικοδόμησης. ARE Goldstrohm & Wickens (2008) Nat Rev Mol Cell Biol 9:337

48 Οι κυριότερες 3 UTR ρυθμιστικές αλληλουχίες Lee JE, Lee JY, Wilusz J, Tian B, et al. (2010) PLoS ONE 5(6): e doi: /journal.pone

49 H σταθερότητα ενός mrna μπορεί να αλλάξει ανταποκρινόμενη σε εξωκυτταρικά σήματα. Οι στεροειδείς ορμόνες για παράδειγμα επιδρούν στο κύτταρο ελέγχοντας όχι μόνο το ρυθμό της μεταγραφής ειδικών γονιδίων, αλλά και τη σταθερότητα ορισμένων mrnas.

50 Η Τ3 ρυθμίζει την πρόσδεση διαφόρων πρωτεϊνικών παραγόντων στην 3 - UTR του mrna της TSH. Απουσία της Τ3, το TSH mrna είναι πολυαδενυλιωμένο και σταθερό. Παρουσία της Τ3, το TSH mrna αποαδενυλιώνεται και διασπάται με τη δράση εξω- και ενδο- ριβονουκλεασών.

51 Ο ρυθμός αποικοδόμησης συγκεκριμένων mrnas μπορεί να μεταβάλλεται ως απόκριση σε συγκεκριμένα ερεθίσματα. Η αλληλουχία iron-response element (IRE) επηρεάζει την αποικοδόμηση mrnas που κωδικοποιούν την σύνθεση πρωτεϊνών που επηρεάζουν την ομοιόσταση του σιδήρου. Σε ανταπόκριση της αύξησης της συγκέντρωσης του σιδήρου στο κυτοσόλιο, το κύτταρο αυξάνει τη σύνθεση της φερριτίνης προκειμένου να δεσμεύσει τον επιπλέον σίδηρο και ελαττώνει τη σύνθεση του υποδοχέα της τρανφερρίνης, προκειμένου να εισάγει λιγότερο σίδηρο στο κύτταρο.

52 Έλεγχος της έκφρασης των mrna της φερριτίνης και της τρανσφερρίνης μέσω στοιχείων ανταπόκρισης στο σίδηρο (ΙRE). - Fe + Fe

53 Αποικοδόμηση του mrna που κωδικοποιεί τον TNF-α Ο TNF-α είναι μια προαποπτωτική κυτταροκίνη, το mrna της οποίας περιέχει αλληλουχίες CDE (είναι μια κατηγορία συντηρημένων RNA δομών). Οι πρωτεΐνες Roquin δεσμεύονται στα CDE και επάγουν τη δράση του συμπλόκου CCr4-Caf1-Not προκαλώντας αποαδενυλίωση του mrna. Έτσι στα μακροφάγα, η σύνθεση του TNF-α καταστέλλεται και επομένως η μεταβολή των επιπέδων έκφρασης της Roquin μπορεί να λειτουργεί ως ρυθμιστής της φλεγμονής, της ανοσολογικής απάντησης και της κυτταρικής ανάπτυξης του ανοσοποιητικού συστήματος. Leppek et al., Cell, Volume 153, Issue 4, p , 2013

54 Ενεργοποίηση παραγωγής ιντερλευκίνης-2 στα Τ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα Η δέσμευση των TTP, AUF-1, KSRP και HuR πρωτεϊνικών παραγόντων στα ΑRΕs της 3 UTR του mrna της Ιντερλευκίνης-2, έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή της αποικοδόμησης του. Αντίθετα, η δέσμευση του ΥΒ1 και της νουκλεολίνης στην 5 UTR με ταυτόχρονη δέσμευση των HuR και NF-90 πρωτεϊνικών παραγόντων στην 3 UTR (μια κατάσταση που επάγεται μετά από συνδιέγερση του υποδοχέα CD28), έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή της σταθερότητας του mrna της Ιντερλευκίνης-2 και κατά συνέπεια την παραγωγή της.

55 Η σταθερότητα του mrna καθορίζεται από την ύπαρξη διαφόρων cis-acting elements.

56 Καταστολή ενδογενών mrna μετά από μόλυνση από ιό Οι ιοί έχουν αναπτύξει μηχανισμούς καταστολής ενδογενών mrnas για να διευκολύνουν την επιβίωσή τους και να αυξήσουν την έκφραση των mrnas του ιού. Η καταστολή των ενδογενών mrnas οδηγεί σε καταστολή της έκφρασης των ενδογενών πρωτεϊνών «μονοπωλώντας» την πρωτεϊνοσυνθετική δυνατότητα του κυττάρου προς όφελος σύνθεσης πρωτεϊνών του ιού και καταστέλλοντας την άμυνα έναντι της μόλυνσης. Οι ιοί έχουν αναπτύξει μηχανισμούς έτσι ώστε να παρεμποδίζουν: 1. Την ωρίμανση των πρόδρομων mrna του κυττάρου ξενιστή 2. Την μεταφορά του ώριμου mrna από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα 3. Την μετάφραση του mrna μέσω αποικοδόμησης

57 Καταστολή ενδογενών mrna μετά από μόλυνση από ιό

58 Πυρηνικά συστήματα επιτήρησης νεοσυντιθέμενων RNA Τα ελαττωματικά πυρηνικά RNAs εντοπίζονται και καταστρέφονται από ένα σύστημα επιτήρησης πυρηνικών RNA. Το εξώσωμα του πυρήνα έχει διπλό ρόλο: συμμετέχει στην τροποποίηση των φυσιολογικών RNAs και καταλύει τη διάσπαση των ελαττωματικών RNAs. Το σύμπλεγμα TRAMP στρατολογεί το εξώσωμα στα ελαττωματικά RNAs και διευκολύνει την 3 5 εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση των RNA στόχων. Στον πυρήνα, η προσθήκη μίας oligo(a) ουράς (περίπου 15 καταλοίπων) σε ελαττωματικά μόρια στρατολογεί πρωτεΐνες που εξασφαλίζουν την αποικοδόμησή τους.

59 Πυρηνικά συστήματα επιτήρησης νεοσυντιθέμενων RNA Ο ρόλος του συμπλόκου TRAMP και του εξωσώματος στην αποικοδόμηση ελαττωματικών RNA (μη φυσιολογική πτύχωσηλανθασμένη ωρίμανση- έλλειψη poly(a) ουράς).

60 3 η Διάλεξη

61 Αποικοδόμηση των ευκαρυωτικών mrnas 1. Γενικά μονοπάτια αποικοδόμησης των mrnas - Σημαντικός ρόλος στην ρύθμιση των γενικών επιπέδων έκφρασης σε επίπεδο RNA 2. Εξειδικευμένα μονοπάτια αποικοδόμησης mrnas - Ρύθμιση αποικοδόμησης mrna ως απόκριση σε ερεθίσματα: ορμόνες, στάδιο του κυτταρικού κύκλου, μόλυνση από ιούς, διαφοροποίηση, διαθεσιμότητα θρεπτικών, καταπόνηση 3. Αποικοδόμηση ελαττωματικών μορίων mrna - Μηχανισμός ποιοτικού ελέγχου για την απομάκρυνση μηνυμάτων που δεν μεταφράζονται σωστά 4. Σωμάτια επεξεργασίας (P bodies)

62 Πυρηνικά συστήματα επιτήρησης νεοσυντιθέμενων RNA Τα ελαττωματικά πυρηνικά RNAs εντοπίζονται και καταστρέφονται από ένα σύστημα επιτήρησης πυρηνικών RNA. Το εξώσωμα του πυρήνα έχει διπλό ρόλο: συμμετέχει στην τροποποίηση των φυσιολογικών RNAs και καταλύει τη διάσπαση των ελαττωματικών RNAs. Το σύμπλεγμα TRAMP στρατολογεί το εξώσωμα στα ελαττωματικά RNAs και διευκολύνει την 3 5 εξωνουκλεολυτική αποικοδόμηση των RNA στόχων. Στον πυρήνα, η προσθήκη μίας oligo(a) ουράς (περίπου 15 καταλοίπων) σε ελαττωματικά μόρια στρατολογεί πρωτεΐνες που εξασφαλίζουν την αποικοδόμησή τους.

63 Πυρηνικά συστήματα επιτήρησης νεοσυντιθέμενων RNA Ο ρόλος του συμπλόκου TRAMP και του εξωσώματος στην αποικοδόμηση ελαττωματικών RNA (μη φυσιολογική πτύχωσηλανθασμένη ωρίμανση- έλλειψη poly(a) ουράς).

64 Κυτταροπλασματικά μονοπάτια επιτήρησης ελαττωματικών mrnas Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί τρία μονοπάτια επιτήρησης μορίων mrna τα οποία συνδέονται μηχανιστικά με την λειτουργία της μετάφρασης: 1. NMD: Μονοπάτι αποικοδόμησης mrnas με πρόδρομο κωδικόνιο λήξης (Nonsense-mediated mrna Decay) 2. No-go decay: Μονοπάτι αποικοδόμησης mrnas που δεν μεταφράζονται λόγω περίπλοκων τριτοταγών δομών 3. Non-stop decay: Μονοπάτι αποικοδόμησης mrnas που δεν περιλαμβάνουν κωδικόνιο λήξης Τα μονοπάτια αποικοδόμησης No-go και Non-stop decay μοιράζονται κοινούς πρωτεϊνικούς παράγοντες.

65 NMD: Ο μηχανισμός αποικοδόμησης mrna με πρόωρο κωδικόνιο λήξης (Nonsense-mediated mrna decay) Τα mrna με ανερμηνεύσιμες μεταλλαγές που περιέχουν πρόωρα κωδικόνια λήξης (PTC Premature Termination Codon) μπορεί να οδηγήσουν σε παθολογικό φαινότυπο λόγω σύνθεσης πρωτεϊνών με μικρότερο μήκος, που εμφανίζουν μειωμένη ή μηδενική λειτουργικότητα. Το 3-10% των κυτταρικών mrnas περιέχουν PTC και μπορεί να προκύψουν λόγω μεταλλάξεων στο γενωμικό DNA, λάθη σε φαινόμενα ανασυνδυασμού, ή λάθη κατά την μεταγραφή ή την ωρίμανση. Τα mrnas με PTC αναγνωρίζονται και αποικοδομούνται από έναν μηχανισμό ποιοτικού ελέγχου που σχετίζεται με τη μετάφραση και ονομάζεται NMD.

66 Νonsense mediated mrna decay Το mrna φέρει σύμπλοκα πρωτεϊνών στα σημεία συρραφής, τα οποία απομακρύνονται κατά τη μετάφραση. Στα mrna που φέρουν πρόωρα κωδικόνια λήξης, τα σύμπλοκα συρραφής δεν απομακρύνονται, το ριβόσωμα ακινητοποιείται και δεσμεύονται πάνω σ αυτό οι πρωτεϊνες Upf προκαλώντας την ενεργοποίηση των ενζύμων decapping. Το σύμπλοκο της μετάφρασης αποδιοργανώνεται και το mrna αποικοδομείται.

67 Η αναγνώριση των μηνυμάτων που φέρουν πρόωρο κωδικόνιο λήξης πραγματοποιείται λόγω: A.της παρουσίας του συμπλόκου συρραφής (exon junction complex EJC) καταρροϊκά του σημείου λήξης της μετάφρασης B.και / ή του ασυνήθιστα μεγάλου μήκους της 3 UTR περιοχής. Η παρουσία ενός συμπλόκου EJC καταρροϊκά του πρόδρομου κωδικονίου λήξης και η μεγάλη απόσταση του σημείου λήξης από την poly(a) ουρά στρατολογούν παράγοντες (Upf1) που οδηγούν στην αποικοδόμηση του αντίστοιχου mrna.

68 NMD: Ο μηχανισμός αποικοδόμησης mrna με πρόωρο κωδικόνιο λήξης

69 Δύο διακριτά μονοπάτια αποικοδόμησης φαίνεται να διασπούν τα mrna-στόχους στο μονοπάτι NMD

70 To κύτταρο διαθέτει μηχανισμούς αναγνώρισης μηνυμάτων που έχουν προκύψει από εναλλακτική συρραφή και φέρουν πρόωρα κωδικόνια λήξης. Μερικές φορές το κύτταρο επιλέγει τη σύνθεση «λανθασμένων μηνυμάτων» προκειμένου να ελαττώσει την κυτταροπλασματική συγκέντρωση ενός συγκεκριμένου mrna (μηχανισμός RUST)

71 Ρύθμιση της κυτταρικής διαφοροποίησης μέσω NMD Ένας μεγάλος αριθμός φυσιολογικών μεταγράφων αποτελούν στόχους αποικοδόμησης μέσω NMD, γεγονός που δείχνει ότι πρόκειται για μονοπάτι γενικής ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Πρόσφατες έρευνες δείχνουν ότι ο UPF1 συμμετέχει σε μονοπάτια νευρωνικής διαφοροποίησης στα σπονδυλόζωα. Η αυξημένη σύνθεση του UPF1 οδηγεί σε αυξημένη δραστικότητα του NMD, οδηγεί στη διάσπαση mrnas που συνθέτουν πρωτεΐνες κυτταρικής διαφοροποίησης και έτσι τα πρόδρομα κύτταρα δεν διαφοροποιούνται. Αντίθετα, η νευρωνική διαφοροποίηση επάγεται μέσω καταστολής της σύνθεσης του UPF1 (μέσω μικρών ρυθμιστικών mirna) και επιτρέπεται η σύνθεση πρωτεϊνών διαφοροποίησης σε ώριμους νευρώνες. Lou et al., Cell Reports, Vol. 6, Issue 4, p , 2014

72 Το μονοπάτι No-go decay (NGD) Αποικοδομεί mrnas με περίπλοκες δομές που οδηγούν στην ακινητοποίηση των ριβοσωμάτων 1. Πολύπλοκες τριτοταγείς δομές σε συγκεκριμένες περιοχές του mrna, μπορεί να προκαλέσουν ακινητοποίηση του ριβοσώματος με αποτέλεσμα, τη στρατολόγηση του συμπλέγματος Dom34-Hbs1. 2. Το γεγονός αυτό προκαλεί την ενδονουκλεολυτική διάσπαση του μηνύματος, με τελικό αποτέλεσμα την πλήρη αποικοδόμησή του.

73 Το μονοπάτι Nonstop decay (NSD) Αποικοδομεί mrnas που δεν περιλαμβάνουν κωδικόνιο λήξης. 1. Στην περίπτωση απουσίας κωδικονίου λήξης από το mrna, η μετάφραση συνεχίζεται μέχρι και την poly(a) ουρά. Αυτό έχει ως αποτέλεσμα την προσθήκη πολλαπλών καταλοίπων λυσίνης στο τέλος της πρωτεΐνης και τη χρονοτριβή του ριβοσώματος στο τέλος του mrna. 2. Το ριβόσωμα που χρονοτριβεί δεσμεύεται από μια πρωτεΐνη (Ski7) η οποία υποκινεί την αποδιοργάνωση του μεταφραστικού συμπλέγματος και την αποικοδόμηση του mrna από το εξώσωμα. 3. Επιπρόσθετα, μια ειδική πρωτεάση διασπά το λανθασμένο προϊόν της μετάφρασης.

74 Σύνοψη των κυτταροπλασματικών μονοπατιών mrna επιτήρησης

75 mrnp-σωμάτια: P bodies, stress grannules, neuronal granules Τα mrnp σωμάτια είναι κυτταροπλασματικές δομές πλούσιες σε mrna και οι κυριότεροι τύποι είναι τα P bodies (processing bodies), τα σωμάτια καταπόνησης (stress granules) και τα νευρωνικά σωμάτια (neuronal granules). Πρόκειται για δυναμικές δομές, διακριτές στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο που λειτουργούν σαν «πυρήνες» έντονης αποικοδόμησης ή καταστολής της μετάφρασης των mrna μορίων που περιέχουν. Ο εντοπισμός mrnas σε συγκεκριμένες κυτταρικές θέσεις εξυπηρετεί διάφορες λειτουργίες σε συγκεκριμένους κυτταρικούς τύπους και στα αναπτυσσόμενα έμβρυα.

76 P bodies: Διακριτά κυτταροπλασματικά σωμάτια όπου συνεντοπίζονται πρωτεΐνες που σχετίζονται με την Αποικοδόμηση mrna Καταστολή της μετάφρασης Αποσιώπηση της γονιδιακής έκφρασης μέσω μικρών RNAs Nature Reviews Mol. Cell. Biol., 2007, Vol. 8, p. 9-22

77 Μοντέλο δημιουργίας των P-bodies στη ζύμη 1. Παράγοντες των «Pbodies» στρατολογούνται στο mrna δημιουργώντας σύμπλοκο. 2. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών των P- bodies στο σύμπλοκο οδηγούν στο σχηματισμό μιας δομής «κλειστής θηλειάς». 3. Τα mrnps συσσωματώνονται μέσω των Q/N περιοχών δημιουργώντας ορατά κυτταροπλασματικά σωμάτια. Carolyn J. Decker, and Roy Parker Cold Spring Harb Perspect Biol 2012;4:a012286

78 " Δείχνει τη δυναμική κίνηση του mrna μεταξύ των πολυσωμάτων, P-bodies και stress granules, καθώς και τις πιθανές μεταβάσεις των mrnp μεταξύ των διαφόρων φάσεων του mrna " Μοντέλο του «κύκλου mrna. Σύμφωνα με το μοντέλο, προτείνεται ότι τα mrnas που έχουν συμπλοκοποιηθεί με την «μηχανή απομάκρυνσης του καπέλου» μπορούν: Να οδηγηθούν σε αποικοδόμηση Να συσσωματωθούν σε P- bodies Ή μέσω ανταλλαγής των παραγόντων αποικοδόμησης με παράγοντες έναρξης της μετάφρασης να σχηματίσουν πολυσώματα. Carolyn J. Decker, and Roy Parker Cold Spring Harb Perspect Biol 2012;4:a012286

79 Ορισμένα mrnas εντοπίζονται σε συγκεκριμένες κυτταρικές θέσεις π.χ. Δημιουργία διαφορετικών πληθυσμιακών προτύπων σε ωοκύτταρα και έμβρυα. π.χ. Δημιουργία διαφορετικών θυγατρικών κυττάρων κατά την ασύμμετρη κυτταρική διαίρεση. π.χ. Διαμερισματοποίηση ενός κυττάρου σε ειδικές περιοχές. Η μετακίνηση των mrnas προϋποθέτει την ύπαρξη cis στοιχείων επί του mrna και trans παραγόντων που εξασφαλίζουν την μετακίνηση.

80 Το σήμα εντοπισμού (zipcode) αποτελείται από μεγάλο αριθμό cis στοιχείων που εμπλέκονται στην μεταφορά του mrna σε συγκεκριμένη κυτταρική τοποθεσία. Η μεταφορά πραγματοποιείται κυρίως μέσω κατευθυνόμενης κίνησης των mrnps επί του κυτταροσκελετού. π.χ. Μηχανισμός μετακίνησης του Ash1 mrna.

81 Πρόσθετο υλικό για τις Ριβονουκλεάσες

82 Ριβονουκλεάσες που δρουν στο εξωκυττάριο περιβάλλον Η υπεροικογένεια εκκρινόμενων ριβονουκλεασών στα Σπονδυλόζωα περιλαμβάνει μικρές εκκρινόμενες πρωτεΐνες που ποικίλουν ως προς τη δομή και ως προς την λειτουργία. Στους πρωτεϊνικούς αντιπροσώπους της υπεροικογένειας έχουν αποδοθεί πολλαπλοί βιολογικοί ρόλοι που περιλαμβάνουν την αγγειογένεση και την προστασία από παθογόνους παράγοντες. Τα ομόλογα των Θηλαστικών κατατάσσονται σε 8 οικογένειες που χαρακτηρίζονται ως «κανονικές» ριβονουκλεάσες που παλιότερα ονομάζονταν και ριβονουκλεάσες «παγκρεατικού τύπου» λόγω της παγκρεατικής ριβονουκλεάσης Α, της πρώτης που απομονώθηκε και μελετήθηκε. Σήμερα, η ριβονουκλεάση Α θεωρείται το πληρέστερα μελετημένο ένζυμο και αποτελεί μοντέλο για την κατανόηση δέσμευσης και ενδοριβονουκλεολυτικής αποικοδόμησης πολυμερών υποστρωμάτων.

83 Η ριβονουκλεάση Α ως μοντέλο μελέτης των ενζύμων Η ριβονουκλεάση Α είναι το ένζυμο που αποικοδομεί το RNA της τροφής. Αποτέλεσε ιδανικό μοντέλο μελέτης των ενζύμων λόγω του μικρού μεγέθους της, της σταθερότητάς της και της εύκολης απομόνωσής της. Θεμελιώδεις ιδέες για τη βιοχημεία εδραιώθηκαν με αφορμή μελέτες στην ριβονουκλεάση Α και βραβεύτηκαν με Nobel: 1. O Christian Anfinsen απέδειξε ότι η αλληλουχία των αμινοξέων καθορίζει την δομή μιας πτυχωμένης πρωτεΐνης. 2. Ο Stanford Moore και William Stein έδειξαν ότι η συγκεκριμένη διάταξη ορισμένων αμινοξέων στον χώρο καθορίζει το ενεργό κέντρο των ενζύμων 3. O Bruce την συνέθεσε in vitro δείχνοντας ότι τα βιομόρια είναι απλές χημικές οντότητες και μπορούν να παραχθούν στο εργαστήριο.

84 Η ριβονουκλεάση Α είναι ένα εξαιρετικά ενεργό ένζυμο Η ριβονουκλεάση Α είναι μια ενδοριβονουκλεάση, διασπά δηλαδή εσωτερικούς φωσφοδιεστερικούς δεσμούς μετά από κατάλοιπα κυτιδίνης και σε μικρότερο ρυθμό μετά από κατάλοιπα ουριδίνης. Είναι τόσο ενεργή που η διάσπαση του υποστρώματος περιορίζεται μόνο από την διάχυσή της στο διάλυμα της αντίδρασης. Δηλαδή δρα αστραπιαία μόλις έρθει σε επαφή με το υπόστρωμα. Κόκκινο: RNA Μπλε: Ριβονουκλεάση Α Η RNάση Α είναι εξαιρετικά σταθερό μόριο χάρη στην ύπαρξη δισουλφιδικών δεσμών. Κατά την διαδικασία απομόνωσής της από το πάγκρεας η επίδραση με θειϊκό οξύ και η θέρμανση έως σημείου βρασμού δεν επηρεάζουν την δράση της και είναι σχεδόν το μόνο ένζυμο που δεν επηρεάζεται. Η σταθερότητά της εξασφαλίζει την δραστικότητά της στον πεπτικό σωλήνα. Η δράση της παρεμποδίζεται από τον αναστολέα RI (RNase inhibitor) που χρησιμοποιείται στο εργαστήριο και κατά την απομόνωση και μελέτη μορίων RNA.

85 Οι ανθρώπινες ριβονουκλεάσες της υπεροικογένειας Α Αποτελούν τις πιο καλά μελετημένες ανθρώπινες ριβονουκλεάσες Μέχρι σήμερα 13 μέλη της υπεροικογένειας Α έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί στον άνθρωπο Εκτός από ριβονουκλεολυτική ενεργότητα εμφανίζουν ενδιαφέρουσες βιολογικές δράσεις: η RNase 1 η RNase 3 η RNase 5 η RNase 7 διάσπαση τροφών και βακτηρίων στον πεπτικό σωλήνα αντιβακτηριακή, κυτταροτοξική και νευροτοξική δράση αγγειογένεση, εμφάνιση και εξέλιξη τύπων καρκίνου αντιβακτηριακή και κυτταροτοξική δράση