Μελέτη της γενετικής ποικιλότητας στο κολοκύθι (Cucurbita pepo) με ουδέτερους και βασισμένους σε γονίδια μοριακούς δείκτες.

Transcript

1 Μελέτη της γενετικής ποικιλότητας στο κολοκύθι (Cucurbita pepo) με ουδέτερους και βασισμένους σε γονίδια μοριακούς δείκτες Αλίκη Ξανθοπούλου Μεταπτυχιακή διατριβή 2013

2 Επιβλέπουσα Καθηγήτρια Ειρήνη Νιάνιου-Ομπεϊντάτ Επίκουρος Καθηγήτρια, Σχολή Γεωπονίας, Α.Π.Θ. Μέλη Eξεταστικής Επιτροπής Αλέξης Πολύδωρος Επίκουρος Καθηγητής Σχολή Γεωπονίας Παναγιώτης Μαδέσης Ερευνητής γ βαθμίδος ΙΝΕΒ/ΕΚΕΤΑ 2

3 αφιερωμένο στην γιαγιά μου Αθηνά Γκαντίδου 3

4 Ευχαριστίες Αρχικά θα ήθελα να ευχαριστήσω την επιβλέπουσα καθηγήτρια μου Ειρήνη Νιάνιου- Ομπεϊντάτ, επίκουρο καθηγήτρια του Α.Π.Θ., Σχολή Γεωπονίας για την πολύτιμη επιστημονική και ηθική υποστήριξη που μου προσέφερε κατά την διάρκεια των μεταπτυχιακών μου σπουδών καθώς και για την βοήθεια της στην λογική ροή και δομή της μεταπτυχιακής μου διατριβής. Οφείλω τις θερμές μου ευχαριστίες στον Αλέξη Πολύδωρο, επίκουρο καθηγητή του Α.Π.Θ., Σχολή Γεωπονίας και μέλος της τριμελής επιτροπής μου για τις συμβουλές στην δομή της διατριβής μου, την καθοδήγηση του και το αμείωτο ενδιαφέρον του καθόλη την διάρκεια της διεκπεραίωσης της διατριβής αυτής. Ιδιαίτερη μνεία αξίζει ο Παναγιώτης Μαδέσης, Ερευνητής Γ βαθμίδος ΙΝΕΒ/ΕΚΕΤΑ για την πνευματική, επιστημονική και ψυχολογική στήριξη που μου έδειξε καθώς και για την ανεκτικότητα του καθ όλη την διάρκεια της υλοποίησης των πειραμάτων μου στο Ινστιτούτο Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών (ΙΝΕΒ, ΕΚΕΤΑ). Επίσης θέλω να ευχαριστήσω τον κ. Κωνσταντίνο Πασέντση, τεχνικό επιστήμονα του INΕΒ, για την σημαντική τεχνική υποστήριξη που μου έδειξε, την Δρ. Αφροδίτη Τσάμπαλλα που χωρίς την συμβολή της στα πρώτα μου δειλά βήματα στον κόσμο του εργαστηρίου δεν θα μπορούσα να ανταπεξέλθω στις εργαστηριακές απαιτήσεις της μεταπτυχιακής μου διατριβής, όλα τα μέλη του Ινστιτούτου Εφαρμοσμένων Βιοεπιστημών για την ευχάριστη συνεργασία καθώς και την κ. Παρθενώπη Ράλλη και την Ελληνική Τράπεζα Γενετικού Υλικού του Ελληνικού Γεωργικού Οργανισμού Δήμητρα (ΕΛΓΟ -ΔΗΜΗΤΡΑ) που βρίσκεται στην Θέρμη της Θεσσαλονίκης για την χορηγία των σπόρων κολοκυθιού. Επιπλέον θα ήθελα να αναγνωρίσω την συνεισφορά του συντρόφου μου Ιωάννη Γανόπουλου που χωρίς την ανιδιοτελή, αμέριστη και ανυπολόγιστη υποστήριξη του αλλά και τις εποικοδομητικές επιστημονικές συζητήσεις σε εύκολες αλλά και δύσκολες στιγμές θα ήταν αδύνατη η ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής. Τέλος θέλω να εκφράσω την ευγνωμοσύνη μου στην μητέρα μου Φωτεινή Δαλίπη και την γιαγιά μου Αθηνά Γκαντίδου για την οικονομική και ηθική βοήθεια τους καθώς και την αγαπημένη μου αδερφή Αιμιλία Ξανθοπούλου για την ολόψυχη αγάπη και την συνεχή ενθάρρυνση που μου προσέφερε

5 Περιεχόμενα ΠΕΡΙΛΗΨΗ 7 ABSTRACT 8 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ 9 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Κολοκυνθοειδή Ιστορία, Προέλευση και Βοτανική Ταξινόμηση Οικονομική σημασία των κολοκυνθοειδών Διατροφική αξία Βελτιωτικά επιτεύγματα Μοριακοί δείκτες Λειτουργικοί ή εντοπισμένοι σε γονίδια μοριακοί δείκτες Εντός Απλών Επαναλαμβανόμενων Αλληλουχιών (ISSR) Πολυμορφισμοί Στοχευμένοι στο Κωδικόνιο Έναρξης (SCoT) Απλές Επαναλαμβανόμενες Αλληλουχίες (SSRs) Τεχνικές ανάλυσης των Μοριακών Δεικτών Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Σύγκριση Καμπυλών Τήξης σε Υψηλή Ανάλυση (HRM) Γενετική ποικιλότητα Τοπικές ποικιλίες και η χρησιμότητα τους στην βελτίωση 28 2.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Φυτικό γενετικό υλικό Απομόνωση DNA Ανάλυση των μοριακών δεικτών ISSR και SCoT Ανάλυση HRM των μοριακών δεικτών EST-SSR Στατιστική ανάλυση Μαθηματικοί τύποι στατιστικών παραμέτρων Βιοπληροφορική ανάλυση 37 5

6 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Ανάλυση των Μοριακών Δεικτών ISSR Ανάλυση των Μοριακών Δεικτών SCoT Φυλογενετική σύγκριση των Μοριακών Δεικτών ISSR και SCoT Ανάλυση των Μοριακών Δεικτών EST-SSR Βιοπληροφορική ανάλυση των γονιδίων πάνω στα οποία σχεδιάστηκαν οι δείκτες EST-SSR με την βοήθεια του αλγόριθμου BLASTx ΣΥΖΗΤΗΣΗ Μοριακοί δείκτες ISSR και SCoT Μοριακοί δείκτες EST-SSR ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ 71 6

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Το κολοκύθι (Cucurbita pepo), είναι ένα παγκόσμια καλλιεργούμενο είδος που κατάγεται από το Μεξικό και χαρακτηρίζεται από εξαιρετικά μεγάλη παραλλακτικότητα ως προς τα χαρακτηριστικά του καρπού του. Τα περισσότερα ευρέως καλλιεργούμενα εμπορικά είδη ανήκουν στις επιμήκεις μορφές του είδους C. pepo ssp. pepo. Στην παρούσα μελέτη διερευνήθηκε η γενετική ποικιλομορφία τριάντα έξι ελληνικών παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού χρησιμοποιώντας Πολυμορφισμούς Στοχευμένους στο Κωδικόνιο Έναρξης (SCoT δείκτες) και Πολυμορφισμούς Εντός Απλών Επαναλαμβανόμενων Αλληλουχιών (ISSR δείκτες) καθώς και Απλές Επαναλαμβανόμενες Αλληλουχίες (SSR δείκτες). Επίσης, συγκρίθηκε η πληροφοριακή ικανότητα και η αποτελεσματικότητα των μοριακών δεικτών ISSR και SCoΤ. Τo δενδρόγραμμα που προέκυψε από τον συνδυασμό δεδομένων των ISSR και SCoΤ ταξινόμησε τις παραδοσιακές ποικιλίες σε έξι διακριτές ομάδες. Τα διαγράμματα διασποράς της Ανάλυσης Κυρίων Συντεταγμένων (PCA) ενίσχυσαν περαιτέρω τα αποτελέσματα των δενδρογραμμάτων. Επιπλέον συνδυάστηκε η Σύγκριση Καμπυλών Τήξης σε Υψηλή Ανάλυση (HRM) με τους μοριακούς δείκτες EST-SSR, προκειμένου να γίνει η ταυτοποίηση των τριάντα έξι ελληνικών παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού. Οι έξι δείκτες EST-SSR χρησιμοποιήθηκαν ήταν πληροφοριακοί και παρήγαγαν ένα μοναδικό προφίλ καμπυλών τήξης για κάθε γενότυπο επιτρέποντας τη σύγκριση και την ταξινόμησή τους. Σύμφωνα με βιοπληροφορική ανάλυση οι δείκτες EST- SSR που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη βρέθηκε να είναι υβριδοποιημένοι γονίδια που συσχετίζονται με την αντίδραση των φυτών σε στρες από βαρέα μέταλλα καθώς και από βιοτικές καταπονήσεις. Τα αποτελέσματα αποδεικνύουν που σε ότι ο συνδυασμός σωστά επιλεγμένων δεικτών EST - SSR και ανάλυσης HRM αποτελεί χρήσιμο εργαλείο στην αξιολόγηση της βιοποικιλότητας καθώς και στην διαχείριση του γενετικού υλικού κολοκυθιού σε προγράμματα βελτίωσης. 7

8 ABSTRACT Cucurbita pepo (squash, pumpkin, gourd), a worldwide cultivated vegetable of American origin, is extremely variable in fruit characteristics. Most of its widely grown commercial types are known as summer squashes and belong to the elongated forms of C. pepo ssp. pepo (Cocozelle, Vegetable marrow and Zucchini groups). The conservation and characterization of summer squash (Cucurbita pepo) genetic resources in germplasm banks have been the basis of their use in breeding programmes that result in development of new cultivars. The genetic diversity of thirty six summer squash landraces from Greece were investigated using start codon targeted (SCoT) polymorphism and inter-simple sequence repeat (ISSR) as well as Simple Sequence Repeats (SSR) based on ESTs markers. In this study, we compared the informativeness and efficiency of the molecular markers SCoT and ISSR in the analysis of 36 landraces of Cucurbita pepo germplasm. For this, we considered the marker s discriminatory power and level of polymorphism detected and also the genetic relationships, clustering (dendrogram) and Principal Coordinate (PCA) analysis. To our knowledge, this is the first detailed comparison of performance among the targeted DNA region molecular markers (SCoT) and the ISSR technique on a set of samples of C. pepo. Furthermore, we have integrated the High Resolution Melting (HRM) analysis method with EST-SSR marker genotyping, in order to facilitate the identification of thirty six summer squash landraces originated from Greece. The six EST-SSR loci used were informative and generated a unique melting curve profile of EST derived microsatellites for each accession allowing their comparison and classification. We were able to construct a highly informative and discriminative dendrogram where the 36 genotypes were classified in 6 distinct clusters. Moreover, we acquired information about the genes containing the EST- SSRs using bioinformatic tools. We found that the EST-SSRs used in this study were hybridizing to genes involved in stress response to heavy metals and biotic stresses. The results presented here suggest that the panel of EST-SSR markers used in combination with HRM analysis could be useful in a variety of applications, like squash biodiversity assessment but most importantly in managing squash germplasm to improve breeding programs. 8

9 ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ ABA = Abscisic acid = Αμπσισικό οξύ ACBP = Acyl-CoA-binding protein = Ακυλό- CoA πρωτεΐνες πρόσδεσης AFLPs = Amplified fragment length polymorphisms = Πολλαπλασιασμός Πολυμορφικών Τμημάτων DNA εκ Περιορισμού ATG = Κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης BLAST = Basic Local Alignment Statistical Tool = Εργαλείο Έρευνας Βασικής Τοπικής Ευθυγράμμισης cdna = Complementary DNA = συμπληρωματικό DNA CHS = Chalcone synthase = συνθάση χαλκόνης DFM = Άμεσοι λειτουργικοί δείκτες dntps = deoxynucleotide triphosphates = Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια EST= Expressed Sequence Tag = Αναγνωριστική εκφρασμένη ακολουθία FLS = Flavone synthase = συνθάση φλαβόνης FMs = Functional markers = Λειτουργικοί δείκτες gdna= genomic DNA = γονιδιωματικό DNA HRM analysis = High Resolution Melting analysis = Σύγκριση καμπυλών τήξης σε υψηλή ανάλυση GMMs = Genic Molecular Markers = Γονιδιακοί μοριακοί δείκτες GTMs = Gene Targeted Markers = Δείκτες γονιδιακής στόχευσης IFMs = Indirect Functional Markers = Έμμεσοι λειτουργικοί δείκτες ISSRs = Inter-Simple Sequence Repeats = Μεταξύ-Απλών Επαναλαμβανόμενων Αλληλουχιών MAS = Marker Assistant Selection = επιλογή βοηθούμενη από μοριακούς δείκτες mirna = Micro RNA = μικρά RNA NAT = Nucleobase Ascorbate Transporter = Νουκλεοβασικός μεταφορέας του ασκορβικού οξέος NCS2 = Nucleobase Cation Symporter family = Οικογένεια συμμεταφορέων κατιόντων PCA = Principal Component Analysis = Ανάλυση κυρίων συντεταγμένων 9

10 PCR = Polymerase Chain Reaction = Αλυσιδωτή Αντίδραση της Πολυμεράσης PFam = Protein Families = Οικογένειες Πρωτεϊνών PIC = Polymorphism Information Content = περιεχόμενη πληροφορία πολυμορφισμού RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA = Τυχαίο ενισχυμένο πολυμορφικό DNA RDMs= Random DNA Markers = Τυχαίοι δείκτες DNA RLFP = Restriction Fragment Length Polymorphism = Πολυμορφισμός Μήκους Θραυσμάτων εκ Περιορισμού RNA = Ribonucleic Acid = Ριβονουκλεϊκό οξύ SCoT = Πολυμορφισμοί στοχευμένοι στο κωδικόνιο έναρξης SNP = Single Nucleotide Polymorphism = Μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός SRAP= Sequence-Related Amplified Polymorphism = ενισχυμένη πολυμορφισμοί σχετικών αλληλουχιών SSRs = Simple Sequence Repeats = Απλές Επαναλαμβανόμενες Αλληλουχίες Tm = Θερμοκρασία τήξης UPGMA = Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean 10

11 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Το κολοκύθι (Cucurbita spp.) κατάγεται από το Μεξικό και καλλιεργείται στην Ευρώπη από το 1542 μ.χ. Ανήκει στην οικογένεια των κολοκυνθοειδών (Cucurbitaceae), το γένος Cucurbita που αποτελείται από πέντε εξημερωμένα είδη (C.maxima, C.moschata, C.ficifolia, C.argyrosperma, C.pepo) (Jeffrey 2005). Τα είδη C. pepo, C. maxima και C. moschata αντιπροσωπεύουν τα κατά σειρά τρία οικονομικά σημαντικότερα είδη που καλλιεργούνται σε ολόκληρο τον κόσμο (Robinson και Decker-Walters 1997; Whitaker και Davis 1962). Η οικογένεια τον κολοκυνθοειδών είναι από τις πρώτες οικογένειες φυτών που εξημερώθηκαν και χαρακτηρίζεται από υψηλή γενετική ποικιλότητα που ένα μεγάλο μέρος της βρίσκεται στις ελληνικές τοπικές ποικιλίες. Η γενετική ποικιλότητα επηρεάζει σε μεγάλο βαθμό την προσαρμοστική ικανότητα των ειδών διότι επιτρέπει την ανάπτυξη προσαρμοστικότητας και εξασφαλίζει την συνεχή εξέλιξη τους σε περιβάλλοντα που μεταβάλλονται. Υπάρχουν πολλοί λόγοι για την εκτίμηση και την διατήρηση της γενετικής ποικιλότητας. Πρώτον, η γενετική ποικιλότητα δίνει την δυνατότητα στα διάφορα είδη να διατηρούν τις απαραίτητες οικολογικές αλληλεπιδράσεις τους ώστε να μην υπάρχει τοπική εξαφάνιση των ειδών. Όταν εξαλείφονται ολόκληροι πληθυσμοί χάνονται μαζί και πολύτιμοι γενότυποι οι οποίοι αποτελούν σημαντική πηγή γενετικού υλικού στην βελτίωση των φυτών. Βασικό εργαλείο για την ταυτοποίηση αλλά και την μελέτη της γενετικής ποικιλότητας είναι οι μοριακοί δείκτες. Ένας μοριακός δείκτης πρέπει να είναι πολυμορφικός, ανεξάρτητος, παρέχοντας επαρκή και αξιόπιστη ανάλυση σχετικά εύκολα, γρήγορα και με αρκετά χαμηλό κόστος. Παρόλα αυτά δεν υπάρχει ιδανικός μοριακός δείκτης. Η επιλογή των μοριακών δεικτών γίνεται ανάλογα με τη φύση της εκάστοτε μελέτης. Οι μοριακοί δείκτες χρησιμοποιήθηκαν από το 1980 στο γένος Cucurbita με σκοπό την ταξινόμηση των καλλιεργούμενων και άγριων ειδών. Πρόσφατα, με βάση τους πολυμορφισμούς του DNA έχει παραχθεί ένας υψηλός αριθμός νέων μοριακών δεικτών όπως οι Τυχαία Ενισχυμένο Πολυμορφικό DNA (RAPD), Απλές Επαναλαμβανόμενες Αλληλουχίες (SSR), Δια - Απλών Επαναλαμβανόμενων Αλληλουχιών (ISSR), και Πολλαπλασιασμός Πολυμορφικών Τμημάτων DNA εκ 11

12 Περιορισμού (AFLP) ((Decker-Walters κ.ά. 2002; Ferriol κ.ά. 2003; Katzir κ.ά. 2002; Paris και Nerson 2003). Τέλος έχει χρησιμοποιηθεί και το DNA των χλωροπλαστών για την δημιουργία μοριακών δεικτών (Sanjur κ.ά. 2002). Εκτός από την συμβατική ανάλυση των μοριακών δεικτών με την Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) ακολουθούμενη από ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων σε πηκτές αγαρόζης ή πολυακρυλαμίδης που είναι τεχνικές που βασίζονται στο μέγεθος των ενισχυόμενων προϊόντων, τελευταία έχει ανακαλυφθεί μια καινούργια μέθοδος ανάλυσης η Σύγκριση Καμπυλών Τήξης σε Υψηλή Ανάλυση (HRM). Η μέθοδος αυτή μετρώντας τις θερμοκρασίες τήξης των προϊόντων και λαμβάνοντας υπόψη το μέγεθος, την περιεκτικότητα σε GC βάσεις και την αλληλουχία του προϊόντος παράγει καμπύλες τήξης που είναι μοναδικές για κάθε προϊόν και διακρίνουν με ακρίβεια τα προϊόντα. Ο συνδυασμός σωστά επιλεγμένων δεικτών EST-SSR και ανάλυσης HRM βοηθάει στη μείωση του κόστους γενοτύπησης και παρέχει μια γρήγορη και ακριβή μέθοδο για τον διαχωρισμό και την ταυτοποίηση ποικιλιών κολοκυθιού. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η μελέτη της γενετικής ποικιλότητας και η ταυτοποίηση 36 ελληνικών ποικιλιών κολοκυθιού με ουδέτερους και βασισμένους σε γονίδια μοριακούς δείκτες. Οι επιμέρους στόχοι είναι α) η αξιολόγηση της διακριτικής ικανότητας διαφορετικών ειδών δεικτών και β) ο υπολογισμός της αναλυτικής ικανότητας της ανάλυσης HRM σε συνδυασμό με τους μοριακούς δείκτες EST-SSR. Αρχικά επιχειρείται για πρώτη φορά η αξιολόγηση του δυναμικού των SCοT και ISSR μοριακών δεικτών για τον προσδιορισμό του γενοτύπου ελληνικών ποικιλιών κολοκυθιού της Τράπεζας Γενετικού Υλικού της Ελλάδας. Επίσης θα γίνει η σύγκριση των δύο τύπων μοριακών δεικτών (ISSR και SCoT) ως προς την αποτελεσματικότητα τους στον διαχωρισμό και την ταξινόμηση ελληνικών ποικιλιών κολοκυθιού του είδους C.pepo. Τέλος, η μελέτη αυτή είναι μια προσπάθεια μοριακής ταυτοποίησης 36 ελληνικών παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού χρησιμοποιώντας τους μοριακούς δείκτες EST-SSR σε συνδυασμό με την ανάλυση HRM για την διάκριση των παραπάνω ποικιλιών σε γενετικό επίπεδο με σκοπό την διατήρηση και τη χρήση τους σε μελλοντικά προγράμματα βελτίωσης. 12

13 1.1 Κολοκυνθοειδή Ιστορία, Προέλευση και Βοτανική Ταξινόμηση Το κολοκύθι (Cucurbita spp.) ανήκει στην οικογένεια των κολοκυνθοειδών (Cucurbitaceae) (Εικόνα 1). Τα κολοκυνθοειδή είναι μια οικογένεια φυτών που περιλαμβάνει περίπου 125 γένη και 825 είδη (Jeffrey 2005). Το γένος Cucurbita, στο οποίο ανήκει και το κολοκύθι αποτελείται από πέντε εξημερωμένα είδη τα: C. pepo L., C. maxima Duchesne, C. moschata Duchesne, C. argyrosperma C. Huber και C. ficifolia Bouché. Εικόνα 1: Απεικόνιση του καρπού και του άνθους του κολοκυθιού. Τα κολοκυνθοειδή είναι από τις μεγαλύτερες και τις πιο διαφοροποιημένες οικογένειες φυτών, έχουν ένα μεγάλο φάσμα χαρακτηριστικών των καρπών τους και καλλιεργούνται σε όλο τον κόσμο σε μια ποικιλία περιβαλλοντικών συνθηκών. Το γένος Cucurbita θεωρείται ότι είναι μορφολογικά ένα από τα γένη με την μεγαλύτερη παραλλακτικότητα σε ολόκληρο το φυτικό βασίλειο (Robinson κ.ά. 1976). Τα 22 άγρια και τα 5 καλλιεργούμενα είδη του γένους Cucurbita είναι εξαιρετικά ανομοιογενή ως προς το χρώμα, το μέγεθος και το σχήμα του καρπού (Εικόνα 2) (Whitaker και Bemis 1975). Το κολοκύθι (2n=40) είναι κατά κύριο λόγο ένα μόνοικο φυτό (ατομικά άνθη είτε αρσενικά είτε θηλυκά, αλλά και τα δύο φύλα υπάρχουν στο ίδιο φυτό). Πρόκειται για ένα φυτό με μεγάλα, κίτρινα άνθη από τα οποία θα σχηματιστούν στην συνέχεια καρποί (Jeffrey 1980). 13

14 Εικόνα 2: Απεικόνιση της παραλλακτικότητας των καρπών διαφόρων ειδών κολοκυθιού. Αρχαιολογικά αρχεία υποδηλώνουν ότι το γένος Cucurbita ήταν ένα από τα πρώτα γένη φυτών που εξημερώθηκαν (Nee 1990). Ένα από τα πρώτα είδη του γένους Cucurbita που εξημερώθηκαν ήταν το C. pepo. Η καλλιέργεια του χρονολογείται μεταξύ και π.χ., προγενέστερη του καλαμποκιού και του φασολιού κατά περισσότερο από χρόνια (Smith 1997). Λόγω της μεγάλης ποικιλότητας που παρουσιάζει το γένος Cucurbita υπάρχει μεγάλη διχογνωμία για τις ορολογίες που χρησιμοποιούνται για τον χαρακτηρισμό των ειδών και των ποικιλιών του κολοκυθιού. Ο όρος "Κολοκύθα" (winter squashes, pumpkins) χρησιμοποιείται ως επί το πλείστον για ποικιλίες με μεγάλους ώριμους καρπούς που χρησιμοποιούνται είτε στην μαγειρική είτε ως ζωοτροφές και καλλιεργούνται κατά κύριο λόγο τον χειμώνα. Αντίθετα ο όρος κολοκυθάκι (summer squashes, squashes) χρησιμοποιείται κυρίως για ποικιλίες που καλλιεργούνται για τους βρώσιμους ανώριμους καρπούς τους κυρίως κατά την καλοκαιρινή περίοδο (Decker-Walters κ.ά. 2002). Η εξημέρωση και η εξάπλωση όλων των ειδών του γένους Cucurbita έγινε κυρίως στην Αμερική. Το είδος C. ficifolia ήταν το πιο διαδεδομένο καλλιεργούμενο είδος και επεκτείνεται από το Μεξικό στην Βόρεια Χιλή και την Αργεντινή (Whitaker και Bemis 1975; Wilson κ.ά. 1992). Αντιθέτως, το είδος C. maxima ήταν το μόνο είδος που καλλιεργείτο σε ένα φάσμα έκτασης που περιορίζεται στη Νότια Αμερική και στις ζεστές εύκρατες περιοχές της Ουρουγουάης και της Αργεντινής. Το είδος C. 14

15 moschata προήλθε από τα χαμηλά εδάφη των τροπικών και υποτροπικών περιοχών της Αμερικής (Μεξικό και Νότια Αμερική), ενώ το είδος C. argyrosperma προέρχεται από τις ακτές του Ειρηνικού. Τέλος, το είδος C. pepo πρωτοεμφανίστηκε στα μεγάλα υψόμετρα του Μεξικού και της Βόρειας Κεντρικής Αμερικής (Nee 1990; Wilson κ.ά. 1992). Τρία είναι τα είδη που έχουν οριστεί ως πρόγονοι των κολοκυνθοειδών. Το C. αndreana Naud. που φαίνεται να είναι ο πρόγονος του C. maxima, το C. sororia Bailey που πιθανώς να είναι ο πρόγονος του C. argyrosperma (Nee 1990) και το C. texana Gray που είναι ο πιθανός πρόγονος του C. pepo (Decker 1988; Nee 1990). H ανάλυση με αλλοένζυμα έδειξε μια ανεξάρτητη εξημέρωση του είδους C.pepo από τους άγριους προγόνους C. fraterna και C. texana, στις ανατολικές Ηνωμένες Πολιτείες και στο Μεξικό (Decker-Walters 1990). Όμως λόγω τις μεγάλης ροής γονιδίων μεταξύ των ειδών C. texana και C. pepo συμπεραίνεται ότι συνέβησαν υβριδισμοί μεταξύ τους και έτσι επιβεβαιώθηκε ότι το είδος C. texana είναι πρόγονος του είδους C. pepo (Kirkpatrick και Wilson 1988) Οικονομική σημασία των κολοκυνθοειδών Τα είδη C. pepo, C. maxima και C. moschata αντιπροσωπεύουν τα τρία οικονομικά σημαντικότερα είδη που καλλιεργούνται σε ολόκληρο τον κόσμο (Robinson και Decker-Walters 1997; Whitaker και Davis 1962). Σύμφωνα με τα στοιχεία του Οργανισμού Τροφίμων και Γεωργίας Ηνωμένων Εθνών (FAO, 2011), η παγκόσμια παραγωγή του κολοκυθιού εκτιμάται ότι είναι περίπου 20 εκατομμύρια τόνοι, με τη μεγαλύτερη παραγωγή κολοκυθιού να έχει καταγραφεί στην Κίνα (6,140,840 t.), (Πίνακας 1). Πίνακας 1: Παραγωγή κολοκυθιού σε τόννους (t) σύμφωνα με τα στοιχεία του FAOSTAT(2011). country production(tonnes) China 6,140,840 India 4,424,200 RussianFederation 988,18 U.S.A 778,63 Europe Greece Cyprus

16 Διατροφική αξία Τα φυτά που ανήκουν στην οικογένεια Cucurbitaceae καταναλώνονται νωπά (καρποί), ψημένα (σπόροι κολοκυθιού), αλλά παράγουν και χρήσιμες ίνες. Επίσης, είναι μια πλούσια πηγή βιταμίνης Α, β-καροτενίου, φολικού οξέος, μαγνησίου και καλίου (Robinson και Decker-Walters 1997). Επιπλέον, η σάρκα της κολοκύθας είναι πολύ χαμηλή σε θερμίδες και περιέχει ωφέλιμες διαλυτές φυτικές ίνες που βοηθούν στην μείωση της χοληστερόλης και των καρδιακών παθήσεων. Η κατανάλωση σπόρων του κολοκυθιού έχει βρεθεί ότι μπορεί να έχει θετική επίδραση στη θεραπεία των προβλημάτων του προστάτη. Τα έλαια που περιέχουν οι σπόροι αυτοί περιλαμβάνουν πολλούς τύπους ακόρεστων λιπαρών οξέων (ελαϊκό οξύ και λινελαϊκό οξύ) και φυτοστερόλες. Πολλά σημαντικά θρεπτικά συστατικά όπως τα ανόργανα άλατα καλίου και μαγνησίου, καθώς και οι βιταμίνες C και Ε έχουν βρεθεί επίσης σε μεγάλες ποσότητες στη σάρκα της κολοκύθας. Το κολοκύθι θεωρείται μια από τις πλέον ωφέλιμες τροφές του φυτικού βασιλείου, λόγω της παρουσίας ενός συνεργικού συνδυασμού οργανικών ενώσεων που είναι γνωστές ως καροτενοειδή, τα οποία είναι γνωστά για την αντιοξειδωτική τους δράση. Πιστεύεται ότι η μακροχρόνια κατανάλωση καροτενοειδών πιθανώς λόγω της αντιοξειδωτικής τους δράσης μειώνει τον κίνδυνο προσβολής από καρκίνο του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, της ουροδόχου κύστης, του δέρματος, του τραχήλου της μήτρας, καθώς και του μαστού (Collins 1999) Βελτιωτικά επιτεύγματα Οι ποικιλίες του γένους Cucurbita χαρακτηρίζονται από υψηλή γενετική ποικιλότητα η οποία αποδίδεται εν μέρει στην τάση που έχουν να διασταυρώνονται. Η επιλογή για πρωιμότητα, μέγεθος, χρώμα, σχήμα και ποιότητα καρπού και η ζήτηση για ομοιομορφία του καρπού οδήγησε στην αύξηση της ομοζυγωτίας των ποικιλιών. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων 35 ετών, έχουν δημιουργηθεί καθαρές σειρές που χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργηθούν υβρίδια περισσότερο ομοιόμορφα και ομοιογενή από τα προηγούμενα που είχαν προέλθει από ελεύθερη επικονίαση (Paris 1989). Επιπρόσθετα, δημιουργήθηκαν δια-ειδικά υβρίδια μεταξύ των ειδών C. maxima και C. moschata με στόχο να αυξηθεί η ποιότητα των καρπών (Robinson et.al. 1997). Το πιο διαδεδομένο υβρίδιο είναι το «Tetsukabuto», που προέρχεται από τη διασταύρωση του C. maxima cv.«delicious» και του C. moshata 16

17 cv. «Kurokawa no. 2», χρησιμοποιώντας το C. maxima, ως μητρικό φυτό (Robinson και Decker-Walters 1997). Τα προγράμματα βελτίωσης έχουν επικεντρωθεί σε συγκεκριμένα χαρακτηριστικά. Ένα τέτοιο επιθυμητό χαρακτηριστικό είναι το βαθύ πορτοκαλί χρώμα στον καρπό που του προσδίδει μια ελκυστική εμφάνιση καθώς και υψηλότερη συγκέντρωση της προ-βιταμίνης Α (Whitaker κ.ά. 1986). Τα χαρακτηριστικά που επιλέχθηκαν κατά τη διάρκεια της εξημέρωσης έχουν ερευνηθεί σε μεγάλο βαθμό (Paris και Brown 2005). Αυτά περιλαμβάνουν το μέγεθος του καρπού, το οποίο είναι ένα ιδιαίτερα πολυγονιδιακό χαρακτηριστικό, αλλά επίσης και την σκληρότητα του καρπού καθώς και την περιεκτικότητα του σε κουκουρμπιτακίνη (cucurbitacin, τερπενοειδής ένωση που προσδίδει στον καρπό πικρή γεύση αλλά έχει αντικαρκινική δράση) που ελέγχεται από ένα μόνο γονίδιο (Robinson και Decker-Walters 1997). Επιπλέον, έχει γίνει επιλογή για το σχήμα και το χρώμα του καρπού. Το σχήμα είναι ένα χαρακτηριστικό που ελέγχεται από πολλά γονίδια αλλά έχουν αναφερθεί και περιπτώσεις όπου μεμονωμένα γονίδια ελέγχουν το σχήμα όπως το Di που προσδίδει το δισκοειδές σχήμα στον καρπό (Paris και Brown 2005). Μερικές από τις πιο θεαματικές αυξήσεις στην παραγωγικότητα των φυτών επιτυγχάνονται μέσω των αλλαγών στην αρχιτεκτονική των φυτών ή στην ανάπτυξή τους όπως είναι η αλλαγή τους σε καθορισμένης ανάπτυξης (Kwack 1995). Η προώθηση αυτών των καθορισμένης ανάπτυξης ποικιλιών που έχουν πιο θαμνώδη μορφή έχει αρχίσει να εφαρμόζεται μέσω της βελτίωσης σε όλα τα είδη των κολοκυνθοειδών. Επιπλέον, έχουν γίνει μελέτες για την αύξηση της ανθεκτικότητας των ποικιλιών του κολοκυθιού σε παράσιτα (Maynard 2001), σε μύκητες (Cohen κ.ά. 2003) και σε ιούς (Tobias και Palkovics 2003). Σήμερα, εφαρμόζονται όλο και περισσότερο νέες βιοτεχνολογικές προσεγγίσεις για την βελτίωση του γένους Cucurbita (Brown 2001), αν και βρίσκονται ακόμα σε πρωταρχικά στάδια. Έχουν γίνει προσπάθειες δημιουργίας υβριδίων C. maxima x C. moschata (Yamaguchi και Shiga 1993), ωστόσο, υπήρξε δυσκολία μεταφοράς και σταθερής κληρονόμησης των επιθυμητών γονιδίων μεταξύ των απογόνων διαφορετικών ειδών. Επιπλέον, έχουν χρησιμοποιηθεί in vitro τεχνικές σε διάφορα είδη κολοκυθιού (Rahman κ.ά. 1993; Sarowar κ.ά. 2003), καθώς βοηθούν στην μείωση του χρόνου παραγωγής, και στην παραγωγή απλοειδών και διαπλοειδών φυτών. Επιπλέον έχουν γίνει προσπάθειες ανάπτυξης φυτών μέσω οργανογένεσης στα είδη C. pepo και C. maxima, που οδήγησαν σε παραγωγή βλαστών από ώριμες 17

18 κοτυληδόνες (Lee κ.ά. 2003). Επίσης, επιτεύχθηκε εμβρυογένεση στα είδη C. pepo (Leljak-Levanić κ.ά. 2004) και C. ficifolia (Urbanek κ.ά. 2004). Τέλος, η έρευνα για την παραγωγή απλοειδών ή διαπλοειδών από ιστούς ωαρίου, ανθήρων ή γύρης είναι ελλιπής και μόνο στο είδος C. pepo, παρήχθησαν απλοειδή φυτά από ωάρια και ανθήρες (Metwally κ.ά. 1998). Η χρήση των δεικτών ξεκίνησε από το 1960 στο γένος Cucurbita με σκοπό την ταξινόμηση των καλλιεργούμενων και άγριων ειδών. Τα ισοένζυμα ήταν οι πρώτοι δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν για το σκοπό αυτό (Weeden και Robinson 1990). Πρόσφατα, με βάση τους πολυμορφισμούς του DNA έχει παραχθεί ένας υψηλός αριθμός μοριακών δεικτών. Έχει επίσης χρησιμοποιηθεί το DNA των χλωροπλαστών για την δημιουργία μοριακών δεικτών (Sanjur κ.ά. 2002). Στο είδος C. pepo, οι μελέτες με ισοενζυμικούς δείκτες επέτρεψαν την ομαδοποίηση των άγριων και των καλλιεργούμενων ποικιλιών. Παρόμοιες μελέτες έγιναν και με μοριακούς δείκτες με βάση το DNA, όπως οι Τυχαία Ενισχυμένο Πολυμορφικό DNA (RAPD), Απλές Επαναλαμβανόμενες Αλληλουχίες (SSR), Εντός Απλών Επαναλαμβανόμενων Αλληλουχιών (ISSR), και Πολλαπλασιασμός Πολυμορφικών Τμημάτων DNA εκ Περιορισμού (AFLP) (Decker-Walters κ.ά. 2002; Ferriol κ.ά. 2003; Katzir κ.ά. 2002; Paris και Nerson 2003). Πιο συγκεκριμένα στο είδος C. moschata, οι δείκτες RAPD, SRAP και οι AFLP έχουν χρησιμοποιηθεί για να διαχωρίσουν τις παραδοσιακές ποικιλίες (Gwanama κ.ά. 2000). Στο είδος C.maxima πραγματοποιήθηκαν λιγότερες μελέτες της ποικιλότητας (Baranek κ.ά. 2000). Πρόσφατα, οι δείκτες RAPD, AFLP και SRAP έχουν χρησιμοποιηθεί για να την μελέτη της ποικιλότητας του είδους C. maxima στην Ισπανία (Ferriol κ.ά. 2004a; Ferriol κ.ά. 2003; Ferriol κ.ά. 2004b). Τέλος, ελάχιστα έχουν γίνει για τη μελέτη της ενδοειδικής γενετικής ποικιλότητας στο είδος C. argyrosperma, (Montes-Hernκαιez και Eguiarte 2002) ενώ στο είδος C. ficifolia παρόλο που είναι από τα λιγότερο ποικιλόμορφα καλλιεργούμενα είδη πραγματοποιήθηκαν ορισμένες μελέτες με βάση τα ισοένζυμα (Κaires 1990; Ferriol 2005). Ο πρώτος χάρτης του γένους Cucurbita κατασκευάστηκε από 11 ισοενζυμικές θέσεις και διέκρινε πέντε ομάδες σύνδεσης με βάση την F 2 γενιά διασταύρωσης των ειδών C maxima x C. Ecuadorensis (Weeden κ.α.,1986). Μεταγενέστερα, για την δημιουργία μοριακών χαρτών χρησιμοποιήθηκαν κυρίως οι δείκτες RAPD με το μειονέκτημα ότι είναι κυρίαρχοι και είναι αποτελεσματικοί σε συγκεκριμένους πληθυσμούς. Οι Lee κ.ά. (1995) χαρτογράφησαν πέντε ομάδες σύνδεσης από την F 2 18

19 γενιά της διασταύρωσης C. pepo x C. Moschata με 28 RAPD δείκτες. Ο μεγαλύτερος χάρτης, που καλύπτει περίπου το 75% του γονιδιώματος του γένους Cucurbita, κατασκευάστηκε από τους Brown και Myers (2002) και περιελάμβανε 148 RAPD δείκτες και 28 ομάδες σύνδεσης. Πιο πρόσφατα, κατασκευάστηκε ένας χάρτης από τους F 2 απόγονους της διασταύρωσης C. pepo x C. pepo ο οποίος περιέχει 36 ομάδες σύνδεσης με την χρήση 254 RAPD δεικτών (Zraidi κ.ά. 2004) Μοριακοί δείκτες Στην βελτίωση του κολοκυθιού εκτός από τις κλασικές μεθόδους (διασταυρώσεις, δημιουργία υβριδίων και καθαρών σειρών) αναπτύχθηκαν και οι μορφολογικοί δείκτες (Whitaker και Bemis, 1975). Επειδή όμως επηρεάζονταν άμεσα από το περιβάλλον έδωσαν την σκυτάλη στους βιοχημικούς δείκτες (ισοένζυμα) (Decker-Walters, 1990) οι οποίοι επηρεάζονται έμμεσα από το περιβάλλον. Έτσι δημιουργήθηκαν οι μοριακοί δείκτες (Montes-Hernκαιez και Eguiarte 2002). Μοριακός δείκτης είναι μια οποιαδήποτε περιοχή του DNA που είναι συνδεδεμένη με μια συγκεκριμένη περιοχή του γονιδιώματος. Τα τελευταία χρόνια, έχουν αναπτυχθεί πολλά υποσχόμενες τεχνικές μοριακών δεικτών στην γενετική φυτών. Λόγω της ταχείας ανάπτυξης στην έρευνα του γονιδιώματος εντοπίζεται μια τάση απομάκρυνσης από τους τυχαία τοποθετημένους στο γονιδίωμα μοριακούς δείκτες, διότι προτιμώνται οι μοριακοί δείκτες που στοχεύουν σε περιοχές του γονιδιώματος όπου υπάρχουν γονίδια (λειτουργικοί δείκτες) (Gupta και Rustgi 2004). Λόγω της ταχείας δημιουργίας αρκετών δημόσιων βάσεων δεδομένων γονιδιώματος, η ανάπτυξη λειτουργικών δεικτών, που βρίσκονται κοντά σε γονίδια που παρουσιάζουν ενδιαφέρον, έχει γίνει ευκολότερη. Οι δείκτες αυτοί έχουν σημαντικό ρόλο στις μελέτες της γενετικής ποικιλότητας, στην κατασκευή χαρτών σύνδεσης καθώς και στον εντοπισμό ατόμων με επιθυμητά γονίδια (Kalendar κ.ά. 2010). Οι λειτουργικοί δείκτες μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν στην επιλογή γνωρισμάτων που είναι δύσκολο να μετρηθούν με βάση το φαινότυπο (Appleby κ.ά. 2009). Τέλος, οι μοριακοί δείκτες έχουν πολλές άλλες εφαρμογές, συμπεριλαμβανομένων και των φυλογενετικών ταξινομήσεων. Ένας ιδανικός μοριακός δείκτης πρέπει να είναι πολυμορφικός, ανεξάρτητος, παρέχοντας αξιόπιστη και επαρκή ανάλυση σχετικά εύκολα, γρήγορα και με αρκετά χαμηλό κόστος. Παρόλα αυτά δεν υπάρχει ιδανικός μοριακός δείκτης. Η επιλογή των μοριακών δεικτών γίνεται ανάλογα με τη φύση της εκάστοτε μελέτης. 19

20 Πρωτοπόρα μέθοδος στις μελέτες των δεικτών ήταν η τεχνική ανάλυσης των ισοενζύμων (Brown 1978) αλλά τα μειονεκτήματα της τεχνικής αυτής οδήγησαν στην ανάπτυξη δεικτών με βάση το DNA (Botstein κ.ά. 1980). Το πρώτο σύστημα μοριακών δεικτών που αναπτύχθηκε το 1980 ήταν οι δείκτες RFLP που βασίζονται σε πολυμορφισμούς του μεγέθους περιοριστικών τμημάτων DNA. Αργότερα, με την εισαγωγή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) ξεκίνησε μια ευρέως εφαρμοσμένη κατηγορία μοριακών δεικτών, των δεικτών που βασίζονται στην αντίδραση PCR. Τέλος, με την εξέλιξη της τεχνολογίας ανακαλύφθηκαν και οι μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί (SNP) που είναι πολύ ακριβείς διότι εντοπίζουν τις διαφορές ακόμα και σε ένα νουκλεοτίδιο αλλά έχουν μεγαλύτερο κόστος σε σχέση με τους συμβατικούς τύπους μοριακών δεικτών. Οι τεχνικές αυτές, σε συνδυασμό με την Επόμενης Γενιάς Αλληλούχηση (NGS=Next Generation Sequencing), οδήγησαν σε υψηλής ακρίβειας και χαμηλού κόστους αναλύσεις Λειτουργικοί ή εντοπισμένοι σε γονίδια μοριακοί δείκτες Τα τελευταία χρόνια, στην τεχνολογία των μοριακών δεικτών έχει παρατηρηθεί μία μετατόπιση από τους λεγόμενους ουδέτερους μοριακούς δείκτες (RDM), που σχεδιάστηκαν σε τυχαία πολυμορφικές αλληλουχίες του γενωμικού DNA ή αλληλουχίες γονιδίων, στους μοριακούς δείκτες που σχεδιάζονται σε κωδικές περιοχές γονιδίων. Αυτή η νέα κατηγορία μοριακών δεικτών έχουν περιγραφεί ως Μοριακοί Δείκτες Βασισμένοι σε Γονίδια (GMM). Οι GMM έχουν ταξινομηθεί σε δύο ομάδες. 1. Δείκτες Γονιδιακής Στόχευσης (GTM): προέρχονται από τους πολυμορφισμούς που συμβαίνουν εντός των γονιδίων, ωστόσο δε συσχετίζονται απαραίτητα στη φαινοτυπική παραλλακτικότητα του γνωρίσματος. 2. Λειτουργικοί Δείκτες (FM): προέρχονται από πολυμορφικές αλληλουχίες μέσα στις κωδικές περιοχές των γονίδιων και επομένως, είναι πιθανό να συσχετίζονται με τη φαινοτυπική παραλλακτικότητα του γνωρίσματος (π.χ. μοριακοί δείκτες που βασίζονται σε υποψήφια γονίδια). Οι FM δείκτες, ανάλογα με τη συμμετοχή τους στη φαινοτυπική παραλλακτικότητα του γνωρίσματος, ταξινομούνται περαιτέρω σε δύο υπό-ομάδες α) Έμμεσοι Λειτουργικοί Δείκτες (IFM), των οποίων ο ρόλος στη φαινοτυπική παραλλακτικότητα του γνωρίσματος είναι έμμεσος και οι β) Άμεσοι Λειτουργικοί Δείκτες (DFM), για τους οποίους ο ρόλος για τη φαινοτυπική παραλλακτικότητα του γνωρίσματος είναι άμεσος. 20

21 Οι ουδέτεροι μοριακοί δείκτες προέρχονται από τυχαίες πολυμορφικές περιοχές του γονιδιώματος ενώ οι GTM προέρχονται από πολυμορφισμούς που υπάρχουν στις αλληλουχίες των γονιδίων. Οι RDMs και οι GTMs σχεδιάζονται ανεξαρτήτως της συσχέτισής τους με κάποιο φαινοτυπικό χαρακτήρα κάτι που δε συμβαίνει με τους FM που προέρχονται από πολυμορφικές περιοχές μέσα στα γονίδια που επιδρούν στη φαινοτυπική παραλλακτικότητα ενός γνωρίσματος. Έτσι η ανάπτυξη λειτουργικών μοριακών δεικτών απαιτεί αλληλουχίες από λειτουργικά χαρακτηρισμένα γονίδια. Η χρήση των λειτουργικών μοριακών δεικτών εξαρτάται από τη διαθεσιμότητα αλληλουχιών και τεχνολογιών δοκιμής δεικτών. Το κλειδί για την ανάπτυξη των λειτουργικών μοριακών δεικτών είναι η αλληλουχία ενός γονιδίου με χαρακτηρισμένη λειτουργία. Η συλλογή φυτικών νουκλεοτιδικών αλληλουχιών συνεχίζεται με εκθετικούς ρυθμούς, με πάνω από 88 εκατομμύρια εισαγωγές να κατατίθενται στην Τράπεζα Γενετικών Δεδομένων Εντός Απλών Επαναλαμβανόμενων Αλληλουχιών (ISSR) Τα ISSR είναι τμήματα DNA από 100 έως 300 bp που εδράζονται μεταξύ παρακείμενων και αντίθετα προσανατολισμένων μικροδορυφορικών περιοχών. Οι ISSR μοριακοί δείκτες ενισχύονται μέσω της τεχνικής της PCR χρησιμοποιώντας ως εκκινητές αλληλουχίες από μικροδορυφορικές περιοχές (16-18 bp). Περίπου 10 με 60 τμήματα από πολλαπλές γονιδιακές περιοχές ενισχύονται ταυτόχρονα, διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση και αναλύονται ως παρουσία ή απουσία ζωνών συγκεκριμένου μεγέθους (Zietkiewicz κ.ά. 1994). Το κύριο πλεονέκτημα των δεικτών ISSR είναι ότι δεν υπάρχει ανάγκη για ύπαρξη γνωστών αλληλουχιών για την κατασκευή των εκκινητών. Επίσης οι απαιτήσεις σε DNA είναι μικρές λόγω του ότι η αναλυτική διαδικασία περιλαμβάνει την αντίδραση PCR. Επιπλέον οι ISSR είναι τυχαία διασκορπισμένοι σε όλο το γονιδίωμα. Ως τεχνική που ενισχύει ταυτόχρονα διαφορετικές γονιδιωματικές περιοχές οι ISSR έχουν το μειονέκτημα της πιθανότητας ύπαρξης δύο ζωνών με ίδιο μέγεθος που να μην προέρχονται από ομόλογες περιοχές. Εξαιτίας της αναπαραγωγής ζωνών από πολλαπλές γονιδιακές περιοχές, οι ISSR μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε μελέτες γενετικής ταυτοποίησης, πιστοποίησης κλώνων και σε ταξινομικές μελέτες μεταξύ συγγενικών ειδών. 21

22 Επιπρόσθετα οι ISSR θεωρούνται χρήσιμοι μοριακοί δείκτες για μελέτες γενετικής χαρτογράφησης Πολυμορφισμοί Στοχευμένοι στο Κωδικόνιο Έναρξης (SCoT) Οι μοριακοί δείκτες από την περιοχή του μεταγραφήματος του γονιδιώματος έχουν δυνατότητες για διάφορες εφαρμογές προσδιορισμού του γενοτύπου των φυτών διότι εμφανίζουν πολυμορφισμό που θα μπορούσε να σχετίζεται άμεσα με την λειτουργία ενός γονιδίου. Ένας νέος δείκτης που περιγράφεται από τους Collard και Mackill (2009), απέκτησε γρήγορα δημοτικότητα. Η μέθοδος των δεικτών SCoT βασίζεται στην παρατήρηση ότι οι μικρές περιοχές των φυτικών γονιδίων που περιβάλλουν το κωδικόνιο έναρξης της μετάφρασης (ATG) είναι συντηρημένες (Εικόνα 3) (Sawant κ.ά. 1999). Οι SCoT μοριακοί δείκτες ενισχύονται μέσω της τεχνικής της PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές σχεδιασμένους να επαναδιατάσσονται στις πλευρικές περιοχές των κωδικόνιων έναρξης και στις δύο αλυσίδες του DNA. Τα ενισχυόμενα προϊόντα πιθανόν να βρίσκονται σε περιοχές γονιδίων (Gorji κ.ά. (2011). Οι δείκτες SCoT είναι υψηλά αναπαραγώγιμοι δείκτες και κυρίαρχοι. Ωστόσο, υπάρχουν και συγκυρίαρχοι δείκτες SCoT γεγονός που τους καθιστά χρήσιμους στην ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας. Οι δείκτες SCoT μπορούν να χρησιμοποιηθούν είτε μεμονωμένα είτε σε συνδυασμό με άλλους δείκτες για την εκτίμηση της γενετικής ποικιλότητας ώστε να προκύψουν αξιόπιστες πληροφορίες για τη δομή του πληθυσμού σε διάφορες οικογένειες φυτών (Poczai 2011). Εικόνα 3:Αρχή μεθόδου μοριακών δεικτών SCoT. 22

23 1.2.4 Απλές Επαναλαμβανόμενες Αλληλουχίες (SSRs) Οι μικροδορυφόροι ή απλές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες είναι γενετικοί δείκτες που αποτελούνται από τυχαία διασκορπισμένες επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες του ενός έως έξι νουκλεοτιδίων (Εικόνα 4). Βρίσκονται σε αφθονία και κατανέμονται τυχαία σε όλο το γονιδίωμα τόσο στα φυτά όσο και στα ζώα. Οι εκκινήτες που χρησιμοποιόυνται (~20-25bp) σχεδιάζονται είτε σε περιοχές του γενωμικού DNA είτε σε αλληλουχίες εκφραζόμενων γονιδίων (EST) που βρίσκονται κατατεθειμένες σε βάσεις δεδομένων. Σε ορισμένες περιπτώσεις οι μοριακοί δείκτες SSR μπορεί να είναι συντηρημένοι μεταξύ των ειδών και έτσι μπορούν να χρησιμοποιηθούν και σε συγγενικά είδη. Οι απλές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (SSR) έχουν γίνει όλο και πιο έντονα οι δείκτες επιλογής για γενετικές αναλύσεις πληθυσμών. Δυστυχώς, η ανάπτυξη των μοριακών δεικτών SSR από γενωμικό DNA είναι δαπανηρή και χρονοβόρα. Η ανάπτυξη των δεικτών SSR με βάση τα EST (EST-SSR) έχει αποδειχθεί ότι είναι μια καλή επιλογή για την δημιουργία υψηλής ποιότητας μοριακών δεικτών (Bhat κ.ά. 2005; Gupta κ.ά. 2003). Τα EST είναι αλληλουχίες μερικού cdna που αποκτήθηκαν με αυτοματοποιημένες μεθόδους αλληλούχησης του DNA. Υπάρχουν εκατοντάδες χιλιάδες καταχωρήσεις EST από ποικίλους οργανισμούς. Η βάση δεδομένων του NCBI ( περιέχει ένα συνεχώς αυξανόμενο αριθμό cdna αλληλουχιών, που σημαίνει ότι υπάρχουν ήδη οι πόροι που απαιτούνται για την αποτελεσματική ανάπτυξη μεγάλου αριθμού μοριακών δεικτών EST-SSR. Για τον σχεδιασμό ενός μοριακού δείκτη SSR με βάση τα EST απαιτείται ο σχεδιασμός δύο εκκινητών από την αλληλουχία του EST. Οι εκκινητές χρησιμοποιούνται κατόπιν για την ενίσχυση προϊόντων DNA με την μέθοδο της PCR. Στο επόμενο βήμα, αποκαλύπτονται οι πολυμορφισμοί στα ενισχυμένα προϊόντα με διάφορους τρόπους όπως η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης ή πηκτή πολυακρυλαμίδης. Ένα σημαντικό πλεονέκτημα των δεικτών αυτών είναι ότι αποκαλύπτουν την ποικιλότητα δομικών γονιδίων. Οι EST-SSR δείκτες που σχεδιάζονται πάνω σε γονίδια είναι υψηλής ποιότητας και παράγουν ισχυρές ζώνες που ξεχωρίζουν επαρκώς τα αλληλόμορφα και εντοπίζουν με υψηλή ακρίβεια τους πολυμορφισμούς. (Cho κ.ά. 2000; Kota κ.ά. 2001; Nicot κ.ά. 2004; Saha κ.ά. 2004; Thiel κ.ά. 2003). Η ποιότητα των εκκινητών που θα σχεδιαστούν είναι πολύ σημαντική για την ποιότητα των δεικτών. Οι δείκτες 23

24 EST-SSR είναι λιγότερο πολυμορφικοί από τους απλούς SSR δείκτες που σχεδιάστηκαν πάνω σε γενωμικό DNA διότι η αλληλουχία του DNA στις περιοχές του μεταγραφήματος είναι περισσότερο συντηρημένη (Cho κ.ά. 2000; Russell κ.ά. 2004; Scott κ.ά. 2000). Επίσης, οι EST-SSR δείκτες που σχεδιάστηκαν πάνω στο 3 άκρο των EST φαίνεται να είναι υπέρτεροι σε σχέση με αυτούς που σχεδιάστηκαν πάνω στο 5 άκρο των EST (Gao κ.ά. 2003; Gupta κ.ά. 2003; Holton κ.ά. 2002; Scott κ.ά. 2000). Αυτός ο τύπος δεικτών έχει μεγάλη χρησιμότητα σε μελέτες γενετικής χαρτογράφησης καθώς και στην ταυτοποίηση της γενετικής ποικιλότητας των φυσικών πληθυσμών. Τα κύρια πλεονεκτήματα των SSR μοριακών δεικτών είναι η συγκυριαρχία τους, η αφθονία τους στα ευκαρυωτικά γονιδιώματα και η τυχαία κατανομή τους σε όλο το γονιδίωμα, με προτίμηση στις περιοχές χαμηλής αντιγραφής. Επιπλέον ως τεχνική που βασίζεται στην PCR, απαιτεί μικρές ποσότητες DNA ( ng/αντίδραση). Επίσης, λόγω της χρήσης μεγάλου μεγέθους εξειδικευμένων εκκινητών για την PCR, έχουν υψηλή επαναληψιμότητα. Επιπλέον μειώνεται σημαντικά το κόστος της ανάλυσης διότι υπάρχει η δυνατότητα να γίνει ανάλυση πολλών γονιδιακών περιοχών ταυτόχρονα με τη χρήση της αντίδρασης PCR. Τέλος, η ανάλυση των δεικτών SSR μπορεί να αυτοματοποιηθεί, με τη χρήση των αυτόματων προσδιοριστών αλληλουχίας (Madesis κ.ά. 2013). Ένα από τα κυριότερα μειονεκτήματα των δεικτών SSR είναι το υψηλό κόστος ανάπτυξης όταν δεν υπάρχουν πληροφορίες ως προς τις αλληλουχίες που περιέχουν μικροδορυφορικές περιοχές, γεγονός που καθιστά δύσκολη την εφαρμογή τους σε είδη που δεν έχουν μελετηθεί αρκετά. Επίσης, αν και είναι συγκυρίαρχοι δείκτες, μεταλλάξεις στην αλληλουχία των εκκινητών μπορεί να επιφέρουν την εμφάνιση μηδενικών αλληλόμορφων (δεν υπάρχει ενίσχυση του αναμενόμενου προϊόντος με την PCR), που μπορεί να οδηγήσει σε σφάλματα κατά την ανάλυση τους. Τα μηδενικά αλληλόμορφα μπορεί να οδηγήσουν σε μια λανθασμένη εκτίμηση της συχνότητας των αλληλόμορφων καθώς και στην παράλειψη υπολογισμού της ετεροζυγωτίας. Ένα πολύ κοινό είδος προβλήματος στην ανάλυση των δεικτών SSR είναι η εμφάνιση επιπλέον ζωνών που προκύπτουν από τη μετατόπιση του DNA κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης μέσω της PCR. Αυτές οι επιπλέον ζώνες μπορεί να περιπλέξουν την ερμηνεία του σχεδίου ζωνών γιατί είναι δύσκολο να αναλυθούν τα μεγέθη των ζωνών καθώς μπορεί να συγχέονται τα 24

25 ετεροζύγωτα με τα ομοζύγωτα. Ωστόσο, η ερμηνεία μπορεί να διασαφηνιστεί με τη χρήση ενός γενοτύπου αναφοράς με γνωστά μεγέθη ζωνών. Σε γενικές γραμμές, οι SSR μοριακοί δείκτες δείχνουν ένα υψηλό επίπεδο πολυμορφισμού. Ως εκ τούτου θεωρούνται μοριακοί δείκτες που μπορεί να χρησιμοποιηθούν στις μελέτες πληθυσμών, οι οποίες κυμαίνονται από το επίπεδο των συγγενικών ειδών έως το ενδοειδικό επίπεδο. Αντίθετα, ο υψηλός ρυθμός μεταλλάξεων τους καθιστά ακατάλληλους για μελέτες που αφορούν υψηλότερα ταξινομικά επίπεδα. Εικόνα 4: Αρχή μεθόδου μοριακών δεικτών SSR. 1.3 Τεχνικές ανάλυσης των Μοριακών Δεικτών Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) Η Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR) είναι μια τεχνική ενζυματικού πολλαπλασιασμού του DNA που αναπτύχθηκε από τον Dr. Kary Mullis το Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει επαναλαμβανόμενους κύκλους σε διαφορετικές θερμοκρασίες, με γρήγορη μετάβαση από την μια θερμοκρασία στην άλλη. Πριν από κάθε κύκλο το αρχικό δείγμα DNA υποβάλλεται σε θερμοκρασία ο C για 1-5 λεπτά ώστε να επιτευχθεί η πλήρης αποδιάταξη του δίκλωνου μορίου DNA. Κάθε κύκλος περιλαμβάνει αρχικά την θέρμανση σε υψηλή θερμοκρασία για την αποδιάταξη (denaturation) του DNA συνήθως σε θερμοκρασίες ο C. Στην συνέχεια γίνεται θέρμανση υβριδισμού (annealing step) κατά την διάρκεια της οποίας οι εκκινητές υβριδίζουν με τον στόχο DNA. Η θερμοκρασία υβριδισμού εξαρτάται από το μήκος του εκκινητή και την περιεκτικότητα του σε GC βάσεις και είναι συνήθως 5 ο C μικρότερη από την υπολογισμένη θερμοκρασία τήξης (Tm) του 25

26 εκκινητή. Εάν η θερμοκρασία υβριδισμού είναι πολύ υψηλή δεν πραγματοποιείται υβριδισμός ενώ αν είναι χαμηλή οι εκκινητές υβριδίζουν με DNA αλληλουχίες που δεν έχουν 100% ομολογία. Ο χρόνος στην θέρμανση υβριδισμού είναι από 30 δευτερόλεπτα έως 1 λεπτό. Μετά ακολουθεί η θερμοκρασία πολυμερισμού (extension step) κατά την διάρκεια της οποίας η πολυμεράση συνθέτει την συμπληρωματική αλυσίδα του DNA, με κατεύθυνση από το 5 άκρο προς το 3 άκρο. Για μια περιοχή στόχο 1kb αρκεί 1 λεπτό στους 72 ο C. Οι τρεις αυτές διαδικασίες επαναλαμβάνονται από 20 έως 40 φορές με αποτέλεσμα τον εκθετικό πολλαπλασιασμό της αλληλουχίας του DNA στόχου. Μετά τον τελευταίο κύκλο της αντίδρασης η θερμοκρασία διατηρείται στους 72 ο C για 5-15 λεπτά για την ολοκλήρωση της επιμήκυνσης. Με την ολοκλήρωση του προγράμματος η θερμοκρασία ρυθμίζεται στους 4 ο C ώστε να σταματήσει η αντίδραση και να διατηρηθούν τα δείγματα Σύγκριση Καμπυλών Τήξης σε Υψηλή Ανάλυση (HRM) Η Σύγκριση Καμπυλών Τήξης σε Υψηλή Ανάλυση (HRM) επιτρέπει τον προσδιορισμό του γενοτύπου από την διάκριση των αλλαγών στην αλληλουχία του DNA, όπως οι απλές σημειακές μεταλλάξεις και οι μικρές εισαγωγές και διαγραφές (indels), με βάση τις μεταβολές των θερμοκρασιών τήξης (Tm) των προϊόντων της PCR (Wittwer 2009; Wittwer κ.ά. 2003; Zhou κ.ά. 2005). Η μέθοδος αυτή περιλαμβάνει την ανίχνευση σε πραγματικό χρόνο των αλλαγών στο σήμα φθορισμού που προκαλείται από την απελευθέρωση φθοριζουσών ουσιών κατά την σταδιακή μετουσίωση (τήξη) των προϊόντων της PCR (Erali και Wittwer 2010). Ο προσδιορισμός του γενοτύπου με την βοήθεια της ανάλυσης HRM έχει πολλά οφέλη για τους ερευνητές, κυρίως λόγω του ότι έχει χαμηλό κόστος και υψηλή αποτελεσματικότητα. Επίσης η τεχνική αυτή είναι ταχύτερη και απλούστερη από ότι οι άλλες εναλλακτικές προσεγγίσεις που απαιτούν αναλύσεις μετά την PCR όπως την χρήση περιοριστικών ενζύμων και ηλεκτροφόρησης. Η ανάλυση HRM μπορεί επίσης να εφαρμοστεί για την διάκριση των αλληλομόρφων και για τον έλεγχο ύπαρξης άγνωστων αλλαγών στην αλληλουχία χωρίς να γίνει αλληλούχηση των δειγμάτων. Η χρήση της ανάλυσης HRM στην γενοτύπηση καθώς και στην εύρεση γονιδίων έχει αναφερθεί σε πολλά καλλιεργούμενα είδη, συμπεριλαμβανομένου του ρυζιού (Li κ.ά. 2011), της τομάτας (JoongHwan κ.ά. 2010), της πιπεριάς (Golding κ.ά. 2010), του πεπονιού (SongJi κ.ά. 2010), της κερασιάς (Ganopoulos κ.ά. 2011) και της αμυγδαλιάς (Wu κ.ά. 2008). 26

27 1.4 Γενετική ποικιλότητα Ως γενετική ποικιλότητα (genetic diversity) ορίζεται η διαφοροποίηση του γενετικού υλικού μεταξύ των ατόμων του ίδιου είδους και αναφέρεται στην διαφοροποίηση στα ποσοστά των αλληλομόρφων μεταξύ των πληθυσμών του ίδιου είδους ή/και στη ποικιλία γονιδιακών αλληλομόρφων μεταξύ των ατόμων του ίδιου πληθυσμού. Υπάρχουν πολλοί λόγοι για την εκτίμηση και την διατήρηση της γενετικής ποικιλότητας. Πρώτον, η γενετική ποικιλότητα δίνει την δυνατότητα στα διάφορα είδη να διατηρούν τις απαραίτητες οικολογικές αλληλεπιδράσεις τους ώστε να μην υπάρχει τοπική εξαφάνιση των ειδών. Όταν εξαλείφονται ολόκληροι πληθυσμοί χάνονται μαζί και πολύτιμοι γενότυποι οι οποίοι αποτελούν σημαντική πηγή γενετικού υλικού στην βελτίωση των φυτών. Τέλος, η γενετική ποικιλότητα αποτελεί σημαντική παράμετρο στον χαρακτηρισμό του γενετικού υλικού και στην επιλογή των επιθυμητών γενοτύπων. Πρόσφατα, λόγω της μεγάλης προόδου που έχει σημειωθεί στη μοριακή γενετική, η γενετική ποικιλότητα μπορεί να μετρηθεί σε επίπεδο DNA με την ανάπτυξη και χρήση διάφορων μοριακών δεικτών (Madesis κ.ά. 2013). Μελέτες της γενετικής ποικιλότητας έδειξαν ότι τα καλλιεργούμενα είδη του κολοκυθιού ανήκουν σε γενετικά διαφορετικές ομάδες. Για την επιβεβαίωση της μεγάλης ποικιλότητας που διακατέχει το κολοκύθι κατασκευάστηκε ένα δενδρόγραμμα για τα 21 είδη του γένους Cucurbita χρησιμοποιώντας 93 φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και έτσι τα καλλιεργούμενα είδη ταξινομήθηκαν σε πέντε διαφορετικές ομάδες (Whitaker και Bemis 1975). Μεταξύ των καλλιεργούμενων ειδών, το είδος C. moshata ήταν το πιο μεταβλητό και το πλησιέστερο στον κοινό πρόγονο των κολοκυνθοειδών λόγω της υψηλής διαειδικής συμβατότητας (Whitaker και Bemis 1975). Τέλος, η μοριακή μελέτη με ισοένζυμα έδειξε ότι το είδος C. pepo έχει ένα κοινό πρόγονο με τα είδη C. moschata και C. argyrosperma, αλλά όχι με το είδος C. maxima (Decker-Walters 1990). Το κολοκύθι είναι ένα είδος που διακρίνεται από μεγάλη παραλλακτικότητα και ένα μεγάλο μέρος της βρίσκεται στις ελληνικές τοπικές ποικιλίες. Η διατήρηση των ελληνικών τοπικών ποικιλιών είναι πολύ σημαντική διότι δίνει την δυνατότητα της οικονομικής ανάπτυξης του αγροτικού τομέα της χώρας μας. Συνεπώς είναι προφανής η σημασία της μελέτης της γενετικής ποικιλότητας και της ταυτοποίησης των ελληνικών ποικιλιών. 27

28 1.5 Τοπικές ποικιλίες και η χρησιμότητα τους στην βελτίωση Τοπική ποικιλία είναι μια ποικιλία που κατάγεται από μια συγκεκριμένη περιοχή και τα ποιοτικά χαρακτηριστικά της μπορούν να αποδοθούν σε ένα βαθμό στην συγκεκριμένη γεωγραφική περιοχή. Η σύγχρονη γεωργία, οι συμβατικές μέθοδοι καλλιέργειας και η αλόγιστη χρήση των εισροών έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της γενετικής ποικιλότητας και τη στασιμότητα των αποδόσεων ειδικά σε λιγότερο ευνοϊκές περιοχές. Όλο και περισσότερες παραδοσιακές ποικιλίες έχουν αντικατασταθεί από εμπορικές ποικιλίες που είναι λιγότερο ανθεκτικές στα παράσιτα, στις ασθένειες αλλά και στις αβιοτικές καταπονήσεις, χάνοντας έτσι μια πολύτιμη πηγή γενετικού υλικού για την κάλυψη των μελλοντικών αναγκών της αειφόρου γεωργίας στο πλαίσιο της κλιματικής αλλαγής. Πρόσφατα έχει γίνει μεγάλη προσπάθεια για τη συλλογή, την οργάνωση, την μελέτη και την ανάλυση των παραδοσιακών ποικιλιών. Τα πλεονεκτήματα των τοπικών ποικιλιών είναι πολλά και έχουν μεγάλη σημασία στην βελτίωση. (Newton κ.ά. 2010). Οι τοπικές ποικιλίες έχουν πολύ πλούσια και διαφοροποιημένη καταγωγή και έτσι παρουσιάζουν μεγάλη παραλλακτικότητα όσον αφορά την ανθεκτικότητα σε διάφορες καταπονήσεις. Επίσης, προσφέρουν πόρους και σημαντικά κληρονομήσιμα χαρακτηριστικά για την ανάπτυξη των μελλοντικών καλλιεργειών. Υπάρχουν πολλές συλλογές γενετικού υλικού παραδοσιακών ποικιλιών που εμφανίζουν πολύτιμη παραλλακτικότητα ως προς τα μορφολογικά, τα αγρονομικά και τα βιοχημικά χαρακτηριστικά τους. Το γενετικό τους υλικό έχει χαρακτηριστεί σε ικανοποιητικό βαθμό και με πολλούς διαφορετικούς τρόπους, συμπεριλαμβανομένων και των μοριακών δεικτών. Ένα μεγάλο μέρος αυτού του γενετικού υλικού διατηρείται τόσο με τη μακροχρόνια αποθήκευση όσο και την εκμετάλλευση του σε τοπικές καλλιέργειες. Βέβαια, υπάρχει μεγάλη ανησυχία για την ευκολία προσβασιμότητας στις καταχωρήσεις αυτές παρά τις διεθνείς στρατηγικές για την αντιμετώπιση αυτού του ζητήματος. Οι εξελίξεις στον τομέα των τεχνολογιών γενοτύπησης καθιστούν δυνατό τον εντοπισμό της γενετικής παραλλακτικότητας των τοπικών ποικιλιών. Ωστόσο, θα πρέπει η γενοτύπηση να συνδυάζεται με υψηλής ακρίβειας, εκτεταμένη και λεπτομερή εκτίμηση του φαινοτύπου. 28

29 Η αποδοτικότητα χρήσης των θρεπτικών συστατικών είναι ένα πολύ σημαντικό κριτήριο για την αειφορική ανάπτυξη. Το γενετικό υλικό από τις τοπικές ποικιλίες προσφέρει μια πιθανή πηγή για τη βελτίωση των καλλιεργειών ως προς την αποδοτικότητα χρήσης των θρεπτικών συστατικών, αν και αυτά τα χαρακτηριστικά αλληλεπιδρούν σε μεγάλο βαθμό με το περιβάλλον τους, ιδιαίτερα με τις συνθήκες του εδάφους καθώς και ξένους οργανισμούς που επηρεάζουν τις ρίζες και το μικροπεριβάλλον των φυτών. Οι τοπικές ποικιλίες είναι μια δυνητική πηγή χαρακτηριστικών για τη βελτίωση της διατροφικής αξίας των καλλιεργειών, ιδιαίτερα όσον αφορά την περιεκτικότητα σε αντιοξειδωτικά, φαινολικά και καροτενοειδή. Επίσης είναι μια πηγή γενετικού υλικού για την βελτίωση της περιεκτικότητας σε ανόργανα άλατα, ιδιαίτερα σε σίδηρο και ψευδάργυρο. Τα διάφορα επιθυμητά χαρακτηριστικά είναι εύκολο να μεταφερθούν από το γενετικό υλικό των τοπικών ποικιλιών στο γενετικό υλικό των εμπορικών ποικιλιών. Συγκεκριμένα, οι τοπικές ποικιλίες κολοκυθιού έχουν μεγάλη χρησιμότητα ως πηγή χαρακτηριστικών διότι το κολοκύθι χαρακτηρίζεται από μεγάλη παραλλακτικότητα, ακόμα και ενδοειδικά. Η Ελλάδα, περιέχει ένα μεγάλο ποσοστό της γενετικής ποικιλότητας των τοπικών ποικιλιών κολοκυθιού οπότε οι ελληνικές τοπικές ποικιλίες κολοκυθιού καθιστούν μια πολύτιμη πηγή γενετικού υλικού για τα Προγράμματα Βελτίωσης. 29

30 2.ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ 2.1 Φυτικό γενετικό υλικό Για την ανάλυση της γενετικής ποικιλότητας του κολοκυθιού χρησιμοποιήθηκαν 36 ελληνικές τοπικές ποικιλίες (Πίνακας 3). Οι ποικιλίες αυτές αντιπροσωπεύουν ένα μεγάλο μέρος της γενετικής ποικιλότητας των ελληνικών ποικιλιών κολοκυθιού (90% για το είδος C.pepo) και χορηγήθηκαν από την Ελληνική Τράπεζα Γενετικού Υλικού του Ελληνικού Γεωργικού Οργανισμού Δήμητρα (ΕΛΓΟ -ΔΗΜΗΤΡΑ) που βρίσκεται στην Θέρμη της Θεσσαλονίκης. Οι 36 ποικιλίες της παρούσας μελέτης ανήκουν στον μορφολογικό τύπο Zucchini που αναφέρεται κυρίως σε μικρόκαρπα κολοκυθάκια που ανήκουν στο είδος C.pepo. Όπως φαίνεται και στην Εικόνα 5 οι ποικιλίες προήλθαν από διαφορετικά μέρη της Ελλάδος συμπεριλαμβανομένων και κάποιων νησιών όπως η Ρόδος και η Κάλυμνος. Κάποιες μάλιστα από τις ποικιλίες αυτές έχουν και τοπικές ονομασίες γεγονός που υποδεικνύει ότι χρησιμοποιούνται από τον τοπικό πληθυσμό για καλλιέργεια. 2.2 Απομόνωση DNA Για την απομόνωση του DNA από τις 36 ελληνικές τοπικές ποικιλίες κολοκυθιού ακολουθήθηκε η εξής διαδικασία: Βήμα 1: Πραγματοποιήθηκε η λυοτρίβηση των σπόρων κάθε ποικιλίας ξεχωριστά σε αποστειρωμένα γουδιά με την παρουσία υγρού αζώτου. Η παραγόμενη σκόνη τοποθετήθηκε σε σωληνάκια (eppendorf). Βήμα 2: Το DNA απομονώθηκε από τις 36 ποικιλίες σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Nucleospin Extract Plant II (Macherey&Nagel)). Βήμα 3: Τα DNA φασματοφωτομετρήθηκαν στα 260 και 280nm με την χρήση του φασματοφωτόμετρου Eppendorf BioPhotometer. Στην συνέχεια έγινε ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης 0.8% για να διαπιστωθεί η ακεραιότητα του DNA και όλα τα δείγματα αραιώθηκαν σε τελική συγκέντρωση 20ng/μL. 30

31 Πίνακας 3: Χαρακτηριστικά των 36 υπό μελέτη ποικιλιών κολοκυθιού (C.pepο). No Κωδικός Προέλευση Τοπική ονομασία Μορφολογικός 1 GRC262/04 CHANIA Zucchini 2 GRC597/04 AHAIA Zucchini 3 GRC1025/04 AETOLOAKARNANIA Zucchini 4 GRC1369/04 ARTA Zucchini 5 ATS-030/06 ΚΑΙROS ISL. Zucchini 6 ATS-063/06 TINOS Zucchini 7 F-104/06 KASTORIA Zucchini 8 F-135/06 KASTORIA Πιτσιάλα Zucchini 9 K-061/06 KOZANI Zucchini 10 K-161/06 GREBENA Zucchini 11 K-192/06 GREBENA Zucchini 12 M-047/06 LESVOS ISL. Μαγιάτικο Zucchini 13 M-166/06 LESVOS ISL. Zucchini 14 P-054/06 ARKADIA Zucchini 15 P-085/06 MESSINIA Zucchini 16 P-170/06 LAKONIA Zucchini 17 P-199/06 ARKADIA Καρδιά Zucchini 18 SK-067/06 SERRES Zucchini 19 T-024/06 KARDITSA Zucchini 20 T-121/06 KARDITSA Zucchini 21 T-223/06 KARDITSA Zucchini 22 T-373/06 TRIKALA Zucchini 23 T-528/06 TRIKALA Ριζίτες Zucchini 24 ANP-039/07 AMORGOS ISL. Zucchini 25 ANP-163/07 NAXOS ISL. Zucchini 26 AO-059/07 AG. OROS Zucchini 27 HL-018/07 IRAKLION Φορμάρες Zucchini 28 HL-195/07 LASITHI Zucchini 29 KD-014/07 KAVALA Zucchini 30 LKK-058/07 KALYMNOS ISL. Zucchini 31 RK-046/07 RODOS ISL Σαραβάνες Zucchini 32 ROX-091/07 XANTHI Zucchini 33 ROX-139/07 RODOPI Zucchini 34 SAS-010/07 ALONNISOS ISL. Zucchini 35 SAS-085/07 SKOPELOS ISL. Zucchini 36 XKA-010/07 CHALKIDIKI Zucchini 31

32 Εικόνα 5: Γεωγραφική απεικόνιση των 36 παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού στον ελλαδικό χώρο. 2.5 Ανάλυση των μοριακών δεικτών ISSR και SCoT Η αντίδραση PCR με τους εκκινητές ISSR (Πίνακας 4) πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 15 μl που περιείχε 20 ng DNA από σπόρο των ποικιλιών του είδους C. pepo, 1.5 μl of 10 Taq DNA, 2 mm MgCl2, 0,2 mm dntps, 40 pmol για κάθε εκκινητή και 1U Taq polymerase (Invitrogen). Οι κύκλοι της PCR πραγματοποιήθηκαν σε συσκευή PTC 200 (MJ Research). Η ενίσχυση μέσω της PCR, συνίσταται από την αρχική περίοδο για την αποδιάταξη (στάδιο μετουσίωσης) του DNA και την ενεργοποίηση του ενζύμου της πολυμεράσης στους 94 0 C για 5 λεπτά., ακολουθούμενη από 35 κύκλους στους 94 0 C για 30 δευτερόλεπτα για την αποδιάταξη του DNA, στους C (ανάλογα τον εκκινητή) για 90 δευτερόλεπτα για τον υβριδισμό των εκκινητών και στους 72 0 C για 90 δευτερόλεπτα για τον εκθετικό πολλαπλασιασμό του επιλεγμένου τμήματος του DNA. Μετά από 35 32

33 κύκλους, η θερμοκρασία διατηρήθηκε στους 72 0 C πολυμερισμό. για 5 λεπτά για τον τελικό Πίνακας 4: Χαρακτηριστικά των μοριακών δεικτών ISSR. Όνομα εκκινητή (ISSR) Αλληλουχία εκκινητή (5'-3') Θερμοκρασία υβριδισμού ( o C) Εύρος μεγέθους ζώνης(bp) ISSR-811 GAG AGA GAG AGA GAG AC ISSR-823 TCT CTC TCT CTC TCT CC ISSR-827 ACA CAC ACA CAC ACA CG ISSR-834 AGA GAG AGA GAG AGA GYT ISSR-860 TGT GTG TGT GTG TGT GRA ISSR-881 GGG TGG GGT GGG GTG Ομοίως, η PCR με τους εκκινητές SCoT (Πίνακας 5) πραγματοποιήθηκε σε τελικό όγκο 15 μl που περιείχε 20 ng DNA από σπόρο των ποικιλιών του είδους C. pepo, 1.5 μl of 10 Taq DNA, 2 mm MgCl2, 0,2 mm dntps, 40 pmol για κάθε εκκινητή και 1U Taq polymerase (Invitrogen). Οι κύκλοι της PCR πραγματοποιήθηκαν σε συσκευή PTC 200 (MJ Research). Η ενίσχυση μέσω της PCR, συνίσταται από την αρχική περίοδο για την αποδιάταξη (στάδιο μετουσίωσης) του DNA και την ενεργοποίηση του ενζύμου της πολυμεράσης στους 94 0 C για 5 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους στους 94 0 C για 30 δευτερόλεπτα για την αποδιάταξη του DNA, στους C (ανάλογα τον εκκινητή) για 90 δευτερόλεπτα για τον υβριδισμό των εκκινητών και στους 72 0 C για 90 δευτερόλεπτα για την αντιγραφή του επιλεγμένου τμήματος του DNA από τους εκκινητές. Μετά από 35 κύκλους, η θερμοκρασία διατηρήθηκε στους 72 0 C για 5 λεπτά για τον τελικό πολυμερισμό. 33

34 Πίνακας 5: Χαρακτηριστικά των μοριακών δεικτών SCoT. Όνομα εκκινητή (UBC) Εκκινητής (5'-3') Θερμοκρασία υβριδισμού ( o C) Εύρος μεγέθους ζώνης SCOT-33 CCATGGCTACCACCGCAG SCOT-34 ACCATGGCTACCACCGCA SCOT-61 CAACAATGGCTACCACCG SCOT-70 ACCATGGCTACCAGCGCG SCOT-13 ACGACATGGCGACCATCG SCOT-14 ACGACATGGCGACCACGC Η ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων της αντίδρασης PCR και για τα δύο συστήματα μοριακών δεικτών πραγματοποιήθηκε σε πηκτή αγαρόζης 1.5%. Η φωτογράφηση της πηκτής πραγματοποιήθηκε με τη συσκευή Uvitec (UVItec LIMITED Avebury House 36A Union Lane Cambridge CB4 1QB, United Kingdom) και για την εύρεση του ακριβούς μεγέθους των ζωνών χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό πρόγραμμα UVIDocMw version (UVI Tech, St John s Innovation Center, Cawley Road, CAMBRIDGE). 2.6 Ανάλυση HRM των μοριακών δεικτών EST-SSR Η αντίδραση PCR και η ανάλυση HRM πραγματοποιήθηκαν σε μία συσκευή RotorGene 6600 (Corbett Research Pty Ltd, Sydney, Australia) και τα αποτελέσματα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού προγράμματος RotorGene 6000, έκδοση Οι αλληλουχίες των εκκινητών EST-SSR που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση των 36 τοπικών ποικιλιών κολοκυθιάς περιγράφονται στον Πίνακας 6. Οι εκκινητές σχεδιάστηκαν όπως περιγράφεται από τους Blanca, (2011). Τα 15 μl του όγκου αντίδρασης της PCR περιείχαν 1 U Kappa Taq, 1X PCR buffer, 2.5 mm MgCl2, 0.2 mm dntp, 300 nm από κάθε εκκινητή, 1.5 μm χρωστική Syto 9 (Invitrogen, Paisley, UK) και 1 μl DNA (συγκέντρωση 30 ng/ μl). Οι συνθήκες της PCR ήταν: επώαση στους 95 0 C για 2 λεπτά, ακολουθούμενη από 35 κύκλους επώασης στους 95 0 C για 10 δευτερόλεπτα, στους 55 0 C για 20 δευτερόλεπτα και τέλος στους 72 0 C για 20 δευτερόλεπτα. Η ανάλυση HRM 34

35 πραγματοποιήθηκε αμέσως μετά την PCR ανάλογα με τα ζεύγη των εκκινητών από τους 70 0 C έως τους 90 0 C με διάβασμα κάθε 0,2 0 C και με απόσταση 2 δευτερολέπτων μεταξύ των διαβασμάτων. Για τον έλεγχο της επαναληψιμότητας χρησιμοποιήθηκαν δειγματοληπτικά τρία δείγματα DNA από 5 τοπικές ποικιλίες που προήλθαν από διαφορετικές απομονώσεις. Τα απόλυτα επίπεδα φθορισμού πριν και μετά την τήξη ομαλοποιήθηκαν στο 100% και 0% αντίστοιχα για να μετρηθούν οποιαδήποτε διαφορετικά επίπεδα φθορισμού από τις διαφορετικές αντιδράσεις. Η ανάλυση HRM βασίζεται περισσότερο στο σχήμα των καμπυλών τήξεως παρά στην απόλυτη τιμή της θερμοκρασίας τήξης που προέρχεται από το αρνητικό παράγωγο (negative derivative, όπως γίνεται με τη χρήση της χρωστικής SYBR Green). Γι αυτό οι καμπύλες τήξεως στη συνέχεια ομαλοποιούνται κατά μήκος του άξονα της θερμοκρασίας (μετατόπιση θερμοκρασίας) για τον καλύτερο διαχωρισμό των καμπυλών τήξης (Montgomery κ.ά. 2007). Πίνακας 6: Χαρακτηριστικά των μοριακών δεικτών EST-SSR. Cucurbita Ανοδικός εκκινητής SSR Καθοδικός εκκινητής SSR Μέγεθος unigene ID προϊόντος (bp) CUTC GTGGGCTAAGTTCAAATCGTTC GAACCCAATCTTCTCATTTCCA 183 CUTC ATCCCAGGTCCCAATTTTCTTC CCATACCTGAGGGACCTGAAAC 189 CUTC CAAAACTGCCCATGACCACTAC CTTTCTACCCCAACCCCACAT 146 CUTC AGCACTGGGTTAACAGAGGAAA ATGATACAGTAATCGGCGTCCT 149 CUTC TGTGATTTGTTGGGCTCTCTGT ACATGGAAATCCACCTCTTCGT 223 CUTC CCCTCGGTAGCAATTTTGTAGT TTTGGTGGGAGTGATACTGATG Στατιστική ανάλυση Για την ανάλυση των μοριακών δεικτών ISSR και SCoT, υπολογίστηκαν η γενετική ποικιλότητα κατά Nei (GD) (Nei 1973) και ο πληροφοριακός δείκτης Shannon (I) (Lewontin 1972) με το λογισμικό POPGEN 1.32 (Yeh και Boyle 1997). Επίσης υπολογίστηκε η διαχωριστική ισχύς (Rp) του κάθε εκκινητή: Rp = Σ IB όπου IB= 1 [2 x (0.5 p)] και p είναι το ποσοστό των 21 ποικιλιών που περιέχουν την ζώνη (Prevost και Wilkinson 1999). 35

36 Τα προϊόντα ενίσχυσης που εμφανίστηκαν στην πηκτή αγαρόζης για τους μοριακούς δείκτες ISSR και SCoT αποτυπώθηκαν σε πίνακες όπου σημειώθηκαν η παρουσία (1) ή η απουσία (0) των αντίστοιχων ζωνών (ζεύγη βάσεων) για κάθε εκκινητή και δείγμα. Ενώ για τους μοριακούς δείκτες EST-SSR οι ποικιλίες διαχωρίστηκαν σε ομάδες με βάση τις καμπύλες τήξης της ανάλυσης HRM. Οι διαφορές στις καμπύλες αντιπροσωπεύουν και τις διαφορές στους γενοτύπους. Στην συνέχεια δημιουργήθηκαν πίνακες όπου οι τιμές 0 και 1 δόθηκαν στις ποικιλίες ανάλογα με το πρότυπο καμπύλης που ακολούθησαν. Οι πίνακες και για τα 3 είδη δεικτών (ISSR, SCot, και EST-SSR) αναλύθηκαν με το λογισμικό FreeTree v (Hampl, 2001). Οι πίνακες των συντελεστών ομοιομορφίας που υπολογίστηκαν από το λογισμικό FreeTree μετατράπηκαν στο λογισμικό MEGA 4 v4.1 (Kumar, Tamura, Nei 2004) με σκοπό την καλύτερη αποτύπωση του δενδρογράμματος. Η περιεχόμενη πληροφορία πολυμορφισμού (PIC) υπολογίστηκε σύμφωνα με τους (Botstein κ.ά. 1980) για κάθε εκκινητή χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο PICcalc (Nagy κ.ά. (2012). Τέλος υπολογίστηκε και η διαχωριστική ικανότητα του δείκτη (MI). Η πληροφοριακή ικανότητα των μοριακών δεικτών, όπως μετράται από την τιμή PIC καθώς και την τιμή ΜΙ μπορεί να εκτιμήσει ικανοποιητικά την χρησιμότητα του δείκτη ((Powell κ.α., 1996).: MI = PIC x E or MI= n x b x PIC) Μαθηματικοί τύποι στατιστικών παραμέτρων Γενετική ποικιλότητα ή ετεροζυγωτία GD =1-Σpi 2 όπου pi η συχνότητα των ith αλληλομόρφων. Συντελεστής γενετικής ποικιλότητας Shannon I=Σpilnpi όπου ln ο φυσικός λογάριθμος και pi η συχνότητα των ith αλληλομόρφων. Διαχωριστική ισχύς Rp= Σ ΙΒ όπου IB=1-[2 x (0.5-p)] p είναι το ποσοστό των 36 ποικιλιών που περιέχουν την ζώνη 36

37 Διαχωριστική ικανότητα του δείκτη ΜΙ= PIC x n x β β = n p /(n p + n np ) n p = πολυμορφικές γενετικές περιοχές n np = μη πολυμορφικές γενετικές περιοχές 2.8 Βιοπληροφορική ανάλυση Προκειμένου να αποκτηθεί πληροφορία σχετικά με τα γονίδια που περιέχουν οι υπό μελέτη μοριακοί δείκτες EST-SSR, οι συναρμολογημένες αλληλουχίες (contigs) του C. pepo εισήχθησαν στη βάση δεδομένων του NCBI ( στον αλγόριθμο BLASTx σαν ερωτήματα (queries) πρωτεϊνών. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκε η βάση δεδομένων της Phytozome ( και ο αλγόριθμος BLASTn για την ταυτοποίηση των πιθανών ορθόλογων γονιδίων αγγουριού με τα contigs του κολοκυθιού, αφού το αγγούρι (C. sativus) και το κολοκύθι (C. pepo) έχουν υψηλό βαθμό ομοιότητας των γονιδιωμάτων τους, αλλά μόνο το γονιδίωμα της αγγουριάς είναι πλήρως αλληλουχημένο. Τα πιθανά ορθόλογα γονίδια του αγγουριού ευθυγραμμίστηκαν (aligned) με τις νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των συναρμολογημένων αλληλουχιών του κολοκυθιού με τη χρήση της μεθόδου πολλαπλής ευθυγράμμισης ClustalW ( Στις περιπτώσεις όπου οι συναρμολογημένες αλληλουχίες του κολοκυθιού χωρίστηκαν σε περισσότερα του ενός εξώνια στο γονιδίωμα του αγγουριού, χρησιμοποιήθηκε το πρόγραμμα Spidey ( ) με σκοπό να ερευνηθούν οι ομοιότητες των νουκλεοτιδίων. 37

38 3. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 3.1 Ανάλυση των Μοριακών Δεικτών ISSR Οι έξι εκκινητές ISSR που χρησιμοποιήθηκαν, παρήγαγαν πρότυπα πολλαπλών ζωνών για κάθε τοπική ποικιλία (Πίνακας 7). Επίσης δημιούργησαν σαράντα δύο αξιόπιστες και αναπαραγώγιμες ζώνες από το DNA των 36 ποικιλιών κολοκυθιού. Ο συνολικός αριθμός των ζωνών κυμάνθηκε από έξι έως εννέα και ο αριθμός των πολυμορφικών ζωνών από τρία έως επτά/εκκινητή. Οι εκκινητές ISSR811, ISSR823, ISSR827 και ISSR834 παρήγαγαν το μικρότερο αριθμό πολυμορφικών ζωνών (τρεις) ενώ οι εκκινητές ISSR860 (Εικόνα 6) και ISSR881 (Εικόνα 7) παρήγαγαν το μεγαλύτερο αριθμό πολυμορφικών ζωνών (επτά). Το μέγεθος των ζωνών κυμάνθηκε από 600 bp (ISSR811 και ISSR834) έως 4.0 kb (ISSR860). Μεταξύ των παραδοσιακών ποικιλιών που αναλύθηκαν, το 60,5% των ζωνών ISSR ήταν πολυμορφικές. Τα δεδομένα για τις τιμές GD και Ι για τις 36 παραδοσιακές ποικιλίες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τους έξι δείκτες ISSR και οι μέσες τιμές τους ήταν 0,294 και 0,451 αντίστοιχα (Πίνακας 7). Το γενετικό προφίλ της κάθε τοπικής ποικιλίας που υπολογίστηκε με τη χρήση των έξι εκκινητών ISSR χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της απόδοσης των εκκινητών μετρώντας τρεις παραμέτρους: την περιεχόμενη πληροφορία πολυμορφισμού (PIC) την διαχωριστική ικανότητα του δείκτη (MI) και την διακριτική ικανότητα (R P ). Ως αποτέλεσμα, βρέθηκε υψηλή τιμή PIC στον εκκινητή ISSR834 (0.302) ενώ χαμηλή τιμή PIC βρέθηκε στον εκκινητή ISSR881 (0,189) (Πίνακας 7). Ο μέσος όρος των PIC τιμών ανά εκκινητή ήταν Ο μέσος όρος των τιμών Rp ήταν ανά εκκινητή (Πίνακας 7). Η υψηλότερη τιμή Rp παρατηρήθηκε στον εκκινητή ISSR881 (5.662) ενώ η χαμηλότερη στον εκκινητή ISSR827 (1.504). Η υψηλότερη τιμή MI βρέθηκε στον εκκινητή ISSR860 (1.330) ενώ η χαμηλότερη στον εκκινητή ISSR823 (0.672). 38

39 Εικόνα 6: Ηλεκτροφόρηση των 36 ελληνικών ποικιλιών κολοκυθιού με βάση τον δείκτη ISSR860. Εικόνα7: Ηλεκτροφόρηση των 36 ελληνικών ποικιλιών κολοκυθιού με βάση τον δείκτη ISSR

40 Πίνακας 7: Στατιστικές παράμετροι των μοριακών δεικτών ISSR. Εκκινητής (ISSR) Αναλογία πολυμορφικών ζωνών Ποσοστό πολυμορφισμού (%) Γονιδιακή ποικιλότητα (GD) Δείκτης Shannon (I) PIC Διαχωριστική ισχύς (RP) MI 811 3/ / / / / / Mean 4.3/ Ανάλυση των Μοριακών Δεικτών SCoT Η αντίδραση PCR για τις 36 τοπικές ποικιλίες που ανήκουν στο είδος C.pepo χρησιμοποιώντας επτά δείκτες SCoT οδήγησε στην παραγωγή 78 ζωνών συνολικά εκ των οποίων οι 49 ήταν πολυμορφικές (Πίνακας 8). Ο αριθμός των πολυμορφικών ζωνών κυμάνθηκε από 14 (SCoT70) (Εικόνα 8) έως 3 (SCoT61) με ένα μέσο όρο 7 ανά εκκινητή. Το μέγεθος των ενισχυμένων προϊόντων κυμάνθηκε από 250 έως 3800bp. Το ποσοστό πολυμορφισμού κυμάνθηκε από 30% έως 100% με μέσο όρο το 62.82%. Οι τιμές PIC κυμάνθηκαν από 0,153 (SCoT61) έως (SCoT33) (Εικόνα 9), με μία μέση τιμή το Η ποικιλομορφία των ελληνικών παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού αναλύθηκε υπολογίζοντας την παραλλακτικότητα με βάση την τιμή Nei (GD), καθώς και τον δείκτη Shannon (Ι). Τα δεδομένα για τις τιμές GD και I για τις 36 παραδοσιακές ποικιλίες που αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας επτά δείκτες SCoT είχαν μέσες τιμές τους 0,251 και 0,393 αντίστοιχα (Πίνακας 8). Η εκτίμηση της διακριτικής ικανότητας (Rp) είναι μια ένδειξη της ικανότητας των δεικτών SCoT να διακρίνουν τις 36 παραδοσιακές ποικιλίες. Η διακριτική ικανότητα (Rp) του κάθε εκκινητή εκτιμήθηκε προκειμένου 40

41 να προσδιορίσει τους πιο πληροφοριακούς εκκινητές για τη διάκριση των παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού. Οι τιμές Rp των επτά εκκινητών SCoT κυμάνθηκαν από 0,612 για τον εκκινητή SCoT61 έως για τον εκκινητή SCoΤ13 (Πίνακας 8) με μια μέση τιμή το 4,595. Τρεις από τους εκκινητές SCoΤ, οι SCoΤ13, SCoΤ70 και SCoT14, είχαν υψηλές τιμές R P (10.054, 8.78 και 4.556, αντίστοιχα) και είναι οι πιο αποτελεσματικοί για την αποτύπωση της γενετικής ποικιλότητας στις 36 ελληνικές παραδοσιακές ποικιλίες. Η υψηλότερη τιμή MI παρατηρήθηκε στον εκκινητή SCoΤ 70 (3.094) και η χαμηλότερη στον εκκινητή SCoΤ 61 (0,315). Εικόνα 8: Ηλεκτροφόρηση των 36 ελληνικών ποικιλιών κολοκυθιού με βάση τον δείκτη SCoT70. Εικόνα 9: Ηλεκτροφόρηση των 36 ελληνικών ποικιλιών κολοκυθιού με βάση τον δείκτη SCoT33. 41

42 Πίνακας 8: Στατιστικές παράμετροι των μοριακών δεικτών SCoT. Εκκινητής (SCoT) Αναλογία πολυμορφικών ζωνών Ποσοστό πολυμορφισμού (%) Γονιδιακή ποικιλότητα (Gd) Δείκτης Shannon (I) PIC Διαχωριστική ισχύς (RP) MI SCoT13 11/ SCoT14 8/ SCoT33 3/ SCoT34 3/ SCoT61 3/ SCoT66 7/ SCoT70 14/ Mean 7/ Φυλογενετική σύγκριση των Μοριακών Δεικτών ISSR και SCoT Συγκριτικά και οι δύο μοριακοί δείκτες (SCoΤ και ISSR) διέκριναν ικανοποιητικά τις 36 ελληνικές τοπικές ποικιλίες κολοκυθιού (C. pepo). Το επίπεδο πολυμορφισμού των δεικτών SCoΤ (62,82%) ήταν παρόμοιο με εκείνο των δεικτών ISSR (60,5%). Οι γενετικές σχέσεις των 36 ελληνικών τοπικών ποικιλιών κολοκυθιού, όπως προσδιορίζονται από τα δενδρογράμματα για τους δείκτες ISSR, τους δείκτες SCoΤ καθώς και το συγκεντρωτικό δενδρόγραμμα για τους δείκτες ISSR και SCoΤ μαζί απεικονίζονται στην Εικόνα 10, 11 και 12 αντίστοιχα. Τα δενδρογράμματα που δημιουργήθηκαν από τους δείκτες SCoΤ (Εικόνα 11) και ISSR (Εικόνα 10) ήταν σχετικά όμοια και οι τοπικές ποικιλίες διαχωρίστηκαν σε ομάδες κατά τον ίδιο τρόπο. Το δενδρόγραμμα των δεικτών SCoΤ ήταν πιο κοντά στο συνολικό δενδρόγραμμα των συγκεντρωτικών δεδομένων (ISSR και SCoΤ μαζί) σε σχέση με το δενδρόγραμμα των δεικτών ISSR. Σε αμφότερες τις αναλύσεις διασποράς, η τοπική ποικιλία LKK58/07 δεν ομαδοποιήθηκε με άλλους γενοτύπους 42

43 και διαχωρίστηκε σε ξεχωριστή υποομάδα. Οι γενότυποι που ανήκουν στην ομάδα F τόσο στο δενδρόγραμμα των δεικτών SCoT όσο και στο δενδρόγραμμα των δεικτών ISSR ήταν περίπου οι ίδιοι. Στο δενδρόγραμμα (Εικόνα 12) των συγκεντρωτικών δεδομένων, οι γενότυποι ομαδοποιήθηκαν σε έξι διαφορετικές ομάδες (A-F). Σύμφωνα με τους δείκτες ISSR, οι 36 τοπικές ποικιλίες κολοκυθιού ταξινομήθηκαν σε πέντε ομάδες, με τρεις μεγάλες ομάδες με δέκα, οκτώ και οκτώ τοπικές ποικιλίες αντίστοιχα (Εικόνα 10, ομάδες Β, Δ και Ε, αντιστοίχως), και δύο μικρότερες ομάδες που αποτελούνται από πέντε παραδοσιακές ποικιλίες η κάθε μια (Εικόνα 10, ομάδες Α και Γ). Κρίνοντας από τη θέση τους στο δενδρόγραμμα, οι τοπικές ποικιλίες KD14/07 και RK46/07 παρουσιάζουν ένα υψηλό επίπεδο γενετικής συσχέτισης. Για τους δείκτες SCoT, οι πολυμορφικές ζώνες που ανιχνεύθηκαν, χρησιμοποιήθηκαν για να υπολογιστεί ο συντελεστής ομοιότητας των ποικιλιών και στη συνέχεια να κατασκευάσει ένα δενδρόγραμμα ομοιότητας χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο UPGMA. Σε αυτό το δενδρόγραμμα ομοιότητας οι 36 τοπικές ποικιλίες κολοκυθιού ταξινομήθηκαν σε έξι ομάδες, (Εικόνα 11), και τρεις μικρότερες ομάδες που αποτελούνται από δύο έως τέσσερις παραδοσιακές ποικιλίες (Εικόνα 11, ομάδες Β, C και E). Μία μόνο τοπική ποικιλία, η P89/06, δεν ταξινομήθηκε σε καμία ομάδα. Τα διαγράμματα διασποράς της PCA ανάλυσης (Εικόνα 13) υποστηρίζουν περαιτέρω τα παραπάνω δενδρογράμματα, εξηγώντας ένα υψηλό ποσοστό της συνολικής γενετικής ποικιλότητας και συγκεκριμένα το 47,14% για τους εκκινητές SCoT και το 47,02% για τους εκκινητές ISSR. 43

44 Εικόνα 10: Φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των 36 ποικιλιών κολοκυθιού με βάση τους μοριακούς δείκτες ISSR. Τα γράμματα (A-E) υποδηλώνουν τις διαφορετικές ομάδες. 44

45 Εικόνα 11: Φυλλογενετικές σχέσεις μεταξύ των 36 ποικιλιών κολοκυθιού με βάση τους μοριακούς δείκτες SCoT. Τα γράμματα (A-F) υποδηλώνουν τις διαφορετικές ομάδες. 45

46 Εικόνα 12: Ανάλυση των φυλλογενειτκών σχέσεων μεταξύ των 36 ποικιλιών κολοκυθιού με την χρήση των μοριακών δεικτών ISSR και SCoT. Τα γράμματα (A-F) υποδηλώνουν τις διαφορετικές ομάδες. 46

47 Εικόνα 13: Ανάλυση κυρίων συντεταγμένων (PCA) των 36 παραδοσιακών ποικιλιών με βάση τους μοριακούς δείκτες A) SCoT και B) ISSR. 47

48 3.4 Ανάλυση των Μοριακών Δεικτών EST-SSR Για την γενοτύπηση και την διάκριση των 36 ελληνικών τοπικών ποικιλιών κολοκυθιού, αξιολογήθηκαν έξι διαφορετικοί εκκινητές EST-SSR που βασίζονται σε γονίδια. Για όλα τα ζεύγη εκκινητών, επιβεβαιώθηκε τόσο η ευαισθησία τους όσο και η επαναληψημότητά τους ως προς την ανίχνευση των διαφορών μεταξύ των γενοτύπων. Ο πολυμορφισμός εντός των 36 τοπικών ποικιλιών κολοκυθιού από τα έξι ζεύγη εκκινητών, με βάση τις καμπύλες HRM ήταν 100% (Εικόνα 14). Εικόνα 14: Καμπύλες τήξης της ανάλυσης HRM των 36 διαφορετικών γενοτύπων που αναλύθηκαν με τον δείκτη CUTC Η απλή ανάλυση των καμπυλών τήξης δεν επιτρέπει την επαρκή διάκριση των διαφορετικών γενοτύπων, καθώς χρησιμοποιεί μόνο τις τιμές της θερμοκρασίας τήξης (Τm). Αντιθέτως, η ισχύς της ανάλυσης HRM είναι πολύ μεγαλύτερη από ό, τι της συμβατικής ανάλυσης των καμπυλών τήξης διότι οι καμπύλες της ανάλυσης HRM είναι ιδιαίτερα χαρακτηριστικές και μοναδικές για κάθε προϊόν και βασίζονται σε περισσότερες παραμέτρους όπως είναι το περιεχόμενο σε GC βάσεις, η αλληλουχία καθώς και η θερμοκρασία τήξης του προϊόντος. Στην Εικόνα 15 απεικονίζονται οι κανονικοποιημένες καμπύλες τήξης της ανάλυσης HRM 7 ελληνικών παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού που αντιπροσωπεύουν τις διαφορετικές ομάδες γενοτύπων, με τη χρήση του δείκτη EST-SSR CUTC Όλες οι υπόλοιπες καμπύλες τήξης των ποικιλιών ακολουθούσαν κάποιο από αυτά τα 7 πρότυπα καμπυλών τήξης. Χρησιμοποιώντας το σχήμα των καμπυλών τήξης αποκαλύφθηκαν οι διαφορές μεταξύ των υπό μελέτη ποικιλιών και διαπιστώθηκε ότι μπορούν εύκολα να 48

49 διακριθούν οπτικά, όπως για παράδειγμα οι διαφορές στις ποικιλίες «K161/06» και «SAS10/07». Τα αποτελέσματα των άλλων δεικτών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν παρόμοια, δείχνοντας μια σαφή διάκριση των παραδοσιακών ποικιλιών που μελετήθηκαν. (Εικόνες Π1-Π6, Παράρτημα) Εικόνα 15: Ανάλυση HRM των 7 αντιπροσωπευτικών γενοτύπων του κολοκυθιού με τον δείκτη EST-SSR CUTC A) Κανονικοποιημένες καμπύλες τήξης για τις 7 διαφορετικές ομάδες. Β) Γράφημα διαφορετικότητας των 7 αντιπροσωπευτικών γενοτύπων χρησιμοποιώντας τον γενότυπο T373/06 ως γενότυπο αναφοράς. C) Προφίλ ηλεκτροφόρησης των 7 διαφορετικών γενοτύπων. Για να επιβεβαιωθεί ότι αυτές οι 7 καμπύλες είναι πράγματι διαφορετικές κατασκευάστηκε το γράφημα διαφορετικότητας των 7 αντιπροσωπευτικών καμπυλών τήξης των τοπικών ποικιλιών κολοκυθιού σε σύγκριση με το γενότυπο «T373/06» που χρησιμοποιείται ως βάση (Εικόνα 15Β). Η προσεκτικότερη εξέταση του γραφήματος διαφορετικότητας της ανάλυσης HRM που παρουσιάζεται στην Εικόνα 15Β, με την καμπύλη «T373/06» ως γενότυπο αναφοράς, αποκάλυψε ότι όλες οι καμπύλες των 7 διαφορετικών γενοτύπων που απεικονίζονται διαφέρουν από την καμπύλη του γενοτύπου αναφοράς. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι όλες οι ποικιλίες που εξετάστηκαν μέσω των καμπυλών HRM, είναι πράγματι διαφορετικές. Το αποτέλεσμα του δενδρογράμματος UPGMA δείχνει ότι οι τριάντα έξι ελληνικές 49

50 τοπικές ποικιλίες κολοκυθιού μπορούν να διακριθούν επαρκώς με την χρήση των έξι δεικτών EST-SSR σε συνδυασμό με την ανάλυση HRM (Εικόνα 16). Εικόνα 16: Δενδρόγραμμα γενετικών σχέσεων των 36 παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού με την χρήση των μοριακών δεικτών EST-SSR. 50

51 3.4.1 Βιοπληροφορική ανάλυση των γονιδίων πάνω στα οποία σχεδιάστηκαν οι δείκτες EST-SSR με την βοήθεια του αλγόριθμου BLASTx. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκαν έξι δείκτες SSR βασιζόμενοι σε EST για τη διάκριση των 36 ελληνικών παραδοσιακών ποικιλιών του κολοκυθιού. Τρεις από τους δείκτες SSR (ESTs CUTC005800, CUTC και CUTC046645) βρίσκονται μέσα στην κωδική περιοχή γονιδίων, ενώ οι άλλοι τρεις δείκτες SSR (ESTs CUTC002749, CUTC και CUTC017708) βρίσκονται στην 3' UTR περιοχή γονιδίων. Τα EST, CUTC και CUTC είναι της ίδιας περιοχής του μεταγραφήματος που κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη της οικογένειας Νουκλεοβασικός Μεταφορέας του Ασκορβικού οξέος (Nucleobase-Ascorbate Transporter (ΝΑΤ), που ανήκει στην Οικογένεια Συμμεταφορέων Κατιόντων (Nucleobase Cation Symporter family (NCS2)) και περιέχει πρωτεΐνες που είναι οξειδωμένες πουρίνες ουρικό οξύ / ξανθίνη - και νουκλεοβάση - ουρακίλη - H + συμμεταφορείς που βρέθηκαν σε βακτήρια, μύκητες και φυτά. Αυτή η οικογένεια περιλαμβάνει επίσης μια υποοικογένεια όπου ανήκουν και τα NAT γονίδια των θηλαστικών και μεταφέρει το L-ασκορβικό οξύ (Diallinas και Gournas 2008). Η ξανθίνη και το ουρικό οξύ είναι σημαντικές πηγές αζώτου για τα φυτά (Brychkova κ.ά. 2008; Nakagawa κ.ά. 2007). Η αραβίδοψη (Arabidopsis thaliana) διαθέτει 12 NAT γονίδια, αλλά σε κανένα από αυτά δεν έχει αποδοθεί κάποιος ρόλος (Maurino κ.ά. 2006). Τα ESTs, CUTC και CUTC κωδικοποιούν μία πρωτεΐνη, την 528aa, που έχει μεγάλη ομοιότητα με την NAT6 πρωτεΐνη του αγγουριού (92% ομοιότητα) και την NAT6 πρωτεΐνη της αραβίδοψης (83% ομοιότητα). Το μόνο φυτικό γονίδιο ΝΑΤ με γνωστή λειτουργία είναι το Lpe1 (Leaf Permease 1) γονίδιο του καλαμποκιού που είναι απαραίτητο για την ανάπτυξη της δομής του χλωροπλάστη και την μεταφορά πουρίνης (Argyrou κ.ά. 2001; Schultes κ.ά. 1996). Ο δείκτης SSR με βάση το EST CUTC κωδικοποιεί ένα τμήμα μιας πρωτεΐνης που έχει ομοιότητα με την πρωτεΐνη ACBP του αγγουριού και την ACBP2 της αραβίδοψης (GenBank: AAG ) (Εικόνα 17). Αυτός ο δείκτης EST-SSR κωδικοποιεί μια σειρά εννέα ασπαρτικών οξέων (D) πριν από τον τομέα ACB. Η πρωτεΐνη AtACBP2, μία από τις έξι πρωτεΐνες ACBP της αραβίδοψης ανήκει στην κατηγορία Ι υποοικογένεια που περιέχει το ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) και τις πρωτεΐνες της κυτταρικής μεμβράνης (Li και Chye 2003; Xiao και Chye 2011). Οι πρωτεΐνες AtACBP2 και AtACBP1 έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκονται στην ανάπτυξη των σπόρων και του εμβρύου της αραβίδοψης (Chen κ.ά. 2010a) καθώς και στην 51

52 αντίδραση σε στρες από βαρέα μέταλλα, οξειδωτικούς παράγοντες (Gao κ.ά. 2009; Xiao κ.ά. 2008) και στην βιοτική άμυνα έναντι στο στρες (Li και Chye 2004). Εικόνα 17: Ευθυγράμμιση της πρωτεΐνης AtACBP2 από την αραβίδοψη, της προβλεπόμενης πρωτεΐνης ACBP2 του αγγουριού και της προβλεπόμενης πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το EST CUTC του κολοκυθιού. Τα εννέα ασπαρτικά οξέα που κωδικοποιούνται από τον δείκτη SSR CUTC επισημαίνεται με μπλε χρώμα. Η παχιά μαύρη γραμμή υπογραμμίζει τον υψηλά συντηρημένο τομέα ACB (Pfam: PF00887). Ένας άλλος δείκτης SSR βρίσκεται στην κωδική περιοχή του EST CUTC Αυτό το EST κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη, που έχει μεγάλη ομοιότητα με μια προβλεπόμενη πρωτεΐνη, την gi , GeneBank ref XM_ , του αγγουριού καθώς και με την MYB12 πρωτεΐνη της αραβίδοψης (GenBank: ABB03913). Όλες αυτές οι πρωτεΐνες έχουν μια Myb DNA περιοχή πρόσδεσης (Pfam: PF00249) στο Ν-άκρο τους. Ο Myb τομέας που είναι παρόν στους Myb παράγοντες μεταγραφής εμπεριέχει έως τέσσερις επαναλήψεις αμινοξέων. Όπως φαίνεται από την ευθυγράμμιση της Εικόνας 18, η αμινοξική αλληλουχία του EST CUTC έχει δύο γειτονικές R επαναλήψεις παρόμοιες με αυτές τις πρωτεΐνης AtMYB12 (R2R3 μοτίβο) που αποτελεί τον τομέα Myb. Το εύρημα αυτό υποδεικνύει ότι η αλληλουχία του κολοκυθιού είναι πιθανώς ένας R2R3 τύπου Myb παράγοντας μεταγραφής. Η πρωτεΐνη AtMYB12 (AT2G47460) προβλέπεται ότι συσχετίζεται με την πρωτεΐνη ath-mir858 της αραβίδοψης στις θέσεις της mrna αλληλουχίας. Αυτή η περιοχή είναι σχεδόν ίδια μεταξύ του γονιδίου AtMYB12 και του EST, CUTC (Εικόνα 18). Ωστόσο, μια mirbase έρευνα με κριτήριο την ομοιότητα για πιθανούς mirnas στόχους στο EST CUTC005800, έδειξε ότι τα EST του κολοκυθιού θα μπορούσαν να είναι στόχος του μικρού RNA, mir828s των ειδών: Vitis vinifera (αμπέλι), Salvia sclarea (σάλβια), Glycine max (σόγια), Populus 52

53 trichocarpa (λεύκη), Malus domestica (μηλιά), Cucumis melo (πεπόνι), γεγονός που υποδηλώνει ότι ενδεχομένως o Myb μεταγραφικός παράγοντας που κωδικοποιείται από το EST CUTC μπορεί να είναι ένας στόχος μεταμεταγραφικής ρύθμισης, όπως πολλοί άλλοι Myb παράγοντες φυτών. Το γονίδιο AtMYB12 ελέγχει την έκφραση δύο θεμελιωδών για την παραγωγή φλαβονοειδών φυτικών γονιδίων, της συνθάσης χαλκόνης (CHS) και της συνθάσης φλαβόνης (FLS) (Mehrtens κ.ά. 2005). Τα φλαβονοειδή χρησιμεύουν όχι μόνο στον χρωματισμό των ανθέων αλλά και στη σηματοδότηση καθώς και ως προστάτες από την υπεριώδη ακτινοβολία και τα έντομα (Harborne και Williams 2000). Όταν το γονίδιο AtMYB12 υπερεκφράστηκε στον καπνό, εκτός από το γεγονός ότι τα φυτά παρήγαγαν περισσότερα φλαβονοειδή, προκλήθηκε η έκφραση πολλών άλλων γονιδίων που συνδέονται με την προστασία από το στρες. Επιπλέον, τα φυτά του καπνού ήταν σε θέση να αντιμετωπίσουν έντομα όπως τα Spodoptera litura και Helicoverpa armigera, λόγω της υψηλής παραγωγής ρουτίνης, που είναι μία φλαβονοειδής γλυκοσιδάση (Misra κ.ά. 2010). Εικόνα 18: Μέρος της ευθυγράμμισης της πρωτεΐνης AtMYB12 από την αραβίδοψη και της προβλεπόμενης αλληλουχίας πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από την αλληλουχία του EST CUTC του κολοκυθιού. Οι δύο γειτονικές επαναλήψεις R (R2, R3) του Myb τομέα της πρωτεΐνης AtMYB12 βρίσκονται μέσα στα τετράγωνα ενώ τα συντηρημένα αμινοξέα στο εσωτερικό αυτών των επαναλήψεων έχουν χρωματιστεί με κίτρινο χρώμα. Τα χρωματισμένα με μωβ χρώμα αμινοξέα είναι οι πιθανοί στόχοι μικρών RNA. Η ευθυγράμμιση δείχνει την υψηλή συντήρηση των αμινοξέων στο εσωτερικό του τομέα Myb ενώ η υπόλοιπη αλληλουχία της πρωτεΐνης δεν είναι συντηρημένη κάτι που έχει παρατηρηθεί και στο παρελθόν (Dubos et αϊ. 2010). 53

54 Στην αλληλουχία του EST CUTC σχεδιάστηκε ένας δείκτης SSR που περιλαμβάνει μια προβλεπόμενη κωδική περιοχή. Το EST αυτό κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη που έχει ομοιότητα με μια μη χαρακτηρισμένη πρωτεΐνη του αγγουριού. Η προβλεπόμενη πρωτεΐνη του κολοκυθιού περιέχει, σύμφωνα με την Pfam βάση δεδομένων, έναν κυκλικό τομέα συνθετικών νουκλεάσων που συνδέει άτομα ψευδαργύρου. Ο Ζn-RING_2 (Pfam: PF13639) κυκλικός τομέας του EST του κολοκυθιού περιέχει μια σειρά από κυστεΐνη (C) και αμινοξέα ιστιδίνης (Η) που ακολουθούν το C-X2-CX [9-39]-CX [1-3]-ΗΧ [2-3]-Ο-Χ2-CX [4-48]-C-Χ2-C μοτίβο (Borden και Freemont 1996). Τέλος, η προβλεπόμενη αμινοξική αλληλουχία του EST CUTC009607, παρόλο που μοιάζει πολύ με μία μη χαρακτηρισμένη πρωτεΐνη του αγγουριού, του αμπελιού (NCBI: XP_ ) και τις σόγιας (GenBank: ACU ) δεν φαίνεται να διαθέτει κάποιον γνωστό τομέα πρωτεϊνών, σύμφωνα με την Pfam βάση δεδομένων. Οι μοριακοί δείκτες SSR που βασίζονται σε γονίδια που εμπλέκονται στην αντίδραση των φυτών σε συνθήκες στρες, μπορεί να είναι εξαιρετικά χρήσιμοι για τον εντοπισμό αλληλομόρφων που επηρεάζουν τις μεταλλάξεις που ελέγχουν την έκφραση αυτών των γονιδίων. Οι δείκτες SSR με βάση τα ESTs CUTC046645, CUTC CUTC του κολοκυθιού που βρίσκονται μέσα σε κωδικές περιοχές και είναι συντηρημένα μεταξύ των ειδών, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό της ενδοειδικής γενετικής ποικιλότητας σε όλα τα είδη των κολοκυνθοειδών (Gupta κ.ά. 2003). Ο δείκτης SSR που βασίζεται στο EST CUTC του κολοκυθιού είναι εξειδικευμένος επομένως απουσιάζει από άλλα είδη της οικογένειας Cucurbitaceae. Αυτό αποτελεί ένα παράδειγμα ότι ένας τέτοιος δείκτης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάκριση των ειδών που ανήκουν στην ίδια οικογένεια με βάση έναν πολυμορφισμό μέσα σε ένα λειτουργικό γονίδιο. Αν ο πολυμορφισμός αυτός αλλάζει τη λειτουργία του γονιδίου είναι κάτι που χρειάζεται περαιτέρω πειραματισμό και θα μπορούσε να βοηθήσει στην επιλογή μέσω μοριακών δεικτών (MAS) σε προγράμματα βελτίωσης. Τέλος ο δείκτης SSR, με βάση το EST CUTC είναι κοινός μεταξύ του κολοκυθιού, του καρπουζιού και του αγγουριού (Εικόνα 19). Η ικανότητα της μεταφοράς των δεικτών SSR μεταξύ των ειδών, που είναι χαρακτηριστικό των δεικτών SSR που βασίζονται σε EST και όχι των SSR που σχεδιάζονται πάνω σε γενωμικό DNA έχει αποδειχθεί πολύ χρήσιμη στα φυτά (Pashley κ.ά. 2006; Varshney κ.ά. 2005). 54

55 Εικόνα 19: Ευθυγράμμιση της νουκλεοτιδικής περιοχής των δεικτών SSR μεταξύ μελών της οικογένειας Cucurbitaceae. Ο δείκτης SSR με το μοτίβο -GCT- συμβολίζεται με μπλε χρώμα και είναι κοινός στο 3 UTR για το EST CUTC του κολοκυθιού, το EST CU του αγγουριού και το EST WMU39548 του καρπουζιού. Τα προβλεπόμενα κωδικόνια τερματισμού συμβολίζονται με κόκκινο χρώμα και για τα τρία ESTs. 55

56 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 4.1 Μοριακοί δείκτες ISSR και SCoT Η ταυτοποίηση και η αξιοποίηση του διαφορετικού γενετικού υλικού είναι το σημαντικότερο θέμα στην βελτίωση των φυτών. Η άριστη γνώση της γενετικής παραλλακτικότητας των καλλιεργούμενων φυτών είναι απαραίτητη για την επιλογή γονέων σε προγράμματα κλασικής βελτίωσης. Οι ακριβείς περιγραφές των γενοτύπων καθώς και των προτύπων εκτίμησης της γενετικής ποικιλότητας θα μπορούσαν να βοηθήσουν στον προσδιορισμό των μελλοντικών στρατηγικών βελτίωσης και να διευκολύνουν την εισαγωγή καλύτερου γενετικού υλικού στις εμπορικές ποικιλίες του κολοκυθιού. Από τα αποτελέσματα που προκύπτουν από την παρούσα μελέτη, είναι εμφανές ότι υπάρχει μια σημαντική γενετική διαφοροποίηση μεταξύ των ελληνικών παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού η οποία ανιχνεύεται σε μοριακό επίπεδο. Αυτό δίνει την δυνατότητα να επιλεχθούν οι ευνοϊκοί γενότυποι κολοκυθιού με τα καλύτερα χαρακτηριστικά και να χρησιμοποιηθούν είτε για περαιτέρω βελτίωση είτε για εισαγωγή επιθυμητών χαρακτηριστικών σε άλλες ποικιλίες που υπολείπονται στα συγκεκριμένα χαρακτηριστικά. Σε συγκριτικές μελέτες του είδους C. pepo έχουν χρησιμοποιηθεί με επιτυχία οι μοριακοί δείκτες ISSR και SSR (Ferriol κ.ά. 2003; Katzir κ.ά. 2000), αλλά μέχρι σήμερα, δεν έχουν διεξαχθεί δημοσιευμένες μελέτες με τους μοριακούς δείκτες SCoT για τον χαρακτηρισμό του γενετικού υλικού του κολοκυθιού. Στην παρούσα μελέτη η γενετική ποικιλότητα με βάση την τιμή του Nei (GD) και τον δείκτη ποικιλότητας Shannon (Ι) η οποία είναι ανεξάρτητη από το μέγεθος του δείγματος, αποκάλυψε υψηλό επίπεδο γενετικής ποικιλότητας των παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού (GD = 0,251, I = για τους SCoT δείκτες και GD = 0.254, I = για τους ISSR δείκτες). Οι εκτιμήσεις μας είχαν σημαντική συσχέτιση με άλλες μελέτες γενετικής ποικιλότητας του γένους Cucurbita. Για παράδειγμα, οι Montes-Hernκαιez και Eguiarte (2002) βρήκαν GD = 0,40 σε 16 πληθυσμούς τεσσάρων ειδών του γένους Cucurbita και οι Inan κ.ά. (2012) βρήκαν GD = 0,3, I = 0,46 σε 24 πληθυσμούς τριών ειδών του γένους Cucurbita. Επιπλέον, οι Yildiz κ.ά. (2011) μέτρησαν την γενετική ποικιλότητα με δείκτες ISSR, SRAP και RAPD και αποκάλυψαν μεγάλη ποικιλομορφία μεταξύ των τουρκικών γενοτύπων πεπονιού (GD = 0,28 και = 0,43). Επίσης ο υπολογιζόμενος δείκτης γενετικής ποικιλότητας 56

57 ήταν σε συμφωνία με άλλα καλλιεργούμενα είδη της οικογένειας Cucurbitaceae όπως το πεπόνι (Chen κ.ά. 2010b; López-Sesé κ.ά. 2002; Staub κ.ά. 2004). Σε μια παρόμοια μελέτη σε ποικιλίες μήλου, εξηγήθηκε το 40,43% της παραλλακτικότητας από τις πρώτες δύο συντεταγμένες (Song κ.ά. 2006) ενώ στην παρούσα μελέτη εξηγήθηκε το 47,02% και το 47,14% για τους δείκτες ISSR και τους δείκτες SCoΤ αντίστοιχα. Οι Mady κ.ά. (2013) χρησιμοποίησαν τους μοριακούς δείκτες RAPD για την εκτίμηση της γενετικής ποικιλότητας 20 παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού. Στη μελέτη τους, χρησιμοποιήθηκαν συνολικά δέκα RAPD δείκτες και παρήγαγαν 65 αναπαραγώγιμες ζώνες από τις οποίες οι 46 ήταν πολυμορφικές (Ποσοστό πολυμορφισμού=70,77%). Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκαν συνολικά έξι εκκινητές ISSR και παρήγαγαν 78 ζώνες εκ των οποίων οι 49 ήταν πολυμορφικές και επτά εκκινητές SCoΤ που παρήγαγαν 42 ζώνες εκ των οποίων οι 26 ήταν πολυμορφικές (Πόσοστά πολυμορφισμού, SCoΤ = 62,82%, ISSR = 60,5%). 4.2 Μοριακοί δείκτες EST-SSR Στην παρούσα μελέτη παρήχθησαν 36 πρότυπα καμπυλών τήξης της ανάλυσης HRM για τις 36 ελληνικές παραδοσιακές ποικιλίες κολοκυθιού που καλύπτουν ένα ευρύ φάσμα γενοτύπων, χρησιμοποιώντας έξι εκκινητές EST-SSR που επιλέχθηκαν από τη μελέτη των Blanca κ.ά. (2011). Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται στην έρευνα αυτή για τους δείκτες EST-SSR που χρησιμοποιήθηκαν, υποδεικνύουν το σαφή διαχωρισμό των 36 ελληνικών παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού. Αυτό υποδηλώνει ότι αυτοί οι έξι δείκτες EST-SSR μπορούν να εφαρμόζονται με επιτυχία για τον διαχωρισμό διαφόρων ποικιλιών καθώς και τοπικών ποικιλιών κολοκυθιού. Ως εκ τούτου, οι πληροφορίες που παρέχονται στην μελέτη αυτή μπορούν να χρησιμοποιηθούν και σε άλλα προγράμματα βελτίωσης, σε μελέτες βιοποικιλότητας καθώς και στην γενετική χαρτογράφηση όχι μόνο του κολοκυθιού αλλά και άλλων ειδών. Η μέθοδος της ανάλυσης HRM, έχει πολλά πλεονεκτήματα σε σύγκριση με τα υπάρχοντα συστήματα που βασίζονται σε υψηλής ανάλυσης πηκτές ή σε τριχοειδή ηλεκτροφόρηση (Reed κ.ά. 2007). Κάθε μονονουκλεοτιδικός πολυμορφισμός ή πολυμορφισμός στο μήκος φέρει πολυμορφισμό και στο σημείο τήξης και έτσι μπορεί να πραγματοποιηθεί η βαθμονόμηση χωρίς χαρακτηρισμό του πολυμορφισμού. Συνεπώς, δεν υπάρχει καμία απαίτηση να προσδιοριστεί η θέση, ή η ταυτότητα του 57

58 πολυμορφισμού. Επίσης δεν υπάρχει ανάγκη για την επισήμανση των εκκινητών και η ανάλυση HRM πραγματοποιείται αμέσως μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης PCR στην ίδια συσκευή. Η ανάλυση HRM συλλέγει περισσότερα σημεία δεδομένων κατά τη διάρκεια της γεγονός που αυξάνει τη συνολική απόδοση της μεθόδου. Είναι επίσης σημαντικό να αναφερθεί ότι επειδή τα σχήματα των καμπυλών τήξης δεν εξαρτώνται μόνο από το μέγεθος των ενισχυμένων θραυσμάτων, αλλά και από τη σύνθεση των βάσεων, η μέθοδος αυτή είναι πιο ευαίσθητη και ακριβής όσο αφορά την διάκριση στενά συνδεδεμένων γενοτύπων όπως οι ποικιλίες του ίδιου είδους (Madesis κ.ά. 2013). 58

59 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Οι τοπικές ποικιλίες αποτελούν σημαντικούς γενετικούς πόρους, λόγω της σημαντικής γενοτυπικής παραλλακτικότητας που διαθέτουν. Η γενετική ποικιλότητα στα ελληνικά ενδημικά είδη του γένους Cucurbita βρέθηκε να είναι πολύ υψηλή, γεγονός που υποδηλώνει μια εκτεταμένη γενετική ποικιλομορφία που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε βελτιωτικά προγράμματα. Ο χαρακτηρισμός μιας ευρύτερης γενετικής βάσης του είδους C. pepo, θεωρείται προτεραιότητα στην έρευνα για την βελτίωση του κολοκυθιού με στόχο την εκμετάλλευση των τοπικών ποικιλιών που είναι καλύτερα προσαρμοσμένες στο μικροπεριβάλλον και να υπερτερούν σε ορισμένα ποιοτικά χαρακτηριστικά καθώς και σε ανθεκτικότητες σε βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες. Η καλλιέργεια των προσαρμοσμένων ελληνικών παραδοσιακών ποικιλιών προωθεί την ανάπτυξη της τοπικής αγοράς. Η περιγραφή των προτύπων της γενετικής συγγένειας και η ομαδοποίηση των παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού προάγει την διατήρηση του τοπικού γενετικού υλικού. Οι μοριακοί δείκτες ISSR και SCoT είναι μια πολύ καλή επιλογή για την αξιολόγηση της γενετικής ποικιλότητας μεταξύ των παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιού που ανήκουν σε διαφορετικές γεωγραφικές περιοχές της Ελλάδας. Η παρούσα ανάλυση είναι η πρώτη μελέτη της γενετικής ποικιλότητας της συλλογής των ελληνικών παραδοσιακών ποικιλιών που ανήκουν στις επιμήκεις μορφές του είδους C. pepo ssp. pepo του κολοκυθιού, χρησιμοποιώντας τους ουδέτερους μοριακούς δείκτες ISSR και SCoΤ. Ο συνδυασμός σωστά επιλεγμένων μοριακών δεικτών EST-SSR και ανάλυσης HRM βοηθάει στη μείωση του κόστους γενοτύπησης και παρέχει μια γρήγορη, αποτελεσματική και ακριβή μέθοδο για τον διαχωρισμό και την ταυτοποίηση ποικιλιών κολοκυθιού. 59

60 6. ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ Από την μεταπτυχιακή μου διατριβή προέκυψαν οι εξής δημοσιεύσεις: Xanthopoulou Aliki, Ganopoulos Ioannis, Madesis Panagiotis, Tsaballa Aphrodite, Nianiou-Obeidat Irene, Kalivas Apostolos and Tsaftaris Athanasios (2013). Summer squash identification by High-Resolution-Melting (HRM) analysis using gene-based EST-SSR molecular markers. Plant Molecular Biology Reporter. I.F.=5.319 Xanthopoulou Aliki, Ganopoulos Ioannis, Kalivas Apostolos, Nianiou-Obeidat Irene, Moysiadis Theodoros, Tsaftaris Athanasios and Madesis Panagiotis. Comparative analysis of genetic variation in Greek summer squash landraces using start codon targeted (SCoT) polymorphism and ISSR markers. (Submitted to Scientia Horticulturae). Ξανθοπούλου Αλίκη, Γανόπουλος Ιωάννης, Καλύβας Απόστολος, Τσάμπαλλα Αφροδίτη, Νιάνιου-Ομπεϊντάτ Ειρήνη, Τσαυτάρης Αθανάσιος, Μαδέσης Παναγιώτης, Μελέτη γενετικής ποικιλότητας παραδοσιακών ποικιλιών κολοκυθιάς (Cucurbita pepo) με ουδέτερους και βασισμένους σε γονίδια μοριακούς δείκτες, 13 ο Πανελλήνιο Συνέδριο της Ελληνικής Βοτανικής Εταιρείας με τίτλο «Το πράσινο της ελπίδας: Η βοτανική σήμερα, θεωρία και πράξη». Θεσσαλονίκη, 3-6 Οκτωβρίου, 2013, Αναρτημένη εργασία Xanthopoulou Aliki, Ganopoulos Ioannis, Tsaballa Aphrodite, Nianiou-Obeidat Irene, Kalivas Apostolos, Tsaftaris Athanasios and Madesis Panagiotis, Genetic diversity study of summer squash landraces (Cucurbita pepo) with neutral and genebased molecular markers, International Plant Breeding Congress, 10-14/11/2013, Antalya, Turkey, Oral presentation 60

61 7. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ Andres, T. C Biosystematics, theories on the origin, and breeding potential of Cucurbita ficifolia. Pages Cornell University Press, New York. Appleby, N., Edwards, D. and Batley, J New technologies for ultra-high throughput genotyping in plants. Pages Plant Genomics. Springer. Argyrou, E., Sophianopoulou, V., Schultes, N. and Diallinas, G Functional Characterization of a Maize Purine Transporter by Expression in Aspergillus nidulans. The Plant Cell Online 13(4): Baranek, M., Stift, G., Vollmann, J. and Lelley, T Genetic diversity within and between the species Cucurbita pepo, C. moschata and C. maxima as revealed by RAPD markers. REPORT-CUCURBIT GENETICS COOPERATIVE 23: Bhat, P. R., Krishnakumar, V., Hendre, P. S., Rajendrakumar, P., Varshney, R. K. and Aggarwal, R. K Identification and characterization of expressed sequence tags derived simple sequence repeats markers from robusta coffee variety CxR (an interspecific hybrid of Coffea canephora Coffea congensis). Molecular Ecology Notes 5(1): Blanca, J., Cañizares, J., Roig, C., Ziarsolo, P., Nuez, F. and Picó, B. n Transcriptome characterization and high throughput SSRs and SNPs discovery in Cucurbita pepo (Cucurbitaceae). BMC genomics 12(1):104. Botstein, D., White, R. L., Skolnick, M. and Davis, R. W Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. American journal of human genetics 32(3):314. Brown, A Isozymes, plant population genetic structure and genetic conservation. Theoretical and Applied Genetics 52(4): Brown, R. N The use and development of molecular breeding tools in Cucurbita: a literature review. REPORT-CUCURBIT GENETICS COOPERATIVE 24: Brown, R. N. and Myers, J. R A genetic map of squash (Cucurbita sp.) with randomly amplified polymorphic DNA markers and morphological markers. Journal of the American Society for Horticultural Science 127(4):

62 Brychkova, G., Fluhr, R. and Sagi, M Formation of xanthine and the use of purine metabolites as a nitrogen source in Arabidopsis plants. Plant Signaling and Behavior 3(11): Chen, Q.-F., Xiao, S., Qi, W., Mishra, G., Ma, J., Wang, M. and Chye, M.-L. 2010a. The Arabidopsis acbp1acbp2 double mutant lacking acyl-coa-binding proteins ACBP1 and ACBP2 is embryo lethal. New Phytologist 186(4): Chen, Y., Li, G. and Wang, X. L. 2010b. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucumis melo L. using SRAP markers. Yi chuan = Hereditas / Zhongguo yi chuan xue hui bian ji 32(7): Cho, Y. G., Ishii, T., Temnykh, S., Chen, X., Lipovich, L., McCouch, S. R., Park, W. D., Ayres, N. and Cartinhour, S Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and GenBank sequences in rice (Oryza sativa L.). Theoretical and Applied Genetics 100(5): Cohen, Y., Meron, I., Mor, N. and Zuriel, S A new pathotype ofpseudoperonospora cubensis causing downy mildew in cucurbits in Israel. Phytoparasitica 31(5): Collard, B. and Mackill, D Conserved DNA-derived polymorphism (CDDP): a simple and novel method for generating DNA markers in plants. Plant Molecular Biology Reporter 27(4): Collins, A. R Oxidative DNA damage, antioxidants, and cancer. Bioessays 21(3): Decker-Walters, D. S Evidence for multiple domestication of Cucurbita pepo. Biology and utilization of the Cucurbitaceae Cornell University Press, Ithaca, NY: Decker-Walters, D. S., Staub, J. E., Chung, S.-M., Nakata, E. and Quemada, H. D Diversity in free-living populations of Cucurbita pepo (Cucurbitaceae) as assessed by random amplified polymorphic DNA. Systematic botany 27(1): Decker, D. S Origin (s), evolution, and systematics ofcucurbita pepo (Cucurbitaceae). Economic Botany 42(1):4-15. Diallinas, G. and Gournas, C Structure-function relationships in the nucleobase-ascorbate transporter (NAT) family. Channels 2(5):

63 Erali, M. and Wittwer, C. T High resolution melting analysis for gene scanning. Methods (San Diego, Calif) 50(4):250. Ferriol, M., Pico, B., de Córdova, P. F. and Nuez, F. 2004a. Molecular Diversity of a Germplasm Collection of Squash () Determined by SRAP and AFLP Markers. Crop Science 44(2): Ferriol, M., Pico, B. and Nuez, F Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP markers. Theoretical and Applied Genetics 107(2): Ferriol, M., Picó, B. and Nuez, F. 2004b. Morphological and molecular diversity of a collection of Cucurbita maxima landraces. Journal of the American Society for Horticultural Science 129(1): Ferriol, M., Picó, B., and Nuez, F Genetic diversity of Cucurbita spp. in the Canary Islands: a bridge between America and Europe, in: Plant Genetic Resources of Geographical and Other Islands Ganopoulos, I., Argiriou, A. and Tsaftaris, A Microsatellite high resolution melting (SSR-HRM) analysis for authenticity testing of protected designation of origin (PDO) sweet cherry products. Food Control 22(3-4.): Gao, L., Tang, J., Li, H. and Jia, J Analysis of microsatellites in major crops assessed by computational and experimental approaches. Molecular Breeding 12(3): Gao, W., Xiao, S., Li, H.-Y., Tsao, S.-W. and Chye, M.-L Arabidopsis thaliana acyl-coa-binding protein ACBP2 interacts with heavy-metal-binding farnesylated protein AtFP6. New Phytologist 181(1): Golding, B., Jeong, H.-J., Jo, Y. D., Park, S.-W. and Kang, B.-C Identification of Capsicum species using SNP markers based on high resolution melting analysis. Genome 53(12): Gorji, A. M., Poczai, P., Polgar, Z. and Taller, J Efficiency of arbitrarily amplified dominant markers (SCoT, ISSR and RAPD) for diagnostic fingerprinting in tetraploid potato. American journal of potato research 88(3): Gupta, P. and Rustgi, S Molecular markers from the transcribed/expressed region of the genome in higher plants. Functional & integrative genomics 4(3):

64 Gupta, P. K., Rustgi, S., Sharma, S., Singh, R., Kumar, N. and Balyan, H. S Transferable EST-SSR markers for the study of polymorphism and genetic diversity in bread wheat. Molecular Genetics and Genomics 270(4): Gwanama, C., Labuschagne, M. and Botha, A Analysis of genetic variation in Cucurbita moschata by random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers. Euphytica 113(1): Harborne, J. B. and Williams, C. A Advances in flavonoid research since Phytochemistry 55(6): Holton, T. A., Christopher, J. T., McClure, L., Harker, N. and Henry, R. J Identification and mapping of polymorphic SSR markers from expressed gene sequences of barley and wheat. Molecular Breeding 9(2): Inan, N., Yildiz, M., Sensoy, S., Kafkas, S. and Abak, K Efficacy of ISSR and SRAP techniques for molecular characterization of some cucurbita genotypes including naked (hull-less) seed pumpkin. Journal of Animal and Plant Sciences 22(1): Jeffrey, C A review of the Cucurbitaceae. Botanical Journal of the Linnean Society 81(3): Jeffrey, C A new system of Cucurbitaceae. Bot Zhurn 90: JoongHwan, B., Yang, H., HeeJin, J., Young, C., HakSoon, C. and ByoungCheorl, K Development of a SNP marker set for tomato cultivar identification. Korean Journal of Horticultural Science & Technology 28(4): Kalendar, R., Flavell, A., Ellis, T., Sjakste, T., Moisy, C. and Schulman, A Analysis of plant diversity with retrotransposon-based molecular markers. Heredity 106(4): Katzir, N., Portnoy, V., Yonash, N., Mozes-Daube, N., Tzuri, G. and Paris, H Use of AFLP, ISSR, and SSR marker systems to assess genetic diversity in Cucurbita pepo. Proc. Plant, Animal and Microbe Genomes Xth Conference, San Diego, California. Katzir, N., Tadmor, Y., Tzuri, G., Leshzeshen, E., Mozes-Daube, N., Danin- Poleg, Y. and Paris, H. S Further ISSR and preliminary SSR analysis of relationships among accessions of Cucurbita pepo. 64

65 Kirkpatrick, K. J. and Wilson, H. D Interspecific gene flow in Cucurbita: C. texana vs. C. pepo. American Journal of Botany: Kota, R., Varshney, R. K., Thiel, T., Dehmer, K. J. and Graner, A Generation and Comparison of EST Derived SSRs and SNPs in Barley (Hordeum Vulgare L.). Hereditas 135(2 3): Kwack, S Inheritance of determinate growth habit in Cucurbita moschata Poir. Journal of The Korean Society for Horticultural Science 36. Lee, Y., Jeon, H., Kim, B. and Hong, K Use of random amplified polymorphic DNAs for linkage group analysis in interspecific hybrid F2 generation of Cucurbita. Journal of The Korean Society for Horticultural Science 36. Lee, Y. K., Chung, W. I. and Ezura, H Efficient plant regeneration via organogenesis in winter squash (< i> Cucurbita maxima</i> Duch.). Plant science 164(3): Leljak-Levanić, D., Bauer, N., Mihaljević, S. and Jelaska, S Somatic embryogenesis in pumpkin (< i> Cucurbita pepo</i> L.): Control of somatic embryo development by nitrogen compounds. Journal of plant physiology 161(2): Li, H.-Y. and Chye, M.-L Membrane localization of Arabidopsis acyl-coa binding protein ACBP2. Plant Molecular Biology 51(4): Li, H.-Y. and Chye, M.-L Arabidopsis Acyl-CoA-Binding Protein ACBP2 Interacts With an Ethylene-Responsive Element-Binding Protein, AtEBP, via its Ankyrin Repeats. Plant Molecular Biology 54(2): Li, J., Wang, X., Dong, R., Yang, Y., Zhou, J., Yu, C., Cheng, Y., Yan, C. and Chen, J Evaluation of high-resolution melting for gene mapping in rice. Plant Molecular Biology Reporter 29(4): López-Sesé, A. I., Staub, J., Katzir, N. and Gómez-Guillamón, M. L Estimation of between and within accession variation in selected Spanish melon germplasm using RAPD and SSR markers to assess strategies for large collection evaluation. Euphytica 127(1): Lynch, M. and Milligan, B Analysis of population genetic structure with RAPD markers. Molecular Ecology 3(2): Madesis, P., Ganopoulos, I. and Tsaftaris, A Microsatellites: Evolution and Contribution. Pages 1-13 Microsatellites. Springer. 65

66 Mady, E. A., Helaly, A. A.-D., El-Hamd, A. N. A., Abdou, A., Shanan, S. A. and Craker, L. E Genetic diversity assessment of summer squash landraces using molecular markers. Molecular biology reports:1-6. Maurino, V. n. G., Grube, E., Zielinski, J., Schild, A., Fischer, K. and FlΓΌgge, U.-I Identification and Expression Analysis of Twelve Members of the Nucleobaseβ Ascorbate Transporter (NAT) Gene Family in Arabidopsis thaliana. Plant and Cell Physiology 47(10): Maynard, D. N Variation among Tropical Pumpkin (Cucurbita moschata) Cultivars in Susceptibility to Silverleaf. REPORT-CUCURBIT GENETICS COOPERATIVE 24: Mehrtens, F., Kranz, H., Bednarek, P. and Weisshaar, B The Arabidopsis Transcription Factor MYB12 Is a Flavonol-Specific Regulator of Phenylpropanoid Biosynthesis. Plant Physiology 138(2): Metwally, E., Moustafa, S., El-Sawy, B. and Shalaby, T Haploid plantlets derived by anther culture of Cucurbita pepo. Plant cell, tissue and organ culture 52(3): Misra, P., Pandey, A., Tiwari, M., Chandrashekar, K., Sidhu, O. P., Asif, M. H., Chakrabarty, D., Singh, P. K., Trivedi, P. K., Nath, P. and others Modulation of Transcriptome and Metabolome of Tobacco by Arabidopsis Transcription Factor, AtMYB12, Leads to Insect Resistance. Plant Physiology 152(4): Montes-Hernandez, S. and Eguiarte, L. E Genetic structure and indirect estimates of gene flow in three taxa of Cucurbita (Cucurbitaceae) in western Mexico. American Journal of Botany 89(7): Montgomery, J., Wittwer, C. T., Palais, R. and Zhou, L Simultaneous mutation scanning and genotyping by high-resolution DNA melting analysis. Nat Protoc 2(1): Nakagawa, A., Sakamoto, S., Takahashi, M., Morikawa, H. and Sakamoto, A The RNAi-Mediated Silencing of Xanthine Dehydrogenase Impairs Growth and Fertility and Accelerates Leaf Senescence in Transgenic Arabidopsis Plants. Plant and Cell Physiology 48(10): Nee, M The domestication of cucurbita (Cucurbitaceae). Economic Botany 44(3):

67 Nei, M Analysis of Gene Diversity in Subdivided Populations. Proceedings of the National Academy of Sciences 70(No 12): Newton, A. C., Akar, T., Baresel, J. P., Bebeli, P. J., Bettencourt, E., Bladenopoulos, K. V., Czembor, J. H., Fasoula, D. A., Katsiotis, A. and Koutis, K Cereal landraces for sustainable agriculture. A review. Agronomy for Sustainable Development 30(2): Nicot, N., Chiquet, V., Gandon, B., Amilhat, L., Legeai, F., Leroy, P., Bernard, M. and Sourdille, P Study of simple sequence repeat (SSR) markers from wheat expressed sequence tags (ESTs). Theoretical and Applied Genetics 109(4): Paris, H. S Historical records, origins, and development of the edible cultivar groups ofcucurbita pepo (Cucurbitaceae). Economic Botany 43(4): Paris, H. S. and Brown, R. N The genes of pumpkin and squash. HortScience 40(6): Paris, H. S. and Nerson, H Seed dimensions in the subspecies and cultivargroups of Cucurbita pepo. Genetic Resources and Crop Evolution 50(6): Pashley, C. H., Ellis, J. R., McCauley, D. E. and Burke, J. M EST Databases as a Source for Molecular Markers: Lessons from Helianthus. Journal of Heredity 97(4): Poczai, P Molecular genetic studies on complex evolutionary processes in Archaesolanum (Solanum, Solanaceae). University of Pannonia. Prevost, A. and Wilkinson, M. J A new system of comparing PCR primers applied to ISSR fingerprinting of potato cultivars. Theoretical and Applied Genetics 98(1): Rahman, S., Hossain, M., Islam, R. and Joarder, O Plant regeneration from internode segments of Cucurbita maxima Duch. Cucurbita moschata Duch. Current science 65(7): Robinson, R. W. and Decker-Walters, D Cucurbits. Cab international. Robinson, R. W., Munger, H. M. and Whitaker, T. W., et al Genes of Cucurbitaceae. HortScience v.11: Russell, J., Booth, A., Fuller, J., Harrower, B., Hedley, P., Machray, G. and Powell, W A comparison of sequence-based polymorphism and 67

68 haplotype content in transcribed and anonymous regions of the barley genome. Genome 47(2): Saha, M. C., Mian, M. A. R., Eujayl, I., Zwonitzer, J. C., Wang, L. and May, G. D Tall fescue EST-SSR markers with transferability across several grass species. Theoretical and Applied Genetics 109(4): Sanjur, O. I., Piperno, D. R., Andres, T. C. and Wessel-Beaver, L Phylogenetic relationships among domesticated and wild species of Cucurbita (Cucurbitaceae) inferred from a mitochondrial gene: Implications for crop plant evolution and areas of origin. Proceedings of the National Academy of Sciences 99(1): Sarowar, S., Oh, H., Hyung, N., Min, B., Harn, C., Yang, S., Ok, S. and Shin, J In vitro micropropagation of a Cucurbita interspecific hybrid cultivar a root stock plant. Plant cell, tissue and organ culture 75(2): Sawant, S. V., Singh, P. K., Gupta, S. K., Madnala, R. and Tuli, R Conserved nucleotide sequences in highly expressed genes in plants. Journal of Genetics 78(2): Schultes, N. P., Brutnell, T. P., Allen, A., Dellaporta, S. L., Nelson, T. and Chen, J Leaf permease1 gene of maize is required for chloroplast development. The Plant Cell Online 8(3): Scott, K. D., Eggler, P., Seaton, G., Rossetto, M., Ablett, E. M., Lee, L. S. and Henry, R. J Analysis of SSRs derived from grape ESTs. Theoretical and Applied Genetics 100(5): Smith, B. D The initial domestication of Cucurbita pepo in the Americas 10,000 years ago. Science 276(5314): Song, Y., Zhai, H., Yao, Y.-x., Li, M. and Du, Y.-p Analysis of Genetic Diversity of Processing Apple Varieties. Agricultural Sciences in China 5(10): SongJi, A., HeeBum, Y., HyeJeong, C., HeeJin, J., YongJae, K., GyungJa, C. and ByoungCheorl, K SNP marker development for purity test of oriental melon and melon. Korean Journal of Breeding Science 42(4): Staub, J. E., LΓ³pez-SesΓ, A. I. and Fanourakis, N Diversity among melon landraces (Cucumis melo L.) from Greece and their genetic relationships with other melon germplasm of diverse origins. Euphytica 136(2):

69 Thiel, T., Michalek, W., Varshney, R. and Graner, A Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSRmarkers in barley (Hordeum vulgare L.). Theoretical and Applied Genetics 106(3): Tobias, I. and Palkovics, L Characterization of Hungarian isolates of zucchini yellow mosaic virus (ZYMV, potyvirus) transmitted by seeds of Cucurbita pepo var Styriaca. Pest management science 59(4): Urbanek, A., Zechmann, B. and Müller, M Plant regeneration via somatic embryogenesis in Styrian pumpkin: cytological and biochemical investigations. Plant cell, tissue and organ culture 79(3): Varshney, R. K., Sigmund, R., BΓ rner, A., Korzun, V., Stein, N., Sorrells, M. E., Langridge, P. and Graner, A Interspecific transferability and comparative mapping of barley EST-SSR markers in wheat, rye and rice. Plant Science 168(1): Weeden, N. F., and R. W. Robinson. (1986)"Allozyme segregation ratios in the interspecific cross Cucurbita maxima X C. ecuadorensis suggest that hybrid breakdown is not caused by minor alterations in chromosome structure." Genetics 114, no. 2: Weeden, N. F. and Robinson, R. W Isozyme studies in Cucurbita. Cornell University Press, New York. Whitaker, T., Robinson, R. and Basset, M Breeding vegetable crops. Breeding vegetable crops. Whitaker, T. W. and Bemis, W Origin and evolution of the cultivated Cucurbita. Bulletin of the Torrey Botanical Club: Whitaker, T. W. and Davis, G. N Cucurbits. Interscience, New York. Wilson, H. D., Doebley, J. and Duvall, M Chloroplast DNA diversity among wild and cultivated members of Cucurbita (Cucurbitaceae). Theoretical and Applied Genetics 84(7-8): Wittwer, C. T High resolution DNA melting analysis: advancements and limitations. Human mutation 30(6): Wittwer, C. T., Reed, G. H., Gundry, C. N., Vandersteen, J. G. and Pryor, R. J High-resolution genotyping by amplicon melting analysis using LCGreen. Clinical chemistry 49(6):

70 Wu, S.-B., Wirthensohn, M. G., Hunt, P., Gibson, J. P. and Sedgley, M High resolution melting analysis of almond SNPs derived from ESTs. Theoretical and Applied Genetics 118(1):1-14. Xiao, S. and Chye, M.-L New roles for acyl-coa-binding proteins (ACBPs) in plant development, stress responses and lipid metabolism. Progress in Lipid Research 50(2): Xiao, S., Gao, W., Chen, Q.-F., Ramalingam, S. and Chye, M.-L Overexpression of membrane-associated acyl-coa-binding protein ACBP1 enhances lead tolerance in Arabidopsis. The Plant Journal 54(1): Yamaguchi, J. and Shiga, T Characteristics of regenerated plants via protoplast electrofusion between melon (Cucumis melo) and pumpkin (interspecific hybrid, Cucurbita maxima x C. moschata). Japanese Journal of Breeding 43. Yildiz, M., Ekbic, E., Keles, D., Sensoy, S. and Abak, K Use of ISSR, SRAP, and RAPD markers to assess genetic diversity in Turkish melons. Scientia Horticulturae 130(1): Zhou, L., Wang, L., Palais, R., Pryor, R. and Wittwer, C. T High-resolution DNA melting analysis for simultaneous mutation scanning and genotyping in solution. Clinical Chemistry 51(10): Zietkiewicz, E., Rafalski, A. and Labuda, D Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20(2): Zraidi, A., Lelley, T., Lebeda, A. and Paris, H Genetic map for pumpkin Cucurbita pepo using random amplified polymorphic DNA markers. Proc. Progress in cucurbit genetics and breeding research Proceedings of Cucurbitaceae 2004, the 8th EUCARPIA Meeting on Cucurbit Genetics and Breeding, Olomouc, Czech Republic, July,

71 8. ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ Εικόνα Π1: Τα HRM προφίλ των 36 διαφορετικών γενοτύπων που αναλύθηκαν με τον δείκτη CUTC Εικόνα Π2: Τα HRM προφίλ των 36 διαφορετικών γενοτύπων που αναλύθηκαν με τον δείκτη CUTC