οξείας µυελογενούς λευχαιµίας»

Transcript

1 ΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥ ΩΝ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Kακοσαίου Αικατερίνη, Α.Μ Βιολόγος «Γονίδια αποτοξικοποίησης στη διερεύνηση της προδιάθεσης της οξείας µυελογενούς λευχαιµίας» Επιβλέπων : Π. Κόλλια, Επίκουρη Καθηγήτρια Τοµέα Γενετικής & Βιοτεχνολογίας, Τµήµα Βιολογίας Πανεπιστηµίου Αθηνών Επιστ. Υπεύθυνη : Κ. Μανωλά, Βιολόγος-Κυτταρογενετίστρια Ερευνήτρια Β Βαθµίδας, Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «ηµόκριτος» ΑΘΗΝΑ Σεπτέµβριος 2013

2 ΙΑΤΜΗΜΑΤΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΙ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ Κακοσαίου Αικατερίνη, Α.Μ Βιολόγος «Γονίδια αποτοξικοποίησης στη διερεύνηση της προδιάθεσης της οξείας µυελογενούς λευχαιµίας» Τριµελής Επιτροπή Π. Κόλλια, Επίκουρη Καθηγήτρια Τοµέα Γενετικής & Βιοτεχνολογίας, Τµήµα Βιολογίας Πανεπιστηµίου Αθηνών (Επιβλέπων) Β. Αλεπόρου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Τοµέα Γενετικής & Βιοτεχνολογίας, Τµήµα Βιολογίας Πανεπιστηµίου Αθηνών Κ. Μανωλά, Βιολόγος-Κυτταρογενετίστρια Ερευνήτρια Β βαθµίδας, Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «ηµόκριτος» (Επιστ. Υπεύθυνη) ΑΘΗΝΑ, Σεπτέµβριος

3 Τόπος διεξαγωγής της εργασίας Η παρούσα διπλωµατική εργασία πραγµατοποιήθηκε στα πλαίσια του διετούς διατµηµατικού Προγράµµατος Μεταπτυχιακών Σπουδών «Εφαρµογές της Βιολογίας στην Ιατρική» του τµήµατος Βιολογίας του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστηµίου Αθηνών και της Ιατρικής Σχολής. Εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Υγειοφυσικής, Ραδιοβιολογίας και Κυτταρογεννετικής (ΙΠΡΕΤΕΑ), του Εθνικού Κέντρου Έρευνας Φυσικών Επιστηµών «ΗΜΟΚΡΙΤΟΣ», το διάστηµα Σεπτέµβρης Σεπτέµβρης 2013, υπό την εποπτεία της ρ. Μανωλά Καλλιόπη, Ερευνήτρια Β Βαθµίδας και της ρ. Κόλλια Παναγούλα, Επίκουρη Καθηγήτρια Παν. Αθηνών. 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Πρόλογος Πίνακας Συντµήσεων Α. Εισαγωγή Α1. Λευχαιµίες Α2. Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία...8 Α2.1 Πρωτοπαθής και ευτεροπαθής Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία..9 Α2.2 Επιδηµιολογία Α2.3 Αιτιολογία Α2.4 Παθογένεση Α2.5 Κλινική εικόνα Α2.6 ιάγνωση...14 Α3. Κυτταρογενετική Α3.1 Κλασική Κυτταρογενετική Α3.1.1 Καρυότυπος Α3.2 Μοριακή Κυτταρογενετική Α3.3 Κυτταρογενετικά ευρήµατα στην ΟΜΛ Α4. Ταξινόµηση της Οξείας Μυελογενούς Λευχαιµίας...29 Α4.1 Ταξινόµηση κατά FAB...29 A4.2 Tαξινόµηση κατά WHO...30 A5. H συµβολή της Κυτταρογενετικής στην ΟΜΛ Α6. Πρόγνωση και Εξέλιξη της νόσου...34 Α7. To γενετικό υπόβαθρο της ΟΜΛ...36 Α7.1 Μοριακές αλλαγές στην ΟΜΛ.37 Α7.2 Συχνότερες µεταλλάξεις στην ΟΜΛ 39 Α7.2.1 FLT A7.2.2 NPM A7.2.3 CEBPA...40 A7.2.3 MLL...40 A8. Γενετική προδιάθεση και ανάπτυξη ΟΜΛ...41 A9 Μηχανισµοί αποτοξικοποίησης τοξικών παραγόντων..42 Α9.1 Γονίδια CYP και ΟΜΛ....45

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Α10. Σκοπός της εργασίας...49 Β Υλικά και Μέθοδοι...50 Β1 Υλικά Β2. Οργανολογικός Εξοπλισµός Β3. Αντιδραστήρια και ιαλύµατα. 52 Β4. Μέθοδοι...53 Β4.1 Κλασσική Κυτταρογενετική Καρυότυπος.. 54 Β4.1.1 Παραλαβή και καλλιέργεια κυττάρων.. 54 Β4.1.2 Συλλογή και µονιµοποίηση κυττάρων Β4.1.3 Προετοιµασία των χρωµοσωµατικών παρασκευασµάτων. 55 Β4.1.4 Ζωνοποίηση χρωµοσωµάτων: µέθοδος GTG..56 Β4.1.5 Μικροσκοπική παρατήρηση και καρυοτυπική ανάλυση.56 Β4.2 Μελέτη του πολυµορφισµού A785G του γονιδίου CYP2B Β4.2.1 Αποµόνωση γενωµικού DNA..58 Β4.2.2 Γονοτυπική ανάλυση του πολυµορφισµού A785G µε PCR- RFLPs..58 Β4.2.3 Γονοτυπική ανάλυση του πολυµορφισµού A785G µε Real- Time PCR...61 Β4.2.4 Στατιστική επεξεργασία των γονοτυπικών αποτελεσµάτων...64 Γ Αποτελέσµατα...66 Γ1. Κλασσική κυτταρογενετική ανάλυση ασθενών µε OMΛ...67 Γ2. Μελέτη του πολυµορφισµού A785G του γονιδίου CYP2B6..70 Γ2.1 Γονοτυπική ανάλυση οµάδας ελέγχου (control group)..70 Γ2.2 Γονοτυπική ανάλυση ασθενών µε OMΛ (case group)..71 Γ2.3 Σύγκριση συχνοτήτων γονοτύπων και αλληλοµόρφων ασθενών- µαρτύρων.. 73 Γ2.4 Συσχετισµός γονοτύπων και αλληλοµόρφων µε τα χαρακτηριστικά των ασθενών και τον καρυότυπο Γ2.4.1 Συσχετισµός γονοτύπων και αλληλοµόρφων µε το φύλο 75 Γ2.4.2 Συσχετισµός γονοτύπων και αλληλοµόρφων µε την ηλικία.76 Γ2.4.3 Συσχετισµός γονοτύπων και αλληλοµόρφων µε τον καρυότυπο...78 Συζήτηση Κλασσική κυτταρογενετική ανάλυση ασθενών µε ΟΜΛ... 80

6 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 2 Ο πολυµορφισµός A785G του γονιδίου CYP2B6 στην προδιάθεση εκδήλωσης OMΛ Κατανοµή γονοτύπων CYP2B6 στην οµάδα των υγιών δοτών (control group) Κατανοµή γονοτύπων CYP2B6 στην οµάδα των ασθενών µε ΟΜΛ (case group) Ο πιθανός ρόλος του πολυµορφισµού A785G του γονιδίου CYP2B6 στην προδιάθεση εκδήλωσης ΟΜΛ Συσχετισµός του πολυµορφισµού A785G του γονιδίου CYP2B6 µε το φύλο, την ηλικία διάγνωσης και τις κυτταρογενετικές αλλοιώσεις Γενικά συµπεράσµατα Ε Περίληψη..88 ΣΤ Βιβλιογραφία.. 94

7 ΠΡΟΛΟΓΟΣ ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η παρούσα διπλωµατική εργασία έγινε στα πλαίσια του διατµηµατικού Μ..Ε. «Εφαρµογές της Βιολογίας στην Ιατρική» του Τµήµατος Βιολογίας και της Ιατρικής Σχολής του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστηµίου Αθηνών. Εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Υγειοφυσικής, Ραδιοβιολογίας και Κυτταρογεννετικής, ΙΠΡΕΤΕΑ, του Εθνικού Κέντρου Έρευνας Φυσικών Επιστηµών «ΗΜΟΚΡΙΤΟΣ», υπό την εποπτεία της βιολόγου-κυτταρογενετίστριας ρ.καλλιόπης Μανωλά (Ερευνήτρια Β ) κατά το ακαδηµαϊκό έτος Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω τον ιευθυντή του µεταπτυχιακού καθηγητή Σταύρο Χαµόδρακα για την δυνατότητα που µου προσέφερε να συµµετάσχω στο συγκεκριµένο πρόγραµµα, την ρ. Παναγούλα Κόλλια, Επίκουρη καθηγήτρια του τµήµατος Βιολογίας του Πανεπιστηµίου Αθήνας, επιβλέπουσα της διπλωµατικής µου καθώς και την ρ. Β. Αλεπόρου Αναπληρώτρια καθηγήτρια του τµήµατος Βιολογίας του Πανεπιστηµίου Αθηνών και µέλος της τριµελούς επιτροπής της διπλωµατικής µου. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως την ρ. Καλλιόπη Μανωλά για την ευκαιρία που µου έδωσε να εκπονήσω τη διπλωµατική µου εργασία στο τµήµα Κυτταρογενετικής καθώς και για την εµπιστοσύνη που έδειξε στο πρόσωπο µου. Να την ευχαριστήσω για την υπόδειξη του θέµατος, τη καθοδήγηση και την πολύτιµη βοήθεια που µου προσέφερε στην κατανόηση του θεωρητικού και την διεκπεραίωση του πρακτικού µέρους της εργασίας, όσο και τη συγγραφή της παρούσας διπλωµατικής. Θα ήθελα να ευχαριστήσω ιδιαιτέρως τη συνάδελφο Αγγελική αράκη, υποψήφια διδάκτωρ του τµήµατος Βιολογίας του Πανεπιστηµίου Αθηνών, για την καταλυτική βοήθειά της στη εκµάθηση των τεχνικών που χρησιµοποιήθηκαν και τη διεξαγωγή του πειραµατικού µέρους της διπλωµατικής µου εργασίας, η οποία αποτελεί µέρος της διδακτορικής διατριβής της. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω τη συνάδελφο Σοφία Ζαχάκη, υποψήφια διδάκτωρ της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστηµίου Αθηνών για την αµέριστη συµπαράστασή της καθ όλη τη διάρκεια των µεταπτυχιακών µου σπουδών καθώς και τη συµφοιτήτριά µου Φαίδρα Ροσµαράκη για τις σηµαντικές συζητήσεις και την ηθική συµπαράστασή της καθ όλη τη διάρκεια των µεταπτυχιακών µου σπουδών. 4

8 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Θα ήταν παράλειψη να µην ευχαριστήσω τον διευθυντή του εργαστηρίου ρ. Γαβριήλ Παντελιά καθώς και την ρ. Κωνσταντίνα Σαµπάνη για την φιλοξενία τους στο εργαστήριο. Τέλος, ένα µεγάλο ευχαριστώ στην οικογένεια και τους φίλους µου για την αµέριστη συµπαράσταση, την στήριξη και την κατανόηση που µου δείχνουν. 5

9 ΠΙΝΑΚΑΣ ΣΥΝΤΜΗΣΕΩΝ Πίνακας Συντµήσεων Σύντµηση Αγγλικός Όρος Μεταφρασµένος Αγγλικός Όρος AML Acute Myelocytic Leukemia Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία, ΟΜΛ BM Bone Marrow Μυελός των οστών cdna συµπληρωµατικό Complementary Deoxiribonucleic acid δε(σ)οξυριβο(ζο)νουκλεϊ(νι)κό οξύ CYP Cytochrome P450 Κυττόχρωµα Ρ450 DNA Deoxiribonucleic acid δε(σ)οξυριβο(ζο)νουκλεϊ(νι)κό οξύ FAB French American British system Γαλλο-Αµερικανο-Βρετανικό σύστηµα FISH Fluorescence in-situ hybridazition Φθορίζων in-situ υβριδισµός Γενωµικό δε(σ)οξυριβο(ζο)νουκλεϊ(νι)κό genomic Deoxiribonucleic Acid gdna οξύ GSTs Glutathione S-Transferases S-τρανφεράσες της γλουταθειόνης GTG G-banding-Trypsin-Giemsa Μέθοδος ζωνοποίησης Giemsa/Θρυψίνης ISCN International System for Human Cytogenetic Nomenclature ιεθνές Σύστηµα για την ανθρώπινη κυτταρογενετική ονοµατολογία MDS Myelodysplastic Syndrome Μυελοδυσπλαστικό Σύνδροµο, Μ Σ MPS Myeloproliferative Syndromes Μυελοϋπερπλαστικά Σύνδροµα PB Peripheral Blood Περιφερικό αίµα PCR Polymerase chain Reaction Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης RAEB Refactory Anemia with excess blasts Ανθεκτική αναιµία µε δακτυλιοειδείς σιδηροβλάστες RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Πολυµορφισµός Μήκους Θραύσµατος εκ Περιορισµού Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυµεράσης Real-Time Polymerase Chain Reaction RT-PCR Πραγµατικού Χρόνου SNP Single Nucleotide Polymorphism Μονονουκλεοτιδικός Πολυµορφισµός STRs Short Tandem Repeats Μικρές εν σειρά επαναλήψεις Treatment-related Acute Myelocytic Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία µετά από t-aml Leukemia χηµειο/ακτινο-θεραπεία Tm Melting temperature Θερµοκρασία αποδιάταξης U.V. Ultra Violet Υπεριώδης ακτινοβολία WHO World Health Organization Παγκόσµιος Οργανισµός Υγείας, ΠΟΥ 6

10 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α ΕΙΣΑΓΩΓΗ 7

11 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α1 ΛΕΥΧΑΙΜΙΕΣ Η λευχαιµίες είναι το σύνολο των κακοήθων ασθενειών που επηρεάζουν το αίµα, το µυελό των οστών και το λεµφικό σύστηµα, οι οποίες είναι γνωστές και ως νεοπλασίες του αίµατος. Οι λευχαιµίες ανάλογα µε την κλινική τους πορεία και την παθολογική τους εικόνα διακρίνονται σε οξείες και χρόνιες. Οι οξείες χαρακτηρίζονται από ραγδαία αύξηση άωρων λευχαιµικών κυττάρων µε βαρύτερη πρόγνωση, ενώ οι χρόνιες χαρακτηρίζονται από συσσώρευση σχετικά διαφοροποιηµένων ώριµων κυττάρων µε βραδεία εξέλιξη και καλύτερη πρόγνωση. Επιπλέον, οι τύποι της ασθένειας υποδιαιρούνται σύµφωνα µε ποιο είδος λευκού αιµοσφαιρίου επηρεάζεται. Έτσι διαχωρίζεται η λευχαιµία σε λεµφοβλαστική ή λεµφοκυτταρική, και στη µυελοβλαστική ή µυελογενή (Bennett et al., 2004). Συνδυάζοντας τις παραπάνω ταξινοµήσεις, διακρίνονται τέσσερις βασικές κατηγορίες λευχαιµιών που παρουσιάζονται στον ακόλουθο πίνακα. Πίνακας 1. Κατηγορίες λευχαιµιών Κυτταρικός τύπος Οξεία Χρόνια Λεµφική σειρά Μυελική σειρά Οξεία λεµφοκυτταρική ή λεµφοβλαστική λευχαιµία (ΟΛΛ) Οξεία µυελογενής λευχαιµία (ΟΜΛ) Χρόνια λεµφοκυτταρική ή λεµφοβλαστική λευχαιµία (ΧΛΛ) Χρόνια µυελογενής λευχαιµία (ΧΜΛ) Α2 ΟΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ Η Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία (ΟΜΛ) είναι µία ετερογενής κλωνική διαταραχή των άωρων αιµοποιητικών κυττάρων του µυελού των οστών, τα οποία έχουν χάσει την ικανότητα ρύθµισης της αυτοανανεωτικής τους λειτουργίας και της διαφοροποίησης προς τα ώριµα κύτταρα του αίµατος. H κλινική εκτίµηση, η θεραπεία και η πρόγνωση της ΟΜΛ έχουν αλλάξει δραµατικά τις τελευταίες δύο δεκαετίες. Οι µοριακές, κυτταρογενετικές και ανοσολογικές αναλύσεις έχουν 8

12 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ συνεισφέρει στην κατανόηση της παθογένειας, πρόγνωσης και παρακολούθησης της νόσου. Η φυσική εξέλιξη του νοσήµατος είναι η αντικατάσταση των φυσιολογικών κυττάρων του αιµοποιητικού ιστού από τους απόγονους των λευχαιµικών βλαστών και θάνατος των ασθενών, λόγω των επιπλοκών της έλλειψης των ώριµων αιµοποιητικών κυττάρων, όπως λοιµώξεις, αναιµία και αιµορραγία (Stirewalt et al., 2003). Α2.1 ΠΡΩΤΟΠΑΘΗΣ ΚΑΙ ΕΥΤΕΡΟΠΑΘΗΣ ΟΞΕΙΑ ΜΥΕΛΟΓΕΝΗΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑ Οι οξείες µυελογενείς λευχαιµίες διακρίνονται σε πρωτοπαθείς ή de novo και σε δευτεροπαθείς. Πρωτοπαθής ΟΜΛ παρατηρείται σε ασθενείς οι οποίοι δεν έχουν έρθει σε επαφή µε κάποιο γενοτοξικό παράγοντα καθώς επίσης και ασθενείς που πρωτοδιαγιγνώσκονται ως ΟΜΛ χωρίς προηγούµενο ιστορικό κακόηθης νόσου. Η δευτεροπαθής λευχαιµία είναι µια ανεπαρκώς καθορισµένη έννοια που συνήθως αναφέρεται στην ανάπτυξη της ΟΜΛ µετά από προηγούµενη νόσο, όπως Μ Σ ή χρόνια µυελοϋπερπλαστική διαταραχή ή µετά από θεραπεία, λόγω προηγούµενου καρκίνου, όπως για παράδειγµα καρκίνο του µαστού, µε χηµειοθεραπεία, κυρίως µε αλκυλιωτικούς παράγοντες και αναστολείς της τοποϊσοµεράσης ΙΙ, ή µε ακτινοβολία ή / και ανοσοκατασταλτικά φάρµακα όπως η αζαθειοπρίνη (Estey and Dohner, 2006). Οξεία µυελογενής λευχαιµία αναπτύσσεται επίσης µετά από αυτόλογη µεταµόσχευση αρχέγονων κυττάρων. Ο κίνδυνος ανάπτυξης οξείας λευχαιµίας σε ασθενείς µε λέµφωµα Hodgkin µετά από χηµειοθεραπεία και αυτόλογη µεταµόσχευση κυµαίνεται από 9-18% και καθορίζεται εν µέρη από την ένταση του προπαρασκευαστικού σχήµατος µε αλκυλιωτικούς παράγοντες και τη χορήγηση ή µη ακτινοβολίας. Τέλος πρέπει να αναφερθεί ότι έχουν παρατηρηθεί δευτεροπαθείς οξείες µυελογενείς λευχαιµίες οι οποίες οφείλονται σε έκθεση περιβαλλοντικών ή επαγγελµατικών καρκινογόνων ουσιών, όπως το βενζόλιο (Hederson, 1990). 9

13 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α2.2 EΠΙ ΗΜΙΟΛΟΓΙΑ Η ΟΜΛ αποτελεί το 34% όλων των λευχαιµιών και είναι η πιο συχνή οξεία λευχαιµία στους ενήλικες (85% των περιστατικών), ενώ στην παιδική ηλικία συναντάται πιο σπάνια (15-20% των περιστατικών) (Hematology, 4 th ed., Hederson, 1990). Η µέση ηλικία διάγνωσης είναι τα 64 έτη (Taylor et al., 1995). H συχνότητα της ΟΜΛ υπολογίζεται σε 3,5/ περιστατικά στην ηλικία των 50ετών, 15/ στα 70 και 35/ στην ηλικία των 90ετών. Έχει βρεθεί ότι στην Ευρώπη προκύπτουν κάθε χρόνο περίπου νέα περιστατικά (Smith et al., 2004), ενώ η ΟΜΛ ευθύνεται για το 1,2% των θανάτων από καρκίνο στις ΗΠΑ (Jemal et al., 2002). Eπιπλέον έχει παρατηρηθεί ότι η νόσος είναι πιο συχνή στους άνδρες σε σχέση µε τις γυναίκες, σε αναλογία 3:2 (Estey et al., 2006),ενώ φαίνεται να παρουσιάζει και γεωγραφική κατανοµή. Στους ενήλικες, τα υψηλότερα ποσοστά παρατηρήθηκαν στη Βόρειο Αµερική, Ευρώπη και Ωκεανία και τα µικρότερα στην Ασία και στη Λατινική Αµερική (Linet, 1985). Αν και έχουν περιγραφεί σπάνιες οικογενείς περιπτώσεις ΟΜΛ, φαίνεται ότι στις περισσότερες περιπτώσεις οι λευχαιµογόνες µεταλλάξεις είναι επίκτητες κατά τη διάρκεια της ζωής, παρά κληρονοµικές. Βέβαια υπάρχει η πιθανότητα σποραδικές περιπτώσεις ΟΜΛ να οφείλονται σε προκαθορισµένες βλάβες που συµβαίνουν κατά την εµβρυική ζωή, οι οποίες επιταχύνουν τον ρυθµό απόκτησης νέων µεταλλάξεων (αστάθεια DNA) (Aoki et al., 1992). Α2.3 ΑΙΤΙΟΛΟΓΙΑ Η αιτιολογία της ΟΜΛ δεν είναι πλήρως αποσαφηνισµένη. Επιδηµιολογικές µελέτες, που έγιναν σε διάφορες χώρες, δεν έδωσαν συγκεκριµένες συσχετίσεις, αν και αναφέρεται σε συγγράµµατα ότι βιολογικοί, ακτινοβιολογικοί και χηµικοί παράγοντες µπορεί να ευθύνονται για την ανάπτυξη της νόσου. Στους παράγοντες κινδύνου περιλαµβάνονται ιοί, γενετικές βλάβες όπως σύνδροµο Down, αναιµία Falconi και διάφορα άλλα σύνδροµα (Shimizu et al., 1995), έκθεση σε ιονίζουσα ακτινοβολία, φάρµακα (αλκυλιωτικοί παράγοντες, αναστολείς τοποϊσοµεράσης II) 10

14 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ και επαγγελµατική έκθεση σε τοξικούς παράγοντες (πχ βενζόλιο) (Rewied in WΗΟ, 2001). Μετά την έκρηξη της ατοµικής βόµβας στη Ηisoshima και στο Nagasaki, αυξήθηκαν τα κρούσµατα των ΟΜΛ, ΟΛΛ και ΧΜΛ στους επιζήσαντες. Συγγενείς πρώτου βαθµού ασθενών µε ΟΜΛ, έχουν τριπλάσιο στατιστικό κίνδυνο προσβολής από τη νόσο. Επίσης το κάπνισµα αυξάνει την πιθανότητα εµφάνισης της νόσου στους καπνίζοντες. Παρ όλες αυτές τις συσχετίσεις πρέπει να αναφέρουµε ότι, στην παρούσα φάση, µόνο το 1-2% των διαγεγνωσµένων λευχαιµιών µπορούν να αποδοθούν σε αυτούς τους γονοτοξικούς παράγοντες (Aksou et al., 1978). Προλευχαιµία Προλευχαιµικές διαταραχές στο αίµα, όπως τα µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα (Μ Σ) ή τα µυελοϋπερπλαστικά νοσήµατα µπορεί να εξελιχθούν σε ΟΜΛ. Η ακριβής πιθανότητα εξαρτάται από τον τύπο ΟΜΛ/Μ Σ (Sanz et al., 1989). Έκθεση σε χηµικά Έκθεση σε χηµειοθεραπεία και συγκεκριµένα σε αλκυλιωτικό αντινεοπλασµατικό παράγοντα, µπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο εµφάνισης ΟΜΛ. Ο κίνδυνος είναι µέγιστος περίπου 3-5 χρόνια µετά τη χηµειοθεραπέια (Le Beau et al., 1986). Άλλοι χηµειοθεραπευτικοί παράγοντες, συγκεκριµένα ποδοφιλοτοξίνη και ανθρακυκλίνες, έχουν επίσης συνδεθεί µε την θεραπειοσχετιζόµενη λευχαιµία. Αυτές οι θεραπειοσχετιζόµενες (θεραπειο-επαγώµενες ορθότερα) λευχαιµίες σχετίζονται συχνά µε συγκεκριµένες χρωµοσωµικές ανωµαλίες στα λευχαιµικά κύτταρα (Thirman et al., 1993). Η επαγγελµατική έκθεση σε χηµικές ουσίες όπως βενζόλιο και άλλοι οργανικοί διαλύτες είναι αµφιλεγόµενη ως αιτία πρόκλησης ΟΜΛ. Το βενζόλιο και πολλά παράγωγά του είναι γνωστά καρκινογόνα in vitro. Ενώ κάποιες έρευνες εντοπίζουν συσχέτιση µεταξύ επαγγελµατικής έκθεσης σε βενζόλιο και αυξηµένου κινδύνου εµφάνισης ΟΜΛ κάποιες άλλες προτείνουν το αντίθετο (Austin et al., 1988). 11

15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ακτινοβολία Έκθεση σε ιονίζουσα ακτινοβολία µπορεί να αυξήσει τον κίνδυνο εµφάνισης ΟΜΛ (Linet, 1985). Επιζώντες των ατοµικών βοµβών είχαν αυξηµένα ποσοστά ΟΜΛ (Bizzozero et al., 1966) όπως και οι ακτινολόγοι που εκτέθηκαν σε υψηλά επίπεδα Χ ακτινοβολίας πριν την υιοθέτηση των σύγχρονων µεθόδων ακτινοπροστασίας (Yoshinaga et al., 2004). Γενετική προδιάθεση Αυξηµένος κίνδυνος εµφάνισης ΟΜΛ φαίνεται ότι να υπάρχει λόγω κληρονοµικότητας (Taylor and Birch, 1996). Υπάρχουν, όµως, πολυάριθµες αναφορές πολλαπλών περιπτώσεων ΟΜΛ που αναπτύχθηκαν σε οικογένειες σε ποσοστό υψηλότερο από την προβλεπόµενη πιθανότητα για το κάθε µέλος ατοµικά (Horwitz et al., 1996). Ο κίνδυνος ανάπτυξης ΟΜΛ αυξάνεται στο τριπλάσιο σε συγγενείς πρώτου βαθµού ασθενών µε ΟΜΛ (Gunz and Veale, 1969). Πολλές συγγενείς ανωµαλίες και παθήσεις µπορεί να αυξήσουν τον κίνδυνο εµφάνισης λευχαιµίας, η πιο συνηθισµένη από τις οποίες είναι το Σύνδροµο Down, που συνδέεται µε δεκαπλάσιο έως δεκαοκταπλάσιο κίνδυνο εµφάνισης ΟΜΛ (Evans and Steward, 1972). Α2.4 ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ Οι αιτιολογικοί παράγοντες που αναφέρθηκαν οδηγούν σε χρωµοσωµατικές αλλοιώσεις ή κακοήθεις µεταλλάξεις ενός αρχέγονου αιµοποιητικού κυττάρου (stem cell) ή ενός σχετικά πιο διαφοροποιηµένου άωρου προγονικού κυττάρου του αίµατος. Οι αλλοιώσεις αυτές προσφέρουν στο λευχαιµικό κύτταρο ένα πλεονέκτηµα επιβίωσης και αυτοανανέωσης σε συνδυασµό µε αναστολή της διαφοροποίησης του. Έτσι, προκύπτει ένας λευχαιµικός πληθυσµός που κυριαρχεί και καταστέλλει τους φυσιολογικούς πληθυσµούς των αιµοποιητικών κυττάρων. Ο πληθυσµός αυτός καλείται µονοκλωνικός, γιατί προέρχεται από ένα αρχικό κύτταρο και περιέχει τις γενετικές ανωµαλίες του κυττάρου αυτού. Η αναστολή της ανάπτυξης των φυσιολογικών αιµοποιητικών κυττάρων έχει ως αποτέλεσµα την εµφάνιση αναιµίας, ουδετεροπενίας και θροµβοπενίας. Τα κυριότερα συµπτώµατα, εργαστηριακά 12

16 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ευρήµατα και αίτια θανάτου των ασθενών µε ΟΜΛ οφείλονται στη µεγάλη καταστολή της φυσιολογικής αιµοποίησης (Stirewalt et al., 2003). Α2.5 ΚΛΙΝΙΚΗ ΕΙΚΟΝΑ Η κλινική εικόνα των ασθενών µε ΟΜΛ είναι αποτέλεσµα κυρίως της διήθησης του µυελού των οστών αλλά και άλλων ιστών και οργάνων από τα βλαστικά κύτταρα. Επίσης παρατηρούνται κλινικές εκδηλώσεις λόγω διαταραχής της µικροκυκλοφορίας ή του µηχανισµού πήξεως. Η διήθηση του µυελού των οστών οδηγεί σε αναιµία, ουδετεροπενία και θροµβοπενία. Οι ασθενείς προσέρχονται στο ιατρείο συνήθως επικαλούµενοι αίσθηµα καταβολής, ωχρώτητα, δύσπνοια, κόπωση ή στηθαλγικά ενοχλήµατα, πυρετό, λοιµώξεις αναπνευστικού, δέρµατος κτλ που οφείλονται στην ουδετεροπενία, αλλά και αιµορραγίες εξαιτίας της θροµβοπενίας. Πιο σπάνια ή σε προχωρηµένες καταστάσεις, οι ασθενείς εµφανίζουν σπληνοµεγαλία, αλλά συνήθως είναι µικρού βαθµού, σε αντίθετη περίπτωση η ΟΜΛ είναι συχνά δευτεροπαθής, στα πλαίσια εκτροπής προϋπάρχοντος χρόνιου µυελοϋπερπλαστικού συνδρόµου ή χρόνιας µυελοµονοκυτταρικής λευχαιµίας. Περίπου το 1/3 των ασθενών εµφανίζει ηπατοµεγαλεία ή/και σπληνοµεγαλία (Taylor et al., 1995). Εικόνα 1. Απεικόνιση µυελού των οστών ασθενούς µε οξεία µυελογενή λευχαιµία. Στην οξεία µυελοµονοκυτταρική λευχαιµία είναι επίσης συχνή η διήθηση του δέρµατος, που εκδηλώνεται µε το µορφή ανώδυνων ιωδών πλακών ή οζιδίων ή ως διάχυτη διήθηση. Επίσης, στον τύπο αυτό ΟΛ παρατηρείται πιο συχνά και το σύνδροµο της λευκόστασης, σε ασθενείς µε αυξηµένο αριθµό λευκών αιµοσφαιρίων. 13

17 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κατά το σύνδροµο αυτό, τα µικρά αγγεία φράσουν από έµβολα βλαστικών κυττάρων ή ρήξεις και επακολουθεί η αιµορραγία τους. Το σύνδροµο αυτό µπορεί να επηρεάσει και το ΚΝΣ (Mauritzson et al., 2002). Α2.6 ΙΑΓΝΩΣΗ Η πρώτη ένδειξη για τη διάγνωση της ΟΜΛ είναι συνήθως ένα µη φυσιολογικό αποτέλεσµα µιας γενικής αίµατος που µπορεί να περιλαµβάνει υπερβολική αύξηση των λευκών αιµοσφαιρίων του αίµατος (λευκοκυττάρωση), µείωση των αιµοπεταλίων, των ερυθρών αιµοσφαιρίων, ή ακόµα και λευκοπενία. Μια πιθανή διάγνωση ΟΜΛ µπορεί να γίνει µε επίχρισµα περιφερικού αίµατος όταν οι λευκοβλάστες κυκλοφορούν στα αγγεία. Η οριστική διάγνωση όµως απαιτεί βιοψία του µυελού των οστών. Εικόνα 2: a) Λήψη περιφερικού αίµατος. b) Λήψη µυελού των οστών για βιοψία Ο µυελός ή το αίµα εξετάζονται µε οπτικό µικροσκόπιο και µε κυτταροµετρία ροής για να διαγνωσθεί η παρουσία λευχαιµίας και να γίνει η διαφοροδιάγνωση της ΟΜΛ από τους άλλους τύπους λευχαιµιών, όπως και για να προσδιοριστεί ο τύπος της. Το δείγµα µυελού ή αίµατος συνήθως ελέγχεται και για χρωµοσωµικές µετατοπίσεις µε µεθόδους κυτταρογενετικής (καρυότυπο) ή/και µοριακής κυτταρογενετικής [FISH (fluorescent in situ hybridization)]. Επίσης, µοριακές αναλύσεις µπορεί να πραγµατοποιηθούν ώστε να προσδιοριστούν συγκεκριµένες µεταλλάξεις σε γονίδια όπως είναι οι µεταλλάξεις στα γονίδια FLT3, nucleophosmin και KIΤ, που µπορεί να επηρεάσουν την πορεία και την κατάληξη της νόσου (Baldus 14

18 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ et al., 2007). Σύµφωνα µε τα κριτήρια της WHO 2008, η διάγνωση της ΟΜΛ γίνεται όταν εντοπίζονται λευχαιµικοί µυελοβλάστες σε περισσότερο από το 20% του αίµατος ή/και του µυελού των οστών µε εξαίρεση τη κατηγορία των ΟΜΛ µε επαναλλαµβανόµενες αλλοιώσεις [πχ. t(15;17), t(8;21), t(16;16)/inv(16)]. Σύµφωνα όµως µε την FAB κατάταξη του Γαλλο-Αµερικανο-Βρετανικού συστήµατος που είναι πιο αυστηρή, για τη διάγνωση της ΟΜΛ απαιτείται ποσοστό βλαστών τουλάχιστον 30% σε µυελό των οστών ή στο περιφερικό αίµα. Η ΟΜΛ πρέπει να διαφοροποιείται προσεκτικά από "προλευχαιµικές" καταστάσεις, όπως είναι τα µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα ή τα µυελοϋπερπλαστικά νοσήµατα, τα οποία αντιµετωπίζονται µε διαφορετική αγωγή (Amin et al., 2005). Α3 ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ Η κυτταρογενετική (Cytogenetics) αποτελεί κλάδο της βιολογίας που µελετά τη σύσταση του γονιδιώµατος των ατόµων σε επίπεδο κυττάρων και χρωµοσωµάτων αποκαλύπτοντας κληρονοµικές ή επίκτητες χρωµοσωµικές αλλοιώσεις. ιακρίνεται σε κλασσική κυτταρογενετική (καρυότυπος), βάση της οποίας αποτελούν οι τεχνικές ζωνοποίησης (banding techniques) των µεταφασικών χρωµοσωµάτων και σε µοριακή κυτταρογενετική, που περιλαµβάνει τις καινοτόµες τεχνικές του in situ φθορίζοντος υβριδισµού (FISH), multicolour FISH, το συγκριτικό υβριδισµό του γονιδιώµατος [Comparative Genomic Hybridization (CGH)] και τέλος τη µέθοδο array-cgh. H Κυτταρογενετική βρίσκει εφαρµογές κυρίως I. Στον προγεννητικό έλεγχο II. Στα προϊόντα αποβολών III. Στο περιφερικό αίµα ατόµων µε δυσµορφίες IV. Σε ζευγάρια µε προβλήµατα αναπαραγωγής V. Στον καρκίνο των στερεών όγκων VI. Στο µυελό των οστών ασθενών µε αιµατολογικές κακοήθειες 15

19 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α3.1 ΚΛΑΣΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ Η κλασική Κυτταρογενετική αποτελεί κλάδο της βιολογίας που µελετά τη σύσταση του γονιδιώµατος σε επίπεδο χρωµοσωµάτων και η οποία µπορεί να αποκαλύψει κληρονοµικές ή επίκτητες χρωµοσωµατικές αλλοιώσεις. Βασικό της πλεονέκτηµα είναι ο ταυτόχρονος έλεγχος όλων των χρωµοσωµάτων, η µελέτη και η ανάλυση των οποίων πραγµατοποιείται είτε σε κύτταρα που πολλαπλασιάζονται από µόνα τους όπως για παράδειγµα τα κύτταρα του µυελού των οστών, είτε σε κύτταρα που έχουν χάσει την ικανότητα να πολλαπλασιάζονται αλλά επάγουµε τη διαίρεση µε µιτογόνα. Χαρακτηριστικό παράδειγµα της δεύτερης οµάδας κυττάρων αποτελούν τα Τ-λεµφοκύτταρα του περιφερικού αίµατος που διεγείρονται µε φυτοαιµατογλουτίνη (PHA) (Taylor και Birch, 1996). Τα χρωµατοσώµατα αναλύονται κυρίως κατά τη µετάφαση ή το προµεταφασικό στάδιο της µίτωσης. Κατά τη διάρκεια αυτών των σταδίων, τα χρωµατοσώµατα διακρίνονται στο µικροσκόπιο διασκορπισµένα και το καθένα από αυτά αποτελείται από δύο χρωµατίδες, που συνδέονται µεταξύ τους στο κεντροµερίδιο. Το κεντροµερίδιο, ή αλλιώς πρωτογενής περίσφιξη, αποτελεί σταθερό σηµείο του χρωµατοσώµατος και το διαιρεί σε δύο βραχίονες, τον µικρό βραχίονα που συµβολίζεται µε το γράµµα p και τον µεγάλο βραχίονα που συµβολίζεται µε το q. Οι πλέον αποµακρυσµένες περιοχές από το κεντροµερίδιο του χρωµοσώµατος ονοµάζονται τελοµερίδια (Thompson και Thompson, 2001)(εικ. 3). Εικόνα 3: Γραφική απεικόνιση χρωµοσώµατος 16

20 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ανάλογα µε τη θέση του κεντροµεριδίου, τα ανθρώπινα χρωµατοσώµατα διακρίνονται σε τέσσερις κατηγορίες: Μετακεντρικά: Το κεντροµερίδιο βρίσκεται στη µέση του χρωµατοσώµατος και οι δύο βραχίονες έχουν περίπου το ίδιο µήκος Υποµετακεντρικά: Το κεντροµερίδιο βρίσκεται σε έκκεντρη θέση και οι δύο βραχίονες έχουν διαφορετικό µήκος Ακροκεντρικά : Το κεντροµερίδιο βρίσκεται στο απώτατο τµήµα του ενός άκρου, ενώ υπάρχει ένας µόνο βραχίονας (Taylor and Birch, 1996). Εικόνα 4: Τύποι χρωµοσωµάτων ανάλογα µε τη θέση του κεντροµεριδίου. Α3.1.1 KAΡΥΟΤΥΠΟΣ Η απεικόνιση των µεταφασικών χρωµοσωµάτων σε ζεύγη οµολόγων χρωµοσωµάτων κατά ελαττούµενο µέγεθος, ανάλογα µε τη θέση του κεντροµεριδίου και το πρότυπο ζώνωσης ονοµάζεται καρυότυπος (εικόνα 5). Για να ταξινοµηθούν τα χρωµοσώµατα, απαιτείται η φωτογράφηση τους µε κάµερα που είναι προσαρµοσµένη στο µικροσκόπιο. Όταν η ταξινόµηση αυτή προκύπτει από σχεδιασµό και όχι φωτογράφηση έχουµε το «ιδεόγραµµα» των χρωµοσωµάτων (εικόνα 6). 17

21 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 5: Φυσιολογικός καρυότυπος θηλυκού ατόµου µε G-ζωνωποίηση Τα χρωµοσώµατα αριθµούνται κατά ζεύγη από το 1 έως το 23, σύµφωνα µε το πρότυπο σύστηµα ονοµατολογίας που προτάθηκε το 1960 στο Denver. Μετά από πρόταση του Patau η οµαδοποίηση των χρωµοσωµάτων βασίστηκε στο µέγεθός τους, στο µοναδικό πρότυπο ζώνωσης τους αλλά και τις ιδιότητες τους, ως εξής: Οµάδα Α: Περιλαµβάνει τα µετακεντρικά χρωµοσώµατα 1 έως 3. Οµάδα Β: Σε αυτήν την οµάδα ανήκουν τα υποµετακεντρικά χρωµοσώµατα 4 και 5. Οµάδα C: Περιλαµβάνει τα χρωµοσώµατα 6 έως και 12, που είναι µεσαίου µεγέθους υποµετακεντρικά χρωµοσώµατα. Οµάδα D: Στην οµάδα D ανήκουν τα ακροκεντρικά χρωµοσώµατα 13 έως και 15 που φέρουν δορυφόρους. Ο µικρός βραχίονάς τους χαρακτηρίζεται από ποικιλοµορφία, ως προς το µέγεθος, την ύπαρξη και το µέγεθος των δορυφόρων. Οµάδα Ε: Περιλαµβάνει τα χρωµοσώµατα 16 έως και 18 που είναι µικρού µεγέθους µετακεντρικά ή υποµετακεντρικά χρωµοσώµατα. 18

22 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Οµάδα F: Αποτελείται από τα µικρού µεγέθους µετακεντρικά χρωµοσώµατα 19 και 20. Οµάδα G: Συνίσταται από τα µικρά ακροκεντρικά χρωµοσώµατα 21 και 22. Τέλος ακολουθούν τα φυλετικά χρωµοσώµατα Χ και Υ. Οι επικρατέστερες τεχνικές ζωνωποίησης που χρησιµοποιούνται σήµερα για τον έλεγχο ολόκληρου του καρυοτύπου είναι οι G ή R µεθόδους. Εικόνα 6: Ιδεόγραµµα ανθρώπινων χρωµοσωµάτων βάση G ζωνωποίησης(ηeim και Mitelman, 2009). 19

23 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ A3.2 ΜΟΡΙΑΚΗ ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗ Τα τελευταία χρόνια, µε την ραγδαία εξέλιξη της µοριακής βιολογίας, αναπτύχθηκαν δυο µέθοδοι µοριακής κυττατογενετικής ο in situ φθορίζον υβριδισµός (FISH) και ο συγκριτικός υβριδισµός του γονιδιώµατος (CGH) (Ηeim και Mitelman, 2009; Popescu και Zimonjic, 1997). In situ φθορίζον υβριδισµός (FISH) Η µέθοδος του in situ φθορίζοντος υβριδισµού (FISH) αποσκοπεί στον υβριδισµό µεταξύ µιας αλληλουχίας «στόχου», δηλαδή της υπό µελέτη χρωµοσωµικής περιοχής, και ενός µοριακού ανιχνευτή (probe) που αντιστοιχεί σε µια συνθετική µονόκλωνη αλληλουχία νουκλεοτιδίων, συµπληρωµατική ως προς την αλληλουχία-στόχο (Ηeim και Mitelman, 2009). Οι εφαρµογές της FISH στην έρευνα Περαιτέρω διερεύνηση των χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων στον καρυότυπο. Ταυτοποίηση χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων σε µεσοφασικούς πυρήνες όταν υπάρχει έλλειψη µεσοφάσεων. Ταυτοποίηση των εµπλεκοµένων σηµείων θραύσης στις µετατοπίσεις. Ταυτοποίηση του κοινού ελλείποντος τµήµατος στις ελλείψεις. Χαρτογράφηση νέων γονιδίων. Ταυτοποίηση πολλαπλασιασµένων γονιδίων. Μελέτη µηχανισµών που διέπουν τη δηµιουργία χρωµοσωµικών ανακατατάξεων. Ταυτοποίηση νέων, µη τυχαίων χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων. Συγκριτικός υβριδισµός του γονιδιώµατος (CGH) Ο συγκριτικός υβριδισµός του γονιδιώµατος (CGH) είναι µια αποτελεσµατική µέθοδος για την ανίχνευση των γονιδιωµατικών τµηµάτων που υπερεκφράζονται ή υποεκφράζονται σε νεοπλασµατικά δείγµατα. Η µέθοδος αυτή βασίζεται στην σύγκριση του υπό µελέτη DNA µε φυσιολογικό DNA µε σκοπό τον προσδιορισµό των αντιγράφων των χρωµοσωµάτων του δείγµατος που µας ενδιαφέρει και τη διάγνωση µερικής ή ολικής ανευπλοειδίας (Ηeim και Mitelman, 2009). Η τεχνική αυτή έχει πλέον αντικατασταθεί σε µεγάλο βαθµό από τη µέθοδο των array CGH, παρέχοντας πολύ υψηλότερη ανάλυση από ότι η απλή metaphase CGH. 20

24 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Χρησιµοποιείται για την ανίχνευση µεταλλαγών προσθήκης ή απώλειας της γονιδωµατικής αλληλουχίας όσο και για την αξιολόγηση των γονιδιωµατικών ανωµαλιών, όπως αλλαγές του αριθµού αντιγράφων ή η απώλεια ετεροζυγωτίας µε µονογονική δισωµία. Σε αντιδιαστολή µε τη συµβατική FISH, η CGH µειονεκτεί στην ανίχνευση ισορροπηµένων αναστροφών, ενθέσεων και µεταθέσεων (Ηeim και Mitelman, 2009).. Α3.3 ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΑ ΕΥΡΗΜΑΤΑ ΣΤΗΝ ΟΜΛ Μη τυχαίες χρωµοσωµικές ανωµαλίες ανευρίσκονται στις περισσότερες περιπτώσεις των ασθενών µε ΟΜΛ και σχετίζονται µε την πρόγνωση της νόσου. Με τη βελτίωση των κυτταρογενετικών τεχνικών βρέθηκε ότι παθολογικός καρυότυπος υπάρχει στο 55-78% των ενηλίκων και στο 79-85% των παιδιών µε ΟΜΛ. Περίπου το 55% των ασθενών αυτών έχει µόνο µία απλή κυτταρογενετική ανωµαλία (το 15-20% έχουν ένα επιπλέον ή ένα λιγότερο χρωµόσωµα), ενώ το 45% φέρει δύο ή περισσότερους τύπους χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων. Οι σύνθετοι καρυότυποι (complex karyotype) χαρακτηρίζονται από την παρουσία τριών τουλάχιστον τυχαίων χρωµοσωµατικών ανωµαλιών απουσία των χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων καλής πρόγνωσης t(8;21), inv(16)/t(16;16), t(15;17), t(9;11), t(6;9), inv(3)/t(3;3) and t(1;22) (Swerdlow SH et al., 2008). Ασθενείς που φέρουν σύνθετους καρυοτύπους παρουσίαζουν κακή πρόγνωση (Οrozco et al., 2012). Πρόσφατες έρευνες αναφέρονται στον όρο µονοσωµικοί καρυότυποι (monosomal karyotype, ΜΚ). Για να χαρακτηριστεί ένας καρυότυπος ως µονοσωµικός (ΜΚ) πρέπει να φέρει δύο τουλάχιστον αυτοσωµικές µονοσωµίες ή µια µονοσωµία συνοδευόµενη από δοµικές ανωµαλίες στις οποίες όµως δεν περιλαµβάνονται οι αλλοιώσεις καλής πρόγνωσης t(15;17), t(8;21), t(16;16)/inv(16). Οι µονοσωµικοί καρυότυποι χαρακτηρίζονται από εξαιρετικά δυσµενή πρόγνωση (Manola et al., 2013;Voutiadou et al., 2013) Οι πιο συχνές χρωµοσωµατικές ανωµαλίες στην ΟΜΛ είναι οι εξής: t(15;17), t(8;21),, τρισωµία 8, -7/del(7q), -5/del(5q), inv(16) και µετατοπίσεις της περιοχής 11q23 (Martens και Stunnenberg, 2010) 21

25 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Γενικά οι χρωµοσωµικές αλλοιώσεις που µπορούν να παρατηρηθούν σε περιπτώσεις ασθενών µε ΟΜΛ χωρίζονται στις παρακάτω κατηγορίες ΟΜΛ µε ισοζυγισµένες χρωµοσωµικές ανωµαλίες. Συνήθως παρατηρούνται αµοιβαίες µεταθέσεις όπως οι t(8;21), t(16;16), t(15;17) ή αναστροφές όπως το inv(16). Για πολλές από αυτές τα εµπλεκόµενα γονίδια έχουν κλωνοποιηθεί και λειτουργικά χαρακτηριστεί. ΟΜΛ µε µη ισοζυγισµένες χρωµοσωµικές ανωµαλίες. Σε αυτές τις περιπτώσεις η βλάβη αφορά επιπρόσθετο χρωµοσωµικό υλικό ή έλλειψη χρωµοσωµικού υλικού. Οι συγκεκριµένες ανωµαλίες δεν έχουν χαρακτηριστεί επαρκώς σε µοριακό επίπεδο. Συνήθως περιλαµβάνονται κυρίως µονοσωµίες και τρισωµίες χρωµοσωµάτων όπως η τρισωµία 8, η µονοσωµία 5 (-5) και 7 (-7), ή ελλείψεις χρωµοσωµικών τµηµάτων, όπως η έλλειψη στο µεγάλο βραχίονα του χρωµοσώµατος 5 [del(5q)] και του χρωµοσώµατος 7 [del(7q)]. ΟΜΛ χωρίς ανιχνεύσιµες κυτταρογενετικές ανωµαλίες. Σε 30-50% των περιπτώσεων δεν ανιχνεύεται χρωµοσωµική αλλοίωση και σε αυτές τις περιπτώσεις συνιστάται ο µοριακός έλεγχος συγκεκριµένων γονιδίων που σχετίζονται µε ΟΜΛ. Στον πίνακα που ακολουθεί παρουσιάζονται οι κύριες κυτταρογενετικές ανωµαλίες στην ΟΜΛ, τα εµπλεκόµενα γονίδια καθώς και η συχνότητα εµφάνισης τους σε ενήλικες ασθενείς. Πίνακας 3: Οι κυριότερες κυτταρογενετικές ανωµαλίες της ΟΜΛ (Martens και Stunnenberg, 2010) Κυτταρογενετική ανωµαλία Εµπλεκόµενα γονίδια FAB ταξινόµηση Συχνότητα % σε Ενήλικες Φυσιολογ. καρυότυπος πολλαπλά % t(8;21) ETO;AML1 Μ1, Μ2 10% inv(16), t(16;16) MYH11;CBFb Μ4, Μ2 5-8% t(15;17) PML;RARa Μ % Αναδιατάξεις του 11q23 MLL µε άλλα γονίδια Μ4/Μ5 4% t(9;22) BCR;ABL1 M5, M4, M2 2% t(6;9) DEK;CAN Μ4/Μ2 <1% t(1;22) RBM15;MKL1 Μ7 <1% t(9;11) MLLT3;MLL M1 <1% -7/del(7q) πολλαπλά Μ2, Μ4, Μ5 6-8% 22

26 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ -5/del(5q) πολλαπλά Μ1,Μ2,Μ4,Μ6 4-6% Τρισωµία 8 πολλαπλά Μ % Οι πιο χαρακτηριστικές αλλοιώσεις που παρατηρούνται στην ΟΜΛ αναλύονται παρακάτω και είναι οι εξής : Τρισωµία 8 Η τρισωµία (+8) είναι η πιο συχνή χρωµοσωµατική ανωµαλία που παρατηρείται στην ΟΜΛ. H χρωµοσωµατική αλλοίωση +8, παρατηρείται στο 5% των περιπτώσεων ασθενών µε ΟΜΛ ως µεµονωµένη αλλοίωση και στο 10% των περιπτώσεων που φέρουν επιπλέον αλλοιώσεις, κυρίως der(1;7)(q10;p10), t(3;21)(q26;q22), t(7;12)(q36;p13), t(9;11)(p21;q23), t(9;22)(q34;q11), t(11;17)9q23;q21), t(11;19)9q23;p13.1), t(15;17)(q22;q21) και inv(16)(p13q22). Η τρισωµία 8 ως µεµονωµένη αλλοίωση είναι εξίσου συχνή σε άντρες όσο και σε γυναίκες και εµφανίζεται σε άτοµα µέσης ηλικίας τα 50 έτη. Παρατηρείται σε οξείες µυελογενείς λευχαιµίες Μ1, Μ2, Μ4 και Μ5 σύµφωνα µε τη FAB ταξινόµηση (Dastugue et al., 2002) και παρατηρείται πιο συχνά σε πρωτοπαθείς παρά σε δευτεροπαθείς ΟΜΛ. Τέλος αρκετές µελέτες έχουν χαρακτηρίσει τη τρισωµία 8 ως αλλοίωση ενδιάµεσης πρόγνωσης (Grimwade et al., 1998; Wolman et al., 2002). Μονοσωµία 5/del(5q) Η µονοσωµία του χρωµοσώµατος 5 (-5) είναι µια από τις πιο κοινές αριθµητικές ανωµαλίες που παρατηρούνται στην ΟΜΛ (Εικόνα 7). Η έλλειψη της χρωµοσωµικής περιοχής 5q [del(5q)] αντιπροσωπεύει το 5 µε 10% των ασθενών µε ΟΜΛ και παρατηρείται συνήθως µαζί µε -7, -17 και -18. Επίσης del(5q) παρατηρείται και ως αλλοίωση σε ασθενείς µε ΟΜΛ που φέρουν και inv(3)(q21q26)/t(3;3)(q21;q26) ή t(9;22)(q34;q11.2). Πρόσφατα η έλλειψη του 5q συσχετίστηκε παθογενετικά µε τα τον αυξητικό παράγοντα EGFR1, τα γονίδια της ριβοσωµικής πρωτείνης S14 (RPS14) καθώς και µε την απώλεια του γονιδίου της catenin alpha 1 (CTNNA1) (Λαζαρίδου, 2009). Η µονοσωµία 5 ως µεµονωµένη αλλοίωση αλλά και ως αλλοίωση σε σύνθετο καρυότυπο παρατηρείται συχνότερα σε άνδρες και κυρίως σε άτοµα µέσης ηλικίας τα 60 έτη. Η del(5q) αλλοίωση εµφανίζεται συχνότερα σε άνδρες όταν πρόκειται για µεµονωµένη αλλοίωση στον καρυότυπο και σε γυναίκες όταν συνυπάρχει µε άλλες αλλοιώσεις (Hrusak and Porwit-MacDonald, 2002). Αρκετές 23

27 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ µελέτες αναφέρουν ότι περιπτώσεις ασθενών µε ΟΜΛ που φέρουν την αλλοίωση - 5/del(5q) έχουν συσχετιστεί µε δυσµενή πρόγνωση και κατ επέκταση τέτοια περιστατικά αντιµετωπίζονται ως υψηλού κινδύνου στα θεραπευτικά πρωτόκολλα (Bene et al., 2001). Εικόνα 7: Τα κυριότερα σηµεία θραύσης του χρωµοσώµατος 5 Μονοσωµία 7/ del(7q) Η µονοσωµία 7 παρατηρείται στο 10% των περιπτώσεων ασθενών µε ΟΜΛ που φέρουν επιπλέον αλλοιώσεις, κυρίως -5, del(5q) και -17 και στο 5% των περιπτώσεων ως µεµονωµένη αλλοίωση (Εικόνα 8). Επίσης εµφανίζεται ως δευτερογενής ανωµαλία στο 50% των περιπτώσεων µε inv(3)(q21q26)/t(3;3)(q21;q26) και στο 10% µε t(2;3)(p15-23)(p26-27). Η έλλειψη της χρωµοσωµικής περιοχής 7q [del(7q)], αντιπροσωπεύει το 5% των περιπτώσεων µε ΟΜΛ που φέρουν ως επιπλέον αλλοίωση συνήθως -5 και -17. Μπορεί να χαρακτηριστεί και ως δευτερογενής ανωµαλία στο 15% των περιπτώσεων που φέρουν t(3;12)(q26;p13), στο 8% µε t(3;21)(q26;q22) και στο 5% µε inv(16)(p13q22). Συχνά τόσο η µονοσωµία 7 όσο και το del(7q) παρατηρούνται σε οξείες µυελογενείς λευχαιµίες Μ6, Μ0, Μ1 και Μ7 σύµφωνα µε τη FAB ταξινόµηση (Dastugue et al., 2002). Στις αρχές της δεκαετίας του 80 έγινε αντιληπτό ότι η αλλοίωση -7/del(7q) συνδέεται µε δυσµενή πρόγνωση (Larson et al., 1983). Σήµερα είναι γνωστό ότι ασθενείς µε ΟΜΛ που φέρουν -7/del(7q), έχουν µικρή ανταπόκριση στη χηµειοθεραπεία και χαµηλή επιβίωση (Grimwade et al., 1998; Hasle et al.,2007). 24

28 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 8: Έλλειψη στο µεγάλο βραχίονα του χρωµοσώµατος 7 [del(7q)(q22 q32)] t(8;21)(q22;q22) Η αµοιβαία µετάθεση t(8;21)(q22;q22) παρατηρείται στο 7% των περιπτώσεων ασθενών µε ΟΜΛ που φέρουν επιπλέον αλλοιώσεις και στο 40% των περιπτώσεων ως µεµονωµένη αλλοίωση (Εικόνα 9). Η αµοιβαία µετάθεση t(8;21) σχετίζεται µε την οξεία µυελογενή λευχαιµία Μ2 κατά FAB και προκαλεί τη σύντυξη του AML1 γονιδίου της χρωµοσωµατικής περιοχής 21q22 (γνωστό και ως RUNX1) µε το γονίδιο ΕTO που εδράζεται στη χρωµοσωµατική περιοχή 8q22. Αυτό έχει σαν αποτέλεσµα τη παραγωγή της χιµαιρικής πρωτείνης AML1-ETO (Mauritzson et al., 2002). Σε ασθενείς µε ΟΜΛ που φέρουν την αλλοίωση t(8;21)(q22;q22), επιτυγχάνεται πλήρης ίαση µετά από συµβατική χηµειοθεραπεία και η αµοιβαία µετάθεση t(8;21) θεωρείται γενικά καλής πρόγνωσης (Grimwade et al., 1998). Εν τούτοις όταν η αλλοίωση t(8;21) συνοδεύεται από µεταλλάξεις στα γονίδια MLL και KIT παρουσιάζει δυσµενή πρόγνωση (Shimada et al., 2006). Εικόνα 9:Η αµοιβαία µετατόπιση t(8;21)(q22;q22) 25

29 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ t(15;17)(q22;q21) Από τις πιο καλά µελετηµένες µορφές της ΟΜΛ είναι η οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία, υπότυπος Μ3 κατά FAB, η οποία αποτελεί το 5-8% όλων των περιπτώσεων της ΟΜΛ. Η οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία, περιγράφηκε για πρώτη φορά το 1957 και χαρακτηρίζεται κυτταρογενετικά από την αµοιβαία µετάθεση t(15;17)(q22;q21) (εικ. 10). Σε αυτή την αµοιβαία µετάθεση το γονίδιο PML, που εδράζεται στην 15q21 χρωµοσωµική θέση, ενώνεται µε το γονίδιο RARα που εδράζεται στην 17q21 χρωµοσωµική θέση, µε αποτέλεσµα το σχηµατισµό ενός µεταγραφικού ενεργού υβριδικού γονιδίου, του PML/RARα (Martens and Stunnenberg, 2010). Η αµοιβαία µετάθεση t(15;17)(q22;q21) παρατηρείται στο 75% των περιπτώσεων ασθενών µε ΟΜΛ ως µεµονωµένη αλλοίωση, ενώ η τρισωµία 8 αποτελέι τη πιο συχνή (10-15%) δευτερογενή αλλοίωση της t(15;17). Εικόνα 10. Η αµοιβαία µετατόπιση µεταξύ των χρωµοσωµάτων 15 και 17 Η αµοιβαία µετάθεση t(15;17) παρατηρείται το ίδιο συχνά σε άνδρες όσο και σε γυναίκες και κυρίως σε άτοµα µέσης ηλικίας τα 40 έτη. Παρά το γενονός ότι τα τελευταία χρόνια θεωρείται µια αλλοίωση καλής πρόγνωσης, αρκετές µελέτες αναφέρουν ότι η χαµηλή επιβίωση ορισµένων ασθενών οφείλεται στην παρουσία δευτερογενών χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων και µεταλλάξεων στο γονίδιο FLT3 (Grimwade et al., 1998; De Botton et al., 2000). inv(16)(p13q22) / t(16;16)(p13;q22) Ασθενείς µε inv(16)(p13q22)/t(16;16)(p13;q22) συνήθως ανήκουν στον υπότυπο ΟΜΛ-Μ4 (FAB ταξινόµηση) (εικόνα 11). Η περικεντρική αναστροφή του χρωµοσώµατος 16 σχετίζεται κυρίως µε την Μ4Eo. Η ανίχνευσή της µε κλασσική κυτταρογενετική είναι πολλές φορές δύσκολη και χρειάζεται FISH ή RT-PCR για την 26

30 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ταυτοποίησή της. Η περικεντρική αναστροφή του χρωµοσώµατος [16 inv(16)] ή η αντιµετάθεση t(16;16) παρατηρείται στο 4% των περιπτώσεων ασθενών µε ΟΜΛ µε την αναστροφή να είναι πολύ πιο συχνή (95%) από την αντιµετάθεση (5%). Οι αλλοιώσεις inv(16)(p13q22) και t(16;16)(p13;q22) είναι πιο συχνές στους άντρες σε σχέση µε τις γυναίκες. Εµφανίζονται σε όλες τις ηλικίες και κυρίως σε άτοµα µέσης ηλικίας τα 35 έτη. Ασθενείς µε ΟΜΛ που φέρουν την αλλοίωση inv(16)/t(16;16) έχουν εξαιρετικά καλή πρόγνωση και την πιο υψηλή επιβίωση σε σχέση µε άλλους υποτύπους ΟΜΛ (Grimwade et al., 1998; Marcucci et al., 2005). Εικόνα 11: Η αµοιβαία µετατόπιση t(16;16)(p13;q22) Αναδιατάξεις του 11q23 Το γονίδιο MLL που εδράζεται στην 11q23 χρωµοσωµική περιοχή ρυθµίζει την έκφραση των γονιδίων homeobox (HOX), τα οποία λειτουργούν ως ενεργοποιητές της µεταγραφής. Η διαταραχή της έκφρασης τους έχει καθοριστική επίδραση στα αιµοποιητικά κύτταρα. Μετταλλάξεις στο γονίδιο MLL εµφανίζονται πιο συχνά σε νεογέννητα και παιδιά σε ποσοστό που φτάνει το 50-70% των περιπτώσεων. Η MLL είναι µια πρωτείνη που προσδένεται στη χρωµατίνη αλλάζοντας τη δοµή της µε αποτέλεσµα τη ρύθµιση της έκφρασης γονιδίων-στόχων. Μελέτες έχουν δείξει ότι το γονίδιο MLL, εµπλέκεται περισσότερο από κάθε άλλο γονίδιο, σε πολλές χρωµοσωµικές µεταθέσεις που σχετίζονται µε λευχαιµίες. Έχουν περιγραφεί έως σήµερα, περισσότερα από 80 διαφορετικά γονίδια που συµµετέχουν στη δηµιουργία υβριδικών γονιδίων µε το MLL (εικ. 12). Ασθενείς στους οποίους παρατηρείται ενίσχυση της περιοχής 11q23-25, χαρακτηρίζονται από σύνθετους καρυοτύπους και έχουν κακή πρόγνωση. Αναδιατάξεις του MLL έχουν παρατηρηθεί τόσο σε de novo ΟΜΛ όσο και σε δευτεροπαθείς ΟΜΛ µετά από χηµειοθεραπεία, κυρίως µετά από τη χορήγηση αναστολέων της τροποϊσοµεράσης ΙΙ (Zatkova et al., 2009). 27

31 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 12. Περισσότερα από 80 διαφορετικά γονίδια συµµετέχουν στη δηµιουργία υβριδικών γονιδίων µε το MLL t(9;22)(q34;q11.2) Εκτός από τις περιπτώσεις ΧΜΛ αλλά και των ενήλικων σθενών µε ΟΛΛ, το χρωµόσωµα Φιλαδέλφεια που είναι αποτέλεσµα της µετάθεσης t(9;22)(q34;q11.2), παρατηρείται και στο 2% όλων των αλλοιωµένων καρυοτύπων σε περιπτώσεις ΟΜΛ. Ως µεµονωµένη αλλοίωση παρατηρείται στο 40% των ασθενών αυτών, ενώ το ποσοστό αυξάνεται όταν υπάρχουν δευτερογενείς αλλοιώσεις όπως +8, -7, +19 και der(22)t(9;22). Οι περισσότερες περιπτώσεις ΟΜΛ µε t(9;22) ταξινοµούνται ως Μ1 ή Μ2 κατά FAB ενώ λιγότερο συχνά παρατηρούνται σε περιπτώσεις Μ0, Μ4 και Μ7. Ασθενείς µε ΟΜΛ, θετικοί για την αντιµετάθεση t(9;22)(q34;q11.2), εµφανίζουν φτωχή απόκριση στη χηµειοθεραπεία και χαµηλό ποσοστό επιβίωσης (Bloomfield et al., 1977). Μελέτες που έχουν πραγµατοποιηθεί σχετικά µε την πρόγνωση των περιπτώσεων ασθενών µε ΟΜΛ, αναφέρουν ότι σε ασθενείς µε t(9;22) σπάνια 28

32 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ επιτυγχάνεται πλήρης ίαση µετά από συµβατική χηµειοθεραπεία και η αλλοίωση t(9;22) κατατάσσεται στην οµάδα ανωµαλιών κακής πρόγνωσης (Soupir et al., 2007). Α4 ΤΑΞΙΝΟΜΗΣΗ ΤΗΣ ΟΞΕΙΑΣ ΜΥΕΛΟΓΕΝΟΥΣ ΛΕΥΧΑΙΜΙΑΣ Α4.1 Ταξινόµηση κατά FAB Η πρώτη ταξινόµηση της ΟΜΛ έγινε το 1976 από µια οµάδα Γάλλων, Αµερικανών και Άγγλων ερευνητών, µε βάση την πορεία διαφοροποίησης των αιµοποιητικών κυττάρων της λεµφικής σειράς και ονοµάστηκε ταξινόµηση κατά FAB (French-American-British) (Bennett et al., 2004). H FAB ταξινόµηση βασίζεται κυρίως σε µορφολογικά κριτήρια και εξακολουθεί να χρησιµοποιείται έως σήµερα. Στα πλεονεκτήµατα της περιλαµβάνεται η ταχύτητα, η ευκολία στην εκτίµηση και η µεγάλη συµφωνία µεταξύ των µελετητών, σε ποσοστό >80%. Ωστόσο, παρουσιάζει µειονεκτήµατα, όπως η δυσχέρεια αναγνώρισης ορισµένων µορφών ΟΜΛ (Μ0, Μ7, διφαινοτυπική) (Matutes et al., 1997) και η περιορισµένη αξία στην πρόγνωση της νόσου ή την ανίχνευση υπολειµµατικής νόσου (Head et al., 1997). Στον πίνακα 2 φαίνονται οι 8 υπότυποι της ΟΜΛ µε βάση την ταξινόµηση κατά FAB. 29

33 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 2. Ταξινόµηση κατά FAB της ΟΜΛ. Συχνότητα και πρόγνωση σε ενηλίκους ασθενείς (Fladrin G., 2002). Yπότυπος Κυτταρικός τύπος Συχνότητα Πρόγνωση Μ0 Μ1 Μ2 Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία µε ελάχιστη διαφοροποίηση Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία χωρίς ωρίµανση Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία µε ωρίµανση 3-5% υσµενής 15-20% Ενδιάµεση 25-30% Ευνοϊκή Μ3 Μ3ν Οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία µε αδρά βασεόφιλα κοκκία στα προµυελοκύτταρα Οξεία προµυελοκυτταρική λευχαιµία µε λεπτή κοκκίωση 10-15% Άριστη Μ4 Οξεία µυελοµονοκυτταρική λευχαιµία Ενδιάµεση Μ4eo Οξεία µυελοµονοκυτταρική λευχαιµία µε παθολογικά ηωσινόφιλα στον µυελό 20-30% Ευνοϊκή M5a M5b Οξεία µονοβλαστική λευχαιµία, ελαφρά διαφοροποιηµένη Οξεία µονοκυτταρική λευχαιµία, διαφοροποιηµένη 2-9% Ενδιάµεση M6 Οξεία ερυθρολευχαιµία 3-5% υσµενής M7 Οξεία µεγακαρυοβλαστική λευχαιµία 3-5% υσµενής Α4.2 Ταξινόµηση κατά WHO Η η ταξινόµηση κατά WHO (World Health Organization) από τον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας βασίζεται στα κυτταρογενετικά και µοριακά ευρήµατα, στην παρουσία δυσπλαστικών χαρακτηριστικών και στην προηγούµενη ιστορία της νόσου. Στην κατάταξη της WHO του 2008 κάποια εξατοµικευµένα χαρακτηριστικά της νόσου εµφανίζονται απλουστευµένα, αλλά η κατάταξη είναι συνολικά πιο περίπλοκη 30

34 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ γι αυτό ακόµη χρησιµοποιείται η FAB ως πιο εύχρηστη (Jeffe et al., 2001). Η ταξινόµηση κατά WHO περιλαµβάνει 5 βασικές κατηγορίες (Greer et al., 2004). 1. ΟΜΛ µε επαναλαµβανόµενες γενετικές ανωµαλίες a. ΟΜΛ µε t(8;21)(q22;q22); (AML1/ETO) b. ΟΜΛ µε ηωσινοφιλία µυελού i. inv(16)(p13q22) ii. t(16;16)(p13;q22); (CBFβ/MYH 11) c. ΟΠΜΛ µε t(15;17)(q22;q12); (PML/RARa) και παραλλαγές d. ΟΜΛ µε 11q23 (MLL) ανωµαλίες e. ΟΜΛ µε t(9;11)(p22;q23); MLLT3-MLL f. ΟΜΛ µε t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214 g. ΟΜΛ µε inv(3)(q21q26.2) ή t(3;3)(q21;q26.2); RPN1-EVI1 h. ΟΜΛ (µεγακαρυοβλαστική) µε t(1;22)(p13;q13); RBM15-MKL1 i. ΟΜΛ µε µεταλλαγµένο NPM1 γονίδιο j. ΟΜΛ µε µεταλλαγµένο CEBPA γονίδιο (NCI,2009) 2. ΟΜΛ µε πολυγραµµική δυσπλασία a. Με προηγηθέν Μ Σ ή Μ Σ/ΜΥΣ b. Χωρίς προηγηθέν Μ Σ ή Μ Σ/ΜΥΣ αλλά µε δυσπλασίες σε τουλάχιστον 50% των κυττάρων σε δύο ή περισσότερες µυελικές σειρές 3. Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία και µυελοδυσπλαστικά σύνδροµα σχετιζόµενα µε θεραπεία ή δευτεροπαθής ΟΜΛ µετά από θεραπεία a. Αλκυλιωτικοί παράγοντες/ακτινοβολία b. Αναστολείς τοποϊσοµεράσης ΙΙ c. Άλλοι τύποι 4. Οξεία µυελοβλαστική λευχαιµία µη ταξινοµούµενη διαφορετικά a. ΟΜΛ ελάχιστα διαφοροποιηµένη ( FAB Μ0) b. ΟΜΛ χωρίς ωρίµανση (FAB Μ1) c. ΟΜΛ µε ωρίµανση (FAB Μ2) d. Οξεία Μυελοµονοκυτταρική λευχαιµία (FAB Μ4) e. Οξεία Μονοκυτταρική/Μονοβλαστική λευχαιµία (FAB Μ5a και M5b) f. Οξεία ερυθροβλαστική λευχαιµία i. ερυθροβλαστική/µυελοβλαστική (Μ6a) ii. αµιγώς ερυθροβλαστική (Μ6b) g. Οξεία µεγακαρυοβλαστική λευχαιµία (Μ7) h. Οξεία βασεοφιλική λευχαιµία i. Οξεία µεγακαρυοβλαστική πανµυέλωση µε µυελοϊνωση j. Μυελοβλαστικό σάρκωµα 5. Οξεία µυελογενής λευχαιµία µε ασαφή σειρά προέλευσης a. Οξεία αδιαφοροποίητη λευχαιµία b. Οξεία δίγραµµη λευχαιµία c. Οξεία διφαινοτυπική λευχαιµία 31

35 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α5 Η ΣΥΜΒΟΛΗ ΤΗΣ ΚΥΤΤΑΡΟΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΣΤΗΝ ΟΜΛ Η κυτταρογενετική µελέτη του µυελού των οστών σε ασθενείς µε οξεία µυελογενή λευχαιµία, µέσω της κλασσικής κυτταρογενετικής (καρυότυπος), δίνει τη δυνατότητα ελέγχου όλου του γονιδιώµατος σε επίπεδο χρωµοσωµάτων και συµβάλλει: Στην ακριβή διάγνωση, αφού ένας σηµαντικός αριθµός ειδικών χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων στα νεοπλασµατικά κύτταρα συνδέονται µε συγκεκριµένο τύπο/υπότυπο της ΟΜΛ. Στην προγνωστική αξιολόγηση της πορείας της νόσου (πλήρης ύφεση, διάρκεια πλήρους ύφεσης, κίνδυνος υποτροπής και επιβίωση) Στην κατάταξη των ασθενών σε οµάδα χαµηλού, ενδιάµεσου ή υψηλού κινδύνου Στην επιλογή του κατάλληλου θεραπευτικού πρωτοκόλλου Στην εκτίµηση του θεραπευτικού αποτελέσµατος Στον καθορισµό υπολειπόµενης νόσου Στην παρακολούθηση της επιτυχίας της µεταµόσχευσης µε τον προσδιορισµό της καταγωγής των κυττάρων (κύτταρα δότη ή δέκτη αν ο δότης και ο δέκτης είναι διαφορετικού φύλου) ή µε την ανίχνευση του διαγνωστικού κλώνου Η µοριακή κυτταρογενετική και συγκεκριµένα η τεχνική του in situ φθορίζοντος υβριδισµού (FISH), χρησιµοποιείται ευρέως στην κυτταρογενετική ως συµπληρωµατική του συµβατικού καρυοτύπου για την ακριβέστερη διάγνωση και λεπτοµερέστερη παρακολούθηση των ασθενών µε λευχαιµία. Είναι µια µέθοδος γρήγορη, µε υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, η οποία µπορεί να µελετά ταυτόχρονα µεγάλο αριθµό κυττάρων. Εφαρµόζεται και δίνει πληροφορίες για καρυοτυπικές ανωµαλίες σε µη διαιρούµενα κύτταρα και εποµένως είναι χρήσιµη σε δείγµατα µε ελάχιστες ή καθόλου µεταφάσεις. Χρησιµοποιείται για την περαιτέρω διερεύνηση των αλλοιώσεων που έχουν ανιχνευτεί στον καρυότυπο, για την ταυτοποίηση των γονιδίων και το σχηµατισµό υβριδικών γονιδίων που εµπλέκονται και πιθανόν να συµµετέχουν στη λευχαιµογένεση, καθώς επίσης και για την ανίχνευση και ταυτοποίηση αναδιαταγµένων γονιδίων ή χρωµοσωµατικών/γονιδιακών µικροελλείψεων. Η µέθοδος αυτή όµως, αδυνατεί να ανιχνεύσει το σύνολο των 32

36 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ χρωµοσωµατικών ανωµαλιών και έχει σχετικά υψηλό κόστος. Ουσιαστικά ανιχνεύει συγκεκριµένες αλλοιώσεις για τις οποίες έχουµε χρησιµοποιήσει ειδικούς ανιχνευτές. Εικόνα 13. Συσχέτιση διακριτικών ορίων µε µεθόδους κλασικής κυτταρογενετικής, µοριακής κυτταρογενετικής και µοριακής βιολογίας. Το πόσο σηµαντικός είναι ο ρόλος της κυτταρογενετικής στις λευχαιµίες φαίνεται από το γεγονός ότι οι χρωµοσωµατικές αλλοιώσεις έχουν συνεκτιµηθεί στην κατά FAB ταξινόµηση των λευχαιµιών, ενώ έχουν κυρίαρχο ρόλο στη νέα ταξινόµηση που προτάθηκε από τον Παγκόσµιο Οργανισµό Υγείας (World Health Organization, WHO 2008) 33

37 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α6 ΠΡΟΓΝΩΣΗ ΚΑΙ ΕΞΕΛΙΞΗ THΣ ΝΟΣΟΥ Η πρόγνωση της οξείας µυελογενούς λευχαιµίας έχει βελτιωθεί τα τελευταία χρόνια. Μέχρι προ ολίγων ετών ήταν πολύ κακή στις µέρες µας όµως υπάρχει ένα ποσοστό ασθενών που θεραπεύεται πλήρως. Επίσης, πρόσφατες µελέτες έχουν δείξει ότι η πενταετής επιβίωση ανέρχεται στο 35-40% των περιπτώσεων για ασθενείς <55-60 ετών, µετά το 1990, ενώ το ποσοστό για τις ίδιες ηλικίες ασθενών ανερχόταν τη δεκαετία του 70 στο 10% και τη δεκαετία του 80 στο 25% (Sekeres et al., 2004). Η βελτίωση της πρόγνωσης οφείλεται στους ακόλουθους παράγοντες: Αύξηση των γνώσεων γύρω από τη νόσο Σχεδιασµός αποδοτικότερων θεραπευτικών πρωτοκόλλων Βελτίωση των διεργασιών που αφορούν τη µεταµόσχευση µυελού των οστών (χρήση αυτόλογης µεταµόσχευσης και βελτίωση µεθόδων αλλογενούς µεταµόσχευσης). Ένας από τους πιο σηµαντικούς προγνωστικούς παράγοντες, στην εξέλιξη της νόσου, είναι οι καρυοτυπικές ανωµαλίες. Έτσι, σήµερα µιλάµε για περιπτώσεις µε καλή πρόγνωση και περιστατικά µε κακή πρόγνωση, βασιζόµενοι στο αν υπάρχει συγκεκριµένη χρωµοσωµική ανωµαλία που επηρεάζει σε ποιά από τις δύο οµάδες ανήκει ο ασθενής. Πιο συγκεκριµένα οι αλλοιώσεις t(15;17)(q22;q12), t(8;21)(q22;q22), και inv(16)(p13.1q22)/t(16;16) (p13.1q22) θεωρούνται καλής πρόγνωσης, οι αλλοιώσεις +8, +21, +22, -Υ,del(9q)/t(9;11)(p22;q23), το εύρηµα του φυσιολογικού καρυοτύπου καθώς και όλες οι υπόλοιπες δοµικές ή αριθµητικές αλλαγές θεωρούνται ενδιάµεσης πρόγνωσης ενώ οι del(5q), -5, del(7q), - 7,inv(3q)/t(3;3),οι αναδιατάξεις του 11q23,t(6;9)(p23;q34), del(17p) και οι σύνθετοι καρυότυποι(>3 χρωµοσωµικές ανωµαλίες) θεωρούνται αλλοιώσεις κακής πρόγνωσης. Στο παρακάτω πίνακα παρουσιάζονται οι πιο συχνές κυτταρογενετικές αλλοιώσεις καθώς και τα εµπλεκόµενα γονίδια (Πίνακας 4). 34

38 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 4. Προγνωστική ταξινόµηση ΟΜΛ βάση αρυοτυπικών και µοριακών ευρηµάτων (Dohner et al., 2010). Κυτταρογενικές Εµπλεκόµενα FAB Συχνότητα αλλοιώσεις γονίδια ταξινόµηση σε Ενήλικες Πρόγνωση t(8;21) ETO/AML1 Μ1, Μ2 10% Καλή inv(16), t(16;16) MYH11/CBFb Μ4, Μ2 5-8% Καλή t(15;17) PML/RARa Μ % Καλή Φυσιολογικός καρυότυπος % Ενδιάµεση t(1;22) RBM15/MKL1 Μ7 <1% Ενδιάµεση t(9;11) MLLT3/MLL M5, M4, M2 <1% Ενδιάµεση Τρισωµία 8 Αναδιατάξεις του 11q23 [εκτός t(9;11)] Πολλαπλά γονίδια MLL µε άλλα γονίδια Μ1- Μ6 9-11% Ενδιάµεση - Κακή Μ4, Μ5 4% Κακή t(6;9) DEK;CAN Μ4, Μ2 <1% Κακή -7/del(7q) Πολλαπλά γονίδια Μ2, Μ4, Μ5 6-8% Κακή -5/del(5q) Πολλαπλά γονίδια Μ1,Μ2,Μ4,Μ6 4-6% Κακή t(9;22) BCR/ABL1 M1 2% Ενδιάµεση Εκτός όµως από το δυσµενή καρυότυπο υπάρχουν και άλλοι δυσµενείς προγνωστικοί παράγοντες, όπως η ηλικία του ασθενούς, ο αριθµός των λευκών αιµοσφαιρίων, η προΰπαρξη Μ Σ ή θεραπείας, η παρουσία ίνωσης κλπ (Πίνακας 5). Αυτό που δεν είναι γνωστό µέχρι σήµερα είναι το κατά πόσο αυτοί οι παράγοντες είναι ανεξάρτητοι µεταξύ τους. Παρ όλα αυτά, η ανάγκη περαιτέρω βελτίωσης της πρόγνωσης είναι υπαρκτή και προς αυτή την κατεύθυνση τα τελευταία χρόνια γίνεται εντατική έρευνα. 35

39 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πίνακας 5. Προγνωστικοί παράγοντες ΟΜΛ Προγνωστικοί παράγοντες Ηλικία υσµενής επίπτωση >60 ετών Αριθµός λευκών αιµοσφαιρίων >10x10 9 /1 Καρυότυπος Αιτιολογία Ίνωση Μεταλλάξεις σε συγκεκριµένα γονίδια del(5q), -5, del(7q), -7, inv(3q)/t(3;3), αναδιατάξεις του 11q23, t(6;9)(p23;q34), del(17p) σύνθετοι καρυότυποι ευτεροπαθής ή σχετιζόµενη µε χηµειοθεραπεία παρούσα FLT3, c-kit, BAALC και ERG Κατά την εξέλιξη της νόσου εµφανίζονται βαριές λοιµώξεις και αιµορραγίες. Οι λοιµώξεις είναι κατά βάση βακτηριακές, µπορεί να προκαλέσουν προβλήµατα στη σωστή λειτουργία των πνευµόνων αλλά και πυρετό, ενώ συχνά παρουσιάζεται και σηψαιµία. Οι αιµορραγίες είναι συνήθως δερµατικές, ενίοτε όµως αιµορραγεί το πεπτικό ή το γεννητικό σύστηµα και σπανιότερα το ουροποιητικό ή το αναπνευστικό. Οι ασθενείς µε ΟΜΛ καταλήγουν µετά από λοιµώξεις και αιµορραγίες, σε περιόδους που εµφανίζονται σοβαρές κυτταροπενίες, λόγω της χηµειοθεραπείας, σε συνδυασµό πολλές φορές µε την παρουσία ανθεκτικής νόσου. Σπανιότερες αιτίες θανάτου είναι οι ανεπιθύµητες ενέργειες της θεραπείας, όπως ασθενών που έχουν υποβληθεί σε αλλογενή µεταµόσχευση προγονικών αιµοποιητικών κυττάρων (Bradstock et al., 1994). A7 ΤΟ ΓΕΝΕΤΙΚΟ ΥΠΟΒΑΘΡΟ ΤΗΣ ΟΜΛ Όταν µελετάται η ΟΜΛ ω ξεχωριστή οµάδα, οι τύποι µεταλλάξεων που σχετίζονται µε αυτή διαφέρουν από εκείνες που συχνά συναντώνται σε άλλα είδη λευχαιµίας. Οι γενετικές ανωµαλίες που σχετίζονται µε την ΟΜΛ είναι ισοζυγισµένες χρωµοσωµατικές µετατοπίσεις, που οδηγούν στο σχηµατισµό χιµαιρικών πρωτεϊνών. Αυτές οι χιµαιρικές πρωτεΐνες ανήκουν στην οµάδα των µεταγραφικών ρυθµιστικών 36

40 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ πρωτεϊνών. Η άποψη αυτή στηρίζει τη γενικότερη θεώρηση, σύµφωνα µε την οποία η ΟΜΛ προέρχεται κυρίως από µεταγραφική δυσλειτουργία (Σταυρογιάννη, 2007). Α7.1 ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΑΛΛΑΓΕΣ ΣΤΗΝ ΟΜΛ Η πολυσταδιακή πορεία της ΟΜΛ αντανακλά τη συσσώρευση κυτταρικών και µοριακών βλαβών κατά την ανάπτυξη της νόσου. Περίπου το 50% των ασθενών µε de novo ΟΜΛ έχουν φυσιολογικό καρυότυπο, που θεωρείται ενδιάµεσης πρόγνωσης και περιλαµβάνει µια ετερογενή οµάδα ασθενών των οποίων η ολική επιβίωση στα 5 χρόνια κυµαίνεται από 24-42%. Η διαφορετική επιβίωση αυτών των ασθενών µπορεί να οφείλεται στην ύπαρξη επιπρόσθετων επίκτητων γενετικών και επιγενετικών αλλαγών που δεν διακρίνονται µε την κυτταρογενετική ανάλυση, όπως είναι οι µεταλλάξεις σε συγκεκριµένα γονίδια. Η ύπαρξη µοριακών αλλοιώσεων µπορεί να επηρεάσει την ανταπόκριση στη θεραπεία και την ολική επιβίωση, αλλά και να χρησιµεύσουν ως προγνωστικοί παράγοντες ή θεραπευτικοί στόχοι για νέες στοχευµένες θεραπείες. Σήµερα θεωρείται ότι ασθενείς µε φυσιολογικό καρυότυπο πρέπει να ελέγχονται µοριακά µε PCR/RT-PCR κυρίως για µεταλλάξεις των γονιδίων FLT3, c-kit, NPM1, MLL-PTD (partial tandem duplications of MLL) και CEBPA (19q13.1). Πρόσφατα αποδείχτηκε ότι υψηλή έκφραση του γονιδίου AF1q είναι κακός προγνωστικός δείκτης για ασθενείς µε ΟΜΛ µε φυσιολογικό καρυότυπο (Stunk et al., 2009). Οι µεταλλάξεις αυτές µέσα από µελέτες έχουν οµαδοποιηθεί σε δύο κατηγορίες: Α) Σηµειακές µεταλλάξεις τύπου Ι (FLT3/ITD, FLT3/TKD, ΚΙΤ, RAS, PTPN11, JAK2). Προσφέρουν ενισχυτικό πλεονέκτηµα ή πλεονέκτηµα επιβίωσης στα κύτταρα και προκαλούν διαταραχές µεταβίβασης σήµατος (Σταυρογιάννη, 2007). Β) Μεταλλάξεις µεταγραφικών παραγόντων τύπου ΙΙ (PML/RARA, RUNX1/RUNX1T1, CBFB/MYH11, MLLfusions, CEBPA, NPM1). Επηρεάζουν τη διαφοροποίηση και προσδίδουν την ιδιότητα της αυτοανανέωσης στα κύτταρα. 37

41 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 14. Μοριακό µοντέλο για ΟΜΛ ασθενείς (Pangiotou and Polychronopoulou- Androulakali, 2000). Και οι δύο τύποι πιθανά συµβάλλουν στη παθογένεια της οξείας µυελογενούς λευχαιµίας. Μεταλλάξεις της ίδιας κατηγορίας σπάνια συµβαίνουν στον ίδιο άρρωστο, ενώ συχνά συνυπάρχουν µεταλλάξεις των δύο διαφορετικών οµάδων (Σταυρογιάννη, 2007). Οι µεταλλάξεις τύπου Ι ανιχνεύονται στο 50% των περιπτώσεων ΟΜΛ. Συγκεκριµένα, πρόσφατες µελέτες έδειξαν ότι µεταλλάξεις στο γονίδιο ΚΙΤ βρίσκονται στο 12-47% των ασθενών µε t(8;21) και σχετίζονται µε κακή πρόγνωση, και στο 22-38% µε inv(16)(p13.1q22)/t(16;16)(p13.1;q22). Οι µεταλλάξεις της κινάσης FLT-3 ανιχνεύονται σε ποσοστό 20-38% των περιπτώσεων ΟΜΛ. Οι FLT3- ITD (internal tandem duplications) και FLT3-TKD βρίσκονται στο 2-9% και στο 2-7% των ασθενών µε t(8;21), καθώς επίσης στο 0-7% και στο 6-24% σε ασθενείς µε inv(16). Μεταλλάξεις FLT-3 έχουν επίσης παρατηρηθεί στο 35-45% των ΟΜΛ-Μ3 περιπτώσεων (Εικόνα 14) (Pangiotou and Polychronopoulou-Androulakali, 2000). 38

42 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Στις µεταλλάξεις τύπου ΙΙ συµπεριλαµβάνεται η CBF (Core-binding factor) ΟΜΛ η οποία χαρακτηρίζεται από την παρουσία των αλλοιώσεων t(8;21)(q22;q22), και inv(16)(p13.1q22)/t(16;16)(p13.1;q22) που οδηγούν στη δηµιουργία των υβριδικών γονιδίων RUNX1-RUNX1T1 και CBFB-MYH11, αντιστοίχως. Η ΟΜΛ µε inv(16)(p13.1q22) ή t(16;16)(p13.1;q22) που οδηγεί στη δηµιουργία του υβριδικού γονιδίου CBFB-MYH11 συναντάται στο 5-10% των ασθενών µε ΟΜΛ και κυρίως σε νεότερες ηλικίες. Η ανίχνευσή της µε κλασσική κυτταρογενετική είναι πολλές φορές δύσκολη και χρειάζεται FISH ή RT-PCR για την ταυτοποίησή της. Όπως αποδεικνύεται και από τα παραπάνω η κλασσική κυτταρογενετική, η µοριακή κυτταρογενετική καθώς και οι τεχνικές της µοριακής βιολογίας συµπληρώνουν η µία την άλλη επιτρέποντας την ταυτοποίηση των λευχαιµιών καθώς επίσης και την ανάπτυξη στοχευµένων και πιο ειδικών θεραπειών. Α7.2 ΣΥΧΝΟΤΕΡΕΣ ΜΕΤΑΛΛΑΞΕΙΣ ΣΤΗΝ ΟΜΛ Α7.2.1 FLT3 Το γονίδιο FLT3 εδράζεται στο χρωµόσωµα 13 (13q12) και είναι το γονίδιο που µεταλάσσεται πιο συχνά στην ΟΜΛ, µε συχνότητα που αγγίζει το 35%. Ο FLT3 είναι ένας υποδοχέας τυροσινικής κινάσης τάξης III, ο οποίος εκφράζεται σε ανώριµα αιµοποιητικά κύτταρα και είναι απαραίτητος για την αύξηση και διαφοροποίηση των προγονικών κυττάρων. O προσδέτης FL (FLT3 Ligand) του FLT3 είναι µια πρωτεΐνη η οποία κατά τη σύνδεσή της προκαλεί τον διµερισµό του υποδοχέα. Ο διµερισµός του υποδοχέα FLT3 οδηγεί στην αυτοφωσφορυλίωση ενδοκυτταρικών αµινοξέων τυροσίνης, µε αποτέλεσµα να επάγεται ένας καταρράκτης αντιδράσεων κυτταρικής σηµατοδότησης. Ο ενεργοποιηµένος FLT3, µαζί µε αυξητικούς αιµοποιητικούς παράγοντες προάγει τον πολλαπλασιασµό των προγονικών αιµοποιητικών κυττάρων.(gilliland and Griffin., 2002). Μεταλλάξεις του FLT3 παρατηρούνται στο 30% των περιστατικών ΟΜΛ. Μέχρι τώρα έχουν αναγνωριστεί δύο τύποι µεταλλάξεων που σχετίζονται µε το γονίδιο FLT3. Ο πρώτος τύπος αφορά στο διαδοχικό διπλασιασµό αλληλουχιών (Internal Tandem Duplications, ITDs), που βρίσκονται ανάµεσα στα εξόνια 11 και 12 και έχουν µήκος 3-40 bp. O δεύτερος τύπος µεταλλάξεων αφορά σηµειακές µεταλλάξεις που συµβαίνουν στον ενεργό βρόγχο του FLT3. Ο ενεργός βρόγχος υπό φυσιολογικές 39

43 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ συνθήκες εµποδίζει την πρόσβαση του ATP και του υποστρώµατος στην περιοχή της κινάσης, εως ότου συνδεθεί ο προσδέτης στον υποδοχέα και προκύψει η φωσφορυλίωση. Η αντικατάσταση της ασπαραγίνης στη θέση 835 από τυροσίνη (Asp835Tyr) είναι η πιο συχνή σηµειακή µετάλλαξη του ενεργού βρόγχου και οδηγεί στη συνεχή ενεργοποίηση του υποδοχέα FLT3 (Gilliland et al., 2002). Α7.2.2 NPM1 Το γονίδιο nucleophosmin 1 (NPM 1) έχει εντοπιστεί στο χρωµόσωµα 5 (5q35). Οι λειτουργίες της ΝΡΜ αφορούν κατά κύριο λόγο στη ρύθµιση του κυτταρικού κύκλου. Οι µεταλλάξεις του ΝΡΜ1 γονιδίου ανιχνεύονται στο 50% περίπου των ενηλίκων ασθενών µε OMΛ και φυσιολογικό καρυότυπο (CN-AML) και στο 35% περίπου του συνόλου των περιπτώσεων ΟΜΛ (Chou et al., 2007). Κατά συνέπεια, είναι οι συχνότερα ανιχνευόµενες µεταλλάξεις στην ΟΜΛ. Οι µεταλλάξεις του ΝΡΜ1 γονιδίου στην παιδική ΟΜΛ είναι αρκετά σπανιότερες (επίπτωση <10%) (Dvorakova et al., 2009). Α7.2.3 CEBPA Το CEBPA γονίδιο (χρωµόσωµα 19q13) κωδικοποιεί την οµώνυµη πρωτεΐνη µε δραστικότητα µεταγραφικού παράγοντα, η οποία έχει σηµαντική συµβολή στη διαφοροποίηση της µυελικής σειράς. Οι µεταλλάξεις στο ένα και µοναδικό εξόνιο του προαναφερθέντος γονιδίου οδηγούν σε διαταραχή της λειτουργικότητας του CEBPA µεταγραφικού παράγοντα, µε τελική συνέπεια την αναστολή διαφοροποίησης της µυελικής σειράς. Συνήθως (>90% των περιπτώσεων) πρόκειται για προσθήκες ή ελλείψεις µικρού αριθµού βάσεων. Το ποσοστό των CEBPA µεταλλάξεων στους ενήλικες ασθενείς µε CN-AML είναι περίπου 15% (10% περίπου για το σύνολο των περιπτώσεων ΟΜΛ) (Smith et al., 2006). Α7.2.4 ΜLL Το γονίδιο MLL (11q23) κωδικοποιεί την παραγωγή ενός µεταγραφικού παράγοντα µε ειδικότητα δράσης στα προγονικά αιµοποιητικά κύτταρα. Η παρουσία µερικού αναδιπλασιασµού (partial tandem duplication, PTD) του MLL ανιχνεύεται στο 10% περίπου των ενηλίκων ασθενών µε CN-AML (5% περίπου του συνόλου των περιπτώσεων ΟΜΛ). Πιο συγκεκριµένα, πρόκειται για διπλασιασµό της περιοχής του 40

44 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ γονιδίου η οποία περιλαµβάνεται µεταξύ των εξονίων 5 και 11 και στη συνέχεια ενσωµάτωσή της στο ιντρόνιο 4. Από κλινική άποψη, κάποιες µελέτες έχουν συσχετίσει την παρουσία του MLL/PTD σε ασθενείς µε CN-AML, µε ελάττωση της διάρκειας της πλήρους ύφεσης µετά από συµβατική Χ/Θ µε αποτέλεσµα ελαττωµένη επιβίωση χωρίς εξέλιξη νόσου. (Weisser et al., 2005). Οι µεταλλάξεις που έχουν µέχρι σήµερα ταυτοποιηθεί στα παραπάνω γονίδια µας επιτρέπουν να αποκρυπτογραφήσουµε τη γενετική ποικιλότητα εντός των κυτταρογενετικών οµάδων, ιδίως εντός της µεγάλης και ετερογενούς οµάδας των ασθενών µε φυσιολογικό καρυότυπο (CN-ΑΜL). Η πρόγνωση των φυσιολογικών καρυοτύπων εξαρτάται από µεταλλάξεις στα γονίδια NPM1, CEBRA και FLT3 όταν εµφανίζονται µεµονωµένες ή σε συνδιασµό (Kottaridis et al., 2001). Ασθενείς µε φυσιολογικό καρυότυπο που φέρουν µεταλλάξεις στο γονίδιο FLT3, παρουσιάζουν δυσµενή πρόγνωση ενώ όλες πλέον οι µελέτες συµφωνούν για τη θετική προγνωστική αξία της παρουσίας των ΝΡΜ1 µεταλλάξεων µε ταυτόχρονη απουσία του FLT3/ITD. Ασθενείς µε NPM1(-)/FLT3-ITD(+) έχουν τη χειρότερη πρόγνωση, ενώ ασθενείς µε NPM1(+)/FLT3-ITD(+) και NPM1(-)/FLT3-ITD(-) παρουσιάζουν ενδιάµεση πρόγνωση (Nakao et al., 1996; Dohner et al., 2005). Πρόσφατες µελέτες συµφωνούν για τη θετική προγνωστική αξία των µεταλλάξεων του γονιδίου CEBPA στους ασθενείς µε CN-AML. Παραµένει όµως ακόµα ανοιχτό το ερώτηµα αν η παρουσία FLT3 µεταλλάξεων δυσχεραίνει την πρόγνωση σε ασθενείς µε µεταλλαγµένο το γονίδιο CEBPA (Wouters et al., 2009). Τέλος οι µεταλλάξεις στο γονίδιο MLL θεωρούνται γενικά κακής πρόγνωσης είτε εµφανίζονται µεµονωµένες είτε σε συνδιασµό µε το FLT3/ITD (Schnittger et al., 2000; Dohner et al., 2002). Α.8. ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΠΡΟ ΙΑΘΕΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑΠΤΥΞΗ OMΛ Τα τελευταία χρόνια έχει δοθεί ιδιαίτερη έµφαση στην ανάδειξη γενετικών, επιγενετικών και περιβαλλοντικών παραγόντων που εµπλέκονται στην ανάπτυξη ΟΜΛ. Όσον αφορά τους γενετικούς παράγοντες, τα αποτελέσµατα των σχετικών ερευνών συγκλίνουν στο ότι οι γενετικοί πολυµορφισµοί γονιδίων που εµπλέκονται στην προστασία των κυττάρων από τοξικούς παράγοντες και στην επιδιόρθωση βλαβών του DNA προδιαθέτουν γενετικά τα άτοµα για την ανάπτυξη ΟΜΛ. Οι 41

45 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ πολυµορφισµοί αυτοί αφορούν αλλαγές στην αλληλουχία του DNA (πολλαπλά αλληλόµορφα) που εµφανίζονται στο γενικό πληθυσµό µε συχνότητα µεγαλύτερη από 1%. Οι γενετικοί πολυµορφισµοί, σε ποσοστό 10%, αφορούν ενθέσεις ή ελλείψεις νουκλεοτιδίων, µικροδορυφορικές αλληλουχίες και ψευδογονίδια, ενώ σε ποσοστό 90% αφορούν αλλαγές ενός µόνο νουκλεοτιδίου (Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs). Πολυµορφισµοί σε κωδικοποιούσες περιοχές του γονιδιώµατος οδηγούν πιθανώς σε αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης και κατ επέκταση σε µείωση ή ολική απώλεια της ενζυµατικής δράσης, µε αποτέλεσµα την ανεπαρκή αποτοξικοποίηση ή/και επιδιόρθωση του DNA, αντίστοιχα. Α.9 ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΑΠΟΤΟΞΙΚΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΟΞΙΚΩΝ ΠΑΡΑΓΟΝΤΩΝ Για να εκδηλώσει µια ουσία την τοξική της δράση θα πρέπει η ίδια ή τα προϊόντα βιοµετατροπής της να φθάσουν στα όργανα-στόχους και να παραµείνουν εκεί, σε επαρκείς συγκεντρώσεις, για ικανό χρονικό διάστηµα. Η βιοµετατροπή τόσο των ενδογενών όσο και εξωγενών τοξικών ουσιών συµβαίνει µε τις ίδιες οδούς και χωρίζεται σε δύο φάσεις, τις φάσεις αποτοξικοποίησης Ι και ΙΙ (detoxification phase Ι and II). Στη φάση Ι αποκαλύπτονται προϋπάρχουσες λειτουργικές οµάδες στο µόριο της ουσίας ή προστίθενται λειτουργικές οµάδες (-ΟΗ, -SH, -NH 2, -COOH) στο µόριό της µέσω αντιδράσεων οξείδωσης, αναγωγής ή υδρόλυσης. Στη Φάση ΙΙ µπορεί να οδηγηθεί η µητρική ουσία στα προϊόντα βιοµετατροπής της από τη Φάση Ι. Κατά τη Φάση ΙΙ συµβαίνουν συνθετικές (µεθυλίωση, ακετυλίωση, θείωση) ή συνδετικές αντιδράσεις µε ενδογενείς ουσίες του οργανισµού (γλυκουρονικό ή θειϊκό οξύ, γλουταθειόνη, κ.α.) (Watson et al., 1998). Οι αντιδράσεις αυτές επειδή είναι βιοσυνθετικές απαιτούν την κατανάλωση ενέργειας, η οποία προσφέρεται από ενδογενείς δότες υψηλής ενέργειας, µεταξύ των οποίων είναι και η γλουταθειόνη για το σχηµατισµό µερκαπτουρικών οξέων (µη τοξικοί µεταβολίτες). Η ισορροπία της δραστηριότητας των δύο φάσεων είναι κρίσιµη για το κύτταρο (Nebet και Dalton, 2006). Τα ένζυµα αποτοξικοποίησης και επιδιόρθωσης του DNA, το προστατεύουν από βλάβες που µπορούν να προκληθούν από ενδογενείς ή εξωγενείς παράγοντες. Όταν η 42

46 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ δράση των ενζύµων αυτών είναι µη αποτελεσµατική, µπορεί να προκληθεί χρωµοσωµική αστάθεια που οδηγεί σε σοβαρή βλάβη των κυτταρικών λειτουργιών και εν τέλει σε απόπτωση ή ογκογένεση. Πολυµορφισµοί που µεταβάλλουν την ενεργότητα των ενζύµων αποτοξικοποίησης και τις οδούς επιδιόρθωσης του DNA είναι πρωταρχικοί υποψήφιοι σε µελέτες που πραγµατοποιούνται για τη διερεύνηση της προδιάθεσης της ΟΜΛ (Nebet και Dalton, 2006).. Τα ένζυµα αποτοξικοποίησης φάσης Ι Η οξείδωση αποτελεί τον πιο κοινό τρόπο βιοµετατροπής τοξικών χηµικών ουσιών. Οι διάφορες οξειδώσεις λαµβάνουν χώρα στο ηπατικό µικροσωµατικό σύστηµα, µε τη βοήθεια του ενζυµικού συστήµατος του κυτοχρώµατος Ρ-450 (CYP- 450). Το σύστηµα αυτό αποτελείται κυρίως από δύο ένζυµα τα οποία είναι συζευγµένα µεταξύ τους: την αναγωγάση του κυτοχρώµατος Ρ-450, το οποίο έχει ως συν-παράγοντα το NADPH, και το κυττόχρωµα Ρ-450 το οποίο περιέχει αίµη (Εικόνα 15). Το ενζυµικό αυτό σύστηµα βρίσκεται στις µεµβράνες του ενδοπλασµατικού δικτύου (Ε..) οι οποίες ως γνωστόν είναι λιποπρωτεϊνικής σύστασης. Η παρουσία του ενζυµικού αυτού συστήµατος στο λιποπρωτεϊνικό υλικό είναι καθοριστικής σηµασίας, αφού τα λιπόφιλα υποστρώµατα (οι διάφορες ουσίες) εκλεκτικά κατανέµονται στις λιπιδικής φύσης µεµβράνες του ενδοπλασµατικού δικτύου όπου και µεταβολίζονται (Rendic, 2002) Σε πολλά από τα µέλη της οικογένειας των γονιδίων CYP έχουν εντοπιστεί γενετικοί πολυµορφισµοί οι οποίοι επηρεάζουν την λειτουργία των αντίστοιχων πρωτεϊνών και συµβάλλουν στην δηµιουργία γενετικής ποικιλοµορφίας µεταξύ των ατόµων. Πολλοί από τους προαναφερθέντες πολυµορφισµούς έχουν µελετηθεί στην ΟΜΛ ως πιθανοί παράγοντες κινδύνου εκδήλωσης της νόσου (Nebet και Dalton, 2006). 43

47 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Εικόνα 15. Καταλυτικός κύκλος κυτοχρώµατος Ρ450 Τα ένζυµα αποτοξικοποίησης φάσης ΙΙ Oι τρανσφεράσες της γλουταθειόνης S (Glutathione-S-tranferases, GSTs) είναι µία οικογένεια κυτταροπλασµατικών ενζύµων αποτοξικοποίησης φάσης ΙΙ. Τα υποστρώµατα τους είναι πολλά και περιλαµβάνουν περιβαλλοντικά µεταλλαξογόνα, φαρµακευτικές ουσίες και προϊόντα του οξειδωτικού στρες, τα οποία µπορεί να προέρχονται ή όχι από βιοµετατροπή προϊόντων της φάσης Ι. Ο τρόπος δράσης των ενζύµων της οικογένειας των GSTs είναι µέσω σύζευξης της τοξικής ουσίας µε τη γλουταθειόνη (Coles et al., 2001). Τα ένζυµα αυτά εκφράζονται σε όλους τους ιστούς (Terrier et al., 1990). Στον άνθρωπο, τα GSTs κατηγοριοποιούνται σε πέντε γονίδια µι (M1-M5), δύο γονίδια θήτα (T1-T2) και ένα γονίδιο πι (P1) (Voso et al., 2002). ύο µέλη της οικογένειας, προϊόντα πολυµορφισµού, τα γονίδια GSTMI και GSTT1 εµφανίζουν σε υψηλότερο ποσοστό γονότυπο µε οµόζυγο έλλειµµα του φυσιολογικού γονιδίου. Έχει βρεθεί ότι τα ελλείµµατα αυτά είναι υπεύθυνα για την ανάπτυξη καρκίνου στους πνεύµονες και την ουροδόχο κύστη, ενώ πρόσφατες µελέτες τα έχουν συσχετίσει και µε τη προδιάθεση για ανάπτυξη ΟΜΛ (Mossallam et al., 2006). Στην 44

48 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Καυκάσια φυλή, οµόζυγο έλλειµµα GSTM1(µ) εµφανίζεται στο 50% του πληθυσµού, ενώ οµόζυγο έλλειµµα GSTT1(θ) εµφανίζεται στο 20-38% του πληθυσµού (Terrier et al., 1990). Γενετικοί πολυµορφισµοί στα παραπάνω γονίδια µπορούν να τροποποιήσουν τη γονιδιακή έκφραση ελαττώνοντας ή ακόµα και µηδενίζοντας την ενζυµατική λειτουργία (Watson et al., 1998). Α9.1 ΓΟΝΙ ΙΑ CYP ΚΑΙ ΟΜΛ Το µικτό σύστηµα οξείδωσης του κυτοχρώµατος Ρ450 αποτελείται από τα κυριότερα ένζυµα µεταβολισµού των διαφόρων ουσιών της φάσης Ι. Αναφορικά µε την ονοµατολογία, τα ένζυµα του συµπλέγµατος του κυτοχρώµατος Ρ450 συµβολίζονται µε τα γράµµατα CYP. Στη συνέχεια ακολουθεί ένας αριθµός που υποδεικνύει την οικογένεια αυτού και ένα κεφαλαίο γράµµα που αναφέρεται στην υποοικογένεια, ενώ τέλος ακολουθεί και πάλι ένας αριθµός που αναφέρεται στο εξατοµικευµένο ένζυµο (πχ CYP3A4). Στον άνθρωπο, τα ένζυµα CYP1, CYP2 και CYP3 ευθύνονται για την πλειονότητα των φαρµακευτικών αντιδράσεων βιοµετασχηµατισµού και αποτελούν το 70% του περιεχοµένου κυτοχρώµατος Ρ450 στο ανθρώπινο ήπαρ (Mimura et al., 1993). Τα ένζυµα του κυτοχρώµατος Ρ450 (CYP), εµπλέκονται στον µεταβολισµό πολλών ενδογενών και εξωγενών παραγόντων (φάρµακα, βιοµόρια, ξενοβιοτικά). Η οικογένεια του κυτοχρώµατος P450 περιλαµβάνει περισσότερα από 50 ισοένζυµα µε κυριότερα µέλη τα CYP1A2, CYP2C9, CYP2C19, CYP2D6, CYP3A4 και CYP3A5 που κωδικοποιούνται από τα αντίστοιχα γονίδια. Μεταλλάξεις και πολυµορφισµοί των γονιδίων CYP µπορούν να προάγουν την ανάπτυξη καρκίνου, και άλλων ασθενειών ή µπορούν να δράσουν προστατευτικά για τον οργανισµό (D'Alò et al., 2004). Η γενετική ποικιλοµορφία των CYP γονιδίων δύναται να αλλάξει την βιοενεργότητα ορισµένων ξενοβιοτικών ουσιών καθώς και τα χηµικά και φυσιολογικά χαρακτηριστικά τους (Hayashi et al., 1991). Ορισµένα ξενοβιοτικά έχουν προκαρκινογόνο δράση και µπορούν να βρεθούν στην καθηµερινότητά µας (Voso et al., 2007). Πολλά προκαρκινογόνα µεταβολίζονται από τα ένζυµα CYP. Κάποια από αυτά βιοµετατρέπονται προς βιολογικά µη ενεργά ενδιάµεσα, ενώ κάποια άλλα προς 45

49 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ενεργούς ηλεκτροφιλικούς µεταβολίτες. Τα προκαρκινογόνα που µετά την βιοµετατροπή ενεργοποιούνται, αντιδρούν µε το DNA µη αντιστρεπτά προκαλώντας χρωµοσωµατικές αλλοιώσεις και καρκίνο (Hoffman et al., 2001). CYP2E1 Το γονίδιο CYP2E1 παρουσιάζει γενετικό πολυµορφισµό τύπου SNP που αφορά αντικατάσταση βάσης από κυτοσίνη σε θυµίνη στο 5' άκρο του εκκινητή (CYP2E1*5). Ο πολυµορφισµός αυτός συνδέεται µε την αύξηση της µεταγραφικής δραστηριότητας (Hayashi et al., 1991). Με πειράµατα που έγιναν µε ανοσοιστοχηµεία παρατηρήθηκε αυξηµένη έκφραση του πολυµορφισµού σε ασθενείς µε ΟΜΛ και inv(16) σε σχέση µε την ύπαρξη άλλων χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων. Φαίνεται δηλαδή ότι ο CYP2E1 πολυµορφισµός παίζει σηµαντικό ρόλο στην παθογένεση της ΟΜΛ µε inv(16) (Kanagal et al., 2012). CYP3A4 Το γονίδιο CYP3Α4 παρουσιάζει γενετικό πολυµορφισµό τύπου SNP που αφορά αντικατάσταση βάσης από αδενίνη σε γουανίνη στο 5' άκρο του υποκινητή (CYP3Α4*1Β) (Amirimani et al., 2003). Ο πολυµορφισµός αυτός αρχικά συσχετίσθηκε µε την αλλαγή ενός ρυθµιστικού στοιχείου στο πλαίσιο του υποκινητή µε αποτέλεσµα τη µείωση της ενεργότητας (Rebbeck et al., 1998). Περαιτέρω έρευνες σε πληθυσµό της Ιταλίας, έδειξαν ότι το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο βρίσκεται σε αυξηµένα ποσοστά σε ασθενείς µε ΟΜΛ σε σχέση µε τους υγιείς µάρτυρες. Εποµένως η παρουσία του πολυµορφισµού σχετίζεται άµεσα µε τη προδιάθεση ανάπτυξης ΟΜΛ (Kuehl et al., 2001). CYP3A5 Το γονίδιο CYP3A5 παρουσιάζει δύο πολυµορφισµούς τύπου SNP, τους CYP3A5*3 και CYP3A5*6, οι οποίοι προκαλούν εναλλακτικό µάτισµα και αλλοιωµένα πρωτεϊνικά προϊόντα, λόγω της απουσίας του CYP3A5 (Kuehl et al., 2001). Οι συχνότητες των πολυµορφισµών αυτών έχουν µελετηθεί σε ασθενείς µε ΟΜΛ σε πληθυσµό της Ινδίας. Βρέθηκε σηµαντική διαφορά στην κατανοµή των CYP3A5*3 και CYP3A5*6 αλληλοµόρφων µεταξύ ασθενών και µαρτύρων, ενώ η 46

50 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ ύπαρξη του πολυµορφισµού φαίνεται να παίζει σηµαντικό ρόλο και στην πρόγνωση των ασθενών (Nageswara et al., 2011). CYP2B6 Το γονίδιο CYP2B6 που κωδικοποιεί για ένα ένζυµο φάσης Ι, είναι µέλος της υπεροικογένειας του κυτοχρώµατος P450 και έχει χαρτογραφηθεί στο µεγάλο βραχίονα του χρωµοσώµατος 19 (19q.13.2) (Hoffman et al., 2001). Το µήκος του γονιδίου αυτού είναι 28kb και περιλαµβάνει 9 εξόνια και 8 ιντρόνια. Εικόνα 16. Ιδεόγραµµα χρωµοσώµατος 19 Οι Ρ450 πρωτεΐνες είναι µονο-οξυγενάσες που καταλύουν πολλές αντιδράσεις µεταβολισµού ενδογενών και εξωγενών παραγόντων (Rendic, 2002). H πρωτεΐνη CYP2B6, µεγέθους 48kDa, εκφράζεται στα µικροσώµατα του ήπατος, στα νεφρά, στο έντερο, στους πνεύµονες και στην τραχεία (Wang και Tompkins, 2008). Aρχικά θεωρήθηκε ότι το ανθρώπινο ένζυµο CYP2B6 αποτελεί µόλις το 1% του συνολικού Ρ450 ενζυµικού συστήµατος. Παρόλα αυτά, πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι η µέση συγκέντρωση του CYP2B6 στο συνολικό ηπατικό Ρ450 σύστηµα ανέρχεται από 2 έως 10% (Wang et al., 2006). To ένζυµο CYP2B6 παίζει πολύ σηµαντικό ρόλο στο µεταβολισµό πολλών ευρέως χρησιµοποιούµενων φαρµάκων, όπως είναι τα αντικαρκινικά, oι κυκλοφωσφαµίδες και ιφοσφαµίδες, τα αναισθητικά, αντινικοτινικά, αντιβιοτικά για το Parkinson, και η µεθαδόνη. Το ακριβές ποσοστό των φαρµάκων που µεταβολίζονται από το ένζυµο CYP2B6 δεν έχει πλήρως αποσαφηνιστεί µέχρι σήµερα, ωστόσο υπερβαίνει τις προηγούµενες εκτιµήσεις (Tmomas et al., 2000). 47

51 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Πολλά µετάγραφα του γονίδιου CYP2B6 έχουν περιγραφεί. Ωστόσο, δεν έχει διευκρινιστεί κατά πόσο αυτά παράγονται από το γονίδιο CYP2B6 ή από ένα στενά συνδεδεµένο ψευδογονίδιο, το CYP2B7. Τόσο το γονίδιο CYP2B6 όσο και το ψευδογονίδιο CYP2B7 βρίσκονται στη µέση ενός ψευδογονιδίου, του CYP2A στο χρωµόσωµα 19q (Gounden et al., 2010). Το ένζυµο αποτοξικοποίησης CYP2B6 παίζει σηµαντικό ρόλο στο µεταβολισµό ξενοβιοτικών, προστατεύοντας το κύτταρο από µεταλλάξεις που µπορεί να οδηγήσουν σε χρωµοσωµατικές αλλοιώσεις και καρκίνο. Το ένζυµο CYP2B6 λειτουργεί µέσω αντιδράσεων οξείδωσης, εισάγοντας ένα άτοµο οξυγόνου στο ενεργό υπόστρωµα, αποτοξικοποιώντας και µετατρέποντάς το σε ένα περισσότερο πολωµένο σύµπλεγµα. Η ενεργότητα του ενζύµου εξαρτάται από ένα γενετικό πολυµορφισµό τύπου SNP (A 785 G), καθώς η επακόλουθη αντικατάσταση µίας λυσίνης σε αργινίνη (Lys262Arg) επηρεάζει τη θερµική σταθερότητα της κωδικοποιούσας πρωτεΐνης και κατ επέκταση την καταλυτική ενεργότητα του ενζύµου. Έτσι, άτοµα ετερόζυγα (A/G) ή οµόζυγα (G/G) ως προς το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο έχουν µειωµένη συζευκτική ικανότητα σε σύγκριση µε τους οµοζυγώτες για το αλληλόµορφο αγρίου τύπου (Α/Α) (Gounden et al., 2010). Το γονίδιο CYP2B6 παρουσιάζει πολλούς πολυµορφισµούς τύπου SNP (single nucleoid polymorphism) που αλλάζουν την έκφραση ή ενεργότητα του ενζύµου. Ως εκ τούτου έχει αποτελέσει αντικείµενο εκτεταµένης έρευνας τα τελευταία χρόνια. Πρόσφατα συγκεντρώθηκαν συνολικά 29 διαφορετικά αλληλόµορφα του CYP2B6 γονιδίου στην ιστοσελίδα (Ηuman Cytochrome 450 Allele Nomenclature Commitee). Ο πολυµορφισµός CYP2B6 G516T που οδηγεί σε αντικατάσταση ενός αµινοξέος (Gln172His) έχει µελετηθεί εκτεταµένα στο εργαστήριό µας και έχει βρεθεί συσχέτιση µε την προδιάθεση ανάπτυξης συγκεκριµένων χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων ειδικών για την ΟΜΛ [-5/del(5q), -7/del(7q)]. Στην παρούσα εργασία θα µελετηθεί ο πολυµορφισµός Α 785 GCYP2B6. Ο Α 785 G CYP2B6 είναι ένας πολυµορφισµός τύπου SNP στη θέση 785 του cdna (A 785 G) (Εικόνα 17) που οδηγεί σε αντικατάσταση αµινοξέος (Lys262Arg), µε αποτέλεσµα τη µείωση της ενζυµικής ενεργότητας του ενζύµου CYP2B6. Πρόσφατες µελέτες έχουν συσχετίσει αυτόν τον πολυµορφισµό µε την προδιάθεση ανάπτυξης καρκίνου του µαστού, ενώ παρόµοιες µελέτες ασθενών-µαρτύρων για συσχέτιση του µε τη προδιάθεση ανάπτυξης οξείας µυελογενούς λευχαιµίας δεν έχουν πραγµατοποιηθεί. 48

52 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Nucleotide position C C C C C C A Α G G A C C T C A T C Εικόνα 17. Ο πολυµορφισµός Α 785 G εµφανίζεται στο νουκλεοτίδιο Νο στο γονίδιο CYP2B6. G Α10 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σκοπός της παρούσας διπλωµατικής εργασίας είναι η ανάδειξη του πιθανού ρόλου του πολυµορφισµού Α 785 G του γονιδίου αποτοξικοποίησης CYP2B6 στην προδιάθεση ανάπτυξης ΟΜΛ. Πιο συγκεκριµένα θα πραγµατοποιηθεί συσχετισµός των γονοτύπων του υπό µελέτη πολυµορφισµού µε τα δηµογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών (φύλο και ηλικία διάγνωσης ), την εµφάνιση των πιο συχνών ειδικών καρυοτυπικών αλλοιώσεων της ΟΜΛ καθώς και την πρόγνωση των ασθενών βάση καρυοτύπου. Η διερεύνηση και ο εντοπισµός γενετικών πολυµορφισµών γονιδίων αποτοξικοποίησης και επιδιόρθωσης του DNA, αναµένεται να συµβάλλουν στην βαθύτερη κατανόηση των παθογενετικών µηχανισµών της νόσου, και κατ επέκταση στην έγκαιρη πρόγνωση και στην αποτελεσµατικότερη θεραπεία, πράγµα που αποτελεί ίσως τον σηµαντικότερο στόχο των επιστηµόνων στον τοµέα αυτό σήµερα. 49

53 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 50

54 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Β1. Υλικά Το υλικό της µελέτης αυτής περιλαµβάνει δείγµατα µυελού των οστών 269 ασθενών µε πρωτοπαθή και δευτεροπαθή οξεία µυελογενή λευχαιµία και δείγµατα περιφερικού αίµατος 243 υγιών µαρτύρων. Πιο αναλυτικά το υλικό της µελέτης αποτέλεσαν: i) 269 δείγµατα µυελού των οστών από ενήλικες ασθενείς µε ΟΜΛ, τα οποία παρελήφθησαν από το Εργαστήριο Υγειοφυσικής, Ραδιοβιολογίας και Κυτταρογενετικής του Ινστιτούτου ΙΠΡΕΤΕΑ του ΕΚΕΦΕ ΗΜΟΚΡΙΤΟΣ. Τα δείγµατα παρελήφθησαν προκειµένου να ελεγχθούν για την ύπαρξη κλωνικών δοµικών και/ή αριθµητικών χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων. Η διάγνωση της ΟΜΛ πραγµατοποιήθηκε σε ελληνικά Νοσοκοµεία και µας δόθηκαν όλα τα δηµογραφικά και κλινικά στοιχεία των ασθενών. ii) 243 δείγµατα περιφερικού αίµατος υγιών µη-συγγενικών ατόµων ελληνικής καταγωγής αντίστοιχης ηλικίας και φύλου, τα οποία παραπέµπονται στο Ιατρείο του Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. «ηµόκριτος» για τακτικό αιµατολογικό έλεγχο. Β2 Οργανολογικός Εξοπλισµός Οι κύριες συσκευές και τα όργανα που χρησιµοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή της πειραµατικής πορείας είναι τα ακόλουθα: 1. Οπτικό µικροσκόπιο µε ικανότητα µεγέθυνσης 100Χ 1000Χ 2. Απαγωγός κάθετης ροής (Laminar Flow Hood) 3. Επωαστικός Κλίβανος διοξειδίου του άνθρακα (37 ο C, 5% CO 2 ) 4. Επιτραπέζια µικροφυγόκεντρος 5. Ηλεκτρονικός ζυγός ακριβείας τεσσάρων δεκαδικών ψηφίων 6. Λογισµικό πρόγραµµα ανάλυσης εικόνας καρυοτύπου, Ikaros 7. Θερµικός κυκλοποιητής LightCycler, Roche 8. CFX96 Real-Time PCR System, Bio-Rad 9. Συσκευή ηλεκτροφόρησης Horizon BibcoBRL 10. Τράπεζα υπεριώδους φωτός TFX-20M UV Transilluminator, BibcoBRL 51

55 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Β3 Αντιδραστήρια και ιαλύµατα Τα αντιδραστήρια που χρησιµοποιήθηκαν για τη διεξαγωγή της πειραµατικής πορείας είναι τα ακόλουθα: 1. Qiamp DNA-extraction midikit, Qiagen, Hilden, Germany 2. HotstarTaq Master Mix Kit, Cat. No: , Qiagen, Hilden, Germany 3. εοξυνουκλεοτίδια datp, dctp, dgtp, και dttp, cat. N0446S, New England BioLabs 4. Certified Molecular Biology Agarose, cat , Bio-Rad Laboratories 5. GelRed TM Nucleic Acid Gel Stain, Biotium, USA. 6. Tris, Molecular Biology Grade, A 2264, Applichem, 1000µg/ml 7. Ethylenediamine-tetraacetic acid (EDTA), Sigma - Aldrich 8. Acetic Acid (CH3COOH MW= 60,05g/mol), J.T. Baker 9. Φάγος φχ174 DNA-HaeIII Digest, cat. N3026S, New England BioLabs 10. GoTaq Plexor qpcr System, cat. A4031, Promega, USA 11. Περιοριστική ενδονουκλεάση Hae II, R0107S, New England BioLabs Περιοριστική ενδονουκλεάση Sty I, R0500S, New England BioLabs 12. Εκκινητές για την ενίσχυση του γονιδίου CYP2B6 µε συµβατικό PCR (οι αλληλουχίες αναγράφονται στον πίνακα ) 13. Σηµασµένοι εκκινητές για την ενίσχυση του γονιδίου CYP2B6 µε PCR πραγµατικού χρόνου (οι αλληλουχίες αναγράφονται στον πίνακα ) 14. Θρεπτικό υλικό MC Coy s 5A modified medium (1x) για καλλιέργεια ανθρώπινων κυττάρων 15. Εµβρυϊκός ορός µόσχου-featal Calf Serum (FCS) 16. ιάλυµα αντιβιοτικών: Penicillin/Streptomycin 17. L-γλουταµίνη (20mM) 18. ιάλυµα κολσεµιδίου σε PBS συγκέντρωσης 10µg/ml 19. Χλωριούχο Κάλιο (KCL) σε σκόνη (MW=74,56g/mol) 20. Μεθανόλη (CH 4 O, MW= 32,44g/mol) 21. Ισοτονικό διάλυµα θρυψίνης σε PBS: Trypsin/EDTA 0.05%/0.02% in PBS 22. ιάλυµα χρώσης χρωµοσωµατικών παρασκευασµάτων Giemsa (Giemsa Azur- Eosin-Methylene Blue Solution) 23. Ρυθµιστικό διάλυµα Sorensen (ph 6.8) σε ταµπλέτες 52

56 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ 24. Υλικό επικόλλησης καλυπτρίδων (Entellan) 25. Συνθετικό κεδρέλαιο για οπτικό µικροσκόπιο Τα διαλύµατα που παρασκευάστηκαν για τη διεξαγωγή της πειραµατικής πορείας είναι τα ακόλουθα: 1. 10x TΑE (Tris-Acetic-EDTA) 0,4Μ Tris 1,14% Acetic Acid 0,01M EDTA 2. Πλήρες θρεπτικό υλικό για κυτταροκαλλιέργειες (V=500ml) 440ml McCoy s 5A 50ml Εµβρυϊκός ορρός µόσχου (FCS-Featal Calf Serum) 5ml L-γλουταµίνη (200mM 5ml ιάλυµα αντιβιοτικών Penicillin/Streptomycin, 10000U/10000µg/µl 3. Υποτονικό διάλυµα KCL (75mM) ιάλυση 0,56g Χλωριούχου Καλίου (KCL) σε 100mL απεσταγµένου νερού 4. 3:1 ιάλυµα Μονιµοποίησης Carnoy s (Μεθανόλη/Οξικό οξύ) (V=120ml) 90mL Μεθανόλη (Methanol CH 4 O) 30mL Οξικού (Acetic Acid glacial, CH 3 COOH) 5. ιάλυµα χρώσης της Giemsa 1 δισκίο Sorensen phosphate buffer διαλύεται σε 1L απεσταγµένο νερό (10x). Aκολουθεί µία δεκαδική αραίωση σε απεσταγµένο νερό (1x). Σε 70ml διαλύµατος Sorensen 1x (ph=6.8) προστίθενται 2ml Giemsa (C τελ =5%). Β4 Μέθοδοι Στην παρούσα εργασία µελετήθηκαν ασθενείς µε πρωτοπαθή ή δευτεροπαθή ΟΜΛ και υγιείς µη-συγγενείς των δοτών, αντίστοιχης ηλικίας και φύλου, όπου αποµονώθηκε ολικό γενωµικό DNA (genomic DNA, gdna) από τα κύτταρα µυελού των οστών των ασθενών και περιφερικού αίµατος των µαρτύρων. Η γονοτυπική ανάλυση του πολυµορφισµού Α785G του γονιδίου CYP2B6 πραγµατοποιήθηκε µε δύο µεθόδους, τη µέθοδο ανίχνευσης πολυµορφισµών µε πέψη µε ένζυµα περιορισµού (Restricted Fragment Length Polymorphism, RFLP) και µε τη µέθοδο PCR πραγµατικού χρόνου (Real-Time PCR). Στη συνέχεια υπολογίστηκαν οι συχνότητες του υπό µελέτη πολυµορφισµού και συσχετίσθηκαν µε τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών και τα καρυοτυπικά ευρήµατα. 53

57 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Β4.1 Κλασσική Κυτταρογενετική Καρυότυπος Η µεθοδολογία της κλασσικής κυτταρογενετικής που ακολουθήθηκε περιλαµβάνει την παραλαβή και καλλιέργεια κυττάρων µυελού των οστών, τη συλλογή και µονιµοποίηση των κυττάρων, την προετοιµασία των χρωµοσωµατικών παρασκευασµάτων για κυτταρογενετική ανάλυση, τη ζωνοποίηση των χρωµοσωµάτων µε τη µέθοδο G-banding-Trypsin-Giemsa (GTG banding) και τέλος τη µικροσκοπική και καρυοτυπική ανάλυση των παρασκευασµάτων. Οι καρυότυποι περιγράφηκαν σύµφωνα µε το διεθνές σύστηµα ονοµατολογίας για τη περιγραφή καρυοτύπων (ISCN 2013). Βάσει καρυοτύπου, οι ασθενείς κατηγοριοποιηθήκαν σύµφωνα µε το International Prognosis Scoring System (IPSS 2013) σε τρεις υποοµάδες: καλής, κακής και ενδιάµεσης πρόγνωσης. Β4.1.1 Παραλαβή και καλλιέργεια κυττάρων Πιο αναλυτικά, από κάθε ασθενή, συλλέγεται δείγµα µυελού των οστών 2-3mL υπό άσηπτες συνθήκες σε ηπαρινισµένο σωληνάριο και εν συνεχεία αποστέλλεται στο Εργαστήριο Υγειοφυσικής, Ραδιοβιολογίας και Κυτταρογενετικής του ΕΚΕΦΕ «ηµόκριτος». Για κάθε δείγµα πραγµατοποιούνται δύο ανεξάρτητες καλλιέργειες διάρκειας 24 και 48 ωρών. Σε κάθε καλλιέργεια, προστίθενται ~0,5ml µυελού των οστών σε φλάσκα καλλιέργειας 25cm 2 που περιέχει 5mL πλήρες θρεπτικό υλικό McCoy s. Oι καλλιέργειες µεταφέρονται σε επωαστικό κλίβανο στους 37 C (±0.2 C) και σε ατµόσφαιρα 5% (±0.1%) CO 2. Η θερµοκρασία των 37 C (±0.2 C) είναι απαραίτητη για τη φυσιολογική αύξηση και τον πολλαπλασιασµό των κυττάρων, ενώ το ποσοστό 5% CO 2 (±0.1%) στον αέρα απαιτείται για την επίτευξη κατάλληλου ph ( ) στις καλλιέργειες, διατηρώντας την συγκέντρωση διττανθρακικών ανιόντων και µερικής πίεσης CO 2 σε ισορροπία. Β4.1.2 Συλλογή και µονιµοποίηση κυττάρων 1. Μία ώρα πριν τη λήξη της επώασης κάθε καλλιέργειας (24h ή 48h) προστίθεται 50µl κολσεµίδιο σε τελική συγκέντρωση 0.02µg/ml. To κολσεµίδιο αναστέλλει την πρωτεϊνοσύνθεση των µικροσωληνίσκων της µιτωτικής ατράκτου και καθυστερεί 54

58 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ τον αποχωρισµό των κεντροµεριδίων, µε αποτέλεσµα να αυξάνεται το ποσοστό των κυττάρων που βρίσκονται στη φάση της µετάφασης. Αξίζει να σηµειωθεί ότι τα επιτρεπτά όρια δράσης του κοσλεµιδίου είναι 1-3 ώρες. Η δράση για µικρό χρονικό διάστηµα έχει ως αποτέλεσµα ο αριθµός των µεταφασικών κυττάρων να µην είναι ικανοποιητικός και επαρκής, παρόλο που η µορφολογία των χρωµοσωµάτων είναι καλή. ράση για µεγάλο χρονικό διάστηµα έχει ως αποτέλεσµα την εµφάνιση µεταφάσεων µε συσταλµένα χρωµοσώµατα, στα οποία είναι δύσκολη η ζωνωποίηση και η ανάλυσή τους. 2. Μετά το πέρας της επώασης, τα κύτταρα µεταφέρονται σε ειδικό σωληνάριο (Falcon 14mL) και φυγοκεντρούνται για 10min στις 1300rpm (στροφές/min). 3. Ακολουθεί απόχυση του υπερκείµενου και προσθήκη 8-10mL υποτονικού διαλύµατος KCl (75mM), έτσι ώστε να επιτευχθεί η διόγκωση των κυττάρων, λόγω της διαφοράς στην οσµωτική πίεση µεταξύ ενδοκυττάριου και εξωκυττάριου χώρου. Είναι γνωστό ότι η απελευθέρωση των χρωµοσωµάτων πραγµατοποιείται χωρίς να διαταραχθούν τα κεντροµερίδια. Περιορισµένη ή παρατεταµένη επώαση µε υπότονο διάλυµα θα είχε ως αποτέλεσµα µη διόγκωση ή βίαιο σπάσιµο των κυτταρικών µεµβρανών, αντίστοιχα, και εποµένως η καταµέτρηση του διπλοειδούς αριθµού των χρωµοσωµάτων (2n) των φυσιολογικών κυττάρων θα ήταν ιδιαίτερα δύσκολη. 4. Ακολουθεί φυγοκέντρηση για 10 min στις 1300 rpm (στροφές/min) και απόχυση του υπερκείµενου, ενώ στη συνέχεια στάγδην προσθήκη 8-10ml διαλύµατος Carnoy s (µεθανόλη/οξικό οξύ, 3/1) που επιτρέπει τη µονιµοποίηση των κυττάρων. Β4.1.3 Προετοιµασία των χρωµοσωµατικών παρασκευασµάτων για κυτταρογενετική ανάλυση Η επίστρωση του χρωµοσωµατικού υλικού γίνεται µε 1-2 σταγόνες εναιωρήµατος κυττάρων πάνω σε καθαρή και υγρή αντικειµενοφόρο πλάκα. Οι πλάκες αφήνονται να στεγνώσουν σε θερµοκρασία δωµατίου. Για κάθε δείγµα που προορίζεται για κυτταρογενετική ανάλυση επιστρώνονται τέσσερεις αντικειµενοφόροι πλάκες, δύο από κάθε καλλιέργεια. Για λόγους τήρησης του απορρήτου, Σε κάθε πλακάκι αναγράφεται : - Ο εργαστηριακός κωδικός του δείγµατος - Η ηµεροµηνία παραλαβής του δείγµατος 55

59 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ - Το ονοµατεπώνυµο του ασθενή - Τα αρχικά BM αν πρόκειται για δείγµα µυελού των οστών Η διάρκεια της καλλιέργειας και ο αριθµός του πλακακίου Η ποιότητα των πλακακίων (πυκνότητα πυρήνων, ανάπτυξη µεταφάσεων) ελέγχεται µε παρατήρηση στο οπτικό µικροσκόπιο αντίθετης φάσης. Τέλος, τα πλακάκια επωάζονται στους 90 C για 1h σε ξηρό κλίβανο, προκειµένου να επιτευχθεί η παλαίωση των χρωµοσωµατικών παρασκευασµάτων. Β4.1.4 Ζωνοποίηση χρωµοσωµάτων: µέθοδος GTG Για τον προσδιορισµό των χρωµοσωµάτων και την ανάλυση της δοµής τους χρησιµοποιήθηκε η ζώνωση G ως µέθοδος χρώσης. Η ζώνωση G αυτή αποτελεί την πλέον διαδεδοµένη µέθοδο χρώσης. Περιλαµβάνει κατεργασία των χρωµοσωµάτων µε θρυψίνη για να µετουσιωθούν οι χρωµοσωµατικές πρωτεΐνες, και χρώση µε Giemsa (G-banding-Trypsin-Giemsa, GTG). Κάθε ζεύγος χρωµοσωµάτων χαρακτηρίζεται από µία συγκεκριµένη και σταθερή αλληλοδιαδοχή σκουρόχρωµων και ανοικτόχρωµων ζωνών (ζώνες G). Στην παρακάτω εικόνα (Εικόνα 16) απεικονίζονται διαγραµµατικά η ζώνωση G ανθρώπινων χρωµοσωµάτων µε 550 περίπου ζώνες ανά απλοειδή καρυότυπο. Τα στάδια της µεθόδου είναι τα εξής: 1. Τα κύτταρα επωάζονται σε ισοτονικό διάλυµα θρυψίνης 0.05% για 1min και κατόπιν το ένζυµο αποµακρύνεται µε έκπλυση µε φυσιολογικό ορό. 2. Ακολουθεί χρώση των παρασκευασµάτων σε διάλυµα Giemsa για 15 min (Seabright, 1971). 3. Στη συνέχεια πραγµατοποιείται πλύση µε νερό και τα πλακάκια αφήνονται να στεγνώσουν. 4. Ακολουθεί προσθήκη 2 σταγόνων Edelant σε κάθε αντικειµενοφόρο πλάκα και τοποθέτηση της καλυπτρίδας (24x50mm). Β4.1.5 Μικροσκοπική παρατήρηση και καρυοτυπική ανάλυση χρωµοσωµατικών παρασκευασµάτων Τα χρωµοσωµατικά παρασκευάσµατα µελετώνται σε οπτικό µικροσκόπιο (Zeis- Axioscop 40) συνδεδεµένο µε ψηφιακή κάµερα µικροσκοπίου και µε λογισµικό σύστηµα ψηφιακής εικόνας IKAROS, της εταιρίας Metasystems. Με τη χρήση του αντικειµενικού φακού 10x, σαρώνεται η αντικειµενοφόρος πλάκα και ανιχνεύονται οι 56

60 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ περιοχές που φέρουν µεταφάσεις µε σχετικά καλή µορφολογία και άπλωµα χρωµοσωµάτων καθώς και µε µη απαγορευτικό για την ανάλυση αριθµό αλληλεπικαλυπτόµενων χρωµοσωµάτων. Με τη χρήση του καταδυτικού φακού 100x µεγενθύνουµε τη µετάφαση που έχουµε επιλέξει για καρυοτύπηση την οποία και αποθηκεύουµε σε ηλεκτρονική µορφή. Για κάθε ασθενή µε αιµατολογική κακοήθεια, πλήρης καρυοτυπικός έλεγχος µυελού θεωρείται η ανάλυση 20 µεταφάσεων όταν ανιχνεύεται κλωνική αλλοίωση ή 25 µεταφάσεων όταν ο καρυότυπος είναι φυσιολογικός. Ο καρυότυπος περιγράφεται σύµφωνα µε το ισχύον αναθεωρηµένο σύστηµα κυτταρογενετικής ονοµατολογίας ανθρώπου ISCN 2013 (International System for Human Cytogenetic Nomenclature 2013). Για τη στοιχειοθέτηση αλλοιωµένου κυτταρογενετικού κλώνου απαιτείται η ανίχνευση τουλάχιστον δύο κυττάρων µε την ίδια αλλοίωση, όταν πρόκειται για δοµική αλλοίωση ή τρισωµία, ενώ θα πρέπει να ανιχνευθούν τουλάχιστον τρία κύτταρα µε την ίδια αλλοίωση όταν πρόκειται για µονοσωµία. Εικόνα 19. ιαγραµµατική απεικόνιση της ζώνωσης G ανθρώπινων χρωµοσωµάτων, µε 550 περίπου ζώνες ανά απλοειδή καρυότυπο. Τα χρωµοσώµατα αναπαριστώνται ως µονοχρωµατιδικές δοµές και όχι µε δύο χρωµατίδες όπως φαίνονται τα µιτωτικά χρωµοσώµατα στο µικροσκόπιο. Τα κεντροµερή (πρωτογενείς περισφύξεις) 57

61 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ υποδηλώνονται µε τις σκούρες στικτές περιοχές. Οι ανοικτόχρωµες στικτές περιοχές δείχνουν τις ζώνες στικτής χρώσης και συχνά αντιστοιχούν σε θέσεις ετεροµορφισµών. Β4.2 Μελέτη του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 Ο πολυµορφισµός A 785 G (rs ) του γονιδίου CYP2B6 µέλος της υπεροικογένειας του κυτοχρώµατος Ρ450 (CYP) αφορά αντικατάσταση βάσης στη θέση 785 του cdna (A 785 G) που έχει ως αποτέλεσµα την αλλαγή του 262 ου αµινοξέος από λυσίνη (Lys) σε αργινίνη (Arg). Η διερεύνηση του ρόλου του υπό µελέτη πολυµορφισµού στην προδιάθεση εµφάνισης ΟΜΛ στον Ελληνικό πληθυσµό πραγµατοποιήθηκε παράλληλα µε τη µελέτη σε υγιείς-µάρτυρες (Case-Control Study). Για το σκοπό αυτό, αποµονώθηκε ολικό γενωµικό DNA ασθενών και µαρτύρων και πραγµατοποιήθηκε γονοτυπική ανάλυση προκειµένου να υπολογιστούν οι συχνότητες των φυσιολογικών και µεταλλαγµένων αλληλοµόρφων στις δύο οµάδες. Η γονοτυπική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε παράλληλα µε τη µέθοδο ανίχνευσης πολυµορφισµών µήκους τµηµάτων περιορισµού (Restricted Fragment Length Polymorphism, RFLP) και τη µέθοδο PCR πραγµατικού χρόνου (Real-Time PCR). Τέλος, οι συχνότητες των αλληλοµόρφων του υπό µελέτη πολυµορφισµού συσχετίσθηκαν µε τα κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών και τα καρυοτυπικά ευρήµατα. Β4.2.1 Αποµόνωση γενωµικού DNA Ολικό γενωµικό DNA (gdna) αποµονώθηκε από δείγµατα µυελού των οστών ασθενών µε οξεία µυελογενή λευχαιµία (ΟΜΛ) και από ολικό περιφερικό αίµα υγιών ατόµων µε το kit Gentra Puregene της Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany) σύµφωνα µε τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από την αποµόνωση, το DNA επαναιωρήθηκε σε Tris-EDTA, ph 8.0 και αποθηκεύτηκε στους -20 C. Β4.2.2 Γονοτυπική ανάλυση του πολυµορφισµού A 785 G µε PCR-RFLPs Αρχικά, τµήµα του γονιδίου CYP2B6 που περιλαµβάνει τον υπό µελέτη πολυµορφισµό ενισχύεται in vitro µε τη µέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) και στη συνέχεια το προϊόν της αντίδρασης PCR επωάζεται µε το περιοριστικό ένζυµο StyI δηµιουργώντας 58

62 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ θραύσµατα DNA διαφορετικού µήκους ανάλογα µε την παρουσία ή απουσία του πολυµορφισµού A 785 G. Τα µεγέθη των θραυσµάτων που δηµιουργούνται από τη δράση του περιοριστικού ενζύµου ταυτοποιούνται µε οριζόντια ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης. Πιο συγκεκριµένα, η ενίσχυση του γονιδίου CYP2B6 έλαβε χώρα στον θερµοκυκλοποιητή C1000 TM Thermal Cycler της BIO-RAD. Για την πραγµατοποίηση της αντίδρασης χρησιµοποιήθηκε η HotStarTaq DNA πολυµεράση της Qiagen (Qiagen, Hilden, Germany). Συνοπτικά, λαµβάνει χώρα ενεργοποίηση της θερµοανθεκτικής πολυµεράσης µε αποδιάταξη στους 94 C για 3 min, στη συνέχεια πραγµατοποιούνται 35 κύκλοι αλυσιδωτής αντίδρασης πολυµεράσης (αποδιάταξη στους 94 C για 45 sec, υβριδοποίηση στους 55 C για 45 sec και επιµήκυνση των υβριδισµένων εκκινητών στους 72 C για 60 sec). Τέλος λαµβάνει χώρα η τελική επιµήκυνση των προϊόντων στους 72 C για 10 min. Οι συγκεντρώσεις των εκκινητών στην αντίδραση είναι 0,4 µμ ενώ οι αλληλουχίες που χρησιµοποιήθηκαν έχουν προηγουµένως περιγραφεί από τους Thomas Lang και συνεργάτες (Lang et al. 2000) και είναι οι εξής: Forward primer: 5 -GAC AGA AGG ATG AGG GAG GAA-3 (21nt) Reverse primer: 5 -CTC CCT CTG TCT TTC ATT CTG T-3 (21 nt) Το προϊόν της αντίδρασης PCR µήκους 640bp επωάζεται µε την περιοριστική ενδονουκλεάση Sty I του Salmonella typhi. To ένζυµο αυτό πέπτει το δίκλωνο DNA στη θέση της αλληλουχίας που φαίνεται παρακάτω: Η αντίδραση πραγµατοποιείται παρουσία 12 Units του ενζύµου Sty I, στους 37 C για 6h. Τα µεγέθη του προϊόντος της αντίδρασης ταυτοποιούνται µε οριζόντια ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης 2% που περιέχει 0.05µg/ml GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain (Biotium, USA). Η πέψη του φυσιολογικού αλληλοµόρφου δίνει 4 θραύσµατα µεγέθους 56 bp, 116bp, 171bp και 297 bp, ενώ η παρουσία της 59

63 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ µετάλλαξης Α 785 G οδηγεί σε 3 θραύσµατα µήκους 56 bp, 116bp και 468bp. (Εικόνα 20). (α) β) Εικόνα 20 (α) Αποτύπωση χρωµοσώµατος 19 µε έµφαση στο γενετικό τόπο του γονιδίου CYP2B6 19q13 (σκιασµένη περιοχή). Οι εκκινητές (For: forward και Rev: reverse) οριοθετούν µία περιοχή µήκους 642bp εσωτερικά του γονιδίου CYP2B6 που περιέχει τη θέση του υπό µελέτη πολυµορφισµού. Η περιοχή αυτή ενισχύεται και στη συνέχεια το προϊόν της αντίδρασης PCR επωάζεται µε την περιοριστική ενδονουκλεάση StyI και (β) 60

64 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Aπεικόνιση του πηκτώµατος ηλεκτροφόρησης των προϊόντων πέψης µε το περιοριστικό ένζυµο StyI για τον προσδιορισµό των γονοτύπων του γονιδίου CYP2B6 Β4.2.3 Γονοτυπική ανάλυση του πολυµορφισµού A 785 G µε Real-Time PCR Ο πολυµορφισµός Α 785 G του γονιδίου CYP2B6 µελετήθηκε παράλληλα και µε PCR πραγµατικού χρόνου. H αντίδραση PCR έλαβε χώρα στο σύστηµα LightCycler 2.0, χρησιµοποιώντας το LightCycler DNA Master Hybridization Probes Kit της εταιρίας Roche (Roche, Mennheim, Germany). Το Light-Cycler είναι ένα ολοκληρωµένο σύστηµα που επιτρέπει γρήγορη διεξαγωγή της αντίδρασης PCR σε πραγµατικό χρόνο και παράλληλα την ποιοτική ή ποσοτική ανάλυση των προϊόντων µέσα στο ίδιο µίγµα αντίδρασης και εποµένως µειώνεται ο κίνδυνος επιµόλυνσης (Wittwer et al, 1997). Το σύστηµα αποτελείται από δύο βασικές µονάδες, (Α) το χώρο σε σχήµα κυλίνδρου όπου εκτελείται η PCR (thermal champer) και (Β) το φθοριόµετρο που περιλαµβάνει σύστηµα υψηλής ποιότητας φακών και φίλτρων για την καταγραφή σήµατος που εκπέµπει φθορίζουσα ουσία που ενσωµατώνεται στο προϊόν της PCR κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Οι αυξοµειώσεις της θερµοκρασίας στη µονάδα του Light-Cycler που εκτελείται η PCR επιτυγχάνονται χάρη στην εναλλαγή του θερµαινόµενου αέρα, µε αποτέλεσµα τη µείωση του χρόνου που απαιτείται για την ολοκλήρωση ενός κύκλου PCR (30 κύκλοι αντίδρασης σε λιγότερο από 20 λεπτά). Η PCR πραγµατοποιείται σε γυάλινα τριχοειδή, τα οποία τοποθετούνται σε δίσκο δειγµάτων (carousel) 32 θέσεων. Τα τριχοειδή λόγω της κατασκευής τους παίζουν ρόλο κυβέττας µέτρησης φθορισµού. Η ένταση του σήµατος από την φθορίζουσα ουσία -η οποία ενσωµατώνεται στο προϊόν της αντίδρασης- είναι ανάλογη της ποσότητάς του. Το σήµα φθορισµού που εκπέµπεται ανιχνεύεται και καταγράφεται µια φορά ανά κύκλο αντίδρασης PCR, µε αποτέλεσµα τη µέτρηση του προϊόντος που σχηµατίζεται και κατά συνέπεια την παρακολούθηση της πορείας της αντίδρασης σε πραγµατικό χρόνο. Για την ανίχνευση των προϊόντων της αντίδρασης PCR µέσω του φθοριοµέτρου χρησιµοποιείται η µέθοδος του υβριδισµού σε γειτονικές αλληλουχίες στο εσωτερικό του DNA µε τη χρήση δύο ανιχνευτών, σηµασµένων µε διαφορετικές χρωστικές (Hybridization probes format Fluorescence Resonance Energy Transfer-FRET). Οι 61

65 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ ανιχνευτές σχεδιάζονται ώστε να είναι συµπληρωµατικοί µε το προϊόν της αντίδρασης PCR. Το 5 άκρο του ενός ανιχνευτή (anchor) είναι σηµασµένο µε φθοριόχρωµα (FL 530) το οποίο όταν διεγείρεται εκπέµπει ακτινοβολία (hv 1 ), ενώ το 3 άκρο του δεύτερου παρακείµενου ανιχνευτή (sensor) είναι σηµασµένο µε φθοριόχρωµα (Cy5 ή LC Red 640), το οποίο απορροφά την hv 1 και εκπέµπει σε άλλο µήκος κύµατος (hv 2 ). Η µεταφορά της ενέργειας µεταξύ των γειτονικών ανιχνευτών (FRET) φαίνεται στην εικόνα 21. Ο ανιχνευτής anchor είναι ένα συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο (µήκους βάσεων) το οποίο έχει σχεδιαστεί έτσι ώστε να είναι συµπληρωµατικό στην αλληλουχία του τµήµατος DNA που ενισχύεται µε τη βοήθεια των εκκινητών της PCR. Ο ανιχνευτής sensor είναι επίσης συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο, συµπληρωµατικό στην αλληλουχία στόχο, στο τµήµα της οποίας εντοπίζεται η νουκλεοτιδική αλλαγή (πχ SNP), στην ανίχνευση της οποίας αποσκοπεί το σύστηµα. Οι δύο ανιχνευτές όταν υβριδίζονται στην αλληλουχία στόχο απέχουν µόλις 1-2 βάσεις µεταξύ τους. Έτσι επιτυγχάνεται η διέγερση του sensor από τον anchor µε αποτέλεσµα την ανίχνευση του φθορισµού (Livak et al, 1995). Εικόνα 21. Μεταφορά ενέργειας FRET µεταξύ γειτονικών ανιχνευτών. Η ταυτοποίηση των προϊόντων της PCR στο LightCycler είναι εφικτή µέσω του προσδιορισµού της θερµοκρασίας αποδιάταξης (Τm) των δίκλωνων µορίων DNA που σχηµατίζονται κατά την αντίδραση. Η θερµοκρασία τήξης (Τm) του δίκλωνου µορίου DNA εξαρτάται άµεσα από την αλληλουχία των νουκλεοτιδίων και αλλάζει σηµαντικά µε την αντικατάσταση έστω και µίας µόνο βάσης, µε αποτέλεσµα το τελικό σήµα να είναι ενδεικτικό της ύπαρξης ή όχι µετάλλαξης. Στο LightCycler το τµήµα του DNA που έχει ενισχυθεί µε PCR φθορίζει και εποµένως ο φθορισµός είναι ανάλογος της συγκέντρωσης του προϊόντος της αντίδρασης. Τα δείγµατα υπόκεινται σε σταδιακή αύξηση της θερµοκρασίας µε ρυθµό µεταβολής έως και 0,1 ο C/sec µε ταυτόχρονη λήψη µετρήσεων φθορισµού. Όταν το τµήµα DNA αναδιαταχτεί παύει να εκπέµπει έντονη ακτινοβολία µε συνέπεια την καταγραφή απώλειας φθορισµού από το λογισµικό (Ririe KM et al, 1997). Το λογισµικό παρέχει τη δυνατότητα γραφικής 62

66 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ αναπαράστασης της καµπύλης µεταβολής φθορισµού ανά 0,1 ο C (F/ T), µετασχηµατίζοντάς την στην καµπύλη αποδιάταξης (-df/dt), της οποίας η κορυφή ισούται µε την Tm του προϊόντος της PCR. ιαφορετικά προϊόντα αναπαριστώνται από καµπύλες των οποίων οι κορυφές αντιστοιχούν σε διαφορετικές θερµοκρασίες. Με αυτό τον τρόπο πραγµατοποιείται ο διαχωρισµός των ειδικών και µη ειδικών προϊόντων. Για τη διεξαγωγή της αντίδρασης χρησιµοποιήθηκαν 3µl γενωµικού DNA σε συνολικό όγκο αντίδρασης 20µl, που περιέχει έτοιµο µίγµα Light-Cycler DNA Master Hybridization Probes της Roche Diagnostics. Η αντίδραση της PCR στο Light-Cycler περιλαµβάνει ένα βήµα αποδιάταξης για 10 min στους 95 C, που ακολουθείται από 45 κύκλους 95 C για 10 sec, 60 C για 10 sec και 72 C για 15 sec. Οι εκκινητές χρησιµοποιήθηκαν σε συγκέντρωση 0.5 µμ και οι ανιχνευτές σε συγκέντρωση 0.2 µμ. Οι αλληλουχίες εκκινητών και ανιχνευτών, οι οποίες περιγράφονται στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 6), υβριδοποιούνται στο DNA στόχο, όπως φαίνεται στη σχηµατική απεικόνιση της εικόνας 22. Πίνακας 6. Αλληλουχίες εκκινητών και ανιχνευτών για τη γονοτυπική ανάλυση του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6. Ολιγονουκλεοτίδιο Σήµανση Αλληλουχία (5 3 ) Εκκινητής (F) - CAGGCAAGTTTACAAAAACCTG Εκκινητής (R) - CTCTCTCCCTCTGTCTTTCATTCTGTCT Ancor probe LC CCTCATCGACACCTACCTGCTCCACATG Sensor probe FL 530 ACCCCAGAGCCCCCAAGG--FL Εικόνα 22. Σχηµατική απεικόνιση της γενετικής θέσης του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 και θέσεις υβριδοποίησης των εκκινητών και των ανιχνευτών που χρησιµοποιούνται στην αντίδραση. 63

67 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Β. ΥΛΙΚΑ & ΜΕΘΟΔΟΙ Το T m των διαφορετικών αλληλοµόρφων (φυσιολογικό: A και µεταλλαγµένο: G) που προκύπτουν από την αντίδραση αναπαρίστανται γραφικά µε διαφορετικές καµπύλες αποδιάταξης (-df/dt). Η κορυφή της καµπύλης του φυσιολογικού αλληλοµόρφου A εµφανίζεται στους 63.0 ο C, ενώ η κορυφή της καµπύλης του µεταλλαγµένου αλληλοµόρφου G εµφανίζεται στους 54.0 ο C µε αποτέλεσµα αφενός να διαχωρίζονται τα αλληλόµορφα µεταξύ τους και αφετέρου να διαχωρίζονται από τυχόν µη ειδικά προϊόντα, όπως φαίνεται στην εικόνα 23. A allele: Tm=63 o C G allele: Tm=54 o C Εικόνα 23. Καµπύλες αποδιάταξης των τριών διαφορετικών γονοτύπων του CYP2B6. Η γαλάζια γραµµή αντιστοιχεί σε οµοζυγώτη για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (A/A), η κίτρινη γραµµή αντιστοιχεί σε ετεροζυγώτη (A/G) και η µώβ γραµµή αντιστοιχεί σε οµοζυγώτη για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G). Β4.2.4 Στατιστική επεξεργασία των αποτελεσµάτων Οι συχνότητες των γονοτύπων και των αλληλοµόρφων προσδιορίστηκαν στις οµάδες ασθενών και µαρτύρων και συγκρίθηκαν µε το στατιστικό µη-παραµετρικό τεστ χ 2 (Chi-Square test) χρησιµοποιώντας το στατιστικό πακέτο SPSS (SPSS v17.0). Ο έλεγχος έγινε βάσει 95% διαστήµατος εµπιστοσύνης (95% confidence interval) και επίπεδο σηµαντικότητας 5%. Τα γονοτυπικά ευρήµατα συσχετίστηκαν επιπλέον µε τα χαρακτηριστικά των ασθενών (φύλο, ηλικία) και τα κυτταρογενετικά ευρήµατα. 64

68 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 66

69 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ1. Κλασσική κυτταρογενετική ανάλυση ασθενών µε ΟΜΛ Aναλύθηκαν µε κλασσική κυτταρογενετική 269 δείγµατα µυελού των οστών (Bone Marrow, BM) από ενήλικες ασθενείς µε ΟΜΛ. Στον πίνακα 7 συνοψίζονται τα δηµογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών µε ΟΜΛ που επελέγησαν για την παρούσα µελέτη. Η υπό µελέτη οµάδα των ασθενών µε ΟΜΛ περιλάµβανε 156 άντρες (156/269, 57.9%) και 113 γυναίκες (113/269, 42.0%). Η µέση ηλικία διάγνωσης ήταν 57.4 χρόνια (εύρος έτη). Οι 169 από τους 269 ασθενείς (62.8%) ήταν άνω των 60 ετών (Πίνακας 7). Επιτυχής καρυοτυπική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε σε 265 από τους 269 ασθενείς (98.5%), ενώ η κυτταρογενετική ανάλυση των υπολοίπων (4/269, 1.4%) ήταν αδύνατη λόγω ελλείψεως µεταφάσεων. Από τους ασθενείς µε επιτυχή κυτταρογενετική ανάλυση, οι 201 (201/265, 75.8%) εµφάνισαν κλωνική καρυοτυπική αλλοίωση, ενώ οι υπόλοιποι καρυότυποι ήταν φυσιολογικοί (64/265, 24.2%). Σε κανέναν από τους αλλοιωµένους καρυοτύπους που µελετήθηκαν δεν ανιχνεύθηκαν αλλοιώσεις στη θέση 19q13.2, η οποία και αποτελεί το γενετικό τόπο του γονιδίου CYP2B6. Πίνακας 7. ηµογραφικά χαρακτηριστικά ασθενών µε OΜΛ και υγιών µαρτύρων Ασθενείς Μάρτυρες No Φύλο Άρρεν 156 (57.9%) 132 (54.3%) Θήλυ 113 (42.0%) 111 (45.6%) Ηλικία (έτη) (37.2%) 162 (66.6%) (62.8%) 81 (33.3%) 67

70 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Από τους 269 ασθενείς οι 220 εµφάνισαν πρωτοπαθή (de novo) ΟΜΛ (220/269, 81.7%) και οι 49 δευτεροπαθή ΟΜΛ (s-ομλ) (49/269, 18.2%). Στους de novo οι πιο συχνές χρωµοσωµατικές αλλοιώσεις ήταν η µονοσωµία ή η έλλειψη του µεγάλου βραχίονα του χρωµοσώµατος 7 [-7/del (7q)] σε ποσοστό 18.6%, η µονοσωµία ή η έλλειψη του µεγάλου βραχίονα του χρωµοσώµατος 5 [-5/del (5q)] σε ποσοστό 11.8%, η τρισωµία του χρωµοσώµατος 8 (+8) σε ποσοστό 10.5%, οι αλλοιώσεις του χρωµοσώµατος 11 (11q23) σε ποσοστό 6.8%, καθώς και η έλλειψη του φυλετικού χρωµοσώµατος Y (-Υ) σε ποσοστό 3.6%. Στους s-ομλ συχνότερη ήταν η µονοσωµία ή η έλλειψη του µεγάλου βραχίονα του χρωµοσώµατος 5 [-5/del (5q)] σε ποσοστό 16.3%, η µονοσωµία ή η έλλειψη του µεγάλου βραχίονα του χρωµοσώµατος 7 [-7/del (7q)] σε ποσοστό 12.2% καθώς και η αµοιβαία µετάθεση µεταξύ των χρωµοσωµάτων 9 και 22 [t(9;22)] σε ποσοστό 6.1%. Τα παραπάνω καρυοτυπικά ευρήµατα παρουσιάζονται στον πίνακα 8. Πίνακας 8. Kαρυοτυπικά χαρακτηριστικά ασθενών µε πρωτοπαθή OΜΛ και ασθενών µε δευτεροπαθή ΟΜΛ. Καρυότυπος de novo ΟΜΛ (220) s-ομλ (49) -7/del (7q) 41 (18.6%) 6 (12.2%) -5/del (5q) 26 (11.8%) 8 (16.3%) (10.5%) 0 11q23 15 (6.8%) 0 -Υ 8 (3.6%) 0 t(9;22) 4(1.8%) 3 (6.1%) Οι κυτταρογενετικές αλλοιώσεις που ανιχνεύθηκαν µε µεγαλύτερη συχνότητα ήταν η µονοσωµία ή η έλλειψη του µεγάλου βραχίονα του χρωµοσώµατος 7 [-7/del (7q)] σε ποσοστό 17.7%, η τρισωµία του χρωµοσώµατος 8 (+8) σε ποσοστό 15.8%, η µονοσωµία ή η έλλειψη του µεγάλου βραχίονα του χρωµοσώµατος 5 [-5/del (5q)] σε ποσοστό 12.8%, η αναστροφή του χρωµοσώµατος 16 [inv(16)] σε ποσοστό 5.3%, η αµοιβαία µετάθεση µεταξύ των χρωµοσωµάτων 8 και 21 [t(8;21)] σε ποσοστό 5.3%, 68

71 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ η αµοιβαία µετάθεση µεταξύ των χρωµοσωµάτων 15 και 17 [t(15;17)] σε ποσοστό 4.5% καθώς και η απώλεια του φυλετικού χρωµοσώµατος Y (-Υ) σε ποσοστό 3.0%. Βάσει καρυοτύπου, οι ασθενείς ταξινοµήθηκαν σε καλής (10.9%), ενδιάµεσης (50.9%) και κακής πρόγνωσης (38.1%). Τα παραπάνω καρυοτυπικά ευρήµατα παρουσιάζονται στον πίνακα 9. Πίνακας 9. Καρυοτυπικά χαρακτηριστικά ασθενών µε OΜΛ και υγιών µαρτύρων. [Οι υπολογισµοί των συχνοτήτων έγιναν βάσει του συνόλου των ασθενών µε επιτυχή καρυοτυπική ανάλυση (265/269)]. Καρυότυπος Ασθενείς Φυσιολογικός 64 (24.2%) Αλλοιωµένος 201 (75.8%) -7/del(7q) 47 (17.7%) (15.8%) -5/del(5q) 34 (12.8%) inv(16) 14(5.3%) t(8;21) 14(5.3%) t(15;17) 12(4.5%) t(9;22) 9(3.4%) -Y 8 (3.0%) Σύνθετος* 76 (28.7%) Οµάδες πρόγνωσης Καλή 29 (10.9%) Ενδιάµεση 135 (50.9%) Κακή 101 (38.1%) * 3 χρωμοσωματικές αλλοιώσεις απουσία των t(8;21), inv(16)/t(16;16), t(15;17), t(9;11), t(6;9), inv(3)/t(3;3) and t(1;22) 69

72 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ2. Μελέτη του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 Γ2.1 Γονοτυπική ανάλυση οµάδας ελέγχου (control group) Πραγµατοποιήθηκε γονοτυπική ανάλυση 243 δειγµάτων DNA περιφερικού αίµατος (peripheral blood, PB) υγιών µη-συγγενικών ατόµων ελληνικής καταγωγής για τον πολυµορφισµό A 785 G (rs ) του γονιδίου της υπεροικογένειας του κυτοχρώµατος Ρ450 (CYP2B6). Τα άτοµα που επελέγησαν ως µάρτυρες ήταν ελεύθερα αιµατολογικής ή άλλης νόσου. Η ηλικία και το φύλο των ατόµων της οµάδας ελέγχου ήταν αντίστοιχη της ηλικίας και του φύλου των ατόµων της οµάδας των ασθενών (Πίνακας 7). Η γονοτυπική ανάλυση πραγµατοποιήθηκε µε δύο µεθόδους, τη µέθοδο ανίχνευσης πολυµορφισµών µετά από πέψη µε περιοριστικά ένζυµα (Restricted Fragment Length Polymorphism, RFLP) και µε τη µέθοδο PCR πραγµατικού χρόνου (Real-Time PCR). Τα αποτελέσµατα των δύο µεθόδων ήταν πανοµοιότυπα. Από τους 243 υγιείς µάρτυρες, οι 180 (180/243, 74.1%) ήταν οµόζυγοι για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (A/A), οι 56 (56/243, 23.0%) ετερόζυγοι για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (Α/G) και οι 7 (7/243, 2.8%) οµόζυγοι για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G). Εικόνα 21. Συχνότητες γονοτύπων υγιών µαρτύρων της οµάδας ελέγχου για τον πολυµορφισµό A 785 G (rs ) του γονιδίου CYP2B6. Οι συχνότητες των δύο αλληλοµόρφων στον πληθυσµό των µαρτύρων υπολογίστηκαν σε (416/486) για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (Α) και (70/486) για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G). 70

73 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ2.2 Γονοτυπική ανάλυση ασθενών µε OMΛ (case group) Η γονοτυπική ανάλυση των ασθενών πραγµατοποιήθηκε µε τις ίδιες µεθόδους µε αυτές του γονοτυπικού ελέγχου των µαρτύρων, τη µέθοδο ανίχνευσης πολυµορφισµών µε ένζυµα περιορισµού (Restricted Fragment Length Polymorphism, RFLP) και µε τη µέθοδο PCR πραγµατικού χρόνου (Real-Time PCR). Τα αποτελέσµατα των δύο µεθόδων ήταν πανοµοιότυπα. Από τους 269 ασθενείς, οι 146 (146/269, 54.3%) ήταν οµόζυγοι για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (A/A), 93 (93/269, 34.6%) ετερόζυγοι για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (Α/G) και 30 (30/269, 11.4%) οµόζυγοι για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G). Οι συχνότητες των δύο αλληλοµόρφων στον πληθυσµό των ασθενών υπολογίστηκαν σε (358/538) για το φυσιολογικό Α και (153/538) για το µεταλλαγµένο G αλληλόµορφο (Πίνακας 10). Από τους 220 ασθενείς µε πρωτοπαθή (de novo) ΟΜΛ, οι 126 (126/220, 57.3%) ήταν οµόζυγοι για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (Α/Α), 79 (79/220, 35.9%) ετερόζυγοι για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (A/G) και 15 (15/220, 6.8%) οµόζυγοι για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G). Αντίστοιχα από τους 49 ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ, οι 20 (20/49, 40.8%) ήταν οµόζυγοι για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (Α/Α), 14 (14/49, 28.6%) ετερόζυγοι για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (A/G) και 15 (15/49, 30.6%) οµόζυγοι για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G). Οι συχνότητες αυτές συγκρίθηκαν στατιστικά προκειµένου να αναδειχθεί ο πιθανός ρόλος και συσχέτιση του υπό µελέτη πολυµορφισµού στην ΟΜΛ. Για τη σύγκριση χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό µη-παραµετρικό τεστ χ 2 (Chi-Square test) µε διάστηµα εµπιστοσύνης 95% και επίπεδο σηµαντικότητας 5%. Όπως φαίνεται και στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 10), η κατανοµή των συχνοτήτων των γονοτύπων ασθενών µε πρωτοπαθή ΟΜΛ και ασθενών µε δευτεροπαθή ΟΜΛ διέφερε σηµαντικά, µε σηµαντικά αυξηµένη συχνότητα του µεταλλαγµένου γονοτύπου G/G στους ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ σε σύγκριση µε τους ασθενείς µε πρωτοπαθή ΟΜΛ (p<0.0001, χ 2 =23.0, df=2). Αντίστοιχα, οι συχνότητες των αλληλοµόρφων διέφεραν σηµαντικά µεταξύ ασθενών µε πρωτοπαθή ΟΜΛ και ασθενών µε δευτεροπαθή ΟΜΛ [0.752 vs για το φυσιολογικό αλληλόµορφο A και vs για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο G, αντίστοιχα], µε σηµαντικά αυξηµένη τη συχνότητα του µεταλλαγµένου αλληλοµόρφου G στους ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ σε σύγκριση µε τους ασθενείς µε πρωτοπαθή ΟΜΛ (p<0.0001, χ 2 =16.0, df=1). Η ανάλυση 71

74 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ συχνοτήτων των αλληλοµόρφων µεταξύ ασθενών µε πρωτοπαθή ΟΜΛ και ασθενών µε δευτεροπαθή ΟΜΛ έδειξε ότι οι ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ έχουν 0.4-φορές αυξηµένο κίνδυνο να φέρουν τουλάχιστον ένα µεταλλαγµένο G αλληλόµορφο σε σύγκριση µε τους µάρτυρες (p<0.0001, df=1, OR=0.4, 95%CI=[ ]. Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 10) αναγράφονται συνολικά οι συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων ασθενών µε πρωτοπαθή ΟΜΛ και ασθενών µε δευτεροπαθή ΟΜΛ. Πίνακας 10. Συχνότητες γονοτύπων ασθενών µε πρωτοπαθή (de novo) ΟΜΛ και δευτεροπαθή ΟΜΛ (s-ομλ) για τον πολυµορφισµό A 785 G (rs ) του γονιδίου CYP2B6 Συχνότητες γονοτύπων CYP2B6 (%) Συχνότητες αλληλοµόρφων Οµάδα Νο. A/A A/G G/G A G Ασθενείς µε de novo ΟΜΛ Ασθενείς µε s-ομλ (57.3) 79 (35.9) 15 (6.8) 331 (0.752) 109 (0.247) 20 (40.8) 14 (28.6) 15 (30.6) 54 (0.551) 44 (0.449) χ 2 =23.0, df=2, p=0.000 χ 2 =16.0, df=1 p=0.000 OR=0.4, 95%CI=[ ] 72

75 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ2.3 Σύγκριση συχνοτήτων γονοτύπων και αλληλοµόρφων ασθενών- µαρτύρων Οι συχνότητες των γονοτύπων ασθενών και µαρτύρων συγκρίθηκαν στατιστικά προκειµένου να αναδειχθεί ο πιθανός ρόλος του υπό µελέτη πολυµορφισµού στην ανάπτυξη οξείας µυελογενούς λευχαιµίας. Για τη σύγκριση χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό µη-παραµετρικό τεστ χ 2 (Chi-Square test) µε διάστηµα εµπιστοσύνης 95% και επίπεδο σηµαντικότητας 5%. Όπως φαίνεται και στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 11), η κατανοµή των συχνοτήτων των γονοτύπων ασθενών και µαρτύρων διέφερε σηµαντικά [54.3 vs 74.1% οµόζυγοι για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (A/A), 34.6 vs 23.0% ετερόζυγοι για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (Α/G) και 11.2 vs 2.9% οµόζυγοι για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G), αντίστοιχα], µε σηµαντικά αυξηµένη συχνότητα µεταλλαγµένων γονοτύπων A/G και G/G στους ασθενείς σε σύγκριση µε τους µάρτυρες (p<0.0001, χ 2 =25.8, df=2). Αντίστοιχα, οι συχνότητες των αλληλοµόρφων διέφεραν σηµαντικά µεταξύ ασθενών και µαρτύρων [0.715 vs για το φυσιολογικό αλληλόµορφο A και vs για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο G, αντίστοιχα], µε σηµαντικά αυξηµένη τη συχνότητα του µεταλλαγµένου αλληλοµόρφου G στους ασθενείς σε σύγκριση µε τους µάρτυρες (p<0.0001, χ 2 =295, df=1). Η ανάλυση συχνοτήτων των αλληλοµόρφων µεταξύ ασθενών και µαρτύρων έδειξε ότι οι ασθενείς µε ΟΜΛ έχουν 2.4-φορές αυξηµένο κίνδυνο να φέρουν τουλάχιστον ένα µεταλλαγµένο G αλληλόµορφο σε σύγκριση µε τους µάρτυρες (p<0.0001, df=1, OR=2.4, 95%CI=[ ]). Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 11) αναγράφονται συνολικά οι συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων ασθενών και µαρτύρων. Πίνακας 11. Σύγκριση συχνοτήτων γονοτύπων και αλληλοµόρφων ασθενών-µαρτύρων Συχνότητες γονοτύπων CYP2B6 (%) Συχνότητες αλληλοµόρφων (%) Οµάδα Νο. A/A A/G G/G A G Ασθενείς (54.3) 93 (34.6) 30 (11.2) 358 (0.715) 153 (0.284) Μάρτυρες (74.1) 56 (23.0) 7 (2.9) 416 (0.855) 70 (0.144) χ 2 =25.8, df=2, p=0.000 χ 2 =29.5, df=1 p=0.000 OR=2.4, 95%CI=[ ] 73

76 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Τα διαγράµµατα 1 και 2 απεικονίζουν τις προαναφερθείσες συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων ασθενών και µαρτύρων, αντίστοιχα. ιάγραµµα 1. Συχνότητες γονοτύπων ασθενών µε ΟΜΛ και υγιών µαρτύρων (χ 2 =25.8, df=2, p>0.001) ιάγραµµα 2. Συχνότητες αλληλοµόρφων ασθενών µε ΟΜΛ και υγιών µαρτύρων (χ 2 =29.5, df=1 p>0.001). 74

77 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ2.4 Συσχετισµός γονοτύπων και αλληλοµόρφων µε τα χαρακτηριστικά των ασθενών και τον καρυότυπο Γ2.4.1 Συσχετισµός γονοτύπων και αλληλοµόρφων µε το φύλο Για την ανάδειξη πιθανών συσχετισµών µεταξύ της κατανοµής συχνοτήτων των γονοτύπων και των αλληλοµόρφων CYP2B6 µε το φύλο, οι οµάδες ασθενών και µαρτύρων κατηγοριοποιήθηκαν µε βάση το φύλο σε άρρενα και θήλεα άτοµα και υπολογίστηκαν οι αντίστοιχες συχνότητες. Εν συνεχεία, συγκρίθηκαν οι συχνότητες τόσο µεταξύ των ατόµων της ίδιας οµάδας όσο και µεταξύ των ασθενών και των µαρτύρων. Για τη σύγκριση χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό µη-παραµετρικό τεστ χ 2 µε διόρθωση κατά Yates (Yate s chi-square test). Τα αποτελέσµατα της σύγκρισης γονοτύπων και αλληλοµόρφων δίνονται συγκεντρωτικά στους πίνακες 12 και 13. Όπως φαίνεται από τους πίνακες δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές στην κατανοµή των γονοτύπων και συχνοτήτων των αλληλοµόρφων του γονιδίου CYP2B6 µεταξύ θηλέων και αρρένων ατόµων. Πίνακας 12. Συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων CYP2B6 ασθενών µε βάση το φύλο. ΑΣΘΕΝΕΙΣ Νο. Συχνότητες γονοτύπων CYP2B6 (%) Συχνότητες αλληλοµόρφων Φύλο 269 A/A A/G G/G A G Άρρεν (58.9) 47 (30.1) 17 (10.9) 231 (0.740) 81 (0.259) Θήλυ (47.8) 46 (40.7) 13 (11.5) 154 (0.681) 72 (0.318) χ 2 =3.65, df=2, p=0.161 χ 2 =2.24, df=1, p=0.135 Πίνακας 13. Συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων CYP2B6 µαρτύρων µε βάση το φύλο ΜΑΡΤΥΡΕΣ Νο. Συχνότητες γονοτύπων CYP2B6 (%) Συχνότητες αλληλοµόρφων Φύλο 243 A/A A/G G/G A G Άρρεν (69.7) 34 (25.7) 6 (4.5) 218 (0.825) 46 (0.174) Θήλυ (79.3) 22 (19.8) 1 (0.9) 198 (0.892) 24 (0.108) χ 2 =4.45, df=2, p=0.108 χ 2 =4.28, df=1, p=

78 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ2.4.2 Συσχετισµός γονοτύπων και αλληλοµόρφων µε την ηλικία Για την ανάδειξη πιθανών συσχετισµών µεταξύ της κατανοµής συχνοτήτων των γονοτύπων και των αλληλοµόρφων CYP2B6 µε την ηλικία, οι οµάδες ασθενών και µαρτύρων κατηγοριοποιήθηκαν µε βάση την ηλικία διάγνωσης σε δύο οµάδες, άτοµα ηλικίας µικρότερης ή ίσης µε 60 ετών ( 60) και άτοµα ηλικίας άνω των 60 ετών ( 61) και υπολογίστηκαν οι αντίστοιχες συχνότητες. Εν συνεχεία, συγκρίθηκαν οι συχνότητες τόσο µεταξύ των ατόµων της ίδιας οµάδας όσο και µεταξύ των δύο υπό µελέτη οµάδων. Για τη σύγκριση χρησιµοποιήθηκε το στατιστικό µη-παραµετρικό τεστ χ 2 (chi-square test). Τα αποτελέσµατα της σύγκρισης γονοτύπων και αλληλοµόρφων δίνονται συγκεντρωτικά στους πίνακες 14 και 15 και στα διαγράµµατα 7 και 8 αντίστοιχα. Παρατηρήθηκε στατιστικά διαφορετική κατανοµή γονοτύπων µεταξύ των δύο ηλικιακών οµάδων των ασθενών (p=0.004, χ 2 =11.1, df=2). Πιο συγκεκριµένα, σηµειώθηκε υψηλότερη συχνότητα οµοζυγωτών για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G) σε ασθενείς ηλικίας µεγαλύτερης των 60 ετών, σε σύγκριση µε τους ασθενείς κάτω των 60 ετών (21.2% vs 19.4%, αντίστοιχα). εν βρέθηκε ανάλογη διαφορά στο δείγµα των µαρτύρων µετά από αντίστοιχη κατηγοριοποίηση µε βάση την ηλικία (χ 2 =0.609, df=2, p=0.738). Πίνακας 14. Συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων CYP2B6 ασθενών µε βάση την ηλικία. ΑΣΘΕΝΕΙΣ Νο. Συχνότητες γονοτύπων CYP2B6 (%) Συχνότητες αλληλοµόρφων Ηλικία (έτη) 269 A/A A/G G/G A G (35.5) 42 (45.2) 13 (19.4) 108 (0.614) 78 (0.386) (26.3) 74 (52.5) 30 (21.2) 194 (0.700) 78 (0.300) χ 2 =11.1, df=2, p=0.004 χ 2 =8.650, df=1, p=0.003 OR= %CI=[ ] Πίνακας 15. Συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων CYP2B6 µαρτύρων µε βάση την ηλικία. ΜΑΡΤΥΡΕΣ Νο. Συχνότητες γονοτύπων CYP2B6 (%) Συχνότητες αλληλοµόρφων Ηλικία (έτη) 243 A/A A/G G/G A G (75.3) 35 (21.6) 5 (3.0) 279 (0.861) 45 (0.138) (71.6) 21 (25.9) 2 (2.5) 137 (0.845) 25 (0.154) χ 2 =0.609, df=2, p=0.738 χ 2 =2.09, df=1, p=

79 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ιάγραµµα 3. Συχνότητες γονοτύπων ασθενών µε βάση την ηλικία ιάγραµµα 4. Συχνότητες γονοτύπων µαρτύρων µε βάση την ηλικία 77

80 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Γ2.4.3 Συσχετισµός γονοτύπων και αλληλοµόρφων µε τον καρυότυπο Για την ανάδειξη πιθανών συσχετισµών µεταξύ της κατανοµής συχνοτήτων των γονοτύπων και των αλληλοµόρφων CYP2B6 και του καρυοτύπου, η οµάδα των ασθενών κατηγοριοποιήθηκε µε βάση το είδος της χρωµοσωµατικής αλλοίωσης. Αρχικά, διακρίθηκαν δύο υποοµάδες, εκ των οποίων η µία περιλαµβάνει ασθενείς µε φυσιολογικό καρυότυπο (normal karyotype) και η δεύτερη περιλαµβάνει ασθενείς µε µη-φυσιολογικό καρυότυπο (abnormal karyotype). Εν συνεχεία, η δεύτερη οµάδα χωρίστηκε περαιτέρω ανάλογα µε το είδος της αλλοίωσης και συγκρίθηκαν οι συχνότητες µεταξύ των υπό µελέτη οµάδων. εν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές στην κατανοµή των γονοτύπων και συχνοτήτων των αλληλοµόρφων του γονιδίου CYP2B6 µεταξύ των διαφόρων κυτταρογενετικών οµάδων. Ωστόσο παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ των ασθενών µε συγκεκριµένες χρωµοσωµατικές αλλοιώσεις και των υγειών δοτών. Τα αποτελέσµατα της σύγκρισης γονοτύπων και αλληλοµόρφων δίνονται συγκεντρωτικά στο διάγραµµα 5 και στο πίνακα 16 αντίστοιχα. ιάγραµµα 5. Συχνότητες γονοτύπων ασθενών µε βάση την αλλοίωση 78

81 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Πίνακας 16. Συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων ασθενών µε βάση τον καρυότυπο. Οι συχνότητες των επιµέρους αλλοιώσεων είναι υπολογισµένες στο σύνολο των ασθενών µε επιτυχή καρυότυπο. ΑΣΘΕΝΕΙΣ Νο. Συχνότητες γονοτύπων (%) p p* Συχνότητες αλληλοµόρφων p Καρυότυπος 265 A/A A/G G/G A G Φυσιολογικός Μηφυσιολογικός 201 (75.8%) 64 (24.2%) 36 (56.3) 23 (35.9) 5 (7.8) (58.2) 59 (29.4) 25 (12.4) ns < (0.742) 293 (0.728) 33 (0.179 ) 109 (0.271 ) ns χ 2 =1.630, df=2, p=0.443 χ 2 =0.880., df=1, p= /del(5q) 34 (12.8%) 17 (50.0) 13 (38.3) 4 (11.7) ns (0.691) 21 (0.308) ns (8.6%) 11 (47.8) 9 (39.1) 3 (13.0) ns (0.673) 15 (0.326) ns -Y 8 (3.0%) 5 (62.5) 1 (12.5) 2 (25.0) ns (0.687) 5 (0.312) ns -7/del(7q) 47 (17.7%) 27 (57.5) 13 (27.6) 7 (14.9) ns (0.713) 27 (0.287) ns t(15;17) 12 (4.5%) 6 (50.0) 5 (41.6) 1 (8.3) ns ns 17 (0.708) 7 (0.292) ns inv(16) 14 (5.2%) 6 (42.9) 6 (42.9) 2 (14.3) ns (0.642) 10 (0.360) ns t(8;21) 14 (5.2%) 6 (42.9) 4 (28.6) 4 (28.6) ns < (0.571) 12 (0.428) ns t(9;22) 9 (3.6%) 4 (44.4) 4 (44.4) 1 (11.1) ns ns 12 (0.666) 6 (0.333) ns 11q23 15 (5.6%) 10 (66.6) 2 (13.3) 3 (20.0) ns (0.733) 8 (0.266) ns Άλλη αλλοίωση χ 2 =9.80, df=16, p= (10.1%) 13 (48.1) 8 (29.6) 6 (22.2) 34 (0.629) χ 2 =2.69, df=8, p= (0.370) ns Σύνθετος 76 (28.6%) 37 (48.7) 25 (32.9) 14 (18.4) 99 (0.651) 53 (0.697) p* σε σύγκριση µε την οµάδα υγιών δοτών 79

82 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Γ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Επιπλέον, οι ασθενείς µε αλλοιωµένο καρυότυπο χωρίστηκαν βάση αλλοίωσης σε τρεις οµάδες πρόγνωσης (καλής, ενδιάµεσης και κακής) και υπολογίστηκαν οι συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων. Τα αποτελέσµατα δίνονται στον πίνακα 17. εν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές στην κατανοµή γονοτύπων και αλληλοµόρφων µεταξύ των οµάδων πρόγνωσης. Πίνακας 17. Συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων CYP2B6 µε βάση την πρόγνωση. ΑΣΘΕΝΕΙΣ Νο. Συχνότητες γονοτύπων (%) Συχνότητες αλληλοµόρφων Πρόγνωση 269 A/A A/G G/G A G Καλή 29 (10.7%) 15 (51.7) 11 (37.9) 3 (10.3) 41 (0.706) 17 (0.293) Ενδιάµεση 135 (50.2%) 61 (45.1) 61 (45.1) 13 (9.6) 183 (0.677) 87 (0.322) Κακή 101 (37.5%) 54 (53.4) 33 (32.6) 14 (13.8) 141 (0.698) 61 (0.301) χ 2 =4.10, df=4, p=0.392 χ 2 =0.322, df=2, p=

83 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δ ΣΥΖΗΤΗΣΗ 79

84 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 1. Κυτταρογενετική ανάλυση ασθενών µε ΟΜΛ Στα πλαίσια της παρούσας διπλωµατικής εργασίας αναλύθηκαν καρυοτυπικά 269 ενήλικες ασθενείς µε ΟΜΛ, προκειµένου να ελεγχθούν για την ύπαρξη κλωνικών δοµικών και/ή αριθµητικών χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατά µας παρατηρήσαµε αυξηµένη συχνότητα των χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων -7/del(7q) και -5/del(5q) (17.7% και 12.8%, αντίστοιχα) κάτι που µπορεί να οφείλεται στη διαφορετική γεωγραφική κατανοµή. H πλειονότητα των ασθενών που φέρουν αυτές τις αλλοιώσεις βρίσκονται σε σύνθετο καρυότυπο, κάτι που είναι σύµφωνα µε τα βιβλιογραφικά δεδοµένα (Dohner et al., 2012). Η αλλοίωση -7/del(7q) παρατηρείται ως µεµονωµένη αλλοίωση αλλά και σε σύνθετο καρυότυπο, ενώ η -5/del(5q) παρατηρείται συνήθως σε σύνθετο καρυότυπο (Grimwade και Mrozek, 2011). Αντίστοιχα, η κατηγοριοποίηση της οµάδας των ασθενών σε τρεις οµάδες πρόγνωσης βάσει καρυοτύπου, συγκρίθηκε µε τη δηµοσιευµένη µεγάλη σειρά 1550 ασθενών µε πρωτοπαθή ΟΜΛ του Mrozek και της οµάδας του (Mrozek K. et al., 2012). Η ετερογένεια που παρατηρήθηκε µπορεί να οφείλεται και σε άλλους παράγοντες, όπως είναι η περιβαλλοντική έκθεση και η ηλικία των ασθενών (Mrozek et al., 2012). Στον παρακάτω πίνακα (Πίνακας 17) συνοψίζονται τα συγκριτικά αποτελέσµατα. Πίνακας 17. Συχνότητες οµάδων πρόγνωσης της οµάδας των ασθενών µε ΟΜΛ (N=269) σε σύγκριση µε τα αντίστοιχα ποσοστά του Μrozek A. (N=1550) (x 2 =71.5, df= 2, p<0.001). Ασθενείς OMΛ Συχνότητες ασθενών του Μrozek No Oµάδες πρόγνωσης Καλή 29 (10.7%) 581 (37.4%) Ενδιάµεση 135 (50.2%) 562 (36.2%) Κακή 101 (37.5%) 407 (26.2%) 80

85 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 2. Η συσχέτιση του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 µε OMΛ 2.1 Κατανοµή γονοτύπων CYP2B6 στην οµάδα των υγιών δοτών (control group) Στην οµάδα ελέγχου (control group) συµµετείχαν υγιή µη-συγγενικά άτοµα ελληνικής καταγωγής που είχαν αρνητικό ιστορικό αιµατολογικής κακοήθειας ή άλλης χρόνιας νόσου, ενώ ήταν αντίστοιχης ηλικίας και φύλου συγκριτικά µε τους υπό µελέτη ασθενείς. Στο σύνολο της οµάδας των 243 µαρτύρων, οι συχνότητες των γονοτύπων του CYP2B6 υπολογίστηκαν σε 74.1% για τους οµοζυγώτες για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (A/A), 23.0% για τους ετεροζυγώτες για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (Α/G) και 2.8% για τους οµοζυγώτες για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G). Η κατανοµή των γονοτύπων της οµάδας των µαρτύρων βρίσκεται σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg, γεγονός που υποδηλώνει ότι κατά τις διάφορες γενιές δεν επιδρούν άλλοι παράγοντες εκτός από την ανακατανοµή των γονιδίων κατά τη διαδικασία της µείωσης και εποµένως οι συχνότητες των αλληλοµόρφων παραµένουν σταθερές στον πληθυσµό. Οι συχνότητες των δύο αλληλοµόρφων στους µάρτυρες υπολογίστηκαν σε για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (Α) και για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G). Τα αποτελέσµατά µας είναι σύµφωνα µε τα βιβλιογραφικά δεδοµένα, όπου το εύρος των συχνοτήτων για τους µεταλλαγµένους γονότυπους σε Καυκάσιους πληθυσµούς, κυµαίνεται από 25% έως 32% (Davaalkham et al., 2009, Lang et al., 2001, Huijun et al., 2007, Kirchheiner et al., 2003). 2.2 Κατανοµή γονοτύπων CYP2B6 στην οµάδα των ασθενών µε OMΛ (case group) Στο σύνολο της οµάδας των 269 ασθενών, οι συχνότητες των γονοτύπων του CYP2B6 υπολογίστηκαν σε 54.3% για τους οµοζυγώτες για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (A/A), 34.6% για τους ετεροζυγώτες για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (Α/G) και 11.2% για τους οµοζυγώτες για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G). Οι συχνότητες των δύο αλληλοµόρφων στους ασθενείς 81

86 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ υπολογίστηκαν σε για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (Α) και για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G). Μέχρι σήµερα δεν έχουν πραγµατοποιηθεί µελέτες που να συσχετίζουν τον πολυµορφισµό A 785 G του γονιδίου CYP2B6 µε τη προδιάθεση ανάπτυξης ΟΜΛ. Ωστόσο έχουν πραγµατοποιηθεί αντίστοιχες µελέτες που συσχετίζουν τον εν λόγω πολυµορφισµό µε τη προδιάθεση ανάπτυξης καρκίνου του µαστού (Jakobsen Falk I. et al., 2012), όπου παρατηρείται αυξηµένη συχνότητα µεταλλαγµένων γονοτύπων. 2.3 Ο πιθανός ρόλος του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 στην προδιάθεση εκδήλωσης ΟΜΛ Από τους 269 ασθενείς, οι 220 εµφάνισαν πρωτοπαθή ΟΜΛ και οι 49 δευτεροπαθή. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της παρούσας διπλωµατικής εργασίας, η κατανοµή των συχνοτήτων των γονοτύπων CYP2B6 µεταξύ ασθενών µε πρωτοπαθή OMΛ και ασθενών µε δευτεροπαθή ΟΜΛ διαφέρει στατιστικά, µε σηµαντικά αυξηµένη συχνότητα µεταλλαγµένων γονοτύπων G/G στους ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ σε σύγκριση µε τους ασθενείς µε πρωτοπαθή OMΛ (p<0.0001, χ 2 =23.0, df=2). Ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ έχουν µεγαλύτερη πιθανότητα κατά 2.4 φορές να φέρουν το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο σε σχέση µε τους ασθενείς µε πρωτοπαθή ΟΜΛ. Όπως έχει προαναφερθεί οι ασθενείς µε δευτεροπαθή ΟΜΛ, µπορεί να προέρχονται µετά από άλλη κακοήθη νόσο ή µετά από χηµειοθεραπεία. Το ένζυµο CYP2B6 µεταβολίζει αντικαρκινικά φάρµακα, όπως αλκυλιωτικοί παράγοντες και τοποισοµεράση ΙΙ, που δίνονται σε ασθενείς µε κακοήθη νόσο. Ο κίνδυνος λοιπόν ανάπτυξης δευτεροπαθούς ΟΜΛ είναι αυξηµένος λόγω της µειωµένης ενζυµικής ενεργότητας µε αποτέλεσµα τη µη επαρκή αποτοξικοποίηση των φαρµάκων. Σύµφωνα µε τα αποτελέσµατα της παρούσας διπλωµατικής εργασίας, η κατανοµή των συχνοτήτων των γονοτύπων CYP2B6 µεταξύ ασθενών µε OMΛ και µαρτύρων διαφέρει στατιστικά, µε σηµαντικά αυξηµένη συχνότητα µεταλλαγµένων γονοτύπων A/G και G/G στους ασθενείς σε σύγκριση µε τους µάρτυρες (p<0.0001, χ 2 =25.8, df=2). Το εύρηµα αυτό υποδεικνύει τον πιθανό ρόλο του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 στην προδιάθεση ανάπτυξης ΟΜΛ. Μάλιστα, οι σηµαντικότερες διαφορές βρέθηκαν µεταξύ οµοζυγωτών για το φυσιολογικό (Α/Α) και οµοζυγωτών για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G) (p<0.0001), γεγονός που δείχνει ότι η 82

87 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ έλλειψη της ενζυµικής δράσης του CYP2B6 και η ανεπάρκεια µεταβολισµού ορισµένων τοξικών ουσιών πιθανόν να συµβάλλει σηµαντικά στην ανάπτυξη οξείας µυελογενούς λευχαιµίας. Όσον αφορά τις συχνότητες των αλληλοµόρφων, η παρούσα µελέτη ανέδειξε ότι οι ασθενείς µε ΟΜΛ έχουν 2.4-φορές µεγαλύτερη πιθανότητα να φέρουν το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο σε οµόζυγη ή ετερόζυγη κατάσταση, σε σύγκριση µε τους µάρτυρες. Παρόµοιες µελέτες ασθενών-µαρτύρων για συσχέτιση του πολυµορφισµού αυτού µε τη προδιάθεση ανάπτυξης οξείας µυελογενούς λευχαιµίας δεν έχουν πραγµατοποιηθεί. Ωστόσο µέχρι σήµερα, έχουν δηµοσιευθεί δύο µελέτες σχετικά µε τη µελέτη του πολυµορφισµού G 516 T του γονιδίου CYP2B6 στην προδιάθεση ανάπτυξης ΟΜΛ. Η πρώτη µελέτη έλαβε χώρα το 2009 σε πληθυσµό της Τουρκίας από τους Berkoz και Yalin (Berkoz και Yalin, 2009). H µελέτη αυτή αφορούσε 36 Τούρκους ασθενείς µε ΟΜΛ και 100 υγιείς µάρτυρες ίδιας καταγωγής. Οι συγγραφείς αναφέρουν ότι οι γονοτυπικές συχνότητες ασθενών και µαρτύρων διέφεραν µεταξύ τους σηµαντικά, και εποµένως αναδείχθηκε κάποια συσχέτιση µεταξύ του γονιδίου CYP2B6 και της προδιάθεσης ανάπτυξης ΟΜΛ. Η δεύτερη και πιο πρόσφατη µελέτη έλαβε χώρα το 2011 σε πληθυσµό της Κίνας από τους Ζhong et al (Zhong Y et al, 2011). Η µελέτη αυτή αφορούσε 164 Κινέζους ασθενείς µε ΟΜΛ και 348 υγιείς µάρτυρες ίδιας καταγωγής. Οι συγγραφείς αναφέρουν ότι οι γονοτυπικές συχνότητες ασθενών και µαρτύρων διέφεραν µεταξύ τους σηµαντικά, και εποµένως αναδείχθηκε κάποια συσχέτιση µεταξύ του γονιδίου CYP2B6 και της προδιάθεσης ανάπτυξης ΟΜΛ. Τα παραπάνω αποτελέσµατα βρίσκονται σε συµφωνία µε τα δικά µας για τον πολυµορφισµό A 785 G και υποστηρίζουν το σηµαντικό ρόλο του CYP2B6 στην προδιάθεση ανάπτυξης ΟΜΛ. 2.4 Συσχετισµός του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 µε το φύλο, την ηλικία διάγνωσης και τις κυτταρογενετικές αλλοιώσεις εδοµένου ότι η αναλογία αντρών/γυναικών είναι µεγαλύτερη στην ΟΜΛ (Estey et al., 2006), διερευνήθηκε η πιθανή σχέση µεταξύ του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 και του φύλου. Για το σκοπό αυτό συγκρίθηκαν οι συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων τόσο µεταξύ ανδρών και γυναικών στην οµάδα των ασθενών, όσο και µεταξύ ασθενών και µαρτύρων και για τα δύο φύλα. Από τις εν λόγω συγκρίσεις δεν εντοπίσθηκε κάποια συγκεκριµένη συσχέτιση µεταξύ του 83

88 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ πολυµορφισµού του γονιδίου CYP2B6 και του φύλου, γεγονός που υποδηλώνει ότι ο υπό µελέτη πολυµορφισµός δεν διαφοροποιεί τον κίνδυνο ανάπτυξης ΟΜΛ µε φύλοεξαρτώµενο τρόπο. Όσον αφορά τη σύγκριση των συχνοτήτων γονοτύπων και αλληλοµόρφων σε συνάρτηση µε την ηλικία διάγνωσης των ασθενών, παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δύο ηλικιακών οµάδων ( 60 και >60), στις οποίες χωρίστηκαν οι ασθενείς. Συγκεκριµένα, σηµειώθηκε υψηλότερη συχνότητα οµοζυγωτών για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G) µεταξύ των ασθενών ηλικίας µεγαλύτερης των 60 ετών, σε σύγκριση µε τους ασθενείς κάτω των 60 ετών (16.6% vs 6.9%, αντίστοιχα). Επίσης, σηµειώθηκε υψηλότερη συχνότητα οµοζυγωτών για το φυσιολογικό αλληλόµορφο (Α/Α) µεταξύ των ασθενών της µικρότερης ηλικιακής οµάδας, σε σύγκριση µε τους ασθενείς άνω των 60 ετών (61.7% vs 41.6%, αντίστοιχα). εδοµένου ότι δεν βρέθηκε ανάλογη διαφορά στο δείγµα των µαρτύρων µετά από αντίστοιχη κατηγοριοποίηση µε βάση την ηλικία, το εύρηµα αυτό αποκτά αυξηµένη βαρύτητα. Όσο αυξάνεται η ηλικία, αυξάνεται και η αθροιστική δράση των γονοτοξικών περιβαλλοντικών εκθέσεων, η οποία εµπλέκεται στους µηχανισµούς παθογένεσης της οξείας µυελογενούς λευχαιµίας. Σύµφωνα λοιπόν µε τα παραπάνω, µπορούµε να υποθέσουµε ότι άτοµα µεγαλύτερης ηλικίας που φέρουν το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο σε οµόζυγη κατάσταση, λόγω της περιβαλλοντικής έκθεσης, της συσσώρευσης γονοτοξικών ουσιών και ανάλογα µε το τρόπο ζωής τους (π.χ. κάπνισµα, κατανάλωση αλκοόλ, κ.ά.) είναι πιο ευάλωτα να αναπτύξουν ΟΜΛ. Το γεγονός ότι η ΟΜΛ δεν είναι τόσο συχνή σε άτοµα κάτω των 60 ετών µε οµόζυγο γονότυπο για το µεταλλαγµένο γονίδιο µπορεί να οφείλεται στο γεγονός ότι ο οργανισµός µπορεί να διαθέσει εναλλακτικά µονοπάτια αποτοξικοποίησης τα οποία παύουν να λειτουργούν όσο αυξάνεται η ηλικία. Έτσι σε µεγάλες ηλικίες η µη αποτελεσµατική αποτοξικοποίηση οδηγεί στη συσσώρευση τοξικών ουσιών οι οποίες µπορεί να προκαλέσουν βλάβες στο κύτταρο οι οποίες µπορεί να συµβάλλουν στη προδιάθεση ανάπτυξης ΟΜΛ. Η υπόθεση αυτή αξίζει να διερευνηθεί περαιτέρω σε µελλοντικές µελέτες, λαµβάνοντας υπόψη την έκφραση του ενζύµου CYP2B6 σε συνδυασµό µε το γονότυπο των ασθενών. Επιπλέον για την ανάδειξη πιθανών συσχετισµών µεταξύ της κατανοµής συχνοτήτων των γονοτύπων και των αλληλοµόρφων CYP2B6 και του καρυοτύπου διακρίθηκαν δύο υποοµάδες, εκ των οποίων η µία περιλαµβάνει ασθενείς µε φυσιολογικό καρυότυπο (normal karyotype) και η δεύτερη περιλαµβάνει ασθενείς µε 84

89 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ παθολογικό καρυότυπο (abnormal karyotype). εν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ γονοτύπων και αλληλοµόρφων του γονιδίου CYP2B6 µετά από σύγκριση των δύο υποοµάδων. Στη συνέχεια συγκρίθηκαν οι συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων µεταξύ ασθενών µε φυσιολογικό καρυότυπο και υγιών δοτών και παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές. Υψηλότερη συχνότητα των µεταλλαγµένων γονοτύπων (Α/G και G/G) σηµειώθηκε µεταξύ των ασθενών µε φυσιολογικό καρυότυπο, σε σύγκριση µε τους µάρτυρες (35.9% vs 23.0%, και 7.8% vs 2.88 αντίστοιχα, p=0.013). Πιο συγκεκριµένα, οι ασθενείς µε φυσιολογικό καρυότυπο παρουσίασαν µεγαλύτερη πιθανότητα κατά 1.7 φορές να φέρουν µία τουλάχιστον φορά το µεταλλαγµένο G αλληλόµορφο σε σχέση µε τους υγιείς δότες. Οι φυσιολογικοί καρυότυποι στη ΟΜΛ αποτελούν µια ετερογενή οµάδα που χαρακτηρίζεται από την παρουσία υποµικροσκοπικών αλλοιώσεων καθώς επίσης και από µοριακή ετερογένεια. Μόλις την τελευταία δεκαετία, µελέτες έχουν δείξει ότι η παρουσία ή η απουσία ειδικών µοριακών αλλοιώσεων επηρεάζουν την πρόγνωση των ασθενών µε ΟΜΛ (Marchesi et al., 2011, Mrozek και Bloomfield, 2006). Σύµφωνα µε τα παραπάνω, είναι σηµαντικό να πραγµατοποιηθεί περαιτέρω µελέτη σε ασθενείς µε ΟΜΛ και φυσιολογικό καρυότυπο µε σκοπό τη συσχέτιση του πολυµορφισµού µε µοριακές αλλοιώσεις που παρατηρούνται σε φυσιολογικούς καρυοτύπους. Όσον αφορά τους ασθενείς µε παθολογικό καρυότυπο, δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές µετά από σύγκριση των συχνοτήτων των γονοτύπων µε τους υγιείς δότες. Τέλος όσον αφορά την κατανοµή του γονοτύπου CYP2B6 σε σχέση µε τις καρυοτυπικές αλλοιώσεις, δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές από τη σύγκριση των γονοτυπικών κατανοµών µεταξύ των διαφορετικών κυτταρογενετικών οµάδων. Αυτό πιθανόν να οφείλεται στο µικρό αριθµό ασθενών που υπάγονται σε κάθε κυτταρογενετική οµάδα, γεγονός που αποδυναµώνει τη δύναµη των στατιστικών εργαλείων και δεν επιτρέπει τη διεξαγωγή ασφαλών συµπερασµάτων. Ενδιαφέρον ωστόσο παρουσίασε το γεγονός ότι µετά από σύγκριση των γονοτύπων κάθε κυτταρογενετικής οµάδας µε την οµάδα των µαρτύρων βρέθηκε αυξηµένο ποσοστό µεταλλαγµένων γονοτύπων (A/G και G/G) σε ΟΜΛ ασθενείς µε συγκεκριµένες αλλοιώσεις σε σχέση µε τους µάρτυρες. Πιο συγκεκριµένα παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική διαφορά σε ασθενείς που έφεραν τις αλλοιώσεις -7/del(7q), -5/del(5q), +8, αλλοιώσεις του χρωµοσώµατος 11 (11q23), inv(16), t(8;21) καθώς και η απώλεια του φυλετικού χρωµοσώµατος (-Y). Σύµφωνα µε µελέτες που έχουν πραγµατοποιηθεί, διάφορες κυτταρογενετικές αλλοιώσεις έχουν συσχετισθεί µε την έκθεση σε τοξικούς 85

90 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Δ. ΣΥΖΗΤΗΣΗ παράγοντες (Su Young et al., 2004, Davino et al., 1998). Πιο συγκεκριµένα oι αλλοιώσεις -5/del(5q) και -7/del(7q) έχουν συσχετιστεί µε τη µη αποτελεσµατική αποτοξικοποίηση αλκυλιωτικών παραγόντων, ενώ η τρισωµία 8 µε τον αναποτελεσµατικό µεταβολισµό του βενζολίου και της νικοτίνης (Βigoni et al., 2001, Smith et al., 2000, Albin M. Et al., 2000). Σύµφωνα µε τα βιβλιογραφικά δεδοµένα άτοµα που φέρουν το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο G του γονιδίου CYP2B6 σε οµόζυγη ή ετερόζυγη κατάσταση, παρουσιάζουν µειωµένη ενζυµική ενεργότητα µε αποτέλεσµα τη µη αποτελεσµατική αποτοξικοποίηση των γονοτοξικών ουσιών. Εποµένως, ο κίνδυνος ανάπτυξης συγκεκριµένων χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων είναι αυξηµένος στους ασθενείς µε ΟΜΛ που φέρουν µεταλλαγµένους γονοτύπους γεγονός που παρατηρήθηκε και στη δική µας µελέτη. Τέλος, µετά από την κατηγοριοποίηση των ασθενών σε οµάδες καλής, ενδιάµεσης και κακής πρόγνωσης βάση καρυοτύπου, δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντικές διαφορές όσον αφορά τις συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων του υπό µελέτη πολυµορφισµού. 3. Γενικά συµπεράσµατα Συνοψίζοντας, τα αποτελέσµατα της παρούσας διπλωµατικής εργασίας υπογραµµίζεται: -Η συµβολή του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 στην προδιάθεση εκδήλωσης ΟΜΛ. -Η συµβολή του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 στη δηµιουργία χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων ειδικών για την ΟΜΛ. - εδοµένου του εξέχοντα ρόλου του ενζύµου CYP2B6 στην προστασία του κυττάρου έναντι τοξικών εξωγενών ή/και ενδογενών ουσιών τονίζεται η σπουδαιότητα των µηχανισµών αποτοξικοποίησης στην προδιάθεση εκδήλωσης της νόσου. Για τη διερεύνηση της διαφοράς στην κατανοµή των γονοτύπων µεταξύ των διαφορετικών ηλικιακών οµάδων που παρατηρήθηκε στην παρούσα µελέτη, απαιτούνται περαιτέρω µελέτες οι οποίες θα συσχετίσουν την έκφραση του ενζύµου CYP2B6 µε το γονότυπο των ασθενών και την ηλικία διάγνωσης των ασθενών. 86

91 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ε. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Ε. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η Οξεία Μυελογενής Λευχαιµία (ΟΜΛ) είναι µία ετερογενής κλωνική διαταραχή των άωρων αιµοποιητικών κυττάρων του µυελού των οστών, τα οποία έχουν χάσει την ικανότητα ρύθµισης της αυτοανανεωτικής τους λειτουργίας και της διαφοροποίησης προς τα ώριµα κύτταρα του αίµατος. Η ΟΜΛ µπορεί να διακριθεί σε πρωτοπαθή (de novo) και σε δευτεροπαθή ΟΜΛ (s-ομλ). Η κυτταρογενετική ανάλυση έχει εξέχουσα σηµασία στην ΟΜΛ αφού συµβάλλει στη διάγνωση, πρόγνωση, στην επιλογή του κατάλληλου θεραπευτικού πρωτοκόλλου καθώς και στην παρακολούθηση των ασθενών. Σήµερα είναι γνωστό ότι οι κυτταρογενετικές αλλοιώσεις αποτελούν ανεξάρτητο προγνωστικό παράγοντα και συµβάλλουν στη παθογένεση της νόσου. Παρά τις έντονες ερευνητικές προσπάθειες, δεν έχουν ακόµα διευκρινισθεί οι αιτιολογικοί παράγοντες ανάπτυξης της ΟΜΛ. Στην πολυσταδιακή πορεία της νόσου φαίνεται να συµβάλλουν γενετικοί, επιγενετικοί και περιβαλλοντικοί παράγοντες. Πρόσφατα, η αλληλεπίδραση µεταξύ έκθεσης σε γονοτοξικούς παράγοντες και γενετικής προδιάθεσης έχει ενοχοποιηθεί ως πιθανός παράγοντας εµφάνισης της ΟΜΛ. Οι µηχανισµοί αποτοξικοποίησης τοξικών παραγόντων και επιδιόρθωσης βλαβών του DNA περιλαµβάνουν πολύπλοκα βιοχηµικά µονοπάτια και στηρίζονται στη δράση των παραγόµενων ενζύµων αποτοξικοποίησης και επιδιόρθωσης. Η αποτοξικοποίηση τοξικών ουσιών καταλύεται από τα ένζυµα αποτοξικοποίησης φάσης Ι και ΙΙ τα οποία κωδικοποιούνται από αντίστοιχα γονίδια.. Τα σηµαντικότερα ένζυµα φάσης Ι είναι τα ένζυµα της υπεροικογένειας του κυτοχρώµατος Ρ450 (CYP), τα οποία µεταβολίζουν τοξικές ουσίες. Έχει προταθεί ότι γονίδια που κωδικοποιούν ένζυµα τα οποία µεταβολίζουν γονοτοξικές ουσίες εµπλέκονται στους µηχανισµούς ανάπτυξης OMΛ, δεδοµένου ότι γενετικοί πολυµορφισµοί στις κωδικοποιούσες περιοχές επηρεάζουν την ενεργότητα των παραγόµενων ενζύµων, τροποποιώντας το γενετικό υπόβαθρο των ατόµων. Το γονίδιο CYP2B6 που κωδικοποιεί για ένα ένζυµο φάσης Ι, είναι µέλος της υπεροικογένειας του κυτοχρώµατος P450. Η ενεργότητα του ενζύµου εξαρτάται από ένα γενετικό πολυµορφισµό τύπου SNP (A785G), καθώς η επακόλουθη αντικατάσταση µίας λυσίνης σε αργινίνη (Lys262Arg) επηρεάζει τη θερµική σταθερότητα της κωδικοποιούσας πρωτεΐνης και κατ επέκταση την καταλυτική 88

92 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ε. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ενεργότητα του ενζύµου. Έτσι, άτοµα ετερόζυγα (A/G) ή οµόζυγα (G/G) ως προς το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο έχουν µειωµένη συζευκτική ικανότητα σε σύγκριση µε τους οµοζυγώτες για το αλληλόµορφο αγρίου τύπου (Α/Α). Σκοπός της παρούσας διπλωµατικής εργασίας ήταν η διερεύνηση του πιθανού ρόλου του πολυµορφισµού Α 785 G του γονιδίου αποτοξικοποίησης CYP2B6 στην προδιάθεση ανάπτυξης ΟΜΛ καθώς και η συσχέτισή του µε τα κυτταρογενετικά ευρήµατα και τα δηµογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών. Για το σκοπό αυτό, πραγµατοποιήθηκε µοριακή ανάλυση µιας µεγάλης σειράς ασθενών και µαρτύρων για τον συγκεκριµένο πολυµορφισµό καθώς και κυτταρογενετική ανάλυση των ασθενών. Η µεθοδολογία που ακολουθήθηκε περιλαµβάνει την επιλογή ασθενών µε ΟΜΛ και υγιών µη-συγγενικών δοτών αντίστοιχης ηλικίας και φύλου. Ακολούθως πραγµατοποιήθηκε αποµόνωση ολικού γενωµικού DNA (gdna) από δείγµατα µυελού των οστών των ασθενών και περιφερικού αίµατος των µαρτύρων. Η οµάδα των ασθενών µελετήθηκε µε µεθόδους κλασσικής κυτταρογενετικής για την ανίχνευση δοµικών ή/και αριθµητικών χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων. Η γονοτυπική ανάλυση για την ανίχνευση του υπό µελέτη πολυµορφισµού πραγµατοποιήθηκε µε δύο µεθόδους, τη µέθοδο ανίχνευσης πολυµορφισµών µέσω πέψης µε ένζυµα περιορισµού (Restricted Fragment Length Polymorphism, RFLP) και µε τη µέθοδο PCR πραγµατικού χρόνου (Real-Time PCR). Στη συνέχεια, υπολογίστηκαν οι συχνότητες γονοτύπων και αλληλοµόρφων ασθενών και µαρτύρων και οι κατανοµές τους συγκρίθηκαν µε το στατιστικό µη-παραµετρικό τεστ χ2 (95% CI, α=5%). Τέλος, τα γονοτυπικά ευρήµατα συσχετίσθηκαν µε τα δηµογραφικά χαρακτηριστικά των ασθενών και τα κυτταρογενετικά δεδοµένα. Η κατανοµή των γονοτύπων CYP2B6 της οµάδας των µαρτύρων βρέθηκε να είναι σε ισορροπία κατά Hardy-Weinberg και επιπλέον να συµφωνεί µε τα βιβλιογραφικά δεδοµένα αντίστοιχων µελετών στους Καυκάσιους. Η κατανοµή των συχνοτήτων των γονοτύπων CYP2B6 µεταξύ ασθενών µε OMΛ και µαρτύρων διέφερε στατιστικά, µε σηµαντικά αυξηµένη τη συχνότητα των µεταλλαγµένων γονοτύπων A/G και G/G στους ασθενείς σε σύγκριση µε τους µάρτυρες. Το εύρηµα αυτό αναδεικνύει τον πιθανό ρόλο του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 στην προδιάθεση ανάπτυξης OMΛ. Μάλιστα, οι σηµαντικότερες διαφορές βρέθηκαν µεταξύ οµοζυγωτών για το φυσιολογικό (Α/Α) και οµοζυγωτών για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G). Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η έλλειψη της ενζυµατικής δράσης του CYP2B6 οδηγεί σε ανεπάρκεια µεταβολισµού ορισµένων τοξικών 89

93 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ε. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ουσιών και µπορεί να συµβάλλει στην ανάπτυξη οξείας µυελογενούς λευχαιµίας. Όσον αφορά τις συχνότητες των αλληλοµόρφων, η παρούσα µελέτη έδειξε ότι οι ασθενείς µε ΟΜΛ έχουν περίπου 2.4 φορές µεγαλύτερη πιθανότητα να φέρουν το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο σε οµόζυγη ή ετερόζυγη κατάσταση, σε σύγκριση µε τους µάρτυρες. Από τις συσχετίσεις µεταξύ των γονοτύπων του γονιδίου CYP2B6 µε το φύλο και την ηλικία διάγνωσης των ασθενών, παρατηρήθηκε σηµαντικά υψηλότερη συχνότητα οµοζυγωτών για το µεταλλαγµένο αλληλόµορφο (G/G) µεταξύ των ασθενών ηλικίας µεγαλύτερης των 60 ετών, σε σύγκριση µε τους ασθενείς κάτω των 60 ετών, ενώ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σηµαντική διαφορά µεταξύ των δύο φύλων. Τέλος όσον αφορά την κατανοµή των γονοτύπων του γονιδίου CYP2B6 σε σχέση µε τις καρυοτυπικές αλλοιώσεις, δεν παρατηρήθηκαν σηµαντικές διαφορές από τη σύγκριση των γονοτυπικών κατανοµών µεταξύ των διαφορετικών κυτταρογενετικών οµάδων. Ωστόσο παρατηρήθηκαν στατιστικά σηµαντικές διαφορές µεταξύ των ασθενών µε συγκεκριµένες χρωµοσωµατικές αλλοιώσεις και των υγειών δοτών. Συµπερασµατικά η παρούσα µελέτη αναδεικνύει τον πιθανό ρόλο του πολυµορφισµού A 785 G του γονιδίου CYP2B6 στην προδιάθεση ανάπτυξης της OMΛ και στην δηµιουργία συγκεκριµένων χρωµοσωµατικών αλλοιώσεων που συναντώνται στην ΟΜΛ. 90

94 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ε. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Abstracts Στα πλαίσια της παρούσας διπλωµατικής εργασίας συµµετείχα στα ακόλουθα συνέδρια: The CYP2B6 A 785 G polymorphism in adult patients with Acute Myeloid Leukemia Αικατερίνη Κακοσαίου, Αγγελική αράκη, Φαίδρα Ροσµαράκη, Βασιλική Αλεπόρου, Κωνσταντίνα Σαµπάνη, Παναγούλα Κόλλια, Καλλιόπη N. Μανωλά. 35o Επιστηµονικό Συνέδριο Ελληνικής Εταιρείας Βιολογικών Επιστηµών, Μαΐου 2013, Ναύπλιο Acute myeloid leukaemia (AML) is defined as a clonal disorder with well-known clinical and pathological aspects. Its aetiology underlies the nexus of genetic variants in candidate genes. The CYP2B6 enzyme detoxifies many genotoxic xenobiotics, protecting cells from oxitative damage, chromosomal aberrations and cancer. CYP2B6 Α 785 G gene polymorphism resulting in an aminoacid substitution (Lys262Arg) reduces CYP2B6 enzyme activity. The aim of this study was to determine whether the Α 785 G CYP2B6 polymorphism is implicated to AML susceptibility and/or the occurrence of AML-specific chromosomal abnormalities. Our case-control study is consisted of 100 patients and 180 unrelated healthy volunteers. Genomic DNA was isolated from bone marrow and/or peripheral blood samples. Genotyping was performed by Real-Time PCR and PCR-RFLP. Cytogenetic analysis was successful in 96% of patients. Among them, 69.8% had abnormal karyotypes, 32.3% were complex, while 20.1% exhibited monosomal karyotypes. The most common chromosome aberrations were -7/del(7q) (19.7%), +8 (14.6%), -5/del(5q) (12.5%), abnormalities of 11q23 (7.3%), inv(16) (6.3%), t(15;17) (4.2%) and t(9;22) (3.1%). CYP2B6 genotypic distributions between AML patients and controls showed border statistical significance (p=0.053). Higher frequency of mutant G allele was observed in patients 61years (p=0.037). Interestingly, higher incidence of variant genotypes (heterozygotes A/G and homozygotes G/G) was observed in patients with normal karyotype, as compared to controls (p=0.014). Moreover, a statistically increased frequency of variant genotypes was also observed in patients carrying -7/del(7q) and t(9;22) (p=0.001, p=0.010). Our findings indicate a possible implication of the CYP2B6 polymorphism in AML susceptibility. Reduced enzymatic activity seems to 91

95 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ε. ΠΕΡΙΛΗΨΗ be correlated with the occurrence of certain specific chromosomal abnormalities, such as -7/(del(7q) and t(9;22). According to our knowledge, this is the first report of an association between acute leukemia cases and the CYP2B6 A785G polymorphism. Association of A 313 G glutathione S-transferase P1 germline polymorphism with the susceptibility of de novo Acute Mueloid Leukemia Aggeliki Daraki 1,2, Faidra Rosmaraki 1,2, Sophia Zachaki 1, Katerina Kakosaiou 1,2, Kalliopi-Maria Stavropoulou 1, Constantina Sambani 1, Gabriel E. Pantelias 1, Panagoula Kollia 2, Vassiliki Aleporou 2, Kalliopi N. Manola 1 1 Laboratory of Health Physics & Environmental Health, NCSR Demokritos, Athens, Greece 2 Department of Genetics & Biotechnology, Faculty of Biology, National and Kapodistrian University of Athens, Greece European Society of Human Genetics Conference 2013, June 8-11, Paris-France, abstr P Genetic approaches for understanding the etiology of Acute Myeloid Leukemia (AML) comprise polymorphic variants in xenobiotic metabolizer loci. Glutathione S- transferases (GSTs) are phase II detoxification enzymes, involved in the metabolism of carcinogens and anticancer drugs. GSTP1 gene is subjected to a single nucleotide polymorphism (A 313 G) that decreases the catalytic activity, and consequently, the detoxification capacity. Individuals homozygous for the mutant allele (G/G) have a lower conjugating activity than individuals homozygous for the wild type allele (A/A), while heterozygotes (A/G) display intermediate activity. This study investigates the possible implication of GSTP1 polymorphism in AML susceptibility and AML-specific chromosomal abnormalities. PCR-RFLP assay was applied to detect the GSTP1 polymorphism in 184 de novo AML patients and 370 unrelated healthy donors. Abnormal karyotypes were found in 62.6% of patients and among them, 32.1% and 20.5% had complex and monosomal karyotypes, respectively. A significantly higher incidence of the mutant GSTP1 genotypes (A/G and G/G) was observed in AML patients as compared to the controls (p<0.0001). No association was found between the GSTP1 polymorphism and gender or age. Stratification of patients according to karyotype revealed an increased frequency of G/G homozygotes with normal karyotypes as compared to the abnormal karyotypes (19.5% vs 8.9% respectively, p=0.056). Furthermore, a higher frequency of heterozygotes A/G was observed in patients with -Y, -7/del(7q) and +22. Our results suggest that the GSTP1 A 313 G polymorphism may be a predisposing factor for the development of AML. Moreover, homozygosity of the GSTP1 polymorphism seems to be associated with development of AML with normal karyotype. 92

96 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Ε. ΠΕΡΙΛΗΨΗ Association of GSTP1 polymorphism and chromosome aberrations in Acute Myeloid Leukemia. Aggeliki Daraki 1, Faidra Rosmaraki 1,Katerina Kakosaiou 1, Sophia Zachaki 1,Marina Kalomiraki 1,Vassiliki Aleporou 2, Constantina Sambani 1, Gabriel E. Pantelias 1, Panagoula Kollia 2, Kalliopi N. Manola 1 1 Laboratory of Health Physics & Environmental Health, NCSR Demokritos, Athens, Greece 2 Department of Genetics & Biotechnology, Faculty of Biology, National and KapodistrianUniversity of Athens, Greece 18 th Congress of the European Hematology Association, June , Stocholm- Sweden, Haematologica 2013, Vol 97 abstr 1264, P516. The characterization of Acute Myeloid Leukaemia (AML)is based on cytogenetic findings and genetic alterations. The etiology of AML underlies the nexus of genetic variants in candidate genes. The GSTP1 geneimplicated in the detoxification pathways of manygenotoxicxeniobitics and is subjected to a single-nucleotide polymorphism (A 313 G) leading to abolished GSTP1 enzymatic activity. Homozygotes(G/G) or heterozygotes (A/G) for the mutant allele present decreased enzymatic activity. The present study aimed to investigate the potential implication of GSTP1 polymorphism in AML susceptibility and more specifically in the presence of AML-specific chromosomal abnormalities.chromosome studies were performed on unstimulated cultures derived from 184 AML patients. GSTP1 genotyping was performed by PCR-RFLP assay in all patients and 370 unrelated healthy controls.the sex ratio (males/females) was 1.3:1. FAB classification was available in 102 patients with M2 (32.5%) as the most common subtype. Cytogenetic analysis was successful in 97.3% of patients. Abnormal karyotypewas found in 62.6% of patients and among them, 32.1% were complex while20.5% satisfied the requirements of the monosomal karyotype definition.the most common chromosome aberrations were +8 (21.4%), - 7/del(7q) (20.5%), -5/del(5q) (13.4%), abnormalities of 11q23 (12.5%), t(15;17) (9.8%), t(8;21) (8.0%), -Y (8%), +22 (7.1%) and inv(16) (6.25%). The GSTP1genotypic distribution in patients and controls was significantlydifferent (p<0.0001). An increased frequency of heterozygotes A/G was observed in M2 (70.8%) and M4 (65%) subtypes. Interestingly, a higher frequency of homozygous mutant G/G in AML patients with normal karyotype was observed compared to the abnormal karyotype (p=0.056). Furthermore, a higher frequency of heterozygotes A/G was revealed in AML patients with -Y, -7/del(7q) and +22. Our results suggest that the GSTP1 A 313 G polymorphism may be a predisposing factor for the development of AML-specific abnormalities. Moreover, homozygosity of the GSTP1 polymorphism seems to be associated with development of AML with normal karyotype. 93

97 ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΣΤ. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΚΕΦΑΛΑΙΟ ΣΤ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 94