IMMUNORADIOMETRIC ASSAY FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF TOTAL PROSTATE-SPECIFIC ANTIGEN (PSA) IN HUMAN SERUM AND PLASMA

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1 Strada per Crescentino 4 Saluggia (Vercelli) Italy Tel Fax Total PSA IRMA R4 IMMUNORADIOMETRIC ASSAY FOR THE QUANTITATIVE DETERMINATION OF TOTAL PROSTATESPECIFIC ANTIGEN (PSA) IN HUMAN SERUM AND PLASMA. PRINCIPLE OF THE ASSAY The determination of prostate specific antigen (PSA) is a "sandwich" type assay. In the kit, mouse monoclonal antibodies directed against two different epitopes of PSA and hence not competing are used. Serum or plasma samples, the controls and standards are incubated in tubes coated with the first monoclonal antibody in the presence of the second monoclonal antibody, which is labelled with iodine5. After incubation, the contents of the tubes are rinsed so as to remove unbound 5 Ilabelled antibody. The bound radioactivity is then determined in a gamma counter. The PSA concentrations in the samples are obtained by interpolation from the standard curve. The concentration of total PSA in the samples is directly proportional to the radioactivity.. REAGENTS PROVIDED All reagents of the kit are stable until the expiry date indicated on the kit label, if stored at 8 C. Storage conditions for reagents after reconstitution or dilution are indicated in paragraph Assay Procedure... AntiPSA monoclonal antibody coated tubes: x 5 tubes (readytouse). Each tube must be used only once... 5 Ilabelled monoclonal antipsa antibody: one ml vial (readytouse) The vial contains 58 kbq, at the date of manufacture, of 5 Ilabelled antibody in buffer containing bovine serum albumin, sodium azide (<.%, see Precautions) and a dye... Standards: five.8 ml vials and one ml vial of zero standard (readytouse) The vials contain from to of human PSA in buffer with bovine serum albumin and sodium azide (<.%, see Precautions). The exact concentration is indicated on each vial label..4. Control sera: two vials (lyophilized) The vials contain human PSA lyophilized in bovine serum and sodium azide (<.%, see Precautions). The volume for reconstitution is indicated on the vial label, the concentration range after reconstitution is given on a supplement..5. Wash solution (5x): one ml vial Concentrated solution has to be diluted before use. Note: Temperatures and expiry dates printed on component vial labels apply to the longterm storage by manufacturer only, prior to assembling of the kit. Do not take into account.. MATERIAL REQUIRED BUT NOT PROVIDED In addition to standard laboratory equipment, the following items are required: precision micropipets ( µl). semiautomatic pipets ( ml). vortextype mixer. horizontal or orbital shaker. aspiration system. gamma counter set for 5 I. 4. PRECAUTIONS 4.. General remarks Bring all reagents to room temperature before pipeting. Do not mix the reagents from kits of different lots. A standard curve must be included with each assay. The correct setting of the shaker is very important for the reproducibility of the assay. It is recommended to perform the assay in duplicate. 4.. Basic rules of radiation safety The purchase, possession, utilization, and transfer of radioactive material is subject to the regulations of the country of use. Adherence to the basic rules of radiation safety should provide adequate protection: No eating, drinking, smoking or application of cosmetics should be carried out in the presence of radioactive materials. No pipeting of radioactive solutions by mouth. Avoid all contact with radioactive materials by using gloves and laboratory overalls. All manipulation of radioactive substances should be done in an appropriate place, distant from corridors and other busy places. Radioactive materials should be stored in the container provided in a designated area. A record of receipt and storage of all radioactive products should be kept up to date. Laboratory equipment and glassware which are subject to contamination should be segregated to prevent crosscontamination of different radioisotopes. Each case of radioactive contamination or loss of radioactive material should be resolved according to established procedures. Radioactive waste should be handled according to the rules established in the country of use. 4.. Sodium azide Some reagents contain sodium azide as a preservative. Sodium azide can react with lead, copper or brass to form explosive metal azides. Dispose of the reagents by flushing with large amounts of water through the plumbing system Human serum The materials of human origin, contained in this kit, were found negative for the presence of antibodies to HIV and HIV, antibodies to HCV, as well as of Hepatitis B surface antigen (HBsAg). However, they should be handled as if capable of transmitting disease. No known test method can offer total assurance that no virus is present. Handle this kit with all necessary precautions. All serum and plasma samples should be handled as if capable of transmitting hepatitis or AIDS and waste should be discarded according to the country rules. 5. SPECIMEN COLLECTION, PROCESSING, STORAGE AND DILUTION Collect blood in tubes either not containing any additive or containing heparin, EDTA or sodium citrate. Separate serum or plasma from cells by centrifugation. Serum and plasma samples may be stored at 8 C, if the assay is to be performed within 4 hours. For longer storage keep frozen (at < 8 C) after aliquoting so as to avoid repeated freezing and thawing. Thawing of sample must be performed at room temperature. If samples have concentrations greater than the highest standard, they must be diluted into the zero standard (namely the samples of patients with the developed prostate carcinoma together with bone metastases).

2 6. ASSAY PROCEDURE 6.. Preparation and storage of reagents Bring all the reagents to room temperature Reconstitution of control sera The contents of the vials is reconstituted with the volume of distilled water indicated on the vial label. Wait at least minutes and mix gently to avoid foaming before dispensing. Store the reconstituted solutions frozen at < 8 C until the expiry date of the kit Preparation of the wash solution Pour the contents of the vial into 5 ml of distilled water and homogenize. The diluted solution may be stored at 8 C until the expiry date of the kit. 6.. Assay procedure Step Additions * To antibody coated tubes add successively: µl of standard, control or sample and µl of tracer Mix Step Incubation Incubate for hours at 85 C with shaking (> 8 rpm) Step Counting Aspirate carefully the contents of tubes (except the tubes «total cpm») Wash twice with ml of wash solution and aspirate Count bound cpm (B) and total cpm (T) for min * Add µl of tracer to additional tubes to obtain total cpm. 7. RESULTS Results are obtained from the standard curve by interpolation. The curve serves for the determination of PSA concentrations in samples measured at the same time as the standards. 7.. Standard curve The results in the package insert were calculated using a loglog curve fit ("spline" mode) with determined radioactivity (cpm std cpm std ) on vertical axis and the PSA concentration of the standards on the horizontal axis (). Other data reduction methods may give slightly different results. Total activity: 964 cpm PSA cpm Standards cpm (n=) B/T (%) std () cpm std Example of standard curve, do not use for calculation. 7.. Samples Locate for each sample or control, the (cpm sample cpm std ) value on the vertical axis and read off the corresponding PSA concentration of the sample on the horizontal axis. The concentration of diluted samples must be corrected by the dilution factor. 8. QUALITY CONTROL Good laboratory practices imply that control samples must be used regularly to ensure the quality of the results obtained. These samples must be processed exactly in the same way as the assay samples, and it is recommended to analyse their results using appropriate statistical methods. 9. EXPECTED VALUES It is suggested that each laboratory establishes its own normal values for the local healthy population with respect to age and other potential ethnic and regional differences. Results should be interpreted in the light of the total clinical presentation of the patient, including clinical history, data from additional tests and other appropriate information. The total PSA concentrations in 46 sera from healthy men were determined using this kit. The average concentration was.77 with the standard deviation % of samples showed total PSA level below.8 and 99% of samples below 4.. To estimate the clinical utility of this kit, 99 sera of patients with benign diseases (benign hyperplasia and benign prostate tumour) and 86 sera of patients with prostate cancer were assayed. The optimum cutoff value to distinguish primary benign and malignant prostate diseases corresponding to 9% of clinical specificity was., with 75.6% sensitivity. The relative distribution of PSA concentrations in patients with prostate carcinoma and patients with nonmalignant diseases is presented in the following table. Nonmalignant diseases occurrence Prostate carcinoma occurrence 4 Total PSA concentration 4 > 46.5% 4.4%.% 7% 7.4% 75.6%. PERFORMANCE CHARACTERISTICS for more details, see the data sheet APPENDIX.. Analytical sensitivity:. ng PSA/mL.. Specificity The antibodies used in this kit do not crossreact with human CEA, AFP, prolactin and hcg. The crossreactivity with PAP is.5%... Precision... Intraassay Serum samples were assayed in replicates in the same series. The coefficients of variation were found below or equal to 7.%.... Interassay Serum samples were assayed in duplicate in different series. Coefficients of variation were found below or equal to 6.%..4. Accuracy.4.. Dilution test Three serum samples were diluted with the zero standard and assayed. The recovery percentages obtained were between 88% and 7%..4.. Recovery test Various PSA amounts were added to 4 serum samples and assayed. The recovery percentages obtained were between 75% and %.. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE It is recommended to dilute samples of PSA concentrations greater than the highest standard by the zero standard (namely the samples of patients with the developed prostate carcinoma together with bone metastases). The results obtained must be then multiplied by the dilution factor.

3 Strada per Crescentino 4 Saluggia (Vercelli) Italy Tel Fax PSA total IRMA R4 TROUSSE IMMUNORADIOMETRIQUE POUR LE DOSAGE QUANTITATIVE DE L ANTIGENE PROSTATIQUE SPECIFIQUE (PSA) TOTAL DANS LE SERUM ET LE PLASMA HUMAIN. PRINCIPE DU DOSAGE Le dosage de l antigène prostatique spécifique (PSA) est un dosage de type "sandwich". Dans la trousse, des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre deux épitopes différents du PSA sont utilisés. Les échantillons sériques ou plasmatiques, les contrôles et les standards sont incubés dans des tubes recouverts avec le premier anticorps monoclonal en présence du deuxième anticorps monoclonal, qui est marqué à l iode 5. Après l incubation, le contenu des tubes est rincé afin d éliminer l anticorps marqué à l iode 5 non lié. La radioactivité liée est alors mesurée dans un compteur gamma. Les concentrations de PSA dans les échantillons sont obtenues par interpolation à l aide de la courbe standard. La concentration de PSA total dans les échantillons est directement proportionnelle à la radioactivité.. REACTIFS FOURNIS Tous les réactifs de la trousse conservés à 8 C sont stables jusqu à la date de péremption mentionnée sur la trousse. Les conditions de conservation des réactifs après reconstitution ou dilution sont indiquées dans le paragraphe Mode Opératoire... Tubes revêtus d anticorps monoclonal antipsa: x 5 tubes (prêts à l emploi). Chaque tube ne doit être utilisé qu une seule fois... Anticorps monoclonal antipsa marqué à l iode 5: un flacon de ml (prêt à l emploi) Le flacon contient en début de lot 58 kbq d anticorps marqué à l iode 5 dans un tampon contenant de l albumine sérique bovine, de l azide de sodium (<,%, voir Précautions) et un colorant... Standards: 5 flacons de,8 ml et un flacon de ml de standard zéro (prêts à l emploi) Les flacons contiennent de à de PSA humain dans du tampon en présence d albumine sérique bovine et d azide de sodium (<,%, voir Précautions). La concentration exacte est indiquée sur l étiquette de chaque flacon..4. Sérums de contrôle: flacons (lyophilisés) Les flacons contiennent du PSA humain lyophilisé dans du sérum bovin en présence de l azide de sodium (<,%, voir Précautions). Le volume de reconstitution est indiqué sur l étiquette du flacon, la fourchette de concentration après la reconstitution est donnée dans un supplément..5. Solution de lavage (5x): un flacon de ml Diluer la solution concentrée avant utilisation. Remarque: Les températures et dates d'expiration imprimées sur les étiquettes des flacons concernent uniquement le stockage à long terme des réactifs par le fabricant, avant l'assemblage de la trousse. Ne pas en tenir compte.. MATERIEL NECESSAIRE MAIS NON FOURNI En plus de l'équipement de laboratoire habituel, il est nécessaire d'utiliser le matériel suivant: micropipettes de précision ( µl). pipettes semiautomatiques ( ml). mélangeur de type Vortex. agitateur à mouvement de va et vient horizontal ou à plateau oscillant. système d aspiration. compteur gamma calibré pour l iode PRECAUTIONS 4.. Précautions générales Equilibrer les réactifs à température ambiante avant utilisation. Ne pas mélanger des réactifs de lots différents. Effectuer simultanément la courbe standard et le dosage des échantillons. Le bon réglage de l agitateur est une condition importante pour la reproductibilité du dosage. Il est recommandé de réaliser les dosages en doublets. 4.. Protection contre les rayonnements ionisants L achat, la possession, l utilisation et l échange de matières radioactives sont soumis aux réglementations en vigueur dans le pays de l utilisateur. L application des règles de base de protection contre les rayonnements ionisants assure une protection adéquate. Ne pas manger, ni boire, ni fumer, ni appliquer de cosmétiques dans les laboratoires où des produits radioactifs sont utilisés. Ne pas pipeter des solutions radioactives avec la bouche. Eviter le contact direct avec tout produit radioactif en utilisant des blouses et des gants de protection. Toute manipulation de matières radioactives se fera dans un local approprié, éloigné de tout passage. Les produits radioactifs seront stockés dans leur conditionnement d'origine dans un local approprié. Un cahier de réception et de stockage de produits radioactifs sera tenu à jour. Le matériel de laboratoire et la verrerie qui ont été contaminés doivent être éliminés au fur et à mesure afin d éviter une contamination croisée de plusieurs isotopes. Chaque cas de contamination ou perte de substance radioactive devra être résolu selon les procédures établies. Toute mise aux déchets de matière radioactive se fera en accord avec les règlements en vigueur. 4.. Azide de sodium Certains réactifs contiennent de l azide de sodium comme agent conservateur. L azide de sodium peut réagir avec le plomb, le cuivre et le laiton, et former des azides métalliques explosifs. Lors du rejet de telles solutions à l évier, laisser couler un volume important d eau dans les canalisations Sérum humain Les produits d origine humaine contenus dans les réactifs de cette trousse ont subi un dépistage négatif, concernant les anticorps antivih, et VIH, les anticorps VHC, et l antigène de surface HBs, mais doivent cependant être manipulés comme des produits infectieux. En effet, aucune méthode connue ne peut assurer l absence complète de virus, c est pourquoi il est nécessaire de prendre des précautions lors de leur manipulation. Tous les échantillons de sérum ou de plasma doivent être manipulés comme étant susceptibles de contenir les virus de l hépatite ou du SIDA et les déchets doivent éliminés selon les réglementations nationales en vigueur. 5. PRELEVEMENT, PREPARATION, CONSERVATION ET DILUTION DES ECHANTILLONS Recueillir le sang dans des tubes secs ou contenant de l héparine, de l EDTA ou du citrate de sodium. Séparer le sérum ou le plasma des cellules par centrifugation. Les échantillons sériques ou plasmatiques peuvent être conservés à 8 C si le dosage est réalisé dans les 4 heures. Pour des périodes plus longues, il est préférable de les conserver

4 congelés, de préférence aliquotés (à < 8 C) afin d éviter les congélations et décongélations successives. La décongélation de l échantillon peut être réalisée à température ambiante. Si l échantillon analysé a une concentration supérieure au standard le plus élevé de la gamme, le diluer dans le standard zéro (c estàdire pour des échantillons de patients qui ont développé un carcinome de la prostate suite à des métastases osseuses). 6. MODE OPERATOIRE 6.. Préparation et conservation des réactifs Equilibrer les réactifs à température ambiante Reconstitution des sérums de contrôle Le contenu des flacons est reconstitué avec le volume d eau distillée indiqué sur l étiquette du flacon. Attendre au moins minutes et agiter doucement en évitant la formation de mousse avant de répartir dans les tubes. Conserver les solutions reconstituées à une température inférieure à 8 C jusqu à la date de péremption de la trousse Preparation de la solution de lavage Verser le contenu du flacon dans 5 ml d eau distillée et homogénéiser. La solution diluée peut être conservée à 8 C jusqu à la date de péremption de la trousse. 6.. Mode opératoire du dosage Etape Répartition * Dans les tubes recouverts d anticorps distribuer successivement: µl de standard, de contrôle ou d échantillon et µl de traceur Agiter Etape Incubation Incuber heures à 85 C avec agitation (> 8 rpm) Etape Comptage Aspirer soigneusement le contenu de chaque tube (sauf les tubes «cpm totaux») Laver fois avec ml de solution de lavage et aspirer Compter les cpm liés (B) et cpm totaux (T) pendant minute * Ajouter µl de traceur dans tubes supplémentaires pour obtenir les cpm totaux. 7. RESULTATS Les résultats sont déduits de la courbe standard par interpolation. La courbe sert à déterminer les taux de PSA des échantillons dosés en même temps que les standards. 7.. Courbe standard Les résultats présentés dans cette notice ont été calculés en employant un mode de tracé loglog (mode "spline") avec en ordonnée la radioactivité mesurée (cpm std cpm std ) et en abscisse la concentration en PSA des standards (). L utilisation d un autre mode de calcul peut conduire à des résultats légèrement différents. Activité totale: 67 cpm PSA cpm Standards cpm (n=) B/T (%) std () cpm std 76,4 4, , , , , 796 Exemple de courbe standard, ne pas utiliser pour les calculs. 7.. Echantillons Repérer pour chaque échantillon ou contrôle la valeur (cpm échant cpm std ) sur l axe vertical, puis le point correspondant de la courbe standard sur l axe horizontal et en déduire par lecture la concentration en PSA de l échantillon. La concentration des échantillons dilués doit être corrigée par le facteur de dilution s'il y a lieu. 8. CONTROLE DE QUALITE Les bonnes pratiques de laboratoire impliquent que des échantillons de contrôle soient utilisés dans chaque série de dosage pour s assurer de la qualité des résultats obtenus. Ces échantillons devront être traités de la même façon que les prélèvements à doser et il est recommandé d en analyser les résultats à l aide de méthodes statistiques appropriées. 9. VALEURS ATTENDUES Il est conseillé à chaque laboratoire d établir ses propres valeurs de référence pour la population locale saine en fonction de l âge et d autres différences potentielles, par exemple ethniques ou régionales. Les résultats doivent être interprétés à la lumière du tableau clinique complet du patient, incluant notament l'historique clinique et les résultats de tout autre test ou information relevante. Les concentrations en PSA total dans 46 sérums d hommes en bonne santé ont été mesurées en utilisant cette trousse. La concentration moyenne était de,77 avec un écart type de,76. 95% des échantillons montrent un niveau de PSA total inférieur à,8 et 99% inférieur à 4,. Pour estimer l efficacité clinique de cette trousse, 99 sérums de patients présentant des pathologies bénignes (hyperplasie bénigne et tumeur bénigne) de la prostate et 86 sérums de patients affectés par un cancer de la prostate ont été analysés. La valeur limite optimale pour distinguer des maladies de la prostate primaires bénignes et malignes correspondant à 9% de la spécificité clinique était de,, avec une sensibilité de 75,6%. La distribution relative des concentrations en PSA chez des patients avec un carcinome de la prostate et chez des patients atteints de maladies non malignes est présentée dans le tableau suivant. Concentration en PSA total 4 4 > Taux de maladies non malignes 46,5% 4,4%,% Taux de carcinomes de la prostate 7% 7,4% 75,6%. CARACTERISTIQUES DU DOSAGE voir la feuille APPENDIX pour plus de détails.. Sensibilité analytique:, ng PSA/mL... Spécificité Il n existe pas de réactivités croisées significatives avec l'ace, l'afp, la prolactine et l'hcg humains. La réactivité croisée avec la PAP est de,5%... Précision... Intraessai Des échantillons sériques ont été dosés fois dans une même série. Les coefficients de variation obtenus sont inférieurs ou égaux à 7,%.... Interessai Des échantillons sériques ont été dosés dans séries différentes en doublets. Les coefficients de variation obtenus sont inférieurs ou égaux à 6,%..4. Exactitude.4.. Epreuve de dilution Trois échantillons sériques ont été dilués dans le standard zéro et dosés. Les pourcentages de recouvrement s échelonnent entre 88% et 7%..4.. Epreuve de surcharge Différentes quantités de PSA ont été ajoutées dans 4 échantillons sériques et dosées. Les pourcentages de recouvrement s échelonnent entre 75% et %.. LIMITATIONS DE LA METHODE Il est recommandé de diluer les échantillons avec des concentrations en PSA supérieures au point de gamme le plus élevé en utilisant le standard zéro (c estàdire les échantillons de patients qui ont développé un carcinome de la prostate suite à des métastases osseuses). Les résultats obtenus doivent être multipliés par le facteur de dilution. 4

5 Strada per Crescentino 4 Saluggia (Vercelli) Italy Tel Fax Totales PSA IRMA R4 RADIOIMMUNASSAY FÜR DIE QUANTITATIVE BESTIMMUNG VON DEM TOTALEN PROSTATASPEZIFISCHEN ANTIGEN (PSA) IN HUMANSERUM UND PLASMA. TESTPRINZIP Der Radioimmunassay für die Bestimmung des Prostataspezifischen Antigens (PSA) basiert auf dem typischen Sandwichprinzip. Der Kit verwendet monoklonale Mausantikörper, wobei es sich um zwei nicht gegeneinander konkurrierende Epitope des PSA handelt. Die Proben bzw. Standards werden mit einem an der Röhrchenwand immobilisierten Antikörper inkubiert, in Anwesenheit des zweiten monoklonalen, 5 Jmarkierten Antikörpers. Nach der Inkubation wird die Flüssigkeit abgesaugt, und die Röhrchen gewaschen, um die ungebundenen 5 Jmarkierten Antikörper zu entfernen. Die gebundene Radioaktivität wird in einem GammaCounter gemessen. Die Konzentrationen des totalen PSA werden mittels Interpolation aus der Standardkurve bestimmt und sind direkt proportional zur gebundenen Radioaktivität.. REAGENZIEN Die Reagenzien sind bis zum Verfallsdatum stabil, wenn sie bei 8 C gelagert werden. Lagerungskonditionen der Reagenzien nach der Wiederherstellung oder Verdünnung werden im Paragraphen Testdurchführung erläutert... Röhrchen mit antipsa Antikörpern beschichtet: x 5 Röhrchen (gebrauchsfertig). Jedes Röhrchen darf nur einmal verwendet werden... 5 Jmarkierte monoklonale antipsaantikörper Lösung: ein ml Fläschchen (gebrauchsfertig) Das Fläschchen enthält 58 kbq (am Tag der Herstellung) des 5 J markierten Immunglobulins in Puffer mit Rinderserumalbumin, Natriumazid (<,%, siehe Warnungen und Sicherheitshinweise) und einem Farbstoff... Standards: fünf,8 ml Fläschchen + ein ml Nullstandard Fläschchen (gebrauchsfertig) Die Standardfläschchen enthalten zwischen und humanes PSA in Puffer mit Rinderserumalbumin und Natriumazid (<,%, siehe Warnungen und Sicherheitshinweise). Die genaue Konzentration ist auf jedem Fläschchen angegeben..4. Kontrollseren: zwei Fläschchen (lyophilisiert) Die Fläschchen enthalten lyophilisiertes humanes PSA, Rinderserumalbumin und Natriumazid (<,%, siehe Warnungen und Sicherheitshinweise). Das Volumen für Auflösung ist auf dem Etikett angegeben. Der Konzentrationsbereich nach Auflösung ist auf dem Blatt der Qualitätskontrolle angegeben..5. Waschlösung (5x): ein ml Fläschchen Die konzentrierte Lösung muss vor Gebrauch verdünnt werden. Anmerkung: Auf die Fläschchen gedruckte Temperaturen und Verfallsdaten betreffen nur die Langzeitlagerung beim Hersteller, vor der Zusammensetzung des Kits. Bitte nicht beachten.. ERFORDERLICHE, ABER NICHT MITGELIEFERTE GERÄTE Zusätzlich zu der Standardlaborausstattung werden die folgenden Geräte benötigt: Präzisionspipetten ( µl). Halbautomatische Pipetten ( ml). VortexMixer. Horizontal oder Orbitalschüttler. Absaugsystem. GammaCounter für 5 J. 4. WARNUNGEN UND SICHERHEITSHINWEISE 4.. Allgemeinhinweise Die Reagenzien sollten vor dem Pipettieren Raumtemperatur haben. Reagenzien aus Kits von verschiedenen Chargen sollten nicht miteinander vermischt werden. Eine Standardkurve ist für jeden Assay notwendig. Die korrekte Einstellung des Schüttlers ist sehr wichtig für die Reproduzierbarkheit des Assays. Der Assay sollte als Doppelbestimmung durchgeführt werden. 4.. Schutz vor radioaktiver Strahlung Annahme, Besitz und Verwendung, Lagerung, Transport und Beseitigung unterliegen den Vorschriften der Atomenergie bzw. der jeweiligen staatlichen Behörde. Die Einhaltung der Grundregeln beim Umgang mit Radioaktivität sollte eine ausreichende Sicherheit gewährleisten: In Räumen, in denen mit radioaktiven Materialien gearbeitet wird, sollte Essen, Trinken, Rauchen und Schminken vermieden werden. Keine Mundpipette verwenden. Direkter Kontakt mit radioaktiven Materialien sollte durch Tragen entsprechender Schutzkleidung (Laborkittel, Handschuhe) vermieden werden. Das Arbeiten mit radioaktiven Stoffen muss in dafür speziell gekennzeichneten Bereichen, die vom normalen Laborbetrieb abgetrennt sind, erfolgen. Radioaktive Materialien sollten in einem speziell gekennzeichneten Bereich gelagert werden. Ein Register der Eingänge und Lagerung aller radioaktiven Produkte sollte ständig aktualisiert werden. Kontaminierte Labor und Glasgeräte sollten isoliert werden, um eine Kreuzkontamination von verschiedenen Radioisotopen zu verhindern. Kontaminationen des Arbeitsplatzes müssen unverzüglich sorgfältig nach den üblichen Verfahren entfernt werden. Radioaktiver Abfall muss entsprechend den Richtlinien jedes Einsatzortes entsorgt werden. 4.. Natriumazid Zur Vermeidung mikrobieller Kontamination enthalten einige Reagenzien Natriumazid. Natriumazid kann mit Blei, Kupfer oder Messing zu explosiven Metallaziden reagieren. Um dies zu vermeiden, sollte bei einer Entsorgung über Rohrleitungen mit viel Wasser nachgespült werden Humanserum Bestandteile menschlichen Ursprungs, die für diesen Kit verwendet wurden, sind auf HIV und HIV Antikörper, HCV Antikörper und Hepatitis B OberflächenAntigen (HBsAg) getestet und als nicht reaktiv befunden worden. Es ist so vorzugehen, als ob eine tatsächliche Ansteckungsgefahr bestehen würde. Keine Testmethode kann völlige Sicherheit bieten. Der Kit sollte mit allen notwendigen Sicherheitsvorkehrungen behandelt werden. Alle Serum und Plasmaproben sollten als potentielle Überträger von Hepatitis und AIDS behandelt und Abfälle entsprechend den jeweiligen Länderbestimmungen entsorgt werden. 5. PROBENENTNAHME, BEHANDLUNG, LAGERUNG UND VERDÜNNUNG Sammeln Sie das Blut in Röhrchen, die entweder keine Antikoagulanzien oder Heparin, EDTA oder Natriumzitrat enthalten. Trennen Sie die Zellen vom Serum oder Plasma durch Zentrifugation. 5

6 Serum und Plasmaproben können bei 8 C gelagert werden, wenn der Assay innerhalb von 4 Std. durchgeführt wird. Für eine längere Lagerung sollten die Proben portioniert eingefroren werden (< 8 C), um wiederholtes Auftauen und Einfrieren zu vermeiden. Auftauen sollte bei Raumtemperatur stattfinden. Mit Nullstandard die Proben verdünnen, die PSAKonzentrationen größer als diejenigen des letzten Standards haben (insbesondere Proben von Patienten mit ProstataKarzinom zusammen mit Knochenmetastasen). 6. TESTDURCHFÜHRUNG 6.. Präparation der Reagenzien Die Reagenzien sollten Raumtemperatur haben Wiederaufnahme der Kontrollseren Der Inhalt der Fläschchen wird mit einem auf dem Etikett angegebenen Volumen destilliertem Wassers wiederaufgenommen. Eine Wartezeit von Minuten und leichtes Mischen sollten jegliches Schäumen vor dem Verteilen vermeiden. Die wiederaufgenommenen Lösungen sollten bei < 8 C gelagert werden, bis zum Verfallsdatum des Kits Präparation der Waschlösung Den Inhalt des Fläschchens in 5 ml destilliertes Wasser schütten und homogenisieren. Die verdünnte Lösung ist bei 8 C bis zum Verfallsdatum haltbar. 6.. Testdurchführung Schritt Zugabe * Zugabe zu den mit Antikörpern beschichteten Röhrchen (in dieser Reihenfolge): µl Standard, Kontrolle oder Probe und µl Tracer Mischen Schritt Inkubation Stunden bei 85 C unter Schütteln (> 8 U/m) inkubieren Schritt Messung Vorsichtig den Inhalt der Röhrchen absaugen (außer den zwei Röhrchen für Totalaktivität) Zweimal mit ml Waschlösung waschen und absaugen Gebundene cpm (B) und Totalaktivität (T) bestimmen ( Min) * Fügen Sie µl Tracer in zusätzliche Röhrchen hinzu, um die Totalaktivität zu erhalten. 7. ERGEBNISSE Die Ergebnisse werden aus der Standardkurve mittels Interpolation ermittelt. Die Kurve kann für die Bestimmung der PSAKonzentration in den Proben dienen, die zur gleichen Zeit wie die Standardkurve gemessen wurden. 7.. Standardkurve Die Ergebnisse in der Packungsbeilage wurden errechnet mittels einer loglog Kurvenanpassung ("spline" mode) aus der bestimmten Radioaktivität (cpm Std cpm ) auf der yachse und den PSA Konzentrationen der Standards auf der xachse (). Andere DatenreduktionsMethoden können zu leicht abweichenden Ergebnissen führen. Totalaktivität: 67 cpm cpm Standards PSA () cpm (n=) B/T (%) Std ,4,55,54 4,56,4 5, cpm Beispiel einer Standardkurve, nicht zur Berechnung benutzen. 7.. Proben Für jede Probe wird der (cpmp Probe cpm )Wert auf der yachse bestimmt und die entsprechende PSAKonzentration auf der x Achse abgelesen. Die erhaltenen Konzentrationen müssen, wenn notwendig, mit dem Verdünnungsfaktor korrigiert werden. 8. QUALITÄTSKONTROLLE Zur Einhaltung der Laborgrundregeln sollten regelmäßig Kontrollproben benutzt werden, um die Qualität der Ergebnisse zu sichern. Diese Proben müssen in genau derselben Weise wie die Assay Proben getestet werden, und die Analyse der Ergebnisse sollte mit angemessenen statistischen Methoden stattfinden. 9. ERWARTETE WERTE Jedes Labor sollte seine eigenen Bezugswerte festlegen für die lokale, gesunde Population, auf Grund des Alters und der möglichen ethnischen und regionalen Verschiedenheiten. Die erhaltenen Ergebnisse sind vor dem Hintergrund der gesamten klinischen Situation des Patienten unter Berücksichtigung seiner klinischen Vorgeschichte, den Ergebnissen anderer Testergebnisse sowie weiteren vorliegenden Informationen zu interpretieren. Die Konzentration des totalen PSA wurde in 46 Seren von gesunden Männern mit diesem Kit bestimmt. Die Durchschnittskonzentration war,77, mit einer Standardabweichung von,76. 95% der Proben zeigten einen totalespsawert niedriger als,8, und 99% der Proben niedriger als 4,. Um die klinische Bedeutung des Kits zu überprüfen, wurden 99 Serumproben von Patienten mit gutartigen Krankheiten (gutartige Hyperplasie oder gutartiger ProstataTumor) und 86 Serumproben von Patienten mit ProstataKrebs getestet. Der optimale Grenzwert, um eine primäre gutartige von einer bösartigen ProstataKrankheit zu unterscheiden, war,, entsprechend einer 9%igen klinischen Spezifität und einer 75,6%igen Sensitivität. Der relative PSAKonzentrationsbereich für Patienten mit ProstataKarzinom oder nichtbösartigen Krankheiten ist in der folgenden Tabelle angegeben: TotalesPSAKonzentration 4 4 > Nichtbösartige Krankheiten 46,5% 4,4%,% ProstataKarzinom 7% 7,4% 75,6%. SPEZIFISCHE LEISTUNGSMERKMALE für weitere Details, siehe die beilage Appendix.. Analytische Sensitivität:, ng PSA/mL... Spezifität Die in diesem Immunassay verwendeten Antikörper zeigen keine Kreuzreaktionen mit HumanCEA, AFP, Prolaktin und hcg. Die Kreuzreaktion gegen PAP lag bei,5%... Präzision... IntraAssay Serumproben aus derselben Serie wurden mal getestet. Der Variationskoeffizient war jeweils niedriger oder gleich 7,%.... InterAssay Serumproben aus verschiedenen Serien wurden als Doppelbestimmungen getestet. Der Variationskoeffizient war jeweils niedriger oder gleich 6,%..4. Genauigkeit.4.. Verdünnungstest Drei Serumproben wurden mit Nullstandard verdünnt und getestet. Die erhaltene Wiederfindung lag zwischen 88% und 7%..4.. Wiederfindungstest Verschiedene PSAMengen wurden mit vier Serumproben vermischt und getestet. Die erhaltene Wiederfindung lag zwischen 75% und %.. GRENZEN DES VERFAHRENS Proben, die eine Konzentration über den letzten Standard haben (insbesondere Proben von Patienten mit ProstataKarzinom zusammen mit Knochenmetastasen), sollten mit Nullstandard verdünnt werden. Die erzielten Ergebnisse sollten dann mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert werden. 6

7 Strada per Crescentino 4 Saluggia (Vercelli) Italy Tel Fax PSA totale IRMA R4 KIT IMMUNORADIOMETRICO PER LA DETERMINAZIONE QUANTITATIVA DELL ANTIGENE PROSTATASPECIFICO (PSA) TOTALE IN SIERO E PLASMA UMANI. PRINCIPIO DEL METODO Il dosaggio dell antigene prostataspecifico (PSA) è un metodo immunoradiometrico tipo "sandwich". Nel kit sono utilizzati anticorpi monoclonali da topo, diretti contro due differenti epitopi del PSA e, quindi, non in competizione fra loro. I campioni di siero o plasma, i controlli e gli standard vengono incubati in provette sensibilizzate con il primo anticorpo monoclonale in presenza del secondo anticorpo monoclonale, marcato con 5 I. Al termine dell incubazione le provette vengono aspirate per rimuovere l anticorpo marcato con 5 I non legato. La radioattività legata viene quindi misurata con un contatore gamma. Le concentrazioni di PSA nei campioni vengono ricavate per interpolazione dalla curva standard. La concentrazione di PSA totale nei campioni è direttamente proporzionale alla radioattività.. CONTENUTO DEL KIT I reattivi, conservati a 8 C, sono stabili fino alla data di scadenza riportata sul kit. Le modalità di conservazione dei reattivi dopo ricostituzione o diluizione sono riportate nel paragrafo Metodo del dosaggio... Provette sensibilizzate con anticorpo monoclonale anti PSA: x 5 provette (pronte per l uso). Ogni tubo va usato solo una volta... Anticorpo monoclonale antipsa 5 I: un flacone ( ml) (pronto per l uso) Il flacone contiene 58 kbq, alla data di marcatura, di anticorpi marcati con 5 I in tampone con albumina sierica bovina, sodio azide (<,%; vedi Precauzioni) e un colorante... Standard: cinque flaconi (,8 ml) e un flacone ( ml) di standard zero (pronti per l uso) I flaconi contengono PSA umano in tampone con albumina sierica bovina e sodio azide (<,%; vedi Precauzioni), a concentrazioni comprese tra e. L esatta concentrazione degli standard è riportata sulle etichette dei flaconi..4. Sieri di controllo: due flaconi (liofilizzati) I flaconi contengono PSA umano liofilizzato in siero bovino e sodio azide (<,%; vedi Precauzioni). Il volume di ricostituzione è indicato sull etichetta dei flaconi. L intervallo dei valori attesi dopo la ricostituzione è riportato sul foglio del controllo di qualità..5. Soluzione di lavaggio (5x): un flacone ( ml) Soluzione concentrata da diluire prima dell uso. Nota: Le temperature di conservazione e le date di scadenza riportate sulle etichette di ciascun flacone si riferiscono alla conservazione dei reattivi stabilita in produzione, prima del loro inserimento nel kit. Non tenerne conto.. MATERIALE RICHIESTO MA NON FORNITO Oltre alla normale attrezzatura da laboratorio, è richiesto il materiale seguente: micropipette di precisione ( µl). pipette semiautomatiche ( ml). agitatore tipo Vortex. agitatore oscillante per provette. sistema di aspirazione. contatore gamma programmato per leggere 5 I. 4. PRECAUZIONI 4.. Considerazioni generali Prima dell uso lasciar equilibrare i reattivi a temperatura ambiente. Non utilizzare reattivi di lotti diversi. Inserire la curva standard in ogni esperimento. Per ottenere una migliore riproducibilità è necessario programmare correttamente l agitatore oscillante. Eseguire il dosaggio in duplicato. 4.. Norme di radioprotezione L acquisto, la detenzione, l utilizzo e il trasporto di materiale radioattivo sono soggetti a regolamentazione locale. Lo scrupoloso rispetto delle norme per l uso di sostanze radioattive fornisce una protezione adeguata agli utilizzatori: Nei luoghi dove si usano sostanze radioattive non è consentito consumare cibi o bevande, fumare o usare cosmetici. Non pipettare materiale radioattivo con pipette a bocca. Usare sempre guanti e camici da laboratorio quando si manipola materiale radioattivo. Le sostanze radioattive devono essere conservate in propri contenitori in appositi locali che devono essere interdetti alle persone non autorizzate. Deve essere tenuto un registro di carico e scarico del materiale radioattivo. Il materiale di laboratorio e la vetreria devono essere dedicati all uso di isotopi specifici per evitare crosscontaminazioni. In caso di contaminazione o dispersione di materiale radioattivo, fare riferimento alle norme locali di radioprotezione. I rifiuti radioattivi devono essere smaltiti secondo le norme locali di radioprotezione. 4.. Sodio azide Alcuni reattivi contengono sodio azide come conservante, che può reagire con piombo, rame o ottone presenti nelle tubature di scarico per formare metalloazidi esplosive. Smaltire questi reattivi facendo scorrere abbondante acqua negli scarichi Siero umano Alcuni reattivi presenti nel kit sono di origine umana e si sono rivelati negativi per antihiv e HIV, antihcv e antigene di superficie del virus dell epatite B (HBsAg). Questi reattivi devono essere manipolati come in grado di trasmettere malattie infettive. Non sono disponibili metodi in grado di offrire la certezza assoluta che questi o altri agenti infettivi siano assenti. Manipolare questi reattivi come potenziali fonti di infezioni. Manipolare tutti i campioni di sangue come potenziali fonti di infezioni. (Ad es. epatite o AIDS). I rifiuti devono essere smaltiti secondo le disposizioni legislative e la regolamentazione vigente in ciascun Paese. 5. RACCOLTA, MANIPOLAZIONE, CONSERVAZIONE E DILUI ZIONE DEI CAMPIONI Raccogliere i campioni in provette senza anticoagulante o con eparina, EDTA o sodio citrato. Separare per centrifugazione il siero o il plasma dalla parte corpuscolata. I campioni di siero o di plasma possono essere conservati fino a 4 ore a 8 C o, suddivisi in aliquote, a C o a temperature inferiori per periodi più lunghi. Evitare ripetuti cicli di congelamentoscongelamento dei campioni. Lo scongelamento deve avvenire a temperatura ambiente. 7

8 Diluire con standard zero i campioni con concentrazioni di PSA superiori a quelle dell ultimo standard (in particolare campioni di pazienti con carcinoma della prostata accompagnato da metastasi ossee). 6. METODO DEL DOSAGGIO 6.. Preparazione e conservazione dei reattivi Portare i reattivi a temperatura ambiente Ricostituzione dei sieri di controllo Ricostituire il contenuto dei flaconi con il volume di acqua distillata riportato sull etichetta di ciascun flacone. Lasciar riposare per almeno minuti e mescolare con delicatezza per evitare la formazione di schiuma prima di pipettare. Conservare le soluzioni ricostituite a < 8 C fino alla scadenza del kit Preparazione della soluzione di lavaggio Diluire il contenuto del flacone con 5 ml di acqua distillata e agitare con cura. La soluzione diluita è stabile a 8 C fino alla data di scadenza del kit. 6.. Schema del dosaggio Fase Dispensazione * Aggiungere in successione alle provette sensibilizzate: µl di standard, controlli o campioni µl di marcato Fase Incubazione Incubare ore a 85 C in agitazione (> 8 rpm) Fase Conteggio Aspirare con cura il contenuto delle provette (eccetto le provette per l attività totale) Lavare volte con ml di soluzione di lavaggio Agitare Contare la radioattività legata (B) e l attività totale (T) per un minuto * Aggiungere µl di marcato a provette non sensibilizzate per la determinazione dell attività totale. 7. RISULTATI Le concentrazioni di PSA vengono calcolate per interpolazione sulla curva standard. Campioni e controlli devono essere dosati insieme agli standard. 7.. Curva standard I risultati contenuti nelle istruzioni sono stati calcolati utilizzando una curva logaritmicalogaritmica (modo "spline") con la radioattività determinata (cpm std cpm std ) sull asse verticale (asse delle ordinate) e la concentrazione di PSA degli standard sull asse orizzontale (asse delle ascisse) (). Altri metodi di interpolazione dei risultati possono dare risultati leggermente diversi. Attività totale: 67 cpm PSA cpm Standard cpm (n=) B/T (%) std 4 5 () ,4,55,54 4,56,4 5, cpm std Esempio di curva standard. Non usare per calcolare il valore dei propri campioni. 7.. Campioni Per ogni campione o controllo, riportare il valore (cpm camp cpm std ) sull asse delle ordinate e leggere le concentrazioni di PSA in sull asse delle ascisse. La concentrazione dei campioni diluiti deve essere corretta per il fattore di diluizione. 8. CONTROLLO DI QUALITÀ Si consiglia ad ogni laboratorio di dosare regolarmente sieri di controllo per verificare la qualità dei risultati ottenuti. Questi campioni devono essere manipolati esattamente come i campioni in esame; i risultati devono essere analizzati con metodi statistici appropriati. 9. VALORI ATTESI Ogni laboratorio deve stabilire i propri valori di riferimento per la popolazione locale normale, sulla base dell età e delle potenziali differenze etniche e regionali. I risultati devono essere valutati alla luce dei dati clinici del paziente inclusa la sua storia clinica, risultati di altri test e altre informazioni correlate. La concentrazione di PSA totale in 46 sieri di uomini sani è stata determinata utilizzando questo kit. La concentrazione media è risultata di,77 con una deviazione standard di,76. Il 95% dei campioni ha presentato un valore di PSA totale inferiore a,8 e il 99% dei campioni inferiore a 4,. Per valutare l utilità clinica di questo kit, sono stati analizzati 99 sieri di pazienti con patologie benigne (iperplasia benigna e tumore benigno della prostata) e 86 sieri di pazienti con cancro della prostata. Il valore soglia ottimale per distinguere tra una patologia primaria benigna e maligna della prostata è di,, corrispondente ad una specificità clinica del 9% e ad una sensibilità clinica del 75,6%. La distribuzione relativa delle concentrazioni di PSA in pazienti con carcinoma della prostata e pazienti con patologie non maligne è illustrata nella seguente tabella. Concentrazione di PSA totale 4 4 > Incidenza di patologie non 46,5% 4,4%,% maligne Incidenza di carcinoma della prostata 7% 7,4% 75,6%. CARATTERISTICHE DEL DOSAGGIO Ulteriori dati sono riportati in Appendice... Sensibilità analitica:, ng PSA/mL... Specificità Gli anticorpi utilizzati nel kit non presentano reazioni crociate con CEA, AFP, prolattina e hcg umani. La reazione crociata con la PAP è dello,5%... Precisione... Intrasaggio Alcuni campioni sono stati analizzati volte in uno stesso esperimento; è stato trovato un coefficiente di variazione dell 7,% o inferiore.... Intersaggio Alcuni campioni sono stati analizzati in duplicato in esperimenti differenti; è stato trovato un coefficiente di variazione del 6,% o inferiore..4. Accuratezza.4.. Test di diluizione Tre campioni di siero sono stati diluiti con lo standard zero e analizzati. Le percentuali di recupero sono comprese tra 88% e 7%..4.. Test di recupero Quattro campioni di siero sono stati analizzati dopo aver aggiunto varie quantità di PSA. Le percentuali di recupero ottenute sono comprese tra 75% e %.. LIMITI DELLA PROCEDURA Si raccomanda di diluire con standard zero i campioni con concentrazioni di PSA superiori a quelle dell ultimo standard (in particolare campioni di pazienti con carcinoma della prostata accompagnato da metastasi ossee). I risultati ottenuti devono quindi essere moltiplicati per il fattore di diluizione. 8

9 Strada per Crescentino 4 Saluggia (Vercelli) Italy Tel Fax PSA total IRMA R4 ANÁLISIS INMUNORADIOMÉTRICO PARA LA DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DEL ANTÍGENO TOTAL ESPECÍFICO DE LA PRÓSTATA (PSA) EN SUERO HUMANO Y PLASMA HUMANOS. PRINCIPIO DEL ENSAYO La determinación del antígeno específico de la próstata (PSA) es un análisis de tipo sándwich. En el equipo, se utilizan dos anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos contra dos epitopes diferentes del PSA no competitivos entre sí. Los estándares, las muestras de suero, plasma y los controles se incuban en tubos recubiertos con el primer anticuerpo monoclonal en presencia del segundo anticuerpo monoclonal, específico para el PSA el cual está marcado con I 5. Después de la incubación se aspira el contenido de los tubos y estos se lavan para retirar el anticuerpo marcado con I 5 pero no enlazado. Se determina la actividad enlazada mediante un contador gamma. La concentración de PSA en las muestras se obtiene por interpolación a partir de una curva estándar y es directamente proporcional a la radiactividad medida.. REACTIVOS PROPORCIONADOS Todos los reactivos son estables entre y 8 C hasta la fecha de caducidad del equipo indicada en las etiquetas. Las condiciones de almacenamiento de los reactivos después de la reconstitución o dilución se indican en el inciso Procedimiento del Análisis... Tubos recubiertos con anticuerpo antipsa: x 5 tubos (listos para su uso). Cada tubo debe estar utilizado solamente una vez... Anticuerpo monoclonal antipsa marcado con 5 I: un frasco de ml (listo para su uso) El frasco contiene 58 kbq, en la fecha de fabricación, de inmunoglobulinas marcadas con I 5 en tampón con albúmina sérica bovina, azida de sodio (<,%, véase el inciso sobre las precauciones), y un colorante... Estándares: cinco frascos de,8 ml + frasco de estándar cero de ml (listos para su uso) Los frascos de los estándares contienen de a de PSA humano en albúmina sérica bovina y azida de sodio (<,%, véase el inciso sobre las precauciones). La concentración exacta se indica en la etiqueta de los frascos..4. Controles: dos frascos (liofilizados) Los frascos contienen PSA humano liofilizado en suero bovino y azida de sodio (<,%, véase el inciso sobre las precauciones). El volumen para la reconstitución se indica en la etiqueta. La concentración después de la reconstitución se indica en la hoja suplemento..5. Solución de lavado (5x): un frasco de ml La solución de lavado debe diluirse antes de su uso. Nota: La fecha de caducidad y la temperatura impresa en las etiquetas de los reactivos son válidas sólo para el fabricante, durante su almacenamiento a largo plazo hasta antes de ser ensamblados. No tomar en cuenta.. MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO Además del equipo normal de laboratorio se requiere lo siguiente: micropipetas de precisión ( µl). pipetas semiautomáticas ( ml). mezclador tipo vórtex. mezclador horizontal u orbital. sistema de aspiración. contador gamma calibrado para I PRECAUCIONES 4.. Generales Permitir que los reactivos alcancen la temperatura ambiente antes de su uso. No mezclar los reactivos de lotes diferentes. Incluir una curva estándar en cada ensayo. La calibración correcta del agitador es muy importante para la reproducibilidad del análisis. Se recomienda realizar el ensayo por duplicado. 4.. Seguridad radiológica La compra, posesión, uso y transferencia de material radiactivo están sujetos a las disposiciones legales del país en el que se utiliza. El cumplimiento de las normas básicas de seguridad radiológica proporciona protección adecuada. No se debe comer, beber, fumar o aplicarse cosméticos en presencia de materiales radiactivos. No pipetear las soluciones radiactivas con la boca. Evitar cualquier contacto con materiales radiactivos mediante el uso de guantes y bata de laboratorio. Toda manipulación de material radiactivo debe realizarse en el lugar adecuado, alejado de corredores y espacios ocupados. Los materiales radiactivos deben almacenarse en el contenedor aprobado en una zona especializada. Se debe llevar y conservar actualizado un registro de las entradas y almacenamiento de todos los productos radiactivos. El equipo y la vidriería de laboratorio que son objeto de contaminación se deben separar para evitar la contaminación con otros radioisótopos. Cada caso de contaminación radiactiva o de pérdida de materiales radiactivos se debe resolver de acuerdo con los procedimientos establecidos.` El desecho radiactivo debe manipularse de acuerdo a las reglas establecidas por el país donde se utiliza. 4.. Azida de sodio Algunos reactivos contienen azida de sodio como conservador. La azida de sodio puede reaccionar con el plomo, el cobre y el bronce para formar azidas metálicas explosivas. Deseche los reactivos a través del sistema de drenaje mediante lavado con grandes cantidades de agua Suero humano Ciertos reactivos de este equipo son de origen humano y fueron negativos a las pruebas de HIV, de HIV, de HCV, así como de hepatitis B (HBs Ag). Sin embargo, deben manejarse como si fueran capaces de transmitir enfermedades. Ninguna prueba conocida puede ofrecer la seguridad completa de la ausencia de agentes virulentos. Maneje estos reactivos con todas las precauciones necesarias. Todas las muestras de sangre deben manejarse como si fueran capaces de transmitir enfermedades (por ej. hepatitis o SIDA). Por lo tanto los residuos se deberán eliminar de acuerdo con las reglamentaciones de las agencias autorizadas que tengan jurisdicción sobre el laboratorio, y con las normativas de cada país. 5. COLECCIÓN, PROCESAMIENTO, ALMACENAMIENTO Y DILUCIÓN DE LAS MUESTRAS Colectar la sangre en tubos secos o bien que contengan heparina, EDTA o citrato de sodio. Separar el suero o el plasma de las células mediante centrifugación. Si el análisis habrá de realizarse dentro de las 4 horas