Molekularna diagnostika

Transcript

1 Molekularna diagnostika Predpogoj za uspešno zdravljenje je pravočasno detektiranje povzročiteljev - velja za ljudi, živali, rastline in okolje. Klasični postopki detekcije so vključevali odvzem okuženega vzorca, rast povzročiteljev bolezni v kulturi in analize fizioloških lastnosti, ki so privedle do identifikacije. Taki postopki pa so zamudni in dragi. Nekateri povzročitelji bolezni so tudi zahtevni za gojenje (npr. Chlamydia trachomatis, obvezni intracelularni parazit). Molekularna diagnostika za identifikacijo ne potrebuje izoliranih patogenov in je zato bolj zanesljiva in hitrejša. Uporabljamo imunološke metode ali analiziramo DNA. Diagnostične metode morajo biti: - specifične (pozitivni rezultat smemo dobiti samo s tarčnim organizmom ali molekulo, ne pa z vsemi ostalimi) - občutljive (zaznati moramo čim manjše količine povzročitelja, tudi v prisotnosti nečistoč) - enostavne (za rutinsko uporabo) Novejše metode omogočajo detekcijo signala tudi pri DNA iz onesnaženih vzorcev.

2 Vrste testiranj (splošno) presejalno (možnost, da pride do razvoja bolezni); npr. AFP diagnostično (zaznavanje obstoječe bolezni); npr. amniocenteza, CVS Predanalizna stopnja: - odvzem vzorca - stabilizacija DNA - liziranje vzorca - izolacija DNA Analizna stopnja: - modificiranje / pomnoževanje DNA - detekcija DNA - analiza podatkov

3 Molekularno citogenetska analiza z metodo fluorescentne in situ hibridizacije FISH Metoda fluorescentne in situ hibridizacije omogoča odkrivanje kromosomskih sprememb, ki jih s citogenetskimi metodami ni mogoče odkriti. Razlogi za FISH preiskavo: * prenatalna diagnostika - ultrazvočno odkrite nepravilnosti ploda, pri katerih je prisotna velika verjetnost kromos. nepravilnosti, - samoplačniško. * postnatalna diagnostika - sum na mikrodelecijske sindrome, - odkrivanje nejasnih kromosomskih preureditev, - sum na subtelomerne preureditve pri nepojasnjeni duševni manjrazvitosti, - identifikacija marker kromosoma. Vrsta preiskave Odkrivanje številčnih kromosomskih nepravilnosti za kromosome 13, 18, 21, X in Y Določanje spola Ugotavljanje mikrodelecij Subtelomerni FISH Trajanje 2-3 dni 2-3 dni 10 dni 3-4 tedne

4 Molekularno-genetska diagnostika genskih nepravilnosti (genopatij) temelji na potrditvi klinične diagnoze, prenatalni diagnostiki in predsimptomatski diagnostiki ter preiskavi družinskih članov v povezavi z genetskim informiranjem (svetovanjem). Laboratorij izvaja diagnostiko genetskih bolezni, ki so posledica sprememb na nivoju genomske DNA, z uporabo različnih metod (PCR: verižna reakcija s polimerazo, metoda Southern blot ). BOLEZEN / PREISKAVA TRAJANJE PREISKAVE - tedni SPINOCEREBELARNA ATAKSIJA tip 1,2,3,6,7 (SCA) - ugotavljanje števila ponovitev: (CAG)n 4 UGOTAVLJANJE MIKRODELECIJ KROMOSOMA Y 2 UGOTAVLJANJE MUTACIJ V GENU ZA HEMOKROMATOZO - C282Y, H63D, S65C 2 UGOTAVLJANJE MUTACIJE V GENU ZA FAKTOR V G>A 2 UGOTAVLJANJE MUTACIJE V GENU ZA PROTROMBIN G>A 2 UGOTAVLJANJE MUTACIJE V GENU ZA METILEN-TETRA-HIDRO- FOLAT REDUKTAZO (MTHFR) - 677C>T 2 IZOLACIJA DNA (glej navodila za odvzem in pošiljanje vzorcev) po dogovoru - Kri / - horionske resice / - kultura amniocitov / - rezine zmrzlega tkiva

5 Predimplantancijska genetska diagnostika (PGD) pri oploditvah in vitro testirajo prisotnost anevploidije (trisomij ali izpadov kromosomov), translokacij in okvar posameznih genov ter status HLA vzorec za analizo so embrionalne celice po biopsiji ali polarno telesce (ko analizirajo samo materino polovico genskega nabora)

6 DNA-diagnostika Genetski material vsebuje vse bistvene informacije, ki opredeljujejo povzročitelja bolezni (npr. virulenčni geni) ali mutacije, ki povzročijo nastanek bolezni pri človeku (npr. cistična fibroza). Osnova za izvedbo testov je dolgo bila hibridizacija (glej sklop D2), v zadnjem času pa PCR. Postopek s hibridizacijo ima naslednje ključne stopnje: - vezava tarčne ssdna na membrano - vezava sonde (ssdna) pod pogoji, ki omogočajo hibridizacijo s tarčo - spiranje membrane - detektiranje hibridnih zaporedij Specifičnost zagotavlja sestava sonde - ta se sme vezati samo na zaporedje, ki ga želimo detektirati. Sonde so lahko DNA ali RNA, kratke (<50 b) ali dolge (>100 b), sintetizirane ali klonirani geni ali fragmenti naravne DNA. Razlikujejo lahko med vrstami ali sevi povzročitelja ali med posameznimi geni.

7 DNA-diagnostika /2 Zaporedje, ki bi ga lahko uporabili kot sondo, lahko poiščemo tako, da pripravimo genomsko plazmidno knjižnico patogenega seva, nato pa hibridiziramo na membrani z razrezano genomsko DNA nepatogenega in patogenega seva. Signal, ki ga dobimo samo z DNA iz patogenega organizma, lahko služi kot sonda. Testirati je treba še, če ne reagira z DNA v okolju, v katerem pričakujemo patogeni organizem (npr. človeške celice). Detekcija signala: - radioaktivno označene sonde (P-32) - neradioaktivno označevanje npr. z biotinom označene sonde vezava avidina ali streptavidina vezava reporterskega encima (alkalna fosfataza, peroksidaza) reakcija s kromogenim ali kemoluminiscentnim substratom

8 DNA-diagnostika: malarija Diagnosticiranje malarije Malarijo povzroča parazit Plasmodium falciparum, ki inficira in razgradi eritrocite. Klasična analiza je mikroskopska (zamudno), obstajajo pa tudi imunološke metode (zaznajo Ab in tako detektirajo tudi prebolele bolezni). P. falciparum ima v genomu značilne ponovitve zaporedij. Pripravili so genomsko knjižnico in jo hibridizirali z označeno razrezano genomsko DNA. Izbrali so klone, ki so dali najmočnejše signale in jih testirali z DNA iz nepatogenih vrst rodu Plasmodium. Izbrana sonda detektira >10 pg čiste DNA P. falciparum (1 ng v krvi). Podobno so pripravili sonde za detekcijo mnogih bakterijskih povzročiteljev bolezni (Legionella pneumophila, Salmonella typhi, patogeni sevi E. coli).

9 DNA-diagnostika: dedne bolezni DNA-diagnostika nam omogoča, da prepoznamo nosilce dednih bolezni in ocenimo nevarnost, da obolijo sami ali njihovi potomci. Diagnosticiranje anemije srpastih celic ASC je dedna bolezen, ki jo povzroča točkovna mutacija v zapisu za β-verigo (hemo)globina (Glu6Val). Molekula Hb je pri homozigotih strukturno spremenjena; protein ne more vezati dovolj kisika, kar privede do anemije in poškodb srca in drugih organov. Heterozigoti ne zbolijo, so pa prenašalci gena. Bolezen je pogostejša med temnopoltimi Afričani in Latinoameričani, zato v ZDA rutinsko testirajo prebivalstvo. Z mutacijo se eliminira restrikcijsko mesto za CvnI: CC/TNAGG CCTGTGG Če pomnožimo regijo, ki morda vsebuje mutacijo, in produkt režemo s CvnI, lahko po AGE in barvanju z etidijevim bromidom detektiramo razliko med normalnim in mutiranim zapisom - hibridizacija ni potrebna. Lahko pa s CvnI razrezan gen za β-globin hibridiziramo s sondo, ki predstavlja fragment med prvima dvema mestoma CvnI v normalnem genu. Iz razporeditve in velikosti označenih fragmentov lahko določimo genotip preiskovancev. Zaradi točkovne mutacije namreč pride do razlik v razporeditvi restrikcijskih fragmentov (RFLP): SNP (single nucleotide polymorphism).

10 DNA-diagnostika: PCR/OLA V primeru, ko mutacija ne povzroči spremembe v sliki restrikcijskih fragmentov, moramo izvesti detekcijo na drugačen način. PCR/OLA: PCR v kombinaciji s preskusom ligiranja oligonukleotidov Sintetiziramo 2 oligonukleotida, ki se hibridizirata na normalnem zapisu (stikoma) levo in desno od mesta, kjer je možna (z boleznijo povezana) mutacija. Oba oligonukleotida sta na koncu označena, en z biotinom, drugi z digoksigeninom. Tarčno DNA pomnožimo in hibridiziramo z označenima oligonukleotidoma ter dodamo ligazo. Če je bila mutacija prisotna, se označena oligonukleotida ne bosta mogla povezati, če pa mutacije ni, pa se povežeta. [Pripravimo lahko tudi obrnjen poskus - da se oligonukleotida hibridizirata na mutirano zaporedje, ne pa na naravno.] Po hibridizaciji DNA denaturiramo, da se (ne)ligirana kratka DNA sprosti, in DNA preko biotina vežemo na imobiliziran streptavidin. Dodamo še protitelesa proti digoksigeninu, ki so konjugirana z alkalno fosfatazo ter substrat in detektiramo obarvani produkt. Obstajajo avtomatizirani postopki za analizo po opisanem postopku, ki imajo kapaciteto do 1200 vzorcev dnevno.

11

12 DNA-diagnostika: fluorescenčne oznake Mutacije, ki se pojavljajo na enem mestu, lahko detektiramo s PCR v postopku s tremi oligonukleotidi. Dva se prekrivata z regijo, kjer je možna mutacija: eden, ki ga označimo z rodaminom, (P1) ima zaporedje, ki je komplementarno naravnemu, drugi, ki je komplementaren mutiranemu zaporedju, pa je označen s fluoresceinom (P3). Tretji oligonukleotid (P2) se veže na oddaljeno regijo in ni označen. V reakciji se bo odvisno od tarčnega zaporedja v vzorcu DNA pomnoževal zapis z enim ali drugim od markiranih oligonukleotidov ali pa z obema, če gre za heterozigotno zaporedje. ZDA (2000): >250 molekularno-diagnostičnih laboratorijev testira za >500 genskih napak (2005): >1400 laboratorijev

13 Diagnosticiranje več mutacij Če moramo detektirati znotraj enega gena več mutacij, ki lahko povzročijo bolezen, postopek vključuje PCR in hibridizacijo. Primer: talasemija β: 8 možnih mutacij v genu za globin β; heterozigoti imajo rahle znake bolezni, homozigoti z mutacijo na kateremkoli od 8 mest pa morajo dobivati zdravila in transfuzije. Sintetizirati je treba oligonukleotide (po 20 b), ki se popolnoma ujemajo z zaporedjem na mestu mutacije, na 3 -konec pa dodamo homopolimerni rep iz ~400 T. Preko tega repa sondo vežemo na točno določeno mesto na najlonski membrani. DNA, ki jo testiramo, pomnožimo v 1 reakciji s pari oligonukleotidov, ki pomnožujejo posamezne regije z mutacijami. Po eden iz para teh oligonukleotidov je označen na 5 -koncu z biotinom. Produkte PCR hibridiziramo z oligonukleotidi na membrani ob pogojih, ki dovoljujejo samo popolno ujemanje. Dodamo streptavidin, konjugiran z alkalno fosfatazo, membrano speremo in dodamo substrat; na mestu vezave produkta PCR (fragmenta z možno mutacijo) na pritrjen mutantni oligonukleotid se pojavi lisa.

14 Hitri DNA-testi Testi over-the-counter / osebni kompleti za analizo DNA: za odvzem vzorca doma in analizo v centralnem laboratoriju: sporno zaradi odsotnosti zdravnika / genetskega svetovalca. Genomski servisi posredujejo podatke o SNP-jih, ki so lahko povezani s pojavnostjo nekaterih bolezni. Odprta vrata DNA-testiranju domačih živali in živine.

15 Markerji RAPD RAPD = naključno pomnožena polimorfna DNA Vzorec fragmentov DNA je uporaben tudi v identifikaciji sort in kultivarjev v agronomiji. Fragmente DNA dobimo s PCR. Kot oligonukleotid uporabimo 9-10-mere s 50-80% (G+C) brez palindromnih zaporedij. Taki oligonukleotidi se bodo naključno vezali na kromosomsko DNA in (zaradi tako izbranih reakcijskih pogojev) pomnoževali fragmente dolžine bp. Vedno v reakciji uporabimo samo 1 oligonukleotid. Ker ne moremo vnaprej predvideti, kam se bo oligonukleotid vezal (morda pa se sploh ne bo), so rezultati nepredvidljivi, vendar z uporabo istega oligonukleotida in DNA iste rastline dobimo enak vzorec fragmentov. Za zelo podobne sorte rastlin bo treba verjetno izvesti več PCR z različnimi oligonukleotidi, preden bomo uspeli detektirati razliko v sliki generiranih fragmentov. Prednosti metode: iste oligonukleotide lahko uporabimo za različne rastlinske vrste; ni potrebno prenašanje na membrane, hibridizacija, označevanje; ni potrebno predznanje o zaporedjih, na katera se naj veže začetni oligonukleotid.