MOLEKULARNA GENETIKA

Transcript

1 MOLEKULARNA GENETIKA 1

2 STRUKTURA DNA DNA ima več struktur: enojni, dvojni ali trojni heliks je levo- ali desnosučen, linearna ali krožna. Najpogostejša oblika je B desnosučni heliks, ki je iz dveh komplementarnih polinukleotidov. Ogrodje molekule tvorita sladkor in fosfat, ki sta povezana s 3`-5`fosfodiestersko vezjo. Glede na to vez sta verigi nasprotni: ena 3`-5`, druga 5`-3`. Na sredini so baze, ki predstavljajo genetsko informacijo(str. 70, sl.33 in 9-1). Glikozidni vezi, ki vezeta komplementarni bazi na sladkorja, nista v isti ravnini, zato tudi fosfodiesterski vezi nukleotidnega para nista v isti ravnini. Posledica tega je, da celotno ogrodje (sladkor in fosfat) ni enakomerno vzdolž molekule. TAVTOMETRIJA Vodiki na bazah se lahko spontano ali inducirano premaknejo na drugo mesto na isti bazi. Tako so možne spremembe funkcionalnih skupin v bazah: amino-imino, keto-enol, veliko pogostejše pa so amino- in keto- skupine. Za normalno delovanje DNA je pomembno, da vodiki ne spreminjajo položaja, ker bi lahko prišlo do napačnega parjenja baz. DENATURACIJA IN RENATURACIJA DNA denaturira, ce spremenimo ph, povišamo T, Denaturacija je posledica pretrganja vodikovih vezi med bazami. Tiste molekule, ki imajo višje odstotek CG baznih parov, denaturirajo kasneje, kot tiste z več AT pari, ker je pri prvih prisotnih več H-vezi. DNA lahko tudi renaturira, ker se zaradi komplementarnosti verigi zopet povezeta. ENOJNA DNA Enojno DNA imajo nekateri dovolj majhni bakteriofagi (QX174, S13, f1, M13). DNA je enojna le v fagu, ko fag okuži celico, se podvoji. V večceličnih organizmih enojna DNA ne bi normalno delovala. Ko se DNA pred mitozo podvoji, omogoča dvojni heliks natančno podvojevanje oz. uspešne popravljalne mehanizme. Če bi bila DNA enojna, bi pri podvojevanju lahko prišlo do številnih napak in hčerinski celici ne bi imeli enake informacije. Značilnost enojne dna je, da je bolj zavita kot dvojna. Pri enojni DNA pride na nekaterih mestih do tvorbe dvojnega heliksa (sl.9-6), drugje po verigi pa ni vodikovih vezi, zato delujejo Van der Waalsove vezi (sile), ki atome v molekuli približajo bolj, kot pa bi jih H- vezi. OBLIKE DVOJNEGA HELIKSA Bazi, ki tvorita bazni par, nista v isti ravnini, temveč se obrneta (propeller twist) tako, da je med njunima ravninama kot (sl. 9-7). Purini tako pridejo preblizu, kar se kompenzira s 2

3 premikom purinov iz osrednje lege ali pa se spremeni kot med sosednjimi baznimi pari. Tko različne DNA molekule nimajo nikoli čisto enake oblike. OBLIKA DNA Desnosučni obliki (purini in pirimidini vedno anti) 1.) A: krajša, debelejša, med sosednjima baznima paroma 2.7 A, bazni pari 30 iz osi Desnosučni obliki (purini in pirimidini vedno anti) heliksa, globok in ozek veliki jarek, mali jarek ozek in širok 2.) B: dolga, tanka, razdalja med sosednjima baznima paroma 3.4A, bazni pari približno v osi heliksa, širok veliki jarek, ozek mali jarek A oblika nastane,če je okrog molekule malo vode. Takšna je kristalizirana DNA. Podobna je tudi RNA. Levosučna oblika: Z cik-cak izgled, daljša in tanjša kot B, med sosednjima baznima paroma 3.8 A, zelo ozek in globok mali jarek. Z oblika nastane iz B oblike: 1.) če je v molekuli izmenično purin-pirimidin in se gvanin zavrti iz ant v sin obliko. To se zgodi ob dovolj visoki koncentraciji kationov (sl. 9-10) 2.) če pride do metilacije citozina na mestu 5`(5-metilcitozin) Količina Z oblike v celici ni znana. METILACIJA IN HEMIMETILACIJA Encim metilaza metilira baze, ko so že vključene v molekulo: citozin na mestu 5; nastane 5-metilcitozin ( pri evkariontih in prokariontih), adenin na mestu 6; nastane 6-metiladenin. Pri evkariontih se metilirajo le tisti ogljiki, ki so na mestu 5`CG3`. Metilacija indirektno vpliva na ekspresijo genov, olajša prehod B oblike v Z obliko in stabilizira DNA, ker metilne skupine tvorijo hidrofobni ovoj. Metilacija DNA je pomembna tudi kot zaščita pred lastnimi restriktazami, encimi, ki režejo DNA (opisani v tem poglavju).metilaze prepoznajo specifična mesta za lastne restriktaze in jih metilirajo (sl.9-37). Tako preprečijo delovanje lastnih restriktaz, ne pa tudi ostalih, ki režejo na drugih mestih. Dovolj je tudi, če encimi metilirajo prepoznavno mesto samo na eni verigi DNA, to je hemimetilacija. SPONTANE DEFORMACIJE DNA je zelo plastična struktura. Lahko se upogiba, zvija, steguje, zanka. Do tega pride zaradi prekinjanja in nastajanja vodikovih vezi, ter zaradi rotacij kovalentnih vezi, ob tem pa se porabi malo energije. DNA ima posebna zaporedja, ki omogočajo pregibe in s tem tvorbo bolj kompaktne strukture. Takšno specifično zaporedje je npr. CAAAAATGTCAAAAATAGGCAAAAATGCCAAAAAT 3

4 TROJNI HELIKS Na nastanek trojnega heliksa vpliva encim RecA (opisan v poglavju o rekombinaciji), trojni heliks pa je stabilen tudi, ko encim ni več prisoten. Enojna DNA po nekem mehanizmu (ne po komplementarnosti) prepozna dvojni heliks, se veže s purini (z G, A v dvojnem heliksu) in se vleže v veliki jarek, nastane trojni heliks. To omogoča zaščito DNA (pred restriktazami) in blokado nekaterih genov. LINEARNA IN KROŽNA DNA Krožno DNA imajo nekateri virusi in večina bakterij. Linearna DNA je v evkariontskih celicah in nekaterih virusih. Plazmidi so lahko krožni ali linearni. Linearna DNA mora biti na obeh koncih zaščitena pred eksonukleazami (sl.9-19). V fagu je DNA linearna, ko pa pride fag v celico, se konci povežejo in DNA je krožna. Fagi imajo lahko na 5` koncih za zaščito posebne proteine, na koncih so lahko zanke, nekateri fagi pa imajo na obeh koncih identična zaporedja. SUPERNAVITOST DNA DNA je zelo fleksibilna struktura, njena oblika se spreminja. Linearna oblika DNA lahko prosto rotira zato, da kompenzira spremembe v številu navojev molekule. Pri krožni DNA pa je število navojev točno določeno. Če se spremeni povprečno število baznih parov v navojih dvojnega heliksa, se formira ustrezno število supernavojev, ki kompenzirajo spremembe. Supernavitost pomeni nadaljnje zavijanje dvojnega heliksa DNA. Odvijanje verig vodi v supernavitost v negativni (levosučni) smeri, posledica čezmernega zavijanja DNA pa je pozitivna (desnosučna) supernavitost (sl. 9-20). Supernavita DNA je manj stabilna, kot navadna krožna (relaksirana) DNA. Rezanje ene same verige povzroči, da se supernavita DNA spremeni v relaksirano (se odvije), krožno obliko (sl.9-21). Relaksirana DNA ima daljši čas sedimentacije in daljši čas potovanja po agaroznem gelu pri gelski elektroforezi (sl. 9-22). LOKALNA DENATURACIJA Posledica stresa ob negativnem supernavijanju DNA (na mestih s T-A pari) je lahko lokalna denaturacija, pri kateri se komplementarni verigi ločita, supernavita DNA pa preide v relaksirano obliko (sl. 9-23). Če denaturirani deli verige vsebujejo homologne sekvence, potem tvorijo Zanke v obliki križa, ki so energetsko stabilnejše (sl. 9-24). Zaenkrat še ni dokazano, da takšne zanke nastajajo tudi v živi celici.kinetično so take zanke neugodne. Lažji prehod iz B oblike v Z obliko dvojnega heliksa. 4

5 KOMBINACIJA DNA-PROTEINI V celicah prokariontov in evkariontov se praktično vsa DNA nahaja kot negativno supernavita s specifičnimi proteini (DNA-binding proteins). To strukturo imenujemo kromatin. Najpomembnejši proteini pri evkariontih so histoni; relativno majhni proteini ki vsebujejo arginin in lizin.združujejo se v histonske sredice. Okoli vsake sredice se dvakrat negativno supernavije segment DNA (200 baznih parov), nastane nukleosom (sl.9-26 in 9-28). Histoni imajo pomembno strukturno vlogo. Ostali proteini še niso popolnoma raziskani. Večina DNA je povezane s proteini. Kjer proteinov ni, delujejo encimi, tukaj se začne podvojevanje. Tudi prokariontske celice vsebujejo histonom podobne proteine, vezane na DNA (histonlike DNA-binding proteins).eden takšnih proteinov je DNA binding protein II, ki nastopa kot dimer (sl.9-29). TOPOIZOMERAZE Topoizomeraze so skupina encimov, ki izomerizirajo eno tpoploško obliko DNA v drugo, tako da povzročijo spremembo navoja DNA (tabela 9-2). So esencielni encimi. Ene topoizomeraze zavijajo DNA molekule, npr. topoizomeraza II (giraza) pri prokariontih, ki tvori negativni supernavoj, pri tem porablja energijo ATP. Druge tpopizomeraze delujejo nasprotno, torej odvijajo supernavito DNA in tvorijo energetsko ugodnejšo, relaksirano obliko DNA, npr. topoizomeraza1. topoizomeraza1 supernaviti > relaksirani topoizomerazaii dvojni heliks > dvojni heliks Topoizomeraze delujejo tako, da katalizirajo prekinitev in ponovno tvorbo fosfodiesterskih DNA vezi. Najprej odvijejo dvojni heliks, nato prekinejo vez v eni polinukleotidni verigi in se vežejo na proste konce (terminalne fosfatne skupine). Tako preprečijo prosto rotacijo heliksa in ohranijo energijo fosfodiesterskih vezi. Nato spremenijo zavoj tako, da ob konformacijski spremembi encima potegnejo DNA verigo skozi začasno prekinitev (topoizomeraza1) oz. prekinitvi (topoizomeraza2) in zopet povežejo proste konce. Pri topoizomerazi1 tako nastane DNA z enim negativnim supernavojem manj, pri topoizomerazi2 pa z dvema supernavojema več (sl.9-31 in 9-32). RESTRIKTAZE Restrikcijski encimi ali nukleaze, so encimi ki režejo fosfodiesterske vezi v polinukleotidni verigi.endonukleaze prekinjajo notranje vezi v DNA in so specifične. Eksonukleaze delujejo na koncih DNA molekule (sl.9-34). Restriktaze delujejo kot obrambni mehanizem, saj razgrajujejo tujo DNA. Razlikujejo lahko med nativno DNA, nastalo v lastni celici, in tujo DNA drugih vrst. Njihova glavna naloga je, da uničijo tujo DNA, preden se ta vključi v lastno kromosomalno DNA. Restriktaze napadajo specifično in simetrično zaporedje dolgo 4-6 nukleotidov. 5

6 Le redki encimi prepoznajo zaporedje osmih nukleotidov. Rez ne poteka nujno po sredini simetričnega zaporedja, lahko je pomaknjen v eno ali drugo stran (sl.9-35). Danes je poznanih več kot 100 endonukleaz različnih prokariontov, medtem ko jih pri evkariontih še niso našli. Specifično zaporedje 6 nukleotidov se pojavi samo na vsakih nekaj 1000 baznih parov zato po delovanju restriktaz nastanejo fragmenti značilne dolžine. Encim EcoRI prepozna zaporedje 6 baznih parov, ki se pojavi v DNA faga SV40 (5243 baznih parov) samo enkrat.encim sestavljata dve simetrični polipeptidni podenoti, ki se ovijeta okoli dvojnega heliksa (sl.9-36). Rez poteka med G in A specifičnega zaporedja. Encim Hin diii prepozna kot specifično zaporedje 6 baznih parov: AAGCTT TTCGAA Rez poteka med adeninoma. Fag SV40 ima 5 takšnih zaporedij,zato ga Hin diii petkrat prereže. Encimi metilaze (jih metilirajo in tako inaktivirajo) prepoznavajo ista specifična zaporedja kot restriktaze, vendar ni nobene očitne homologije v sestavi njihovih polipeptidov in tudi geni, ki jih kodirajo so popolnoma različni. REPLIKACIJA DNA UVOD Pomembna ugotovitev v genetiki je bila, da DNA sama funkcionira kot matrika za sintezo novihverig DNA. S tem je bil rešen problem, kako se geni podvajajo. Replikacija celo najenostavnejših molekul je komplicirana (multiencimski procesi). PREDPOGOJ ZA PODVOJEVANJE JE LOČITEV DVOJNEGA HELIKSA Tudi v najmanjših DNA molekulah sta verigi dvojnega heliksa večkrat naviti druga okoli druge in se morata odviti, da se podvajanje lahko začne (sl. 10-1).Pri tem se morajo ločiti H- vezi med organskimi bazami.te vezi so zelo specifične, relativno šibke in noben encim ni potreben za njihovo ločitev ali nastanek.h-vezi imajo pomen tudi pri specifični vezavi matrike in njene komplementarne verige (replike). Povprečna energija H-vezi je okoli 3Kcal/mol. PARJENJE BAZ MORA OMOGOČATI NATANČNO REPLIKACIJO Purinske in pirimidinske baze tvorijo različno število H-vezi. H-vezi so visoko specifične, za razliko od van der Waalsovih vezi, ki so manj specifične in šibkejše. Replikacija para GC je še bolj natančna kot para AT, ker sta GC povezana s tremi H- vezmi, AT pa le z dvema. Občasno (približno enkrat na 10000) pride do napačnega parjenja baz. Encim DNA polimeraza zelo poveča specifičnost parjenja baz (proofreading, glej naslov Rast verige v obeh smereh). 6

7 Ogranske baze lahko tvorijo enako močne H-vezi tudi z atomi H in O iz vode. Molekule vode pa se ne morejo kemično povezati z rastočo polinukleotidno verigo, zato se zelo hitro odstranijo z difuzijo in jih nadomestijo primerni nukleotidi. Ni še popolnima jasno zakaj se dve purinski ali dve pirimidinski bazi ne vežeta med sabo. Taka vezava bi uničila sladkorno-fosfatno hrbtenico. DELNA DENATURACIJSKA MAPA Od zaporedja baz so odvisne fizikalne lastnosti DNA. Kratko izpostavljanje linearne DNA denaturacijskim pogojem (visoka T, visok ali nizek ph, reagenti ki cepijo H-vezi) prej odvije odseke DNA z AT baznimi pari, odseki z mnogo močnejšimi GC baznimi pari pa ostanejo intaktni to je delna denaturacijska mapa. Če take delno denaturirane molekule tretiramo s formaldehidom, se enoverižne DNA (na mestu denaturacije) stabilizirajo, ker se formaldehid veže s prostimi amino skupinami adenina in prepreči nastanek AT baznih parov. Na mestu denaturacije se pojavijo mehurji, ki se nahajajo na točno določenih mestih. S pomočjo teh mest lahko dobimo denaturacijsko. Denaturacijska mapa nam omogoča, da ločimo en konec linearne DNA od drugega in s pomočjo tega lahko opredelimo mesto začetka replikacije (sl.10-2). PODVAJANJE LINEARNE DNA Dokaj enostavno je izolirati DNA med procesom podvajanja in to predstaviti pod elektronskim mikroskopom. To so prvič naredili pri linearni T7 virusni DNA.Pričakovali so da se bo replikacija začela na začetku enega ali obeh koncev DNA. Presenetljivo pa so ugotovili, da se replikacija začne»notranje«vedno v isti točki = origin of replication; ni histona a so drugi proteini (približno 15% stran od levega konca molekule).ko se podvajanje začne poteka v obeh smereh. Najprej je videti kot -o- struktura, nato se spremeni v Y obliko, ko leva stran replikacijskih vilic doseže konec DNA. Taka struktura razveljavi mnenje o podvajanju DNA v dveh korakih, pri katerem naj bi se obe parentalni verigi popolnoma odvili in bi šele nato začel nastajati dvojni heliks. Hčerinska polinukleotidna veriga je sintetizirana praktično takoj, ko se starševski verigi ločita. REPLIKACIJA KROŽNE DNA Z θ (THETA) VMESNO OBLIKO Pri podvajanju krožne DNA ohranjata starševski verigi ves čas krožno obliko. Zavzameta pa theta obliko ki se pojavi na začetku replikacijskega mehurčka na mestu origin (sl.10-4). Replikacijski mehurček se povečuje na obe strani na ta način, da se starševski verigi odvijata.to pa povzroči supernavitost v nasprotni smeri, kar kasneje ustavi rast replikacijskega mehurčka, ker nadaljna supernavitost ni več možna.tako ustavljen mehurček lahko ponovno raste če topoizomeraza I naredi rez ene verige in tako spreobrne visoko supernavite odseke, ki se ne podvajajo v sproščeno konfiguracijo Obstajata topoizomeraza I in II. Topoizomeraza I relaksira DNA (odvija), tako da neredi enoverižen rez.topoizomeraza II (giraza) pa zavija DNA in povzroča supernavoje. 7

8 RAST VERIGE V OBEH SMEREH OD 5`--- 3` IN 3`--- 5` Nasprotna usmerjenost obeh verig (5`---3` in 3`---5`) dvojnega heliksa pomeni, da mora tudi sinteza obeh hčerinskih verig teči v nasprotni smeri. Ena veriga mora rasti v smeri 5`---3`, druga pa v smeri 3`---5` (sl.10-6). DNA polimeraza, edini poznan encim ki lahko dodaja nukleotidne prekurzorje na DNA, dela to le v smeri 5`---3`. Kemična reakcija, ki jo katalizira ta encim omogoča nukleozid trifosfatom, da reagirajo le s 3`OH koncem rastoče polinukleotidne verige (sl. 10-7). Postavilo se vprašanje, če obstaja šeen encim, ki bi priključeval na prostem 5` koncu. Takega encima niso našli. OKAZAKIJEVI FRAGMENTI, LEADING IN LAGGING VERIGA Rešitev podvajanja v smeri 3`---5` je prišlo s spoznanjem, da deoksiribonukleotidni substrati niso vedno priključeni direktno na dolgo hčerinsko verigo. Namesto tega se združujejo hkrati v kratke fragmente DNA = okazakijevi fragmenti, ki se kasneje združijo z rastočo hčerinsko verigo s pomočjo DNA ligaze. Danes je jasno, da so okazakijevi fragmenti prekurzorji v sintezi le ene od obeh hčerinskih verig.ta razlika v načinu rasti 3`---5` in 5`---3` nitko producira kratke odseke enoverižne starševske DNA v replikacijskih vilicah (sl.10-9). Okazakijevi fragmenti se začnejo sintetizirati le na točno določenih točkah enoverižne starševske DNA. Med temi točkami (signali) je razdalja, ki določa povprečno dolžino okazakijevih fragmentov. REPLIKACIJA IN VITRO Danes znajo ustvariti razmere, ki popolnoma posnemajo stanje v rastočih celicah.tudi sinteza DNA je možna in vitro produkti so pogosto enaki tistim, ki nastanejo in vivo (intracelularno). Ekstrakti E. coliso služili za ugotovitev narave in načina delovanja encimov vključenihv replikacijske procese. Ustvarili so natančne pogoje za in vitro spreobrnitev enoverižne DNA (virusov thetan174 inm13 ) v njihov dvoverižni replikativni intermediat.encimi ki sodelujejo pri tem so drugačni pri enem kot pri drugem virusu. To pomeni da so posamezni replikacijski geni bakterijske DNA potrebni za replikacijo enega virusa, ne pa tudi za replikacijo drugega. Očitno različne DNA molekule uporabljajo različne modele replikacije. TRIJE TIPI DNA POLIMERAZ Najprej so odkrili le eno polimerazo, danes imenovano DNA polimeraza I. Kasneje so ugotovili da obstajajo tri različne DNA polimeraze. Za dve od teh je danes poznana dokajnatančna vloga pri replikaciji. Dolgo so mislili, da je DNA polimeraza I glavni encim, ki združuje skupaj deoksiribonukleotide v resnici pa ima pri polimerizaciji glavno vlogo najkasneje odkriti encim DNA polimeraza III. DNA polimeraza I se uporablja predvsem za polnenje vrzeli med majhnimi okazakijevimi fragmenti. Za DNA polimerazoii še ni dokazana specifična vloga pri replikaciji.celice mutante, ki imajo malo ali pa sploh nimajo molekul DNA polimeraze II lahko preživijo.zato je mogoče ta encim nebistven in njegovo vlogo je težko definirati. 8

9 POPRAVLJANJE NAPAK PRI 3`---5` EKSONUKLEAZNI FUNKCIJI Isti encim (velja za vse tri DNA polimeraze)ki ima polimerazno funkcijo ima tudi 3`-5` eksonukleazno aktivnost. Vsaka molekula DNA polimeraze ima sposobnost ponovno zrezati nastajajoče polinukleotide, ravno tako, kot jih lahko tudi združuje. Vendar je sinteza prevladujoča nad degradacijo. Na prvi pogled nima degradacijska funkcija nobenega pravega pomena. Njena navzočnost pa se pokaže za zelo pomembno, ko pride do napačnega dodajanja baz.če se napačna baza doda na koncu 3` rastoče verige, je velika verjetnost, da bo odstranjena preden se bo priključila naslednja baza (3`5` eksonukleazna aktivnost da v tem primeru kontrolno sposobnost). To da replikaciji DNA veliko večjo natančnost, kot bi jo imela, če bi bila selekcija le rezultat začetnega dodajanja baz. Stalna potreba po kontroliranju prepisovanja je mogoče razlog, da ni encima, ki bi dodajal deoksiribonukleotide na 5` konec. Če bi rast potekala v tej smeri bi bil rastoči konec vedno zaključen s trifosfatno skupino katere visoko energetske vezi so potrebne za vezavo naslednjega nukleotida.odstranitev nazadnje priključenega deoksiribonukleotida iz take s trifosfatom zaključene molekule med proofreadingom bi tu oblikoval z 5`-monofosfatom zaključeno verigo, ki bi bila energetsko neprimerna za delovanje DNA polimeraze. DNA POLIMERAZA DELUJE POSTOPOMA Ves čas polimerizacije (ko DNA polimeraza dodajanukleotide za podaljševanje verige DNA) je encim DNA polimeraza povezan z DNA. Povezan je vse dotlej, dokler ne pride do stop signala. DNA polimeraza je tridimenzionalna struktura. DNA polimeraza ima na karboksi-terminalnem koncu Klanow fragment, ki ima polimerazno aktivnost in 3`---5` eksonukleazno aktivnost, ki ureja napačno sparjene nukleotide. Ta fragment vsebuje dva različna predela: večji predel je 20A dolga razpoka, v katero se veže DNA manjši predel, kjer se vežejo nukleotidi. Ko se DNA veže v razpoko se ta zapre in začno se nalagati nukleotidi. DNA lahko drsi naprej ali nazaj skozi to odprtino. Če pa se v DNA vstavi napačna baza = ne tvorijo se pravi bazni pari = nastane detormirana oblika, ki ne more zdrsniti skozi 20A dolgo dimerno razpoko. Taka DNA gre nazaj. Eksonukleaza pa odstrani napačno bazo proofreading in s tem lahko gre DNA polimeraza I zopet naprej. HELIKAZA ODVIJA DVOJNI HELIKS Polimeraza je omejena v aktivnosti, ker potrebuje encime, da ji zapro dvojni heliks. Verige dvojnega heliksa se na mestu replikacijskih vilic ne razklenejo spontano, ampak za to potrebujejo specifične proteine helikaze, ki se vežejo na ATP in enojno verigo DNATe helikaze potrebujejo za cepitev vezi vzdolž DNA energijo, ki jo dobijo s cepitvijo ATP na ADP. Ponavadi sodelujeta dve različni helikazi. Ena helikaza (II ali III) se veže na lagging verigo in se pomika v smeri 5`---3`. Druga helikaza (rep. prot) se veže na leading verigo DNA in se pomika v obratni smeri 3`---5`. Glede na DNA gre vsaka v svojo smer; topografsko pa gresta obe v isto smer. Cepitev vezi ATP v ADP, vodi do konformacijskih sprememb, ki poganjajo helikaze vzdolž verige, na katero so se vezale. 9

10 STABILIZACIJA IZPOSTAVLJENE ENOJNE VERIGE DNA Z SSB PROTEINI Ko se DNA razpre zaradi helikaz je na teh mestih enojna veriga. Ta mesta takoj zaščitijo SSB proteini (single-stranded binding proteins). Pri tem ne uporabljajo ATP in nimajo encimske funkcije kot helikaze. Glavni SSB protein v E. coli je polipeptid iz 177AK, tetramerne oblike in pokrije 32 sosednjih nukleotidov na enojni verigi DNA. Vezava enega SSB tetramera olajša vezavo drugih SSB proteinov v njegovi bližini (kooperativna vezava). Enojna veriga DNA je tesno prekrita z SSB, s tem ji je onemogočeno gibanje (postane rigidna = ne more tvoriti zank, ne more se upogibati). Ta rigidna konformacija je osnova za delovanje DNA kot templeta; osnova na kateri nastaja komplementarna DNA. To olajša DNA polimerazi, ki lahko sama dodaja baze. NASTANEK OKAZAKIJEVIH FRAGMENTOV S POMOČJO RNA PRIMERJEV: PRIMAZE, PRIMOSOMI DNA polimeraza lahko sama vstavlja nukleotide v nastajajočo polipeptidno verigo, ne more pa začeti sinteze DNA. Sinteza DNA se začne z RNA, ki je evolucijsko starejša. Začetno mesto sinteze DNA ne prepozna DNA polimeraza, ampak encim (RNA polimeraza), ki prepisuje DNA v RNA verigo. Ta služi kot primer (RNA). RNA polimeraza, celični encim, ki normalno prepisuje matično DNA v RNA, naredi majhne RNA fragmente. Primerje za okazakijeve fragmente naredijo posebne RNA polimeraze, imenovane primaze, ki prepoznajo specifična zaporedja enojne verige DNA. Primaza E. coli je enojen peptid iz 60kdal. Prisotna v kopijah na celico.primaza sama zase (očiščena) je le delno aktivna. V povezavi s 6 proteini pa tvori agregat imenovan primosom. Primaza s temi encimi pa je polno aktivna (holoencim). Vsak okazakijev fragment se začne z RNA primerjem, ki ga naredi primosom. Ta se pomika 5`---3` koncu. Primosom začne sintezo RNA primerja na specifičnih sekvencah. Razdalje na teh sekvencah regulirajo velikost okazakijevih fragmentov. Vsi primerji imajo enake sekvence, zato so vsa startna mesta pred okazakijevimi fragmenti enaka. Primosom se pomika po verigi DNA v nasprotni smeri kot kadar katalizira sintezo lastne RNA. To razlaga dejstvo, zakaj se sintetizirajo le kratki RNA primerji, dolgi nekaj nukleotidov (3bp pri E. coli, 5bp virus, 9bp živalska celica). DNA polimeraza I zapolni razpoke med okazakijevimi fragmenti in hkrati odstranjuje RNA primer na 5` koncu sosednjega fragmenta. DNA polimeraza je hkrati eksonukleaza za smer 3`---5` in 5`---3`, zato lahko odstrani deoksiribonukleotide kot tudi ribonukleotide in ni omejena le na RNA primer.odstrani lahko tudi poškodovane dele DNA. Da so RNA primerji nujno potrebni za začetek sinteze cele DNA ima pomen, ker se na ta način zaščitijo številne letalne napake na mestih začetka sinteze. Vezava prvih nukleotidov vzdolž matrike DNA Je tako lahko veliko bolj natančna, kot če bi se nukleotidi dodajali vzdolž dolgega dela že formiranega dvojnega heliksa. Zato so velike selektivne prednosti tega iniciacijskega mehanizma, ki omogoča razlikovati in pozneje odstraniti začetne nukleotidne sekvence. Lipaza naredi zadnjo fosfatno vez med fragmentoma DNA. DNA POLIMERAZA III JE AGREGAT SEDMIH RAZLIČNIH POLIPEPTIDOV Za polno aktivnost DNA polimeraze III mora biti prisotnih vseh 7 polipeptidov.proteini, ki sestavljajo DNA polimerazo III so: gama-1x, alfa, beta, epsilon, theta, T-2x.Proteinaza ima 10

11 funkcijo polimeizacije in eksonukleazno funkcijo v smeri 5`---3`, medtem ko ima polipeptid epsilon le eksonukleazno funkcijo v smeri 3`---5`.Ostali proteini imajo druge funkcije, kot so vezava na ATP molekulo, ki je potrebna, da DNA polimeraza III začne sintezo na koncu primerja.število DNA polimeraz v celici E. coli je majhno. Na replikacijskih vilicah sta dve molekuli holoencima DNA polimeraze III. Dvojni agregat bi lahko vršil simultano sintezo na lagging in leading verigi. To se zgodi, če se lagging veriga zvije (okoli polimeraze) in postane enako orientirana kot leading (glede na encim). Glede na to shemo, se lagging veriga vleče skozi holoencimski kompleks in doseže primer, ki ga je sintetiziral primosom. Okazakijev fragment raste in ko doseže začetek že prej sintetiziranega okazakijevega fragmenta, se zanka sprosti ni več pritrjena na holoencim.sinteza leading verige naredi na razpolago novo raztegnitev nesparjene lagging verige, ki se bo zavila nazaj in sodelovala v nastanku naslednjega okazakijevega fragmenta na lagging verigi.po takem mehanizmu sinteza leading verige ne bo nikoli preveč prehitevala sintezo lagging verige.še več, primosom se bo avtomatsko pomikal vzdolž podvojevanja DNA z enako hitrostjo, kot DNA polimerizacijske komponente DNA polimeraze III. Podvojevalni kompleks proteinov replisom : - DNA polimeraza III - Primosom - helikaza Replisom je najpomembnejši del, ki vodi podvojevalni proces. SKICA 1 11

12 ZAČETEK PODVOJEVANJA NA MESTU ORI Začetek podvojevanja je oddaljen od začetka okazakijevih fragmentov. Bakterijska in virusna DNA vsebuje le eno ORI mesto (mesto začetka podvojevanja). Pri E. coli je to mesto omejeno na 245 baznih parov, ki ležijo med geni za sintezo asparagina in sintezo, ki vrši kontrolo ATP sistetaze. Mutageneza in vitro je pokazala, da je samo del baz na ORI mestu bistvenih za podvojevanje. Morda so to tiste baze, ki jih prepoznajo proteini vključeni v procesu nastanka replikacijskih vilic.ključni dogodek je začetek sinteze leading verige. Tej sintezi sledi kmalu sinteza lagging verige po prej opisanem mehanizmu.najprej pride do transkripcije ORI mesta leading verige DNA s pomočjo RNA polimeraze. a) za nekatera ORI mesta (plazmid coi E) lahko služijo te RNA verige kot primerji za leading vrvico. Rna verigo, ki ni več potrebna pa razgradi encim Rna-sa H (H = hibrid), primer odstrani Rna-sa N. b) Pri večini RNA veriga, ki jo sintetizira RNA polimeraza nima funkcije primerja, ampak odpre heliks na ORI mestu. Tja se veže primosom, ki naredi pravi primer v obratno smer.proces imenujemo transkripcijska aktivacija. Ni pomembno, na kakšen način nastane primer. Prisotnost RNA primerja še ne pomeni, da se bo DNA avtomatsko sintetizirala, ker se ponavadi RNA veriga takoj loči od DNA. Posledica tega je da se ločeni verigi DNA zopet združita v dvojni heliks.za to morajo biti prisotne posebne molekule, ki preprečijo ponovno vezavo v dvojni heliks. Začetek leading vrvice v mnogih primerih zahteva še prisotnost dodatnih proteinov, ki sodelujejo le med iniciacijo. Med temi proteini je dnaa (E. coli) in O protein (fag), ki se povežeta s štirimi seti, po 9 baznih parov, ki so v različnih sistemih ohranjeni v zaporedju. Informacija za sam začetek sinteze je kodirana v DNA. LOČITEV DVEH STARŠEVSKIH VERIG ZAHTEVA SODELOVANJE ENCIMA TOPOPIZOMERAZE II Pri podvojevanju krožne DNA nastane vrzel, ko se odstranijo RNA primerji. Vrzel se zapolni z nukleotidi. Krožna DNA se podvaja obojesmerno vse dotlej, da se nasprotni replikacijski vilici ne srečata. To se zgodi približno 180 od začetka replikacije. Končno ločitev dveh hčerinskih dvojnih heliksov ni avtomatska.po koncu replikacije sta hčerinska dvojna heliksa povezana še z zavoji, druga okoli druge.in vitro topoizomeraza II katalizira ločitev teh dveh hčerinskih dvojnih heliksov. Topoizomeraza cepi in spaja DNA. Brez nje bi nastali supernavoji. Njena značilnost je, da lahko katalizira na obeh koncih DNA (5`in3`), medtem ko DNA polimeraza le na koncu 3`OH. MODEL ODVIJAJOČEGA SE KROGA PRI KROŽNI DNA (SKICA 2) Na ta način se podvajajo plazmidi, virusna DNA, amplifikacija genov. Po tem modelu se podvaja DNA med konjugacijo pri bakterijah.sinteza DNA se začne s prekinitvijo na ORI mestu vrvice starševske DNA. Na ta način dobimo dva prosta konca polinukleotida, ki se kemijsko razlikujeta. Na enem koncu je na ostanku sladkorja prosta 3`OH skupina, na drugem pa prosta 5` fosfatna skupina. 5` konec je izpodrinjen in se v obliki repa odvija v dolžino. Na repu se zbirajo SSB proteini. 12

13 Sinteza DNA se začne z vezavo nukleotidov na 3 OH konec s pomočjo DNA polimeraze III. Ta proces je mogoč, če se istočasno cel obroč vrti okoli svoje osi. Imenuje se, ker je odvijanje prostega konca omogočeno s kroženjem DNA okoli svoje osi. To odvijanje ne predstavlja nobenega topografskega problema, ker se obroč drži s pomočjo ene same polinukleotidne verige. DNA se tako stalno odvija, sproti se delajo fragmenti, zato topoizomeraze niso potrebne. V donorski celici se DNA odvija, v recipientski pa se podvojuje z Okazakijevimi fragmenti. Celici sta skupaj. 5 konec v obliki repa se v gostitelju hitro podvojuje v dvojni heliks DNA. Primaza, vključena v primosom, naredi RNA-primer-je. Nato pa rastejo Okazakijevi fragmenti. Sila, ki odvija 5 konec, verjetno ni posledica polimerizacije na 3 koncu, ampak pomik DNA polimeraze III primosomskega kompleksa (replisom), ki ga poganja lastna helikaza. DNA faga lahko ostanejo linearne ali pa tvorijo obroč s pomočjo svojih enoverižnih komplementarnih koncev. Linearna in krožna DNA sta med seboj interkonvertibilni. PODVOJITEV KROŽNE ENOJNE VERIGE DNA V DVOJNI HELIKS Za podvojitev enojne DNA virusa M13, 64, X174 v replikativno formo (RF), ki se podvoji v dvojni heliks (+/-), so potrebni RNA-primerji. Podvajanje virusne DNA se začne po infekciji + verige, ki vstopi v gostiteljsko celico in postane pokrita z SSB proteini. RNA polimeraza katalizira sintezo kratke RNA verige. Ta omogoči sintezo verige. Po sintezi se primerji odstranijo, zato ostanejo majhne vrzeli, ki jih zapolni polimeraza I, ki tudi odstrani RNA primer. V celici je vedno dvojna DNA virusa, ven gre pa zopet enojna. SINTEZA KROŽNE + VERIGE PO SINTEZI RF (+/-) Vse RF enojne verige DNA fagov uporabljajo»rolling circles«za produkcijo njihovih lastnih kopij in produkcijo + verige. Kako se to zgodi, je najbolj raziskano pri fagu X174. Ta ima protein A, ki reže verigo in je nujen za začetek»rolling circle«. Ta encim prepozna ORI mesto na kovalentno zaprti RF, jo na tem mestu prereže in ostane vezan na 5 koncu DNA. 5 konec + verige ima vezan tudi replisom, ki opravlja funkcijo replikacijskih vilic. SINTEZA IN PRENOS ENOJNE DNA MED PARJENJEM BAKTERIJE Pri parjenju bakterije se moška DNA prenese v žensko bakterijo v enoverižni obliki. DNA se sintetizira po»rolling«mehanizmu. Sinteza se začne s cepitvijo ene verige moškega kromosoma. Ta veriga se podaljšuje na svojem 3 koncu, 5 konec pa se izpodriva. Encimi, ki režejo dvojno DNA na specifičnem mestu, so podobni encimom, ki»rolling circle«. Encimi ostanejo vezani na 5 koncu in vodijo enojno verigo DNA v žensko celico. Ko je moška DNA znotraj recipienta, se podvoji v normalno dvojno vijačnico. Ta DNA lahko v procesu rekombinacije izmenja gene s prvotnim ženskim kromosomom. (SLIKA 3) 13

14 LINEARNE VIRUSNE DNA, KI SE PODVAJAJO BREZ UPORABE PRIMERJEV (str.304) Številni virusi (od katerih se nekateri množijo v prokariontskih, drugi pa v evkariontskih celicah) imajo linearne DNA, katerih sinteza ne uporablja RNA primerjev. Najbolj poznane so linearne DNA faga 29 in tiste, ki so jih našli v adenovirusih (skupina virusov, ki inficirajo vretenčarske celice). Te linearne DNA se ne začnejo podvajati»notranje«na ori mestu. Namesto tega se replikacija vedno začne na enem izmed koncev DNA. Z enako verjetnostjo se lahko začne na enem ali drugem koncu. Vsaka taka linearna DNA molekulama na svojih koncih istovrstne sekvence, vendar je ta odsek orientiran v nasprotni smeri. Tako njihovo podvajanje DNA ne more proizvajati»concatamer«med replikacijo. Med replikacijo ne pride do tvorbe dveh komplementarnih verig, od katerih bi vsaka služila kot matrika. Namesto tega 3 5 orientirana veriga služi kot matrika, druga 5 3 orientirana starševska veriga pa se pomakne (imenujemo jo tudi enoverižni rep). Ta veriga (5 3 ) tvori H-vezi med komplementarnimi sekvencami na svojem 3 in 5 koncu. Pri tem nastane zanka. Ta veriga (rep) nato služi kot matrika za 5 3 hčerinsko verigo. Vsi 5 konci adenovirusnih verig vsebujejo specifičen protein, pritrjen na končni citozin nukleotid. Preden se replikacija začne, se ta terminalni protein kovalentno veže s 5 fosfatom deoksicitidin monofosfata. Ti procesi zahtevajo edinstveno od virusa kodirano DNA polimerazo, ki uporabi terminalni protein kompleks kot primer. Kompletna replikacija zahteva delovanje topoizomeraze, ki odstrani supernavitost, ki je nastala pri premestitvi. To je primer, ko se tudi linearna DNA, ki ima sicer proste konce, ne more podvajati brez delovanja topoizomeraze I. Adenovirus kodira ta protein, ki se veže na enojno DNA. Ta protein nastaja med multireplikacijo adenovirusa in ima podobno funkcijo kot helikaza. REGULACIJA SINTEZE DNA (str. 305) Zaenkrat še niso popolnoma raziskani razlogi, ki omejujejo DNA replikacijo na določene omejene periode znotraj celičnega cikla. Ne moremo tudi zagotoviti, da se origin uporabi samo enkrat skozi cikel kromosomske replikacije. Mogoče ključni začetni proteini (kot npr. dnaa protein pri E. coli) nekako modificirajo DNA na katero se vežejo, tako da se origin-i ne morejo znova uporabiti kot štartna mesta za sintezo DNA, dokler se ne modificirajo nazaj do njihovega originalnega stanja (npr. metilacijsko-demetilacijski cikel). Vendar za take modifikacije še ni dokazov. Zelo zanimiv odgovor lahko pride z analizo plazmidne DNA. Podvajanje plazmida ColE1 pri E. coli je regulirano vsaj v odseku pri sintezi RNA molekul, ki se prepišejo v nasprotni smeri od tistih DNA sekvenc, ki dajo signal RNA primerjem za sintezo»leading«verige. Taka RNA blokira primerjev začetek sinteze DNA. Enako važna informacija lahko pride iz študij evkariontskih plazmidnih DNA, ki se podvajajo samo enkrat v celičnem ciklu. Tudi tu pride verjetno do ovire origin mesta, da bi lahko funkcioniral več kot enkrat na celični cikel. 14

15 ALI SO MEMBRANE VKLJUČENE V DNA REPLIKACIJO IN LOČITEV (str. 306) Vprašanje, kako se lahko DNA molekule (kromosomi) pravilno ločijo med mitozo, tako da vsaka hčerinska celica dobi enega od starševskih kromosomov., še nima jasnega odgovora. Dolgo so domnevali, da gre za zvezo med celično (ali jedrno) membrano in specifično regijo kromosoma. Danes je jasno, da nobena stopnja v replikaciji DNA ne potrebuje navzočnosti katerekoli komponente membrane. To dejstvo pa ne pomeni, da se membrana in DNA ne vežejo specifično druga z drugo. Kakor dolgo bo tako težko ločiti celično membrano od ostalih celičnih partiklov, na o vprašanje ne bo možno zagotovo odgovoriti. FUNKCIONALNE POSEBNOSTI DNA POLIMERAZ PRI EVKARIONTSKIH CELICAH (str. 306) Težko je ugotoviti, kako poteka replikacija DNA na encimskem nivoju pri evkariontskih celicah. Karakterizirane so tri različne DNA polimeraze: α, β in γ. α DNA polimeraza ima tako vlogo, kot jo ima DNA polimeraza III pri bakterijah. Kot polimeraza III je tudi α polimeraza holoencim, sestavljen iz različnih polipeptidov. Še vedno pa je nekoliko nejasna funkcija veliko manjše β DNA polimeraze. Domnevajo, da sodeluje pri popravljanju DNA Precej bolje je raziskana γ DNA polimeraza. Ta je locirana (in mogoče v kloroplastih). Tu sodeluje pri podvajanju mitohondrijske DNA. Katalizira dislokacijski tip sinteze (slika 10-27), v katerem se najprej kopira le ena veriga ( H ). Šele ko naredijo replikacijske vilice pol poti okoli, se začne kopiranje na drugi ( L ) verigi. Po pričakovanjih so v mitohondrijih našli tudi topoizomeraze. Te katalizirajo zapiranje in rezanje, ki da možnost odvijanja starševskih verig in kasnejšo ločitev hčerinskega dvojnega heliksa. REKOMBINACIJA DNA (str.313) Rekombinacija je proces, pri katerem se genetski elementi več različnih genomov združijo v eno enoto. Rekombinantna DNA molekula tako vsebuje DNA iz različnih virov. Genetska izmenjava poteka konstantno in je vzrok veliki variabilnosti. Najbolj očitna je pri mejozi (crossing over med homolognimi kromosomi). Zaporedje genov je relativno stabilno, občasno pa lahko pride do sprememb vrstnega reda genov. To omogočajo transpozicijski elementi, ki imajo določeno samostojnost. So nosilci enega ali več genov, lahko vplivajo na ekspresijo drugih genov. Rekombinacija ni naključna, temveč gre za reguliran encimatski proces. Posledice rekombinacije so variabilnost, pridobitev izgubljenih sekvenc, regulacija genske ekspresije, v zadnjem času pa služi kot orodje za usmerjeno manipulacijo z geni. 15

16 Homologna rekombinacija (str. 264) Generira jo crossing over. Pojavi se med dvema regijama DNA, ki vsebuje identične ali skoraj identične sekvence. Ponavadi so te sekvence na ekvivalentnih regijah homolognih kromosomov, vendar lahko crossing over poteka tudi med homolognimi segmenti v neekvivalentnih regijah. Posledica je nastanek duplikacij in delecij v kromosomu (sl. 7-25). Ker je dvojna DNA neaktivna, je pogoj za začetek rekombinacije prekinitev H-vezi vsaj v eni nitki. Prekinitev omogoča dostop nukleazam, ki degradirajo eno od verig, ali encimom, ki razvijejo dvojno DNA. Končna posledica je izpostavljena enojna DNA. Več prekinitev pomeni večjo frekvenco rekombinacije. Tak efekt povzročajo UV in X žarki ali mutacije genov za DNA polimerazo in DNA ligazo. RecA protein pari enojno DNA verigo in komplementarno sekvenco v tarčnem kromosomu. Je produkt gena RecA v E. coli. Encimatske lastnosti RecA proteina omogočajo rekombinacijo prekinjene DNA. Mehanizem delovanja (sl. 11-5): RecA specifično prepoznava enojno DNA, nanjo se veže v fiksnem razmerju (1 polipeptid na 5 nukleotidov), nastane DNA proteinski filament. RecA vezan v filamentu išče od zunaj komplementaren del dvojne vijačnice (evkarionti: pri iskanju homologije sodelujejo še drugi proteini) ko najde homologen del, odvije dvojno vijačnico ATP omogoča parjenje v smeri od 5 proti 3 glede na enojno vijačnico Ko se stvori nov DNA hibrid, RecA protein odpade Vmesna struktura pri parjenju je trojni heliks (sl. 11-7) Primer vezave enojne krožne in dvojne linearne DNA (sl. 11-6). Heterodupleksi (sl ) so tiste regije na rekombinantnih DNA molekulah, kjer pride do parjenja različnih verig območje, kjer baze niso komplementarne. So kratkoživi, obstajajo do naslednje podvojitve rekombinantnih DNA molekul. Pri tej ločitvi (segregaciji) heterodupleksov in nadaljni sintezi nove verige pride do sprememb zaradi popravljalnih mehanizmov. Pri rekombinaciji dveh dvojnih DNA vijačnic se pojavi intermediat s prekrižanimi verigami, imenovan Holliday-ev mostiček (sl.11-8). Obe dvojni DNA sta na kratkem delu denaturirani. Na mestu stika prihaja do parjenja baz. Prosta rotacija osi DNA molekule dopušča, da se na mestu Holliday-evega stika prehaja enojna veriga iz ene dvojne vijačnice na drugo vijačnico in obratno.ta premik poteka brez izgube parov in tvorbe neustreznih vezi. Ko je ta prečna povezava vzpostavljena, lahko potuje vzdolž molekul kot zadrga. Pri tem pride do zamenjave obsežnega dela verige, dobimo druge dele hibridne DNA, ki lahko vsebujejo heterodupleksne regije (sl. 11-9). Druga lastnost Holliday-eve strukture je zmožnost izomerizacije. Sterične preureditve povzročijo spremembo položaja posameznih vrvic. Na koncu nukleaza prekine prečno povezavo, sprostita se dve izomeri (sl ). Drugi proteini pri rekombinaciji: Nukleaza (neidentificirana) reže Holliday-eve stike in s tem sprošča rekombinantne DNA molekule nekateri proteini DNA sinteze 16

17 RecBC protein (2 podenoti, Mr=300 kd, produkt genov RecB in RecC v E. coli). Če je ta protein defekten, je frekvenca rekombinacije po konjugaciji 100X manjša. Ima dvojno aktivnost: deluje kot nukleaza in razvija dvojno DNA. Posledica teh aktivnosti je izpostavitev enojne DNA z enim prostim koncem. S tem je omogočena vezava RecA proteina. Mehanizem delovanja (sl.11-17): RecBC začne razvijati verigo samo, če ima DNA prosti konec. Potrebuje energijo ATP, da lahko potuje vzdolž ene vijačnice. Pri tem zavija in razvija DNA. Ker je hitrost odvijanja večja od hitrosti zavijanja, nastaneta dve enoverižni zanki (»zajčja ušesa«). Zanki raseta, dokler RecBC ne razvije mesta χ (= hi, specifična sekvenca nukleotidov 5 GCTGGTGG 3 ). Ob tem mestu protein deluje kot nukleaza in reže vrvico. χ mesto je v E. coli zelo pogosto (okoli 1000 takih mest). Rec BC protein deluje tudi na bakteriofagno DNA. Nerecipročne rekombinacije Pri genski konverziji (zamenjavi) pride do izgube enega alela, drugi je podvojen (str. 325, sl ). Do izgube pride pri nastanku heterodupleksa, kjer popravljalni encimi izrežejo nekomplementarni bazi in nastane nerecipročna rekombinacija. Insercije in delecije zaradi napak pri crossing over-ju Pri crossing over-ju pride včasih do nastanka heterodupleksa (sparjeni verigi nista čisto homologni). To lahko vodi do insercije in delecije večjih blokov nukleotidov, kar ponavadi izvrši RecA protein (str. 326, sl.11-29). Rekombinacijski popravljalni sistem poškodovane molekule DNA Poleg tega, da je crossing over vzrok za gensko raznolikost, ima tudi pomembno vitalno vlogo pri popravljanju DNA. 1. Del ene nitke dvojnega heliksa je poškodovan oz. manjka Mehanizem popravljanja (str. 324, sl ) a) RecA protein zapolni poškodovano mesto, prisotna je še homologna DNA za to mesto. b) Nukleaze cepijo nepoškodovano homologno DNA, ki zapolni poškodovano mesto oz. vrzel, dvojna heliksa sta povezana. c) Vrzel se premesti na drugi heliks, ki ga dogradijo DNA polimeraze. Rekombinacija kot popravljalni mehanizem pride v poštev, če sta dva T-T dimera blizu skupaj ali pa če pride do navzkrižne vezave C-C zaradi delovanja mitomicina, saj se podvojevanje ob takšnih mestih ustaviin potrebna je rekombinacija s homologno DNA. 2. Del dvojnega heliksa je poškodovan (vzrok so lahko X-žarki). Mehanizem popravljanja temelji na uporabi nepoškodovanega homolognega dvojnega heliksa DNA (sl.11-20): 17

18 a) Nukleaze izpostavijo odtrgana konca, RecA protein zapolni vrzel. b) Homologni nitki se izmenjata in pride do tvorbe dvojnega rekombinacijskega skupka. c) Vrzeli zapolnijo DNA polimeraze z nukleotidi. d) Dvojna heliksa se ločita. (SKICA 4) 18

19 Mestoma specifična rekombinacija To je rekombinacija med določenimi mesti, delno homolognimi. Na teh mestih so sekvence za encime, ki katalizirajo rezanje in ponovno združevanje. Velikokrat je rezultat drugačno izražanje genov. Primer: Bakteriofag λ in E. coli: rekombinacija med mestoma att.p (na fagu) in att.b (na bakteriji) (str. 329, sl.11-21). Za ta primer, kot tudi na splošno, velja: izmenjava je recipročna, ohranja DNA in se pojavlja na specifičnih nukleotidih brez kratke homologne regije fagne in bakterijske DNA. Bakteriofag λ kodira encim λ integrazo, ki usmerja vključitev faga λ v E. coli in rekombinacijo. Na mestu att.b sedi protein IHF. Mehanizem rekombinacije: λ integraza cepi ob mestih att.p in att.b in vgradi fag v bakterijski kromosom, fag pa postane neaktiven profag. Integraza deluje podobno kot topoizomeraza II. Isti mehanizem velja tudi za umetno narejen plazmid, ki vsebuje oba att.p in att.b. Integraza prepozna iz 250 baznih parov sestavljen att.p, vzdolž katerih potekajo ločena oprijemalna mesta za integrazo in IHF (str. 330, sl ). Att.B pa sestavlja okoli 20 baznih parov. Obe mesti imata nekakšno jedro, ki je homologni del iz 15 baznih parov. Tu poteka crossing over in je tudi oprijemališče za integrazo. Reverzibilni proces je ekscizija, fagna in bakterijska DNA sta spet ločeni. Profag λ ima gen za ekscizionazo, ki skupaj z integrazo omogoči obratno reakcijo. Mestoma specifična rekombinacija regulira gensko ekspresijo rekombinacija med mestoma na isti DNA molekuli Pri takšni rekombinaciji sta lahko dve mesti glede na orientacijo rekombinantnih mest (str.331, sl.11-24): 1. Če sta rekombinantni mesti nesprotno obrnjeni, pride do inverzije vmesno ležečega segmenta. 2. Če sta rekombinantni mesti enako obrnjeni, pride do ekscizije oz. odstranitve vmesnega segmenta. Pogosto se takšna rekombinacija uporablja za regulacijo prisotnosti oz. odsotnosti zunanjega proteina, ki ima lahko vlogo površinskega antigena. Takšen je flagelarni antigen Salmonelle, sestavljen iz dveh proteinov: H1 in H2, ki se izražata alternativno. (SLIKA 5) 19

20 Transpozoni prenašajo gene na nova, nedoločena mesta (str. 332) Pri rekombinaciji se vrstni red genov na kromosomu običajno ohrani. Eksperimentalno pa so ugotovili, da povsem nepričakovano prihaja tudi do prestrukturiranja kromosoma. Najbolj nazoren primer genskega premeščanja je bakterijska rezistenca proti antibiotikom, kot je tetraciklin (Tc), penicilin, Geni bakterijske rezistence proti antibiotikom se lahko prenašajo s plazmidi, ki niso homologni bakterijskemu kromosomu. V celici, ki vsebuje plazmid z informacijo za rezistenco, se geni za rezistenco občasno pojavijo v bakterijskem kromosomu ali v genu inficirajočega faga, z rekombinacijo, povsem brez homologije. Po vključitvi genov za rezistenco v nov genom, se ti geni lahko ponovno prenesejo (iz bakterijske DNA v kak drug plazmid), vendar so taki primeri redki. TRANSPOZIBILNI ELEMENTI (TE) so specifična zaporedja DNA, ki se lahko premikajo z enega mesta v genomu na druga, brez homologije. Znani TE so dolgi od 700 do baznih parov. Te so lahko: Enostavni = insercijske sekvence (IS) Ti vsebujejo le informacijo za transpozicijo. Nimajo specifične funkcije v celici, vendar z insercijo lahko spreminjajo gensko aktivnost. Kompleksni = transpozoni (Tn) Kompleksni transpozoni poleg informacije za transpozicijo vsebujejo še od enega do nekaj genov za lastnosti, kot so: rezistenca na antibiotike, produkcija toksinov, Na konceh kompleksnih Tn so IS ali pa vsaj ostanki IS. To pomeni, da se Tn verjetno formira, kadar se IS hkrati vključijo na obe strani gena, IS tako postaneta del celote kompleksnega transpozona in se ne moreta več samostojno premikati, temveč se cela skupnost prenaša vezano. Transpozoni s naravno prisotni v vseh organizmih. Faktorji prenosa rezistence sestojijo pretežno iz transpozonov in lahko določajo rezistenco za več antibiotikov hkrati (str. 335) Multiplo rezistentne bakterije predstavljajo resen medicinski problem. Patogena bakterija lahko postane rezistentna na več antibiotikov hkrati, ko v svoj genom vključi plazmid z informacijo za rezistenco na vsakega od teh antibiotikov. Informacije za rezistenco se v plazmidu nahajajo na ločenih genih. Razvoj multiplo rezistentnih plazmidov je omogočila sposobnost transpozonov, da se rekombinirajo brez homologije in tako združijo v en sam plazmid, katerega obstanek je zagotovljen z redno uporabo kombinacije antibiotikov. Kompleksen plazmid R1 je naravni element. Sestavljen je iz transpozonov z informacijo za rezistenco na kloramfenikol (Cm) in konamicin (Cn). Poleg tega vsebuje še Tn4 z informacijo za rezistenco na sulfonamid (Su), streptomicin (Sm) in amplicin (Ap) (stran. 334, sl ). Sam Tn4 pa vsebuje še ločen, samostojen transpozon Tn3, ki vsebuje le informacijo za rezistenco na Ap. 20

21 Celotna skupina genov za rezistence (=r-determinanta), je povezana z ostalimi zaporedji, ki vsebujejo informacijo za replikacijo in prenos plazmida. Produkti teh genov zagotovijo kontakt donorja z recipientom, kar omogoči prenos plazmida iz ene celice v drugo. Transpozoni vsebujejo gene, ki usmerjajo in regulirajo njihovo transpozicijo (str. 334) Geni za rezistenco na antibiotike so le dodatna informacija v transpozonski DNA. Njena osnovna informacija služi usmerjanju in reguliranju frekvence lastnega gibanja. Za vedenje transpozonov sta bistveni dve lastnosti: 1. Obrnjene ponovitve (IR):20 do 40 nukleotidov iz enega konca je skoraj identično ponovljenih na drugem koncu Tn, le z obratno orientacijo. 2. Gene, ki kodirajo transpozazo (to je encim,ki katalizira insercijo kromosoma na novo mesto). Koncentracija transpozaze v celici je zelo nizka, zato je transpozicija redka. Primer za Tn10: v povprečju se sintetizira manj kot ena molekula transpozaze v vsaki generaciji. Taka količina encima omogoči transpozicijo Tn10 enkrat v 10 7 celičnih generacijah. Pri višjih koncentracijah transpozaze se število transpozicij poveča do 1000X. Zelo verjetno je število naravnih transpozicij regulirano s koncentracijo transpozaze. Pred nedavnim so odkrili pomemben dejavnik za ekspresijo in delovanje transpozaze. Promoterji za delovanje transpozaze pri Tn10 in nekaterih drugih transpozazah imajo GATC zaporedje baz v DNA. Komplementarna sekvenca sekvenci GATC je ravno GATC (smer 5 3 ). Na tem mestu sta metilirani obe verigi DNA. Pod takimi pogoji je promoter relativno neaktiven. Po podvojitvi DNA adenin v novo sintetizirani verigi v zaporedju GATC kratek čas ni metiliran. To je hemimetilirano stanje, v katerem je promoter mnogo bolj aktiven, zato se majhen del transpozaze sintetizira takoj po replikaciji. Podobno tudi mesto v Tn10, na katerega deluje transpozaza, vsebuje GATC zaporedje. Transpozaza je mnogo bolj dovzetna za to zaporedje, dokler še ni metilirana. Zato Tn10 teži k temu, da bi prišlo do transpozicije takoj po replikaciji DNA. Ni še znano, ali tudi drugi dejavniki v celici vplivajo na metilacijo in tako tudi na število transpozicij. Nekateri transpozoni vsebujejo tudi informacijo za encim resolvazo. Ta katalizira drugo stopnjo transpozicije (str. 336, sl.11-29). Pri Tn10 ima resolvaza še dodatno funkcijo, ki je neodvisna od prve: je represor lastnega gena in gena za transpozazo (str.335, sl.11-27). Veže se na transpozon med gen za resolvazo in gen za transpozazo in ju tako inhibira. Zato imata oba gena v normalnih pogojih nizko stopnjo ekspresije. Potek prenosa transpozonov (str.335) 1. Znano je, da je prenos transpozona izredno natančen. Prenese se celotno zaporedje baz Tn in niti delček iz DNA pred in po koncu transpozona. To omogoča encim (najverjetneje kar sama transpozaza), ki prepozna oba konca Tn. Konca sta običajno identična, saj imata isto vezavno mesto na transpozazi. 21