μέγεθος της πρωτεΐνης (αριθμός αμινοξέων ) διαιρούμενο με τον χρόνο transit

Μέγεθος: px

Εμφάνιση ξεκινά από τη σελίδα:

Download "μέγεθος της πρωτεΐνης (αριθμός αμινοξέων ) διαιρούμενο με τον χρόνο transit"

Ακακιος Αλεξίου
7 χρόνια πριν
Προβολές:

1 Η συνολική ταχύτητα της πρωτεϊνοσύνθεσης μπορεί να προσδιορισθεί ελέγχοντας το πόσο γρήγορα ενσωματώνονται στις αναπτυσσόμενες πρωτεΐνες ραδιενεργά σεσημασμένα αμινοξέα τα οποία προστίθενται στο μέσο επώασης Ο τρόπος προσδιορισμού παρουσιάζει Ο τρόπος προσδιορισμού παρουσιάζει προβλήματα τα οποία μπορούν να οφείλονται,στην μεταβλητή ποσότητα των μη ραδιενεργών αμινοξέων,στην de novo σύνθεση μη ραδιενεργών αμινοξέων καθώς και στην αποικοδόμηση των νεοσυντιθεμένων πρωτεϊνών

2 Μια άλλη προσέγγιση για να προσδιορίσουμε την ταχύτητα της πρωτεινοσύνθεσης στα κύτταρα είναι προσδιορίζοντας την ταχύτητα επιμήκυνσης/λήξης αλλά και τον αριθμό των ενεργών ριβοσωμάτων στο κύτταρο Η ταχύτητα επιμήκυνσης είναι ιση με το μέσο Η ταχύτητα επιμήκυνσης είναι ιση με το μέσο μέγεθος της πρωτεΐνης (αριθμός αμινοξέων ) διαιρούμενο με τον χρόνο transit

3 Το μέσο μέγεθος των πρωτεϊνών που συντίθεται μπορεί να προσδιορισθεί αναλύοντας τις ραδιενεργά σεσημασμένες πρωτεΐνες σε SDS πήκτωμα ακρυλαμίδης και προσδιορίζοντας την ποσότητα με φλουορογραφία την ποσότητα ραδιενέργειας που ενσωματώνεται σε πρωτεΐνη συγκεκριμένου Μοριακού βάρους

4 Ο χρόνος trans it του ριβοσωματίου αναφέρεται στον χρόνο π ου απ αιτείται για να επ ιμηκυνθεί και να ολοκληρωθεί μια αρτιγενής π ολυπ επ τιδική αλυσίδα μετά την έναρξη Ο χρόνος trans it μετράται π ροσθέτοντας Ο χρόνος trans it μετράται π ροσθέτοντας ραδιενεργά αμινοξέα σε μία κυτταροκαλλιέργεια και μετέπ ειτα ανάλυση των δειγμάτων π ου λαμβάνονται σε διάφορα χ ρονικά διαστήματα

5 Προσδιορισμός Χ ρόνος T rans it του ριβοσωματίου Κ ύτταρα σημαίνονται με ραδιενεργό μεθειονίνη Κ ύτταρα επ ωάζ ονται και φυγοκεντρούνται για διάφορα χρονικά διασ τήματα Έ να κλάσμα του ομογενοπ οιήματος υφίσταται καταβύθιση με τριχ λωροξεικό οξύ π ροκειμένου να μετρηθεί η ενσωμάτωση της ραδιενεργού μεθειονίνης στις π ρωτεΐνες (ολική ενσωμάτωση) Έ να δεύτερο κλάσμα φυγοκεντρείται π ροκειμένου να έλθουν στο ίζημα τα ριβοσωμάτια όπ ου π εριέχονται οι αρτιγενείς π ολυπ επ τιδικές αλυσίδες ενώ στο υπ ερκείμενο ευρίσκονται οι ελεύθερες π ρωτεΐνες π ου έχουν συντεθεί

6 O χρόνος που απαιτείται για την ενσωμάτωση ραδιενέργειας στο σύνολο των πρωτεϊνών είναι διαφορετικός από τον χρόνο που απαιτείται για την ενσωματωση στις απελευθερονομένες πρωτεΐνες η διαφορά αυτών των χρόνων ισούται με τον μισό transit time

7 Ο απόλυτος αριθμός των ριβοσωματίων ανά κύτταρο μπορεί να προσδιορισθεί ως εξης Το ομογενοποιημα υπερφυγοκεντρείται τα ριβοσωμάτια κααβυθίζονται και στο ίζημα που περιέχονται τα ριβοσωμάτια μετραται η οπτική πυκνότητα Τα ριβοσωμάτια από τον συνολικό πληθυσμό που συμμετέχουν ενεργά στην πρωτεινοσύνθεση μπορούν να προσδιορισθούν με υπερφυγοκέντριση του ομογενοποιήματος των κυττάρων σε γραμμικά μεταβαλλόμενη κλίση σακχαρόζης

8 Ενεργά ριβοσώματα είναι αυτά που βρίσκονται οργανωμένα σε πολυσώματα συν μια μικρή ποσότητα από τα μονοσώματα.η 80S κορυφή είναι μείγμα ριβοσωματίων που μεταφράζουν και ριβοσωματίων που δεν μεταφράζουν Η οπτική πυκνότητα στην περιοχή των Η οπτική πυκνότητα στην περιοχή των πολυσωμάτων διαιρουμένη με την ολική πυκνότητα από την 40S υπομονάδα μέχρι τον βυθό της κλίσης αντιπροσωπεύει το ποσό των ριβοσωματίων που συμμετέχουν ενεργά στην πρωτεινοσύνθεση

12 Πληροφορίες για το ποια φάση της πρωτεϊνοσύνθεσης είναι ο περιοριστικός παράγων της πρωτεϊνοσύνθεσης έχουν συλλεχθεί εξετάζοντας την κατανομή των πολυσωμάτων. Το μέγεθος των πολυσωμάτων (αριθμός των ριβοσωμάτων ανά mrna) προσδιορίζεται από τρεις παραμέτρους: Είναι ανάλογος προς το μήκος της κωδογόνου περιοχής του mrna. Είναι ανάλογος προς την ταχύτητα έναρξης. Είναι αντιστρόφως ανάλογος προς την ταχύτητα επιμήκυνσης. Κατά μέσο όρο στα φυτικά πολυσώματα έχουμε ένα ριβόσωμα κάθε νουκλεοτίδια.

13 Κ ατά μέσ ο όρο τα ριβοσ ω μάτια διευθετούνται σ τα φυσ ικά π ολυσ ώματα κάθε νουκλεοτίδια Γ ια π αράδειγμα το μέσο μέγεθος των π ολυσωμάτων για γλοβίνες είναι π ερίπ ου 5 ριβοσωμάτια ανά mr NA η αλλιώς ένα ριβόσωμα κάθε 90 νουκλεοτίδια στην κωδικοπ οιούσα π εριοχή Ό ταν η σύνθεση αναστέλλεται με κυκλοεξιμίδιο ώστε ο π εριοριστικός π αράγοντας να είναι η ταχ ύτητα επ ιμήκυνσης τα π ολυσώματα αυξάνονται σε μέγεθος (π ερισσότερα απ ό 12 ριβοσωμάτια ανά μόριο mr NA γλοβίνης ) ή αλλιώς ένα ριβόσωμα κάθε νουκλεοτίδια

14 Το όριο για σ φικτό π ακετάρισ μα των ριβοσ ω ματίω ν σ το π ολύσ ωμα δεν μπ ορεί να ξεπ εράσ ει ένα ριβόσ ω μα ανά νουκλεοτίδια μια και ένα ριβόσ ωμα καταλαμβάνει π ερ ίπ ου 30 νουκλεοτίδια Βεβαίως οι μέσες π υκνότητες των π ολυσωμάτων μέσα στο κύτταρο είναι π ολύ μικρότερες και αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι ταχύτητες έναρξης είναι αρκετά χαμηλότερες σε σχέση με τις ταχύτητες επ ιμήκυνσης

15 Υ π ό φυσιολογικές συνθήκες όταν η ταχύτητα της π ρωτεινοσύνθεσης ελαττώνεται τα π ολυσώματα γίνονται μικρότερα εάν η αναστολή επ ηρεάζ ει την έναρξη ενώ π αραμένουν μεγάλα ή γίνονται ακόμη μεγαλύτερα εάν επ ηρεάζεται η ταχύτητα επ ιμήκυνσης

16 Πολυσ ω μική ανάλυσ η χρησ ιμοπ οιείται ευρέω ς για να αξιολογηθούν αλλαγές σ την μετάφρασ η τω ν ειδικώ ν mr NAs Σ τις π εριπ τώσεις αυτές η π οσότητα των ειδικών mr NA στα κλάσματα της γραμμικά μεταβαλλόμενης κλίσης π ου αντιστοιχούν στο profile των π ολυσωμάτων π ροσδιορίζεται με τεχνικές υβριδοπ οίησης Αλλαγές στον αριθμό των ριβοσωμάτων ή αλλαγές στην π οσότητα του mr NA μπ ορούν να χρησιμοπ οιηθούν π ροκειμένου να γίνουν κατανοητές μεταβολές στην π ρωτεινοσύνθεση

17 Ε άν το μέγεθος τω ν π ολυσ ωμάτων ελαττώ νεται είτε η έναρξη ανασ τέλλεται είτε η επ ιμήκυνσ η αυξάνεται ή σ υμβαίνουν και τα δύο Σ την συντριπ τική π λειοψηφία των Σ την συντριπ τική π λειοψηφία των π εριπ τώσεων επ ηρεάζεται η έναρξη Αντίθετα αύξηση στο μέγεθος των π ολυσωμάτω ν σημαίνει είτε αυξημένη ταχ ύτητα έναρξης ή ελαττωμένη ταχ ύτητα επ ιμήκυνσης

18 Σ ε μια μεταβολή στο μέγεθος των π ολυσωμάτων π ροκειμένου για να διευκρινισθεί τι ακριβώς συμβαίνει θεωρείται σκόπ ιμο να μετρηθεί η ταχύτητα επ ιμήκυνσης μετρώντας τον χρόνο trans it π ου απ αιτείται για να μεταφρασθεί ένα mr NA Όταν η ταχύτητα επ ιμήκυνσης ελαττώνεται ενώ συγχρόνως σμικρύνονται τα π ολυσώματα είναι βέβαιο ότι η αναστολή π αρατηρείται κατά την έναρξη

20 Η αναστολή ή η ενεργοπ οίηση της σύνθεσης μιας π ρωτεΐνης δεν επηρεάζει π άντοτε το μέγεθος των π ολυσωμάτων.μπ ορεί να επ ηρεάζεται ο αριθμός των μεταφραζ όμενων μηνυμάτω ν απ λά καλύπ τοντας τα συγκεκριμένα μηνύματα ή κινητοπ οιώντας τα π ρος τα π ολυσώματα. Κ ατά συνέπεια επ ηρεάζεται η αναλογία των mr NA π ου υπ άρχουν σε μη ενεργά mr NP σε σχέση με αυτά π ου βρίσκονται σε π ολυσώματα Σ τις π εριπ τώσεις αυτές εχωμε μεταβολές στην π οσότητα των μηνυμάτων π ου βρίσκονται στα π ολυσώματα όμως το μέγεθος των π ολυσωμάτων διατηρείται σταθερό

21 Η μέθοδος π ου π αραπ άνω π εριγράφηκε μπ ορεί να χ ρησ ιμοπ οιηθεί επ ίσ ης για την μέτρησ η της ταχύτητας έναρξης της μετάφρασ ης για εξειδικευμένα mr NA Η Τ αχύτητα έναρξης π χ ο αριθμός των συμπ λεγμάτων έναρξης π ου δημιουργούνται στην μονάδα του χρόνου μπ ορεί να υπ ολογισθεί απ ό τον αριθμό των ριβοσωματίων π ου μεταφράζ ει ένα mr NA (μέγεθος π ολυσώματος) και τον χρόνο π ου απ αιτείται για να διατρέξει το ριβόσωμα το μήνυμα (χρόνος T rans it) Αριθμός συμπ λεγμάτων έναρξης/μοναδα χρόνου = Μέγεθος π ολυσωμάτων/trans it time

22 Απ ό τον P almiter έγιναν κάπ οιοι ενδιαφέροντες υπ ολογισ μοί όσ ον αφορά την μετάφρασ η του mr NA της οβαλβουμίνης σ τον ω αγω γό όρνιθας

23 Υπάρχουν περιπτώσεις που ρυθμίζεται η ταχύτητα επιμήκυνσης Διερευνηση ενός αριθμού ειδικών mrna δειχνει ότι εχουν ευρεθεί μικρές ή ελάχιστες αλλαγές στην ταχύτητα επιμήκυνσης υπό την επίδραση διαφόρων παραγόντων όπως ορμόνες ή άλλοι παράγοντες Από την άλλη πλευρά η ταχύτητα επιμήκυνσης για το Από την άλλη πλευρά η ταχύτητα επιμήκυνσης για το mrna της αμινοτρανσφεράσης της τυροσίνης διεγείρεται πεντε φορές όταν ηπατικά κύτταρα κατεργασθούν με διβουτυρυλικό camp.ενώ η ταχύτητα επιμηκυνσης για το mrna της βιτελογενίνης όταν ήπαρ κατεργασθεί σε οργανοκαλλιεργεια με β-οιστραδιόλη

Σχετικά έγγραφα

Τ ι είναι όμως αυτό π ου π ροσδιορίζει τα γεγονότα εναρξης στην μονάδα του χρόνου

Τ ι είναι όμως αυτό π ου π ροσδιορίζει τα γεγονότα εναρξης στην μονάδα του χρόνου Τ έσσερεις είναι οι κύριες π αράμετροι π ου επηρεάζουν ή προσδιορίζουν την ταχύτητα μιας σφαιρικής π ρωτεΐνης. Ποσότητα