ΦΑΡΜΑΚΟΧΘΜΙΚΘ ΠΡΟΕΓΓΙΘ ΣΘΝ ΑΝΣΙΜΕΣΩΠΙΘ ΧΡΟΝΙΩΝ ΠΑΘΘΕΩΝ. ΒΙΟΪΟΣΕΡΘ ΧΕΔΙΑΜΟ, ΤΝΘΕΘ, IN VITRO ΚΑΙ IN SILICO ΜΕΛΕΣΘ.

Transcript

1 ΑΡΙΣΟΣΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΘΜΙΟ ΘΕΑΛΟΝΙΚΘ ΣΜΘΜΑ ΦΑΡΜΑΚΕΤΣΙΚΘ ΣΟΜΕΑ ΦΑΡΜΑΚΕΤΣΙΚΘ ΧΘΜΕΙΑ ΠΟΛΤΞΕΝΘ ΑΛΕΞΙΟΤ ΠΣΤΧΙΟΤΧΟΤ ΦΑΡΜΑΚΕΤΣΙΚΘ ΦΑΡΜΑΚΟΧΘΜΙΚΘ ΠΡΟΕΓΓΙΘ ΣΘΝ ΑΝΣΙΜΕΣΩΠΙΘ ΧΡΟΝΙΩΝ ΠΑΘΘΕΩΝ. ΒΙΟΪΟΣΕΡΘ ΧΕΔΙΑΜΟ, ΤΝΘΕΘ, IN VITRO ΚΑΙ IN SILICO ΜΕΛΕΣΘ. ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΘ ΔΙΑΣΡΙΒΘ ΘΕΑΛΟΝΙΚΘ 2010

2

3 ΠΟΛΤΞΕΝΘ ΑΛΕΞΙΟΤ ΦΑΜΑΚΟΧΘΜΛΚΘ ΡΟΣΕΓΓΛΣΘ ΣΤΘΝ ΑΝΤΛΜΕΤΩΡΛΣΘ ΧΟΝΛΩΝ ΡΑΚΘΣΕΩΝ. ΒΛΟΪΣΟΣΤΕΘΣ ΣΧΕΔΛΑΣΜΟΣ, ΣΥΝΚΕΣΘ, IN VITRO ΚΑΛ IN SILICO ΜΕΛΕΤΘ. ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΘ ΔΙΑΣΡΙΒΘ Υποβλικθκε ςτο Τμιμα Φαρμακευτικισ, Τομζασ Φαρμακευτικισ Χθμείασ Θμερομθνία Ρροωορικισ Εξζταςθσ: 16 Απριλίου 2010 ΕΞΕΣΑΣΙΚΘ ΕΠΙΣΡΟΠΘ Κακθγθτισ Κακθγιτρια Αν. Κακθγιτρια Κακθγθτισ Κακθγιτρια Αν. Κακθγιτρια Λζκτορασ Δθμόπουλοσ Βαςίλθσ, Επιβλζπων Κακθγθτισ Χατηθπαφλου-Λίτινα Διμθτρα, Μζλοσ Τριμελοφσ Συμβουλευτικισ Επιτροπισ Γερονικάκθ Ακθνά, Μζλοσ Τριμελοφσ Συμβουλευτικισ Επιτροπισ Μαράκοσ Ραναγιϊτθσ, Εξεταςτισ Τςαντίλθ-Κακουλίδου Άννα, Εξετάςτρια ζκκα Ελζνθ, Εξετάςτρια Νικολάου Λωάννθσ, Εξεταςτισ 3

4

5 ΑΡΙΣΟΣΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΘΜΙΟ ΘΕΑΛΟΝΙΚΘ ΤΜΘΜΑ ΦΑΜΑΚΕΥΤΛΚΘΣ ΡΟΛΥΞΕΝΘ ΑΛΕΞΛΟΥ ΦΑΜΑΚΟΡΟΛΟΥ ΦΑΡΜΑΚΟΧΘΜΙΚΘ ΠΡΟΕΓΓΙΘ ΣΘΝ ΑΝΣΙΜΕΣΩΠΙΘ ΧΡΟΝΙΩΝ ΠΑΘΘΕΩΝ. ΒΙΟΪΟΣΕΡΘ ΧΕΔΙΑΜΟ, ΤΝΘΕΘ, IN VITRO ΚΑΙ IN SILICO ΜΕΛΕΣΘ. που εκπονικθκε ςτο Τομζα Φαρμακευτικισ Χθμείασ του Τμιματοσ Φαρμακευτικισ ΕΡΤΑΜΕΛΘΣ ΕΞΕΤΑΣΤΛΚΘ ΕΡΛΤΟΡΘ Κακθγθτισ Κακθγιτρια Αν. Κακθγιτρια Κακθγθτισ Κακθγιτρια Αν. Κακθγιτρια Λζκτορασ Δθμόπουλοσ Βαςίλθσ, Επιβλζπων Κακθγθτισ Χατηθπαφλου-Λίτινα Διμθτρα, Μζλοσ Τριμελοφσ Συμβουλευτικισ Επιτροπισ Γερονικάκθ Ακθνά, Μζλοσ Τριμελοφσ Συμβουλευτικισ Επιτροπισ Μαράκοσ Ραναγιϊτθσ, Εξεταςτισ Τςαντίλθ-Κακουλίδου Άννα, Εξετάςτρια ζκκα Ελζνθ, Εξετάςτρια Νικολάου Λωάννθσ, Εξεταςτισ 5

6

7 Θ επταμελισ εξεταςτικι επιτροπι που ορίςτθκε για τθν κρίςθ τθσ Διδακτορικισ Διατριβισ τθσ Ρολυξζνθσ Αλεξίου, Φαρμακοποιοφ, ςυνιλκε ςε ςυνεδρίαςθ ςτο Αριςτοτζλειο Ρανεπιςτιμιο Κεςςαλονίκθσ τθν 16 θ Απριλίου 2010, όπου παρακολοφκθςε τθν υποςτιριξθ τθσ διατριβισ με τίτλο ΦΑΜΑΚΟΧΘΜΛΚΘ ΡΟΣΕΓΓΛΣΘ ΣΤΘΝ ΑΝΤΛΜΕΤΩΡΛΣΘ ΧΟΝΛΩΝ ΡΑΚΘΣΕΩΝ. ΒΛΟΪΣΟΣΤΕΘΣ ΣΧΕΔΛΑΣΜΟΣ, ΣΥΝΚΕΣΘ, IN VITRO ΚΑΛ IN SILICO ΜΕΛΕΤΘ. Τα μζλθ τθσ επιτροπισ ζκριναν ομόωωνα ότι θ διατριβι είναι πρωτότυπθ και αποτελεί ουςιαςτικι ςυμβολι ςτθν πρόοδο τθσ επιςτιμθσ. ΕΠΣΑΜΕΛΘ ΕΞΕΣΑΣΙΚΘ ΕΠΙΣΡΟΠΘ Κακθγθτισ Κακθγιτρια Αν. Κακθγιτρια Κακθγθτισ Κακθγιτρια Αν. Κακθγιτρια Λζκτορασ Δθμόπουλοσ Βαςίλθσ, Επιβλζπων Κακθγθτισ Χατηθπαφλου-Λίτινα Διμθτρα, Μζλοσ Τριμελοφσ Συμβουλευτικισ Επιτροπισ Γερονικάκθ Ακθνά, Μζλοσ Τριμελοφσ Συμβουλευτικισ Επιτροπισ Μαράκοσ Ραναγιϊτθσ, Εξεταςτισ Τςαντίλθ-Κακουλίδου Άννα, Εξετάςτρια ζκκα Ελζνθ, Εξετάςτρια Νικολάου Λωάννθσ, Εξεταςτισ 7

8

9 Ρολυξζνθ Α. Αλεξίου Α.Ρ.Κ. ΦΑΜΑΚΟΧΘΜΛΚΘ ΡΟΣΕΓΓΛΣΘ ΣΤΘΝ ΑΝΤΛΜΕΤΩΡΛΣΘ ΧΟΝΛΩΝ ΡΑΚΘΣΕΩΝ. ΒΛΟΪΣΟΣΤΕΘΣ ΣΧΕΔΛΑΣΜΟΣ, ΣΥΝΚΕΣΘ, IN VITRO ΚΑΛ IN SILICO ΜΕΛΕΤΘ. {ISBN} «Θ ζγκριςθ τθσ παροφςθσ Διδακτορικισ Διατριβισ από το Τμιμα Φαρμακευτικισ του Αριςτοτελείου Ρανεπιςτθμίου Κεςςαλονίκθσ δεν υποδθλϊνει αποδοχι των γνωμϊν του ςυγγραωζωσ» (Ν 5343/1932, άρκρο 202, παρ. 2) 9

10

11 σξτρ γξμείρ μξτ και ςσημ αδεπυή μξτ Αγγέλα 11

12

13 ΠΕΡΙΕΦΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟ ΤΝΣΟΜΟΓΡΑΦΙΕ ΠΕΡΙΛΘΨΘ SUMMARY ΕΙΑΓΩΓΘ ΕΛΣΑΓΩΓΛΚΑ ΣΘΜΕΛΑ ΕΝΗΥΜΟ ΑΝΑΓΩΓΑΣΘ ΤΘΣ ΑΛΔΟΗΘΣ (ALR2): ΔΟΜΘ, ΕΝΕΓΟ ΚΕΝΤΟ ΚΑΛ ΑΡΟΨΕΛΣ ΓΛΑ TO ΜΘΧΑΝΛΣΜΟ ΤΘΣ ΕΝΗΥΜΑΤΛΚΘΣ ΚΑΤΑΛΥΣΘΣ ΕΜΡΛΟΚΘ ΤΘΣ ALR2 ΣΕ ΡΑΚΟΦΥΣΛΟΛΟΓΛΚΕΣ ΚΑΤΑΣΤΑΣΕΛΣ ΡΟΛΟ ΣΗ ALR2 Ε ΟΜΟΙΟΣΑΣΙΚΟΤ ΜΗΧΑΝΙΜΟΤ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΗ ΣΗ ΜΕΣΑΒΟΛΙΚΗ ΟΔΟΤ ΣΩΝ ΠΟΛΤΟΛΩΝ ΚΑΙ ΕΠΑΚΟΛΟΤΘΕ ΒΙΟΧΗΜΙΚΕ/ΜΕΣΑΒΟΛΙΚΕ ΔΙΕΡΓΑΙΕ ALR2 & ΧΡΟΝΙΕ ΕΠΙΠΛΟΚΕ ΣΟΤ ΑΚΧΑΡΩΔΗ ΔΙΑΒΗΣΗ διαβθτικι αμωιβλθςτροειδοπάκεια καρδιαγγειακζσ επιπλοκζσ διαβθτικι νευροπάκεια διαβθτικι νεωροπάκεια ALR2 & ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕ ΚΑΣΑΣΑΕΙ Ε ΜΗ ΔΙΑΒΗΣΙΚΟΤ ΑΘΕΝΕΙ ALR2 & καρδιαγγειακζσ νόςοι ALR2 & ωλεγμονι ALR2 & διαταραχζσ διάκεςθσ ALR2 & νεωρικζσ δυςλειτουργίεσ ALR2 & ωοκθκικζσ ανωμαλίεσ ALR2 & καρκίνοσ ΑΝΑΣΤΟΛΕΛΣ ΤΘΣ ALR ΓΕΝΛΚΑ ΣΤΟΛΧΕΛΑ ΥΡΟΛΟΓΛΣΤΛΚΘΣ ΧΘΜΕΛΑΣ & IN SILICO ΜΕΛΕΤΩΝ ΑΝΣΙΚΕΙΜΕΝΟ & ΚΟΠΟ ΓΕΝΙΚΑ ΣΟΙΧΕΙΑ ΤΝΘΕΣΙΚΘ ΧΘΜΕΙΑ ΣΩΝ ΚΤΡΙΩΝ ΚΑΣΘΓΟΡΙΩΝ ΕΝΩΕΩΝ ΣΘ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΘ ΔΙΑΣΡΙΒΘ ΓΕΝΛΚΕΣ ΜΕΚΟΔΟΛ ΣΥΝΚΕΣΘΣ ΣΟΥΛΦΟΝΑΜΛΔΛΩΝ ΓΕΝΛΚΕΣ ΜΕΚΟΔΟΛ ΣΥΝΚΕΣΘΣ 5-ΥΡΟΚΑΤΕΣΤΘΜΕΝΩΝ-1Η-ΤΕΤΑΗΟΛΛΩΝ ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΟ ΜΕΡΟ ΟΓΑΝΑ, ΑΝΤΛΔΑΣΤΘΛΑ & ΛΟΛΡΟΣ ΕΞΟΡΛΛΣΜΟΣ ΟΡΓΑΝΑ ΑΝΣΙΔΡΑΣΗΡΙΑ ΚΑΙ ΕΝΖΤΜΙΚΑ ΠΑΡΑΚΕΤΑΜΑΣΑ HARDWARE & ΤΠΟΛΟΓΙΣΙΚΑ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΣΑ ΣΥΝΚΕΣΘ ΕΝΩΣΕΩΝ ΕΝΩΕΙ ΠΟΤ ΠΑΡΑΚΕΤΑΣΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΑΣΡΙΒΗ ΚΑΙ Η ΤΝΘΕΗ ΣΟΤ ΕΧΕΙ ΔΗΜΟΙΕΤΣΕΙ ΑΠΟ ΑΛΛΟΤ ΕΡΕΤΝΗΣΕ ςφνκεςθ τθσ 4-νιτρο-2,6-διωκοροωαινόλθσ (Λ) ςφνκεςθ του υδροχλωρικοφ άλατοσ τθσ 4-αμινο-2,6-διωκοροωαινόλθσ (ΛΛ) ζλεγχοσ αςτάκειασ τθσ 4-αμινο-2,6-διωκοροωαινόλθσ

14 ςφνκεςθ του 2-(ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικοφ οξζοσ (Α) ςφνκεςθ του N-(κυανομεκυλο)βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-10a) και του παραπροϊόντοσ N-(κυανομεκυλο)-N- (ωαινυλοςουλωονυλο)βενηολοςουλωοναμιδίου(ax-10β)(πρωτότυπθ ζνωςθ) ςφνκεςθ του N-(1H-τετραηολο-5-υλο)βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-16) ΠΡΩΣΟΣΤΠΕ ΕΝΩΕΙ ΠΟΤ ΠΑΡΑΚΕΤΑΣΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΑΣΡΙΒΗ γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο) αροχλοςουλωοναμιδίων (ΑΧ-1, ΑΧ-2, ΑΧ-3 και AX-7) ςφνκεςθ του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-4) ςφνκεςθ του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-(1Θ-πυρρολο-1-υλο) βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-5) γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των διωκορο-υδροξυωαινυλο-βενηαμιδίων (AX-6 και AX-9) ςφνκεςθ του N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-(3-αικυλουρεϊδο)βενηολο ςουλωοναμιδίου (ΑΧ- 8) γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των διωκορο-αροχλοςουλωαμιδο-ωαινολικϊν εςτζρων του βενηοϊκοφ οξζοσ (AX-18a και AX-19a/ΑΧ-19α ) γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των βρωμο-ωκοροβενηυλο-διωκορο-υδροξυωαινυλο- αροχλοςουλωοναμιδίων (AX-18, AX-19) ςφνκεςθ του N-(4-βρωμο-2-ωκοροβενηυλο)-N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-20) ςφνκεςθ του N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-Ν-(ωαινυλοςουλωονυλο)-βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-21) ςφνκεςθ του N-((1Θ-τετραηολο-5-υλο)μεκυλο)βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-10) ςφνκεςθ του N-(μεκυλοςουλωονυλο)-2-(βενηολοςουλωοναμιδο)ακεταμιδίου (ΑΧ-13) ςφνκεςθ του (R)-N-(3-οξοϊςοξαηολιδιν-4-υλο)βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-15) ςφνκεςθ του (S)-N-(3-οξοϊςοξαηολιδιν-4-υλ)βενηοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-17) ΦΑΜΑΚΟΧΘΜΛΚΕΣ ΔΟΚΛΜΑΣΛΕΣ IN VITRO ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣOY ENZYMOY ΑΝΑΓΩΓΑΗ ΣΗ ΑΛΔΟΖΗ (ALR2) υλικά διαλφματα in vitro πειραματικό πρωτόκολλο προςδιοριςμοφ τθσ ικανότθτασ αναςτολισ του ενηφμου αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ (ALR2) ανάλυςθ δεδομζνων και ςτατιςτικι επεξεργαςία ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣOY ENZYMOY ΑΝΑΓΩΓΑΗ ΣΩΝ ΑΛΔΕΫΔΩΝ (ALR1) υλικά διαλφματα in vitro πειραματικό πρωτόκολλο προςδιοριςμοφ τθσ ικανότθτασ αναςτολισ του ενηφμου αναγωγάςθ των αλδεχδϊν (ALR1) ανάλυςθ δεδομζνων και ςτατιςτικι επεξεργαςία ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΡΩΗ ΣΗ ΕΛΕΤΘΕΡΗ ΡΙΖΑ DPPH υλικά - διαλφματα in vitro πειραματικό πρωτόκολλο προςδιοριςμοφ τθσ ικανότθτασ αλλθλεπίδραςθσ με τθν ελεφκερθ ρίηα DPPH ανάλυςθ δεδομζνων και ςτατιςτικι επεξεργαςία ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΗ ΤΠΕΡΟΞΕΙΔΩΗ DOPC ΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ υλικά διαλφματα in vitro πειραματικό πρωτόκολλο κατεργαςίασ λιποςωμάτων, επϊαςθσ και προςδιοριςμόσ τθσ λιπιδικισ υπεροξείδωςθσ ανάλυςθ δεδομζνων και ςτατιςτικι επεξεργαςία IN SILICO ΜΕΛΕΤΘ IN SILICO ΜΕΛΕΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑΜΟΡΦΩΗ QSAR ΣΩΝ ΣΕΛΙΚΩΝ ΕΝΩΕΩΝ ΠΟΤ ΑΝΑΠΣΤΧΘΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΗ ΔΙΑΣΡΙΒΗ υπολογιςμόσ ωυςικοχθμικϊν ιδιοτιτων διαμόρωωςθ ςχζςεων 2D-QSAR IN SILICO ΜΕΛΕΣΗ ΑΝΑΣΟΛΕΩΝ ΣΗ ALR2 (ARIs) ΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΜΕ ΚΟΠΟ ΣΗ ΔΙΑΜΟΡΦΩΗ ΓΕΝΙΚΩΝ 2D-QSAR ΚΑΙ ΔΗΜΙΟΤΡΓΙΑ ΜΟΝΣΕΛΩΝ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΣΗ ΑΝΑΣΑΛΣΙΚΗ ΔΡΑΗ ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ & ΤΗΘΣΘΘ ΣΥΝΚΕΣΘ ΕΝΩΣΕΩΝ

15 ΕΝΩΕΙ ΠΟΤ ΠΑΡΑΚΕΤΑΣΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΑΣΡΙΒΗ ΚΑΙ Η ΤΝΘΕΗ ΣΟΤ ΕΧΕΙ ΔΗΜΟΙΕΤΣΕΙ ΑΠΟ ΑΛΛΟΤ ΕΡΕΤΝΗΣΕ αρωματικι νίτρωςθ και αναγωγι τθσ νιτρο-ομάδασ ςτο δακτφλιο τθσ 2,6-διωκοροωαινόλθσ ςυνκζςεισ γνωςτϊν ςουλωοναμιδίων με ποικίλεσ λειτουργικζσ ομάδεσ ΠΡΩΣΟΣΤΠΕ ΕΝΩΕΙ ΠΟΤ ΠΑΡΑΚΕΤΑΣΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΑΣΡΙΒΗ γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο) αροχλοςουλωοναμιδίων (ΑΧ-1, ΑΧ-2, ΑΧ-3 και AX-7) ςφνκεςθ του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-4) ςφνκεςθ του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-(1Θ-πυρρολο-1-υλο) βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-5) γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των διωκορο-υδροξυωαινυλο-βενηαμιδίων (AX-6 και AX-9) ςφνκεςθ του N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-(3-αικυλουρεϊδο)βενηολο ςουλωοναμιδίου (ΑΧ- 8) γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των διωκορο-αροχλοςουλωαμιδο-ωαινολικϊν εςτζρων του βενηοϊκοφ οξζοσ (AX-18a και AX-19a) γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των βρωμο-ωκορο-βενηυλοδιωκορο-υδροξυωαινυλο- αροχλοςουλωοναμιδίων (AX-18, AX-19) ςφνκεςθ του N-(4-βρωμο-2-ωκοροβενηυλο)-N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-20) ςφνκεςθ του N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-Ν-(ωαινυλοςουλωονυλο)βενηολο ςουλωοναμιδίου (ΑΧ-21) ςφνκεςθ του N-((1Θ-τετραηολο-5-υλο)μεκυλο)βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-10) ςφνκεςθ του N-(μεκυλοςουλωονυλο)-2-(βενηολοςουλωοναμιδο)ακεταμιδίου (ΑΧ-13) ςφνκεςθ του (R)-N-(3-οξοϊςοξαηολιδιν-4-υλο)βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-15) και του (S)-N-(3-οξοϊςοξαηολιδιν- 4-υλ)βενηοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-17) ΕΚΤΛΜΘΣΘ ΦΑΜΑΚΟΧΘΜΛΚΩΝ ΔΟΚΛΜΑΣΛΩΝ IN VITRO ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣOY ENZYMOY ΑΝΑΓΩΓΑΗ ΣΗ ΑΛΔΟΖΗ (ALR2) ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣOY ENZYMOY ΑΝΑΓΩΓΑΗ ΣΩΝ ΑΛΔΕΫΔΩΝ (ALR1) ΚΑΙ ΠΡΟΔΙΟΡΙΜΟ ΣΗ ΕΚΛΕΚΣΙΚΟΣΗΣΑ ΜΕ ΣΟ ΟΜΟΛΟΓΟ ΕΝΖΤΜΟ ΑΝΑΓΩΓΑΗ ΣΗ ΑΛΔΟΖΗ (ALR2) ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΡΩΗ ΣΗ ΕΛΕΤΘΕΡΗ ΡΙΖΑ DPPH ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΗ ΤΠΕΡΟΞΕΙΔΩΗ DOPC ΛΙΠΟΩΜΑΣΩΝ ΑΡΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ & ΣΥΗΘΤΘΣΘ ΤΘΣ IN SILICO ΜΕΛΕΤΘΣ ΔΙΑΜΟΡΦΩΗ ΧΕΕΩΝ 2D-QSAR ΣΩΝ ΕΝΩΕΩΝ ΑΧs ΠΟΤ ΑΝΑΠΣΤΧΘΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΗ ΔΙΑΣΡΙΒΗ ΔΙΑΜΟΡΦΩΗ ΓΕΝΙΚΩΝ ΧΕΕΩΝ 2D-QSAR ΑΝΑΣΟΛΕΩΝ ΣΗ ALR2 (ARIs) ΠΟΤ ΑΝΑΦΕΡΟΝΣΑΙ ΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ωαινολικά παράγωγα παράγωγα 1-βενηοπυραν-4-όνθσ μθ υδαντοϊνικά και μθ καρβοξυλικά παράγωγα, παράγωγα αροχλο-ςουλωονυλο-πυριδαηιν-3(2θ)-όνθσ ΑΞΙΟΛΟΓΗΗ ΣΟΤ ΝΝ ΜΟΝΣΕΛΟΤ ΠΡΟΒΛΕΨΗ ΣΗ ΑΝΑΣΑΛΣΙΚΗ ΔΡΑΗ Ω ΠΡΟ ΣΗΝ ALR ΤΜΠΕΡΑΜΑΣΑ ΣΥΜΡΕΑΣΜΑΤΑ ΑΡΟ ΤΟΝ ΣΧΕΔΛΑΣΜΟ, ΤΘ ΣΥΝΚΕΣΘ ΚΑΛ ΤΘ ΦΑΜΑΚΟΧΘΜΛΚΘ ΜΕΛΕΤΘ ΣΟΥΛΦΟΝΑΜΛΔΛΩΝ, ΡΑΑΓΩΓΩΝ ΔΛΦΚΟΟΦΑΛΝΟΛΘΣ, ΤΕΤΑΗΟΛΛΟΥ, ΜΕΚΥΛΟΣΟΥΛΦΟΝΑΜΛΔΛΟΥ ΚΑΛ ΚΥΚΛΟΣΕΛΝΘΣ ΥΡΟΛΟΓΛΣΤΛΚΘ ΦΑΜΑΚΟΧΘΜΕΛΑ/ IN SILICO ΜΕΛΕΤΘ ΤΩΝ ΤΕΛΛΚΩΝ ΕΝΩΣΕΩΝ ΑΧ, ΑΝΑΣΤΟΛΕΩΝ ΤΘΣ ALR ΥΡΟΛΟΓΛΣΤΛΚΘ ΦΑΜΑΚΟΧΘΜΕΛΑ/ IN SILICO ΜΕΛΕΤΘ ΕΝΩΣΕΩΝ ΤΘΣ ΒΛΒΛΛΟΓΑΦΛΑΣ ΣΥΝΟΨΘ ΠΑΡΑΡΣΘΜΑ A: ΔΟΜΕ ΣΩΝ ΕΝΩΕΩΝ ΠΟΤ ΤΝΣΕΘΘΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΘ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΘ ΔΙΑΣΡΙΒΘ ΠΑΡΑΡΣΘΜΑ B: ΦΑΜΑΣΑ 1 Η NMR ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΩΝ ΠΡΩΣΟΣΤΠΩΝ ΕΝΩΕΩΝ ΠΟΤ ΠΑΡΑΚΕΤΑΣΘΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΘ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΘ ΔΙΑΣΡΙΒΘ Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)βενηολοςουλωοναμίδιο (ΑΧ-1) Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-μεκοξυβενηολοςουλωοναμίδιο (ΑΧ-2) Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμίδιο (ΑΧ-4)

16 N-(4-(N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)ςουλωαμοχλο)ωαινυλο)βενηαμίδιο (ΑΧ-6) N-(4-βρωμο-2-ωκοροβενηυλο)-N-(3,5-διωκορο-4υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμίδιο (ΑΧ-20) N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-Ν-(ωαινυλοςουλωονυλο)βενηολοςουλωοναμιδίο (ΑΧ-21) ΠΑΡΑΡΣΘΜΑ Γ: ΔΟΜΕ, ΑΝΑΣΑΛΣΙΚΘ ΔΡΑΘ ΚΑΙ ΤΠΟΛΟΓΙΜΕΝΕ ΦΤΙΚΟΧΘΜΙΚΕ ΙΔΙΟΣΘΣΕ ARIS ΣΘ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΟΤ ΧΡΘΙΜΟΠΟΙΘΘΘΚΑΝ ΣΙ IN SILICO ΜΕΛΕΣΕ Γ.1. ΦΑΛΝΟΛΛΚΑ ΡΑΑΓΩΓΑ Γ.1.1. ΔΟΜΕ ΚΑΙ IC 50 (μμ) Γ.1.2. ΤΠΟΛΟΓΙΜΕΝΕ ΦΤΙΚΟΧΗΜΙΚΕ ΙΔΙΟΣΗΣΕ Γ.2. ΡΑΑΓΩΓΑ 1-ΒΕΝΗΟΡΥΑΝ-4-ΟΝΘΣ Γ.2.1. ΔΟΜΕ ΚΑΙ IC 50 (μμ) Γ.2.2. ΤΠΟΛΟΓΙΜΕΝΕ ΦΤΙΚΟΧΗΜΙΚΕ ΙΔΙΟΣΗΣΕ Γ.3. ΜΘ ΥΔΑΝΤΟΪΝΛΚΑ ΚΑΛ ΜΘ ΚΑΒΟΞΥΛΛΚΑ ΡΑΑΓΩΓΑ, ΡΑΑΓΩΓΑ ΑΟΫΛΟ-ΣΟΥΛΦΟΝΥΛΟ-ΡΥΛΔΑΗΛΝ-3(2Η)-ΟΝΘΣ Γ.3.1. ΔΟΜΕ ΚΑΙ IC 50 (μμ) Γ.3.2. ΤΠΟΛΟΓΙΜΕΝΕ ΦΤΙΚΟΧΗΜΙΚΕ ΙΔΙΟΣΗΣΕ ΔΘΜΟΙΕΤΕΙ ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΕ ΠΡΟΦΟΡΙΚΕ ΚΑΙ ΑΝΑΡΣΘΜΕΝΕ ΑΝΑΚΟΙΝΩΕΙ Ε ΤΝΕΔΡΙΑ ΚΑΣΑ ΣΘ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΕΚΠΟΝΘΘ ΣΘ ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΘ ΔΙΑΣΡΙΒΘ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

17 ΠΡΟΛΟΓΟ Η οαπξύςα διδακσξπική διασπιβή εκοξμήθηκε ςσξμ Σξμέα Υαπμακετσικήρ Φημείαρ σξτ Σμήμασξρ Υαπμακετσικήρ σξτ Απιςσξσελείξτ Παμεοιςσημίξτ Θεςςαλξμίκηρ. Η ιδέα σηρ εμαςφόληςηρ μξτ με σημ εκοόμηςη διδακσξπικήρ διασπιβήρ νεκίμηςε κασά σημ οεπίξδξ σξτ μεσαοστφιακξύ μξτ. Σόσε είφα ση δτμασόσησα μα μάθψ οεπιςςόσεπα οπάγμασα για ση ςημαςία και σξ πόλξ σηρ Υαπμακετσικήρ Φημείαρ, εμώ οαπάλληλα μξτ δημιξτπγήθηκε η αμηςτφία μα αςφξληθώ οεπιςςόσεπξ με σξ ςφεδιαςμό και ση ςύμθεςη μέψμ υαπμακξμξπίψμ. Η επγαςία ατσή έφει ψρ σίσλξ «ΥΑΡΜΑΚΟΦΗΜΙΚΗ ΠΡΟΕΓΓΙΗ ΣΗΝ ΑΝΣΙΜΕΣΩΠΙΗ ΦΡΟΝΙΩΝ ΠΑΘΗΕΩΝ. ΒΙΟΪΟΣΕΡΗ ΦΕΔΙΑΜΟ, ΤΝΘΕΗ, IN VITRO ΚΑΙ IN SILICO ΜΕΛΕΣΗ». Αυξπά ςση υαπμακξφημική μελέση μέψμ αμαςσξλέψμ σηρ αμαγψγάςηρ σηρ αλδόζηρ (ALR2), εμόρ εμζύμξτ οξτ εμολέκεσαι ςσημ οπόκληςη φπόμιψμ οαθήςεψμ όοψρ ξι φπόμιερ διαβησικέρ εοιολξκέρ, καπδιαγγειακέρ μόςξι, διασαπαφέρ διάθεςηρ, μευπικέρ δτςλεισξτπγίερ και καπκίμξρ. Με βάςη σημ ψρ σώπα γμώςη ςφεδιάςσηκαμ και ςτμσέθηκαμ ςξτλυξμαμίδια, οαπάγψγα διυθξπξυαιμόληρ, σεσπαζξλίξτ, μεθτλξςξτλυaμτλαμίμηρ και κτκλξςεπίμηρ. Οι μέερ εμώςειρ μελεσήθηκαμ με in vitro βιξλξγικά οειπάμασα οξτ αυξπξύμ ςσημ ικαμόσησα αμαςσξλήρ σηρ ALR2 αλλά και σξτ ξμόλξγξτ εμζύμξτ αμαγψγάςη σψμ αλδεϋδώμ (ALR1) καθώρ και ςσημ αμσιξνειδψσική σξτρ δπάςη. Εοίςηρ οπαγμασξοξιήθηκε in silico μελέση αμαςσξλέψμ σηρ ALR2. Η εμαςφόληςη μξτ με όλα σα οαπαοάμψ θέμασα με ξδήγηςαμ μα μάθψ διάυξπερ σεφμικέρ ςύμθεςηρ, οπαγμασξοξίηςηρ in vitro βιξλξγικώμ οειπαμάσψμ αλλά και φπήςηρ τοξλξγιςσικώμ μεθόδψμ για in silico μελέσερ. Σξ κτπιόσεπξ ψςσόςξ όυελξρ μξτ ήσαμ η εμοειπία οξτ αοέκσηςα αλλά και η δτμασόσησα αμάοστνηρ σηρ κπισικήρ εοιςσημξμικήρ ςκέχηρ ψρ ςημαμσικό ευόδιξ για όλα σα βήμασα σηρ μελλξμσικήρ μξτ ζψήρ. Ετφαπιςσώ θεπμά σξμ Καθηγησή Βαςίλη Δημόοξτλξ, εοιβλέοξμσα σηρ οαπξύςαρ διδακσξπικήρ διασπιβήρ, για σημ τοόδεινη σξτ θέμασξρ ατσήρ και σημ ξτςιαςσική και αμεκσίμηση ςτμβξλή σξτ ςε ατσή. Η ςτμεπγαςία μαρ όλξ ατσό σξ διάςσημα, αοό σημ οεπίξδξ οξτ ψρ οπξοστφιακή υξισήσπια ςσξ Σμήμα Υαπμακετσικήρ θέληςα μα αςφξληθώ οεπιςςόσεπξ με σημ έπετμα, σξμ κύκλξ ςοξτδώμ για σημ αοόκσηςη 17

18 μεσαοστφιακξύ σίσλξτ ειδίκετςηρ μέφπι και σημ ξλξκλήπψςη σηρ διδακσξπικήρ μξτ διασπιβήρ, ήσαμ άπιςση. Ετφαπιςσώ ξλόχτφα σημ Καθηγήσπια Δήμησπα Φασζηοαύλξτ-Λίσιμα, μέλξρ σηρ σπιμελξύρ ςτμβξτλετσικήρ εοισπξοήρ, για ση βξήθεια σηρ και σιρ εοξικξδξμησικέρ οαπασηπήςειρ σηρ. Κασά ση διάπκεια σψμ ςοξτδώμ μξτ με ςσήπιζε ξλόχτφα και ξι ςτμβξτλέρ σηρ ήσαμ κασαλτσικέρ. Ιδιαίσεπη όμψρ ήσαμ η ςσήπινη σηρ, σόςξ ηθική όςξ και ξτςιαςσική, σξμ σελετσαίξ φπόμξ σηρ εκοόμηςηρ σηρ διασπιβήρ μξτ οξτ ήσαμ μια ιδιαίσεπα δύςκξλη, οιεςσική και αοαισησική οεπίξδξρ και οπαγμασικά φπειαζόμξτμ άσξμα μα με ςσηπίνξτμ και μα με εμθαππύμξτμ. Θα ήσαμ οαπάληχη μα μημ αμαυεπθώ και ςσημ οξλύσιμη βξήθεια σηρ κασά ση ςτγγπαυή αλλά και διόπθψςη σξτ κειμέμξτ σηρ διασπιβήρ ατσήρ. Ετφαπιςσώ ξλόχτφα σημ Αμαοληπώσπια Καθηγήσπια Αθημά Γεπξμικάκη, μέλξρ σηρ σπιμελξύρ ςτμβξτλετσικήρ εοισπξοήρ, καθώρ και σημ Αμαοληπώσπια Καθηγήσπια Ελέμη Ρέκκα, μέλξρ σηρ ενεσαςσικήρ εοισπξοήρ, για σιρ ιδιαίσεπα φπήςιμερ τοξδείνειρ σξτρ κασά ση διάπκεια εκοόμηςηρ σηρ διδακσξπικήρ μξτ διασπιβήρ αλλά και σιρ εύςσξφερ οαπασηπήςειρ και διξπθώςειρ ςσξ κείμεμξ ατσήρ. Αυιέπψςαμ οξλύ αοό σξ φπόμξ σξτρ ςσξ μα εοιμεληθξύμ σόςξ σξ κείμεμξ όςξ και σημ σελική οαπξτςίαςη σηρ διασπιβήρ και οπαγμασικά η βξήθεια σξτρ ήσαμ αμεκσίμησηρ ανίαρ. Εοίςηρ ετφαπιςσώ σξμ Καθηγησή Παμαγιώση Μαπάκξ και σημ Καθηγήσπια Άμμα Σςαμσίλη-Κακξτλίδξτ σξτ Σμήμασξρ Υαπμακετσικήρ σξτ Εθμικξύ Καοξδιςσπιακξύ Παμεοιςσημίξτ και μέλη σηρ ενεσαςσικήρ μξτ εοισπξοήρ για σιρ ξτςιαςσικέρ οαπασηπήςειρ σξτρ ςσξ κείμεμξ σηρ διασπιβήρ. Πξλλέρ ετφαπιςσίερ και ςσξ Λέκσξπα Ιψάμμη Νικξλάξτ, μέλξρ σηρ ενεσαςσικήρ εοισπξοήρ, σόςξ για σιρ οαπασηπήςειρ σξτ ςσξ κείμεμξ σηρ διασπιβήρ όςξ και για σξ κλίμα ςτμεπγαςίαρ ςσξ επγαςσήπιξ. Θα ήσαμ μεγάλη οαπάληχη μα μημ ετφαπιςσήςψ σξμ Καθηγησή Νικήσα Δημόοξτλξ (Department of Electrical and Computer Engineering, University of Victoria, Canada) για σημ ςτμεπγαςία μαρ οξτ αυξπά ςσημ in silico μελέση με φπήςη σηρ σεφμξλξγίαρ σψμ μετπψμικώμ δικσύψμ (Neural Networks) αλλά και για σιρ εοξικξδξμησικέρ και εύςσξφερ τοξδείνειρ και οαπασηπήςειρ σξτ όςξ αυξπά σξ κείμεμξ σηρ διασπιβήρ οξτ αυξπά ςσα οαπαοάμψ. Η βξήθεια σξτ ήσαμ εοίςηρ ςημαμσικόσαση όςξ αυξπά σημ αοξςαυήμιςη οπξρ εμέμα όπψμ και εμμξιώμ ςφεσικώμ με σα μετπψμικά 18

19 δίκστα, έσςι ώςσε μα ενξικειψθώ όςξ σξ δτμασό οεπιςςόσεπξ με σξ ςτγκεκπιμέμξ και οπψσόγμψπξ για μέμα οεδίξ in silico μελεσώμ. Ετφαπιςσώ ακόμη θεπμά σξμ Ομόσιμξ Καθηγησή Παμαγιώση Κξτπξτμάκη για σημ τοξςσήπινη σξτ κασά σημ διάπκεια εκοόμηςηρ σηρ διδακσξπικήρ μξτ διασπιβήρ, σιρ εοξικξδξμησικέρ ςτζησήςειρ μαρ αλλά και για σημ ξτςιαςσική ςτμβξλή σξτ ςσημ διαμόπυψςη σηρ σελικήρ οαπξτςίαςηρ σηρ διασπιβήρ. Αοξσελεί για μέμα καθήκξμ μα ετφαπιςσήςψ σημ Εοισπξοή Επετμώμ σξτ Απιςσξσελείξτ Παμεοιςσημίξτ Θεςςαλξμίκηρ για σημ Τοξσπξυία Απιςσείξ Ππξόδξτ οξτ μξτ αοέμειμε για σημ ενέλινη σηρ διδακσξπικήρ μξτ διασπιβήρ κασά σξ δεύσεπξ έσξρ σηρ οπαγμασξοξίηςηρ σηρ, καθώρ και σξ Ίδπτμα Κπασικώμ Τοξσπξυιώμ για σημ φξπήγηςη τοξσπξυίαρ για σημ εκοόμηςη σηρ οαπξύςηρ διδακσξπικήρ διασπιβήρ. Για σξτρ θεψπησικξύρ τοξλξγιςμξύρ διαυόπψμ υτςικξφημικώμ οαπαμέσπψμ και σημ εναγψγή σψμ Πξςξσικώμ φέςεψμ Δξμήρ-Δπάςηρ (QSARs), οξτ οπαγμασξοξιήθηκαμ και οαπξτςιάζξμσαι ςσημ επγαςία ατσή φπηςιμξοξιήθηκε σξ λξγιςμικό οπόγπαμμα C-QSAR σηρ Biobyte. Ετφαπιςσώ οξλύ σξτρ Drs Hansch C. και σξμ Leo A. και σημ Biobyte για σημ ελεύθεπη φπήςη σξτ οπξγπάμμασξρ. Θεψπώ αμάγκη μα ετφαπιςσήςψ σημ Ελλημική Εσαιπεία Υαπμακξφημείαρ για σημ τοξσπξυία οξτ μξτ οαπείφε για σημ ςτμμεσξφή μξτ ςσξ European Workshop in Drug Design, Sienna 2009 (VII EWDD), σημ European Federation of Medicinal Chemistry (EFMC) για σημ τοξσπξυία οξτ μξτ οαπείφε για σημ οαπακξλξύθηςη σξτ European School of Medicinal Chemistry-XXVIΙ Advanced Course of Medicinal Chemistry and E. Duranti National Seminar for PhD Students, Urbino 2007 και σημ ετκαιπία μα οαπξτςιάςψ μέπξρ σηρ διδακσξπικήρ μξτ διασπιβήρ, καθώρ και σημ Federation of European Biochemical Societies (FEBS) για σημ τοξσπξυία ςτμμεσξφήρ ςσξ International Free Radical Summer School 2006: Biomarkers of Oxidative Stress and Responses. Εοίςηρ φάπη ςση ςτμμεσξφή σηρ επετμησικήρ ξμάδαρ σξτ εοιβλέοξμσα μξτ κ. Βαςίλη Δημόοξτλξτ ςσξ επετμησικό οπόγπαμμα COST Action B-35, είφα σημ ετκαιπία μα ςτμμεσέφψ ςσξ SFFR-E Free Radical Summer School 2008: Lipid peroxidation and free radical signaling: role in pathophysiology αλλά και μα εοιςκευσώ για επετμησικξύρ ςκξοξύρ σξ Department de Ciencies Mediques Basiques, Facultat de Medicina, Universitat de Lleida, Spain. Εοίςηρ θα ήθελα μα ετφαπιςσήςψ σξτρ ςτμαδέλυξτρ οξτ αςκξύμσαι επετμησικά ςσξμ Σξμέα, διδάκσξπερ, τοξχήυιξτρ διδάκσξπερ και μεσαοστφιακξύρ υξισησέρ και 19

20 έφξτμ δημιξτπγήςει κλίμα ςτμεπγαςίαρ και ςτμοόπετςηρ. Ακόμη ετφαπιςσώ σξμ Δπ. Αμσώμη Γαβαλά για σημ βξήθεια σξτ, όοξσε φπειάςσηκε, κασά ση διάπκεια σηρ εκοόμηςηρ σηρ διδακσξπικήρ μξτ διασπιβήρ και σημ Λέκσξπα Διώμη Παοαγιαμμξοξύλξτ για ση λήχη κάοξιψμ υαςμάσψμ NMR. Εκσόρ αοό σξτρ ςτμάδελυξτρ οξτ ήσαμ οξλύσιμξι ςσημ οξπεία μξτ ατσή σόσε ςίγξτπα ξι υίλξι ήσαμ ατσξί οξτ αοεσέλεςαμ σα κύπια ηθικά ςσηπίγμασα και σξτρ ετφαπιςσώ όλξτρ θεπμά. Σέλξρ, αοό σα βάθη σηρ καπδιάρ μξτ ετφαπιςσώ σξτρ γξμείρ μξτ Αμαςσάςιξ και Αθημά για σημ καθξπιςσική σξτρ ηθική, τλική και ομετμασική ςτμοαπάςσαςη όλα ατσά σα φπόμια. Αοεσέλεςαμ σξ οξλύσιμξ μξτ ςσήπιγμα και φψπίρ ση δική σξτρ ςσήπινη δε θα είφα υθάςει ςσξ ςημείξ ατσό. Ετφαπιςσώ θεπμά και σημ αδεπυή μξτ Αγγέλα για ση αμέπιςση ςσήπινη σηρ όλξμ ατσό σξμ καιπό. Σέλξρ, θα ήθελα μα ετφαπιςσήςψ όλξτρ, όςξι με ξοξιξδήοξσε σπόοξ ςτμέβαλαμ ςσημ οπξεσξιμαςία, διόπθψςη και εοιμέλεια σηρ επγαςίαρ ατσήρ. 20

21 ΤΝΣΟΜΟΓΡΑΥΙΕ 3-DOGzn (3-deoxyglucosone): 3-δεςοξυ-γλυκοςόνθ AGEs (advanced glycation end products): τελικά προϊόντα γλυκοηυλίωςθσ των πρωτεϊνϊν AKRs (aldo-keto reductases): αλδο-κετο αναγωγάςεσ ι οξειδο-ρεδουκτάςεσ ALR1 (aldehyde reductase): αναγωγάςθ των αλδεχδϊν ALR2 (aldose reductase): αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ ARIs (aldose reductase inhibitors): αναςτολείσ τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ BBB (blood brain barrier): αιματοεγκεωαλικόσ ωραγμόσ COX-2 (cyclooxygenase-2): κυκλοξυγονάςθ 2 CSF (cerebrospinal fluid): εγκεωαλονωτιαίο υγρό DAG (diacylglycerol): διακυλογλυκερόλθ DHAP (dihydroxyacetone phosphate): ωωςωορικι διυδροξυ-ακετόνθ ECM (extracellular matrix proteins): πρωτεΐνεσ ECM ERKs (extracellular signal-regulated kinases): κινάςεσ ERK F3P (fructose-3-phosphate): 3-ωωςωορικι ωρουκτόηθ G3PDH (glycerol-3-phosphate dehydrogenase): δεχδρογονάςθ τθσ 3-ωωςωορικισ γλυκερόλθσ GA3PDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase): δεχδρογονάςθ τθσ 3-ωωςωορικισ γλυκερυναλδεψδθσ GALT (galactose-1-phosphate uridil transferase): ουριδιλο-τρανςωεράςθ τθσ 1-ωωςωορικισ γαλακτόηθσ GR (glutathione reductase): αναγωγάςθ τθσ γλουτακειόνθσ GSH (glutathione): γλουτακειόνθ GSSG: οξειδωμζνθ μορωι γλουτακειόνθσ HK (hexokinase): εξοκινάςθ HNE (4-hydroxy-nonenal): 4-υδροξυ-ενεάλθ IL-1 (interleukin-1): ιντερλευκίνθ-1 JNKs (Jun N-terminal kinases): κινάςεσ JNK Km: ςτακερά Michaelis LDL (low density lipoprotein): χαμθλισ πυκνότθτασ λιποπρωτεΐνθ LPS (lipopolysaccharide): λιποπολυςακχαρίτθσ 21

22 MAPKs (mitogen-activated protein kinases): πρωτεϊνικζσ κινάςεσ που ενεργοποιοφνται από μιτογόνα MCP-1 (monocyte chemotactic protein-1): πρωτεΐνθ MCP-1 MI (myo-inositol): μυο-ινοςιτόλθ NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells): παράγοντασ NF-κB ΝΝs (neural networks): νευρωνικά δίκτυα NO (nitrogen monoxide): μονοξείδιο του αηϊτου NO-synthase: ςυνκετάςθ του μονοξειδίου του αηϊτου PARP (poly(adp-ribose)polymerase): πολυ(adp-ριβοηο)πολυμεράςθ PKC (protein kinase C): πρωτεϊνικι κινάςθ C QSAR (quantitive structure-activity relationships): ποςοτικζσ ςχζςεισ δομισ-δράςθσ ROS (reactive oxygen species): ενεργζσ μορωζσ οξυγόνου SDH (sorbitol dehydrogonase): αωυδρογονάςθ τθσ ςορβιτόλθσ ΣGF-b1 (transforming growth factor beta 1): παράγοντασ TGF-b1 TLR4 (toll-like receptor 4): υποδοχζασ TLR4 TNF-α (tumor necrosis factor-a): παράγοντασ ΤNF-a VEGF (vascular endothelial growth factor): παράγοντασ ανάπτυξθσ VEGF VSMCs (vascular smooth muscle cells): αγγειακά λεία μυϊκά κφτταρα 22

23 ΠΕΡΙΛΗΧΗ Το 1 o ζνηυμο του μεταβολικοφ μονοπατιοφ των πολυολϊν, θ αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ (aldose reductase, ALR2), και ειδικά ο ανταγωνιςμόσ αυτοφ από αναςτολείσ τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ (aldose reductase inhibitors, ARIs) απαςχολεί τθν ωαρμακευτικι κοινότθτα τα τελευταία χρόνια και αποτελεί ζναν πολλά υποςχόμενο ωαρμακοκεραπευτικό ςτόχο. Θ ALR2 πζρα από τον ρόλο τθσ ωσ ζνηυμο αποτοξίνωςθσ από τοξικζσ αλδεψδεσ, ρυκμιςτι ϊςμωςθσ ςτουσ νεωροφσ και ρυκμιςτι τθσ ωρίμανςθσ των ςπερματοηωαρίων, αρχικά βρζκθκε να ςυνδζεται με τθν πρόκλθςθ των χρόνιων επιπλοκϊν του ςακχαρϊδθ διαβιτθ. Ωςτόςο, μζχρι ςιμερα, πολλαπλζσ αναωορζσ αωοροφν ςτθν εμπλοκι του ενηφμου με πλθκϊρα χρόνιων πακολογικϊν καταςτάςεων που αποτελοφν κυρίαρχα προβλιματα υγείασ του 21 ο αιϊνα. Μεταξφ αυτϊν ςυγκαταλζγονται καρδιαγγειακζσ νόςοι, διαταραχζσ διάκεςθσ, νεωρικζσ δυςλειτουργίεσ, ωοκθκικζσ ανωμαλίεσ και διάωορεσ μορωζσ καρκίνου. Τισ τελευταίεσ δεκαετίεσ, πλικοσ ελπιδοωόρων ARIs με ςθμαντικό δυναμικό τόςο ςε in vitro όςο και ςε in vivo ςυςτιματα ζχουν αναπτυχκεί, μα μόνο θ επαλρεςτάτθ (Epalrestat, Kinedak ) είναι εμπορικά διακζςιμθ και μόνο ςτθν Λαπωνία. Πλοι οι υπόλοιποι ARIs που ζχουν ειςαχκεί ςε κλινικζσ μελζτεσ ζχουν αποςυρκεί εξαιτίασ μθ ικανοποιθτικοφ κινθτικοφ προωίλ ι παρενεργειϊν. Ζτςι, αποτελεί αναγκαιότθτα θ ανάπτυξθ νζων χθμειοτφπων, που κα ςτεροφνται τα προαναωερόμενα μειονεκτιματα των ποικίλων ARIs που απζτυχαν ςτισ διεξαχκείςεσ κλινικζσ μελζτεσ. Ρροσ τθν κατεφκυνςθ αυτι πολλζσ μελζτεσ προςανατολίηονται προσ τθν ανάπτυξθ ωαρμακομορίων που δεν αποτελοφν παράγωγα του καρβοξυλικοφ οξζοσ και τθσ υδαντοΐνθσ, προκειμζνου να αποτελζςουν πικανζσ ενϊςεισ οδθγοφσ δραςτικϊν ARIs, με βελτιωμζνα ωαρμακοδυναμικά και ωαρμακοκινθτικά χαρακτθριςτικά. Πςο αωορά ςτο επικυμθτό ωαρμακοδυναμικό προωίλ ενόσ εν δυνάμει αναςτολζα, τα παρακάτω ςθμεία κα πρζπει να τονιςτοφν: ARIs που ωαίνονται να είναι δραςτικοί ςε in vitro πειραματικά πρότυπα αποτυγχάνουν να αντεπεξζλκουν ςτισ απαιτιςεισ των κλινικϊν μελετϊν εξαιτίασ ζλλειψθσ εκλεκτικότθτασ. Για το λόγο αυτό παράγοντεσ εκλεκτικότθτασ κα πρζπει να λαμβάνονται υπ όψθ κατά το ςχεδιαςμό και τθν ανάπτυξθ βιοδραςτικϊν ARIs. Σε αυτό το ςθμείο κα πρζπει να αναωερκεί πωσ θ ALR2 αποτελεί μζλοσ τθσ οικογζνειασ των αλδο-κετο αναγωγαςϊν (aldo-keto reductase, AKRs). Άλλο μζλοσ των AKRs είναι το ζνηυμο αναγωγάςθ των αλδεχδϊν (aldehyde reductase, ALR1), και αποτελεί πλζον κοινι πεποίκθςθ πωσ το μθ ευνοϊκό προωίλ πολλϊν ARIs ςτισ κλινικζσ μελζτεσ είναι αποτζλεςμα τθσ παράλλθλθσ αναςτολισ αυτοφ του ενηφμου πζρα από τθν αναςτολι τθσ ALR2. Είναι κοινά αποδεκτό πωσ το οξειδωτικό ςτρεσ, ςε ςυνδυαςμό με τθν ενεργοποίθςθ τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν, εμπλζκεται ςτθν αιτιολογία πρόκλθςθσ πολλϊν πακολογικϊν καταςτάςεων. Από τθ ςτιγμι λοιπόν που θ παρεμπόδιςθ/αναςτολι και των δυο αυτϊν διαδικαςιϊν είναι επικυμθτι, ζνα ωαρμακομόριο με διττι δράςθ κα μποροφςε να αποτελζςει ςθμαντικό ωαρμακοκεραπευτικό παράγοντα. 23

24 Στθν παροφςα διδακτορικι διατριβι πραγματοποιικθκε ο ςχεδιαςμόσ, θ ςφνκεςθ και θ ωαρμακοχθμικι μελζτθ νζων ωαρμακομορίων ωσ πικανϊν ARIs. Ο ςχεδιαςμόσ ςτθρίχκθκε ςτθν λογικι τθσ αντικατάςταςθσ λειτουργικϊν ομάδων τθσ ζνωςθσ οδθγοφ, του 2- (ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικοφ οξζοσ, από ποικίλθσ χθμικισ δομισ ομάδεσ που εμωανίηουν χαρακτθριςτικά μθ κλαςςικισ ιςοςτζρειασ με τθν ομάδα του καρβοξυλίου. Ζχει ανακοινωκεί πωσ ςειρά ενϊςεων, παραγϊγων του 2-(ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικοφ οξζοσ (αροχλοςουλωονυλογλυκίνθσ) παρουςιάηουν ςθμαντικι αναςταλτικι δράςθ επί του ενηφμου ALR2. Οι παραπάνω όμωσ αναςτολείσ τθσ ALR2, ωσ παράγωγα του οξικοφ οξζοσ είναι ςχεδόν πλιρωσ ιονιςμζνοι ςτο ωυςιολογικό ph, παρουςιάηοντασ μθ ικανοποιθτικζσ ωαρμακοκινθτικζσ ιδιότθτεσ. Επιλζχκθκε λοιπόν, ωσ ζνωςθ οδθγόσ το 2- (ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικό οξφ και μια ςειρά από μθ κλαςςικζσ ιςοςτερείσ ομάδεσ του οξικοφ οξζοσ με τελικό ςκοπό τθν ανάπτυξθ νζων ARIs, με βελτιωμζνα τόςο τα κινθτικά όςο και τα ωαρμακοδυναμικά τουσ χαρακτθριςτικά. Στθν επιλογι τθσ ζνωςθσ οδθγοφ ςυνζβαλε κετικά το γεγονόσ πωσ θ χθμικι οντότθτα των ςουλωοναμιδίων (R 2 SO 2 NR 2 ) αποτελεί μια κοινά αποδεκτι δομι ςτθ ωαρμακευτικι χθμεία όταν ενςωματϊνεται ςε πικανά μικροφ μοριακοφ βάρουσ ωαρμακομόρια, μια που ζχει και τθ δυνατότθτα να προκαλεί ποικίλεσ θλεκτροςτατικζσ αλλθλεπιδράςεισ με μοριακοφσ ςτόχουσ και πρωτεΐνεσ (κατά το χρονικό διάςτθμα ζχουν δθμοςιευτεί εννζα διπλϊματα ευρεςιτεχνίασ που περιζχουν αυτι τθ χθμικι οντότθτα και αωοροφν ευρφ ωάςμα βιολογικϊν δράςεων). Ωσ μθ κλαςςικζσ ιςοςτερείσ ομάδεσ του καρβοξυλικοφ οξζοσ επιλζχτθκαν οι ακόλουκεσ: 2,6-διωκοροωαινόλθ, τετραηόλιο, μεκυλοςουλωονυλαμίδιο και κυκλοςερίνθ. Θ ομάδα τθσ 2,6- διωκοροωαινόλθσ μπορεί να κεωρθκεί ωσ μια λιγότερο όξινθ και περιςςότερο λιπόωιλθ ιςοςτερισ ομάδα ςυγκρινόμενθ με τθν καρβοξυλικι. Οι ομάδεσ του μεκυλοςουλωανυλαμιδίου και του τετραηολίου μοιάηουν με τθ καρβοξυλικι κυρίωσ όςο αωορά τισ ωυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ ςχετικζσ με τθ οξφτθτα, με τθ ομάδα του τετραηολίου να είναι περιςςότερο ςτακερι και λιπόωιλθ. Τζλοσ, θ κυκλοςερίνθ, που ζχει δομικζσ ομοιότθτεσ με τισ υδαντοΐνεσ (γνωςτι κατθγορία ARIs), μελετικθκε ωσ πικανι ιςοςτερισ δομι του καρβοξυλίου με μειωμζνθ οξφτθτα και αυξθμζνθ λιποωιλικότθτα. Τα αποτελζςματα που προζκυψαν ςχετικά με τθν in vitro ικανότθτα αναςτολισ του ενηφμου ALR2 από τισ προαναωερόμενεσ ενϊςεισ ιταν ιδιαίτερα ενκαρρυντικά ςτθν περίπτωςθ του παραγϊγου τθσ 2,6-διωκοροωαινόλθσ (αναπτφχκθκε ςειρά ενϊςεων, με ποικίλεσ χθμικζσ τροποποιιςεισ), ενϊ ιδιαίτερου ενδιαωζροντοσ ιταν και θ ανάδειξθ βιοϊςοςτζρειασ ςτθν περίπτωςθ αντικατάςταςθσ τθσ ομάδασ του οξικοφ οξζοσ από τθν L-κυκλοςερίνθ αλλά όχι ςτθν περίπτωςθ τθσ D-κυκλοςερίνθσ. Αναςκόπθςθ ςτα βιβλιογραωικά δεδομζνα ςχετικά με τουσ υπό ανάπτυξθ ARIs αλλά και αυτοφσ που βρίςκονται ςε προχωρθμζνεσ κλινικζσ μελζτεσ (πχ ρανιρεςτάτθ ςε κλινικζσ μελζτεσ ΛΛΛ ςτισ Θ.Ρ.Α) (Schemmel et al., 2009) αναδεικνφει τθν παρουςία αλογονομζνων βενηολικϊν δακτυλίων ωσ υποκαταςτατϊν που πικανά ςυμβάλλουν ςθμαντικά ςτθν βελτίωςθ τθσ αναςταλτικισ δράςθσ. Θ παρατιρθςθ αυτι ςε ςυνδυαςμό με το όλο και αυξανόμενο ενδιαωζρον τθσ ωαρμακευτικισ κοινότθτασ προσ τθν ευνοϊκι ςε πολλζσ περιπτϊςεισ ειςαγωγι ατόμων F ςε 24

25 όλο και περιςςότερα ωαρμακομόρια, οδιγθςε ςτθν επιλογι του 4-βρωμο-2-ωκορομεκυλοβενηολίου ωσ μιασ πικανισ προνομιοφχασ δομισ privileged scaffold που κα μποροφςε να ενςωματωκεί ςτο χθμειότυπο των νζων διωκοροωαινολικϊν παραγϊγων. Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτεί πωσ οι ιδιότθτεσ που κακορίηουν τθν απορρόωθςθ κακϊσ και τθν κινθτικι και δυναμικι των νζων ενϊςεων, γνωςτζσ με το ακρωνφμιο ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Elimination, ADME) αποτελοφν κριτιρια που πρζπει να διερευνϊνται παράλλθλα με τθ δράςθ ςτουσ υποδοχείσ/ζνηυμα, ϊςτε να εξαςωαλίηεται θ αποτελεςματικότθτα και θ αςωάλειά των νζων μορίων. Στα πλαίςια αυτά ζχουν προτακεί ςυγκεκριμζνα όρια ι εφρθ τιμϊν για οριςμζνεσ ωυςικοχθμικζσ και μοριακζσ ιδιότθτεσ που κακορίηουν τα ωαρμακοχθμικά χαρακτθριςτικά (drug-likeness), με κυριότερο τον κανόνα του 5 που προτάκθκε το 1997 από τον Lipinksi και προτείνει ανϊτατα όρια για τθ λιποωιλία, το μοριακό βάροσ και τθν ικανότθτα ατόμων για ςχθματιςμό δεςμϊν υδρογόνου ωσ δότεσ ι ωσ δζκτεσ και ςυμπλθρϊκθκε ακολοφκωσ με όρια που αωοροφν ςτο εμβαδόν πολικισ μοριακισ επιωάνειασ. Τα προαναωερόμενα κριτιρια λιωκθκαν υπόψθ ςτθν ανάπτυξθ των νζων ARIs. Για τισ ςυνκζςεισ όλων των προαναωερόμενων ενϊςεων εωαρμόςτθκαν κακιερωμζνεσ αλλά και νζεσ ςυνκετικζσ προςεγγίςεισ ενϊ χρειάςτθκε να πραγματοποιθκεί θ ςφνκεςθ πολλϊν ενϊςεων ιδθ γνωςτϊν από τθ βιβλιογραωία κυρίωσ με ςκοπό τθσ αξιολόγθςθ και ςφγκριςθ των βιολογικϊν αποκρίςεων κάτω από τισ ίδιεσ in vitro πειραματικζσ ςυνκικεσ. Οι τελικζσ ενϊςεισ εξετάςτθκαν ωσ προσ τθν ικανότθτα τουσ να αναςτζλλουν in vitro τo ζνηυμο ALR2 κακϊσ και το ομόλογο ζνηυμο ALR1, προκειμζνου να προςδιοριςτεί θ εκλεκτικότθτα των νζων ωαρμακομορίων. Επιπλζον, προςδιορίςτθκε το αντιοξειδωτικό δυναμικό των δραςτικϊν τελικϊν ενϊςεων ςε δυο διαωορετικά in vitro πειραματικά πρότυπα: ςτο ομογενζσ ςφςτθμα ςάρωςθσ τθσ ελεφκερθσ ρίηασ DPPH και ςτο ετερογενζσ ςφςτθμα λιπιδικισ υπεροξείδωςθσ DOPC λιποςωμάτων. Στα πλαίςια τθσ in silico μελζτθσ των νζων ωαρμακομορίων αρχικά πραγματοποιικθκε ο υπολογιςμόσ επιλεγμζνων ωυςικοχθμικϊν ιδιοτιτων με χριςθ κατάλλθλων υπολογιςτικϊν προγραμμάτων και ζγινε προςπάκεια διεξαγωγισ ποςοτικϊν ςχζςεων δομισ-δράςθσ (quantitive structure-activity relationships, QSAR). Επίςθσ εξιχκθςαν ςυμπεράςματα ςχετικά με τισ δομικζσ και ωυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ των μθ κλαςςικϊν ιςοςτερϊν ομάδων που ενςωματϊκθκαν ςτθν ζνωςθ οδθγό (lead compound) με ςκοπό τθν εμωάνιςθ αναςταλτικισ δράςθ προσ το ζνηυμο-ςτόχο τθσ ALR2. Τελικόσ ςτόχοσ τθσ in silico μελζτθσ ιταν θ διεξαγωγι χριςιμων και αξιοποιιςιμων ςυμπεραςμάτων για τον μετζπειτα ςχεδιαςμό πιο αποτελεςματικϊν και εκλεκτικϊν ARIs. Επίςθσ, με χριςθ δεδομζνων τθσ βιβλιογραωίασ που αωοροφν ARIs, ζγινε προςπάκεια διεξαγωγισ γενικότερων ςχζςεων QSAR ενϊ κα πρζπει να ςθμειωκεί πωσ τα ίδια δεδομζνα χρθςιμοποιικθκαν από ςυνεργαηόμενθ ερευνθτικι ομάδα για τθν δθμιουργία ενόσ νευρωνικοφ δικτφου NN ωσ μοντζλο πρόβλεψθσ και μελζτθσ ARIs ποικίλθσ χθμικισ δομισ. Θ προβλεπτικι ικανότθτα του ΝΝ μοντζλου αξιολογικθκε ςε ςχζςθ με τα πραγματικά in vitro δεδομζνα που προζκυψαν για τουσ νζουσ χθμειότυπουσ που αναπτφχκθκαν ςτα πλαίςια αυτισ τθσ διδακτορικισ διατριβισ. 25

26

27 SUMMARY Aldose reductase enzyme (ALR2) of the polyol metabolic pathway, and especially its inhibition by aldose reductase inhibitors (ARIs), has been gaining attention over the last years from the pharmaceutical community, as it appears to be a promising pharmacotherapeutic target. Apart from its role as a detoxifying enzyme towards toxic aldehydes, osmoregulator in the kidney and regulator of sperm maturation, it was first found to be implicated in the etiology of the long term diabetic complications. However, to date, emerging reports have suggested that under normal glucose concentration, ALR2 may be up-regulated by factors other than hyperglycemia and therefore be involved also in numerous chronic pathological processes that have become major threats to human health in the 21 st century. Such pathologies are a number of cardiac disorders, inflammation, mood disorders, renal insufficiency and ovarian abnormalities. In addition, ALR2 was found to be over-expressed in different human cancers such as liver, breast, ovarian, cervical and rectal cancers. Over the last decades, a number of promising ARIs have been discovered and showed significant efficacy in vitro and in animal models, but only Epalrestat (Kinedak ) has made it to the market, and only in Japan. All the other compounds that have reached the stage of clinical trials on humans have been withdrawn due to their inadequate pharmacokinetic profile or side effects. Thus, it is becoming of great importance, novel chemotypes to be developed, lacking the poor pharmacokinetic profile or the side-effects of the various ARIs that have failed to the clinical trials. Towards this direction, many studies have been reported to date, providing evidence that novel chemotypes, being neither carboxylic acid nor hydantoin derivatives, could be considered as promising hits or lead compounds for further development of potent ARIs with improved pharmacodynamic and pharmacokinetic properties. As regards the desirable pharmacodynamic profile of a novel ARI, the following points should be highlighted: ARIs that appear to be promising during in vitro studies often fail to proceed any further into clinical use due to side effects, which in many cases have been attributed to the luck of selectivity for other enzymes. Therefore, selectivity factors should be taken into consideration for the design and development of potent ARIs. At this point it should be mentioned that ALR2 is a member of the aldo-keto reductase (AKR) superfamily. Another member of the AKR superfamily is aldehyde reductase (ALR1), and it is widely believed that the unfavorable profile of many ARIs in clinical trials is due to their concurrent inhibition of these closely related AKRs. It is widely accepted that oxidative stress and the activation of the polyol pathway are implicated in the etiology of a variety of chronic pathologies. Since the inhibition of both of these processes is desirable, a bifunctional compound that would combine ALR2 inhibitory activity and antioxidant potential could be of great importance. The present PhD thesis involves the pharmakochemical study of novel ARIs. The design of the novel compounds was based on the concept of bioisosterism, a strategy used for molecular 27

28 modifications on the lead compound. It has been reported that a series of compounds, derivatives of 2-(phenylsulfonamido)acetic acid, show important in vitro ALR2 inhibitory activity. However, these inhibitors, being acetic acid derivatives, are almost completely ionized in blood ph and show poor kinetic profile. Therefore, 2-(phenylsulfonamido)acetic acid was chosen as the lead compound and a series of non classical isosters to the acetic acid moiety were used for the latter s replacement, in order potent (with improved pharmacokinetic and pharmacodynamic characteristics) ARIs to be developed. The sulfonamide (R 2 SO 2 NR 2 ) functionality is an acceptable functional group in medicinal chemistry when incorporated into putative small-molecule therapeutics, as it has the potential to form several electrostatic interactions with protein and other targets (during the period of , there were nine published patents in which all or most reported compounds, with a variety of biological responses, contained the sulfonamide functional group). Diverse functional groups are known for their isosteric relationships with the carboxylate group. The methylsulfonylamine and the tetrazole group mimic the carboxylate group principally in terms of its physicochemical properties related to acidity, although tetrazole is more stable and lipophilic. In order to further balance acidity with lipophilicity, the acetic acid moiety in the lead compound was replaced with that of difluorophenol, a reported bioisoster for carboxylate. Furthermore, cycloserine was studied as a potent isostere for the carboxylate group, as it has relevant structure to that of hydantoins (a known class of ARIs). The data derived from the in vitro experiments revealed important bioisosterism in the case of the difluorophenol (a series of such derivatives with various chemical modifications was developed), as well as in the case of L-cycloserine but not D-cycloserine. Review on the literature about ARIs under development as well as those being already in clinical trials (ex. Ranirestat in clinical trials III in the USA) highlight the presence of halogenated benzene rings as substituent that importantly contribute to the improvement of the ALR2 inhibitory activity. This observation, together with the increasing interest towards the employment of fluorine at medical and pharmaceutical agents, led to the choice of 4-bromo-2-fluoro-methylobenzene as a potent privileged scaffold that could be introduced to the difluorophenol derivatives. The concept of drug-likeness helps to optimize absorption, pharmacokinetic and pharmacodynamic properties, known as ADME properties (Absorption, Distribution, Metabolism, Elimination, ADME) and comprises an additional criterion that should be assessed together with the biological response on enzyme/receptor targets. It was the great merit of Lipinski et al. first to identify, then to list, in a formalized and simple form, the molecular properties that contribute most to drug-likeness, based on disposition criteria. The critical properties that emerged from the analysis are molecular weight, lipophilicity as calculated by the ClogP algorithm, and simple counts of H-bond donors and acceptors. Because each threshold is a multiple of 5, the set of criteria has been called the rule-of-five and it has been applied to the novel chemotypes developed in this PhD thesis. 28

29 All the synthesized compounds were tested in vitro for their ability to inhibit the target enzyme ALR2. Towards to an improved pharmacodynamic profile of the potent ARIs developed, they were also tested in vitro for their ability to inhibit the homologous enzyme ALR1. Furthermore their antioxidant potential was tested in two different in vitro systems: the homogeneous system of DPPH and the heterogeneous system of DOPC liposomes. As regards the in silico studies of the novel ARIs developed, initially selected physicochemical properties were calculated using the appropriate software and quantitive structure-activity relationships (QSAR) were developed. Conclusions about the structural and physicochemical requirements for non classical isosteric groups adopted in the scaffold of the lead compound with potential ALR2 inhibitory activity were conducted. Additionally, data regarding ARIs from the literature were collected and QSAR were determined. The same data were used by a collaborative research team in order a neural network (ΝΝ) heuristic predictor model for ARIs to be established. The experimental data derived from the in vitro studies conducted in the scope of this thesis were used for the NN model s predictive ability evaluation. 29

30

31 1. ΕΙΑΓΨΓΗ 1.1. ΕΙΑΓΨΓΙΚΑ ΗΜΕΙΑ Το ζνηυμο αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ (aldose reductase, ALR2) τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν, και ειδικά ο ανταγωνιςμόσ αυτοφ από αναςτολείσ τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ (aldose reductase inhibitors, ARIs) απαςχολεί τθν ωαρμακευτικι κοινότθτα τα τελευταία χρόνια αωοφ ωαίνεται να αποτελεί ζναν πολλά υποςχόμενο ωαρμακοκεραπευτικό ςτόχο. Αρχικά βρζκθκε να εμπλζκεται ςτθν πρόκλθςθ των χρόνιων επιπλοκϊν του ςακχαρϊδθ διαβιτθ που ταξινομοφνται ςε μικροαγγειοπάκειεσ (αμωιβλθςτροειδοπάκεια, νευροπάκεια και νεωροπάκεια), μακροαγγειοπάκειεσ (αρτθριοςκλιρυνςθ, ςτεωανιαία νόςοσ και περιωερικι αγγειοπάκεια) και άλλεσ όπωσ ευπάκεια ςε λοιμϊξεισ, υπερλιπιδαιμίεσ, λιπϊδθσ διικθςθ του ιπατοσ και περιοδοντίτιδα (Demopoulos et al., 2005; Hornick and Aron, 2008). Ωςτόςο, μζχρι ςιμερα, πολλαπλζσ αναωορζσ εςτιάηουν ςτθν υπερζκωραςθ και ρφκμιςθ τθσ λειτουργίασ τθσ ALR2 από διάωορουσ παράγοντεσ, πζραν τθν υπεργλυκαιμίασ, με αποτζλεςμα τθν εμπλοκι του ενηφμου ςε πλθκϊρα χρόνιων πακολογικϊν καταςτάςεων που αποτελοφν κυρίαρχα προβλιματα υγείασ του 21 ο αιϊνα (Alexiou et al., 2009). Ρλθκϊρα καρδιαγγειακϊν νόςων όπωσ ιςχαιμία του μυοκαρδίου, καρδιακι ανεπάρκεια και καρδιομυοπάκειεσ ζχουν ςυςχετιςτεί με παραγωγι αυξθμζνων επιπζδων ενεργϊν μορωϊν οξυγόνου (reactive oxygen species, ROS) κακϊσ και λιπιδικισ υπεροξείδωςθσ ςτο μυοκάρδιο. Επιπλζον, θ ALR2 ζχει βρεκεί πωσ ςχετίηεται με ωλεγμονϊδεισ διαταραχζσ (Ramana and Srivastava, 2010), διαταραχζσ διάκεςθσ (Regenold et al., 2000), νεωρικζσ δυςλειτουργίεσ (Hasuike et al., 2002), ωοκθκικζσ ανωμαλίεσ (Meyer et al., 1992) και επιπλζον υπερεκωράηεται ςε διάωορεσ μορωζσ καρκίνου (Saraswat et al., 2006). Τισ τελευταίεσ δεκαετίεσ, πλικοσ ελπιδοωόρων ARIs με ςθμαντικό δυναμικό τόςο ςε in vitro όςο και ςε in vivo ςυςτιματα ζχουν αναπτυχκεί, μα μόνο θ επαλρεςτάτθ (Epalrestat, Kinedak ) είναι εμπορικά διακζςιμθ και μόνο ςτθν Λαπωνία (Hotta et al., 2006; Ramirez and Borja, 2008). Πλοι οι υπόλοιποι ARIs που ζχουν ειςαχκεί ςε κλινικζσ μελζτεσ ζχουν αποςυρκεί εξαιτίασ μθ ικανοποιθτικοφ ωαρμακοκινθτικοφ προωίλ ι παρενεργειϊν. Ζτςι, αποτελεί αναγκαιότθτα θ ανάπτυξθ νζων χθμειοτφπων, και πολλζσ είναι οι μζχρι τϊρα μελζτεσ που αωοροφν ςτθν ανάπτυξθ ωαρμακομορίων που δεν αποτελοφν παράγωγα του καρβοξυλικοφ οξζοσ και τθσ υδαντοΐνθσ, προκειμζνου να αποτελζςουν πικανζσ ενϊςεισ οδθγοφσ δραςτικϊν ARIs, με βελτιωμζνα ωαρμακοδυναμικά και ωαρμακοκινθτικά χαρακτθριςτικά ΕΝΖΤΜΟ ΑΝΑΓΨΓΑΗ ΣΗ ΑΛΔΟΖΗ (ALR2): ΔΟΜΗ, ΕΝΕΡΓΟ ΚΕΝΣΡΟ ΚΑΙ ΑΠΟΧΕΙ ΓΙΑ TO ΜΗΦΑΝΙΜΟ ΣΗ ΕΝΖΤΜΑΣΙΚΗ ΚΑΣΑΛΤΗ Το ζνηυμο αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ (ALR2; AR; AKR1B1; alditol: NADP oxidoreductase; EC ) αποτελεί μζλοσ τθσ οικογζνειασ των αλδο-κετο αναγωγαςϊν (οξειδοαναγωγάςεσ) (aldoketo reductases, AKRs) (Jez et al., 1997a; Jez et al., 1997b). Από τισ αρχζσ τθσ δεκαετίασ του 60 προςδιορίςτθκε ωσ το πρϊτο ζνηυμο τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν και παρουςία του ςυνενηφμου NADPH καταλφει τθν αναγωγι τθσ γλυκόηθσ προσ ςορβιτόλθ. Θ ALR2 αποτελείται από 31

32 316 αμινοξζα (ΜΒ=36kDa) και θ πρωτοταγισ τθσ δομι προςδιορίςτθκε για πρϊτθ ωορά ςε ωακοφσ βοοειδϊν (Schade et al., 1981) και επιμφων (Carper et al., 1988; Nishimura et al., 1989). Στισ αρχζσ τθσ δεκαετίασ του 90 δθμοςιεφτθκαν οι πρϊτεσ μελζτεσ που αωοροφςαν τθν κρυςταλλογραωικι δομι τθσ ALR2 (Borhani et al., 1992; El-Kabbani et al., 1991; Rondeau et al., 1992; Wilson et al., 1992) ςφμωωνα με τισ οποίεσ το ζνηυμο εμωανίηει μια β/α βαρζλι τριτοταγι δομι (barrel motif), αποτελοφμενθ από 8 παράλλθλα β-πτυχωτά ελάςματα που ςυνδζονται με 8 περιωερειακζσ α-ζλικεσ (εικόνα 1), και όπου ζνα μικρό τμιμα των β-ελαςμάτων καλφπτει τθν Ν- τερματικι απόλθξθ (υπόλοιπα αμινοξζων 2-14) κακϊσ και τθ C-τερματικι προζκταςθ (υπόλοιπα αμινοξζων ). Το ενεργό κζντρο του ενηφμου εντοπίηεται ςτο ζνα άκρο του β/α μοτίβου όπου τα C-τελικά άκρα των β-πτυχωτϊν ελαςμάτων ςυνδζονται με τα Ν-τελικά άκρα των α- ελικοειδϊν τμθμάτων (Farber and Petsko, 1990). Ο δακτφλιοσ του νικοτιναμιδίου, ςτθν εκτεταμζνθ του μορωι, εντοπίηεται ςυνδεδεμζνοσ ςτο κζντρο τθσ κοιλότθτασ του ενεργοφ κζντρου του ενηφμου και ςυγκεκριμζνα μεταξφ των υπολοίπων Gly213 και Ser226, που οριοκετοφν μια κοιλότθτα που χαρακτθρίηεται ωσ safety-belt pocket. Το ιδιαίτερα υδρόωοβο ενεργό κζντρο αποτελείται από αρωματικά υπόλοιπα (Trp20, Tyr48, Trp79, Trp111, Phe121, Phe122 and Trp219); άπολα (Val47, Pro218, Leu300 and Leu301); πολικά (Gly49, Cys298 and His110) κακϊσ και τρία υπόλοιπα πικανοφσ δότεσ πρωτονίων (Tyr48, His110 και Cys298). ΕΙΚΟΝΑ 1: β/α βαρζλι (barrel motif) με πυρινα 8 παράλλθλων β-πτυχωτϊν ελαςμάτων (κίτρινο) που ςυνδζονται με 8 περιωερειακζσ α-ζλικεσ (κόκκινο) (ref: 32

33 Το 1993 προςδιορίςτθκε θ δομι του ενηφμου ςυνκρυςταλλωμζνο με τον αναςτολζα ηοπολρεςτάτθ (Wilson et al., 1993) και ςυγκριτικά με τισ προαναωερόμενεσ μελζτεσ παρατθρικθκαν αλλαγζσ ςτθ διαμόρωωςθ του ολοενηφμου και ςυγκεκριμζνα ςτα υπόλοιπα και προκειμζνου να υποβοθκθκεί θ ςφνδεςθ του υποςτρϊματοσ ςτο ενεργό κζντρο, ενϊ θ Tyr48 ιταν το υπόλοιπο ςτθν καλφτερθ κζςθ για προςωορά πρωτονίου. Ρεραιτζρω μελζτεσ ςχετικά με τθν ςφνδεςθ τθσ ALR2 με τουσ αναςτολείσ ςορβινίλθ και τολρεςτάτθ ςτο ίδιο ενεργό κζντρο ανζδειξαν τθν φπαρξθ μιασ κοιλότθτασ εκλεκτικότθτασ selectivity pocket μεταξφ των υπολοίπων Trp111, Phe122 και Leu300 (Urzhumtsev et al., 1997), θ οποία αποκτά διαωορετικι διαμόρωωςθ ανάλογα με τον αναςτολζα. Λίγο αργότερα δθμοςιεφτθκε μια μελζτθ (Lee et al., 1998) που ανζδειξε με τθ βοικεια υπολογιςτικϊν μεκόδων τα βαςικά κριτιρια ωαρμακομορίων με δράςθ ωσ ARIs και ςυγκεκριμζνα: μια ιονιςμζνθ ομάδα που κα μπορεί να αλλθλεπιδρά με τα υπόλοιπα Tyr48, His110 και Trp111 που οριοκετοφν μια κοιλότθτα ςφνδεςθσ ανιόντων anionbinding pocket, ζναν αρωματικό δακτφλιο που κα αλλθλεπιδρά με τα υπόλοιπα Trp20, Trp111 και Phe120 και ζνα ακόμα αρωματικό δακτφλιο που κα διευκετείται μεταξφ των υπολοίπων Trp111 και Leu300 τθσ κοιλότθτασ εκλεκτικότθτασ. Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτεί πωσ πολλζσ είναι οι δομζσ του ενηφμου που ζχουν προςδιοριςτεί με μεκόδουσ κρυςταλλογραωίασ. Ραρ όλο που διαωζρουν ςθμαντικά μεταξφ τουσ όλεσ περιζχουν ζνα οργανικό ι οργανομεταλλικό ανιόν (Costantino et al., 1999). Επιπλζον πολλζσ είναι και οι μελζτεσ προςομοίωςθσ του ενηφμου κατά τθν αλλθλεπίδραςθ με διάωορουσ ARIs, αναδεικνφοντασ διάωορεσ πτυχζσ του μθχανιςμοφ κατάλυςθσ (Podjarny et al., 2004; Steuber et al., 2007b; Steuber et al., 2006; Varnai and Warshel, 2000). Σε γενικά πλαίςια, θ κινθτικι του μθχανιςμοφ κατάλυςθσ τθσ ALR2 διεκπεραιϊνεται από μια αλλθλουχία γεγονότων που ξεκινοφν με τθν ςφνδεςθ του ςυνενηφμου NADPH που προθγείται τθσ ςφνδεςθσ του αλδεχδικοφ υποςτρϊματοσ, ςτθ ςυνζχεια πραγματοποιείται θ αναγωγι του υποςτρϊματοσ ςτθν αντίςτοιχθ αλκοόλθ, ακολουκεί θ απελευκζρωςθ τθσ αλκοόλθσ από το ενεργό κζντρο και τερματίηεται θ διαδικαςία τθσ κατάλυςθσ με τθν απελευκζρωςθ του οξειδωμζνου ςυνενηφμου NADP + (εικόνα 2) (Del Corso et al., 2008; El-Kabbani et al., 1998). Θ ςφνδεςθ και θ απελευκζρωςθ του ςυνενηφμου και του υποςτρϊματοσ ςχετίηεται με αλλαγζσ ςτθ διαμόρωωςθ του ενηφμου. Μια αλλαγι διαμόρωωςθσ που πραγματοποιείται μετά τθν ςφνδεςθ του ςυνενηφμου περιλαμβάνει τθν μετακίνθςθ τθσ safety belt ϊςτε αυτι να καλυωκεί μερικϊσ (Kubiseski et al., 1992), ενϊ ακολουκεί και δεφτερθ αλλαγι διαμόρωωςθσ που αωορά ςτθν ίδια κζςθ μετά τθν πραγματοποίθςθ τθσ καταλυτικισ αντίδραςθσ και ςκοπό ζχει τθν απελευκζρωςθ του ςυνενηφμου (Grimshaw et al., 1990) και αποτελεί και το κακοριςτικό ςτάδιο τθσ όλθσ κατάλυςθσ (Grimshaw et al., 1995). Κα πρζπει να αναωερκεί ςτο ςθμείο αυτό πωσ ςε αντίκεςθ με τον καταλυτικό μθχανιςμό που ιδθ αναπτφχκθκε παραπάνω και είναι κοινά αποδεκτόσ, οι Bohren & Grimshaw (Bohren and Grimshaw, 2000) ανζωεραν stopped-flow κινθτικά δεδομζνα, ςφμωωνα με τα οποία ο αρνθτικά ωορτιςμζνοσ αναςτολζασ ςορβινίλθ ςυνδζεται με το ςφμπλοκο ALR2-NADP + και όχι με το ςφμπλοκο ALR2-NADPΘ. 33

34 ΕΙΚΟΝΑ 2: μθχανιςμόσ κατάλυςθσ τθσ αναγωγισ αλδεχδϊν από τθν ALR2 (Del Corso et al., 2008) Μελζτεσ μοριακισ προςομοίωςθσ και κρυςταλλογραωίασ που ζχουν διεξαχκεί μζχρι ςιμερα αναδεικνφουν πωσ θ αλλθλεπίδραςθ με διάωορουσ αναςτολείσ οδθγεί ςε ςθμαντικζσ αλλαγζσ ςτθ διαμόρωωςθ του ενεργοφ κζντρου του ενηφμου (Urzhumtsev et al., 1997). Το υπό μελζτθ ζνηυμο είναι δυνατό να βρεκεί ςε τουλάχιςτο τρεισ δυνατζσ διαμορωϊςεισ, με εμωανι ωαινόμενα επαγόμενθσ προςαρμογισ ( induced-fit ωαινόμενα) κατά τθ ςφνδεςθ του υποςτρϊματοσ (Klebe et al., 2004; Sotriffer et al., 2004). Θ ωφςθ τθσ περιοχισ ςφνδεςθσ των διαωόρων υποςτρωμάτων τθσ ALR2 (ενεργό κζντρο) είναι διττόσ και ωαίνεται πωσ αποτελείται από μια περιοχι που θ διαμόρωωςθ τθσ διατθρείται ςχεδόν πάντα και μια άλλθ που εμωανίηει ιδιαίτερθ ελαςτικότθτα όςο αωορά τθν διαμόρωωςθ τθσ ςτο χϊρο (εικόνα 3). Με βάςθ μελζτεσ κερμοδυναμικισ ςτακερότθτασ, τζτοιου είδουσ διττι ωφςθ των κζντρων ςφνδεςθσ των ενηφμων αποτελοφν ςθμαντικά λειτουργικά χαρακτθριςτικά των πρωτεϊνϊν με ενηυμικι δράςθ (Urzhumtsev et al., 1997). Ριο ςυγκεκριμζνα, θ κοιλότθτα ςφνδεςθσ ανιόντων από τα υπόλοιπα Trp20 ωσ τθν Tyr48 και Val147, κακϊσ και από τα υπόλοιπα His110 ωσ τθν Trp79, μαηί και με το NADP + εμωανίηονται τζλεια αλλθλεπικαλυπτόμενα κατά τισ υπερκετικζσ απεικονίςεισ του ενεργοφ κζντρου με ςυνδεδεμζνουσ διάωορουσ ARIs. Αντίκετα, το τμιμα μεταξφ των υπολοίπων Val297-Leu300 και οι γειτονικζσ περιοχζσ που οριοκετοφνται από τα υπόλοιπα Trp219, Cys303 και Tyr309 εμωανίηουν διαωορετικζσ διαμορωϊςεισ ανάλογα με τον εκάςτοτε ARI. Το υπόλοιπο Leu300 είναι αυτό που επιδζχεται τα πιο ζντονα ωαινόμενα επαγόμενθσ προςαρμογισ. 34

35 ΕΙΚΟΝΑ 3: ςχθματικι αναπαράςταςθ του κζντρου ςφνδεςθσ τθσ ALR2. Οι χρωματικζσ διαβακμίςεισ αναωζρονται ςτο βακμό ελαςτικότθτασ με το κόκκινο για τισ περιςςότερο επιρρεπείσ ςε αλλαγζσ διαμόρωωςθσ και μπλε για τθν λιγότερο ωσ κακόλου επιρρεπείσ ςε αλλαγζσ διαμόρωωςθσ (Sotriffer et al., 2004) Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτοφν ιδιαίτερα οριςμζνοι παράγοντεσ εκλεκτικότθτασ όςο αωορά ςτθν αναςτολι τθσ ALR2. Ππωσ ζχει ιδθ αναωερκεί το ζνηυμο τθσ ALR2 αποτελεί μζλοσ τθσ οικογζνειασ των AKRs, που αποτελείται από μονομερείσ πρωτεΐνεσ με αμινοξζα και μοριακό βάροσ 36kDa (Jez et al., 1997b). Άλλο μζλοσ των AKRs είναι θ αναγωγάςθ των αλδεχδϊν (aldehyde reductase, ALR1; EC ) και αποτελεί πλζον κοινι πεποίκθςθ πωσ το μθ ικανοποιθτικό ωαρμακοδυναμικό προωίλ πολλϊν ARIs κατά τισ κλινικζσ μελζτεσ οωείλεται ςτθν παράλλθλθ αναςτολι των ομόλογων ενηφμων ALR2 και ALR1 (El-Kabbani et al., 2005). Τα ζνηυμα ALR1 και ALR2 εμωανίηουν ςθμαντικι δομικι ομολογία (~65% ομοιότθτα όςο αωορά ςτθν αλλθλουχία των αμινοξζων αλλά και ςτθν τεταρτοταγι δομι) (Dhagat et al., 2008; El- Kabbani et al., 1998; Steuber et al., 2008). Και τα δυο ομόλογα ζνηυμα αποτελοφνται από β/α μοτίβο ενϊ το ενεργό τουσ κζντρο αποτελείται από δυο κοιλότθτεσ, τθν κοιλότθτα ςφνδεςθσ ανιόντων και μια δεφτερθ κοιλότθτα, τθν κοιλότθτα εκλεκτικότθτασ, που ςυνορεφει με τθν Trp114 και το C-τελικό άκρο των ενηφμων. Στθν κοιλότθτα ςφνδεςθσ των ανιόντων, με τα υπόλοιπα Tyr48, His110 και Trp113 για τθν ALR2 και τα υπόλοιπα Tyr50, His113 και Trp115 ςτθν περίπτωςθ τθσ 35

36 ALR1, εντοπίηεται ςυνδεδεμζνο το NADPH και επιτρζπει τθν απόςπαςθ υδριδίου από τον C-4 ςτθν ομάδα του καρβονυλίου του υποςτρϊματοσ ενϊ ζνα πρωτόνιο προςωζρεται από το υπόλοιπο Tyr48 ι Tyr50 για τθν ALR2 και ALR1 αντίςτοιχα. Επομζνωσ υπάρχουν πολλζσ ομοιότθτεσ ςτον τρόπο ςφνδεςθσ των υποςτρωμάτων με τα παρόμοια ενεργά κζντρα ενϊ ςε περιπτϊςεισ εκλεκτικισ ςφνδεςθσ ςθμαντικό ρόλο διαδραματίηουν αλλθλεπιδράςεισ με τα διαωορετικά υπόλοιπα μεταξφ των AKRs ςτθν κοιλότθτα του C-τελικοφ άκρου, το οποίο είναι μοναδικό για κάκε μζλοσ των AKRs (Bohren et al., 1992) και αποτελεί τθν περιοχι που ευκφνεται για τθν εκλεκτικότθτα ςφνδεςθσ των διαωόρων υποςτρωμάτων με τα μζλθ των AKRs κακϊσ και τθν καταλυτικι δράςθ (Barski et al., 1996). Συγκεκριμζνα, θ κυριότερθ διαωορά μεταξφ των προαναωερόμενων ομόλογων ενηφμων είναι θ αντικατάςταςθ των υπολοίπων Ala299, Leu300, Leu301, Ser302, και Cys303 ςτθν ALR2 από τα υπόλοιπα Val300, Pro301, Met302, Arg312 και Asp313 ςτθν ALR1, τα οποία δθμιουργοφν και μια επιπλζον κοιλότθτα με 10 αμινοξζα μεταξφ των υπολοίπων Met302 και Arg312 ςτο C-τελικό άκρο τθσ ALR1 (El-Kabbani et al., 1998; Rees-Milton et al., 1998; Steuber et al., 2008). Θ επιπλζον αυτι κοιλότθτα ςτθν ALR1 δε ςυμβάλει ιδιαίτερα ςτθν διαωοροποίθςθ τθσ μορωολογίασ του ενεργοφ κζντρου αλλά ςτισ δυναμικζσ του ιδιότθτεσ. Τζλοσ, άλλεσ διαωορζσ που εντοπίηονται μεταξφ των υπό εξζταςθ ομόλογων ενηφμων είναι θ αντικατάςταςθ των υπολοίπων Val47(ALR2) από Λle49(ALR1), Thr113(ALR2) από Tyr116(ALR1), Phe121(ALR2) από Pro124(ALR1) και Cys298(ALR2) από Ile (ALR1) (Steuber et al., 2008). Λδιαίτερο ενδιαωζρον παρουςιάηει το γεγονόσ πωσ ενϊ ο αναςτολζασ ςορβινίλθ αναςτζλλει τόςο τθν ALR2 όςο και τθν ALR1 με παρόμοιεσ τιμζσ IC 50 (2μΜ και 5.4μΜ αντίςτοιχα), οι αναςτολείσ τολρεςτάτθ και ηοπολρεςτάτθ αναςτζλλουν αποτελεςματικότερα τθν ALR2 απ ότι τθν ALR1 (τιμζσ IC μΜ και 0.06μΜ για ALR2 και 0.72μΜ και 27μΜ για ALR1 αντίςτοιχα) (Barski et al., 1995). Κρυςταλλογραωικζσ μελζτεσ, κακϊσ και μελζτεσ μοριακισ προςομοίωςθσ των δυο ενηφμων κατά τθν ςφνδεςθ τουσ με τουσ προαναωερόμενουσ αναςτολείσ ζδειξαν πωσ τα υπόλοιπα του ενεργοφ κζντρου που μετζχουν ςτθν ςφνδεςθ τθσ ςορβινίλθσ είναι τα ίδια ςτα υπό ςυηιτθςθ ομόλογα ζνηυμα. Αντίκετα, ςτθν περίπτωςθ εκλεκτικισ ςφνδεςθσ με τθν ALR2 ςθμαντικό ρόλο διαδραματίηει θ αλλθλεπίδραςθ με υπόλοιπα που εντοπίηονται ςτο C-άκρο του ενηφμου, ςτθν «κοιλότθτα εκλεκτικότθτασ» (Urzhumtsev et al., 1997). Οι δυο εκλεκτικοί αναςτολείσ, μετά τθ ςφνδεςθ τουσ με το ενεργό κζντρο τθσ ALR2 προκαλοφν αλλαγι ςτθ διαμόρωωςθ του ενηφμου ( induced-fit ωαινόμενα) και εκδθλϊνουν τθ δράςθ τουσ. Κάτι τζτοιο δεν πραγματοποιείται ςτθν περίπτωςθ τθσ ALR1 εξαιτίασ του γεγονότοσ πωσ τα υπόλοιπα Leu300, Thr113 και Ser302 ςτθν ALR2 είναι αντικατεςτθμζνα με υπόλοιπα Pro301, Tyr115 και τθν προαναωερόμενθ επιπλζον κοιλότθτα ςτθν ALR1. Θ ειςαγωγι τθσ επιπλζον κοιλότθτασ διαωοροποιεί τθ ωφςθ του κζντρου ςφνδεςθσ ςτθν ALR1 και αυτό μπορεί να ερμθνεφςει τθ διαωορετικι ικανότθτα ςφνδεςθσ τθσ τολρεςτάτθσ. Επιπλζον, ςτθν περίπτωςθ τθσ ηοπολρεςτάτθσ, θ αντικατάςταςθ τθσ Thr113 ςτθν ALR2 από Tyr115 ςτθν ALR1 προκαλεί κατάλθψθ του χϊρου που προορίηεται για το μόριο του αναςτολζα ςτο ςφμπλοκο ηοπολρεςτάτθ-alr2. Από μελζτεσ ςφγκριςθσ τθσ ικανότθτασ ςφνδεςθσ του εκλεκτικοφ αναςτολζα ωινταρεςτάτθ με τα δυο αυτά ζνηυμα (El-Kabbani and Podjarny, 2007; El-Kabbani et al., 2005; Petrova et al., 2005) 36

37 διευκρινίηονται μερικοί ακόμα παράγοντεσ εκλεκτικότθτασ. Ο ςχθματιηόμενοσ δεςμόσ υδρογόνου μεταξφ τθσ εξωκυκλικισ αμιδικισ ομάδασ με το υπόλοιπο Leu300 τθσ ALR2, που δεν εμωανίηεται ςτθν περίπτωςθ τθσ ςφνδεςθσ με τθν ALR1, οφτε αντικακίςταται από κάποια άλλθ παρόμοια αλλθλεπίδραςθ αωοφ ςε αυτι τθ κζςθ υπάρχει το υπόλοιπο Pro301 που δεν προςωζρει δυνατότθτα ςχθματιςμοφ δεςμϊν υδρογόνου, επιτρζπει τθν ελεφκερθ περιςτροωι τθσ εξωκυκλικισ αμιδικισ ομάδασ του αναςτολζα. Επίςθσ θ ανοικτι διαμόρωωςθ τθσ Trp220 που παρατθρείται ςτθν ALR1 μετά από τθ ςφνδεςθ με τθν ωινταρεςτάτθ ςυμβάλλει ςτθν μειωμζνθ ικανότθτα τθσ τελευταίασ να ςυνδεκεί με το ζνηυμο. Τζλοσ κα πρζπει να αναωερκεί πωσ ςτθν περίπτωςθ τθσ ALR1 θ παρουςία των υπολοίπων Arg312 και Asp313 ςυνειςωζρουν ςθμαντικά ςτθν ςυνολικι ενκαλπία κατά τθ ςφνδεςθ υποςτρωμάτων που περιζχουν ςυνολικά θλεκτραρνθτικζσ ομάδεσ όπωσ αλογόνα και καρβοξφλια (Carbone et al., 2009) ΕΜΠΛΟΚΗ ΣΗ ALR2 Ε ΠΑΘΟΥΤΙΟΛΟΓΙΚΕ ΚΑΣΑΣΑΕΙ ΡΟΛΟ ΣΗ ALR2 Ε ΟΜΟΙΟΣΑΣΙΚΟΤ ΜΗΦΑΝΙΜΟΤ Θ ALR2 παρουςιάηει ευρφ ωάρμα υποςτρωμάτων που περιλαμβάνει ςτεροειδι, κατεχολαμίνεσ, ςάκχαρα, λίπθ και ξενοβιοτικά (Grimshaw, 1992; Petrash, 2004). Σε ςυμωωνία με τθν ιδιαίτερα λιπόωιλθ ωφςθ του ενεργοφ κζντρου του ενηφμου (Wilson et al., 1992), πλικοσ υδρόωοβων αλδεχδϊν αποτελοφν υποςτρϊματα τθσ ALR2 με τιμζσ Km μεταξφ μM (Srivastava et al., 1999) με ενδεικτικό παράδειγμα τθν τοξικι αλδεψδθ 4-υδροξυ-ενεάλθ (4- hydroxy-nonenal, ΘΝΕ) που ζχει τιμι Km 22μM (Srivastava et al., 2000; Vander Jagt et al., 1995). Φωςωολιπιδικισ ωφςθσ αλδεψδεσ ζχουν επίςθσ βρεκεί πωσ ανάγονται από τθν ALR2 (Spite et al., 2007). Λδιαίτερο ενδιαωζρον παρουςιάηει το γεγονόσ πωσ θ ςφηευξθ με γλουτακειόνθ (glutathione, GSH) οριςμζνων λιπόωιλων αλδεχδϊν προάγει τθν αναγωγι τουσ από το υπό ςυηιτθςθ ζνηυμο (Ramana et al., 2000), και επιπλζον ζχει βρεκεί και ειδικό ςθμείο ςφνδεςθσ τθσ GSH ςτο ενεργό κζντρο τθσ ALR2 (Ramana et al., 2001). Πλα τα προαναωερόμενα in vitro ςτοιχεία αποτελοφν ενδείξεισ αν όχι αποδείξεισ πωσ το υπό ανάλυςθ ζνηυμο κατζχει και πικανό ρόλο αποτοξίνωςθσ από τοξικζσ αλδεψδεσ (Barski et al., 2008; Ramana et al., 2001). Στουσ περιςςότερουσ ιςτοφσ όπου εντοπίηεται θ ALR2 δεν ζχει ακόμα εξακριβωκεί το ποια είναι τα ενδογενι υποςτρϊματα και επομζνωσ ποιοσ ο πικανόσ ωυςιολογικόσ τθσ ρόλοσ. Στουσ νεωροφσ είναι κοινά αποδεκτό πωσ το ωυςιολογικό υπόςτρωμα τθσ ALR2 είναι θ γλυκόηθ (Petrash, 2004), θ οποία ανάγεται προσ ςορβιτόλθ, ζναν ενδογενι ωςμωλφτθ, με ςκοπό τθν ιςορρόπθςθ τθσ ωςμωτικισ πίεςθσ ςτο εςωτερικό του νεωροφ (Alexiou et al., 2009; Moriyama et al., 1989). Πμοια, ςτα ςπερματοηωάρια, το ωυςιολογικό υπόςτρωμα τθσ ALR2 είναι και πάλι θ γλυκόηθ, που ςε αυτι τθ περίπτωςθ χρθςιμοποιείται με τελικό ςκοπό τθν παραγωγι ωρουκτόηθσ για τθν εξαςωάλιςθ τθσ απαραίτθτθσ ενζργειασ που απαιτείται για τθν ωρίμανςθ τουσ (Alexiou et al., 2009; Frenette et al., 2006; Kobayashi et al., 2002; Sullivan et al., 2005). 37

38 ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΗ ΣΗ ΜΕΣΑΒΟΛΙΚΗ ΟΔΟΤ ΣΨΝ ΠΟΛΤΟΛΨΝ ΚΑΙ ΕΠΑΚΟΛΟΤΘΕ ΒΙΟΦΗΜΙΚΕ/ΜΕΣΑΒΟΛΙΚΕ ΔΙΕΡΓΑΙΕ Σε ωυςιολογικζσ ςυνκικεσ, όπου τα εξωκυτταρικά επίπεδα γλυκόηθσ είναι περίπου 5mM, το μεγαλφτερο μζροσ τθσ ενδοκυτταρικισ γλυκόηθσ ειςζρχεται ςτθν μεταβολικι οδό τθσ εξοκινάςθσ (hexokinase, HK) με ςκοπό τθν γλυκόλυςθ και τθν παραγωγι ενζργειασ για το κφτταρο και μόνο το 1-3% ειςζρχεται ςτθν οδό των πολυολϊν. Σε υψθλζσ όμωσ ςυγκεντρϊςεισ γλυκόηθσ επζρχεται κορεςμόσ τθσ οδοφ τθσ ΘΚ και παρά τθ χαμθλι τιμι Km τθσ ALR2 για τθ γλυκόηθ (30-80mM), παρατθρείται αυξθμζνθ ροι από τθν οδό των πολυολϊν που μπορεί να ωτάςει ποςοςτό 30-50% (Qiu et al., 2008) (ςχιμα 1). Θ ενεργοποίθςθ τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν αωορά ςτθν μετατροπι τθσ γλυκόηθσ προσ ςορβιτόλθ από τθν ALR2 με κατανάλωςθ του ελεφκερου κυτοςολικοφ NADPH και παραγωγι τθσ οξειδωμζνθσ του μορωισ NADP +. Στθ ςυνζχεια θ ςορβιτόλθ οξειδϊνεται από το δεφτερο ζνηυμο τθσ μεταβολικισ αυτισ οδοφ, τθν αωυδρογωνάςθ τθσ ςορβιτόλθσ (sorbitol dehydrogonase, SDH; L-iditol:NAD+ 2-oxidoreductase; EC ) προσ ωρουκτόηθ με ταυτόχρονθ αναγωγι του ελεφκερου κυτοςολικοφ NAD + ςε NADH (ςχιμα 1). ΧΘΜΑ 1: ςχθματικι απεικόνιςθ των μεταβολικϊν οδϊν τθσ γλυκόηθσ Θ αυξθμζνθ ροι διαμζςου τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν και θ ενεργοποίθςθ τθσ ALR2 ζχει ωσ επακόλουκο τθν εκκίνθςθ μιασ αλλθλουχίασ βιοχθμικϊν και μεταβολικϊν διεργαςιϊν που ςυνδζονται με τα ςυςτιματα των ςυνενηφμων NADPH/NADP + και NAD + /NADH και οδθγοφν ςτθν πρόκλθςθ ωςμωτικοφ ςτρεσ, οξειδωτικοφ ςτρεσ, αναγωγικοφ ςτρεσ (ψευδοχποξία), γλυκοηυλιωτικοφ ςτρεσ και ςτρεσ τθσ πρωτεϊνικισ κινάςθσ C (protein kinase C,PKC) (Obrosova, 2005)(εικόνα 4). 38

39 ΕΙΚΟΝΑ 4: απεικόνιςθ τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν και θ ςφνδεςθ με κφριεσ μεταβολικζσ/βιοχθμικζσ διεργαςίεσ ωσ αποτζλεςμα τθσ ενεργοποίθςθσ αυτισ (προζλευςθ ςχιματοσ από (Oates, 2008)) I. Ωςμωτικό ςτρεσ Το ωςμωτικό ςτρεσ προκαλείται από τθν ενδοκυτταρικι ςυςςϊρευςθ ςορβιτόλθσ, ενόσ ιδιαίτερα υδρόωιλου ωςμωλφτθ που δφςκολα διαχζεται εκτόσ του κυττάρου, και οδθγεί ςε ανιςορροπία των επιπζδων θλεκτρολυτϊν, ειςροι νεροφ ςτο κφτταρο, διόγκωςθ και τελικι λφςθ αυτοφ (Demopoulos et al., 2005; Srivastava et al., 2005). Άλλο ζνα ωαινόμενο που ςχετίηεται άμεςα με τθν ςυςςϊρευςθ ςορβιτόλθσ είναι και θ κζνωςθ των επιπζδων τθσ μυο-ινοςιτόλθσ (myo-inositol, ΜΛ) (Thomas et al., 1994) και τθσ τυρίνθσ (2-αμινο-αικανοςουλωονικό οξφ) (Hansen, 2001), μόρια που επίςθσ χαρακτθρίηονται ωσ ενδοκυτταρικοί ωςμωλφτεσ και ςχετίηονται με τθν ρφκμιςθ τθσ ϊςμωςθσ ςτα κφτταρα. Από τθ ςτιγμι που τα επίπεδα τθσ ςορβιτόλθσ είναι αυξθμζνα και προκειμζνου να διατθρθκεί θ ωςμωτικι ιςορροπία, μειϊνονται τα επίπεδα των άλλων προαναωερόμενων ωςμωλυτϊν (Stevens et al., 1993a; Stevens et al., 1993b). Αυτό όμωσ ζχει ωσ ςυνζπεια τθν παρεμπόδιςθ ομοιοςτατικϊν λειτουργιϊν τουσ όπωσ για παράδειγμα τθν ρφκμιςθ τθσ δράςθσ τθσ Na + -K + - ATPάςθσ (Hansen, 2001). II. Οξειδωτικό ςτρεσ Θ εξάντλθςθ των αποκεμάτων του ςυνενηφμου NADPH κατά τθν αναγωγι τθσ γλυκόηθσ προσ ςορβιτόλθ από τθν ALR2 οδθγεί ςτθν εξαςκζνθςθ τθσ άμυνασ του οργανιςμοφ ενάντια ςε διάωορουσ οξειδωτικοφσ παράγοντεσ με αποτζλεςμα τθν πρόκλθςθ οξειδωτικοφ 39

40 ςτρεσ. Θ κζνωςθ των αποκεμάτων του NADPH παρεμβαίνει άμεςα ςτθν ανακφκλθςθ εωεδρικϊν ςυςτθμάτων οξειδοαναγωγαςϊν με ποικίλεσ κυτταρικζσ λειτουργίεσ, όπωσ αυτό τθσ αναγωγάςθσ τθσ GSH (glutathione reductase, GR). Θ GR ανάγει τθν οξειδωμζνθ GSH (GSSG) ςε ανθγμζνθ (GSH) και αποτελεί κοινά αποδεκτό αντιοξειδωτικό μθχανιςμό του οργανιςμοφ (Oates, 2008). Ωσ επακόλουκο όλθσ τθσ προαναωερόμενθσ αλλθλουχίασ γεγονότων είναι θ μείωςθ τθσ ικανότθτασ των κυττάρων να αντεπεξζλκουν ςε οξειδωτικά ερεκίςματα και θ ζκκεςθ τουσ ςε ελεφκερεσ ρίηεσ που παράγονται κατά τθ διάρκεια των διαωόρων ωυςιολογικϊν ι μθ κυτταρικϊν λειτουργιϊν. Επίςθσ τα αυξθμζνα επίπεδα NADH ζχουν ωσ αποτζλεςμα αφξθςθ τθσ οξειδωτικισ ωωςωορυλίωςθσ ςτα μιτοχόνδρια από τθν αναπνευςτικι αλυςίδα που είναι κοινά αποδεκτό πωσ αποτελεί πθγι παραγωγισ ROS και οξειδωτικοφ ςτρεσ (Figueroa-Romero et al., 2008; Rolo and Palmeira, 2006). Επιπλζον, θ ςυςςϊρευςθ ςορβιτόλθσ και θ πρόκλθςθ ωςμωτικοφ ςτρεσ μπορεί να προκαλζςει και οξειδωτικό ςτρεσ διαμζςου τθσ μείωςθσ των επιπζδων τθσ ταυρίνθσ, θ οποία ζχει προτακεί πωσ κατζχει και αντιοξειδωτικι δράςθ παρεμποδίηοντασ το ςχθματιςμό GSSG και αναςτζλλοντασ τθν λιπιδικι υπεροξείδωςθ (Gossai and Lau-Cam, 2009; Stevens et al., 1993b; Tadolini et al., 1995). III. Αναγωγικό ςτρεσ Θ κεωρία του αναγωγικοφ ςτρεσ (ψευδοχποξία) εςτιάηει ςτθν κατανάλωςθ του NAD + κατά τθν οξείδωςθ τθσ ςορβιτόλθσ προσ ωρουκτόηθ από τθν SDH. Το γεγονόσ αυτό προκαλεί αναςτροωι τθσ κυτοςολικισ οξειδωαναγωγικισ κατάςταςθσ (αυξθμζνοσ λόγοσ NADH/NAD + ), ςυντθρϊντασ με αυτό τον τρόπο ωαινότυπο υποξίασ (Obrosova et al., 2001; Srivastava et al., 2005). Θ χρόνια αναςτροωι τθσ προαναωερόμενθσ οξειδωαναγωγικισ κατάςταςθσ ςυμβάλει εκτόσ από τθν ενεργοποίθςθ τθσ PKC (αναλφεται παρακάτω) και ςτθν αφξθςθ των επιπζδων τθσ ελεφκερθσ ρίηασ Ο 2- άρα πρόκλθςθ οξειδωτικοφ ςτρεσ διαμζςου τθσ αφξθςθσ τθσ δράςθσ τθσ NAD(P)H οξειδάςθσ από τθν PKC κακϊσ και του μεταβολιςμοφ των μιτοχονδρίων. IV. Γλυκοηυλιωτικό ςτρεσ Το γλυκοηυλιωτικό ςτρεσ αποτελεί άλλθ μια διεργαςία που ςχετίηεται, τουλάχιςτο εν μζρει, με τθν ενεργοποίθςθ του μεταβολικοφ μονοπατιοφ των πολυολϊν. Θ ωρουκτόηθ, προϊόν τθσ οξείδωςθσ τθσ ςορβιτόλθσ από τθν SDH κεωρείται πωσ είναι περιςςότερο δραςτικι από τθν γλυκόηθ εξαιτίασ τθσ δυνατότθτασ να υιοκετιςει ευκολότερα διαμόρωωςθ εκτεταμζνθσ/ανοικτισ αλυςίδασ (Roscic and Horvat, 2006). Ζχοντασ λοιπόν τθν κατάλλθλθ διαμόρωωςθ, αλλθλεπιδρά με τισ ελεφκερεσ αμινομάδεσ των αμινοξζων οδθγϊντασ ςτο ςχθματιςμό βάςεων Schiff και μετατοπίςεων Amadori. Mε περαιτζρω μετακζςεισ κατά τισ αντιδράςεισ Maillard παρατθρείται ο ςχθματιςμόσ των τελικϊν προϊόντων γλυκοηυλίωςθσ των πρωτεϊνϊν (advanced glycation end products, AGEs) (Peyroux and Sternberg, 2006). Επιπρόςκετα, θ ωρουκτόηθ μετατρζπεται ςε 3-ωωςωορικι ωρουκτόηθ (fructose-3- phosphate, F3P) από τθν 3-ωωςωορικι κινάςθ, με τελικό αποτζλεςμα το ςχθματιςμό τθσ 3- δεςοξυ-γλυκοςόνθσ (3-deoxyglucosone, 3-DOGzn) που αποτελεί πρόδρομο ζνωςθ των 40

41 AGEs (Tsukushi et al., 1999). Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτεί πωσ ουςίεσ πρόδρομεσ των AGEs ςχθματίηονται και από τθν οδό τθσ ΘΚ. Ο ςχθματιςμόσ των AGEs μζςω τθσ οδοφ των πολυολϊν και θ αλλθλεπίδραςθ τουσ με τουσ υποδοχείσ των AGEs (RAGE) αποτελεί το εναρκτιριο ζναυςμα για μια ςειρά μεταγωγικϊν ςθμάτων και ενεργοποίθςθ βιοχθμικϊν οδϊν που μεταξφ των άλλων προκαλοφν τθν παραγωγι ROS και εγκατάςταςθ οξειδωτικοφ ςτρεσ (Alexiou et al., 2010). V. PKC ςτρεσ Τα αυξθμζνα επίπεδα γλυκόηθσ εκτόσ από τθν ενεργοποίθςθ τθσ ALR2 προκαλοφν κορεςμό τθσ οδοφ τθσ ΘΚ με λογικό επακόλουκο τθν αφξθςθ των επιπζδων τθσ ωωςωορικισ διυδροξυ-ακετόνθσ (dihydroxyacetone phosphate, DHAP) και τθσ δεχδρογονάςθσ τθσ 3- ωωςωορικισ γλυκερόλθσ (glycerol-3-phosphate dehydrogenase, G3PDH). Θ ςυςςϊρευςθ DHAP και G3PDH επιτείνεται και από τθν αφξθςθ του λόγου NADH/NAD + που ιδθ ζχει αναλυκεί παραπάνω κακϊσ και από τθν μειωμζνθ δραςτικότθτα τθσ δεχδρογονάςθσ τθσ 3- ωϊςωορικισ γλυκεραλδεψδθσ (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GA3PDH), ζνα ζνηυμο ιδιαίτερα ευαίςκθτο ςε απενεργοποίθςθ από οξειδωτικό ςτρεσ (Ramana et al., 2005). Ο ςυνδυαςμόσ των αυξθμζνων επιπζδων DHAP και NAD + προάγει τθ ςφνκεςθ τθσ διακυλογλυκερόλθσ (diacylglycerol, DAG) δια μζςου του ενηφμου G3PDH, με τελικό αποτζλεςμα τθν ενεργοποίθςθ τθσ PKC (Ramana et al., 2004b), με περαιτζρω ενεργοποίθςθ των επαγόμενων από μιτογόνα πρωτεϊνικϊν κιναςϊν (mitogen-activated protein kinases, MAPKs) που ωωςωορυλιϊνουν μεταγραωικοφσ παράγοντεσ και ζτςι είναι δυνατό να τροποποιιςουν τθν ζκωραςθ γονιδίων και να οδθγιςουν ςε απόπτωςθ (Vincent et al., 2004). Ο τρόποσ με τον οποίο όλεσ οι προαναωερόμενεσ βιοχθμικζσ διεργαςίεσ επιδροφν ςτθν κυτταρικι λειτουργία εξαρτάται από τον τφπο του ιςτοφ ι οργάνου. Συνεπϊσ, θ επίδραςθ τθσ ενεργοποίθςθσ τθσ ALR2 δια μζςω τθσ οδοφ των πολυολϊν τόςο ςτθν πρόκλθςθ των διαβθτικϊν επιπλοκϊν όςο και ςε πλικοσ άλλων χρόνιων πακολογικϊν καταςτάςεων αποτελεί ζνα ςφνκετο ωαινόμενο ALR2 & ΦΡΟΝΙΕ ΕΠΙΠΛΟΚΕ ΣΟΤ ΑΚΦΑΡΨΔΗ ΔΙΑΒΗΣΗ Ο ςακχαρϊδθσ διαβιτθσ αποτελεί μια μεταβολικι αςκζνεια θ οποία χαρακτθρίηεται από αφξθςθ τθσ ςυγκζντρωςθσ του ςακχάρου ςτο αίμα (υπεργλυκαιμία) και διαταραχι του μεταβολιςμοφ τθσ γλυκόηθσ, είτε ωσ αποτζλεςμα ελαττωμζνθσ ι παντελοφσ ζλλειψθσ ζκκριςθσ ινςουλίνθσ είτε λόγω ελάττωςθσ τθσ ευαιςκθςίασ των κυττάρων του ςϊματοσ ςτθν ινςουλίνθ (Bresson and von Herrath, 2004; Panunti et al., 2004). Ρρόςωατθ μελζτθ ςχετικά με τθν επιδθμιολογία του ςακχαρϊδθ διαβιτθ παγκοςμίωσ αναωζρει πωσ το 2.8% (171 εκατομμφρια αςκενείσ) του παγκόςμιου πλθκυςμοφ ζπαςχε από τθ νόςο το 2000, και το ποςοςτό αυτό εκτιμάται πωσ κα ωτάςει το 4.4% (366 εκατομμφρια αςκενείσ) το 2030 (Wild et al., 2004). Σφμωωνα με παρόμοια μελζτθ ςτθν Ελλάδα το 7.6% των αντρϊν και το 5.9% των γυναικϊν (~ αςκενείσ) πάςχουν από ςακχαρϊδθ διαβιτθ, ενϊ 1 ςτουσ 5 αςκενείσ ζχει πλιρθ άγνοια για τθν κατάςταςθ του (Panagiotakos et al., 2005). Ο διαβιτθσ είναι ςυχνότεροσ 41

42 ςτον ανεπτυγμζνο κόςμο (ιδιαίτερα ο διαβιτθσ τφπου 2) και ωαίνεται ότι ςυνδζεται άμεςα με το δυτικό τρόπο ηωισ που περιλαμβάνει τθ διαβίωςθ ςτα μεγάλα αςτικά κζντρα, τον ανκυγιεινό τρόπο διατροωισ και τθν κακιςτικι ηωι. Ο ςακχαρϊδθσ διαβιτθσ ζχει χρόνια πορεία και μπορεί να προκαλζςει μια ςειρά ςοβαρϊν επιπλοκϊν που ταξινομοφνται ςε μικροαγγειοπάκειεσ (αμωιβλθςτροειδοπάκεια, νευροπάκεια και νεωροπάκεια), μακροαγγειοπάκειεσ (αρτθριοςκλιρυνςθ, ςτεωανιαία νόςοσ και περιωερικι αγγειοπάκεια) και άλλεσ μθ αγγειακζσ όπωσ ευπάκεια ςε λοιμϊξεισ, υπερλιπιδαιμίεσ, λιπϊδθσ διικθςθ του ιπατοσ και περιοδοντίτιδα (Hornick and Aron, 2008; Tripathi and Srivastava, 2006). Ο κφριοσ ςφνδεςμοσ μεταξφ ςακχαρϊδθ διαβιτθ και των χρόνιων διαβθτικϊν επιπλοκϊν είναι ευρζωσ αποδεκτό πωσ είναι θ κατάςταςθ τθσ υπεργλυκαιμίασ εξαιτίασ τθσ αδυναμίασ ικανοποιθτικισ ρφκμιςθσ των επιπζδων γλυκόηθσ ςτουσ διαβθτικοφσ αςκενείσ (Rolo and Palmeira, 2006). Οι προτεινόμενοι μοριακοί μθχανιςμοί που εμπλζκονται ςτθ πακογζνεςθ των διαβθτικϊν επιπλοκϊν είναι κυρίωσ θ ενεργοποίθςθ τθσ οδοφ των πολυολϊν, ο ςχθματιςμόσ AGEs, θ επαγόμενθ από τθ γλυκόηθ ενεργοποίθςθ τθσ PKC και θ παραγωγι ROS. O Nishikawa και οι ςυνεργάτεσ του (Nishikawa et al., 2000) πρότειναν πωσ ο ςυνδετικόσ κρίκοσ μεταξφ των διαωόρων βιοχθμικϊν ανωμαλιϊν που παρατθροφνται ςτουσ διαβθτικοφσ αςκενείσ είναι ι θ ενεργοποίθςθ τθσ ALR2 του μεταβολικοφ ςυςτιματοσ των πολυολϊν ι θ παραγωγι ROS. Ο Brownlee και οι ςυνεργάτεσ του (Brownlee, 2001) ςυμπζραναν πωσ ο αυξθμζνοσ ςχθματιςμόσ υπεροξειδίων από τθν αλυςίδα μεταωοράσ θλεκτρονίων των μιτοχονδρίων αποτελεί τον κφριο γνϊριςμα που ςυνδζει όλουσ τουσ προαναωερόμενουσ μοριακοφσ μθχανιςμοφσ διαβητική αμφιβληςτροειδοπάθεια Κακϊσ ο αμωιβλθςτροειδισ χιτϊνασ του οωκαλμοφ επθρεάηεται ςθμαντικά από τον αερόβιο μεταβολιςμό, αλλαγζσ ςτθν οξειδοαναγωγικι κατάςταςθ που παρατθροφνται ςε διαβθτικοφσ αςκενείσ αποτελοφν μια από τισ αιτίεσ πρόκλθςθσ τθσ διαβθτικισ αμωιβλθςτροειδοπάκειασ. Ιδθ ζχει γίνει λόγοσ για μειωμζνα επίπεδα του λόγου NAD + /NADH ςε περιπτϊςεισ διαβιτθ ενϊ ιδιαίτερθ ζμωαςθ κα πρζπει να δοκεί ςτα αποτελζςματα μιασ ζρευνασ που ζδειξε πωσ τα επίπεδα αυτά δεν επθρεάηονται από τθ χοριγθςθ αναςτολζων τθσ SDH, ενϊ είναι πλιρωσ αναςτρζψιμα με τθ χοριγθςθ ARIs (Obrosova et al., 2001). Τα αποτελζςματα αυτά υποδθλϊνουν πωσ θ μειωμζνθ οξειδωτικι ικανότθτα των μιτοχονδρίων δεν είναι αποτζλεςμα τθσ αυξθμζνθσ δράςθσ τθσ SDH, αλλά ςχετίηεται με τθν ενεργοποίθςθ τθσ ALR2. Επίςθσ, το ωςμωτικό ςτρεσ ςτο προςοωκάλμιο ωακό αποδιοργανϊνει τθν κυτταρικι μεμβράνθ προκαλϊντασ διαρροι αμινοξζων, κζνωςθ GSH και MI και τελικά οδθγεί ςτθν εμωάνιςθ καταρράκτθ (Chan et al., 2008). Επιπλζον θ ALR2 εμπλζκεται ςτθν πακογζνεια τθσ διαβθτικισ αμωιβλθςτροειδοπάκειασ διαμζςου πλθκϊρασ μονοπατιϊν μεταγωγισ ςθμάτων όπωσ θ ενεργοποίθςθ του παράγοντα NF-κB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB) με περαιτζρω ρφκμιςθ τθσ πρωτεΐνθσ MCP-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1) που ςυμβάλλει ςτο ςχθματιςμό μεμβρανϊν επί του αμωιβλθςτροειδι (Harada et al., 2006; Mitamura et al., 2006). Επίςθσ, ςτον αμωιβλθςτροειδι χιτϊνα του οωκαλμοφ, ενεργοποίθςθ τθσ ALR2 επάγει τον παράγοντα ανάπτυξθσ VEGF (vascular endothelial growth factor, VEGF). Οι προκαλοφμενεσ 42

43 αλλαγζσ ςτθν αγγειακι διαπερατότθτα και θ πρόκλθςθ του οξειδωτικοφ ςτρεσ είναι διαδικαςίεσ αντιςτρζψιμεσ με τθ χριςθ ARIs (Obrosova et al., 2003). Άλλοσ τρόποσ εμπλοκισ τθσ ALR2 ςτισ υπό ςυηιτθςθ επιπλοκζσ είναι διαμζςου τθσ ενεργοποίθςθσ τθσ πολυ(adp-ριβοηο)πολυμεράςθσ (poly(adp-ribose)polymerase, PARP) (Obrosova et al., 2005). Ενεργοποίθςθ τθσ PARP ωαίνεται να διαδραματίηει κακοριςτικό ρόλο όχι μόνο ςτθν πακογζνεια τθσ διαβθτικισ αμωιβλθςτροειδοπάκειασ αλλά και ςε διαταραχζσ του ενδοκθλίου και μυοκαρδίου κακϊσ και ςτθν διαβθτικι νευροπάκεια (Obrosova and Julius, 2005) καρδιαγγειακέσ επιπλοκέσ Κακϊσ τα αγγειακά ενδοκθλιακά κφτταρα αποτελοφν κφριο ςτόχο του επαγόμενου από τθν υπεργλυκαιμία κυτταρικοφ ςτρεσ, τα μακροωάγα και τα αγγειακά λεία μυϊκά κφτταρα (vascular smooth muscle cells, VSMCs) είναι αυτά που ςυμβάλλουν ςτθν πακογζνεςθ των καρδιαγγειακϊν διαβθτικϊν επιπλοκϊν. Ο κοινόσ παρονομαςτισ των καρδιαγγειακϊν επιπλοκϊν είναι θ διατάραξθ τθσ ιςορροπίασ μεταξφ οξειδωτικϊν και αντιοξειδωτικϊν μθχανιςμϊν ςτα τοιχϊματα των αγγείων με αποτζλεςμα τθν πρόκλθςθ οξειδωτικοφ ςτρεσ (πχ. παραγωγι ROS) και τθν περαιτζρω παρζμβαςθ ςε ομοιοςτατικοφσ μθχανιςμοφσ των αγγείων (εικόνα 5) (Gleissner et al., 2007b; Xiong and Stern, 2005). Θ υπεργλυκαιμία επάγει τθν παραγωγι ROS με πλθκϊρα μθχανιςμϊν, ςυμπεριλαμβανομζνων τθσ ενεργοποίθςθσ τθσ ALR2, του ςχθματιςμοφ AGEs και τθν αλλθλεπίδραςθ αυτϊν με τουσ υποδοχείσ RAGE, κακϊσ και τθν ενεργοποίθςθ τθσ PKC. Θ ενεργοποίθςθ τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν προκαλεί τοξικότθτα ςτα κφτταρα του ενδοκθλίου εξαιτίασ τθσ πρόκλθςθσ οξειδωτικοφ ςτρεσ και καταςτροωισ του DNA, κακϊσ και εξαιτίασ ωςμωτικϊν διαταραχϊν (Oyama et al., 2006). Θ μείωςθ των επιπζδων του NADPH είναι δυνατό να προκαλζςουν δυςλειτουργίεσ ςε πλικοσ NADPH-εξαρτϊμενων ενηφμων ςυμπεριλαμβανομζνων τθσ ςυνκετάςθσ του μονοξειδίου του αηϊτου (ΝΟ-synthase), τθσ GR και του κυτοχρϊματοσ P450. Επιπλζον, τα μεγάλα αποκζματα ATP που παρατθροφνται κατά τθν αυξθμζνθ ροι των πολυολϊν αποτελοφν τα ενεργειακά εωόδια για παραγωγι διαωόρων ενδοκθλιακϊν παραγόντων ανάπτυξθσ (Rosen et al., 2001). Εκτόσ τοφτου, θ ALR2 προκαλεί επαγωγι τθσ PKC και του NF-κB, ωαινόμενα που οδθγοφν ςε αγγειακζσ ωλεγμονϊδεισ καταςτάςεισ με το πιο χαρακτθριςτικό παράδειγμα τθν αρτθριοςκλιρυνςθ (Ramana et al., 2004b). Ωσ απόδειξθ των προαναωερόμενων ωαινομζνων ςτθ πακογζνεςθ αγγειακϊν διαταραχϊν αποτελεί πρόςωατθ ζρευνα που υποςτθρίηει πωσ θ ενεργοποίθςθ τθσ ALR2 ςε πειραματόηωα με ανεπάρκεια υποδοχζων τθσ χαμθλισ πυκνότθτασ λιποπρωτεΐνθσ (low density lipoprotein, LDL) οδιγθςε ςε αυξθμζνο μζγεκοσ ακθρωματικϊν πλακϊν όταν ςτα πειραματόηωα χορθγικθκε ςτρεπτοηοτοκίνθ που οδιγθςε ςτθν πρόκλθςθ διαβιτθ (Gleissner et al., 2007a; Gleissner et al., 2007b). 43

44 ΕΙΚΟΝΑ 5: ςχθματικι παρουςίαςθ των επαγόμενων από τθν υπεργλυκαιμία μθχανιςμών πρόκλθςθσ των διαβθτικών αγγειακών επιπλοκών (Xiong and Stern, 2005) 44

45 διαβητική νευροπάθεια Ρειραματικζσ μελζτεσ δείχνουν πωσ θ πακογζνεια των νευροπακειϊν ςε διαβθτικοφσ αςκενείσ είναι πολυπαραγοντικι, με ποικίλεσ αλλθλεπιδράςεισ μεταξφ μεταβολικϊν και αγγειακϊν ανωμαλιϊν (Simmons and Feldman, 2002). Θ διαβθτικι νευροπάκεια είναι δυνατό να προκλθκεί τόςο από καταςτροωι του νευρικοφ παρεγχφματοσ, όςο και από ιςχαιμία των νεφρων (Sima, 2006). Ο Rosen και οι ςυνεργάτεσ του (Rosen et al., 2001) πρότειναν πωσ θ κατάςταςθ τθσ ψευδοχποξίασ, ςε ςυνδυαςμό με τθν πρόκλθςθ οξειδωτικοφ ςτρεσ διαδραματίηει ςθμαντικό ρόλο. Μια άλλθ εκδοχι από τουσ Vincet και ςυνεργάτεσ (Vincent et al., 2004) εςτιάηει αποκλειςτικά ςτο οξειδωτικό ςτρεσ. Σε όλεσ τισ περιπτϊςεισ το οξειδωτικό ςτρεσ και θ διαταραχι τθσ λειτουργίασ των μιτοχονδρίων ζχει ωσ αποτζλεςμα τθν πρόκλθςθ απόπτωςθσ των νευρικϊν κυττάρων και των κυττάρων Schwann με αποτζλεςμα τθν τελικι και μθ αντιςτρεπτι καταςτροωι των νευρικϊν ινϊν. Άλλθ μια αιτία πρόκλθςθσ τθσ διαβθτικισ νευροπάκειασ είναι και το προκαλοφμενο ωςμωτικό ςτρεσ από τθ ςυςςϊρευςθ ςορβιτόλθσ (Schemmel et al., 2009), που με τθ ςειρά τθσ προκαλεί διαταραχι των επιπζδων ΜΛ, μείωςθ τθσ δράςθσ τθσ Να + -Κ + -ATPάςθσ και κατά ςυνζπεια διατάραξθ τθσ μεταγωγισ νευρωνικϊν ϊςεων διαβητική νεφροπάθεια Θ διαβθτικι νεωροπάκεια εμωανίηεται ωσ αποτζλεςμα ςυνδυαςμοφ αιμοδυναμικϊν και μεταβολικϊν παραγόντων (Soldatos and Cooper, 2008). Αναωορικά, μερικοί από τουσ αιμοδυναμικοφσ παράγοντεσ είναι θ αυξθμζνθ ςυςτθματικι και ενδοςπειραματικι πίεςθ και θ ενεργοποίθςθ του ςυςτιματοσ ρενίνθσ-αγγειοταςίνθσ. Στθν δεφτερθ κατθγορία παραγόντων ανικουν μεταβολικά μονοπάτια εξαρτϊμενα από τθν γλυκόηθ όπωσ αυτό τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν μεταξφ άλλων (πχ. PKC, MAPKs) που προκαλοφν τθν ενεργοποίθςθ πλικουσ μεταγραωικϊν παραγόντων (Sanchez and Sharma, 2009). Το τελικό αποτζλεςμα είναι θ αυξθμζνθ διαπερατότθτα αλβουμίνθσ που προκαλεί αυξθμζνθ πρωτεϊνουρία και ςπειραματοςκλιρυνςθ. Μεταβολζσ ςτθν μορωολογία και λειτουργία των νεωρικϊν κυττάρων ςε καταςτάςεισ διαβιτθ προκαλοφν ςυχνά εμωανείσ δυςλειτουργίεσ. Θ δράςθ τθσ PKC ίςωσ κατζχει πρωταρχικό ρόλο ςτθ πρόκλθςθ τθσ διαβθτικισ νεωροπάκειασ αωοφ θ επαγωγι τθσ δράςθσ τθσ οδθγεί ςε παραγωγι προςταγλανδίνθσ και απϊλεια τθσ ςυςταλτικότθτασ των κυττάρων του ελφτρου του Bowman, οδθγϊντασ με αυτό τον τρόπο ςε υπερδιικθςθ και δυςλειτουργία του ςπειράματοσ (Dunlop, 2000). Επιπλζον, ο ςχθματιςμόσ των AGEs και θ περαιτζρω αλλθλεπίδραςθ τουσ με τουσ υποδοχείσ RAGE ωαίνεται να είναι κακοριςτικισ ςθμαςίασ (Suzuki and Miyata, 1999; Suzuki et al., 1999). Τζλοσ, θ μείωςθ ςτο ρυκμό τθσ ςπειραματικισ διικθςθσ ενδεχομζνωσ να εμπλζκει τον παράγοντα ανάπτυξθσ VEGF (vascular endothelium growth factor) ςτουσ νεωροφσ, μια και που τα επίπεδα του εμωανίηονται αυξθμζνα ςτουσ διαβθτικοφσ αςκενείσ. 45

46 ALR2 & ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΕ ΚΑΣΑΣΑΕΙ Ε ΜΗ ΔΙΑΒΗΣΙΚΟΤ ΑΘΕΝΕΙ ALR2 & καρδιαγγειακέσ νόςοι Θ ιςχαιμία χαρακτθρίηει τθν κατάςταςθ κατά τθν οποία παρατθρείται ςχετικι ι απόλυτθ ζλλειψθ αιμάτωςθσ ενόσ οργάνου. Σχετικι ζλλειψθ υποδθλϊνει μια μθ ωυςιολογικι ςφνδεςθ μεταξφ τθσ παροχισ αίματοσ (μεταωορά οξυγόνου) και των απαιτιςεων του οργανιςμοφ για επαρκι οξυγόνωςθ του ιςτοφ. Πςο αωορά τθν ιςχαιμία του μυοκαρδίου, πολλζσ μελζτεσ αωοροφν ςτθν επίδραςθ τθσ ιςχαιμίασ ςτθν δράςθ τθσ ALR2, κακϊσ και ςτθν επίδραςθ τθσ ροισ δια μζςου τθσ οδοφ των πολυολϊν ςτο μεταβολιςμό τθσ γλυκόηθσ ςτο μυοκάρδιο (Hwang et al., 2002; Ramasamy et al., 1999). Βρζκθκε πωσ κατά τθ διάρκεια τθσ ιςχαιμίασ θ δράςθ τθσ ALR2 είναι αυξθμζνθ εξαιτίασ τθσ επαγωγισ τθσ από ενδογενείσ παράγοντεσ όπωσ θ παραγωγι μονοξειδίου του αηϊτου (ΝΟ) (Kaiserova et al., 2008). Ρράγματι, ο λόγοσ γαλακτικοφ οξζοσ/ πυροςταωυλικοφ οξζοσ (τρόποσ ποςοτικοποίθςθσ τθσ κυτοςολικισ οξειδοαναγωγικισ κατάςταςθσ NADH/NAD + ) βρζκθκε αυξθμζνοσ, με επακόλουκο τθν μειωμζνθ γλυκόλυςθ και παραγωγι ATP ςτο μυοκάρδιο. Αυτι θ αλλθλουχία γεγονότων προκαλεί ιςχαιμικό τραφμα. Φαρμακολογικι αναςτολι τθσ δράςθσ τθσ ALR2 κα μποροφςε να αποβεί καρδιοπροςτατευτικι διαδραματίηοντασ ςθμαντικό ρόλο ςτο ιςχαιμικό τραφμα του μυοκαρδίου, προκαλϊντασ ελάττωςθ του λόγου NADH/NAD + και βελτίωςθ του μεταβολιςμοφ τθσ γλυκόηθσ αυξάνοντασ τθ γλυκόλυςθ και τθν παραγωγι ATP. Επιπλζον, οι ARIs περιορίηουν τθν αφξθςθ των ενδοκυτταρικϊν επιπζδων Na + και Ca 2+ κατά τθ διάρκεια τθσ ιςχαιμίασ αυξάνοντασ τθ δράςθ τθσ Na + -K + -ATPάςθσ. Με βάςθ τα πορίςματα αυτά προτάκθκε πωσ οι ARIs κα μποροφςαν να χρθςιμοποιθκοφν ωσ επιπρόςκετα κεραπευτικά μζςα για τθν αντιμετϊπιςθ οξζοσ εμωράγματοσ του μυοκαρδίου (Ramasamy, 2003). Θ επαναιμάτωςθ αποτελεί τθν πρωταρχικι κεραπευτικι ςτρατθγικι ςε αςκενείσ με οξφ ζμωραγμα του μυοκαρδίου, είτε με απευκείασ αγγειοπλαςτικι είτε με κρομβολυτικι κεραπεία, αλλά ςυγκεκριμζνεσ βιοχθμικζσ και λειτουργικζσ αλλαγζσ που παρατθροφνται κατά τθν επαναιμάτωςθ περιορίηουν τθν μζγιςτθ δυνατι επαναωορά μετά το ιςχαιμικό τραφμα (Kaneko and Ramasamy, 2004). Επομζνωσ ο ρόλοσ των ARIs αποδεικνφεται ςθμαντικόσ αωοφ μειϊνουν το ιςχαιμικό τραφμα μετά από ιςχαιμία και επαναιμάτωςθ του μυοκαρδίου ςε διαγονιδιακά πειραματόηωα με υπερεκωραςμζνθ τθν ALR2 (Hwang et al., 2004). Σφμωωνα με μια άλλθ μελζτθ που διεξάχκθκε ςε απομονωμζνεσ καρδιζσ διαγονιδιακϊν πειραματόηωων διαωαίνεται ζνασ διττόσ ρόλοσ τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν ςτθν ιςχαιμία και επαναιμάτωςθ του μυοκαρδίου (Iwata et al., 2006). Θ χοριγθςθ ARIs πριν από τθ πρόκλθςθ τθσ ιςχαιμίασ βελτίωςαν τθν καρδιακι επίδοςθ και εξαςκζνιςαν τθν καταςτροωι των κυττάρων του μυοκαρδίου, ενϊ χοριγθςθ αυτϊν κατά τθ διάρκεια τθσ ιςχαιμίασ εμωάνιςαν μειωμζνθ επίδραςθ ςτθν καρδιακι επίδοςθ αλλά ςθμαντικά μείωςαν τθν καταςτροωι των κυττάρων περιορίηοντασ το προκαλοφμενο οξειδωτικό ςτρεσ κατά τθν ιςχαιμία και τθν επανοξυγόνωςθ. Σε αντίκεςθ με τα παραπάνω, άλλθ μελζτθ αναωζρει πωσ το ιςχαιμικό τραφμα του μυοκαρδίου μετά από ιςχαιμία και επαναιμάτωςθ αποδίδεται εν μζρει ςτθν παραγωγι προϊόντων λιπιδικισ υπεροξείδωςθσ και πωσ ςφντομεσ περίοδοι υποτοξικισ ιςχαιμίασ, που προςτατεφουν το 46

47 μυοκάρδιο από οξφ ζμωραγμα εξαιτίασ διαδοχικϊν και μεγαλφτερθσ διάρκειασ εμωράξεων των ςτεωανιαίων αρτθριϊν, ελαττϊνουν τισ επιπτϊςεισ του ιςχαιμικοφ τραφματοσ επάγοντασ τθ δράςθ τθσ ALR2 (Shinmura et al., 2002). Σφμωωνα με τα αποτελζςματα αυτισ τθσ μελζτθσ, ο μεταβολιςμόσ τθσ ΘΝΕ από τθν ALR2 ςτο ιςχαιμικό μυοκάρδιο ίςωσ διαδραματίηει προςτατευτικό ρόλο ζναντι των ROS που παράγονται κατά τθ διάρκεια τθσ ιςχαιμίασ και επαναιμάτωςθσ. Θ χριςθ ARIs ολοκλθρωτικά κατάργθςαν τα προςτατευτικά αποτελζςματα που απορρζουν από τθν ςυςςϊρευςθ τθσ HNE. Επιπλζον, οι ARIs δεν είχαν καμία επίδραςθ ςε πειραματόηωα ςτα οποία δεν είχαν παρατθρθκεί ςφντομεσ περίοδοι υποτοξικισ ιςχαιμίασ, γεγονόσ που υποδθλϊνει πωσ θ ALR2 δεν επθρεάηει το τραφμα μετά από ιςχαιμία και επαναιμάτωςθ απουςία υποτοξικισ ιςχαιμίασ. Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτεί πωσ υπάρχει εμωανισ αντίκεςθ μεταξφ των παραπάνω αναωερόμενων μελετϊν. Οι μελζτεσ που υποςτθρίηουν πωσ ωαρμακολογικι αναςτολι τθσ ALR2 είναι δυνατό να προςτατεφςει το μυοκάρδιο μετά από ιςχαιμία και επαναιμάτωςθ διεξιχκθςαν ςε ποντικοφσ και μόνο ζνασ ARI εξετάςτθκε (θ ςορβινίλθ). Στθν μελζτθ που υποςτθρίχκθκε ακριβϊσ το αντίκετο, εξετάςτθκαν δομικά διαωορετικοί ARIs (ςορβινίλθ και τολρεςτάτθ) και τα πειράματα διεξιχκθςαν ςε κουνζλια, ςτα οποία δεν ιταν δυνατι θ ανίχνευςθ τθσ SDH με αποτζλεςμα θ ςορβιτόλθ να μθ μεταβολίηεται περαιτζρω ςε ωρουκτόηθ. Στθ δεφτερθ λοιπόν περίπτωςθ οι ARIs ιταν αδφνατο να προςτατεφςουν το μυοκάρδιο μειϊνοντασ το λόγο NADH/NAD +. Συμπεραςματικά λοιπόν θ οποιαδιποτε ςφγκριςθ των αποτελεςμάτων είναι δφςκολθ και γίνεται ςαωισ θ αναγκαιότθτα πιο εκτεταμζνθσ ζρευνασ όςο αωορά το ρόλο τθσ ALR2 ςτο ιςχαιμικό μυοκάρδιο. Μθ ωυςιολογικόσ πολλαπλαςιαςμόσ των VSMCs αποτελεί ςθμαντικό παράγοντα ςτθν αρτθριοςκλιρυνςθ, επαναςτζνωςθ και ςτθν υπζρταςθ. Χαρακτθριςτικό γνϊριςμα αυτϊν αποτελεί θ μθ ωυςιολογικι λειτουργία του ενδοκθλίου, ωσ αποτζλεςμα διαωόρων παραγόντων που προδιακζτουν για καρδιαγγειακζσ νόςουσ ι εξαιτίασ μθχανικϊν τραυμάτων, με αποτζλεςμα τθν ζκωραςθ διαωόρων μεταγραωικϊν παραγόντων και κυτοκινϊν που αςκοφν μιτογόνο επίδραςθ ςτα VSMCs (Ramana et al., 2002). Βρζκθκε πωσ θ διζγερςθ των VSMCs με μιτογόνα που ρυκμίηουν ευκρινι μεταβολικά μονοπάτια, όπωσ αυτά των ςυηευγμζνων με G-πρωτεΐνεσ υποδοχείσ, οδθγοφν ςτθν υπερζκωραςθ τθσ ALR2. Δομικά διαωορετικοί ARIs εμποδίηουν τθν ανάπτυξθ των VSMCs ςε κυτταροκαλλιζργειεσ παρ όλθ τθν παρουςία διαωόρων αναπτυξιακϊν παραγόντων και επιπλζον μειϊνουν το ςχθματιςμό του ζςω χιτϊνα των αιμοωόρων αγγείων ςτισ αποωραγμζνεσ καρωτιδικζσ αρτθρίεσ επιμφων (Ruef et al., 2000). Αναςτολι τθσ ALR2 εμπόδιςε τθν ςφνκεςθ του DNA, τθν κυτταρικι ανάπτυξθ και τθν υπερπλαςία του εςωτερικοφ των αρτθριϊν in vivo. Θ απουςία του ενηφμου ςτα VSMCs ςε ωάςθ θρεμίασ και θ υπερζκωραςθ αυτοφ ςε VSMCs που βρίςκονται ςε ωάςθ πολλαπλαςιαςμοφ υποδθλϊνει πωσ θ ALR2 υπερεκωράηεται κατά τθ ωάςθ τθσ ανάπτυξθσ. Με τισ προθγοφμενεσ παρατθριςεισ ζρχεται ςε ςυμωωνία και το γεγονόσ πωσ μετά από αποωρακτικά τραφματα τα πολλαπλαςιαηόμενα κφτταρα του εςωτερικοφ των VSMCs εμωανίηουν υψθλά επίπεδα ζκωραςθσ τθσ ALR2. Ο μθχανιςμόσ με τον οποίο θ ALR2 ρυκμίηει ι επιδρά ςτθν κυτταρικι ανάπτυξθ μελετικθκε περαιτζρω και βρζκθκε πωσ οι ARIs εμποδίηουν τθσ επαγόμενθ από τον παράγοντα NFK-α (tumor necrosis factor-a, TNF-α) ενεργοποίθςθ του NF-κB, με τελικό 47

48 αποτζλεςμα τθν μείωςθ τθσ εξάπλωςθσ των VSMCs όχι αυξάνοντασ τον κυτταρικό κάνατο αλλά αναςτζλλοντασ τον πολλαπλαςιαςμό τουσ (Ramana et al., 2002). Πλα τα παραπάνω ερευνθτικά δεδομζνα υποςτθρίηουν τθν άποψθ πωσ θ αναςτολι τθσ ανάπτυξθσ των VSMCs από ARIs μπορεί να αποτελζςει μια νζα κεραπευτικι προςζγγιςθ για τθν αντιμετϊπιςθ των νεοπλαςιϊν που παρατθροφνται κατά τθν επαναςτζνωςθ. Επιπλζον, επειδι ο μθ ωυςιολογικόσ πολλαπλαςιαςμόσ των VSMCs αποτελεί κακοριςτικό παράγοντα και ςε άλλεσ καρδιαγγειακζσ νόςουσ όπωσ θ αρτθριοςκλιρυνςθ και θ υπζρταςθ, θ χριςθ των ARIs κα μποροφςε να ζχει κεραπευτικά αποτελζςματα και ςε αυτζσ τισ πακολογικζσ καταςτάςεισ ALR2 & φλεγμονή Κατά τθ διάρκεια βακτθριακϊν μολφνςεων λιποπολυςακχαρίτεσ (lipopolysaccharide, LPS), προ-ωλεγμονϊδεισ ενδοτοξίνεσ και ςυςτατικά του κυτταρικοφ τοιχϊματοσ των Gramm βακτθρίων, απελευκερϊνονται ςτθν κυκλοωορία και διεγείρουν τον υποδοχζα TLR4 (toll-like receptor 4) (Miller et al., 2005). Στα ενδοκθλιακά και αγγειακά κφτταρα, κακϊσ και ςτα λεία μυϊκά κφτταρα, όπου δεν εντοπίηονται αυτοί οι υποδοχείσ, οι LPS αλλθλεπιδροφν με τον υποδοχζα CD14, προκαλϊντασ τθν μεταγραωι ωλεγμονωδϊν και άνοςο- γονιδίων, τθν επαγωγι του NF-κB και ρφκμιςθ ωλεγμονωδϊν κυτοκινϊν όπωσ τθσ TNK-α, τθσ ιντερλευκίνθσ-1 (interleukin-1, IL-1), προςταγλανδινϊν και NO (Yang et al., 1998). Αδυναμία ρφκμιςθσ των ανοςολογικϊν αποκρίςεων του οργανιςμοφ μπορεί να οδθγιςει ςε ςιψθ και διαςυςτθματικό ωλεγμονϊδεσ ςφνδρομο. Αποτελζςματα μελζτθσ αποδεικνφουν πωσ θ αναςτολι τθσ ALR2 καταςτζλλει τθν από τον NF-κB επαγόμενθ μεταγραωι ςτα υπό τθν επιρεια LPS μακροωάγα και μειϊνει τθν παραγωγι IL-1 και TNK-α (Ramana et al., 2006b). Ραρόμοια αποτελζςματα προζκυψαν και in vivo από τθν μελζτθ των επιδράςεων τθσ αναςτολισ τθσ ALR2 ςτα NF-κB-επαγόμενα μονοπάτια μεταγωγισ ςθμάτων και ςτθ δυςλειτουργία του μυοκαρδίου ςε πειραματικό πρότυπο LPS-επαγόμενου ςοκ (Ramana and Srivastava, 2006; Ramana et al., 2006a). Σφμωωνα με αυτζσ τισ μελζτεσ θ αναςτολι τθσ ALR2 οδθγεί ςτθν επιβίωςθ των πειραματόηωων μετά από ενδεχόμενα κανάςιμθ LPS μόλυνςθ και αυτό δεν οωείλεται ςτθν απευκείασ επίδραςθ ςτον NF-κB αλλά ςε διεργαςίεσ που παρατθροφνται νωρίτερα όπωσ θ ενεργοποίθςθ MAPKs. Επίςθσ υπάρχουν αναωορζσ που εκτόσ από τθν επίδραςθ ςτθ δράςθ του NF-κB, θ αναςτολι τθσ ALR2 επθρεάηει τθν παραγωγι προςταγλανδίνθσ E2, τθ δράςθ τθσ κυκλοξυγονάςθσ 2 (cyclooxygenase-2, COX-2), μονοπάτια PKC και τθ ςφνκεςθ του ΝΟ (Ramana et al., 2007). Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να αναωερκεί πωσ μεταξφ των διαωόρων χρόνιων ωλεγμονωδϊν καταςτάςεων ςυγκαταλζγεται και το άςκμα και πρόςωατθ μελζτθ αναδεικνφει τθν πικανι εμπλοκι τθσ ALR2 ςτθ πακογζνεςθ του κακϊσ και τθ πικανι χριςθ ARIs ςτθν αντιμετϊπιςθ αυτοφ (Srivastava and Ramana, 2010) ALR2 & διαταραχέσ διάθεςησ Με βάςθ το γεγονόσ πωσ θ περιωερικι νευροπάκεια αποτελεί παράγοντα υψθλοφ κινδφνου για τθν εμωάνιςθ κατάκλιψθσ ςε διαβθτικοφσ αςκενείσ (Viinamaki et al., 1995), αρχικά 48

49 διατυπϊκθκε θ υπόκεςθ πωσ ίςωσ να υπάρχει ςυςχζτιςθ μεταξφ διαταραχϊν διάκεςθσ και αυξθμζνθσ ροισ από τθ μεταβολικι οδό των πολυολϊν. Ρράγματι, βρζκθκαν αυξθμζνα επίπεδα ςορβιτόλθσ ςτο εγκεωαλονωτιαίο υγρό (cerebrospinal fluid, CSF) ςε αςκενείσ με διαταραχζσ διάκεςθσ (Regenold et al., 2000). Τα επίπεδα ςορβιτόλθσ ςτο CSF αςκενϊν με διπολικζσ διαταραχζσ (κατάκλιψθ) βρζκθκαν αυξθμζνα κατά 47% ςε ςχζςθ με υγιι άτομα και ςθμαντικά αυξθμζνα ςε ςχζςθ με αςκενείσ με μονοπολικι κατάκλιψθ, ςτουσ οποίουσ τα επίπεδα ςορβιτόλθσ ιταν αυξθμζνα κατά 22% ςε ςχζςθ με τα υγιι άτομα. Σε μια άλλθ μελζτθ αναωζρκθκαν αυξθμζνα επίπεδα ςορβιτόλθσ ςτον εγκζωαλο μθ διαβθτικϊν ατόμων με ςχιηοωρζνεια και διπολικι ι μονοπολικι κατάκλιψθ (Regenold et al., 2004). Κεωρθτικά, αυξθμζνα επίπεδα ςορβιτόλθσ ςτο CSF είναι δυνατό να προκλθκοφν ι από αυξθμζνθ ροι δια μζςου τθσ οδοφ των πολυολϊν ςτον εγκζωαλο ι από μεταωορά ςορβιτόλθσ από τθν περιωζρεια ςτο CSF. Από τθ ςτιγμι που δεν υπάρχουν ενδείξεισ για ενεργθτικι μεταωορά ςορβιτόλθσ από τον αιματοεγκεωαλικό ωραγμό (blood brain barrier, BBB) θ πρϊτθ εκδοχι είναι επικρατζςτερθ. Κα πρζπει ωςτόςο να τονιςτεί πωσ δεν υπάρχουν αναωορζσ ςε μεταβολζσ όςο αωορά τθν δράςθ τθσ ALR2 ςε περιπτϊςεισ αςκενϊν με διαταραχζσ διάκεςθσ. Αντικζτωσ, ζχουν αναωερκεί ωσ αιτίεσ υπεργλυκαιμίασ ςε τζτοιεσ περιπτϊςεισ ο υπερκορτιηονιςμόσ (hypercortisolism) (Kling et al., 1995) και θ χορθγοφμενθ ωαρμακευτικι αγωγι (Goldstein et al., 1999), εςτιάηοντασ όμωσ κυρίωσ ςτισ διαταραχζσ όςο αωορά το μεταβολιςμό τθσ γλυκόηθσ ALR2 & νεφρικέσ δυςλειτουργίεσ Θ ςπειραματοςκλιρυνςθ (glomelurosclerosis) αποτελεί μια πακολογικι κατάςταςθ κατά τθν οποία παρατθροφνται ωαινόμενα όπωσ πολλαπλαςιαςμόσ των κυττάρων του ελφτρου του Bowman, ςυςςϊρευςθ πρωτεϊνϊν ECM (extracellular matrix proteins, ECM) και εξάλειψθ των τριχοειδϊν του νεωρικοφ ςπειράματοσ. Τα ωαινόμενα αυτά αποτελοφν το τελικό ςτάδιο που οδθγεί ςε προοδευτικι απϊλεια τθσ νεωρικισ λειτουργίασ ςε πολλζσ νεωροπάκειεσ. Ο παράγοντασ TGF-b1 (transforming growth factor beta 1, ΤGF-b1) ζχει βρεκεί πωσ διαδραματίηει ςθμαντικό ρόλο ρυκμίηοντασ τθν μεταγραωι και τθν ζκωραςθ πολλϊν ECM πρωτεϊνϊν όπωσ θ ωιμπρονεκτίνθ και το κολλαγόνο IV. Ο εμπλεκόμενοσ μθχανιςμόσ ςχετίηεται με ενεργοποίθςθ των μονοπατιϊν των κιναςϊν JNK (Jun N-terminal kinases, JNKs) και τθσ p38 MAPK (Cohen, 2003). Ζχει αναωερκεί πωσ θ ALR2 ςχετίηεται με τθν TGF-b1-επαγόμενθ ςφνκεςθ τθσ ωιμπρονεκτίνθσ και του κολλαγόνου IV ςτα κφτταρα τθσ κάψασ του Bowman (Jiang et al., 2006), γεγονόσ που ενδεχομζνωσ αποδίδεται ςε παρζμβαςθ ςτθ λειτουργία των JNKs και p38 MAPK μονοπατιϊν κακϊσ και του μεταγραωικοφ παράγοντα AP-1. Ρράγματι, ARIs όπωσ θ ςορβινίλθ ι θ ηοπολρεςτάτθ μείωςαν τθν ενεργοποίθςθ των προαναωερόμενων οδϊν μεταγωγισ ςθμάτων. Θ επαγόμενθ από τθν ALR2 παραγωγι ECM ςυςτατικϊν, ςε ωυςιολογικά επίπεδα γλυκόηθσ, υποδεικνφει πικανό ρόλο του ενηφμου ςτθν πακογζνεια τθσ μθ διαβθτικισ ςπειραματοςκλιρυνςθσ. Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτεί πωσ ςε αςκενείσ με χρόνιεσ νεωρικζσ νόςουσ παρατθρείται υπερζκωραςθ τθσ ALR2 ανεξάρτθτα από το ενδεχόμενο οι αςκενείσ να υποβάλλονται ςε αιμοκάκαρςθ ι να είναι διαβθτικοί (Hasuike et al., 2002). Οι μθχανιςμοί επαγωγισ τθσ δράςθσ τθσ ALR2 ςε αυτζσ τισ περιπτϊςεισ δεν ζχουν μελετθκεί πλιρωσ αλλά πικανά περιλαμβάνουν εγκατάςταςθ οξειδωτικοφ ςτρεσ και ςυςςϊρευςθ ουραιμικϊν ουςιϊν και 49

50 δικαρβονυλικϊν παραγϊγων. Θ επαγωγι τθσ δράςθσ τθσ ALR2, τουλάχιςτο εν μζρει, επθρεάηει τθν μεμβράνθ του περιτόναιου ςε αςκενείσ που υποβάλλονται ςε αιμοκάκαρςθ (Hasuike et al., 2007). Σε αυτζσ τισ περιπτϊςεισ βλαβϊν τθσ μεμβράνθσ του περιτόναιου με μορωολογικζσ αλλοιϊςεισ παρατθρείται μειωμζνθ λειτουργικότθτα, όπωσ για παράδειγμα απϊλεια τθσ ςπειραματικισ διικθςθσ. Ρεριςςότερεσ μελζτεσ απαιτοφνται προκειμζνου να διευκρινιςτεί ο ενδεχόμενοσ προςτατευτικόσ ρόλοσ των ARIs ςε αςκενείσ με χρόνιεσ νεωρικζσ νόςουσ και που υποβάλλονται ςε αιμοκάκαρςθ ALR2 & ωοθηκικέσ ανωμαλίεσ Ραρόλο που θ γαλακτόηθ αποτελεί ςθμαντικό ενεργειακό παράγοντα για τον οργανιςμό και βαςικό υπόςτρωμα για τθ βιοςφνκεςθ διαωόρων μακρομορίων, οι ωοκικεσ των κθλαςτικϊν είναι επιρρεπείσ ςε βλάβεσ εξαιτίασ τθσ ςυςςϊρευςθσ γαλακτόηθσ και των μεταβολιτϊν τθσ ωσ αποτζλεςμα τθσ δράςθσ διαωόρων ενηφμων που υπερεκωράηονται τοπικά (Liu et al., 2000). Τα βαςικά μεταβολικά μονοπατιϊν περιλαμβάνουν τα ζνηυμα ουριδυλο-τρανςωεράςθ τθσ 1- ωωςωορικισ γαλακτόηθσ (galactose-1-phosphate uridil transferase,galt) και 4-επιμεράςθ τθσ UDP-γαλακτόηθσ (UDP-galactose 4-epimerase). Εκτόσ όμωσ από τα προαναωερόμενεσ μεταβολικζσ οδοφσ και θ μεταβολικι οδόσ των πολυολϊν εμπλζκεται ςτον μεταβολιςμό τθσ γαλακτόηθσ με τελικό αποτζλεςμα τθν παραγωγι γαλακτικόλθσ. Θ γαλακτικόλθ μεταβολίηεται ςε πολφ μικρό βακμό και παρατθρείται ςυςςϊρευςθ τθσ τοπικά ςτισ ωοκικεσ με τελικό αποτζλεςμα τθν εμωάνιςθ τοξικότθτασ εξαιτίασ τθσ προκαλοφμενθσ διαταραχισ τθσ ωςμωτικισ ιςορροπίασ και τθσ εξάντλθςθσ των αποκεμάτων τθσ GSH. Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτεί πωσ θ ςυγγζνεια τθσ ALR2 με τθν γαλακτόηθ είναι ςχετικά χαμθλι. Απαιτοφνται λοιπόν υψθλζσ ςυγκεντρϊςεισ για τθν ενεργοποίθςθ τθσ οδοφ των πολυολϊν, όπωσ ςε καταςτάςεισ γαλακτοςαιμίασ, μια κλθρονομικι νόςοσ που οωείλεται ςε ανεπάρκεια του ενηφμου GALT (Berry, 1995). Οι ARIs προκαλοφν αναςτροωι τθσ προκαλοφμενθσ από γαλακτικόλθ τοξικότθτασ ςε πειραματόηωα μειϊνοντασ τα επίπεδα τθσ γαλακτικόλθσ και ζχει βρεκεί πωσ προλαβαίνουν τθν εμωάνιςθ δυςλειτουργιϊν των ωοκθκϊν ςε αρουραίουσ που θ διατροωι τουσ είναι πλοφςια ςε γαλακτόηθ (Meyer et al., 1992) ALR2 & καρκίνοσ Ζχει βρεκεί πωσ υπάρχει υπερζκωραςθ τθσ ALR2 και αυξθμζνθ δράςθ αυτισ ςε ποικίλουσ ανκρϊπινουσ καρκινικοφσ ιςτοφσ όπωσ για παράδειγμα ςε καρκίνουσ του ιπατοσ, των μαςτϊν, των ωοκθκϊν και του ορκοφ (Lee et al., 2001; Saraswat et al., 2006). Ρερίπου ςτο 29% των περιπτϊςεων καρκίνων του ιπατοσ παρατθρείται υπερζκωραςθ τθσ ALR2 ενϊ περίπου το 54% των περιπτϊςεων αυτϊν υπερεκωράηεται μια νζα πρωτεΐνθ, που εμωανίηει 70% ομοιότθτα με τθν ALR2, θ aldose reductase like-1 (ALR-1) (Cao et al., 1998). Το γεγονόσ τθσ υπερζκωραςθσ τθσ ALR2 ςε αυτοφσ τουσ ιςτοφσ προτάκθκε πωσ ςχετίηεται με τθν εμωάνιςθ αντοχισ ςτα χθμειοκεραπευτικά και πωσ οι ARIs κα μποροφςαν να εξαλείψουν το ωαινόμενο τθσ αντίςταςθσ. Θ εμωάνιςθ αντοχισ ςε αντικαρκινικά ωάρμακα, όπωσ για παράδειγμα τα αντιβιοτικά τφπου ανκρακυκλίνθσ δαουνορουβικίνθ και δοξορουβικίνθ, αποτελεί τεράςτιο πρόβλθμα ςτθ χθμειοκεραπεία του καρκίνου και δεν οωείλονται μόνο ςε μεταβολζσ που αωοροφν τθν πρόςλθψθ 50

51 και απζκκριςθ του ωαρμάκου αλλά και ςε ωαινόμενα μεταβολιςμοφ αυτϊν από ζνηυμα βιομετατροπϊν ωάςθσ Λ ςτουσ ανενεργοφσ μεταβολίτεσ τουσ (Plebuch et al., 2007). Κα πρζπει να τονιςτεί πωσ θ αδρανοποίθςθ των εν λόγω χθμειοκεραπευτικϊν εξαιτίασ τθσ αναγωγισ των καρβονυλικϊν ομάδων από διάωορα ζνηυμα, μεταξφ των οποίων και θ ALR2, επάγεται από το ίδιο το υπόςτρωμα (Ax et al., 2000). Επίςθσ βρζκθκε πωσ θ υπερζκωραςθ τθσ ALR2 ςυνοδεφεται από 3.7% αφξθςθ τθσ αντίςταςθσ των καρκινικϊν κυττάρων ςτθν δαουνορουβικίνθ (Plebuch et al., 2007), γεγονόσ που υποδθλϊνει πωσ θ ALR2 κα μποροφςε να κεωρθκεί ωσ ζνασ μθ κλαςςικόσ μθχανιςμόσ αντίςταςθσ ςε χθμειοκεραπευτικά. Επιπλζον κα πρζπει να τονιςτεί πωσ τα χθμειοκεραπευτικά δαουνορουβικίνθ και cisπλατίνθ επάγουν τθ δράςθ των κιναςϊν ERK (extracellular signal-regulated kinases, ERKs) με δοςοεξαρτϊμενο τρόπο (Wang et al., 2000), γεγονόσ που υποδθλϊνει πωσ το ςυγκεκριμζνο μονοπάτι μεταγωγισ ςθμάτων εμπλζκεται ςτα αρχικά ςτάδια ρφκμιςθσ τθσ κυτταρικισ απόκριςθσ ςτα αντικαρκινικά ωάρμακα και μεςολαβεί για τθν πρόκλθςθ τθσ απόπτωςθσ ςτα καρκινικά κφτταρα. Με ςκοπό τθν μελζτθ τθσ επίδραςθσ τθσ ALR2 ςτο μονοπάτι των ERKs διεξάχκθκε μια ζρευνα με χριςθ κυττάρων HeLa (Lee et al., 2002) και βρζκθκε πωσ ενϊ τα χθμειοκεραπευτικά προκάλεςαν επαγωγι τθσ δράςθσ των ERKs, θ ALR2 μείωςε τθν δράςθ αυτι προςτατεφοντασ τα καρκινικά κφτταρα. Στθ περίπτωςθ αναςτολισ τθσ ALR2 από ARIs, θ δράςθ των ERKs αυξικθκε και παρουςιάςτθκε αυξθμζνθ αποτελεςματικότθτα των χρθςιμοποιοφμενων χθμειοκεραπευτικϊν. Πλα τα παραπάνω δεδομζνα παρζχουν ενδείξεισ πωσ ςυμπλθρωματικι κεραπεία με ARIs κα μποροφςε να βελτιϊςει τθν αποτελεςματικότθτα των χθμειοκεραπευτικϊν και μάλιςτα τα ςυγκεκριμζνα κεραπευτικά ςχιματα να περιλαμβάνουν μικρότερθ δόςθ του αντικαρκινικοφ ωαρμάκου ελαχιςτοποιϊντασ με αυτό τον τρόπο τθν τοξικότθτα ςτα υγιι κφτταρα και διατθρϊντασ τθν αποτελεςματικότθτα ςτα καρκινικά. Ραρόλο που ζχει αναωερκεί πωσ θ ALR2 μεταβολίηει τοξικζσ αλδεψδεσ που παράγονται κατά τον αυξθμζνο μεταβολιςμό που παρατθρείται ςτα καρκινικά κφτταρα, ο ρόλοσ τθσ ενηυμικισ τθσ δράςθσ ςε τζτοιου είδουσ κφτταρα δεν είναι ςαωισ. Γεννιζται λοιπόν το ερϊτθμα αν θ υπερζκωραςθ τθσ ALR2 ςτα καρκινικά κφτταρα μπορεί να ςυςχετιςτεί εκτόσ από τθν εμωάνιςθ αντίςταςθσ ςτα χθμειοκεραπευτικά και με τθν επαγωγι τθσ κακοικειασ ενδεχόμενα εξαιτίασ τθσ δθμιουργίασ ενόσ περιςςότερο ευνοϊκοφ και λιγότερου «τοξικοφ» περιβάλλοντοσ για τθν επιβίωςθ των καρκινικϊν κυττάρων (Alexiou et al., 2009). Αποςαωινιςθ ενόσ τζτοιου ρόλου τθσ ALR2 κα μποροφςε να οδθγιςει ςτθν ενδεχόμενθ χριςθ των ARIs με ςκοπό τθν ελάττωςθ του ρυκμοφ ανάπτυξθσ τθσ κακοικειασ πζρα από τθν ελαχιςτοποίθςθ τθσ αντίςταςθσ ςτα χρθςιμοποιοφμενα χθμειοκεραπευτικά. Θ ALR2 ςχετίηεται με τθν ενεργοποίθςθ μονοπατιϊν μεταγωγισ ςθμάτων και ρυκμίηει τθν ζκωραςθ γονιδίων ςθμαντικϊν για τθν επιβίωςθ ι τθν ανάπτυξθ των καρκινικϊν κυττάρων και των προςωυτικϊν κυττάρων (adhesion cells) (Ramana et al., 2004a; Ramana et al., 2004b). Αωοφ το TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) αποτελεί πικανι ογκοπαραγωγό ουςία (tumor promoter), διεξάχκθκε μια μελζτθ με ςκοπό τθ διερεφνθςθ των μονοπατιϊν που εμπλζκονται ςτθ TPAεπαγόμενθ υπερζκωραςθ τθσ ALR2 κακϊσ και το ρόλο του ενηφμου ςε ανκρϊπινα πνευμονικά κφτταρα αδενοκαρκινϊματοσ (Kang et al., 2005) αλλά και ςε HeLa κφτταρα (Lee et al., 2005). 51

52 Διαπιςτϊκθκε πωσ θ ενεργοποίθςθ τθσ PKC από το TPA υποκίνθςε τθν δράςθ του γονιδίου τθσ ALR2 διαμζςου του NF-κB και πωσ αναςτολι τθσ δράςθσ τθσ ALR2 προκάλεςε τροποποιιςεισ ςτο κυτταρικό κφκλο των καρκινικϊν κυττάρων. Πλα αυτά τα ςτοιχεία υποςτθρίηουν τθν άποψθ πωσ θ ALR2 διευκολφνει τθν καρκινικι ανάπτυξθ διεκπεραιϊνοντασ το μεταβολιςμό των τοξικϊν αλδεχδικϊν προϊόντων που ςχθματίηονται κατά το ραγδαίο κυτταρικό πολλαπλαςιαςμό. Ο καρκίνοσ του ορκοφ αποτελεί μια πολφπλοκθ πακολογικι κατάςταςθ που περιλαμβάνει διαταραχι ομοιοςτατικϊν μθχανιςμϊν που ρυκμίηουν τον πολλαπλαςιαςμό, τθν διαωοροποίθςθ και τον προγραμματιςμζνο κυτταρικό κάνατο των κυττάρων του εντερικοφ επικθλίου. Ζνα από τα βαςικά γνωρίςματα αυτισ τθσ μορωισ καρκίνου είναι θ επαγωγι τθσ COX-2 (Gupta and Dubois, 2001) που καταλφει τα δυο πρϊτα ςτάδια τθσ βιοςφνκεςθσ των προςταγλανδινϊν από το αραχιδονικό οξφ. Θ de novo ςφνκεςθ τθσ COX-2 προκαλείται από τθ ζκκεςθ των κυττάρων ςε ποικίλα ερεκίςματα όπωσ κυτοκίνεσ και μεταγραωικοφσ παράγοντεσ, που οδθγοφν ςε παρεμβάςεισ ςτθ ςφνκεςθ των προςταγλανδινϊν με τελικό αποτζλεςμα τον μθ ελεγχόμενο πολλαπλαςιαςμό των κυττάρων του εντερικοφ επικθλίου. Επίςθσ ο NF-κB διαδραματίηει ςθμαντικό ρόλο ςε μιτογόνεσ διαδικαςίεσ που επάγονται από ROS ι άλλα οξειδωτικά. Πλα αυτά τα ςτοιχεία ςε ςυνδυαςμό με το γεγονόσ πωσ θ ALR2 υπερεκωράηεται ςε αυτζσ τισ περιπτϊςεισ αποτζλεςαν το ζναυςμα για τθ διεξαγωγι μελετϊν με ςκοπό τθ διερεφνθςθ του ρόλου τθσ ALR2 ςτθν ζκωραςθ τθσ COX-2 και τθ ςφνκεςθ τθσ προςταγλανδίνθσ Ε2 ςε Caco-2 κφτταρα (Tammali et al., 2006). Αναςτολι του ενηφμου ςθμαντικά ανζςτειλε τθν παραγωγι τθσ προςταγλανδίνθσ E2 και τθν περαιτζρω ανάπτυξθ των κυττάρων και μείωςε ςθμαντικά τα επίπεδα του COX-2 mrna, άρα και τθν επαγόμενθ από μεταγραωικοφσ παράγοντεσ ζκωραςθ τθσ COX-2. Αναςτολι με ςορβινίλθ οδιγθςε ςε μείωςθ κατά 55% με 65% των επιπζδων του COX-2 mrna, γεγονόσ που υποδθλϊνει πωσ θ ALR2 ίςωσ ρυκμίηει τθν μεταγραωικι ενεργοποίθςθ του COX-2 γονιδιϊματοσ. Επιπλζον θ αναςτολι τθσ ALR2 εμπόδιςε τθν ενεργοποίθςθ του NF-κB. Τζλοσ, κα πρζπει να τονιςτεί ιδιαίτερα πωσ θ ALR2 βρζκθκε πωσ αποτελεί απαραίτθτο διαμεςολαβθτι για τον επαγόμενο από μεταγραωικοφσ παράγοντεσ πολλαπλαςιαςμό των καρκινικϊν κυττάρων και πωσ αναςτολι αυτοφ παρεμβαίνει ςτθ ωάςθ S του κυτταρικοφ κφκλου, ενόσ ςταδίου απαραίτθτου για τθν κυτταρικι ανάπτυξθ. Οι όγκοι των επινεωριδίων ταξινομοφνται ςε δυο κατθγορίεσ: ςε ιπιασ κακοικειασ αδενϊματα που είναι ιδιαίτερα ςυχνά και ςε ςπάνια κανάςιμα αδενικά καρκινϊματα που αντιςτοιχοφν ςτο % όλων των καρκίνων, με ιδιαίτερα ωτωχι δυνατότθτα πρόγνωςθσ και ρυκμό επιβίωςθσ 20% για 5 χρόνια (Kopf et al., 2001). Ο ωλοιόσ των επινεωριδίων αποτελεί τόπο ζκωραςθσ τθσ ALR2 και βρζκθκαν ςθμαντικζσ διαωορζσ μεταξφ των προαναωερόμενων κατθγοριϊν όγκων (Lefrancois-Martinez et al., 2004). Συγκεκριμζνα ςτθ περίπτωςθ των καρκινωμάτων που τελικά οδθγοφν ςτο κάνατο τόςο τα επίπεδα του ALR2 mrna όςο και τθσ πρωτεΐνθσ εμωανίηονται μειωμζνα, κάτι που ίςωσ να οωείλεται ςε χρωμοςωμικζσ μεταλλάξεισ ι ακόμα και ςε αποςυντονιςμό των μθχανιςμϊν που ελζγχουν τθν ζκωραςθ των γονιδίων. Σε αυτζσ τισ περιπτϊςεισ και για πρϊτθ ωορά προτάκθκε πωσ το camp αποτελεί ρυκμιςτι τθσ ζκωραςθσ τθσ ALR2 ςε ανκρϊπινα κφτταρα του ωλοιοφ των επινεωριδίων και πιο ςυγκεκριμζνα θ campεπαγόμενθ δράςθ τθσ PKC είναι μειωμζνθ (Bertherat et al., 2003; Rosenberg et al., 2003). Στο 52

53 ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτεί πωσ δεν είναι ξεκάκαρο αν θ μειωμζνθ ζκωραςθ τθσ ALR2 ςτισ προαναωερόμενεσ περιπτϊςεισ είναι αιτία ι αποτζλεςμα τθσ εμωάνιςθσ τθσ κακοικειασ. Το γεγονόσ όμωσ πωσ το 88% των αδενικϊν καρκινωμάτων των επινεωριδίων εμωανίηουν επίπεδα ALR2 πολφ χαμθλότερα από αυτά ςε περιπτϊςεισ ιπιων καρκινικϊν αδενωμάτων ι υγιϊν κυττάρων κακιςτά το ζνηυμο ιδιαίτερθσ ςθμαςίασ ςε περιπτϊςεισ διαωορικισ διάγνωςθσ μεταξφ αυτϊν ΑΝΑΣΟΛΕΙ ΣΗ ALR2 Τισ τελευταίεσ δεκαετίεσ, πλικοσ ελπιδοωόρων ARIs με ςθμαντικό δυναμικό τόςο ςε in vitro όςο και ςε in vivo ςυςτιματα ζχουν αναπτυχκεί, μα μόνο θ επαλρεςτάτθ (Epalrestat, Kinedak ) είναι εμπορικά διακζςιμθ και μόνο ςτθν Λαπωνία. Πλοι οι υπόλοιποι ARIs που ζχουν ειςαχκεί ςε κλινικζσ μελζτεσ ζχουν αποςυρκεί εξαιτίασ μθ ικανοποιθτικοφ ωαρμακοκινθτικοφ προωίλ ι παρενεργειϊν τουσ. Από τουσ πιο πρόςωατουσ ARIs που ζχουν αναπτυχκεί, θ ρανιρεςτάτθ βρίςκεται ςε κλινικζσ μελζτεσ ΛΛΛ ςτισ Θ.Ρ.Α (Schemmel et al., 2009). Οι περιςςότεροι από τουσ διακζςιμουσ ARIs κατζχουν μια όξινθ ομάδα, θ οποία αλλθλεπιδρά με δεςμοφσ υδρογόνου με το ενεργό κζντρο του ενηφμου που περιζχει τα υπόλοιπα Tyr48, His110 και Trp111 κακϊσ και το NADPΘ. Άλλο χαρακτθριςτικό γνϊριςμα των ARIs είναι θ παρουςία μιασ θ περιςςότερων αρωματικϊν ομάδων που αλλθλεπιδροφν με το λιπόωιλο τμιμα του ενηφμου (Bruno et al., 2002; Malamas and Millen, 1991). Οι ARIs μποροφν να ταξινομθκοφν ςε τρεισ κφριεσ κατθγορίεσ (ςχιμα 2): Α) Ραράγωγα καρβοξυλικοφ οξζοσ: Οι ARIs αυτισ τθσ κατθγορίασ εμωανίηουν χαμθλι in vivo δραςτικότθτα εξαιτίασ τθσ χαμθλισ ικανότθτασ διάβαςθσ τουσ από βιολογικζσ μεμβράνεσ, γεγονόσ που αποδίδεται ςτισ χαμθλζσ τιμζσ pka και τον υψθλό βακμό ιονιςμοφ τουσ ςτο ωυςιολογικό ph. Β) Ραράγωγα υδαντοΐνθσ: Οι υδαντοϊνικοί ARIs εμωανίηουν υψθλότερεσ τιμζσ pka από τα παράγωγα του καρβοξυλικοφ οξζοσ και εμωανίηουν καλφτερθ in vivo δράςθ, ωσ αποτζλεςμα τθσ υψθλισ διαπερατότθτασ τουσ ςτουσ ιςτοφσ ωσ μθ ιονιςμζνα μόρια ςτο ωυςιολογικό ph. Ωςτόςο, ςε πολλζσ περιπτϊςεισ εμωανίηονται παρενζργειεσ και τοξικότθτα όπωσ δερματικά εξανκιματα και υπερευαιςκθςία. Γ) Ροικίλθσ χθμικισ δομισ: Ρολλζσ είναι οι μελζτεσ που προςανατολίηουν τθν ζρευνα προσ τθν ανάπτυξθ ωαρμακομορίων που δεν είναι παράγωγα οφτε του καρβοξυλικοφ οξζοσ, οφτε τθσ υδαντοΐνθσ, προκειμζνου να μποροφν να αποτελζςουν πικανζσ ενϊςεισ οδθγοφσ για μελλοντικι ανάπτυξθ δραςτικϊν ARIs, με βελτιωμζνα ωαρμακοδυναμικά και ωαρμακοκινθτικά χαρακτθριςτικά. 53

54 ΧΘΜΑ 2: αντιπροςωπευτικζσ δομζσ αναςτολζων τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ (ARIs) (Alexiou et al., 2009) 54

55 1.5. ΓΕΝΙΚΑ ΣΟΙΦΕΙΑ ΤΠΟΛΟΓΙΣΙΚΗ ΦΗΜΕΙΑ & IN SILICO ΜΕΛΕΣΨΝ Θ αυξανόμενθ ςυςςϊρευςθ γνϊςεων ςχετικά με τον τρόπο δράςθσ των ωαρμακολογικά δραςτικϊν ουςιϊν, αλλά και όςον αωορά ςτθν ωαρμακοκινθτικι τουσ πορεία και ςτθν επίδραςθ του οργανιςμοφ επ αυτϊν, οδιγθςε ςε αυςτθρότερεσ προδιαγραωζσ για αποτελεςματικά και αςωαλι ωάρμακα με ςυνεπακόλουκο τθν αφξθςθ του κόςτουσ ζρευνασ και του χρόνου ανάπτυξθσ νζων προϊόντων (Couvreur et al., 2005; Halliday et al., 1997). Από τθν άλλθ θ ιλιγγιϊδθσ εξζλιξθ των θλεκτρονικϊν υπολογιςτϊν και τθσ πλθροωορικισ, ζχουν οδθγιςει τισ τελευταίεσ δεκαετίεσ ςτθν ανάπτυξθ υπολογιςτικϊν μεκόδων (μεκόδων in silico) για το ςχεδιαςμό νζων ωαρμακολογικά δραςτικϊν ουςιϊν (Kurup, 2003; Nicolaou et al., 2009). Οι μζκοδοι αυτζσ αξιοποιοφν τθ ςυνεχϊσ αυξανόμενθ ςυςςϊρευςθ των πλθροωοριϊν και ςτοχεφουν ςτθ μείωςθ των ενϊςεων που ςυντίκενται και ςτθν ελαχιςτοποίθςθ των βιολογικϊν ελζγχων εξοικονομϊντασ ζτςι χρόνο, κόςτοσ ζρευνασ και άςκοπθ κυςία πειραματόηωων ενϊ παράλλθλα οδθγοφν ςε υποψιωιεσ δραςτικζσ ενϊςεισ που ζχουν μεγαλφτερεσ πικανότθτεσ να ανταπεξζλκουν επιτυχϊσ ςτισ κλινικζσ ωάςεισ και να ειςαχκοφν ωσ ωάρμακα ςτθν αγορά. Θ χθμειοπλθροωορικι ( chemoinformatics ) αποτελεί ζναν όρο που για πρϊτθ ωορά χρθςιμοποιικθκε από τον Dr. Frank Brown το 1998 και ςιμερα χρθςιμοποιείται ευρφτατα (Chen, 2006). Αναωζρεται ςε ζναν επιςτθμονικό τομζα αιχμισ: ςτο ςχεδιαςμό νζων μορίων με χριςθ ςφγχρονων υπολογιςτικϊν μεκόδων. Θ χθμειοπλθροωορικι (υπολογιςτικι χθμεία) αωορά ςτθ μετατροπι δεδομζνων ςε πλθροωορία, και τθσ πλθροωορίασ ςε γνϊςθ, με τελικό ςκοπό τθν επιτυχι ανακάλυψθ ωαρμάκων. Στόχοσ είναι θ αυτοματοποίθςθ τθσ διαδικαςίασ προςδιοριςμοφ και ςχεδιαςμοφ νζων μορίων με επικυμθτζσ ιδιότθτεσ, ελαχιςτοποιϊντασ τον παράγοντα τφχθ και τα χρονοβόρα και δαπανθρά πειράματα. Ο προςδιοριςμόσ τθσ δραςτικότθτασ, τθσ τοξικότθτασ και των ιδιοτιτων των ενϊςεων από τθ δομι τουσ και χωρίσ να είναι απαραίτθτθ θ πειραματικι ςφνκεςι τουσ υπιρξε ανζκακεν μια πρόκλθςθ για τθν υπολογιςτικι χθμεία. Σιμερα διατίκενται πολλά λογιςμικά προγράμματα που επιτρζπουν τον υπολογιςμό μεγάλου αρικμοφ παραμζτρων, οι οποίεσ ςυνιςτοφν μια δεξαμενι περιγραωικϊν μεταβλθτϊν (Ertl et al., 2003; Hall and Kier, 2001; Randic and Pompe, 2001), που προκφπτουν από τθ διςδιάςτατθ ι τθν τριςδιάςτατθ δομι των μορίων. Στθ δεφτερθ περίπτωςθ απαιτείται θ γεωμετρικι βελτιςτοποίθςθ των δομϊν μζςω ελαχιςτοποίθςθσ τθσ ενζργειασ. Ιδθ από τα μζςα τθσ δεκαετίασ του 60 αναπτφχκθκε από τουσ C. Hansch και Τ. Fujita θ κλαςςικι μζκοδοσ QSAR ι αλλιϊσ 2D-QSAR (Hansch and Fujita, 1964), που ςτθ ςυνζχεια κακιερϊκθκε ωσ πολφτιμο εργαλείο ςτθ ζρευνα για νζεσ και ωαρμακολογικά δραςτικζσ ουςίεσ και εξακολουκεί να χρθςιμοποιείται ακόμα και ςιμερα παρ όλθ τθν εξζλιξθ που ζχει παρατθρθκεί τθ τελευταία δεκαετία ςτο τομζα τθν μοριακισ μοντελοποίθςθσ, αλγορικμικισ ανάλυςθσ δεδομζνων και χθμειοπλθροωορικισ (Hansch et al., 2002). Σφμωωνα με τθ ςυγκεκριμζνθ μζκοδο και με χριςθ τθσ Ρολλαπλισ Γραμμικισ Ανάλυςθσ Ραλινδρόμθςθσ κατά Hansch (Hansch and Steward, 1964) ςυςχετίηεται θ βιολογικι δράςθ με επιλεγμζνεσ ωυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ των μορίων. Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να αναωερκεί πωσ εκτόσ από τθν Ρολλαπλι Γραμμικι Ανάλυςθ Ραλινδρόμθςθσ εωαρμόηεται και θ Μθ Γραμμικι Ανάλυςθ Ραλινδρόμθςθσ ενϊ ςε πρόςωατεσ 55

56 μελζτεσ χρθςιμοποιείται θ Ρολυμεταβλθτι Ανάλυςθ Δεδομζνων (Multivariate Data Analysis), θ Ανάλυςθ Κφριων Συνιςτωςϊν (Principal Component Analysis, PCA) και θ Ανάλυςθ Μερικϊν Ελαχίςτων Τετραγϊνων (Partial Least Square, PLS). Θ ανάπτυξθ του QSAR ςε QSAR τριϊν διαςτάςεων (3D-QSAR) γίνεται με τθν εωαρμογι τθσ Συγκριτικισ Aνάλυςθσ Μοριακϊν Ρεδίων (Comparative Molecular Field Analysis, CoMFA). Εκτόσ όμωσ από τισ μεκοδολογίεσ 2D-QSAR και 3D-QSAR, τθν τελευταία δεκαετία τεράςτιο είναι το ενδιαωζρον προσ τα νευρωνικά δίκτυα τεχνθτι νοθμοςφνθ (Neural Networks (NNs)- Artificial Intelligence). Επινοικθκαν το 1943 από τον Αμερικανό νευροωυςιολόγο Γουόρεν Μακ Κοφλοκ και το μακθματικό Γουόλτερ Ριτσ. Ζνα νευρωνικό δίκτυο είναι ζνασ παράλλθλα διανεμθμζνοσ επεξεργαςτισ αποτελοφμενοσ από απλζσ μονάδεσ επεξεργαςίασ, ο οποίοσ ζχει μία εκ ωφςεωσ κλίςθ να αποκθκεφει και να χρθςιμοποιεί εμπειρικι γνϊςθ. Θ ομοιότθτα του νευρωνικοφ δικτφου με τον τρόπο λειτουργίασ του ανκρϊπινου εγκεωάλου ζγκειται αωενόσ μεν ςτισ ςυνδζςεισ μεταξφ των νευρϊνων, δθλαδι των μονάδων επεξεργαςίασ του δικτφου και αωετζρου ςτο γεγονόσ ότι το δίκτυο αποκτά γνϊςθ από το περιβάλλον. Οι αρχιτεκτονικζσ τεχνθτϊν νευρωνικϊν δικτφων είναι ποίκιλλεσ και περιλαμβάνουν μεταξφ άλλων: Δίκτυα πρόςκιασ τροωοδότθςθσ (feedforward neural networks) (Hornik et al., 1989), ςυςχετιςτικά δίκτυα (δίκτυα Hopfield, BAM) (Hopfield, 1982), δίκτυα με ανατροωοδότθςθ (recurrent neural networks), δίκτυα ανταγωνιςτικισ μάκθςθσ (χάρτεσ Kohonen, μοντζλα ART), δίκτυα ακτινικισ ςυνάρτθςθ βάςθσ (radial basis function, RBF) και άλλα (Haykin, 2008) ενϊ ζχουν αναπτυχκεί και νευρωνικά δίκτυα με αςφμμετρεσ ςυνάψεισ, τα οποία επιδεικνφουν αςυμπτωτικι ςυμπεριωορά (Dimopoulos, 1989). Για τθν ανάπτυξθ ενόσ μοντζλου νευρωνικοφ δικτφου είναι απαραίτθτθ θ τροωοδοςία τθσ δομισ του μοντζλου με πειραματικά δεδομζνα, ενϊ για κάκε αρχιτεκτονικι ζχουν αναπτυχκεί εξειδικευμζνοι αλγόρικμοι εκπαίδευςθσ, δθλαδι αλγόρικμοι που προςδιορίηουν τισ τιμζσ των παραμζτρων του μοντζλου, ζτςι ϊςτε το νευρωνικό δίκτυο να ζχει δυνατότθτεσ πρόβλεψθσ ακόμθ και αν τροωοδοτθκεί με δεδομζνα που δεν χρθςιμοποιικθκαν ςτθ διαδικαςία εκπαίδευςθσ. Τεχνθτά νευρωνικά δίκτυα μποροφν να χρθςιμοποιθκοφν τόςο για τθν επίλυςθ προβλθμάτων μθ γραμμικισ παλινδρόμθςθσ (nonlinear regression) όςο και για τθν επίλυςθ προβλθμάτων κατθγοριοποίθςθσ (classification). Σιμερα βρίςκονται ςε ωάςθ ταχείασ ανάπτυξθσ και όλο και περιςςότερεσ μελζτεσ αωοροφν ςτθ χριςθ αυτϊν για το ςχεδιαςμό και ανάπτυξθ νζων ωαρμάκων (Burbidge et al., 2001; Gasteiger et al., 2003; Harget and Bodor, 1992; Schneider, 2000). 56

57 2. ΑΝΣΙΚΕΙΜΕΝΟ & ΚΟΠΟ Το ζνηυμο τθσ ALR2 ερευνάται εδϊ και αρκετά χρόνια όςο αωορά τθν εμπλοκι του ςτθν αιτιολογία χρόνιων πακολογικϊν καταςτάςεων με αξιοςθμείωτο παράδειγμα τισ χρόνιεσ επιπλοκζσ του ςακχαρϊδθ διαβιτθ. Διαρκισ και εντατικι ζρευνα γίνεται με ςκοπό τθν εφρεςθ αποτελεςματικϊν ARIs. Τισ τελευταίεσ δεκαετίεσ, πλικοσ ελπιδοωόρων ARIs με ςθμαντικό δυναμικό τόςο ςε in vitro όςο και ςε in vivo ςυςτιματα ζχουν αναπτυχκεί, μα μόνο θ επαλρεςτάτθ (Epalrestat, Kinedak ) είναι εμπορικά διακζςιμθ και μόνο ςτθν Λαπωνία. Πλοι οι υπόλοιποι ARIs που ζχουν ειςαχκεί ςε κλινικζσ μελζτεσ ζχουν αποςυρκεί εξαιτίασ μθ ικανοποιθτικϊν ωαρμακοκινθτικϊν ιδιοτιτων ι παρενεργειϊν. Ζτςι, αποτελεί αναγκαιότθτα θ ανάπτυξθ νζων χθμειοτφπων, που κα ςτεροφνται τα προαναωερόμενα μειονεκτιματα των ποικίλων ARIs που απζτυχαν ςτισ διεξαχκείςεσ κλινικζσ μελζτεσ. Ρροσ τθν κατεφκυνςθ αυτι πολλζσ μελζτεσ προςανατολίηουν τθν ζρευνα προσ τθν ανάπτυξθ ωαρμακομορίων που δεν είναι παράγωγα οφτε του καρβοξυλικοφ οξζοσ, οφτε τθσ υδαντοΐνθσ, προκειμζνου να μποροφν να αποτελζςουν πικανζσ ενϊςεισ οδθγοφσ για μελλοντικι ανάπτυξθ δραςτικϊν ARIs, με βελτιωμζνα ωαρμακοδυναμικά και ωαρμακοκινθτικά χαρακτθριςτικά. Στθν παροφςα διδακτορικι διατριβι πραγματοποιικθκε θ ωαρμακοχθμικι μελζτθ νζων ενϊςεων ωσ πικανϊν ARIs. Ο ςχεδιαςμόσ ςτθρίχκθκε ςτθν λογικι τθσ αντικατάςταςθσ λειτουργικϊν ομάδων τθσ ζνωςθσ οδθγοφ, του 2-(ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικοφ οξζοσ, από ποικίλθσ χθμικισ δομισ ομάδεσ που εμωανίηουν χαρακτθριςτικά μθ κλαςςικισ ιςοςτζρειασ (Lima and Barreiro, 2005; Patani and LaVoie, 1996; Wagener and Lommerse, 2006) με τθν ομάδα του καρβοξυλίου. Στθν επιλογι τθσ ζνωςθσ οδθγοφ ςυνζβαλε κετικά το γεγονόσ πωσ θ χθμικι οντότθτα των ςουλωοναμιδίων (R 2 SO 2 NR 2 ) αποτελεί μια κοινά αποδεκτι δομι ςτθ ωαρμακευτικι χθμεία όταν ενςωματϊνεται ςε πικανά μικροφ μοριακοφ βάρουσ ωαρμακομόρια, μια που ζχει και τθ δυνατότθτα να προκαλεί ποικίλεσ θλεκτροςτατικζσ αλλθλεπιδράςεισ με μοριακοφσ ςτόχουσ και πρωτεΐνεσ (κατά το χρονικό διάςτθμα ζχουν δθμοςιευτεί εννζα διπλϊματα ευρεςιτεχνίασ που περιζχουν αυτι τθ χθμικι οντότθτα και αωοροφν ευρφ ωάςμα βιολογικϊν δράςεων) (Reitz et al., 2009). Αναωορικά, θ ειςαγωγι των ςουλωοναμιδίων ςτθν κλινικι ιατρικι χρονολογείται ςτθν δεκαετία του 30, με το απλό ωαρμακομόριο του p- αμινοβενηολοςουλωοναμιδίου, που ςθματοδότθςε τθν αρχι τθσ ανάπτυξθσ αποτελεςματικϊν αντιμικροβιακϊν. Ρράγματι, πρόκειται για ζνα χθμειότυπο που είναι πλοφςιοσ ςε θλεκτρόνια και γενικά καλά ανεκτόσ από τον οργανιςμό και προςωζρεται για περαιτζρω χθμικζσ τροποποιιςεισ με τελικό ςκοπό τθν αλλθλεπίδραςθ με ςυγκεκριμζνουσ μοριακοφσ ςτόχουσ. Ζχει ανακοινωκεί πωσ ςειρά ενϊςεων, παραγϊγων του 2-(ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικοφ οξζοσ (αροχλοςουλωονυλογλυκίνθσ) παρουςιάηουν ςθμαντικι αναςταλτικι δράςθ επί του ενηφμου αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ (DeRuiter and Mayfield, 1990; DeRuiter et al., 1987; Mayfield and DeRuiter, 1987). Οι παραπάνω όμωσ αναςτολείσ τθσ ALR2, ωσ παράγωγα του οξικοφ οξζοσ 57

58 (υπολογιςμζνεσ τιμζσ pka= 3,24 ωσ 3,43) είναι ςχεδόν πλιρωσ ιονιςμζνοι ςτο ωυςιολογικό ph και πικανά ςυνδυάηουν μθ ικανοποιθτικζσ ωαρμακοκινθτικζσ ιδιότθτεσ και ωτωχι δράςθ in vivo. Επιλζχκθκε λοιπόν, ωσ ζνωςθ οδθγόσ το 2-(ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικό οξφ (το μθ υποκατεςτθμζνο παράγωγο τθσ προαναωερόμενθσ ςειράσ ARIs, παραγϊγων τθσ αροχλοςουλωονυλογλυκίνθσ) και μια ςειρά από μθ κλαςςικζσ ιςοςτερείσ ομάδεσ του οξικοφ οξζοσ με τελικό ςκοπό τθν ανάπτυξθ πικανϊν ARIs (ςχιμα 3). ΧΘΜΑ 3: βιοϊςοςτερισ αντικατάςταςθ τθσ ομάδασ του καρβοξυλίου Θ επιλογι τθσ ομάδασ τθσ διωκοροωαινόλθσ για τθν αντικατάςταςθ του καρβοξυλίου ςτθν ζνωςθ οδθγό ςτθρίχκθκε ςε προθγοφμενεσ αναωορζσ ςχετικά με τθν παρουςία μθ κλαςςικισ βιοϊςοςτζρειασ μεταξφ των ομάδων αυτϊν (Qiu et al., 1999) αλλά κυρίωσ ςτο ότι μπορεί να οδθγιςει ςε βελτίωςθ τθσ αναςταλτικισ δράςθσ ωσ προσ τθν ALR2 και των ωαρμακοκινθτικϊν ιδιοτιτων (Nicolaou et al., 2004; Sturm et al., 2006). Θ τιμι pka τθσ ωαινόλθσ από το 9.8 μειϊνεται ςτο 7.1 με τθν 2,6-διωκορο-υποκατάςταςθ και ςτο ωυςιολογικό ph είναι ιονιςμζνθ ςε μικρότερο βακμό από το καρβοξφλιο. Πςο αωορά τα άτομα του ωκορίου, ζχουν παρόμοιο μζγεκοσ με το υδρογόνο, είναι αςκενϊσ πιο λιπόωιλα και είναι δυνατόν να ςχθματίςουν δεςμοφσ υδρογόνου και να μιμθκοφν με αυτό τον τρόπο το οξυγόνο του καρβονυλίου. Επομζνωσ θ ομάδα τθσ 2,6- διωκοροωαινόλθσ μπορεί να κεωρθκεί ωσ μια λιγότερο όξινθ και περιςςότερο λιπόωιλθ ιςοςτερισ ομάδα ςυγκρινόμενθ με τθν καρβοξυλικι. Οι ομάδεσ του μεκυλοςουλωανυλαμιδίου και του τετραηολίου μοιάηουν με τθ καρβοξυλικι κυρίωσ όςο αωορά τισ ωυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ ςχετικζσ με τθ οξφτθτα (υπολογιςμζνεσ τιμζσ pka ~5), με τθ ομάδα του τετραηολίου να είναι περιςςότερο ςτακερι και λιπόωιλθ (Yuan and Silverman, 2006). Τζλοσ, θ κυκλοςερίνθ, που ζχει δομικζσ ομοιότθτεσ με τισ υδαντοΐνεσ (γνωςτι κατθγορία ARIs), μελετικθκε ωσ πικανι ιςοςτερι δομι του καρβοξυλίου ωσ μια δομι με μειωμζνθ οξφτθτα και αυξθμζνθ λιποωιλικότθτα. 58

59 Τα αποτελζςματα που προζκυψαν ςχετικά με τθν in vitro ικανότθτα αναςτολισ του ενηφμου ALR2 από τισ προαναωερόμενεσ ενϊςεισ (ςχιμα 3) ιταν ιδιαίτερα ενκαρρυντικά ςτθν περίπτωςθ του παραγϊγου τθσ 2,6-διωκοροωαινόλθσ. Κρίκθκε λοιπόν ςκόπιμο να αναπτυχκεί ςειρά παραγϊγων αυτισ τθσ τάξθσ ενϊςεων. Επιλζχκθκαν διάωοροι υποκαταςτάτεσ, κυρίωσ δότεσ θλεκτρονίων (πχ. OCH 3, -NH 2 ) λαμβάνοντασ υπόψθ τθν αρχικι ςειρά των παραγϊγων του 2- (ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικοφ οξζοσ όπου τζτοιου είδουσ υποκατάςταςθ βρζκθκε να προκαλεί βελτίωςθ τθσ δράςθσ (DeRuiter et al., 1987). Επίςθσ ζγινε προςπάκεια αφξθςθσ τθσ αρωματικότθτασ με τθν ειςαγωγι ενόσ πυρρολικοφ δακτυλίου για πικανι περαιτζρω αφξθςθ τθσ δράςθσ κακϊσ και ειςαγωγι ενόσ τριωκορομεκυλο-υποκαταςτάτθ που απαντάται ςε κάποιουσ αναςτολείσ και πικανά να προςδίδει μειωμζνθ τοξικότθτα (Kirk, 2006). Επίςθσ, επικεντρϊνοντασ τθν προςοχι ςτο αμινο-υποκατεςτθμζνο παράγωγο, που προςωζρεται για περαιτζρω χθμικζσ τροποποιιςεισ, ςχεδιάςτθκαν παράγωγα με μια επιπλζον ομάδα καρβονυλίου κακϊσ και ζνα αρωματικό δακτφλιο ι παράγωγα ουρίασ. Θ επιλογι των ςυγκεκριμζνων χθμικϊν τροποποιιςεων ςτθρίχκθκε ςε προθγοφμενεσ αναωορζσ πωσ αποτελοφν επιπλζον ςθμεία αλλθλεπίδραςθσ με το ενεργό κζντρο τθσ ALR2 (Kador and Sharpless, 1983; Mayfield and DeRuiter, 1987). Ρραγματοποιικθκε λοιπόν θ ανάπτυξθ ςειράσ ςουλωοναμιδίων, παραγϊγων τθσ 2,6- διωκοροωαινόλθσ (ςχιμα 4). ΧΘΜΑ 4: ςουλδοναμίδια, παράγωγα τθσ διωκοροωαινόλθσ 59

60 Αναςκόπθςθ ςτα βιβλιογραωικά δεδομζνα ςχετικά με τουσ υπό ανάπτυξθ ARIs (Rakowitz et al., 2006) αλλά και αυτοφσ που βρίςκονται ςε προχωρθμζνεσ κλινικζσ μελζτεσ (πχ ρανιρεςτάτθ ςε κλινικζσ μελζτεσ ΛΛΛ ςτισ Θ.Ρ.Α) (Schemmel et al., 2009) αναδεικνφει τθν παρουςία αλογονομζνων βενηολικϊν δακτυλίων ωσ υποκαταςτατϊν που πικανά ςυμβάλλουν ςθμαντικά ςτθν βελτίωςθ τθσ αναςταλτικισ δράςθσ. Θ παρατιρθςθ αυτι ςε ςυνδυαςμό με το όλο και αυξανόμενο ενδιαωζρον τθσ ωαρμακευτικισ κοινότθτασ προσ τθν ευνοϊκι ςε πολλζσ περιπτϊςεισ ειςαγωγι ατόμων F ςε όλο και περιςςότερα ωαρμακομόρια (Kirk, 2006), οδιγθςε ςτθν επιλογι του 4-βρωμο-2-ωκορομεκυλοβενηολίου ωσ μιασ πικανισ προνομιοφχασ δομισ privileged scaffold (Duarte et al., 2007) που κα μποροφςε να ενςωματωκεί ςτο χθμειότυπο των προαναωερόμενων διωκοροωαινολικϊν παραγϊγων ωσ υποκαταςτάτθσ ςτο άηωτο του ςουλωοναμιδίου. Ρροσ τθν κατεφκυνςθ αυτι κρίκθκε απαραίτθτο ο ςχεδιαςμόσ να προχωριςει και ςε άλλεσ υποκαταςτάςεισ παρόμοιασ χθμικισ δομισ με τθν επιλογι ενόσ ακόμα αρωματικοφ υποκαταςτάτθ, του ωαινυλοςουλωοξειδίου. Οι χθμειότυποι που αναπτφχκθκαν παρουςιάηονται ςτο επόμενο ςχιμα (ςχιμα 5). ΧΘΜΑ 5: Ν-υποκατεςτθμζνα ςουλωοναμίδια, παράγωγα τθσ διωκοροωαινόλθσ Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτεί πωσ οι ιδιότθτεσ που κακορίηουν τθν απορρόωθςθ κακϊσ και τθν κινθτικι και δυναμικι των νζων ενϊςεων, γνωςτζσ με το ακρωνφμιο ADME (Absorption, Distribution, Metabolism, Elimination, ADME) αποτελοφν κριτιρια που πρζπει να διερευνϊνται παράλλθλα με τθ δράςθ ςτουσ υποδοχείσ/ζνηυμα, ϊςτε να εξαςωαλίηεται θ αποτελεςματικότθτα και θ αςωάλειά των νζων μορίων (Muegge, 2003; Vistoli et al., 2008). Στα πλαίςια αυτά ζχουν προτακεί ςυγκεκριμζνα όρια ι εφρθ τιμϊν για οριςμζνεσ ωυςικοχθμικζσ και μοριακζσ ιδιότθτεσ που κακορίηουν τα ωαρμακοχθμικά χαρακτθριςτικά (drug-likeness), με κυριότερο τον κανόνα του 5 που προτάκθκε το 1997 από τον Lipinksi και προτείνει ανϊτατα όρια για τθ λιποωιλία, το μοριακό βάροσ και τθν ικανότθτα ατόμων για ςχθματιςμό δεςμϊν υδρογόνου ωσ δότεσ ι ωσ δζκτεσ (Lipinski et al., 2001) και ςυμπλθρϊκθκε ακολοφκωσ με το εμβαδόν πολικισ επιωάνειασ (Blake, 2000). Τα προαναωερόμενα κριτιρια λιωκθκαν υπόψθ κατά τθν ανάπτυξθ των προαναωερόμενων ςτο ςχεδιαςμό νζων ARIs. 60

61 Για τισ ςυνκζςεισ όλων των προαναωερόμενων ενϊςεων εωαρμόςτθκαν κακιερωμζνεσ αλλά και νζεσ ςυνκετικζσ προςεγγίςεισ ενϊ χρειάςτθκε να πραγματοποιθκεί θ ςφνκεςθ πολλϊν ενϊςεων ιδθ γνωςτϊν από τθ βιβλιογραωία κυρίωσ με ςκοπό τθσ αξιολόγθςθ και ςφγκριςθ των βιολογικϊν αποκρίςεων κάτω από τισ ίδιεσ in vitro πειραματικζσ ςυνκικεσ (ςυνοπτικι παρουςίαςθ των δομϊν όλων των ενϊςεων που ςυντζκθκαν ςτο παράρτθμα Α, ςελ. 165). Οι τελικζσ ενϊςεισ εξετάςτθκαν ωσ προσ τθν ικανότθτα τουσ να αναςτζλλουν in vitro τo ζνηυμο ALR2 κακϊσ και το ομόλογο ζνηυμο ALR1, προκειμζνου να προςδιοριςτεί θ εκλεκτικότθτα των νζων ωαρμακομορίων. Επιπλζον, προςδιορίςτθκε το αντιοξειδωτικό δυναμικό των δραςτικϊν τελικϊν ενϊςεων ςε δυο διαωορετικά in vitro πειραματικά πρότυπα: ςτο ομογενζσ ςφςτθμα ςάρωςθσ τθσ ελεφκερθσ ρίηασ DPPH και ςτο ετερογενζσ ςφςτθμα λιπιδικισ υπεροξείδωςθσ DOPC λιποςωμάτων. Στα πλαίςια τθσ in silico μελζτθσ των νζων ωαρμακομορίων αρχικά πραγματοποιικθκε ο υπολογιςμόσ επιλεγμζνων ωυςικοχθμικϊν ιδιοτιτων με χριςθ κατάλλθλων υπολογιςτικϊν προγραμμάτων και ζγινε προςπάκεια διεξαγωγισ ποςοτικϊν ςχζςεων δομισ-δράςθσ (quantitive structure-activity relationships, QSAR). Επίςθσ εξιχκθςαν ςυμπεράςματα ςχετικά με τισ δομικζσ και ωυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ των μθ κλαςςικϊν ιςοςτερϊν ομάδων που ενςωματϊκθκαν ςτθν ζνωςθ οδθγό (lead compound) με ςκοπό τθν εμωάνιςθ αναςταλτικισ δράςθ προσ το ζνηυμο-ςτόχο τθσ ALR2. Τελικόσ ςτόχοσ τθσ in silico μελζτθσ ιταν θ διεξαγωγι χριςιμων και αξιοποιιςιμων ςυμπεραςμάτων για τον μετζπειτα ςχεδιαςμό πιο αποτελεςματικϊν και εκλεκτικϊν ARIs. Επίςθσ, με χριςθ δεδομζνων τθσ βιβλιογραωίασ που αωοροφν ARIs, ζγινε προςπάκεια διεξαγωγισ γενικότερων ςχζςεων QSAR ενϊ κα πρζπει να ςθμειωκεί πωσ τα ίδια δεδομζνα χρθςιμοποιικθκαν από ςυνεργαηόμενθ ερευνθτικι ομάδα για τθν δθμιουργία ενόσ νευρωνικοφ δικτφου NN ωσ μοντζλο πρόβλεψθσ και μελζτθσ ARIs ποικίλθσ χθμικισ δομισ. Θ προβλεπτικι ικανότθτα του ΝΝ μοντζλου αξιολογικθκε ςε ςχζςθ με τα πραγματικά in vitro δεδομζνα που προζκυψαν για τουσ νζουσ χθμειότυπουσ που αναπτφχκθκαν ςτα πλαίςια αυτισ τθσ διδακτορικισ διατριβισ. 61

62 62

63 3. ΓΕΝΙΚΑ ΣΟΙΦΕΙΑ ΤΝΘΕΣΙΚΗ ΦΗΜΕΙΑ ΣΨΝ ΚΤΡΙΨΝ ΚΑΣΗΓΟΡΙΨΝ ΕΝΨΕΨΝ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΗ ΔΙΑΣΡΙΒΗ 3.1. ΓΕΝΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ ΤΝΘΕΗ ΟΤΛΥΟΝΑΜΙΔΙΨΝ Θ τυπικι ςφνκεςθ των ςουλωοναμιδίων πραγματοποιείται γενικά με αντίδραςθ μιασ αμίνθσ με ςουλωονυλοχλωρίδια ι ανυδρίτεσ, ςυχνά παρουςία μιασ βάςθσ ςε κάποιον απρωτικό διαλφτθ, με αποδόςεισ που ποικίλουν ανά περίπτωςθ (ςχιμα 6) (Greenfield and Grosanu, 2008). ΧΘΜΑ 6 Το μειονζκτθμα αυτισ τθσ μεκόδου είναι ο ςχθματιςμόσ πζρα του επικυμθτοφ μονοςουλωοναμιδίου (1) και του αντίςτοιχου διςουλωοναμιδίου (3), δια μζςω του ςχθματιςμοφ του αντίςτοιχου μεταβατικοφ ανιόντοσ (2). Θ ςυγκζντρωςθ του ανιόντοσ (2), ο πυρθνόωιλοσ χαρακτιρασ του και επομζνωσ θ χθμικι δραςτικότθτα του εξαρτϊνται από τθ ωφςθ των υποκαταςτατϊν R και R 1, κακιςτϊντασ δφςκολθ τθν εωαρμογι μιασ γενικισ μεκόδουσ για τθν αποωυγι τθσ διςουλωονυλίωςθσ αμινϊν. Οι Greenfield και Grosanu (Greenfield and Grosanu, 2008) πρότειναν ςυνδυαςμό ςυνκθκϊν αντίδραςθσ (διχλωρομεκάνιο ωσ διαλφτθσ επιλογισ, τριαικυλαμίνθ ι δι-ιςοπροπυλο-αικυλαμίνθ ωσ βάςθ και ανυδρίτεσ ωσ μζςα ςουλωονυλίωςθσ) όπου κα καταναλϊνεται πλιρωσ θ πρωτοταγισ αμίνθ, κα ςχθματίηονται μονο- και δι-ςουλωοναμίδια και ςτθ ςυνζχεια in situ υπό τισ αλκαλικζσ ςυνκικεσ ςτο μίγμα τθσ αντίδραςθσ κα πραγματοποιείται υδρόλυςθ του διςουλωοναμιδίου ςτο επικυμθτό μονοςουλωοναμίδιο. Υπό αυτζσ τισ ςυνκικεσ θ ωφςθ των υποκαταςτατϊν δε ωάνθκε να επθρεάηει τθν απόδοςθ των αντιδράςεων όςο αωορά το επικυμθτό προϊόν. Άλλοσ ζνασ αναμενόμενοσ τρόποσ ςφνκεςθσ ςουλωοναμιδίων κα ιταν θ απευκείασ ςφηευξθ ςουλωονικϊν οξζων ι αλάτων τουσ με αμίνεσ και οι μζκοδοι που ζχουν αναωερκεί είναι οι ακόλουκεσ: α) Σφμωωνα με τθ πρϊτθ μζκοδο, με χριςθ πολυμερϊν του δι-τριωκορομεκανικϊν ςουλωονικϊν εςτζρων τθσ τριωαινυλοωωςωίνθσ (triphenylphosphine ditriflate, TPTf 2 O) (Elson et al., 2004) ενεργοποιοφνται άλατα του ςουλωονικοφ οξζοσ με πυριδίνθ ι τριαικυλαμίνθ ςε διχλωρομεκάνιο ωσ διαλφτθ, ςχθματίηοντασ πενταωκοροωαινυλοςουλωονικοφσ εςτζρεσ ωσ πρόδρομεσ ενϊςεισ για τθ ςφνκεςθ των ςουλωοναμιδίων (ςχιμα 7)(Caddick et al., 2004a). 63

64 ΧΘΜΑ 7 Οι ςυγκεκριμζνοι εςτζρεσ είναι εφκολοι ςτο χειριςμό (κρυςταλλικζσ και ςτακερζσ ενϊςεισ) και μποροφν να αντιδράςουν υπό ζνυδρεσ ςυνκικεσ και ςχετικά υψθλζσ κερμοκραςίεσ, αντικακιςτϊντασ τα ςουλωονυλοχλωρίδια που είναι ςχετικά αςτακι και αδφνατο να μετζχουν ςε αντιδράςεισ υπό παρόμοιεσ ςυνκικεσ, με αμίνεσ προσ ςχθματιςμό ςουλωοναμιδίων (ςχιμα 8). ΧΘΜΑ 8 Θ ίδια ερευνθτικι ομάδα ανζπτυξε μζκοδο εωαρμογισ ακτινοβολίασ μικροκυμάτων ςε αυτοφ του τφπου τισ αντιδράςεισ (ςχιμα 9) (Caddick et al., 2004b) με ςκοπό τθν αφξθςθ των αποδόςεων. ΧΘΜΑ 9 Ρρόκειται για μια μζκοδο που μπορεί να εωαρμοςτεί ςε μεγάλθ πλθκϊρα υποςτρωμάτων, όπου ποικίλεσ λειτουργικζσ ομάδεσ κακϊσ και δομικά μοτίβα είναι ανεκτά τόςο όςο αωορά τουσ εςτζρεσ όςο και τισ αμίνεσ. Οι βζλτιςτεσ ςυνκικεσ αντίδραςθσ αωοροφν ςτθ χριςθ Ν- μεκυλοπυρρολιδόνθσ (NMP) ι τετραχδροωουρανίου (THF) ωσ διαλφτθ ενϊ ωσ βάςθ χριςθ τθσ τριαικυλαμίνθσ ι του 1,8-διαηοδικυκλο[5.4.0]ενδεκα-7-ενίου (DBU) που αποτελεί μια ιδιαίτερα δραςτικι βάςθ. 64

65 β) Θ δεφτερθ μζκοδοσ αωορά ςτθν απευκείασ αντίδραςθ ςουλωονικοφ οξζοσ με ιςοκυανίδιο ςε κερμοκραςία δωματίου και χωρίσ τθ χριςθ καταλφτθ (ςχιμα 10) (Shaabani et al., 2007). ΧΘΜΑ 10 Ο προτεινόμενοσ μθχανιςμόσ (ςχιμα 11) τθσ παραπάνω αντίδραςθσ περιλαμβάνει πρωτονίωςθ του ιςοκυανιδίου από το αλκυλο- ι αρυλο- ςουλωονικό οξφ ςχθματίηοντασ το ενδιάμεςο προϊόν (α), το οποίο ςτθ ςυνζχεια υπό τθν επίδραςθ του νεροφ οδθγεί ςτο ςχθματιςμό του ενδιάμεςου τριτοταγοφσ ςουλωοναμιδίου (β), το οποίο τελικά μετά από τθν απομάκρυνςθ του μυρμθκικοφ οξζοσ δίνει το τελικό ςουλωοναμίδιο (γ). ΧΘΜΑ 11 γ) Θ τρίτθ μζκοδοσ αωορά τθν χριςθ τθσ 2,4,6-τριχλωρο-[1,3,5]-τριαηίνθσ (TCT) ςτθ ςφνκεςθ ςουλωοναμιδίων απευκείασ από ςουλωονικά οξζα ι άλατα αυτϊν (ςχιμα 12). Ρζρα από τθ ςυμβατικι μζκοδο με κζρμανςθ ςε κερμοκραςία βραςμοφ για ~20 ϊρεσ, υπάρχει και θ δυνατότθτα εωαρμογισ ακτινοβολίασ μικροκυμάτων. ΧΘΜΑ 12 Τζλοσ αξίηει να αναωερκεί ακόμα μια μζκοδοσ ςφνκεςθσ ςουλωοναμιδίων με δυνατότθτα ποικίλων υποκαταςτάςεων χωρίσ τθ χριςθ βάςθσ και χωρίσ διαλφτθ (solid-phase synthesis) όπωσ δθμοςιεφτθκε από τουσ Sharma και Das (ςχιμα 13) (Sharma and Das, 2004). 65

66 ΧΘΜΑ ΓΕΝΙΚΕ ΜΕΘΟΔΟΙ ΤΝΘΕΗ 5-ΤΠΟΚΑΣΕΣΗΜΕΝΨΝ-1Η-ΣΕΣΡΑΖΟΛΙΨΝ Θ τυπικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ 5-υποκατεςτθμζνων-1Η-τετραηολίων αωορά ςτθν αντίδραςθ μιασ πθγισ υδροαηωϊκοφ οξζοσ (ΘΝ 3 ), όπωσ για παράδειγμα αηίδιο του νατρίου (ΝαΝ 3 ) που αντιδρά με χλωριοφχο αμμϊνιο ι κάποιο άλλο άλασ, και μιασ ομάδασ δζκτθ θλεκτρονίων όπωσ τα νιτρίλια (R-CN) ςε αδρανι οργανικό διαλφτθ όπωσ το διμεκυλοωορμαμίδιο (DMF) ι το διμεκυλοςουλωοξείδιο (DMSO) και ςχετικά υψθλζσ κερμοκραςίεσ (Finnegan et al., 1958; Herr, 2002). Ο μθχανιςμόσ τθσ αντίδραςθσ γενικά αωορά 1,3-διπολικι κυκλοπροςκικθ όπου το νιτρίλιο δρα ωσ το διπολόωιλο προσ το αηίδιο που αποτελεί το 1,3-δίπολο (ςχιμα 14) και πιο ςυγκεκριμζνα παρατθρείται πυρθνόωιλθ προςβολι από το ιόν του αηιδίου ςτο άτομο C του νιτριλίου και κλείςιμο του δακτυλίου για το ςχθματιςμό του τετραηολίου (Aureggi and Sedelmeier, 2007). ΧΘΜΑ 14 Θ ςυγκεκριμζνθ αντίδραςθ βρζκθκε να ευνοείται υπό ςυνκικεσ όξινθσ κατάλυςθσ, αωοφ θ εμωάνιςθ δ + ωορτίου ςτο άτομο C του νιτριλίου είναι απαραίτθτθ για τθν πυρθνόωιλθ προςβολι από το ιόν του αηιδίου (ςχιμα 15). Ριο ςυγκεκριμζνα προςκθκθ 4-10% υδραηωϊκοφ οξζοσ, αμινο-υδροαηιδίων κακϊσ και οξζων κατά Lewis (πχ. BF 3 ) ςχεδόν διπλαςιάηουν τθν ταχφτθτα τθσ αντίδραςθσ (Finnegan et al., 1958). ΧΘΜΑ 15 66

67 Θ ςυγκεκριμζνθ μζκοδοσ όμωσ δεν ενδείκνυται για ςτερεοχθμικά παρεμποδιςμζνα νιτρίλια ενϊ εξϊκερμθ διάςπαςθ των προϊόντων τθσ αντίδραςθσ οδθγεί ςτο ςχθματιςμό εκρθκτικϊν υλϊν (πχ ΘΝ 3 ), κακιςτϊντασ ζτςι τθν αντίδραςθ μθ αςωαλι. Επίςθσ πολλοί οργανικοί διαλφτεσ δεν είναι ςτακεροί ςτισ απαιτοφμενεσ υψθλζσ κερμοκραςίεσ αλλά παρ όλα αυτά χρθςιμοποιείται ςυνικωσ το DMF (χαμθλότερο ςθμείο ηζςθσ) ζναντι του DMSO επειδι υπερζχει όςο αωορά τθν ευκολότερθ απομάκρυνςθ του. Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να αναωερκεί πωσ πολλζσ παραλλαγζσ τθσ ςυνκετικισ μεκόδου που αωορά τθ ςφνκεςθ 5-υποκατεςτθμζνων-1Η-τετραηολίων από νιτρίλια με χριςθ αηιδίου του νατρίου ζχουν αναωερκεί (Das et al., 2010; Herr, 2002). Χαρακτθριςτικά αναωζρεται πωσ ο Koguro και ςυνεργάτεσ ανζπτυξαν μζκοδο ςφνκεςθσ τετραηολίων από νιτρίλια με χριςθ ανόργανου αηιδίου και άλατοσ τριαικυλαμίνθσ, ςε αρωματικό διαλφτθ (ςχιμα 16) (Koguro et al., 1998). Τα πλεονεκτιματα τθσ μεκόδου αυτισ αωοροφν ςτο ότι δε ςχθματίηονται παραπροϊόντα, θ αντίδραςθ γίνεται ταχφτατα με πολφ καλζσ αποδόςεισ και τα προϊόντα εφκολα απομονϊνονται. ΧΘΜΑ 16 Νεότερεσ μζκοδοι ςφνκεςθσ 5-υποκατεςτθμζνων-1Η-τετραηολίων από νιτρίλια αωοροφν τθ χριςθ αςωαλζςτερων (διαλυόμενων ςε οργανικοφσ διαλφτεσ) αηιδίων όπωσ το τριμεκυλοςιλλυλοαηίδιο (εμπορικά διακζςιμο και με υψθλό ςθμείο ηζςθσ 105 C) όπωσ αναωζρεται από τουσ Wittenberger και τουσ ςυνεργάτεσ του (Wittenberger and Donner, 1993), παρουςία καταλυτικισ ποςότθτασ οξειδίου του διβουτυλοκαςςιτζρου (ςχιμα 17). ΧΘΜΑ 17 Ζνασ προτεινόμενοσ μθχανιςμόσ για τθν παραπάνω αντίδραςθ περιλαμβάνει τθν αλλθλεπίδραςθ του τριμεκυλοςιλλυλοαηιδίου με τον καταλφτθ προσ ςχθματιςμό τθσ διακυλο(o-τριμεκυλοςιλλυλο)αηιδοςτανυλουδρίνθσ (α), αλλθλεπίδραςθ με το νιτρίλιο και ςχθματιςμό του ενδιάμεςου Ν-(διακυλο(τριμεκυλοςιλλυλο-oξo)ςτανυλο)τετραηολίου (β). Το ενδιάμεςο αυτό προϊόν ενδεχόμενα διαςπάται ςτο Ν-(τριμεκυλοςιλλυλο)τετραηόλιο (γ) απελευκερϊνοντασ τον καταλφτθ και ςυντθρϊντασ τον κφκλο τθσ αντίδραςθσ (ςχιμα 18). 67

68 ΧΘΜΑ 18 Εναλλακτικόσ προτεινόμενοσ μθχανιςμόσ για τθ ςυντιρθςθ του καταλυτικοφ κφκλου περιλαμβάνει τθν αηιδοενδομοριακι αλλθλεπίδραςθ του ενδιάμεςου Ν- (διακυλο(τριμεκυλοςιλλυλοξο)ςτανυλο)τετραηολίου (β) με το τριμεκυλοςιλλυλοαηίδιο, ςχθματίηοντασ το Ν-(τριμεκυλοςιλλυλο)τετραηόλιο (γ) και απελευκερϊνοντασ τθν διακυλο(ο-τριμεκυλοςιλλυλο)αηιδοςτανυλουδρίνθ (α) (ςχιμα 19). ΧΘΜΑ 19 Ιδθ θ μζκοδοσ αυτι ζχει βρει πολλζσ εωαρμογζσ, ακόμα και για τθν ανάπτυξθ ARIs όπωσ αναωζρεται από τουσ Rakowitz και Constantino (Rakowitz et al., 2000). Τζλοσ αξίηει να γίνει αναωορά και ςτθ δυνατότθτα χριςθσ ακτινοβολίασ μικροκυμάτων για τθ ςφνκεςθ 5-υποκατεςτθμζνων-1Η-τετραηολίων όπωσ περιγράωεται από τουσ Shie και 68

69 Fang (Shie and Fang, 2007) απευκείασ από πρωτοταγείσ αλκοόλεσ και αλδεψδεσ (ςχιμα 20). ΧΘΜΑ 20 69

70 70

71 4. ΠΕΙΡΑΜΑΣΙΚΟ ΜΕΡΟ 4.1. ΟΡΓΑΝΑ, ΑΝΣΙΔΡΑΣΗΡΙΑ & ΛΟΙΠΟ ΕΞΟΠΛΙΜΟ ΟΡΓΑΝΑ Για τον προςδιοριςμό των ςθμείων τιξθσ χρθςιμοποιικθκε ςυςκευι υάλινων ανοικτϊν τριχοειδϊν τφπου Mel-Temp II. Τα ωάςματα υπερφκρου (IR) λιωκθκαν με ωαςματοωωτόμετρα διπλισ δζςμθσ τφπου Shimadzu FTIR-8101M IR spectrophotometer και FTAIR Spectrum BX 11FT-IR System. Τα ωάςματα πυρθνικοφ μαγνθτικοφ ςυντονιςμοφ 1 Η-NMR λιωκθκαν με ωαςματοωωτόμετρα τφπου Bruker AW80 ςτα 80MHz και Bruker AM-300 ςτα 300MHz. Οι τιμζσ χθμικισ μετατόπιςθσ δίνονται ςε μονάδεσ δ, με εςωτερικό πρότυπο το τετραμεκυλοςιλάνιο (δ TMS =0). Επιλεγμζνα ωάςματα NMR παρουςιάηονται ςτο παράρτθμα Β (ςελ. 169). Οι ςτοιχειακζσ αναλφςεισ πραγματοποιικθκαν από τα εργαςτιρια Galbraith Laboratories, Inc., Knoxville, TN, USA ενϊ κάποιεσ πραγματοποιικθκαν ςτο εργαςτιριο τθσ Φαρμακευτικισ Χθμείασ του Τμιματοσ Φαρμακευτικισ (Perkin-Elmer 2400 CHN analyzer) και του Τμιματοσ Χθμείασ του Α.Ρ.Κ (Perkin-Elmer 2400-II CHN analyzer). Για τισ χρωματογραωίεσ ςτιλθσ (flash chromatography) χρθςιμοποιικθκε silica gel Merck Ο πετρελαϊκόσ αικζρασ αναωζρεται ωσ κλάςμα ς.η C. Οι μετριςεισ ςτο υπεριϊδεσ-ορατό UV-vis ζγιναν με ωαςματοωωτόμετρα τφπου Perkin-Elmer 554 UV-Vis Lambda 20, Hitachi U-2001 UV-Vis και Shimadzu UV-1700 PharmaSpec UV-Visible. Οι ωυγοκεντριςεισ πραγματοποιικθκαν ςε ωυγοκζντρουσ Sorval RC-5B Refrigerated SuperSpeed και Heraeus Pico Microcentrifuge. Λοιποί εξοπλιςμοί: ςυςτιματα κακαριςμοφ νεροφ Millipore DirectQ -3UV και Milli-RO15 και υδατόλουτρα SWB ΑΝΣΙΔΡΑΣΗΡΙΑ ΚΑΙ ΕΝΖΤΜΙΚΑ ΠΑΡΑΚΕΤΑΜΑΣΑ Τα χθμικά αντιδραςτιρια που χρθςιμοποιικθκαν προζρχονταν από εμπορικζσ πθγζσ και ιταν ανάλογθσ κακαρότθτασ. Τα ζνηυμα ALR1 και ALR2 απομονϊκθκαν από νεωροφσ και οωκαλμοφσ αντίςτοιχα επιμφων, τθσ αιμομικτικισ ςειράσ Fischer-344, που διατθροφνται ςε κάλαμο ςτακερισ κερμοκραςίασ με τεχνθτό ωωτιςμό 12 ωρϊν. Οι επίμυεσ ηουν μζςα ςε κλωβοφσ από Plexiglass ςε ομάδεσ 6-8 ηϊων και ζχουν ελεφκερθ πρόςβαςθ ςε τυποποιθμζνθ ειδικι τροωι για επίμυεσ και ςε νερό δικτφου φδρευςθσ. Ο χειριςμόσ των πειραματόηωων κακϊσ και θ διεξαγωγι των πειραμάτων πραγματοποιείται ςφμωωνα με το νόμο για τθν προςταςία των πειραματόηωων (Ελλθνικι Δθμοκρατία) και είναι δθλωμζνα ςτθν Κτθνιατρικι Αρχι τθσ Δθμοκρατίασ τθσ Ελλάδασ HARDWARE & ΤΠΟΛΟΓΙΣΙΚΑ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑΣΑ Silicon Graphics O 2 RC5000 computer server (MIPS environment) Spartan SGI v [OpenGL, Wavefunction, Inc., Von Karman Avenue, Suite 370, Irvine, CA U.S.A] 71

72 Molgen v. 4.0 [International Copyright 1996, P. Baricic, M. Mackov & J.E. Slone](Win98 enviroment) Pallas v [CoMPuDrug Chemistry Ltd, Copyright 1994,2006] C-QSAR v. 4.0 [Biobyte](VMS environment) 4.2. ΤΝΘΕΗ ΕΝΨΕΨΝ ΕΝΨΕΙ ΠΟΤ ΠΑΡΑΚΕΤΑΣΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΑΣΡΙΒΗ ΚΑΙ Η ΤΝΘΕΗ ΣΟΤ ΕΦΕΙ ΔΗΜΟΙΕΤΣΕΙ ΑΠΟ ΑΛΛΟΤ ΕΡΕΤΝΗΣΕ ςύνθεςη τησ 4-νιτρο-2,6-διφθοροφαινόλησ (Ι) (Qiu et al., 1999) Διάλυμα τθσ 2,6-διωκοροωαινόλθσ (5g, 38mmol) ςε 13mL οξικοφ οξζοσ αντιδρά με ατμίηον νιτρικό οξφ (2mL). Θ προςκικθ του νιτρικοφ οξζοσ γίνεται υπό ανάδευςθ ςε παγόλουτρο (0-5 C) με αργό ρυκμό (2-3 ςταγόνεσ ςε διάςτθμα 5 λεπτϊν). Αωοφ ολοκλθρωκεί θ προςκικθ του νιτρικοφ οξζοσ απομακρφνεται το παγόλουτρο και θ αντίδραςθ ςυνεχίηεται ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ για 90 λεπτά. Στθ ςυνζχεια γίνεται αραίωςθ του μίγματοσ τθσ αντίδραςθσ με ψυχρό νερό (20mL) ςε παγόλουτρο και εκχυλίηεται με χλωροωόρμιο (2x50mL). Οι ενωμζνεσ οργανικζσ ωάςεισ πλζνονται με υδατικό κορεςμζνο διάλυμα χλωριοφχου νατρίου (2x20mL), ξθραίνονται με κειικό νάτριο, ακολουκεί διικθςθ και τζλοσ το διικθμα ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Μετά τθν εξάτμιςθ του χλωροωορμίου προςτίκεται επτάνιο (3x20mL) και θ ςυμπφκνωςθ ςυνεχίηεται μζχρι ξθροφ. Λαμβάνονται 5.7g τθσ 4-νιτρο-2,6-διωκοροωαινόλθσ ωσ κιτρινωπό-πορτοκαλί ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 85% και χρθςιμοποιείται χωρίσ επιπλζον επεξεργαςία. Σ.τ. : C (ς.τ. βιβλιογραωίασ: C (Qiu et al., 1999), C (Kirk, 1976)) ςύνθεςη του υδροχλωρικού άλατοσ τησ 4-αμινο-2,6-διφθοροφαινόλησ (ΙΙ) (Nicolaou et al., 2004) 72

73 Θ 4-νιτρο-2,6-διωκοροωαινόλθ (5.7g, 32mmol) διαλφεται ςε αικανόλθ (63.4mL) και προςτίκεται κυκλοεξζνιο (19.7mL, 195mmol) και Pd/C 10% (2.84g). Θ όλθ διεργαςία πραγματοποιείται ςε ατμόςωαιρα αηϊτου, υπό ανάδευςθ ςε κερμοκραςία βραςμοφ για 3 ϊρεσ. Στθ ςυνζχεια το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αωοφ ωτάςει ςε κερμοκραςία δωματίου ψφχεται ςε παγόλουτρο χωρίσ να διακοπεί θ ροι αηϊτου. Μετά τθ ψφξθ του μίγματοσ ςταματά θ ροι αηϊτου, και εξακολουκϊντασ να βρίςκεται ςτο παγόλουτρο, οξινίηεται με πυκνό υδροχλωρικό οξφ. Για τθν απομάκρυνςθ του καταλφτθ Pd/C γίνεται διικθςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ με χριςθ Celite. Τζλοσ το διικθμα ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Το προϊόν απομονϊνεται με ανακρυςτάλλωςθ από αικανόλθ/ αικζρα. Λαμβάνονται 5.5g του υδροχλωρικοφ άλατοσ τθσ 4-αμινο-2,6-διωκοροωαινόλθσ ωσ λευκόγκριηωπό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 93%. Σ.τ. : >230 C (ς.τ. βιβλιογραωίασ: >230 C (Qiu et al., 1999) ) 1 H-NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 7.15 (m, 2H) έλεγχοσ αςτάθειασ τησ 4-αμινο-2,6-διφθοροφαινόλησ ε διάλυμα του υδροχλωρικοφ άλατοσ τθσ 4-αμινο-2,6-διφκορο-φαινόλθσ ςε τετραχδροφουράνιο υπό ανάδευςθ και ςε ατμόςφαιρα αηϊτου προςτίκεται τριαικυλαμίνθ (ιςομοριακι ποςότθτα ωσ προσ το αρχικό άλασ) ςε τετραχδροφουράνιο. Ο ρυκμόσ τθσ προςκικθσ είναι ~4ςταγόνεσ /λεπτό. Η ανάδευςθ ςυνεχίηεται για 24 ϊρεσ και κατά τθν διάρκεια αυτισ το μίγμα τθσ αντίδραςθσ είναι λευκό-γκρι και ςταδιακά αρχίηει να πραςινίηει. τθ ςυνζχεια γίνεται ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Σο ςυμπφκνωμα ςτθ ςυνζχεια διαλφεται ςε διχλωρομεκάνιο και πραγματοποιοφνται πλφςεισ με κορεςμζνο διάλυμα χλωριοφχου νατρίου (2x25ml). Η οργανικι φάςθ ξθραίνεται με κειικό νάτριο και ακολουκεί διικθςθ και ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Με φαςματοςκοπία NMR διαπιςτϊνεται θ απουςία αρωματικϊν πρωτονίων ςύνθεςη του 2-(φαινυλοςουλφοναμιδο)οξικού οξέοσ (Α) (DeRuiter et al., 1987) Βενηοχλοςουλωονυλοχλωρίδιο (2.552mL, 20mmol) προςτίκεται ςτάγδθν ςε κερμό (60-70 C) και αναδευόμενο υδατικό διάλυμα (20mL) γλυκίνθσ (1.5g, 20mmol) και καυςτικοφ νατρίου (1.6g, 40mmol). Μετά τθν ολοκλιρωςθ τθσ προςκικθσ το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αωινεται υπό ανάδευςθ για ακόμα 1 ϊρα ςτουσ C. Στθ ςυνζχεια ψφχεται ςε παγόλουτρο και οξινίηεται με πυκνό υδροχλωρικό οξφ μζχρι ph 1. Το επικυμθτό προϊόν, υπό μορωι ιηιματοσ παραλαμβάνεται με διικθςθ και ανακρυςταλλϊνεται από ζνυδρθ αικανόλθ. Λαμβάνονται 2.563g αντίδραςθσ 59%. του 2-(ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικοφ οξζοσ ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ 73

74 Σ.τ.: C (ς.τ. βιβλιογραωίασ : C (DeRuiter et al., 1987), C (Bengelsdorf, 1953)) IR (Nujol): 3324cm -1 st v(r-cooh), 1735cm -1 st v(c=o) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 3.7 (m, 2H, -CH 2 COOH), (m, 7H, αρωματικά-h, καρβοξυλικό-η και -SO 2 NHCH 2 -) ςύνθεςη του N-(κυανομεθυλο)βενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-10a) και του παραπροΰόντοσ N-(κυανομεθυλο)-N-(φαινυλοςουλφονυλο)βενζολοςουλφοναμιδίου(AX- 10β)(πρωτότυπη ένωςη) ΜΕΚΟΔΟΣ Α (χριςθ καταλυτικισ ποςότθτασ N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθσ και τριαικυλαμίνθσ ςε περίςςεια) Σε αιϊρθμα του κειικοφ άλατοσ του 2-αμινοακετονιτριλίου (310mg, 2mmol) ςε τετραχδροωουράνιο (50mL), προςτίκεται βενηοχλοχλωρίδιο (0.34mL, 2.6mmol) και καταλυτικι ποςότθτα 25% N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθσ (DMAP, 63.5mg, 0.52mmol) και το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αωινεται υπό ζντονθ ανάδευςθ και ατμόςωαιρα αηϊτου για 24 ϊρεσ. Στθ ςυνζχεια προςτίκεται ςτάγδθν τριαικυλαμίνθ (0.6mL, 4mmol) ςε τετραχδροωουράνιο (20mL) και θ αντίδραςθ λαμβάνει χϊρα υπό τισ ίδιεσ ςυνκικεσ για ακόμα 72 ϊρεσ. Τζλοσ, το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αραιϊνεται με νερό (50mL) και εκχυλίηεται με διχλωρομεκάνιο (3x50 ml). Ακολουκεί διαχωριςμόσ των δυο ωάςεων και αωοφ γίνεται εξαλάτωςθ τθσ υδατικισ ςτοιβάδασ και εκ νζου εκχφλιςθ αυτισ με διχλωρομεκάνιο (2x20 ml), ςυλλζγονται οι οργανικζσ ωάςεισ. Ακολουκοφν πλφςεισ αυτϊν με κορεςμζνο υδατικό διάλυμα χλωριοφχου νατρίου (3x30mL), ξιρανςθ με κειικό νάτριο και ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ ςε κερμοκραςία <40 C. Από το υπόλειμμα απομονϊνεται το επικυμθτό προϊόν με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ πετρελαϊκοφ αικζρα/ οξικοφ αικυλεςτζρα 5:1. Αναλυτικά δείγματα λαμβάνονται με ανακρυςτάλλωςθ από διχλωρομεκάνιο (που περιζχει ςταγόνεσ ακετονιτριλίου)/ πετρελαϊκό αικζρα. Λαμβάνονται 73mg του N-(κυανομεκυλο)βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-10α) ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 19%. Σ.τ C (ς.τ. βιβλιογραωίασ : C (Knoevenagel, 1904), 80 C (Cocker, 1940)) IR (Nujol): 3303cm -1 st v(ph-nh-r)), 2727cm -1 st v(r-cn), 1620cm -1 st v(αρωματικά C=H), 1540cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1380cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1164cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 4.0 (s, 2H, -NHCH 2 CN), (br s, 1H, -SO 2 NH-), (m, 3H, αρωματικά 3,4,5-H), (m, 2H, αρωματικά 2,6-Η) Υπολογιςκζντα % (C 8 H 8 N 2 O 2 S): C 48.97, H 4.11, N 14.28, Ευρεκζντα: C 48.70, H 3.92, N

75 θμείωςθ: Με τροποποίθςθ τθσ παραπάνω μεκόδου (ΜΕΘΟΔΟ Β: χριςθ N,N-διμεκυλοπυριδιν-4- αμίνθσ ςε περίςςεια και χωρίσ προςκικθ τθσ ιςχυρισ βάςθσ) εκτόσ από το επικυμθτό προϊόν παραλιφκθκε και απομονϊκθκε ωσ παραπροϊόν θ ζνωςθ N-(κυανομεκυλο)-N- (φαινυλοςουλφονυλο)βενηολοςουλφοναμίδιο (AX-10β) ςε ςυγκριτικά αξιόλογι ποςότθτα). Πρόκειται για πρωτότυπθ ζνωςθ αλλά αναλφεται ςε αυτό το ςθμείο για λόγουσ ςυνοχισ. ΜΕΚΟΔΟΣ Β (χριςθ N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθσ ςε περίςςεια και χωρίσ προςκικθ τθσ ιςχυρισ βάςθσ) Σε αιϊρθμα του κειικοφ 2-αμινοακετονιτριλίου (310mg, 2mmol) ςε τετραχδροωουράνιο (50mL), προςτίκεται βενηοχλοχλωρίδιο (0.34mL, 2.6mmol) και N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθ (DMAP, 1024mg, 8.4mmol) και το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αωινεται υπό ζντονθ ανάδευςθ και ατμόςωαιρα αηϊτου για 48 ϊρεσ. Στθ ςυνζχεια, το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αραιϊνεται με νερό (50mL) και εκχυλίηεται με διχλωρομεκάνιο (3x50 ml). Ακολουκεί διαχωριςμόσ των δυο ωάςεων και αωοφ γίνεται εξαλάτωςθ τθσ υδατικισ ςτοιβάδασ και εκ νζου εκχφλιςθ αυτισ με διχλωρομεκάνιο (2x20 ml), ςυλλζγονται οι οργανικζσ ωάςεισ. Ακολουκοφν πλφςεισ αυτϊν με κορεςμζνο υδατικό διάλυμα χλωριοφχου νατρίου (3x30mL), ξιρανςθ με κειικό νάτριο και ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ ςε κερμοκραςία <40 C. Από το υπόλειμμα απομονϊνεται το επικυμθτό προϊόν (ΑΧ-10α) κακϊσ και το παραπροϊόν N-(κυανομεκυλο)-N- (ωαινυλοςουλωονυλο)βενηολοςουλωοναμίδιο (AX-10β) με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ πετρελαϊκοφ αικζρα/ οξικοφ αικυλεςτζρα 5:1. Αναλυτικά δείγματα λαμβάνονται με ανακρυςτάλλωςθ από διχλωρομεκάνιο (που περιζχει ςταγόνεσ ακετονιτριλίου)/ πετρελαϊκό αικζρα. Λαμβάνονται 94mg του N-(κυανομεκυλο)βενηολοςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 24% και 42mg του παραπροϊόντοσ N-(κυανομεκυλο)-N-(ωαινυλοςουλωονυλο) βενηολοςουλωοναμίδιο ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 6%. N-(κυανομεθυλο)-N-(φαινυλοσουλφονυλο)βενηολοσουλφοναμίδιο (AX-10β) Σ.τ C IR (Nujol): 2619cm -1 st v(r-cn), 1658cm -1 st v(αρωματικά C=H), 1572cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1382cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1167cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 75

76 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 4.6 (s, 2H, -CH 2 CN), ( m, 6H, αρωματικά 3,4,5-H ), (m, 4H, αρωματικά 2,6-H) Υπολογιςκζντα % (C 14 H 12 N 2 O 4 S 2 ): C 49.99, H 3.60, N 8.33, Ευρεκζντα: C 49.72, H 3.09, N ςύνθεςη του N-(1H-τετραζολο-5-υλο)βενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-16) Βενηοχλοχλωρίδιο(2.55mL, 20mmol) προςτίκεται ςτάγδθν ςε κερμό (60-70 C) διάλυμα τθσ 1H-τετραηολο-5-αμίνθσ (1.7g, 20mmol) και καυςτικοφ νατρίου (1.6g, 40mmol) ςε νερό (20mL). Μετά από 3 ϊρεσ ανάδευςθσ ςτθν προαναωερόμενθ κερμοκραςία, το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αωινεται να επανζρκει ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ και μετά πραγματοποιείται οξίνιςθ υπό ψφξθ με πυκνό υδροχλωρικό οξφ. Το ακατζργαςτο προϊόν υπό μορωι ιηιματοσ παραλαμβάνεται με διικθςθ και ανακρυςταλλϊνεται από οξικό αικυλεςτζρα/ πετρελαϊκό αικζρα. Λαμβάνονται 1.8g του N-(1H-τετραηολο-5-υλ)βενηολοςουλωοναμιδίου, απόδοςθ αντίδραςθσ 40%. Σ.τ C (ς.τ. βιβλιογραωίασ : C (Dahlbom, 1943)) IR (Nujol): 3324cm -1 st v(n-h τετραηολίου), cm -1 st v(βενηολικά C=C και C=H), 1384cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1264cm -1 st v(τετραηολίου C-N), 1170 cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ (m, 3H, αρωματικά 3,4,5-H), (m, 2H, αρωματικά 2,6-H), 10.7 (br s, 2H, -SO 2 NH- και Η-τετραηολίου) Υπολογιςκζντα % (C 7 H 7 N 5 O 2 S): C 37.33, H 3.13, N 31.09, Ευρεκζντα: C 37.33, H 2.8, N ΠΡΨΣΟΣΤΠΕ ΕΝΨΕΙ ΠΟΤ ΠΑΡΑΚΕΤΑΣΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΑΣΡΙΒΗ γενική μέθοδοσ ςύνθεςησ των Ν-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο) αροώλοςουλφοναμιδίων (ΑΧ-1, ΑΧ-2, ΑΧ-3 και AX-7) Σε διάλυμα του υδροχλωρικοφ άλατοσ τθσ 4-αμινο-2,6-διωκορο-ωαινόλθσ (ΛΛ) (275mg, 1.5mmol) ςε τετραχδροωουράνιο (78mL) υπό ζντονθ ανάδευςθ και ςε ατμόςωαιρα αηϊτου προςτίκεται τριμεκυλοςιλλυλοχλωρίδιο (0.25mL, 1.9mmol) και θ ανάδευςθ ςυνεχίηεται για 48 ϊρεσ. Στθ ςυνζχεια προςτίκεται το αντίςτοιχο αροχλοςουλωονυλοχλωρίδιο (1.9mmol) και καταλυτικι ποςότθτα N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθσ (48mg, 0.4mmol). Θ ανάδευςθ ςυνεχίηεται για 24 ϊρεσ και τθν επόμενθ μζρα προςτίκεται ςτάγδθν διάλυμα τριαικυλαμίνθσ (0.21mL, 1.5mmol) ςε 11.5mL τετραχδροωουράνιο. Θ ανάδευςθ ςυνεχίηεται για 24 ϊρεσ ακόμα. Πλα τα ςτάδια τθσ αντίδραςθσ πραγματοποιοφνται ςε ατμόςωαιρα αηϊτου και υπό ζντονθ ανάδευςθ. Στθ 76

77 ςυνζχεια πραγματοποιείται υδρόλυςθ με προςκικθ τριπλάςιου όγκου νεροφ (270mL) και ψφξθ (παγόλουτρο) για 2 ϊρεσ. Το μίγμα τθσ αντίδραςθσ ςτθ ςυνζχεια εκχυλίηεται με διχλωρομεκάνιο (3x25mL) ενϊ ςτθν υδατικι ωάςθ επιτυγχάνεται κορεςμόσ με χλωριοφχο νάτριο (εξαλάτωςθ) και παραλαμβάνεται τυχόν εναπομείναςα ποςότθτα του προϊόντοσ με εκχφλιςθ με διχλωρομεκάνιο. Οι ενωμζνεσ οργανικζσ ωάςεισ πλζνονται ςτθ ςυνζχεια με κορεςμζνο υδατικό διάλυμα χλωριοφχου νατρίου, ξθραίνονται με κειικό νάτριο και ακολουκεί διικθςθ και ςυμπφκνωςθ του διθκιματοσ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ και κερμοκραςία <40 C. Το τελικό προϊόν απομονϊνεται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και κατάλλθλο ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ πετρελαϊκου αικζρα /οξικου αικυλεςτζρα (ΑΧ-1 2.5:1, ΑΧ-2 2:1, ΑΧ-3 2.5:1 και ΑΧ-7: 2.5:1). Αναλυτικά δείγματα παραλαμβάνονται με ανακρυςτάλλωςθ από διχλωρομεκάνιο (που περιζχει ςταγόνεσ ακετονιτριλίου)/ πετρελαϊκό αικζρα. Ν-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)βενηολοσουλφοναμίδιο (ΑΧ-1) Λαμβάνονται 225mg του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)βενηολοςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 52%. Σ.τ.: C IR (Nujol): cm -1 st v(ph-o-h), 3282cm -1 st v(ph-nh-r)), 1619cm -1 st v(αρωματικά C=H), 1529cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1384cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1170 cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 /DMSO-d 6 ): δ 6.7 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=8.4 Hz,), (m, 6H, αρωματικά-h και ωαινολικό -OH), (br s, 1H, -SO 2 NH-) Υπολογιςκζντα % (C 12 H 9 F 2 NO 3 S): C 50.52, H 3.18, N 4.91, Ευρεκζντα: C 50.34, H 3.19, N 4.84 Ν-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4-μεθοξυβενηολοσουλφοναμίδιο (ΑΧ-2) Λαμβάνονται 278mg του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-μεκοξυβενηολοςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 58%. Σ.τ.: C IR (Nujol): cm -1 st v(ph-o-h), 3260cm -1 st v(ph-nh-r)), 1602cm -1 st v(αρωματικά C=H), 1529cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1371cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1260 cm -1 st v(ar-o-ch3), 1162 cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 77

78 1 H NMR (CDCl 3 /DMSO-d 6 ): δ 3.9 (s, 3H, -OCH 3 ), (m, 5H, μεκοξυωαίνυλο-3,5h, διωκοροωαίνυλο-2,6h and ωαινολικό-oh), 7.7 (d, 2H, μεκοξυωαίνυλο-2,6h, J=5.6 Hz), (br s, 1H, -SO 2 NH-) Υπολογιςκζντα % (C 13 H 11 F 2 NO 4 S): C 49.52, H 3.52, N 4.44, Ευρεκζντα: C 49.18, H 3.50, N 4.37 Ν-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4-νιτροβενηολοσουλφοναμίδιο (ΑΧ-3) Λαμβάνονται 300mg του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-νιτροβενηολοςουλωοναμιδίου ωσ κίτρινο ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 60%. Σ.τ.: C IR (Nujol): cm -1 st v(ph-o-h), 3229cm -1 st v(ph-nh-r), 1623cm -1 st v(αρωματικά C=H), 1534cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1374cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1162 cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 6.7 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=8.1 Hz), (m, 5H, ωαίνυλο - OH και αρωματικά-h), (br s, 1H, -SO 2 NH-) Υπολογιςκζντα % (C 12 H 8 F 2 N 2 O 5 S): C 43.64, H 2.44, N 8.48, Ευρεκζντα: C 43.69, H 2.44, N 8.56 Ν-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4-τριφθορομεθυλοβενηολοσουλφοναμίδιο (ΑΧ-7) Λαμβάνονται 320mg του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-τριωκορομεκυλοβενηολο ςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 60%. Σ.τ.: C IR (Nujol): cm -1 st v(ph-nh-r &Ph-O-H), 1619cm -1 st v(αρωματικά C=H), 1538cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1374cm - 1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1157 cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 6.7 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=8.2 Hz), (m, 4H, τριωκοροωαίνυλο-η), (br s, 1H, ωαινολικό-οη), (br s, 1H, -SO 2 NH-) Υπολογιςκζντα % (C 13 H 8 F 5 NO 3 S): C 44.20, H 2.28, N 3.96, Ευρεκζντα: C 44.04, H 2.59, N

79 ςύνθεςη του Ν-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4-αμινοβενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-4) Tο Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-νιτροβενηολοςουλωοναμίδιο (ΑΧ-3) (500mg, 1.51mmol) διαλφεται ςε ιςοπροπυλικι αλκοόλθ (12.5mL) και προςτίκεται κυκλοεξζνιο (1.15mL, 11.36mmol) και Pd/C 10% (375mg). Θ όλθ διεργαςία πραγματοποιείται ςε ατμόςωαιρα αηϊτου, υπό ζντονθ ανάδευςθ ςε κερμοκραςία βραςμοφ για 4 ϊρεσ. Στθ ςυνζχεια το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αωοφ ζρκει ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ διθκείται υπό κενό με χριςθ Celite. Τζλοσ το διικθμα ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ και το προϊόν ανακρυςταλλϊνεται από διχλωρομεκάνιο/ πετρελαϊκό αικζρα. Λαμβάνονται 348mg του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 77%. Σ.τ.: C IR (Nujol): cm -1 st v(ph-nh-r, Ph-NH2 &Ph-O-H), 1623cm -1 st v(αρωματικά C=H), 1538cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1384cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1151 cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ (br s, 2H, ωαίνυλο-nh 2 ), (m, 5H, ωαινολικό-oh, αμινοωαίνυλο-3,5h, διωκοροωαίνυλο-2,6h), (m, 2H, αμινοωαίνυλο-2,6h), (br s, 1H, -SO 2 NH-) Υπολογιςκζντα % (C 12 H 10 F 2 N 2 O 3 S)(+0.37CH 2 Cl 2 ): C 44.79, H 3.26, N 8.44, Ευρεκζντα: C 44.44, H 3.22, N ςύνθεςη του Ν-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4-(1Η-πυρρολο-1-υλο) βενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-5) Το Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμίδιο (ΑΧ-4) (202mg, 0.67mmol) διαλφεται ςε 1,4-διοξάνιο (10mL) και προςτίκεται 2,5-διμεκοξυ-τετραχδροωουράνιο (0.15mL, 1.1mmol) και υδροχλωρικό άλασ τθσ 4-χλωροπυριδίνθσ (154mg, 1.03mmol). Θ όλθ διεργαςία πραγματοποιείται ςε ατμόςωαιρα αηϊτου, υπό ζντονθ ανάδευςθ ςε κερμοκραςία βραςμοφ για 4 ϊρεσ. Στθ ςυνζχεια το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αωοφ ζρκει ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Από το υπόλειμμα παραλαμβάνεται το προϊόν με διχλωρομεκάνιο, ακολουκεί ξιρανςθ με κειικό νάτριο, διικθςθ και ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Το προϊόν απομονϊνεται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και 79

80 ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ πετρελαϊκου αικζρα /οξικου αικυλεςτζρα 3:1. Αναλυτικά δείγματα παραλαμβάνονται με ανακρυςτάλλωςθ από διχλωρομεκάνιο (που περιζχει ςταγόνεσ ακετονιτριλίου)/ πετρελαϊκό αικζρα. Λαμβάνονται 165mg του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-(1Θ-πυρρολο-1-υλο)βενηολο ςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 70%. Σ.τ.: C IR (Nujol): cm -1 st v(ph-nh-r & Ph-O-H), cm -1 st v(αρωματικά C=H & αρωματικά C=C), 1371cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1153 cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ (m, 4H, πφρρολο-h), 6.7 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=8.7Hz), (m, 4H, 4-πυρρολο-βενηοςουλωοναμιδο-ωαίνυλο-H), (br s, 1H, ωαινολικό- OH), (br s, 1H, -SO 2 NH-) Υπολογιςκζντα % C 16 H 12 F 2 N 2 O 3 S(+0.1CH 2 Cl 2 ): C 53.89, H 3.43, N 7.81, Ευρεκζντα: C 54.15, H 2.9, N γενική μέθοδοσ ςύνθεςησ των διφθορο-υδροξυφαινυλο-βενζαμιδίων (AX-6 και AX-9) Σε διάλυμα του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-4) (295mg, 0.97mmol) ςε 1,4-διοξάνιο (50mL) προςτίκεται τριαικυλαμίνθ (0.27mL, 1.94mmol) και το αντίςτοιχο αροχλοχλωρίδιο (1.94mmol) (βενηοχλοχλωρίδιο: 0.23mL, π-ανιςοχλοχλωρίδιο: 0.27mL) και το μίγμα τθσ αντίδραςθσ κερμαίνεται ςε κερμοκραςία βραςμοφ υπό ατμόςωαιρα αηϊτου για 4 ϊρεσ. Μετά από τθν απομάκρυνςθ του διαλφτθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ, το ακατζργαςτο υπόλειμμα επαναδιαλφεται ςε διχλωρομεκάνιο (50mL) και εκχυλίηεται με νερό (3x30mL), κορεςμζνο υδατικό διάλυμα χλωριοφχου νατρίου (2x20mL) και ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Το υπόλειμμα του 4-(4-βενηαμιδοβενηολοςουλωοναμιδο)-2,6-διωκοροωαινολικοφ εςτζρα του βενηοϊκοφ οξζοσ (239mg) ι του 2,6-διωκορο-4-(4-(4-μεκοξυβενηαμιδο)βενηολο ςουλωοναμιδοωαινυλο-4-μεκοξυ εςτζρα του βενηοϊκου οξζοσ (353mg) επαναδιαλφεται ςε 1,4- διοξάνιο (15mL) και προςτίκεται ςτάγδθν ψυχρό υδατικό διάλυμα καυςτικοφ νατρίου 5% (15mL). Το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αναδεφεται ζντονα ςτουσ 0 C (παγόλουτρο), υπό ατμόςωαιρα αηϊτου για 2ϊρεσ. Χωρίσ να απομακρυνκεί το παγόλουτρο πραγματοποιείται οξίνιςθ με υδατικό διάλυμα υδροχλωρικοφ οξζοσ 10%. Το μίγμα τθσ αντίδραςθσ κατεργάηεται με διχλωρομεκάνιο (100mL) για 15 λεπτά και αωοφ διαχωρίηονται οι δυο ωάςεισ, θ υδατικι ωάςθ εκχυλίηεται περαιτζρω με διχλωρομεκάνιο (2x20mL). Οι ενωμζνεσ οργανικζσ ωάςεισ πλζνονται ςτθ ςυνζχεια με νερό, διάλυμα όξινου ανκρακικοφ νατρίου (2x20mL) και κορεςμζνο υδατικό διάλυμα χλωριοφχου νατρίου, ξθραίνονται με κειικό νάτριο και ακολουκεί ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Το ακατζργαςτο τελικό προϊόν (ΑΧ-6: 168mg και ΑΧ-9: 251mg) απομονϊνεται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ πετρελαϊκοφ αικζρα /οξικοφ αικυλεςτζρα 3:1 και 2.5:1 αντίςτοιχα. Αναλυτικά δείγματα λαμβάνονται με ανακρυςτάλλωςθ από διχλωρομεκάνιο (που περιζχει ςταγόνεσ ακετονιτριλίου)/ πετρελαϊκό αικζρα. 80

81 N-(4-(N-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)σουλφαμοχλο)φαινυλο)βενηαμίδιο (ΑΧ-6) Λαμβάνονται 133mg του N-(4-(N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)ςουλωαμοχλο)ωαινυλο) βενηαμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 34%. Σ.τ C IR (Nujol): cm -1 st v(ph-nh-r & Ph-NHCOPh), cm 1 st v(ph-o-h), 1670cm -1 st v(c=o), 1598cm 1 st v(αρωματικά C=H), cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1370cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1160cm 1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 6.75 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=8.7Hz), (m, 9H, αρωματικά-h), 9.4 (s, 1H, ωαινολικό-oh), 9.8 (s, 1H, -SO 2 NH-), 10.4 (s, 1H, -CONH-) Υπολογιςκζντα % (C 19 H 14 F 2 N 2 O 4 S)(+0.11CH 2 Cl 2 ): C 55.48, H 3.46, N 6.77, Ευρεκζντα: C 55.87, H 3.24, N N-(4-(N-(3,5-διφκορο-4-υδροξυφαινυλο)ςουλφαμοχλο)φαινυλο)-4-μεκοξυβενηαμίδιο (ΑΧ-9) Λαμβάνονται 108mg του N-(4-(N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)ςουλωαμοχλο)ωαινυλο)-4- μεκοξυβενηαμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 25%. Σ.τ C IR (Nujol): cm -1 st v(ph-nh-r, Ph-O-H & Ph-NHCOPh), 1670cm -1 st v(c=o), 1593cm 1 st v(αρωματικά C=H), cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1372cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1162cm 1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1098cm -1 (Ar-O-CH3) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 3.8 (s, 3H, -OCH 3 ), (m, 4H, διωκοροωαίνυλο-2,6h και μεκοξυωαίνυλο-3,5h ), (m, 6H, N-ςουλωαμοχλοωαίνυλο-H και μεκοξυωαίνυλο-2,6h), 9.48 (br s, 1H, ωαινολικό-oh ), 9.87 (s, 1H, -SO 2 NH-), (s, 1H, -CONH-) Υπολογιςκζντα % (C 20 H 16 F 2 N 2 O 5 S)(+0.2CH 2 Cl 2 ): C 53.75, H 3.66, N 6.21, Ευρεκζντα: C 53.54, H 3.42, N ςύνθεςη του N-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4-(3-αιθυλουρεΰδο)βενζολο ςουλφοναμιδίου (ΑΧ- 8) 81

82 Σφμωωνα με ανάλογθ δθμοςιευμζνθ ςυνκετικι πορεία (Buckman et al., 1998) και με κάποιεσ τροποποιιςεισ ιςοκυανικόσ μεκυλεςτζρασ (0.185 ml, 2.33 mmol) προςτίκεται ςε διάλυμα του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμιδίου (116mg, 0.38mmol) ςε 1,4-διοξάνιο (30 ml) και ςτο αναδευόμενο μίγμα τθσ αντίδραςθσ εωαρμόηεται υπερθχθτικι ακτινοβολία για 8.5 ϊρεσ. Στθ ςυνζχεια προςτίκεται επιπλζον ιςοκυανικόσ μεκυλεςτζρασ (0.1 ml, 1.26mmol) και το μίγμα τθσ αντίδραςθσ κερμαίνεται ςτουσ 80 C υπό ατμόςωαιρα αηϊτου και χωρίσ τθν επίδραςθ υπεριχων για 7 ϊρεσ. Μετά από τθν απομάκρυνςθ του διαλφτθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ, το ακατζργαςτο υπόλειμμα επαναδιαλφεται ςε 1,4-διοξάνιο (10mL) και ςτθ ςυνζχεια προςτίκεται ςτάγδθν 5% υδατικό διάλυμα καυςτικοφ νατρίου (10mL). Το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αναδεφεται υπό ατμόςωαιρα αηϊτου για 15 λεπτά ςε κερμοκραςία δωματίου και ςτθ ςυνζχεια ψφχεται και οξινίηεται με υδατικό διάλυμα υδροχλωρικοφ οξζοσ 10%. Το μίγμα τθσ αντίδραςθσ κατεργάηεται με διχλωρομεκάνιο (75mL) για 15 λεπτά και αωοφ διαχωρίηονται οι δυο ωάςεισ, θ υδατικι ωάςθ εκχυλίηεται περαιτζρω με διχλωρομεκάνιο (2x20mL). Οι ενωμζνεσ οργανικζσ ωάςεισ πλζνονται ςτθ ςυνζχεια με νερό και κορεςμζνο υδατικό διάλυμα χλωριοφχου νατρίου, ξθραίνονται με κειικό νάτριο και ακολουκεί ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Το ακατζργαςτο τελικό προϊόν (120mg) απομονϊνεται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ πετρελαϊκοφ αικζρα /οξικοφ αικυλεςτζρα 1:1. Αναλυτικό δείγμα λαμβάνεται με ανακρυςτάλλωςθ από διχλωρομεκάνιο (που περιζχει ςταγόνεσ ακετονιτριλίου)/ πετρελαϊκό αικζρα. Λαμβάνονται 107 mg του N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-(3-αικυλουρεϊδο)βενηολο ςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 74%. Σ.τ C IR (Nujol): 3581cm 1 st v(ph-nhcoνθr), cm -1 st v(ph-nhcoνθr), cm -1 st v(ph-o-h), 1687cm 1 st v(c=o), 1598cm -1 st v(αρωματικά C=H), cm -1 1 st v(αρωματικά C=C), 1370cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1175cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3, DMSO-d 6 ): δ (t, 3H, -CH 2 CH 3, J=7.2Hz), (m, 2H, -NH-CH 2 -CH 3 ), (br s, 1H, -CO-NH-CH 2 CH 3 ), 6.70 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=8.5Hz), (m, 4H, αρωματικά-h), 8.54 (s, 1H, ωαινολικό-oh), 9.32 (s, 1H, -SO 2 NH-), 9.58 (s, 1H, -NH-CONHCH 2 CH 3 ) Υπολογιςκζντα % (C 15 H 15 F 2 N 3 O 4 S)(+0.4CH 2 Cl 2 ): C 45.63, H 3.93, N 10.37, Ευρεκζντα: C 45.93, H 3.73, N γενική μέθοδοσ ςύνθεςησ των διφθορο-αροώλοςουλφαμιδο-φαινολικών εςτέρων του βενζοΰκού οξέοσ (AX-18a και AX-19a/ΑΧ-19α ) Σε διάλυμα του αντίςτοιχου N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)αροχλοςουλωοναμιδίου (0.71mmol) (AX-1: 202mg, AX-3: 256mg) ςε 1,4-διοξάνιο (36.5mL) προςτίκεται τριαικυλαμίνθ (0.1mL, 0.75mmol) και βενηοχλοχλωρίδιο (0.087mL, 0.75mmol) και θ αντίδραςθ πραγματοποιείται ςε κερμοκραςία βραςμοφ και ατμόςωαιρα αηϊτου για 20 και 38 ϊρεσ αντίςτοιχα. Μετά από τθν απομάκρυνςθ του διαλφτθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ, το ακατζργαςτο υπόλειμμα επαναδιαλφεται ςε διχλωρομεκάνιο (100mL) και εκχυλίηεται με νερό (3x30mL), 82

83 κορεςμζνο υδατικό διάλυμα χλωριοφχου νατρίου (3x30mL) και ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Το ακατζργαςτο τελικό προϊόν απομονϊνεται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και κατάλλθλο ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ πετρελαϊκοφ αικζρα /οξικοφ αικυλεςτζρα 10:1 και 7:1 αντίςτοιχα. Αναλυτικά δείγματα λαμβάνονται με ανακρυςτάλλωςθ από διχλωρομεκάνιο (που περιζχει ςταγόνεσ ακετονιτριλίου)/ πετρελαϊκό αικζρα. Ρρζπει να ςθμειωκεί πωσ ςτθν περίπτωςθ ςφνκεςθσ τθσ ζνωςθσ ΑΧ-19α, εκτόσ από το επικυμθτό προϊόν απομονϊκθκε και το παραπροϊόν 2,6-διωκορο-4-(N-(4-νιτροωαινυλοςουλωονυλο)βενηαμιδο)ωαινολικόσ εςτζρασ του βενηοϊκοφ οξζοσ (ΑΧ-19α ). 2,6-διφθορο-4-(βενηολοσουλφοναμιδο)φαινολικός εστζρας του βενηοϊκοφ οξζος (ΑΧ-18α) Λαμβάνονται 100mg του 2,6-διωκορο-4-(βενηολοςουλωοναμιδο)ωαινολικοφ εςτζρα του βενηοϊκοφ οξζοσ ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 73%. Σ.τ C IR (Nujol): 3303cm -1 st v(ph-nh-r), 1722cm -1 st v(c=o), cm -1 st v(αρωματικά C=H), cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1375cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1162cm 1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 6.9 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=8.2Hz), (m, 12H, ωαίνυλο-h and -SO 2 NH- ) Υπολογιςκζντα % (C 19 H 13 F 2 NO 4 S): C 58.61, H 3.37, N 3.60, Ευρεκζντα: C 58.87, H 3.30, N ,6-διφθορο-4-(4-νιτροφαινυλοσουλφοναμιδο)φαινολικός εστζρας του βενηοϊκοφ οξζος (ΑΧ-19α) Λαμβάνονται 222mg του 2,6-διωκορο-4-(4-νιτροωαινυλοςουλωοναμιδο)ωαινολικοφ εςτζρα του βενηοϊκοφ οξζοσ ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 66%. Σ.τ. : C IR (Nujol): 3239cm -1 st v(ph-nh-r), 1760cm -1 st v(c=o), 1609cm -1 st v(αρωματικά C=H), 1522cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1377cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1176cm 1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ (br s, 1H, -SO 2 NH-), 7.0 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=8.3Hz), (m, 9H, αρωματικά-h) Υπολογιςκζντα % (C 19 H 12 F 2 N 2 O 6 S): C 52.54, H 2.78, N 6.45, Ευρεκζντα: C 52.86, H 2.51, N

84 2,6-διφθορο-4-(N-(4-νιτροφαινυλοσουλφονυλο)βενηαμιδο)φαινολικός εστζρας του βενηοϊκοφ οξζος (ΑΧ-19α ) Λαμβάνονται 59mg του παραπροϊόντοσ 2,6-διωκορο-4-(N-(4-νιτροωαινυλοςουλωονυλο) βενηαμιδο)ωαινολικοφ εςτζρα του βενηοϊκοφ οξζοσ ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 14%. Σ.τ. : C, IR (Nujol): 1755cm -1 st v(c=o), 1707cm -1 st v(c=o), 1607cm -1 st v(αρωματικά C=H), 1535cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1310cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1176cm 1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 7.1 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=8.4Hz), (m, 14H, αρωματικά H) Υπολογιςκζντα % C 26 H 16 F 2 N 2 O 7 S: C 57.99, H 2.99, N 5.20, Ευρεκζντα: C 57.73, H 2.84, N γενική μέθοδοσ ςύνθεςησ των βρωμο-φθοροβενζυλο-διφθορο-υδροξυφαινυλοαροώλοςουλφοναμιδίων (AX-18, AX-19) Σφμωωνα με παρόμοια ςυνκετικι μζκοδο (DeRuiter et al., 1989b) υδρίδιο του νατρίου (10.05mg, mmol) ωσ 60% εναιϊρθμα ςε παραωινζλαιο (16.75mg) προςτίκεται ςταδιακά ςε αναδευόμενο διάλυμα του αντίςτοιχου ενδιάμεςου εςτζρα (0.334mmol) (AX-18α: 130mg, AX-19α: 145.8mg ) ςε διμεκυλοωορμαμίδιο (3mL), και το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αναδεφεται ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ για 30 λεπτά υπό ατμόςωαιρα αηϊτου. Στθ ςυνζχεια προςτίκεται το 4-βρωμο-1-(βρωμομεκυλο)-2-ωκοροβενηόλιο (125mg, 0.468mmol) και θ αντίδραςθ πραγματοποιείται υπό ανάδευςθ και ατμόςωαιρα αηϊτου για 72 ϊρεσ. Ακολοφκωσ, προςτίκεται υδατικό διάλυμα 5% καυςτικοφ νατρίου (3mL) και θ αντίδραςθ ςυνεχίηει υπό τισ ίδιεσ ςυνκικεσ για 24 ϊρεσ. Στθ ςυνζχεια υπό ψφξθ ςε παγόλουτρο πραγματοποιείται οξίνιςθ με πυκνό υδροχλωρικό οξφ. Το ακατζργαςτο προϊόν παραλαμβάνεται ωσ ίηθμα (AX-18: 92mg και AX-19: 148mg). Το διικθμα εκχυλίηεται περαιτζρω με τολουόλιο (4x20mL) και το εκχφλιςμα πλζνεται με νερό (3x30mL), κορεςμζνο υδατικό διάλυμα χλωριοφχου νατρίου (2x20mL), ξθραίνεται με κειικό νάτριο και ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ για τθν παραλαβι τυχόν εναπομείναντοσ προϊόντοσ ςτο διικθμα. Το προϊόν απομονϊνεται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ πετρελαϊκοφ αικζρα/ οξικοφ αικυλεςτζρα 10:1. Αναλυτικά δείγματα λαμβάνονται με ανακρυςτάλλωςθ από διχλωρομεκάνιο / πετρελαϊκό αικζρα. 84

85 N-(4-βρωμο-2-φθοροβενηυλο)-N-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)βενηολοσουλφοναμίδιο (ΑΧ-18) Λαμβάνονται 93mg του N-(4-βρωμο-2-ωκοροβενηυλο)-N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)βενηολο ςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 60%. Σ. Τ C IR (Nujol): cm -1 st v(ph-o-θ), st v(αρωματικά C=H), 1530cm -1 1 st v(αρωματικά C=C), 1377cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1153cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 7.90 (m, 9H, αρωματικά-h και ωαινολικό-oh) Υπολογιςκζντα % (C 19 H 13 BrF 3 NO 3 S)(+0.4CH 2 Cl 2 ): C 46.03, H 2.75, N 2.77, Ευρεκζντα: C 45.77, H 2.59, N 2.88 N-(4-βρωμο-2-φθοροβενηυλο)-N-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4-νιτροβενηολο σουλφοναμίδιο (ΑΧ-19) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 4.64 (s, 2H, -CH 2 -), 6.5 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=11.3Hz), Λαμβάνονται 135mg του N-(4-βρωμο-2-ωκοροβενηυλο)-N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4- νιτροβενηολοςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 78%. Σ. Τ C IR (Nujol): cm -1 st v(ph-o-θ), st v(αρωματικά C=H), 1535cm -1 1 st v(αρωματικά C=C), 1377cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1160cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 4.72 (s, 2H, -CH 2 -), (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=17.9Hz), (m, 4H, Br,F-ωαίνυλο-H και ωαίνυλο-οh), 7.8 (d, 2H, 4-νιτροωαίνυλο-2,6H, J=17.4Hz), (d, 2H, 4-νιτροωαίνυλο-3,5H, J=19Hz) Υπολογιςκζντα % C 19 H 12 BrF 3 N 2 O 5 S: C 44.12, H 2.34, N 5.42, Ευρεκζντα: C 44.14, H 2.11, N

86 ςύνθεςη του N-(4-βρωμο-2-φθοροβενζυλο)-N-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4- αμινοβενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-20) Θ ζνωςθ N-(4-βρωμο-2-ωκοροβενηυλο)-N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-νιτροβενηολο ςουλωοναμίδιο (ΑΧ-19) (42mg, 0.08mmol) διαλφεται ςε ιςοπροπυλικι αλκοόλθ (5mL) και προςτίκεται κυκλοεξζνιο (0.06mL, 0.6mmol) και Pd/C 10% (21mg). Θ όλθ διεργαςία πραγματοποιείται ςε ατμόςωαιρα αηϊτου, υπό ζντονθ ανάδευςθ και ακολουκεί κζρμανςθ ςε κερμοκραςία βραςμοφ για 7.5 ϊρεσ. Στθ ςυνζχεια το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αωοφ ζρκει ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ διθκείται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ με χριςθ Celite. Τζλοσ το διικθμα ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Το προϊόν ανακρυςταλλϊνεται από διχλωρομεκάνιο/ πετρελαϊκό αικζρα. Λαμβάνονται 23mg του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 58%. Σ.τ.: C IR (Nujol): cm -1 st v( Ph-NH2 & Ph-O-H), 1594cm -1 st v(αρωματικά C=H), 1544cm -1 st v(αρωματικά C=C), 1376cm - 1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1146 cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 4.34 (s, 2H, -CH 2 -), 4.87 (s, 1H, -OH), 5.07 (s, 2H, -NH 2 -), 6.24 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=8.9Hz), (m, 7H, αρωματικά-h) Υπολογιςκζντα % (C 19 H 14 BrF 3 N 2 O 3 S): C 46.83, H 2.90, N 5.75, Ευρεκζντα: C 46.72, H 2.49, N ςύνθεςη του N-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-Ν-(φαινυλοςουλφονυλο)- βενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-21) Σφμωωνα με παρόμοια ςυνκετικι μζκοδο (Yasuhara et al., 1999) διάλυμα του 2,6-διωκορο- 4-(βενηολοςουλωοναμιδο)ωαινολικoφ εςτζρα του βενηοϊκοφ οξζοσ (ΑΧ-18α) (232mg, 0.59mmol) ςε τετραχδροωουράνιο (4mL) προςτίκεται ςταδιακά ςε αναδευόμενο αιϊρθμα υδριδίου του νατρίου (135mg, 2.25 mmol) (ωσ 60% εναιϊρθμα ςε παραωινζλαιο (225mg)) ςε τετραχδροωουράνιο 86

87 (25mL) και το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αναδεφεται ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ για 1 ϊρα υπό ατμόςωαιρα αηϊτου. Στθ ςυνζχεια το μίγμα τθσ αντίδραςθσ ψφχεται και υπό ψφξθ προςτίκεται το βενηολοςουλωονυλοχλωρίδιο (0.32mL, 2.28mmol) και θ αντίδραςθ πραγματοποιείται υπό ανάδευςθ και ατμόςωαιρα αηϊτου για 72 ϊρεσ ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ. Στθ ςυνζχεια αωοφ γίνει αραίωςθ με νερό (50mL) ακολουκεί κατεργαςία με οξικό αικυλεςτζρα (3x60mL). Θ οργανικι ωάςθ πλζνεται με κορεςμζνο διάλυμα χλωριοφχου νατρίου (2x20mL), ξθραίνεται με κειικό νάτριο και ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Ακολοφκωσ, το ςυμπφκνωμα διαλφεται ςε διοξάνιο (15mL) και προςτίκεται υδατικό διάλυμα 2.5% καυςτικοφ νατρίου (15mL) υπό ψφξθ και θ αντίδραςθ τθσ υδρόλυςθσ πραγματοποιείται υπό άηωτο για 5h. Στθ ςυνζχεια υπό ψφξθ ςε παγόλουτρο πραγματοποιείται οξίνιςθ με πυκνό υδροχλωρικό οξφ. Το ακατζργαςτο προϊόν παραλαμβάνεται με διχλωρομεκάνιο (100mL), ακολουκοφν πλφςεισ με νερό (2x20mL), κορεςμζνο υδατικό διάλυμα χλωριοφχου νατρίου (2x20mL), ξιρανςθ με κειικό νάτριο και ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Το προϊόν απομονϊνεται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ πετρελαϊκοφ αικζρα/ οξικοφ αικυλεςτζρα 5:1. Αναλυτικά δείγματα λαμβάνονται με ανακρυςτάλλωςθ από διχλωρομεκάνιο / πετρελαϊκό αικζρα. Λαμβάνονται 67mg του N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-Ν-(ωαινυλοςουλωονυλο)βενηολο ςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 26%. Σ.τ.: C IR (Nujol): cm -1 st v(ph-o-θ), st v(αρωματικά C=H), 1518cm -1 1 st v(αρωματικά C=C), 1373cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1166cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 6.53 (d, 2H, διωκοροωαίνυλο-2,6h, J=8.8Hz), 7.28 (s, 1H, ωαινολικό- ΟΗ), (m, 10H, αρωματικά-h) Υπολογιςκζντα % C 18 H 13 F 2 NO 5 S: C 50.82, H 3.08, N 3.29, Ευρεκζντα: C 50.84, H 3.03, N ςύνθεςη του N-((1Η-τετραζολο-5-υλο)μεθυλο)βενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-10) Σφμωωνα με παρόμοια ςυνκετικι μζκοδο (Wittenberger and Donner, 1993) ςε διάλυμα του N-(κυανομεκυλο)βενηολοςουλωοναμιδίου (70mg, 0.356mmol) και του τριμεκυλοςιλλυλοαηιδίου (0.093mL, 0.713mmol) ςε τολουόλιο (5mL) προςτίκεται το οξείδιο του διβουτυλοκαςςιτζρου (8.88mg, mmol) και θ αντίδραςθ πραγματοποιείται ςε κερμοκραςία βραςμοφ για 47 ϊρεσ και υπό ατμόςωαιρα αηϊτου. Στθ ςυνζχεια το μίγμα τθσ αντίδραςθσ ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Το υπόλειμμα επαναδιαλφεται ςε μεκανόλθ και ςυμπυκνϊνεται ξανά. Το νζο υπόλειμμα κατεργάηεται με οξικό αικυλεςτζρα (25mL) και 10% υδατικό διάλυμα όξινου ανκρακικοφ νατρίου (26 ml). Διαχωρίηονται οι δυο ωάςεισ και θ οργανικι ςτοιβάδα εκχυλίηεται με επιπλζον ποςότθτα διαλφματοσ όξινου ανκρακικοφ νατρίου (25mL). 87

88 Συγκεντρϊνονται οι υδατικζσ ωάςεισ και αωοφ πραγματοποιείται οξίνιςθ μζχρι ph 2 με 10% υδατικό διάλυμα υδροχλωρικοφ οξζοσ, εκχυλίηονται με οξικό αικυλεςτζρα (2x50mL), ξθραίνονται με κειικό νάτριο και ςυμπυκνϊνονται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ για να δϊςουν το επικυμθτό προϊόν. Αναλυτικά δείγματα λαμβάνονται με ανακρυςτάλλωςθ από διχλωρομεκάνιο / πετρελαϊκό αικζρα. Λαμβάνονται 45mg του N-((1Η-τετραηολο-5-υλο)μεκυλο)βενηολοςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 53%. Σ.τ C IR (Nujol): 3324cm -1 st v(n-h τετραηολίου), cm -1 st v(βενηολικά C=C και C=H), 1384cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), cm -1 st v(τετραηολίου C-N), 1170 cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ (m, 2H, -NHCH 2 -), (m, 7H, βενηολικά-h, -SO 2 NH- και τετραηολίου-h) Υπολογιςκζντα % (C 8 H 9 N 5 O 2 S)(+0.1CH 2 Cl 2 ): C 39.27, H 3.74, N 28.27, Ευρεκζντα: C 39.57, H 3.62, N ςύνθεςη του N-(μεθυλοςουλφονυλο)-2-(βενζολοςουλφοναμιδο)ακεταμιδίου (ΑΧ-13) Σφμωωνα με δθμοςιευμζνθ ςυνκετικι μζκοδο (Yuan and Silverman, 2006) διάλυμα του 2- (ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικοφ οξζοσ (640mg, 2.98mmol) ςε τετραχδροωουράνιο (6mL) προςτίκεται ςτάγδθν ςε αναδευόμενο διάλυμα καρβονυλο-δι-ιμιδαηολίου (CDI) (726mg, 4.46mmol) ςε τετραχδροωουράνιο (7.5mL) υπό ατμόςωαιρα αηϊτου. Το μίγμα παραμζνει υπό ανάδευςθ ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ για 30 λεπτά, ςε κερμοκραςία βραςμοφ για 1 ϊρα, και ςτθ ςυνζχεια αωινεται να επανζλκει ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ. Ρροςτίκεται το μεκυλοςουλωοναμίδιο (425mg, 4.45mmol) και το μίγμα αναδεφεται για 10 λεπτά πριν από τθ ςτάγδθν προςκικθ διαλφματοσ 1,8-διαηοδικυκλο[5.4.0]ενδεκα-7-ενίου (DBU) (0.69mL, 4.45mmol) ςε τεραχδροωουράνιο (4.5mL). Το προκφπτον μίγμα αναδεφεται για 72 ϊρεσ ςε ατμόςωαιρα αηϊτου, ςτθ ςυνζχεια μεταωζρεται ςε ψυχρό διάλυμα 1Ν υδροχλωρικοφ οξζοσ (40mL) και εκχυλίηεται με οξικό αικυλεςτζρα (3x50mL). Αωοφ διαχωρίηονται οι δυο ωάςεισ, ςτθν υδατικι ωάςθ, που εκχυλίηεται περαιτζρω με διαικυλαικζρα (30mL), πραγματοποιείται οξίνιςθ ςε ph=2 και εκχυλίηεται με οξικό αικυλεςτζρα (2x20mL). Οι ενωμζνεσ ωάςεισ του οξικοφ αικυλεςτζρα ξθραίνονται με κειικό νάτριο και ςυμπυκνϊνονται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Το επικυμθτό προϊόν απομονϊνεται με ανακρυςτάλλωςθ από διχλωρομεκάνιο/ πετρελαϊκό αικζρα. Λαμβάνονται 252mg του N-(μεκυλοςουλωονυλο)-2-(βενηολοςουλωοναμιδο)ακεταμιδίου ωσ κιτρινωπό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 29%. 88

89 Σ.τ C IR (Nujol): 3282cm -1 st v(r-nh-r), 1739cm -1 st v(c=o), cm -1 st v(αρωματικά C=H και αρωματικά C=C), 1340cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), 1324cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), cm 1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ 3.08 (s, 3H, -SO 2 CH 3 ), (br s, 3H, -SO 2 NHCH 2 -), (m, 3H, αρωματικά 3,4,5-Η), (m, 2H, αρωματικά 2,6-H), 11,7 (br s, 1H, -CONHSO 2 -) Υπολογιςκζντα % (C 9 H 12 N 2 O 5 S 2 ): C 36.98, H 4.14, N 9.58, Ευρεκζντα: C 36.57, H 3.82, N ςύνθεςη του (R)-N-(3-οξοΰςοξαζολιδιν-4-υλο)βενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-15) Σε ψυχρό διάλυμα τθσ D-κυκλοςερίνθσ (204mg, 2mmol) ςε ρυκμιςτικό διάλυμα NaHCO 3 /Na 2 CO 3 ph=10 (10mL) προςτίκεται ςτάγδθν το βενηοχλοςουλωονυλοχλωρίδιο (0.28mL, 2.2mmol). Θ αντίδραςθ πραγματοποιείται υπό ανάδευςθ και χαμθλι κερμοκραςία για 24 ϊρεσ. Το ακατζργαςτο προϊόν παραλαμβάνεται ωσ ίηθμα μετά από διικθςθ (315mg) και απομονϊνεται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ πετρελαϊκό αικζρα/ οξικό αικυλεςτζρα 2:1. Λαμβάνονται 151mg του (R)-N-(3-οξοϊςοξαηολιδιν-4-υλο)βενηολοςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 39%. Σ.τ C IR (Nujol): 3324cm -1 st v(n-h κυκλοςερίνθσ), cm -1 st v(βενηολικά C=C και C=H), 1380cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), cm -1 st v(κυκλοςερίνθσ C-N), 1162 cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ (m, 3H, οξοϊςοξαηολιδινυλο-h), (m, 6H, αρωματικά- H και -SO 2 NH-), 8.46 (s, 1H, οξοϊςοξαηολιδινυλο-nh) Υπολογιςκζντα % (C 9 H 10 N 2 O 4 S)(+H 2 O): C 41.53, H 4.65, N 10.71, Ευρεκζντα: C 41.22, H 4.68, N ςύνθεςη του (S)-N-(3-οξοΰςοξαζολιδιν-4-υλ)βενζοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-17) Σε ψυχρό διάλυμα τθσ L-κυκλοςερίνθσ (250mg, 2.45mmol) ςε ρυκμιςτικό διάλυμα NaHCO 3 /Na 2 CO 3 ph=10 (12.5mL) προςτίκεται ςτάγδθν το βενηοχλοςουλωονυλοχλωρίδιο (0.34mL, 2.69mmol). Θ αντίδραςθ πραγματοποιείται υπό ανάδευςθ και χαμθλι κερμοκραςία για 24 ϊρεσ. Το ακατζργαςτο προϊόν παραλαμβάνεται ωσ ίηθμα μετά από διικθςθ (315mg) και απομονϊνεται 89

90 με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ πετρελαϊκό αικζρα/ οξικό αικυλεςτζρα 2:1. Λαμβάνονται 90mg του (S)-N-(3-οξοϊςοξαηολιδιν-4-υλο)βενηοςουλωοναμιδίου ωσ λευκό ςτερεό, απόδοςθ αντίδραςθσ 17%. Σ.τ C IR (Nujol): 3324cm -1 st v(n-h κυκλοςερίνθσ), cm -1 st v(βενηολικά C=C και C=H), 1384cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο), cm -1 st v(κυκλοςερίνθσ C-N), 1170 cm -1 st v(ςουλωοναμίδιο) 1 H NMR (CDCl 3 -DMSO-d 6 ): δ (m, 3H, οξοϊςοξαηολιδινυλο-h), (m, 6H, αρωματικά- H και -SO 2 NH-), 8.46 (s, 1H, οξοϊςοξαηολιδινυλο-nh) Υπολογιςκζντα % (C 9 H 10 N 2 O 4 S)(+H 2 O): C 41.53, H 4.65, N 10.71, Ευρεκζντα: C 41.71, H 4.67, N ΥΑΡΜΑΚΟΦΗΜΙΚΕ ΔΟΚΙΜΑΙΕ IN VITRO ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣOY ENZYMOY ΑΝΑΓΨΓΑΗ ΣΗ ΑΛΔΟΖΗ (ALR2) (Alexiou et al., 2008; Demopoulos and Rekka, 1995; Nicolaou and Demopoulos, 2003; Nicolaou et al., 2004; Stefek et al., 2008) υλικά διαλύματα Για τθν διεξαγωγι του πειράματοσ παραςκευάηονται τα ακόλουκα διαλφματα: υκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 0.067M (ph=6.2), διάλυμα NADPH 0.104mM (το διάλυμα γίνεται τθν θμζρα του πειράματοσ και διατθρείται ςε πάγο), διάλυμα DL-γλυκεραλδεψδθσ 10mM (το διάλυμα γίνεται τθν θμζρα του πειράματοσ και διατθρείται ςε πάγο), κορεςμζνο διάλυμα (NH 4 ) 2 SO 4 και τζλοσ υδατικά διαλφματα 10% DMSO τθσ υπό εξζταςθσ ουςίασ ςε ςυγκεντρϊςεισ από 5x10-4 Μ ωσ 10-9 Μ in vitro πειραματικό πρωτόκολλο προςδιοριςμού τησ ικανότητασ αναςτολήσ του ενζύμου αναγωγάςη τησ αλδόζησ (ALR2) Το ζνηυμο τθσ ALR2 απομονϊνεται από ωακοφσ επιμφων με τθ διαδικαςία τθσ κλαςματοποίθςθσ με χριςθ κειικοφ αμμωνίου (NH 4 ) 2 SO 4. Τα ηϊα υπόκεινται ςε ευκαναςία και ταχζωσ απομακρφνονται οι ωακοί από επίμυεσ Fisher-344 και των δυο ωφλων. Το ακατζργαςτο ενηυμικό υπερκείμενο παραςκευάηεται με ομογενοποίθςθ 10 ωακϊν ςε 5mL ψυχροφ διςαπιονιςμζνου νεροφ και το ομογενοποίθμα ωυγοκεντρείται ςτισ 10000rpm για 15 λεπτά ςε κερμοκραςία 4 C. Λαμβάνεται το υπερκείμενο, προςτίκεται διάλυμα (NH 4 ) 2 SO 4 μζχρι να επιτευχκεί κορεςμόσ 40% και αναδεφεται ζντονα. Το μίγμα που προκφπτει ωυγοκεντρείται ςτισ 10000rpm για 15 λεπτά ςε κερμοκραςία 4 C και λαμβάνεται το υπερκείμενο. 90

91 Θ δραςτικότθτα του ενηφμου ALR2, που περιζχεται ςτο πρόςωατα παραςκευαςμζνο 40% υπερκείμενο κειικοφ αμμωνίου, μετράται ωαςματοωωτομετρικά ςτουσ 30 C με προςδιοριςμό τθσ μείωςθσ τθσ ςυγκζντρωςθσ του NADPH ςε λ=340nm. Το μίγμα τθσ αντίδραςθσ περιζχει 2.4mL ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 0.067M (ph=6.2), 100μL διάλυμα NADPH 0.104mM, 100μL διάλυμα DL-γλυκεραλδεψδθσ 10mM και 300μL υπερκείμενο του ενηυμικοφ παραςκευάςματοσ ςε τελικό όγκο 1.1mL. Το δείγμα αναωοράσ περιζχει όλα τα παραπάνω εκτόσ από το υπόςτρωμα DL-γλυκεραλδεψδθ, για τυχόν διόρκωςθ τθσ οξείδωςθσ του NADPH που δεν ςυνδζεται με τθν αναγωγι του υποςτρϊματοσ. Θ καταλυόμενθ από το ζνηυμο αντίδραςθ αρχίηει με τθ προςκικθ του υποςτρϊματοσ και παρακολουκείται για χρονικό διάςτθμα 5 λεπτϊν, μετά από ιςορρόπθςθ τθσ αντίδραςθσ για 1 λεπτό. Θ ταχφτθτα τθσ ενηυμικισ αντίδραςθσ ρυκμίηεται ςτισ ~0,02 ι ~0,01 μονάδεσ απορρόωθςθσ ανά λεπτό με τθν αραίωςθ του υπερκείμενου ενηυμικοφ παραςκευάςματοσ με δις-απεςταγμζνο νερό. Θ επίδραςθ των αναςτολζων ςτθν δραςτικότθτα του ενηφμου υπολογίηεται με τθ προςκικθ 100μl 10% υδατικοφ διαλφματοσ DMSO του αναςτολζα ςτο μίγμα. Γίνεται επίςθσ αντίςτοιχθ προςκικθ διαλφματοσ του αναςτολζα και ςτο δείγμα αναωοράσ, για τθ διόρκωςθ τυχόν απορρόωθςθσ που οωείλεται ςε αυτόν ανάλυςη δεδομένων και ςτατιςτική επεξεργαςία Το ποςοςτό τθσ αναςτολισ του ενηφμου από κάκε αναςτολζα υπολογίηεται με ςφγκριςθ τθσ ταχφτθτασ αντίδραςθσ του διαλφματοσ που περιζχει υπόςτρωμα και αναςτολζα ςε ςχζςθ με το διάλυμα που περιζχει μόνο υπόςτρωμα (control), ςφμωωνα με τον ακόλουκο τφπο: ύ contol ύ ύ control έ 100 Στθ ςυνζχεια προςδιορίηεται θ μζςθ αναςταλτικι ςυγκζντρωςθ (ΛC 50 ), δθλαδι θ ςυγκζντρωςθ τθσ ουςίασ που απαιτείται για να προκαλζςει αναςτολι του ενηφμου κατά 50%. Για τον προςδιοριςμό των τιμϊν ΛC 50 οι ενϊςεισ μελετικθκαν ςε τουλάχιςτο 5 ςυγκεντρϊςεισ. Οι καμπφλεσ λογαρίκμου ςυγκζντρωςθσ-βιολογικισ δράςθσ καταςκευάςτθκαν με ανάλυςθ παλινδρόμθςθσ του ευκφγραμμου τμιματοσ τθσ αντίςτοιχθσ καμπφλθσ, με χριςθ του ςτατιςτικοφ προγράμματοσ Excel ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣOY ENZYMOY ΑΝΑΓΨΓΑΗ ΣΨΝ ΑΛΔΕΫΔΨΝ (ALR1) (Stefek et al., 2008) υλικά διαλύματα Για τθν διεξαγωγι του πειράματοσ παραςκευάηονται τα ακόλουκα διαλφματα: υκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 0.1M (ph=7.2) κακϊσ επίςθσ και ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 10mM (ph=7.2) με αραίωςθ του προθγοφμενου 1:10, S-ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων (10mM ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων + 2mM EDTA + 2mM 2-91

92 μερκαπτοαικανόλθ), S-ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων + ςουκρόηθ (10mM ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων + 0,25Μ ςουκρόηθ + 2mM EDTA + 2.5mM 2-μερκαπτοαικανόλθ), διάλυμα NADPH 0.104mM (το διάλυμα γίνεται τθν θμζρα του πειράματοσ και διατθρείται ςε πάγο), διάλυμα του μετά νατρίου άλατοσ του γλυκουρονικοφ οξζοσ 600mM (το διάλυμα γίνεται τθν θμζρα του πειράματοσ και διατθρείται ςε πάγο), κορεςμζνο διάλυμα (NH 4 ) 2 SO 4 και τζλοσ 10% υδατικά διαλφματα DMSO τθσ υπό εξζταςθσ ουςίασ ςε ςυγκεντρϊςεισ από 5x10-4 Μ ωσ 10-9 Μ in vitro πειραματικό πρωτόκολλο προςδιοριςμού τησ ικανότητασ αναςτολήσ του ενζύμου αναγωγάςη των αλδεώδών (ALR1) Το ζνηυμο τθσ ALR1 απομονϊνεται από νεωροφσ επιμφων με τθ διαδικαςία τθσ κλαςματοποίθςθσ με χριςθ κειικοφ αμμωνίου (NH 4 ) 2 SO 4. Οι νεωροί απομακρφνονται γριγορα από επίμυεσ Fisher-344 του ίδιου ωφλου και βάρουσ όχι μεγαλφτερου από 250g, μετά από ευκαναςία των πειραματόηωων. Στθ ςυνζχεια οι δυο νεωροί ηυγίηονται και ομογενοποιοφνται ςε τριπλάςιο όγκο (ml) διαλφματοσ S-buffer + ςουκρόηθ. Το ομογενοποίθμα ωυγοκεντρείται ςτισ 15000rpm για 30 λεπτά ςτουσ 0-4 C. Το υπερκείμενο λαμβάνεται, προςτίκεται διάλυμα (NH 4 ) 2 SO 4 μζχρι να επιτευχκεί κορεςμόσ 40% και αναδεφεται ζντονα. Στθ ςυνζχεια το διάλυμα αωινεται ςε θρεμία για 30 λεπτά και αναδεφεται ιπια ανά τακτά χρονικά διαςτιματα και ακολουκεί ωυγοκζντρθςθ του διαλφματοσ ςτα 15000rpm για 30 λεπτά ςτουσ 0-4 C. Λαμβάνεται το υπερκείμενο κλάςμα και αναμειγνφεται ξανά με τθν απαραίτθτθ ποςότθτα κορεςμζνου διαλφματοσ (NH 4 ) 2 SO 4 ϊςτε να επιτευχκεί κορεςμόσ 50%. Στθ ςυνζχεια το διάλυμα αωινεται ςε θρεμία για 30 λεπτά και αναδεφεται ιπια ανά τακτά χρονικά διαςτιματα και ακολουκεί ωυγοκζντρθςθ του διαλφματοσ ςτισ 15000rpm για 30 λεπτά ςτουσ 0-4 C. Λαμβάνεται το υπερκείμενο κλάςμα και αναμειγνφεται ξανά με κορεςμζνο διάλυμα (NH 4 ) 2 SO 4 και αναδεφεται ζντονα, ϊςτε να επιτευχκεί κορεςμόσ 75%. Στθ ςυνζχεια το διάλυμα αωινεται ςε θρεμία για 30 λεπτά και αναδεφεται ιπια ανά τακτά χρονικά διαςτιματα και ακολουκεί ωυγοκζντρθςθ του διαλφματοσ ςτισ 15000rpm για 30 λεπτά ςτουσ 0-4 C. Αποχφνεται το υπερκείμενο κλάςμα και γίνεται επαναδιάλυςθ του ιηιματοσ ςε κατάλλθλθ ποςότθτα διαλφματοσ S-ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων ϊςτε θ ςυγκζντρωςθ του ενηυμικοφ παραςκευάςματοσ να είναι ~20mg/mL. Στθ ςυνζχεια γίνεται προςκικθ διαικυλαμινοαικυλο-κελουλόηθσ (DEAE-cellulose) [330mg/10mL+ και μετά από θρεμία του διαλφματοσ για 15 λεπτά αυτό ωυγοκεντρείται ςτισ 15000rpm για 15 λεπτά ςτουσ 0-4 C. Το υπερκείμενο διάλυμα αποτελεί το ενηυμικό παραςκεφαςμα που κα χρθςιμοποιθκεί ςτθ ςυνζχεια. Θ δραςτικότθτα του ενηφμου κακϊσ και θ ικανότθτα αναςτολισ αυτοφ από τισ εξεταηόμενεσ ενϊςεισ προςδιορίηεται ωαςματοωωτομετρικά ςε λ=340nm με προςδιοριςμό τθσ μείωςθσ τθσ απορρόωθςθσ που οωείλεται ςτθν οξείδωςθ του NADPH υπό τθν καταλυτικι δράςθ τθσ ALR1. Πλεσ οι μετριςεισ γίνονται εισ τριπλοφν. Θ αποτίμθςθ τθσ δράςθσ του ενηφμου γίνεται ςτουσ 30 C ςε αντιδρϊν μίγμα που αποτελείται από 2.4mL ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 0.01M (ph=7.2), 100μL διάλυμα NADPH 0.104mM, 300μL ενηυμικό παραςκεφαςμα, 100μl διάλυμα του μετά νατρίου άλατοσ του γλυκουρονικοφ οξζοσ 600mM και 100μl υδατικό διάλυμα 10% DMSO ςε τελικό όγκο 1.1mL. Το διάλυμα του μετά νατρίου άλατοσ του γλυκουρονικοφ οξζοσ προςτίκεται ςτο τζλοσ και ςθματοδοτεί τθν ζναρξθ τθσ αντίδραςθσ, θ οποία παρακολουκείται για 5 λεπτά με λιψθ των 92

93 απορροωιςεων ανά 30 δευτερόλεπτα αωοφ όμωσ ζχει προθγθκεί ιςορρόπθςθ τθσ αντίδραςθσ για 1 λεπτό. Το δείγμα τθσ αναωοράσ περιζχει όλα τα προθγοφμενα εκτόσ από το υπόςτρωμα του γλυκουρονικοφ οξζοσ, ϊςτε να διορκωκεί τυχϊν οξείδωςθ του NADPH που δεν οωείλεται ςτθν αναγωγι του υποςτρϊματοσ. Θ ταχφτθτα τθσ ενηυμικισ αντίδραςθσ πρζπει να είναι ~0,02 ι ~0,01 μονάδεσ απορρόωθςθσ ανά λεπτό και γίνεται ρφκμιςθ ςτα προαναωερόμενα όρια με αραίωςθ του ενηυμικοφ παραςκευάςματοσ αν χρειαςτεί. Πμοια γίνεται και θ αποτίμθςθ τθσ αναςταλτικισ δράςθσ των υπό μελζτθ ενϊςεων ςτουσ 30 C ςε αντιδρϊν μίγμα που αποτελείται από 2.4mL ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 0.01M (ph=7.2), 100μL διάλυμα NADPH 0.104mM, 300μL ενηυμικό παραςκεφαςμα, 100μL διάλυμα του μετά νατρίου άλατοσ του γλυκουρονικοφ οξζοσ 600mM και 100μl διάλυμα τθσ ουςίασ ςε τελικό όγκο 1.1mL. Το δείγμα τθσ αναωοράσ περιζχει όλα τα προθγοφμενα εκτόσ από το υπόςτρωμα, ϊςτε να διορκωκεί εκτόσ από τθν τυχόν οξείδωςθ του NADPH που δεν οωείλεται ςτθν αναγωγι του υποςτρϊματοσ και θ ενδεχόμενθ απορρόωθςθ τθσ ουςίασ ανάλυςη δεδομένων και ςτατιςτική επεξεργαςία Το ποςοςτό τθσ αναςτολισ του ενηφμου από κάκε αναςτολζα υπολογίηεται με ςφγκριςθ τθσ ταχφτθτασ αντίδραςθσ του διαλφματοσ που περιζχει υπόςτρωμα και αναςτολζα ςε ςχζςθ με το διάλυμα που περιζχει μόνο υπόςτρωμα (control), ςφμωωνα με τον ακόλουκο τφπο: ύ contol ύ ύ control έ Στθ ςυνζχεια προςδιορίηεται θ μζςθ αναςταλτικι ςυγκζντρωςθ (ΛC 50 ), δθλαδι θ ςυγκζντρωςθ τθσ ουςίασ που απαιτείται για να προκαλζςει αναςτολι του ενηφμου κατά 50%. Για τον προςδιοριςμό των τιμϊν ΛC 50 οι ενϊςεισ μελετικθκαν ςε τουλάχιςτο 5 ςυγκεντρϊςεισ. Οι καμπφλεσ λογαρίκμου ςυγκζντρωςθσ-βιολογικισ δράςθσ καταςκευάςτθκαν με ανάλυςθ παλινδρόμθςθσ του ευκφγραμμου τμιματοσ τθσ αντίςτοιχθσ καμπφλθσ, με χριςθ του ςτατιςτικοφ προγράμματοσ Excel ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΡΨΗ ΣΗ ΕΛΕΤΘΕΡΗ ΡΙΖΑ DPPH (Alexiou et al., 2008; Stefek et al., 2008) υλικά - διαλύματα Ραραςκευάηονται διαλφματα των ενϊςεων ςε απόλυτθ αικανόλθ ςε διάωορεσ ςυγκεντρϊςεισ κακϊσ και αικανολικό διάλυμα DPPH 0.4 mm (τελικι ςυγκζντρωςθ κατά τθ διεξαγωγι του πειράματοσ 0.2mM) in vitro πειραματικό πρωτόκολλο προςδιοριςμού τησ ικανότητασ αλληλεπίδραςησ με την ελεύθερη ρίζα DPPH Για τον προςδιοριςμό τθσ αντιοξειδωτικισ δράςθσ των ενϊςεων χρθςιμοποιείται θ μζκοδοσ DPPH ςφμωωνα με τθν οποία προςδιορίηεται θ ικανότθτα των μορίων να αλλθλεπιδροφν 93

94 με τθν ςτακερι ελεφκερθ ρίηα 2,2-διωαινυλο-1-πικρυλυδραηφλιο (DPPH). Ρρόκειται για μια ρίηα με λιπόωιλο χαρακτιρα που παρουςιάηει μεγάλθ ςτακερότθτα λόγω ςυντονιςμοφ (ευρφτερθ κατανομι ωορτίου του μονιρουσ θλεκτρονίου ) και δεν διμερίηεται. Θ ελεφκερθ ρίηα DPPH παρουςιάηει απορρόωθςθ ςτα 517nm (βακφ ιϊδεσ χρϊμα). Στθν περίπτωςθ ιςχυρισ αντιοξειδωτικισ δράςθσ παρατθρείται εμωανισ αποχρωματιςμόσ του διαλφματοσ του DPPH. Ο προςδιοριςμόσ τθσ ικανότθτασ αλλθλεπίδραςθσ με τθν ελεφκερθ ρίηα γίνεται ωαςματοωωτομετρικά ςε λ=517 nm μετά από τθ πάροδο κατάλλθλου χρονικοφ διαςτιματοσ ϊςτε θ αλλθλεπίδραςθ να ωτάςει ςτθν ςτακεροποιθμζνθ κατάςταςθ (steady state) (Bondet et al., 1997) και όχι μετά τθν πάροδο 30 λεπτϊν, όπωσ αναωζρεται ςε πολλά πειραματικά πρωτόκολλα (Yokozawa et al., 1998), και πάντα λαμβάνοντασ υπόψθ και τθν απορρόωθςθ των εκάςτοτε εξεταηόμενων μορίων. Πλεσ οι μετριςεισ γίνονται εισ τριπλοφν ανάλυςη δεδομένων και ςτατιςτική επεξεργαςία Θ ικανότθτα αλλθλεπίδραςθσ με τθν ελεφκερθ ρίηα DPPH προςδιορίηεται υπολογίηοντασ το ποςοςτό τθσ ρίηασ που δεςμεφεται από τθν ουςία ςε διάωορεσ ςυγκεντρϊςεισ ςτθν ςτακεροποιθμζνθ κατάςταςθ (steady state). Το ποςοςτό αυτό υπολογίηεται με βάςθ τον ακόλουκο τφπο: 100 A.. DPPH ί.(.. DPPH ) A.. ί Στθ ςυνζχεια προςδιορίηεται θ μζςθ αναςταλτικι ςυγκζντρωςθ (ΛC 50 ), δθλαδι θ ςυγκζντρωςθ τθσ ουςίασ που απαιτείται για να προκαλζςει αλλθλεπίδραςθ με τθν ελεφκερθ ρίηα κατά 50% όταν θ αντίδραςθ βρίςκεται ςτθν ςτακεροποιθμζνθ κατάςταςθ. Ο προςδιοριςμόσ γίνεται μετά από τθ γραμμικι ςυςχζτιςθ του ποςοςτοφ αλλθλεπίδραςθσ τθσ ουςίασ ςε διάωορεσ ςυγκεντρϊςεισ και των αντίςτοιχων λογαρίκμων των ςυγκεντρϊςεων με τθ βοικεια του ςτατιςτικοφ προγράμματοσ Excel Επίςθσ υπολογίηεται και θ τιμι τθσ μζςθσ αποτελεςματικισ ςυγκζντρωςθσ (EC 50 ), που ορίηεται ωσ ο λόγοσ τθσ ΛC 50 προσ τθ χρθςιμοποιοφμενθ ςυγκζντρωςθ του DPPH. Πςο αωορά τθν κινθτικι μελζτθ τθσ αλλθλεπίδραςθσ γίνονται διαγράμματα μεταβολισ τθσ απορρόωθςθσ των διαλυμάτων του DPPH και ιςομοριακϊν ποςοτιτων τθσ ουςίασ και υπολογίηεται θ προκαλοφμενθ μείωςθ αυτισ μετά από χρόνο ςτον οποίο κρίνεται πωσ θ μείωςθ τθσ απορρόωθςθσ είναι ζντονθ και γραμμικι (ςυνικωσ 30 ι 60 δευτερόλεπτα) ενϊ διαπιςτϊνεται και ο χρόνοσ που πραγματοποιείται θ επίτευξθ τθσ ςτακεροποιθμζνθσ κατάςταςθσ (όχι μόνο για ιςομοριακι ποςότθτα ουςίασ αλλά για όλεσ τισ ςυγκεντρϊςεισ) όπου γίνονται οι μετριςεισ για τουσ προαναωερόμενουσ προςδιοριςμοφσ

95 ΜΕΛΕΣΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΗ ΤΠΕΡΟΞΕΙΔΨΗ DOPC ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ (Alexiou et al., 2008; Stefek et al., 2008) υλικά διαλύματα Για τθν διεξαγωγι του πειράματοσ παραςκευάηονται τα ακόλουκα διαλφματα: υκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων M/15 (ph=7.4) κακϊσ επίςθσ και ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 20 mm (ph=7.4) με αραίωςθ του προθγοφμενου 3:10, διάλυμα του υδροχλωρικοφ 2,2 - αηωδισ(2-αμινοπροπάνιου) AAPH 100mM (76.5mg AAPH ςε 2.5mL διαλφματοσ ωωςωορικϊν ιόντων 20mM), διάλυμα 4.5mM ζνυδρου εναμμϊνιου κειικοφ ςιδιρου Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2.6Θ 2 Ο ςε ΘCl (A) (44.1mg Fe(NH 4 ) 2 (SO 4 ) 2.6Θ 2 Ο ςε 25mL 0.2M HCl (8.6mL 37% HCl mL H 2 O)), διάλυμα 3% κειοκυανιοφχου καλίου KSCN ςε μεκανόλθ (B) (0.3g KSCN ςε 10mL CH 3 OH), κειοκυανικό αντιδραςτιριο (Α+Β ςε αναλογία 1:1) (τα τρία τελευταία διαλφματα γίνονται τθν θμζρα του πειράματοσ και διατθροφνται ςε πάγο), μίγμα εκχφλιςθσ (CHCl 3 :MeOH (2:1, v/v) + 2,6-δι-tβουτυλο-p-κρεςόλθ ΒΘΤ (0.05%)) και τζλοσ 10% υδατικά διαλφματα DMSO τθσ υπό εξζταςθσ ουςίασ ςε ςυγκεντρϊςεισ που ξεκινοφν από 3x10-4 Μ ωσ 10-6 Μ. Πλοι οι διαλφτεσ που χρθςιμοποιοφνται είναι απεςταγμζνοι και επιπλζον διαβιβάηεται Ν 2 για ~10 λεπτά με ςκοπό τθν απομάκρυνςθ του Ο in vitro πειραματικό πρωτόκολλο κατεργαςίασ λιποςωμάτων, επώαςησ και προςδιοριςμόσ τησ λιπιδικήσ υπεροξείδωςησ Κατεργαςία λιποςωμάτων: Πλα τα απαραίτθτα διαλφματα τοποκετοφνται ςε παγόλουτρο. Ηυγίηονται 15.7mg λιποςϊματα διελαΐκισ L-α-ωωςωατιδυλοχολίνθσ (C18:1, [cis]-9) (L-α-phosphatidylochlorine dioleoyl (C18:1, [cis]-9) DOPC liposomes) και διαλφονται ςε 5mL CHCl 3. Στθ ςυνζχεια το CHCl 3 εξατμίηεται με διοχζτευςθ Ν 2. Στθ ςυνζχεια το λεπτό υμζνιο ςχθματίηει αιϊρθμα με τθν προςκικθ 20mL 20mM διαλφματοσ ωωςωορικϊν ιόντων ph=7.4 που διατθρείται ςτο πάγο. Επϊαςθ λιποςωμάτων: Για τθν διεξαγωγι των μετριςεων προετοιμάηονται οι δοκιμαςτικοί ςωλινεσ επϊαςθσ με κάποιουσ από αυτοφσ να περιζχουν τθν υπό εξζταςθ ουςία ςε 6 διαφορετικζσ ςυγκεντρϊςεισ ενϊ ο τελικόσ όγκοσ υγροφ είναι 1mL. Θ γενικι διάταξθ είναι θ ακόλουκθ: οσσία [μμ] διάλσμα τωρίς οσσία λιποσώματα 1mΜ buffer AAPH (100mΜ)

96 Πςο τα διαλφματα είναι ςτο πάγο δεν λαμβάνουν χϊρα αντιδράςεισ υπεροξείδωςθσ. Θ αντίδραςθ τθσ υπεροξείδωςθσ ξεκινά ςε κερμοκραςία >50 C. Τα διαλφματα και τα αντιδραςτιρια προςτίκενται με τθ ςειρά που αναγράωονται ςτο πίνακα (ο υδρόωιλοσ αηω-εκκινθτισ τθσ υπεροξείδωςθσ, το AAPH, πάντα ςτο τζλοσ) και ενϊ οι δοκιμαςτικοί ςωλινεσ βρίςκονται ςε πάγο. Αναλυτικά οι ποςότθτεσ αναγράωονται παρακάτω: ουςία *μμ+ διάλυμα χωρίσ ουςία (10% aq.dmso ) Bt0 Bt80 control C1 C2 C3 C4 C5 C mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL λιποςϊματα 1mΜ 0.8mL 0.8mL 0.8mL 0.8mL 0.8mL 0.8mL 0.8mL 0.8mL 0.8mL buffer 0.1mL 0.1mL AAPH (100mΜ) mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL Πλοι οι δοκιμαςτικοί ςωλινεσ εκτόσ από αυτοφσ με αρίκμθςθ 1 ωζρονται ςε υδατόλουτρο ςτουσ 50 C για 80 λεπτά ϊςτε να προκλθκεί κερμικι διάςπαςθ του AAPH που κα οδθγιςει ςτο ςχθματιςμό υπεροξειδικϊν ριηϊν. Αναταράςςονται ανά τακτά χρονικά διαςτιματα και πραγματοποιείται θ οξείδωςθ των λιποςωμάτων (τελικι ςυγκζντρωςθ 0.8mM) παρουςία των διαωόρων ςυγκεντρϊςεων τθσ υπό εξζταςθσ ουςίασ και του υδατοδιαλυτοφ αηω-εκκινθτι AAPH (τελικι ςυγκζντρωςθ 10mM). Ρροςδιοριςμόσ LOOH: Μετά τθν πάροδο 80 λεπτϊν θ επϊαςθ διακόπτεται με μεταωορά ςε πάγο. Στθ ςυνζχεια μεταωζρεται το περιεχόμενο των δοκιμαςτικϊν ςωλινων (1mL) ςε άλλουσ που περιζχουν 2 ml ψυχρό μίγμα των διαλυτϊν εκχφλιςθσ. Το περιεχόμενο των δοκιμαςτικϊν ςωλινων αναταράςςεται με ιπιεσ κινιςεισ για 5 λεπτά και ςτθ ςυνζχεια ωυγοκεντρείται ςτισ 1000rpm/10λεπτά. Θ υδατικι ςτοιβάδα (πάνω ςτοιβάδα) αωαιρείται με αντλία νεροφ και από τθν οργανικι ςτοιβάδα (κάτω ςτοιβάδα) λαμβάνεται 1mL με μεγάλθ προςοχι και μεταωζρεται ςε άλλα ςωλθνάκια, τα οποία δεν είναι ψυχρά. Θ ζκταςθ τθσ λιπιδικισ υπεροξείδωςθσ προςδιορίηεται με τθν κειοκυανικι μζκοδο (Mihaljevic et al., 1996) προςκζτοντασ 1.4mL από το μίγμα διαλυτϊν τθσ εκχφλιςθσ και 0.1mL από το κειοκυανικό αντιδραςτιριο. Κατά τθν εκχφλιςθ τθσ λιπιδικισ ωάςθσ με το ςυγκεκριμζνο μίγμα διαλυτϊν (Folch reagent) απομακρφνονται τυχόν υπεροξείδια αμινοξζων κακϊσ και Θ 2 Ο 2, τα οποία αντιδροφν με τα Fe 2+ και μπορεί να προκαλζςουν αλλοίωςθ των αποτελεςμάτων. To BHT είναι ζνα αντιδραςτιριο που ςταματά τθν αντίδραςθ τθσ υπεροξείδωςθσ. 96

97 Το μίγμα αωινεται ςε θρεμία για 10 λεπτά ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ και ςτθ ςυνζχεια ωυγοκεντρείται ςτισ 3000rpm/10λεπτά. Μετροφνται οι απορροωιςεισ ςε λ=500nm. Για το μθδενιςμό του οργάνου χρθςιμοποιείται το μίγμα τθσ εκχφλιςθσ. Πλεσ οι μετριςεισ γίνονται εισ τριπλοφν ανάλυςη δεδομένων και ςτατιςτική επεξεργαςία Από τα αποτελζςματα των B t0 και B t80 ωαίνεται αν πραγματοποιείται αυτοχπεροξείδωςθ. Στθν περίπτωςθ των DOPC λιποςωμάτων δεν παρατθρείται κάτι τζτοιο, οπότε οι απορροωιςεισ των 1 και 2 χρθςιμοποιοφνται για τθν διόρκωςθ των υπόλοιπων απορροωιςεων. Τα ςωλθνάκια με αρίκμθςθ 3 αποτελοφν τα δείγματα αναωοράσ (control) και ορίηουν το 0% τθσ αναςτολισ. Το ποςοςτό τθσ αναςτολισ τθσ λιπιδικισ υπεροξείδωςθσ από κάκε αναςτολζα υπολογίηεται ςφμωωνα με τον ακόλουκο τφπο: Acontrol Atest 100 Acontrol Στθ ςυνζχεια προςδιορίηεται θ μζςθ αναςταλτικι ςυγκζντρωςθ (ΛC 50 ), δθλαδι θ ςυγκζντρωςθ τθσ ουςίασ που απαιτείται για να προκαλζςει αναςτολι του λιπιδικισ υπεροξείδωςθσ κατά 50%. Για τον προςδιοριςμό των τιμϊν ΛC 50 οι ενϊςεισ μελετικθκαν ςε 6 ςυγκεντρϊςεισ. Οι καμπφλεσ λογαρίκμου δόςθσ-αναςταλτικισ δράςθσ καταςκευάςτθκαν με ανάλυςθ παλινδρόμθςθσ του ευκφγραμμου τμιματοσ τθσ αντίςτοιχθσ καμπφλθσ, με χριςθ του ςτατιςτικοφ προγράμματοσ Excel IN SILICO ΜΕΛΕΣΗ IN SILICO ΜΕΛΕΣΗ ΚΑΙ ΔΙΑΜΟΡΥΨΗ QSAR ΣΨΝ ΣΕΛΙΚΨΝ ΕΝΨΕΨΝ ΠΟΤ ΑΝΑΠΣΤΦΘΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΗ ΔΙΑΣΡΙΒΗ υπολογιςμόσ φυςικοχημικών ιδιοτήτων Για το ςφνολο των τελικϊν ενϊςεων που αναπτφχκθκαν ςτα πλαίςια τθσ παροφςασ διδακτορικισ διατριβισ υπολογίςτθκαν επιλεγμζνεσ ωυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ με τθ βοικεια κατάλλθλων υπολογιςτικϊν προγραμμάτων (πίνακασ 1-3). ΠΙΝΑΚΑ 1: φυςικοχημικέσ ιδιότητεσ που ςχετίζονται με ενεργειακά φαινόμενα ζνωςθ HE (Kcal/mol) E HOMO (hartrees) E LUMO (hartrees) E gap (hartrees) AX AX AX AX AX AX

98 AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX ζνωςθ ΠΙΝΑΚΑ 2: φυςικοχημικέσ ιδιότητεσ που ςχετίζονται με ενεργειακά φαινόμενα και φαινόμενα κατανομήσ φορτίου ESP min (Kcal/mol) ESP max (Kcal/mol) ESP range (Kcal/mol) Dipole (debeys) Polarizability EDSA (Å 2 ) EDVOL AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX (Å 3 ) 98

99 ζνωςθ TPSA (Å 2 ) ΠΙΝΑΚΑ 3: λοιπέσ φυςικοχημικέσ ιδιότητεσ που αναφέρονται ςτη μορφήςτερεοδιάταξη των μορίων, οξύτητα και λιποφιλικότητα PSA (Å 2 ) WASA (Å 2 ) WAVOL (Å 3 ) CMR pka (φαινόλθσ ι αντίςτοιχθσ βιοϊςοςτεροφσ ομάδασ) pka (-SO 2NH-) logp ClogP AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX AX Ο υπολογιςμόσ του ςυνόλου των ωυςικοχθμικϊν ιδιοτιτων που ςχετίηονται με τισ θλεκτρονιακζσ ιδιότθτεσ των μορίων κακϊσ και ωαινόμενα κατανομισ ωορτίου (Netzeva et al., 2005) ζγιναν με το πρόγραμμα Spartan v [OpenGL, Wavefunction, Inc., Von Karman Avenue, Suite 370, Irvine, CA U.S.A]. Συγκεκριμζνα υπολογίςτθκαν: θ διπολικι ροπι (Dipole), οι ενζργειεσ LUMO και HOMO (E LUMO / E HOMO ), το μζγιςτο και ελάχιςτο θλεκτροςτατικό δυναμικό (ESP max/min ) και ο όγκοσ και το εμβαδόν θλεκτρονικισ πυκνότθτασ (EDVOL και EDSA). Για το ςκοπό αυτό ζγινε προςδιοριςμόσ τθσ διαμόρωωςθσ ελάχιςτθσ ενζργειασ. Αναλυτικότερα, ζγινε βελτιςτοποίθςθ τθσ δομισ των ενϊςεων με τθ χριςθ κβαντομθχανικισ μεκόδου ΑΜ1. Ακολοφκωσ, ζγινε τυχαία αναπαραγωγι διαμορωϊςεων με τθ μζκοδο Monte Carlo με επιλογι όλων των δεςμϊν που είναι δυνατό να περιςτραωοφν και εωαρμογι του δυναμικοφ πεδίου μοριακισ μθχανικισ Merck (MMFF94). Στθ ςυνζχεια, ςτο διαμορωομερζσ με τθν ελάχιςτθ ενζργεια ζγιναν υπολογιςμοί με κβαντομθχανικζσ μεκόδουσ ςε επίπεδο RHF/6-31G** και θμι- 99

100 εμπειρικϊσ ςε επίπεδο ΑΜ1-SM2. Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να αναωερκεί πωσ οι διάωοροι υπολογιςμοί αποςτάςεων μεταξφ ατόμων ι κζντρων δακτυλίων αωοροφν ςτισ δομζσ ελάχιςτθσ ενζργειασ. Για τθν εφρεςθ τθσ ενζργειασ ενυδάτωςθσ (ΘΕ) ζγιναν θμι-εμπειρικοί ΑΜ1 υπολογιςμοί (ΑΜ1-SM2, Water (C-T)). Επίςθσ, υπολογίςτθκαν θ επιωάνεια και ο όγκοσ που είναι προςιτά ςτο νερό (WASA και WAVOL) και το εμβαδόν πολικισ μοριακισ επιωάνειασ (PSA) με τθ βοικεια του προγράμματοσ Molgen v.4.0 [International Copyright 1996, P. Baricic, M. Mackov & E. Slone]. Δια μζςω εωαρμογϊν του διαδικτφου υπολογίςτθκαν οι ακόλουκεσ ωυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ: το εμβαδόν τθσ τοπογραωικισ μοριακισ πολικισ επιωάνειασ TPSA [ meetings/emug00/ertl/tpsa.html] και θ πολωςιμότθτα των μορίων (Polarizability) [PETRA on line, petra/ index.html]. Οι τιμζσ pka κακϊσ και οι τιμζσ λιποωιλικότθτασ logp υπολογίςτθκαν με το πρόγραμμα Pallas v [CompuDrug Chemistry Ltd, Copyright 1994, Οι τιμζσ τθσ μοριακισ διακλαςτικότθτασ (CMR) κακϊσ και οι τιμζσ λιποωιλικότθτασ κατά Leo και Hansch ClogP υπολογίςτθκαν με το πρόγραμμα C-QSAR v4.0 [Biobyte]. Επίςθσ ςτα πλαίςια διερεφνθςθσ του αν οι τελικζσ ενϊςεισ πλθροφν τα κριτιρια του κανόνα των 5, όλεσ οι απαιτοφμενεσ πλθροωορίεσ παρουςιάηονται ςυγκεντρωμζνεσ ςτον πίνακα που ακολουκεί (πίνακασ 4). O αρικμόσ των κζςεων ςχθματιςμοφ δεςμϊν υδρογόνου ωσ δότεσ Θ (ΘD) υπολογίςτθκε με βάςθ το ςυνολικό αρικμό των ομάδων ΟΘ και ΝΘ, ενϊ ο αρικμόσ των κζςεων ςχθματιςμοφ δεςμϊν υδρογόνου ωσ δζκτεσ Θ (ΘΑ) υπολογίςτθκε με βάςθ το ςυνολικό αρικμό ατόμων οξυγόνου και αηϊτου του μορίου. ζνωςθ ΠΙΝΑΚΑ 4: ιδιότητεσ που αφορούν ςτον κανόνα των 5 Μοριακό Βάροσ logp/clogp HD HA PSA (Å 2 ) παραβιάςεισ AX / AX / AX / AX / AX / AX / AX / AX / AX / AX / AX / AX / AX /

101 AX / AX / AX / AX / AX / διαμόρφωςη ςχέςεων 2D-QSAR Για τθ διαμόρωωςθ κλαςςικϊν 2D-QSAR χρθςιμοποιικθκε το πρόγραμμα C-QSAR v. 4.0 [Biobyte], όπου χρθςιμοποιείται θ πολλαπλι γραμμικι ανάλυςθ παλινδρόμθςθσ κατά Hansch (Hansch and Steward, 1964; Hansch et al., 2002) με ςκοπό τθν ςυςχζτιςθ τθσ βιολογικισ δράςθσ με τισ ωυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ του μορίου. Βιολογικι Δράςθ = f (Φυςικοχθμικζσ Ιδιότθτεσ) Θ διαδικαςία που ακολουκικθκε ςτθν QSAR ανάλυςθ για τθν εξαγωγι των εξιςϊςεων είναι θ ακόλουκθ: Ρροςδιοριςμόσ τθσ ομάδασ των χθμικϊν μορίων που κα δοκιμαςτοφν Ειςαγωγι των δεδομζνων τθσ βιολογικισ δραςτικότθτασ Οι προχποκζςεισ για τα βιολογικά δεδομζνα είναι: α) οι ενϊςεισ να ζχουν τον ίδιο μθχανιςμό δράςθσ και να δρουν ςτον ίδιο ςτόχο, β) θ βιολογικι δράςθ να είναι εκωραςμζνθ ςε αρικμθτικά δεδομζνα, τα οποία αντιςτοιχοφν ςε μοριακζσ ςυγκεντρϊςεισ (ςυνικωσ με τθν μορωι αρνθτικοφ δεκαδικοφ λογαρίκμου ϊςτε τα αρικμθτικά δεδομζνα να αυξάνουν με αφξθςθ τθσ δράςθσ / ςυχνά χρθςιμοποιείται θ ζκωραςθ log1/ic 50 ), γ) να είναι γνωςτό το επίπεδο διεξαγωγισ των βιολογικϊν πειραμάτων πχ. μοριακό ι κυτταρικό, απομονωμζνο όργανο ι ςφςτθμα, δ) τα βιολογικά πειράματα να ςυνοδεφονται από πλθροωορίεσ για τθν αξιοπιςτία τουσ και ε) θ τιμι τθσ βιολογικισ δράςθσ να ζχει καλι κατανομι. Υπολογιςμόσ ωυςικοχθμικϊν παραμζτρων Συνοπτικι παρουςίαςθ μερικϊν από τισ κυριότερεσ παραμζτρουσ που χρθςιμοποιοφνται ςε QSAR μελζτεσ δίνεται ςτον επόμενο πίνακα (πίνακασ 5). ΠΙΝΑΚΑ 5: Σθμαντικότερεσ παράμετροι που χρθςιμοποιοφνται ςε QSAR Παράμετροι ςυμβολιςμόσ ΤΔΡΟΦΟΒΕ ΠΑΡΑΜΕΣΡΟΙ Λιποωιλικότθτα (λογάρικμοσ του Συντελεςτι Κατανομισ-partition coefficient) Υδρόωοβθ Στακερά Υποκαταςτάτθ log P Υδρόωοβθ Στακερά Τμιματοσ f, f Λογάρικμοσ του Συντελεςτι Διανομισdistribution coefficient π log D 101

102 ΗΛΕΚΣΡΟΝΙΑΚΕ ΠΑΡΑΜΕΣΡΟΙ ΘΕΩΡΗΣΙΚΕ ΠΑΡΑΜΕΣΡΟΙ ΣΕΡΕΟΧΗΜΙΚΕ ΠΑΡΑΜΕΣΡΟΙ Ραράμετροσ Διαλυτότθτασ log S Στακερζσ του Hammet ς, ς -, ς + Taft s επαγωγικζσ (πολικζσ) ςτακερζσ Swain και Lupton παράμετροσ πεδίου (επαγωγισ) Swain και Lupton παράμετροσ ςυντονιςμοφ Στακερά ιονιςμοφ Μετατοπίςεισ 13 C και 1 H ςε μαγνθτικό πεδίο Ατομικό κακαρό ωορτίο Υπερδιαχυτότθτα Ενζργεια υψθλότερου κατειλθμμζνου μοριακοφ τροχιακοφ Ενζργεια χαμθλότερου μθ κατειλθμμζνου μοριακοφ τροχιακοφ Θλεκτροςτατικό δυναμικό Ραράμετροσ του Taft Μοριακόσ όγκοσ Μοριακό βάροσ Ακτίνα Πγκοσ Μοριακι διακλαςθμότθτα Ραράχωρο ς *, ς I F R pk a, ΔpK a δ q ς, q π S N, S E, S R E HOMO E LUMO V(r) E s MV MW r V w MR P r Verloop ςτερεοχθμικζσ παράμετροι L, B 1, B 4, B 5 Ανάλυςθ και επεξεργαςία δεδομζνων Συχνά ςτθν διεξαγωγι των QSAR γίνεται χριςθ δεικτϊν προκειμζνου να περιγραωοφν ιδιότθτεσ των μορίων που δεν εκωράηονται από κάποια υπολογιςμζνθ ωυςικοχθμικι ιδιότθτα. Εξαγωγι εξίςωςθσ QSAR Εω όςον, ζχει γίνει θ ςχετικι επεξεργαςία και ζχουν προςδιοριςτεί οι «εξαρτθμζνεσ» και οι «ανεξάρτθτεσ» μεταβλθτζσ, το τρζχον υπολογιςτικό πρόγραμμα οδθγεί ςτθν εξαγωγι τθσ QSAR εξίςωςθσ. Ρρόκειται για γραμμικζσ εξιςϊςεισ ανάμεςα ςε ςυγκεκριμζνθ δράςθ και ςτα ωυςικοχθμικά χαρακτθριςτικά μιασ ςειράσ δομικά ςυγγενϊν μορίων που ζχουν προκφψει από τθν ίδια οδθγό ζνωςθ με κατάλλθλεσ τροποποιιςεισ ςτθ δομι: Δράςθ = α 0 + α 1 P 1 + α 2 P 2 + α 3 P α n P n όπου P 1 -P n =παράμετροι που περιγράφουν τθ δομι και α 1 -α n =ςυντελεςτζσ που εξάγονται με ςτατιςτικι επεξεργαςία 102

103 Εκτίμθςθ τθσ εξίςωςθσ QSAR Υπάρχουν τεχνικζσ, μζςω των οποίων, μποροφν να διαπιςτωκοφν ποια από τα δεδομζνα, κα πρζπει να τίκενται εντόσ ι εκτόσ των ορίων ανάλυςθσ (outliers) (a «jack knifing» process). Ζλεγχοσ αξιοπιςτίασ Για τον ζλεγχο αξιοπιςτίασ τθσ ικανότθτασ πρόβλεψθσ του προτφπου ζχουν προτακεί διάωοροι τρόποι, από τουσ οποίουσ ο κυριότεροσ είναι θ «Διαςταυροφμενθ Αξιοπιςτία» - «Cross Validation»(Konovalov et al., 2008). Σφμωωνα με τθν μζκοδο αυτι θ ανάλυςθ επαναλαμβάνεται πολλζσ ωορζσ, αποκλείοντασ κάκε ωορά μια ςειρά δεδομζνων και μζχρι όλεσ οι ςειρζσ να ζχουν αποκλειςτεί εκ περιτροπισ. Οι προβλζψεισ που προκφπτουν από κάκε ξεχωριςτι ςτατιςτικι ανάλυςθ ςυγκρίνονται με τισ προβλζψεισ τθσ αρχικισ ανάλυςθσ, που περιλαμβάνει το ςφνολο των δεδομζνων και υπολογίηεται ο διαςταυροφμενοσ ςυντελεςτισ q 2 (cross-validated correlation coefficient). Ανάλυςθ τθσ εξίςωςθσ Σ αυτό το τμιμα τθσ μελζτθσ προςδιορίηονται με βάςθ τθν εξίςωςθ οι ςθμαντικότερεσ ωυςικοχθμικζσ παράμετροι, οι παράμετροι, που δεν κα λθωκοφν υπ όψθ, κακϊσ επίςθσ και τα ςθμεία εκείνα ςτο χθμικό μόριο, τα οποία ευκφνονται για κακεμιά από τισ προβλεπόμενεσ βιολογικζσ δραςτικότθτεσ. Ρροςδιορίηεται, δθλαδι, θ ωφςθ τθσ ςχζςεωσ δομισ δράςθσ. Θ πολλαπλι γραμμικι ανάλυςθ παλινδρόμθςθσ (Multiple Linear Regression Analysis), επιτρζπει τθν ςυςχζτιςθ μιασ εξαρτθμζνθσ μεταβλθτισ με περιςςότερεσ ανεξάρτθτεσ μεταβλθτζσ. Τα απαραίτθτα ςτατιςτικά ςτοιχεία, που πρζπει να ςυνοδεφουν μια εξίςωςθ παλινδρόμθςθσ είναι (Leo et al., 1971): n: ο αρικμόσ των δεδομζνων ενϊςεων. DF: n-k, οι βακμοί ελευκερίασ όπου K ο αρικμόσ των μεταβλθτϊν. r: ο ςυντελεςτισ ςυςχζτιςθσ, πρζπει να τείνει ςτθν μονάδα και λαμβάνει τιμζσ από (-1 ωσ 1). r 2 : το ποςοςτό των περιπτϊςεων που ερμθνεφει θ εξίςωςθ x100, και κεωρείται ωσ μζτρο τθσ περιγραωικισ ικανότθτασ του προτφπου. q 2 : ο διαςταυροφμενοσ ςυντελεςτισ ςυςχζτιςθσ, πρζπει να είναι μικρότεροσ από το ςυμβατικό r 2 και αποτελεί μζτρο τθσ ικανότθτασ πρόβλεψθσ του προτφπου. s: θ τυπικι απόκλιςθ, πρζπει να τείνει ςτο μθδζν. F-test: ορίηουν το επίπεδο εμπιςτοςφνθσ μεταξφ παραμζτρων τθσ εξίςωςθσ και των βακμϊν ελευκερίασ. Συνικωσ χρθςιμοποιείται επίπεδο εμπιςτοςφνθσ 95%. ( ), confidence limits: ςυνοδεφουν τον ςυντελεςτι κάκε παραμζτρου, οπωςδιποτε μικρότερα από το μιςό τθσ τιμισ του ςυντελεςτι. οutliers - «ζκτροπεσ τιμζσ»: δεδομζνα - πειραματικζσ τιμζσ, που απορρίπτονται, που δεν ςυμπεριλαμβάνονται ςτθν εξαγωγι τθσ εξίςωςθσ. 103

104 IN SILICO ΜΕΛΕΣΗ ΑΝΑΣΟΛΕΨΝ ΣΗ ALR2 (ARIs) ΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΥΙΑ ΜΕ ΚΟΠΟ ΣΗ ΔΙΑΜΟΡΥΨΗ ΓΕΝΙΚΨΝ 2D-QSAR ΚΑΙ ΔΗΜΙΟΤΡΓΙΑ ΜΟΝΣΕΛΨΝ ΠΡΟΒΛΕΧΗ ΣΗ ΑΝΑΣΑΛΣΙΚΗ ΔΡΑΗ Από αναςκόπθςθ τθσ βιβλιογραωίασ επιλζχκθκαν τρεισ διαωορετικζσ κατθγορίεσ ARIs, και ςυγκεκριμζνα: ωαινολικά παράγωγα (Costantino et al., 2002), παράγωγα βενηοπυραν-4-όνθσ (Costantino et al., 2001; Costantino et al., 1999) και εκλεκτικοί ARIs που δεν αποτελοφν παράγωγα καρβοξυλικϊν οξζων ι υδαντοΐνθσ και ςυγκεκριμζνα πρόκειται για παράγωγα αροχλοςουλωονυλο-πυριδαηιν-3(2θ)-όνθσ (Mylari et al., 2003). Συγκεντρωτικοί πίνακεσ με τισ ςυνολικά 61 δομζσ, τθν αναςταλτικι δράςθ (τιμζσ IC 50 ςε μμ) κακϊσ και τισ επιλεγμζνεσ ωυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ που χρθςιμοποιικθκαν ςτισ in silico μελζτεσ παρουςιάηονται ςτο παράρτθμα Γ (ςελ. 175). Κατά περιπτϊςεισ υπολογίςτθκαν και επιπλζον ωυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ και ςυγκεκριμζνα για τα ωαινολικά παράγωγα υπολογίςτθκαν θ μοριακι διακλαςθμότθτα MR για τουσ υποκαταςτάτεσ R 1 και R 2 ενϊ για τα παράγωγα τθσ αροχλο-ςουλωονυλο-πυριδαηιν-3(2θ)-όνθσ υπολογίςτθκε θ μοριακι διακλαςτικότθτα των αροχλο-δακτυλίων. H in silico μελζτθ των ςυγκεκριμζνων ενϊςεων πραγματοποιικθκε με δυο διαωορετικζσ μεκόδουσ: Α) Τθν κλαςςικι 2D-QSAR μζκοδο με χριςθ τθσ πολλαπλισ γραμμικισ ανάλυςθσ παλινδρόμθςθσ κατά Hansch (Hansch and Steward, 1964; Hansch et al., 2002) όπου ςυςχετίςτθκε θ βιολογικι δράςθ με τισ επιλεγμζνεσ ωυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ των μορίων. Κατά περίπτωςθ ζγινε και χριςθ δεικτϊν προκειμζνου να περιγραωοφν ιδιότθτεσ των μορίων που δεν περιγράωονται από κάποια ιδθ υπολογιςμζνθ ωυςικοχθμικι ιδιότθτα. Κα πρζπει να τονιςτεί πωσ οι παραπάνω αναωερόμενεσ τρεισ κατθγορίεσ ARIs μελετικθκαν ξεχωριςτά και όχι ωσ ενιαίο ςφνολο, με ςκοπό τθν ςφγκριςθ των αποτελεςμάτων με αυτά που προζκυψαν από τθν in silico μελζτθ των νζων ARIs και τθν πικανι ανάδειξθ κοινϊν ιδιοτιτων που να επθρεάηουν τθ δράςθ. Β) Τα νευρωνικά δίκτυα τεχνθτι νοθμοςφνθ (Neural Networks (NNs)- Artificial Intelligence) που πραγματοποιικθκε ςε ςυνεργαςία με τθν ερευνθτικι ομάδα του κακθγθτι Νικιτα Δθμόπουλου (Department of Electrical and Computer Engineering, University of Victoria, Canada) (Parra-Hernandez et al., 2005a; Parra-Hernandez et al., 2005b). Τα τεχνθτά νευρωνικά δίκτυα (Artificial Neural Networks), ι απλϊσ νευρωνικά δίκτυα (Neural Networks) είναι ζνα μακθματικό μοντζλο για τθν επεξεργαςία πλθροωορίασ που προςεγγίηει τθν υπολογιςτικι και αναπαραςτατικι δυνατότθτα μζςω ςυνάψεων του εγκεωάλου. Το μοντζλο είναι εμπνευςμζνο από τα βιοθλεκτρικά δίκτυα που δθμιουργοφνται ςτον εγκζωαλο ανάμεςα ςτουσ νευρϊνεσ (νευρικά κφτταρα) και ςτισ ςυνάψεισ (ςθμεία επαωισ των νευρικϊν απολιξεων). Το νευρωνικό δίκτυο είναι ζνα δίκτυο από υπολογιςτικοφσ κόμβουσ (νευρϊνεσ, νευρϊνια), ςυνδεδεμζνουσ μεταξφ τουσ. Είναι εμπνευςμζνο από το Κεντρικό Νευρικό Σφςτθμα (ΚΝΣ), το οποίο προςπακοφν να προςομοιϊςουν. Οι νευρϊνεσ είναι τα δομικά ςτοιχεία του δικτφου και πολλαπλαςιάηουν τισ ειςόδουσ τουσ με τα ςυναπτικά βάρθ και υπολογίηουν το άκροιςμα του γινομζνου. Το άκροιςμα που προκφπτει είναι το όριςμα τθσ ςυνάρτθςθ ενεργοποίθςθσ. Το 104

105 νευρωνικό δίκτυο που χρθςιμοποιικθκε αποτελείται από 6 κρυωοφσ νευρϊνεσ, με ςυνάρτθςθ ενεργοποίθςθσ που ορίηεται ωσ y=2/(1+exp(-2n))-1 και μια ζξοδο με γραμμικι ςυνάρτθςθ ενεργοποίθςθσ y=n. Ο αρικμόσ των ειςαγωγϊν (inputs) ςτο ΝΝ ιςοδυναμεί με τον αρικμό των 17 επιλεγμζνων ωυςικοχθμικϊν παραμζτρων (HE, E LUMO, E HOMO, E gap, ESP min, ESP max, ESP dif, Dipole, Polarizability, EDSA, EDVOL, PSA, WASA, WAVOL ClogP, HA και MR)(αναλυτικι περιγραωι αυτϊν ςτισ ςελ ) για τισ 61 ενϊςεισ από τθν βιβλιογραωία. Για τθν δθμιουργία του εν λόγω ΝΝ χρθςιμοποιικθκαν πλθροωορίεσ (training set) που προζρχονται από παρατθριςεισ ςε αλθκινά ςυςτιματα, το ςφνολο αυτϊν είχε μεγάλθ διαςπορά όςο αωορά τισ χθμικζσ κατθγορίεσ των αναςτολζων (οι τρεισ προαναωερόμενεσ κατθγορίεσ ARIs) και οι ςυναρτιςεισ που προζκυψαν ιταν πολφπλοκεσ. Ρεριλθπτικά θ διαδικαςία που ακολουκικθκε ιταν: από τισ 61 ενϊςεισ επιλζχτθκαν τυχαία 4 για να αποτελζςουν το blind test set οι υπόλοιπεσ 57 ενϊςεισ χωρίςτθκαν ςε δυο υποομάδεσ: τθ ςειρά εκμάκθςθσ (training set) και τθ ςειρά εκπαίδευςθσ (test set) οι παράμετροι αναλφκθκαν με χριςθ του MATLAB NN s Toolbox και κανονικοποιικθκαν (normalized) τα ειςαγωγικά δεδομζνα (inputs) ςτα όρια *-1, 1] (αυτό το επίπεδο κανονικοποίθςθσ εωαρμόςτθκε ςε όλα τα sets) μετά από τθν διαδικαςία ανάλυςθσ των δεδομζνων προζκυψε ο αλγόρικμοσ που αποτελεί και το εν λόγω μθ γραμμικό μοντζλο πρόβλεψθσ τθσ αναςταλτικισ δράςθσ Το μοντζλο που προζκυψε αξιολογικθκε ωσ προσ τθν ικανότθτα πρόβλεψθσ τθσ αναςταλτικισ δράςθσ ωσ προσ τθν ALR2 (blind validation test) με μια τζταρτθ κατθγορία ενϊςεων, τισ τελικζσ ενϊςεισ (ARIs) που αναπτφχκθκαν ςτα πλαίςια τθσ παροφςασ διδακτορικισ διατριβισ. Θ αναςταλτικι δράςθ εκωράηεται ωσ pic 50 (=-logic 50 ) (output data). 105

106

107 5. ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ & ΤΖΗΣΗΗ 5.1. ΤΝΘΕΗ ΕΝΨΕΨΝ ΕΝΨΕΙ ΠΟΤ ΠΑΡΑΚΕΤΑΣΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΑΣΡΙΒΗ ΚΑΙ Η ΤΝΘΕΗ ΣΟΤ ΕΦΕΙ ΔΗΜΟΙΕΤΣΕΙ ΑΠΟ ΑΛΛΟΤ ΕΡΕΤΝΗΣΕ αρωματική νίτρωςη και αναγωγή τησ νιτρο-ομάδασ ςτο δακτύλιο τησ 2,6- διφθοροφαινόλησ (Nicolaou et al., 2004; Qiu et al., 1999) Θ πιο ςθμαντικι αντίδραςθ των αρωματικϊν ενϊςεων είναι θ θλεκτρονιόωιλθ αρωματικι υποκατάςταςθ, κατά τθν οποία ζνα θλεκτρονιόωιλο (Ε + ) αντιδρά με κάποιον αρωματικό δακτφλιο και υποκακιςτά ζνα από τα υδρογόνα του. Σε αυτι τθν κατθγορία αντιδράςεων ςυγκαταλζγεται και θ νίτρωςθ των αρωματικϊν δακτυλίων. Θ αντίδραςθ λαμβάνει χϊρα με μίγμα από πυκνό νιτρικό οξφ και κειικό οξφ. Το θλεκτρονιόωιλο ςε αυτι τθν περίπτωςθ είναι το ιόν του νιτρωνίου ΝΟ 2 +, που προκφπτει από το νιτρικό οξφ με πρωτονίωςθ και αποβολι νεροφ. Το ιόν του νιτρωνίου αντιδρά με τον αρωματικό δακτφλιο και ςχθματίηει ζνα ενδιάμεςο καρβοκατιόν. Θ αποβολι του Θ + από αυτό το ενδιάμεςο οδθγεί ςτο ςχθματιςμό του ουδζτερου προϊόντοσ υποκατάςταςθσ. Στθν περίπτωςθ του αρωματικοφ δακτυλίου τθσ 2,6-διωκοροωαινόλθσ, θ παρουςία τθσ ομάδασ του -ΟΘ ενεργοποιεί το δακτφλιο και ευνοεί τθν ο- και π- υποκατάςταςθ ενϊ θ ομάδα του F απενεργοποιεί το δακτφλιο και ευνοεί τθν μ-υποκατάςταςθ. Για τθν ςφνκεςθ των πρϊτων υλϊν, δθλαδι τθσ 4-νιτρο-2,6-διωκοροωαινόλθσ (Λ) και του υδροχλωρικοφ άλατοσ τθσ 4-αμινο-2,6-διωκοροωαινόλθσ (ΛΛ) ακολουκικθκε θ παρακάτω ςυνκετικι πορεία (ςχιμα 21): ΧΘΜΑ 21 Για τθν νίτρωςθ του δακτυλίου τθσ 2,6-διωκοροωαινόλθσ ακολουκείται δθμοςιευμζνθ ςυνκετικι πορεία (Qiu et al., 1999) ςφμωωνα με τθν οποία χρθςιμοποιείται ατμίηον νιτρικό οξφ και θ προςκικθ γίνεται ςτάγδθν ςε παγόλουτρο γιατί θ αντίδραςθ είναι εξϊκερμθ. Αωοφ ολοκλθρωκεί θ προςκικθ απομακρφνεται το παγόλουτρο. Μετά τθν ολοκλιρωςθ τθσ αντίδραςθσ και τθν παραλαβι του προϊόντοσ πραγματοποιείται εκχφλιςθ με χλωροωόρμιο και κατά τθ ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ προςτίκεται και επτάνιο. Αυτό αποςκοπεί ςτθ δθμιουργία 107

108 αηεοτροπικοφ μίγματοσ, ϊςτε να ελαττωκεί το ςθμείο ηζςθσ του οξικοφ οξζοσ και να καταςτεί δυνατι θ απομάκρυνςθ του. Πςο αωορά τθν χθμεία των νιτρο-ενϊςεων αυτζσ δίνουν αντιδράςεισ αναγωγισ προσ τισ αντίςτοιχεσ αμίνεσ. Μεταξφ διαωόρων τρόπων αναγωγισ (πχ. μεταωορά θλεκτρονίων από μζταλλα, μεταωορά υδριδίου του υδρογόνου ςυνικωσ από LiAlH 3 ) ςυγκαταλζγεται και θ καταλυτικι υδρογόνωςθ, που αποτελεί μια ετερογενι διαδικαςία αωοφ πραγματοποιείται πάνω ςτθν επιωάνεια του ςτερεοφ καταλφτθ (ςυνικωσ Pd προςροωθμζνο ςε κάποιο ωορζα) και όχι μζςα ςε ζνα διάλυμα (Johnstone and Wilby, 1985). Θ επικυμθτι αντίδραςθ λοιπόν μπορεί να πραγματοποιθκεί με τον κλαςςικό τρόπο καταλυτικισ υδρογόνωςθσ με Pd/C και διοχζτευςθ αζριου Θ 2 όπωσ περιγράωεται από τουσ Qui et al. (Qiu et al., 1999). Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτεί πωσ εναλλακτικά μπορεί να εωαρμοςτεί καταλυτικι υδρογόνωςθ μεταωοράσ ωάςθσ υδρογόνου, όπου το Θ 2 παράγεται in situ (Johnstone and Wilby, 1985), κακιςτϊντασ τισ ςυνκικεσ τθσ αντίδραςθσ απλζσ και πιο αςωαλείσ. Στθν περίπτωςθ αναγωγισ τθσ 4-νιτρο-2,6-διωκοροωαινόλθσ χρθςιμοποιικθκε κυκλοεξζνιο και Pd/C ςφμωωνα με τθν μζκοδο που αναπτφχκθκε από τουσ Nicolaou και ςυνεργάτεσ (Nicolaou et al., 2004). Με αυτό τον τρόπο ςχθματίηεται υδρογόνο «εν τω γεννάςκαι» για να πραγματοποιθκεί θ αναγωγι. Κα πρζπει να ςθμειωκεί πωσ δεν παρατθρείται ενδεχόμενθ αςυμβατότθτασ τθσ μεκόδου εξαιτίασ του ωκοριομζνου δακτυλίου. Ο μθχανιςμόσ τθσ αντίδραςθσ ετερογενοφσ καταλυτικισ υδρογόνωςθσ μεταωοράσ ωάςθσ υδρογόνου νιτρο-αρυλίων παρουςιάηεται ςτο ςχιμα που ακολουκεί (ςχιμα 22). ΧΘΜΑ 22 Λαμβάνεται το υδροχλωρικό άλασ τθσ 4-αμινο-2,6-διωκοροωαινόλθσ και όχι θ ελεφκερθ αμίνθ γιατί τα διαλφματα τθσ εμωανίηουν αςτάκεια. Κατά τθν πορεία των αντιδράςεων ςε περιπτϊςεισ ενδεχόμενθσ απελευκζρωςθσ τθσ αμίνθσ από το άλασ που χρθςιμοποιείται ωσ πρϊτθ 108

109 φλθ εμωανίηεται πραςινωπό χρϊμα, ζνδειξθ αςτάκειασ και διάωορεσ κθλίδεσ ςτθ χρωματογραωία TLC. Θ ζνωςθ διαςπάται και λαμβάνονται διάωορα προϊόντα που δεν ζχουν αρωματικά πρωτόνια όπωσ προκφπτει από τα αντίςτοιχα ωάςματα NMR που παρουςιάηονται ςτθ ςυνζχεια (ςχιμα 23). ΧΘΜΑ 23 Θ αςτάκεια αυτι ενδεχομζνωσ να οωείλεται ςτθν ενδιάμεςθ μετατροπι τθσ αμίνθσ ςε ιμινοκινόνθ εξαιτίασ οξείδωςθσ (ςχιμα 24) και πικανό επακόλουκο πολυμεριςμό. Ο ζλεγχοσ τθσ 109

110 αςτάκειασ τθσ 4-αμινο-2,6-διωκοροωαινόλθσ ζγινε ςε ςυνκικεσ παρόμοιεσ με αυτζσ των αντιδράςεων για το ςχθματιςμό των τελικϊν προϊόντων (ςελ. 73). ΧΘΜΑ ςυνθέςεισ γνωςτών ςουλφοναμιδίων με ποικίλεσ λειτουργικέσ ομάδεσ Θ ςφνκεςθ των ενϊςεων 2-(ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικό οξφ (Α), N-κυανομεκυλο)βενηολο ςουλωοναμίδιο (ΑΧ-10α) και N-(1H-τετραηολο-5-υλ)βενηολοςουλωοναμίδιο (ΑΧ-16) πραγματοποιικθκε ακολουκϊντασ τθ μζκοδο ςχθματιςμοφ ςουλωοναμιδικοφ δεςμοφ από το βενηοχλοςουλωονυλοχλωρίδιο και τθσ αντίςτοιχθσ αμίνθσ με χριςθ κάποιασ βάςθσ όπωσ ζχει ιδθ γίνει λόγοσ (3.1. γενικζσ μζκοδοι ςφνκεςθσ ςουλφοναμιδίων). Ριο ςυγκεκριμζνα για τθ ςφνκεςθ του 2-(ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικοφ οξζοσ (Α) ακολουκικθκε θ κλαςςικι ςυνκετικι πορεία όπωσ περιγράωεται και από τουσ DeRuiter και ςυνεργάτεσ χωρίσ καμία αλλαγι (ςχιμα 25) (DeRuiter et al., 1987). ΧΘΜΑ 25 Το N-(κυανομεκυλο)βενηολοςουλωοναμίδιο (ΑΧ-10α) παραςκευάςτθκε με χριςθ του κειικοφ άλατοσ του αμινοακετονιτριλίου, βενηοχλοςουλωονυλοχλωρίδιο και χριςθ τριαικυλαμίνθσ και καταλυτικισ ποςότθτασ N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθσ ςε διαλφτθ τετραχδροωουράνιο (ςχιμα 26). 110

111 ΧΘΜΑ 26 Κατά τθσ αρχικζσ προςπάκειεσ ςφνκεςθσ του ςουλωοναμιδίου ΑΧ-10α χρθςιμοποιικθκε θ τριαικυλαμίνθ ςε διπλάςια μοριακι ποςότθτα ωσ βάςθ ςε ςυνδυαςμό με καταλυτικι ποςότθτα 10% N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθσ αλλά το αποτζλεςμα ιταν θ παραλαβι του επικυμθτοφ προϊόντοσ ςε μικρζσ ποςότθτεσ μαηί με το παραπροϊόν Ν-(κυανομεκυλο)-Ν- (ωαινυλοςουλωονυλο)βενηολοςουλωοναμίδιο AX-10β (αποδόςεισ 11% και 7% αντίςτοιχα). Οι μικρζσ αποδόςεισ ίςωσ να οωείλονται ςτθν απότομθ απελευκζρωςθ του αμινο-ακετονιτριλίου εξαιτίασ τθσ παρουςίασ ιςχυρισ βάςθσ, κάτι που ενδεχομζνωσ να οδθγεί ςε αςτάκεια μζςω διμεριςμοφ (ςχιμα 27). ΧΘΜΑ 27 Θ υπόκεςθ πωσ μια αςκενζςτερθ βάςθ από τθν τριαικυλαμίνθ ίςωσ να μθν προκαλοφςε προβλιματα οδιγθςε ςε μια προςπάκεια ςφνκεςθσ με χριςθ αποκλειςτικά τθσ N,Nδιμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθσ ςε διπλάςια μοριακι ποςότθτα ωσ προσ το νιτρίλιο αλλά θ αντίδραςθ δεν προχωροφςε. Αυτό είχε ωσ αποτζλεςμα να επιχειρθκοφν οι ακόλουκεσ δυο εναλλακτικζσ: α) χριςθ καταλυτικισ ποςότθτασ τθσ N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθσ 10% και προςκικθ τθσ τριαικυλαμίνθσ αργότερα ςτάγδθν (μζκοδοσ Α), προςπάκεια που οδιγθςε ςτο ςχθματιςμό αποκλειςτικά του επικυμθτοφ προϊόντοσ, με απόδοςθ 19% και β) χριςθ μόνο τθσ N,Nδιμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθσ αλλά ςε μεγάλθ περίςςεια ωσ προσ το νιτρίλιο (μζκοδοσ Β), προςπάκεια που οδιγθςε ςε μίγμα προϊόντων με αποδόςεισ 24% και 6% για τισ ενϊςεισ AΧ-10α και AX-10β αντίςτοιχα. 111

112 Κα πρζπει να αναωερκεί πωσ εξετάςτθκε το ενδεχόμενο θ αποκλειςτικι χριςθ τθσ τριαικυλαμίνθσ ςε μεγάλθ περίςςεια να ευνοεί τον ςχθματιςμό του παραπροϊόντοσ, και ςυγκεκριμζνα χρθςιμοποιικθκε τετραπλάςια μοριακι ποςότθτα και χωρίσ προςκικθ N,Nδιμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθσ. Το αποτζλεςμα ιταν ο ςχθματιςμόσ του μίγματοσ των προϊόντων αλλά με αποδόςεισ 7% και 10% για τισ ενϊςεισ AΧ-10α και AX-10β αντίςτοιχα. Θ ςφνκεςθ του N-(1H-τετραηολο-5-υλο)βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-16) (ςχιμα 28) επίςθσ πραγματοποιικθκε με τον κλαςςικό τρόπο ςχθματιςμοφ ςουλωοναμιδίων ςφμωωνα με τουσ DeRuiter και ςυνεργάτεσ (DeRuiter et al., 1987). ΧΘΜΑ 28 Στισ περιπτϊςεισ των ενϊςεων Α και ΑΧ-16 χρθςιμοποιικθκε θ ίδια ςυνκετικι πορεία και οι αποδόςεισ ιταν αντίςτοιχα 59% και 40%. Ρρόκειται για αντίδραςθ πυρθνόωιλθσ ςουλωονυλουποκατάςταςθσ (S N ) όπου το πυρθνόωιλο είναι θ γλυκίνθ και το 5-αμινο-τετραηόλιο αντίςτοιχα. Θ διαωορά των αποδόςεων υπό τισ ίδιεσ ςυνκικεσ εφκολα ερμθνεφεται από το γεγονόσ πωσ μείωςθ τθσ βαςικότθτασ τθσ αμινομάδασ (υπολογιςμζνεσ τιμζσ pka για γλυκίνθ και 5-αμινο-τετραηόλιο είναι 9.73 και 6.05 αντίςτοιχα) ςυμβάλει ςτθ μείωςθ του πυρθνόωιλου χαρακτιρα τουσ. Στο ςθμείο αυτό όμωσ πρζπει να αναωερκεί πωσ ςτθν περίπτωςθ του παραγϊγου του τετραηολίου ΑΧ- 16 θ μειωμζνθ απόδοςθ ενδεχομζνωσ να οωείλεται ςτον πικανό ςχθματιςμό καρβαμιδικοφ αηιδίου (ζνωςθ με ανοικτό το δακτφλιο του επικυμθτοφ τετραηολίου), το οποίο απομακρφνκθκε κατά τθν κατεργαςία με οξίνιςθ για τθν παραλαβι του επικυμθτοφ προϊόντοσ ςτο διικθμα, όπωσ αναωζρεται από τουσ Peet και ςυνεργάτεσ (Peet et al., 1987) ςε μια προςπάκεια ςφνκεςθσ παρόμοιων τετραηολικϊν παραγϊγων με αντίδραςθ βενηοχλοχλωριδίου και 5-αμινο-τετραηολίου ςε τετραχδροωουράνιο/ νερό και κζρμανςθ. Για τθν περίπτωςθ του αμινοακετονιτριλίου, θ βαςικότθτα τθσ αμινομάδασ (υπολογιςμζνθ τιμι pka 5.6) είναι ιδιαίτερα μειωμζνθ εξαιτίασ τθσ παρουςίασ τθσ ομάδασ του νιτριλίου. Επομζνωσ ο μειωμζνοσ πυρθνόωιλοσ χαρακτιρασ τθσ ςε ςυνδυαςμό με τθν ενδεχόμενθ αςτάκεια οδθγοφν ςε χαμθλζσ αποδόςεισ τθσ αντίδραςθσ τθσ ςουλωονυλο-υποκατάςταςθσ κακϊσ και ςτο ςχθματιςμό του διςουλωόνυλο παραπροϊόντοσ. 112

113 ΠΡΨΣΟΣΤΠΕ ΕΝΨΕΙ ΠΟΤ ΠΑΡΑΚΕΤΑΣΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΑΣΡΙΒΗ γενική μέθοδοσ ςύνθεςησ των Ν-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο) αροώλοςουλφοναμιδίων (ΑΧ-1, ΑΧ-2, ΑΧ-3 και AX-7) Για τθ ςφνκεςθ των ενϊςεων ΑΧ-1, ΑΧ-2, AX-3 και ΑΧ-7 θ ςυνκετικι πορεία που ακολουκικθκε είναι θ ακόλουκθ (ςχιμα 29): ΧΘΜΑ 29 Ρρόκειται για μια εκλεκτικι, πολλαπλι αντίδραςθ ενόσ ςταδίου (one-pot), κατά τθν οποία δεν διαχωρίηονται τα ενδιάμεςα προϊόντα και ςυνοπτικά περιλαμβάνει τα ακόλουκα ςτάδια: α)προςταςία του ωαινολικοφ υδροξυλίου με τριμεκυλοςιλλυλοχλωρίδιο, β)ςχθματιςμό του ςουλωοναμιδικοφ δεςμοφ με τθ χριςθ του αντίςτοιχου βενηοχλοςουλωονυλοχλωριδίου, παρουςία καταλυτικισ ποςότθτασ N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθσ, γ) προςκικθ ιςομοριακισ ποςότθτασ (ωσ προσ το υδροχλωρικό άλασ τθσ 4-αμινο-2,6-διωκοροωαινόλθσ) τριαικυλαμίνθσ και δ) υδρόλυςθ του ςιλλυλοαικζρα και απομόνωςθ του επικυμθτοφ προϊόντοσ. Για τθν προςταςία του ωαινολικοφ υδροξυλίου ςτο μόριο του υδροχλωρικοφ άλατοσ τθσ 4- αμινο-διωκοροωαινόλθσ χρθςιμοποιικθκε το τριμεκυλοςιλλυλοχλωρίδιο προσ ςχθματιςμό τριμεκυλοςιλλυλοαικζρα, εξαιτίασ τθσ μεγάλθσ ςυγγζνειασ του Si με το O (Basile-Doelsch, 2006; Basile-Doelsch et al., 2005), και δεν παρατθρείται αντίδραςθ με τθν αμινομάδα. Τζτοιου είδουσ αντιδράςεισ πραγματοποιοφνται παρουςία κάποιασ βάςθσ, ςυνικωσ τριαικυλαμίνθσ που βοθκά ςτο ςχθματιςμό του ανιόντοσ ωαινοξειδίου, ενϊ ταυτόχρονα δεςμεφει το ςχθματιηόμενο HCl (House et al., 1969; Langer et al., 1958). Σχετικά με το μθχανιςμό τθσ ςυγκεκριμζνθσ αντίδραςθσ και ςτο ςτάδιο ςχθματιςμοφ του αικζρα, το ανιόν του ωαινοξειδίου προςβάλλει το άτομο του πυριτίου, με ταυτόχρονθ απϊλεια του αποχωροφντοσ ανιόντοσ χλωρίου. Ενϊ λοιπόν πρόκειται για μια αντίδραςθ πυρθνόωιλθσ υποκατάςταςθσ S N 2, θ προςβολι από το πυρθνόωιλο ςε ζνα τριτοταγζσ κζντρο (το τριαλκυλο-υποκατεςτθμζνο άτομο του πυριτίου) είναι δυνατι επειδι το 113

114 πυρίτιο, ωσ ςτοιχείο τθσ τρίτθσ περιόδου του περιοδικοφ πίνακα είναι ογκωδζςτερο από τον άνκρακα και ςχθματίηει δεςμοφσ με μεγαλφτερο μικοσ. Κατά ςυνζπεια θ ςτερεοχθμικι παρεμπόδιςθ από τουσ τρεισ αλκυλο-υποκαταςτάτεσ είναι μικρότερθ ςε ςχζςθ με το αντίςτοιχο τεταρτοταγζσ βουτυλοχλωρίδιο (Showell and Mills, 2003). Θ αποπροςταςία τθσ ωαινόλθσ πραγματοποιείται εφκολα με υδρόλυςθ του ςιλλυλοαικζρα με υδατικά οξζα ι με ανιόντα ωκορίου. Στισ αρχικζσ προςπάκειεσ ςφνκεςθσ τθσ ζνωςθσ ΑΧ-1 κατά τθν προςταςία του ωαινολικοφ υδροξυλίου χρθςιμοποιικθκε ιςομοριακι ποςότθτα τριαικυλαμίνθσ (ωσ προσ το αρχικό άλασ). Αυτό όμωσ προκαλοφςε και τθν αποπρωτονίωςθ τθσ 4-αμινο-2,6-διωκοροωαινόλθσ από ζνα μζροσ του αρχικοφ άλατοσ, τα διαλφματα τθσ οποίασ όμωσ είναι αςτακι (ςελ.79). Στθ ςυνζχεια για το ςχθματιςμό του ςουλωοναμιδίου εκτόσ από το αντίςτοιχο βενηοχλοςουλωονυλοχλωρίδιο και τθν N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθ ωσ ιςχυρό πυρθνόωιλο (ςε καταλυτικι ποςότθτα) χρθςιμοποιικθκε και τριαικυλαμίνθ, ςε διπλάςια μοριακι ποςότθτα αυτι τθ ωορά, ϊςτε να δεςμεφςει τόςο τα ιόντα χλωρίου του βενηοχλοςουλωονυλοχλωριδίου όςο και αυτό του άλατοσ τθσ αμίνθσ. Στισ περιπτϊςεισ αυτζσ, το τελικό αποτζλεςμα μετά τθν υδρόλυςθ ςτο τελευταίο ςτάδιο ιταν εκτόσ από το επικυμθτό ςουλωοναμίδιο να παραλαμβάνεται και ο αντίςτοιχοσ αμινοςουλωονυλοεςτζρασ (ςχιμα 30), ςε ςυγκρίςιμθ ποςότθτα ςε ςχζςθ με το κφριο προϊόν, που ταυτοποιικθκε με ωαςματοςκοπία 1H-NMR (δ 6.3 (m, 2H, C-2-H και C-6-H του 3,5- διφκοροφαινολικοφ δακτυλίου), (m, 7H, -NH 2 και αρωματικά)). ΧΘΜΑ 30 Ζγινε προςπάκεια διαχωριςμοφ του κυρίου και επικυμθτοφ προϊόντοσ από το παραπροϊόν με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και διάωορα ςυςτιματα ζκλουςθσ αλλά ο πλιρθσ διαχωριςμόσ τουσ δεν κατζςτθ δυνατόσ. Τελικά οι ενϊςεισ αυτζσ διαχωρίςτθκαν μετά από μετατροπι του αμινοςουλωονυλοεςτζρα ςε υδροχλωρικό άλασ με προςκικθ υδροχλωρικοφ οξζοσ ςε αικζρα και παραλαβι του προϊόντοσ ΑΧ-1 ςτθν οργανικι ςτοιβάδα. Με μικρζσ αλλαγζσ ςτθν προθγοφμενθ μζκοδο που αωοροφςαν τον ρυκμό προςκικθσ τθσ τριαικυλαμίνθσ ι τθν αντικατάςταςθ αυτισ από μια αςκενζςτερθ βάςθ όπωσ θ Ν-μεκυλο-2-114

115 πυρρολιδόνθ και μικρζσ ποςοτικζσ αλλαγζσ ςτισ ποςότθτεσ των αντιδραςτθρίων, οι αποδόςεισ για τθν ζνωςθ ΑΧ-1 κυμάνκθκαν μεταξφ του 28-38%. Θ πρϊτθ ουςιαςτικι αλλαγι που εωαρμόςτθκε ιταν θ αποωυγι τθσ προςκικθσ τθσ τριαικυλαμίνθσ ςτο ςτάδιο τθσ ςιλλυλίωςθσ του ωαινολικοφ υδροξυλίου. Δεν παρουςιάςτθκε κάποια ζνδειξθ αςτάκειασ ςε αυτό το ςτάδιο αλλά ςτθ ςυνζχεια, μετά τθν προςκικθ τθσ διπλάςιασ μοριακισ ποςότθτασ τριαικυλαμίνθσ (ωσ προσ τθν αρχικι αμίνθ) ςτο επόμενο ςτάδιο το τελικό αποτζλεςμα ιταν το ίδιο, δθλαδι παρουςία πολλϊν κθλίδων ςε χρωματογραωία TLC και παραπλιςια απόδοςθ. Μείωςθ τθσ ποςότθτασ τθσ τριαικυλαμίνθσ του δεφτερου ςταδίου ςτο μιςό (δθλαδι ιςομοριακι ποςότθτα ωσ προσ το αρχικό άλασ) είχε ωσ αποτζλεςμα να μθ ςχθματίηεται το παραπροϊόν, οφτε να υπάρχουν οι διάωορεσ άλλεσ κθλίδεσ ςτθ χρωματογραωία TLC και θ απόδοςθ να αυξθκεί ςθμαντικά (47%). Αλλαγζσ ςτο χρόνο και το ρυκμό προςκικθσ τθσ τριαικυλαμίνθσ αφξθςαν ακόμθ περιςςότερο τθν απόδοςθ (52%) και θ τελικι ςυνκετικι πορεία που υιοκετικθκε είναι αυτι που περιγράωεται ςτο πειραματικό μζροσ (ςελ.76-77). Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτεί πωσ επειδι θ ποςότθτα τθσ τριαικυλαμίνθσ που προςτίκεται είναι μικρότερθ από αυτι των περιπτϊςεων όπου ιταν εμωανισ θ παρουςία του αμινοςουλωονυλοεςτζρα (κφριου παραπροϊόντοσ) το ph του μίγματοσ τθσ αντίδραςθσ κατά τθν επεξεργαςία για τθν παραλαβι του προϊόντοσ δεν είναι αλκαλικό αλλά ελαωρά όξινο (ph=5-6). Άρα, κρίκθκε απαραίτθτο να εξεταςτεί το ενδεχόμενο παρουςίασ του αμινο-ςουλωονυλοεςτζρα ωσ άλατοσ, το οποίο ωσ υδατοδιαλυτό δεν κα γινόταν αντιλθπτό κατά τθν παραλαβι του προϊόντοσ με οργανικό διαλφτθ. Για το λόγο αυτό πραγματοποιικθκε ζλεγχοσ για τυχόν παρουςία αυτοφ μετά από αλκαλοποίθςθ τθσ υδατικισ ςτοιβάδασ με αραιό υδατικό διάλυμα όξινου ανκρακικοφ νατρίου και εκχφλιςθ με διχλωρομεκάνιο. Ο ζλεγχοσ αυτόσ ιταν αρνθτικόσ. Τζλοσ, κα πρζπει να αναωερκεί πωσ θ αντίδραςθ δοκιμάςτθκε και με πλιρθ ζλλειψθ τριαικυλαμίνθσ. Θ απόδοςθ για το κφριο προϊόν ΑΧ-1 ιταν ιδιαίτερα χαμθλι (~27%), γεγονόσ που υποδθλϊνει πωσ ο ρόλοσ αυτισ είναι περιςςότερο βοθκθτικόσ και καταλυτικόσ, αωοφ θ αντίδραςθ λαμβάνει χϊρα κανονικά απουςία τριαικυλαμίνθσ αλλά παρουςία τθσ τελευταίασ ςε ςυγκεκριμζνθ αναλογία και ςε ςυγκεκριμζνο ςτάδιο αυξάνει ςθμαντικά τθν απόδοςθ. Με βάςθ το ςφνολο των παραπάνω παρατθριςεων ο προτεινόμενοσ μθχανιςμόσ για τθν εκλεκτικι, πολλαπλι αντίδραςθ ενόσ ςταδίου (one-pot) ςχθματιςμοφ των βενηολοςουλωοναμιδίων ΑΧ-1, ΑΧ-2 ΑΧ-3 και ΑΧ-7 είναι ο ακόλουκοσ (ςχιμα 31). Σφμωωνα με τον προτεινόμενο μθχανιςμό θ αρχικι ζνωςθ, το άλασ τθσ 4-αμινο-2,6-διωκοροωαινόλθσ (α) βρίςκεται ςε ιςορροπία με τθν ελεφκερθ αμίνθ (υπερτερεί το άλασ). Κα πρζπει να τονιςτεί πωσ δεν είναι ξεκάκαρο αν θ αρχικι ουςία αντιδρά με τθ μορωι του άλατοσ ι όχι. Με τθν προςκικθ του τριμεκυλοςιλλυλοχλωριδίου ςχθματίηεται ο ςιλλυλοαικζρασ, που βρίςκεται ςε ιςορροπία με το αντίςτοιχο άλασ (β). Και ςε αυτι τθν περίπτωςθ υπερτερεί το άλασ, αλλά αυτό που αντιδρά ςτθ ςυνζχεια με το ιςχυρό θλεκτρονιόωιλο (γ), που ςχθματίηεται από το βενηοχλοςουλωονυλοχλωρίδιο και τθν N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθ, για το ςχθματιςμό του ςουλωοναμιδίου (δ) είναι θ ελεφκερθ αμίνθ. Κατά το ςχθματιςμό του ςουλωοναμιδίου (δ) 115

116 ελευκερϊνεται θ N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθ (καταλφτθσ) ωσ άλασ και επιτυγχάνεται ακόμθ μια ιςορροπία μεταξφ αυτοφ και τθσ μθ πρωτονιωμζνθσ μορωισ. Δθλαδι, επιτυγχάνεται μια μορωι κφκλου που οδθγεί ςτθν ανακφκλθςθ του καταλφτθ και θ αντίδραςθ λαμβάνει χϊρα. Μετά από αυτό το ςτάδιο, ο ςχθματιηόμενοσ ςιλλυλοαικζρασ του επικυμθτοφ προϊόντοσ (δ) με υδρόλυςθ δίνει το τελικό προϊόν (ε). ΧΘΜΑ 31 Πλα τα ςτάδια τθσ παραπάνω αντίδραςθσ αποτελοφν μια αλλθλουχία ιςορροπιϊν και κακϊσ διεξάγεται θ αντίδραςθ παρατθρείται ςυςςϊρευςθ υδροχλωρικοφ οξζοσ. Κα πρζπει να τονιςτεί πωσ ο διαλφτθσ που χρθςιμοποιείται είναι το τετραχδροωουράνιο, που είναι απρωτικόσ διαλφτθσ αλλά μπορεί να κεωρθκεί πωσ δεςμεφει ςε μικρό βακμό το υδροχλωρικό οξφ (Knochel, 1999; Ripin and Vetelino, 2003). Κάποια ςτιγμι ο κφκλοσ τθσ αντίδραςθσ επιβραδφνεται και με τθν προςκικθ τθσ τριαικυλαμίνθσ δεςμεφεται ποςότθτα υδροχλωρικοφ οξζοσ, αποκακίςτανται εκ νζου οι ιςορροπίεσ και ο κφκλοσ επαναλαμβάνεται, αυξάνοντασ τθ ςυνολικι απόδοςθ. Κατά τθν ςφνκεςθ των ενϊςεων ΑΧ-1, ΑΧ-2, ΑΧ-3 και ΑΧ-7 οι αποδόςεισ ιταν αντίςτοιχα 51%, 57%, 58% και 59%, δθλαδι παρατθρείται αφξθςθ τθσ απόδοςθσ ςε ςχζςθ με αυτι που αωορά το μθ υποκατεςτθμζνο ςουλωοναμίδιο ΑΧ-1. Στθν περίπτωςθ παρουςίασ υποκαταςτατϊν 116

117 που είναι δότεσ θλεκτρονίων (ΑΧ-2), το αντίςτοιχο βενηοχλοςουλωονυλοχλωρίδιο αντιδρά αργά με τθν N,N-διμεκυλοπυριδιν-4-αμίνθ εξαιτίασ του εξαςκενθμζνου θλεκτρονιόωιλου χαρακτιρα και το ςχθματιηόμενο άλασ δεν είναι ςτακερό και αντιδρά ταχφτατα με τθν αμινομάδα για το ςχθματιςμό του ςουλωοναμιδικοφ δεςμοφ. Αντίκετα ςτισ περιπτϊςεισ υποκαταςτατϊν που είναι δζκτεσ θλεκτρονίων (ΑΧ-3 και ΑΧ-7), θ αντίδραςθ του αντίςτοιχου βενηολοςουλωονυλοχλωριδίου με τον καταλφτθ γίνεται γριγορα, ενϊ το ςχθματιηόμενο άλασ ςτακεροποιείται και ζτςι ευνοείται θ αντίδραςθ ςύνθεςη του Ν-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4-αμινοβενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-4) Θ μετατροπι του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-νιτροβενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ- 3) ςτο αντίςτοιχο αμινο-παράγωγο (ΑΧ-4) περιλαμβάνει αναγωγι τθσ νιτρομάδασ ςε ςυνκικεσ καταλυτικισ υδρογόνωςθσ μεταωοράσ ωάςθσ υδρογόνου(ςχιμα 32): ΧΘΜΑ 32 Κατά τθν αντίδραςθ αυτι δθμιουργείται υδρογόνο «εν τω γεννάςκαι» από τθν ετερογενι υδρογόνωςθ του κυκλοεξενίου, ενϊ το ςχθματιηόμενο κυκλοεξαδιζνιο που μετατρζπεται περαιτζρω ςε βενηόλιο απομακρφνεται εφκολα ςτο τζλοσ τθσ αντίδραςθσ (Johnstone and Wilby, 1985). Αρχικά θ αντίδραςθ πραγματοποιικθκε ςε ςυνκικεσ ανάλογεσ με αυτζσ τθσ αντίδραςθσ για τθν αναγωγι τθσ 4-νιτρο-2,6-διωκοροωαινόλθσ (Qiu et al., 1999). Δθλαδι ωσ διαλφτθσ χρθςιμοποιικθκε θ απόλυτθ αικανόλθ, θ διάρκεια τθσ αντίδραςθσ ιταν μικρότερθ κατά 1 ϊρα και ζγινε προςπάκεια παραλαβισ του υδροχλωρικοφ άλατοσ του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)- 4-αμινοβενηοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-4). Οι αποδόςεισ δεν ιταν ικανοποιθτικζσ ενϊ θ ανακρυςτάλλωςθ του άλατοσ ιταν προβλθματικι ςτισ περιπτϊςεισ που χρθςιμοποιικθκε αικανόλθ ι ιςοπροπυλικι αλκοόλθ/αικζρασ και επιτεφχκθκε μόνο από διχλωρομεκάνιο/ πετρελαϊκό αικζρα. Αντικατάςταςθ του διαλφτθ από ζνα λιγότερο πολικό όπωσ θ ιςοπροπυλικι αλκοόλθ είχε τα ίδια αποτελζςματα. Ενδεχομζνωσ, εξαιτίασ του γεγονότοσ πωσ θ αμινομάδα ςε αυτι τθν περίπτωςθ είναι ελάχιςτα βαςικι (υπολογιςμζνο pka= 2,34) ο ςχθματιςμόσ του άλατοσ είναι ιδιαίτερα προβλθματικόσ. Τελικά θ πορεία που ακολουκικθκε περιλάμβανε τθ χριςθ τθσ 117

118 ιςοπροπυλικισ αλκοόλθσ αντί για αικυλικι αλκοόλθ και παραλαβι του Ν-(3,5-διωκορο-4- υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-4) ωσ ελεφκερθ αμίνθ και όχι ωσ άλασ με πολφ καλζσ αποδόςεισ (70%) ςύνθεςη του Ν-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4-(1Η-πυρρολο-1-υλο) βενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-5) Θ αντίδραςθ ςχθματιςμοφ του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-(1Θ-πυρρολ-1-υλο)- βενηοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-5) δίνεται ςτο επόμενο ςχιμα (ςχιμα 33) και περιλαμβάνει το ςχθματιςμό του πυρρολικοφ δακτυλίου ςε ςυνκικεσ αντίδραςθσ τφπου Clauson-Kaas, κατά τισ οποίεσ πραγματοποιείται ςυμπφκνωςθ αμινϊν με το 2,5-διμεκοξυ-τετραχδροωουράνιο, και με καταλφτθ το υδροχλωρικό άλασ τθσ 4-χλωροπυριδίνθσ ςε διοξάνιο ωσ διαλφτθ (Cardinaud et al., 1993; Nicolaou et al., 2004). ΧΘΜΑ 33 Ρρόκειται για μια τροποποιθμζνθ αντίδραςθ τφπου Clauson-Kaas, αωοφ θ τυπικι μζκοδοσ περιλαμβάνει χριςθ οξικοφ οξζοσ ωσ διαλφτθ ςε κερμοκραςία βραςμοφ (ιδιαίτερα υψθλι κερμοκραςία που ενδεχομζνωσ προκαλεί κερμικι διάςπαςθ του πυρρολικοφ δακτυλίου και κατά ςυνζπεια μειωμζνεσ αποδόςεισ ςτο επικυμθτό προϊόν) (Gourlay et al., 2006). Θ χριςθ του οξικοφ οξζοσ και θ κζρμανςθ ωσ ςκοπό είχε τθν υδρόλυςθ του 2,5-διμεκοξυ-τετραχδροωουρανίου προσ τθ δραςτικότερθ δι-αλδεχδικι του μορωι, ςυνκικεσ που βρζκθκε πωσ δεν είναι απαραίτθτεσ αλλά αρκεί ζνα περιβάλλον με ph<7 για τθν προαναωερόμενθ ενεργοποίθςθ (Gourlay et al., 2006). O γενικόσ μθχανιςμόσ που προτείνεται για το ςχθματιςμό του πυρρολικοφ δακτυλίου από τθ ςυμπφκνωςθ αμίνθσ με το 2,5-διμεκοξυ-τετραχδροωουράνιο ωαίνεται ςτο ακόλουκο ςχιμα (ςχιμα 34) και πραγματοποιείται με τθν διάνοιξθ του 2,5-διμεκοξυ-τετραχδροωουρανίου προσ τθν δραςτικότερθ αλδεχδικι του μορωι, οπότε και πραγματοποιείται πυρθνόωιλθ προςβολι από τθν αμίνθ ςτο καρβονφλιο και ςχθματιςμόσ του ετεροκυκλικοφ δακτυλίου. 118

119 ΧΘΜΑ γενική μέθοδοσ ςύνθεςησ των διφθορο-υδροξυφαινυλο-βενζαμιδίων (AX-6 και AX-9) Για τθν ςφνκεςθ των διωκορο-υδροξυωαινυλοβενηαμιδίων (ΑΧ-6 και ΑΧ-9) ακολουκικθκε ςυνκετικι πορεία που περιλαμβάνει μθ εκλεκτικι προςβολι του βενηοχλοχλωριδίου τόςο από το ωαινολικό ΟΘ όςο και από το ανιλινικό ΝΘ του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4- αμινοβενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-4), ενϊ ςτθ ςυνζχεια πραγματοποιείται εκλεκτικι υδρόλυςθ του εςτερικοφ δεςμοφ και απομόνωςθ του επικυμθτοφ καρβαμιδικοφ προϊόντοσ (ςχιμα 35): ΧΘΜΑ 35 Κατά τθν αρχικι προςπάκεια ςφνκεςθσ τθσ ζνωςθσ ΑΧ-6 ζγινε προςπάκεια προςταςίασ του ωαινολικοφ υδροξυλίου με ςιλλυλοχλωρίδιο, ςχθματιςμό του αμιδικοφ δεςμοφ με 119

120 βενηοχλοχλωρίδιο και υδρόλυςθ του ςιλλυλοαικζρα για τθν παραλαβι του τελικοφ προϊόντοσ. Τα προϊόντα που προζκυψαν όμωσ ιταν πολλαπλά και θ ταυτοποίθςθ τουσ αδφνατθ. Οι παραπάνω παρατθριςεισ οδιγθςαν ςτθν επιλογι μιασ ςυνκετικισ πορείασ όπου με χριςθ του βενηοχλοχλωριδίου ςε διπλάςια μοριακι ποςότθτα ςχθματίηεται μθ εκλεκτικά τόςο ο επικυμθτόσ καρβαμιδικόσ δεςμόσ αλλά και ο εςτερικόσ, οπότε το πρόβλθμα πλζον αποτελοφςε θ πραγματοποίθςθ εκλεκτικισ υδρόλυςθσ μόνο του εςτζρα. Ο μθχανιςμόσ των αντιδράςεων του βενηοχλοχλωριδίου με τθν ομάδα τθσ ωαινόλθσ και τθσ ανιλίνθσ αντίςτοιχα αωορά τυπικι πυρθνόωιλθ ακυλο-υποκατάςταςθ ςτο καρβονφλιο του βενηοχλοχλωριδίου που αποτελεί το θλεκτρονιόωιλο, από τα πυρθνόωιλα ωαινόλθ και ανιλίνθ (Belousova et al., 2000). Λόγω του αςκενοφσ πυρθνόωιλου χαρακτιρα των προαναωερόμενων ομάδων χρθςιμοποιείται μια ιςχυρι βάςθ, θ τριαικυλαμίνθ, θ οποία δεςμεφει το ςχθματιηόμενο HCl αποτρζποντασ ζτςι πικανζσ παράπλευρεσ αντιδράςεισ. Πςο αωορά τθν αλκαλικι υδρόλυςθ αυτϊν των δεςμϊν, που πραγματοποιοφνται επίςθσ μζςω τυπικισ διαδικαςίασ πυρθνόωιλθσ ακυλο-υποκατάςταςθσ όπου το ιόν του υδροξειδίου αποτελεί πλζον το πυρθνόωιλο που προςτίκεται ςτο καρβονφλιο, είναι κοινά αποδεκτό πωσ ο εςτερικόσ δεςμόσ υδρολφεται πολφ εφκολα ςε ςχζςθ με τον αμιδικό που απαιτεί ιςχυρότερεσ ςυνκικεσ (κζρμανςθ) αωοφ το ιςχυρό +R ωαινόμενο του αηϊτου μειϊνει τθ δραςτικότθτα των αμιδίων ςε αντιδράςεισ με πυρθνόωιλα αντιδραςτιρια. Για το λόγο αυτό πραγματοποιικθκε αλκαλικι υδρόλυςθ υπό ψφξθ και παραλιωκθκε το τελικό προϊόν ςε ικανοποιθτικι απόδοςθ. Θ ίδια μζκοδοσ εωαρμόςτθκε και για τθ ςφνκεςθ του μεκοξυδιωκοροχδροξυωαινυλοβενηαμιδίου (ΑΧ-9) αλλά με μικρότερθ απόδοςθ, γεγονόσ που αιτιολογείται από τθν μείωςθ του θλεκτρονιόωιλου χαρακτιρα του π-μεκοξυ-υποκατεςτθμζνου βενηοχλοχλωριδίου ςύνθεςη του N-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4-(3-αιθυλουρεΰδο)βενζολο ςουλφοναμιδίου (ΑΧ- 8) Για τθν ςφνκεςθ του παραγϊγου τθσ ουρίασ N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-(3- αικυλουρεϊδο)βενηολοςουλωοναμίδιο (ΑΧ-8) ακολουκικθκε ςυνκετικι πορεία που περιλαμβάνει τθν αντίδραςθ ιςοκυανικοφ αικυλεςτζρα ςε μεγάλθ περίςςεια με το Ν-(3,5-διωκορο-4- υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολοςουλωοναμίδιο (ΑΧ-4) ςε διοξάνιο, με ςυνδυαςμό επίδραςθσ ακτινοβολίασ υπεριχων και κζρμανςθσ ςτουσ 80 C και ςτθ ςυνζχεια το ακατζργαςτο ενδιάμεςο υπζςτθ εκλεκτικι αλκαλικι υδρόλυςθ για να δϊςει το επικυμθτό προϊόν (ςχιμα 36). 120

121 ΧΘΜΑ 36 Θ παραπάνω μζκοδοσ αποτελεί παραλλαγι γνωςτισ μεκόδου (Buckman et al., 1998), ςφμωωνα με τθν οποία γίνεται προςβολι του καρβονυλίου του ιςοκυανικοφ εςτζρα από ζνα πυρθνόωιλο (ςτθ ςυγκεκριμζνθ περίπτωςθ ανιλίνθ και ωαινόλθ) με ςχθματιςμό ουρίασ αλλά και του εςτζρα αντίςτοιχα. Και ςτισ δυο περιπτϊςεισ πρόκειται για αντίδραςθ πυρθνόωιλθσ προςκικθσ ςτο καρβονφλιο (ςχιμα 37). ΧΘΜΑ 37 Σχετικά με τισ ςυνκικεσ τθσ αντίδραςθσ κα πρζπει να ςθμειωκεί πωσ ο ιςοκυανικόσ αικυλεςτζρασ είναι ιδιαίτερα αςτακισ. Γι αυτό προςτίκεται ςε περίςςεια και θ αντίδραςθ 121

122 πραγματοποιείται ςτουσ 80 C και όχι ςε κερμοκραςία βραςμοφ ενϊ θ ακτινοβολία υπεριχων ωσ ςκοπό ζχει να μειϊςει ςθμαντικά το χρόνο τθσ αντίδραςθσ (χωρίσ ακτινοβόλθςθ ακόμα και μετά από 60h υπό τισ προαναωερόμενεσ ςυνκικεσ θ απόδοςθ ιταν πάρα πολφ μικρι). Τζλοσ πραγματοποιείται εκλεκτικι αλκαλικι υδρόλυςθ του εςτζρα γενική μέθοδοσ ςύνθεςησ των διφθορο-αροώλοςουλφαμιδο-φαινολικών εςτέρων του βενζοΰκού οξέοσ (AX-18a και AX-19a) Θ ςφνκεςθ των απομονωμζνων ενδιάμεςων διωκορο-αρυλοςουλωαμιδοωαινολικϊν εςτζρων του βενηοϊκοφ οξζοσ (AX-18α και AX-19α) πραγματοποιικθκε με ςκοπό τθν προςταςία τθσ ωαινολικισ ομάδασ ςτα αρχικά Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυ-ωαινυλο)βενηολοςουλωοναμίδια (ΑΧ-1 και ΑΧ-3), ϊςτε ςτθ ςυνζχεια να ακολουκιςει Ν-αλκυλίωςθ του ςουλωοναμιδικοφ αηϊτου. Θ προςταςία πραγματοποιικθκε με βενηοχλοχλωρίδιο ςε διοξάνιο, με ιςομοριακι ποςότθτα τριαικυλαμίνθσ για το ςχθματιςμό του ανιόντοσ του ωαινοξειδίου και κζρμανςθ ςε κερμοκραςία βραςμοφ (1 ο ςτάδιο αντίδραςθσ, ςχιμα 38) (Belousova et al., 2000). Ρρόκειται για τυπικι πυρθνόωιλθ ακυλο-υποκατάςταςθ ςτο καρβονφλιο του βενηοχλοχλωριδίου που αποτελεί το θλεκτρονιόωιλο, από τθν πυρθνόωιλθ ομάδα του ωαινοξειδίου. Οι αποδόςεισ των αντιδράςεων ιταν ικανοποιθτικζσ (73% και 66% αντίςτοιχα). Κα πρζπει να τονιςτεί πωσ ςτθν περίπτωςθ του Ν- (3,5-διωκορο-4-υδροξυ-ωαινυλο)-4-νιτροβενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-3) πραγματοποιικθκε ςε πολφ μικρό βακμό και ακυλο-υποκατάςταςθ ςτο ςουλωοναμιδικό άηωτο εξαιτίασ τθσ ςχετικά πιο ευνοϊκισ απομάκρυνςθσ του ατόμου του υδρογόνου από αυτό (υπολογιςμζνεσ τιμζσ pka 8.54 και 6.88 αντίςτοιχα για ΑΧ-1 και ΑΧ-3) γενική μέθοδοσ ςύνθεςησ των βρωμο-φθορο-βενζυλοδιφθορο-υδροξυφαινυλοαροώλοςουλφοναμιδίων (AX-18, AX-19) Θ ςυνκετικι πορεία που ακολουκικθκε για τθ ςφνκεςθ των βρωμο-ωκοροβενηυλοδιωκορο-υδροξυωαινυλο-αρυλοςουλωοναμιδίων (AX-18, AX-19) (ςχιμα 38) (DeRuiter et al., 1989a) αρχικά περιλαμβάνει επίδραςθ μικρισ περίςςειασ υδριδίου του νατρίου ςτον ενδιάμεςο απομονωμζνο εςτζρα (ΑΧ-18α, ΑΧ-19α) ςε διαλφτθ διμεκυλοωορμαμίδιο και ςτθ ςυνζχεια προςκικθ του 4-βρωμο-1-(βρωμομεκυλο)-2-ωκοροβενηολίου για τθν πραγματοποίθςθ τθσ Ν-αλκυλίωςθσ. Χωρίσ καμία κατεργαςία εξαιτίασ τθσ δυςκολίασ απομάκρυνςθσ του διαλφτθ, πραγματοποιείται ςτο τζλοσ εκλεκτικι υδρόλυςθ για τθν παραλαβι του επικυμθτοφ ςουλωοναμιδίου, παραγϊγου τθσ διωκοροωαινόλθσ ςε πολφ καλζσ αποδόςεισ. Μθχανιςτικά θ παραπάνω αντίδραςθ αποτελεί μια αντίδραςθ υποκατάςταςθσ του βρωμίου από το πυρθνόωιλο ιόν του ςουλωοναμιδικοφ αηϊτου, το οποίο δθμιουργείται με επίδραςθ τθσ ιςχυρισ βάςθσ του υδριδίου του νατρίου. 122

123 ΧΘΜΑ 38 Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να αναωερκεί πωσ ζγινε προςπάκεια ςφνκεςθσ των εν λόγω προϊόντων και με μια διαωορετικι μζκοδο (Nicolaou and Demopoulos, 2003) που περιλαμβάνει κατάλυςθ μεταωοράσ ωάςθσ με επίδραςθ τθσ τρι*2-(2-μεκοξυαικοξυ)αικυλ+αμίνθσ (tris[2-(2- methoxyethoxy)ehyl]amine, TDA-1) (Soula, 1985) με προθγοφμενθ προςταςία του ωαινολικοφ υδροξυλίου με τριμεκυλοςιλλυλοχλωρίδιο ςε διαλφτθ τετραχδροωουράνιο όπωσ ζγινε και ςτθ γενικότερθ μζκοδο που αναπτφχκθκε για τθ ςφνκεςθ των ςουλωοναμιδίων, χωρίσ όμωσ αποτζλεςμα ςύνθεςη του N-(4-βρωμο-2-φθοροβενζυλο)-N-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-4- αμινοβενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-20) Θ μετατροπι του N-(4-βρωμο-2-ωκοροβενηυλο)-N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-νιτρο βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-19) ςτο αντίςτοιχο αμινο-παράγωγο (ΑΧ-20) περιλαμβάνει αναγωγι τθσ νιτρομάδασ ςε ςυνκικεσ καταλυτικισ υδρογόνωςθσ μεταωοράσ ωάςθσ υδρογόνου (ςχιμα 39) ακριβϊσ υπό τισ ίδιεσ ςυνκικεσ που χρθςιμοποιικθκαν για τθ ςφνκεςθ τθσ ζνωςθσ ΑΧ-4. ΧΘΜΑ

124 ςύνθεςη του N-(3,5-διφθορο-4-υδροξυφαινυλο)-Ν-(φαινυλοςουλφονυλο)βενζολο ςουλφοναμιδίου (ΑΧ-21) Θ ςφνκεςθ του N-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-Ν-(ωαινυλοςουλωονυλο)βενηολο ςουλωοναμιδίου (ΑΧ-21) πραγματοποιικθκε ςφμωωνα με δθμοςιευμζνθ μζκοδο (Yasuhara et al., 1999) και περιλαμβάνει επίδραςθ περίςςειασ υβριδίου του νατρίου ςτον διωκοροαροχλοςουλωαμιδο-ωαινολικό εςτζρα του βενηοϊκοφ οξζοσ (ΑΧ-18α) ςε διαλφτθ τετραχδροωουράνιο και ςτθ ςυνζχεια προςκικθ του βενηοχλοςουλωονυλοχλωριδίου για τθν πραγματοποίθςθ τθσ Ν-ςουλωονυλίωςθσ (ςχιμα 40) υπό ψφξθ για να αποωευχκεί κίνδυνοσ διάςπαςθσ του χλωριδίου. Θ παραλαβι του ενδιάμεςου προϊόντοσ γίνεται με τθ τυπικι διαδικαςία χριςθσ διχλωρομεκανίου, πλφςεων με νερό, ξιρανςθσ και ςυμπφκνωςθσ. Χωρίσ περαιτζρω κακαριςμό πραγματοποιείται ςτο τζλοσ αλκαλικι υδρόλυςθ (για τθ διάλυςθ του ενδιάμεςου προϊόντοσ χρθςιμοποιείται διοξάνιο) υπό ςυνεχι ψφξθ και ςε πολφ ιπιεσ ςυνκικεσ (2.5% υδατικό διάλυμα NaOH) για να μθν υδρολυκεί κάποιοσ από τουσ ςουλωοναμιδικοφσ δεςμοφσ, όπωσ ζχει αναωερκεί ςε ιςχυρότερεσ ςυνκικεσ (Yasuhara et al., 1999), και παραλαμβάνεται το τελικό διςουλωοναμίδιο, παράγωγο τθσ διωκοροωαινόλθσ. Μθχανιςτικά θ παραπάνω αντίδραςθ αποτελεί μια αντίδραςθ υποκατάςταςθσ του χλωρίου από το πυρθνόωιλο ιόν του ςουλωοναμιδικοφ αηϊτου, το οποίο δθμιουργείται με επίδραςθ τθσ ιςχυρισ βάςθσ του υδριδίου του νατρίου. ΧΘΜΑ

125 ςύνθεςη του N-((1Η-τετραζολο-5-υλο)μεθυλο)βενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-10) Θ ςφνκεςθ τθσ ζνωςθσ N-((1Η-τετραηολο-5-υλο)μεκυλο)βενηολοςουλωοναμίδιο (ΑΧ-10) πραγματοποιικθκε ςφμωωνα με δθμοςιευμζνθ μζκοδο (Wittenberger and Donner, 1993), τθσ οποίασ ο μθχανιςμόσ αναλφκθκε πλιρωσ ςε προθγοφμενθ ενότθτα (ςελ. 68), με επίδραςθ τριμεκυλοςιλλυλοαηιδίου ςε διάλυμα του N-(κυανομεκυλο)βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-10α) ςε τολουόλιο και καταλυτικισ ποςότθτασ οξειδίου του διβουτυλοκαςςιτζρου, ςε κερμοκραςία βραςμοφ για 47 ϊρεσ (ςχιμα 41). Αξίηει να ςθμειωκεί πωσ πριν από τθν κατεργαςία για τθν απομόνωςθ του επικυμθτοφ προϊόντοσ, το μίγμα τθσ αντίδραςθσ ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ και το υπόλειμμα επαναδιαλφεται ςε μεκανόλθ και ςυμπυκνϊνεται ξανά, με ςκοπό τθν μεκανόλυςθ των οξειδίων του καςςιτζρου και κατά ςυνζπεια τθν εφκολθ απομάκρυνςθ τουσ (υδατοδιαλυτά) αλλά και τθν μεκανόλυςθ του ενδιάμεςου Ν-(τριμεκυλοςιλλυλο)τετραηολίου προσ απελευκζρωςθ του επικυμθτοφ προϊόντοσ. ΧΘΜΑ ςύνθεςη του N-(μεθυλοςουλφονυλο)-2-(βενζολοςουλφοναμιδο)ακεταμιδίου (ΑΧ-13) Για τθ ςφνκεςθ του N-(μεκυλοςουλωονυλο)-2-(βενηολοςουλωοναμιδο)ακεταμιδίου (ΑΧ-13) ακολουκικθκε δθμοςιευμζνθ μζκοδοσ (Yuan and Silverman, 2006) που περιλαμβάνει προςκικθ διαλφματοσ καρβονυλο-δι-ιμιδαηολίου (CDI) ςε διαλφτθ τετραχδροωουράνιο ςε διάλυμα τετραχδροωουρανίου του 2-(ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικοφ οξζοσ (Α) και ςτθ ςυνζχεια προςκικθ του μεκυλοςουλωοναμιδίου και του 1,8-διαηοδικυκλο[5.4.0]ενδεκα-7-ενίου (DBU) (ςχιμα 42). ΧΘΜΑ 42 Θ αντίδραςθ μεταξφ του καρβοξυλικοφ οξζοσ και τθσ βάςθσ CDI αποςκοπεί ςτθν ενεργοποίθςθ του οξζοσ με μια αντίδραςθ πυρθνόωιλθσ υποκατάςταςθσ ςτο καρβονφλιο, ϊςτε να 125

126 αποτελζςει το ακυλιωτικό μζςο για το ςχθματιςμό του επικυμθτοφ ςουλωοναμιδίου. Ο προτεινόμενοσ μθχανιςμόσ παρουςιάηεται ςτο ςχιμα που ακολουκεί (ςχιμα 43). ΧΘΜΑ 43 Στθ ςυνζχεια το ενεργοποιθμζνο πλζον οξφ (ιμιδαηολίδιο, imidazolide) αντιδρά με το μεκυλοςουλωοναμίδιο παρουςία τθσ ιςχυρισ τεταρτοταγοφσ βάςθσ 1,8- διαηοδικυκλο[5.4.0]ενδεκα-7-ζνιο (DBU), που βοθκά ςτθν αποπρωτονίωςθ του μεκυλο ςουλωοναμιδίου (Drummond and Johnson, 1988) ςύνθεςη του (R)-N-(3-οξοΰςοξαζολιδιν-4-υλο)βενζολοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-15) και του (S)-N-(3-οξοΰςοξαζολιδιν-4-υλ)βενζοςουλφοναμιδίου (ΑΧ-17) Για τθ ςφνκεςθ των (R)-N-(3-οξοϊςοξαηολιδιν-4-υλο)βενηολοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-15) και (S)-N-(3-οξοϊςοξαηολιδιν-4-υλ)βενηοςουλωοναμιδίου (ΑΧ-17) αναπτφχκθκε ςυνκετικι πορεία που ςτθρίηεται ςτθ χριςθ ρυκμιςτικοφ διαλφματοσ NaHCO 3 /Na 2 CO 3 με ph=10 (ςχιμα 44), ενϊ όλθ θ αντίδραςθ πραγματοποιείται ςε χαμθλζσ κερμοκραςίεσ. 126

127 ΧΘΜΑ 44 Αρχικζσ προςπάκειεσ ςφνκεςθσ των ςυγκεκριμζνων ςουλωοναμιδίων, παραγϊγων τθσ κυκλοςερίνθσ αωοροφςαν ςτον κλαςςικό τρόπο με επίδραςθ του βενηοχλοχλωριδίου παρουςία ιςομοριακισ ποςότθτασ τριαικυλαμίνθσ και καταλυτικισ ποςότθτασ 10% DMAP ςε διαλφτθ τετραχδροωουράνιο. Θ αντίδραςθ όμωσ οδιγθςε ςτο ςχθματιςμό πλικουσ προϊόντων, από τα οποία κανζνα δεν ιταν το επικυμθτό. Θ κυκλοςερίνθ παρουςιάηει αςτάκεια ςε όξινα ι ουδζτερα υδατικά διαλφματα ενϊ είναι ςχετικά ςτακερι ςε αλκαλικά (Malspeis and Gold, 1964) και ίςωσ αυτι θ αςτάκεια να εμωανίηεται και ςε διαλφματα πολικϊν οργανικϊν διαλυτϊν, γεγονόσ που οδιγθςε ςτθν αποτυχία τθσ μεκόδου. Επίςθσ, ςε υδατικά διαλφματα με τθ πάροδο του χρόνου είναι δυνατόν να διμεριςτεί προσ 2,5-δις(αμινοξυμεκυλο)-3,6-δικετοπιπεραηίνθ. Τα τελικά προϊόντα τθσ όξινθσ υδρόλυςθσ τθσ κυκλοςερίνθσ ζχει βρεκεί πωσ είναι το 2-αμινο-3- (αμινοξυ)προπανοϊκό οξφ (i) και το 2-άμινο-Ν,3-διυδροξυπροπαναμίδιο (ii) (ςχιμα 45). ΧΘΜΑ 45 Ζνασ πικανόσ μθχανιςμόσ για τθν όξινθ υδρόλυςθ τθσ κυκλοςερίνθσ, ςτθν περίπτωςθ που το τελικό προϊόν τθσ υδρόλυςθσ είναι το 2-αμινο-3-(αμινοξυ)προπανοϊκό οξφ, περιλαμβάνει προςβολι ενόσ μορίου νεροφ ςτο ςυηυγζσ οξφ τθσ κυκλοςερίνθσ (ςχιμα 46). Στθν περίπτωςθ που το τελικό προϊόν είναι το 2-άμινο-Ν,3-διυδροξυπροπαναμίδιο, τότε θ αντίδραςθ περιλαμβάνει προςβολι του νεροφ ςτο άτομο αηϊτου του ετεροκυκλικοφ δακτυλίου (ςχιμα 47). 127

128 ΧΘΜΑ 46 ΧΘΜΑ 47 Για τουσ παραπάνω λόγουσ θ αντίδραςθ πραγματοποιικθκε παρουςία ρυκμιςτικοφ διαλφματοσ με ph=10, όπου θ κυκλοςερίνθ εμωανίηεται ςχετικά ςτακερι αωοφ βρίςκεται με τθ μορωι του αντίςτοιχου ανιόντοσ (Malspeis and Gold, 1964). 128

129 5.2. ΕΚΣΙΜΗΗ ΥΑΡΜΑΚΟΦΗΜΙΚΨΝ ΔΟΚΙΜΑΙΨΝ IN VITRO Θ μελζτθ των ενϊςεων για τθ δράςθ τουσ ωσ ARIs, θ διερεφνθςθ τθσ εκλεκτικότθτασ τουσ ωσ προσ το ζνηυμο ALR2 ςε ςφγκριςθ με το ζνηυμο ALR1 και το αντιοξειδωτικό τουσ δυναμικό πραγματοποιικθκε ςε in vitro πειραματικά ςυςτιματα. Θ αξιολόγθςθ των ενϊςεων (ςυνοπτικι παρουςίαςθ των δομϊν τουσ ςτο παράρτθμα Α, ςελ. 165) ζγινε με τθ βοικεια γνωςτϊν ι τροποποιθμζνων τεχνικϊν από τθ βιβλιογραωία και τα αποτελζςματα τουσ ςυγκρίκθκαν ωσ προσ αυτά που παρουςίαςαν ςτισ ίδιεσ πειραματικζσ ςυνκικεσ πρότυπεσ ουςίεσ αναωοράσ ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣOY ENZYMOY ΑΝΑΓΨΓΑΗ ΣΗ ΑΛΔΟΖΗ (ALR2) Ζχει βρεκεί ότι υπάρχει ςθμαντικι ομοιότθτα (85%) ςτθν αλλθλουχία των αμινοξζων του ενηφμου από επίμυεσ με αυτό του ανκρϊπου, ενϊ υπάρχει απόλυτθ ταφτιςθ αμινοξζων ςτο ενεργό τουσ κζντρο (Gui et al., 1995). Θ ικανότθτα λοιπόν των τελικϊν ενϊςεων κακϊσ και τθσ ςορβινίλθσ (ζνωςθ αναωοράσ) να αναςτζλλουν το ζνηυμο ALR2 μελετικθκε ςε ςυγκεντρϊςεισ από 5x10-4 M ωσ 10-9 Μ (ανάλογα με τθν δραςτικότθτα τθσ υπό μελζτθσ ζνωςθσ), ςε ενηυμικό παραςκεφαςμα από ωακοφσ επιμφων (Alexiou et al., 2008; Nicolaou and Demopoulos, 2003; Nicolaou et al., 2004). Ωσ ζνωςθ αναωοράσ χρθςιμοποιείται θ ςορβινίλθ που υπό τισ ςυγκεκριμζνεσ πειραματικζσ ςυνκικεσ προκαλεί αναςτολι 44.67(±4.37)% ςε ςυγκζντρωςθ 0.25μΜ (δθμοςιευμζνεσ τιμζσ IC 50 : 0.25μΜ (Demopoulos and Rekka, 1995)). Ππωσ ζχει αναπτυχκεί και αιτιολογθκεί ςε προθγοφμενθ ενότθτα, επιλζχκθκε ωσ ζνωςθ οδθγόσ το 2-(ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικό οξφ και κάποιεσ μθ κλαςςικζσ ιςοςτερείσ ομάδεσ του οξικοφ οξζοσ και πραγματοποιικθκε θ ςφνκεςθ ςειράσ πικανϊν ARIs, ποικίλθσ χθμικισ δομισ και με κοινό χαρακτθριςτικό γνϊριςμα τθν παρουςία μιασ ωαινυλοςουλωοναμιδο-ομάδασ. Τα αποτελζςματα για τισ αντιπροςωπευτικζσ ενϊςεισ των διαωόρων κατθγοριϊν που αναπτφχκθκαν παρουςιάηονται ςτο διάγραμμα που ακολουκεί (διάγραμμα 1) ωσ ποςοςτά αναςτολισ τθσ ALR2 ςε διάωορεσ ςυγκεντρϊςεισ, ενϊ για τθ ςειρά των δραςτικϊν διωκοροωαινολικϊν παραγϊγων δίνονται παρακάτω οι τιμζσ IC 50 κακϊσ και το ποςοςτό αναςτολισ ςε ςυγκζντρωςθ 10-4 Μ (πίνακασ 6). Πλα τα αποτελζςματα που παρουςιάηονται αποτελοφν το μζςο όρο τριϊν μετριςεων ενϊ οι τυπικζσ αποκλίςεισ (±SD) όλων είναι <10%. Αναωζρεται για τον γνωςτό αναςτολζα 2- (ωαινυλοςουλωοναμιδο)οξικό οξφ (Α) θ υπολογιςμζνθ τιμι IC 50 = 86.7(±4.12)μΜ (δθμοςιευμζνθ τιμι IC 50 : 134μΜ (DeRuiter et al., 1987)). 129

130 ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 1 Ππωσ ωαίνεται ςτο διάγραμμα με εξαίρεςθ τθν ζνωςθ ΑΧ-1, που αποτελεί παράγωγο τθσ διωκοροωαινόλθσ, όλεσ οι υπόλοιπεσ ενϊςεισ δεν είναι ιδιαίτερα δραςτικζσ. Συγκεκριμζνα το τετραηόλιο ΑΧ-10 παρουςιάηει ςτακερι αναςτολι του ενηφμου τθσ τάξθσ του 25% για ςυγκεντρϊςεισ από 1-100μΜ ενϊ το τετραηόλιο ΑΧ-16 εμωανίηεται δραςτικότερο, με αναςτολι τθσ τάξθσ του 50% ςε ςυγκζντρωςθ 500μΜ. Το μεκυλοςουλωοναμίδιο ΑΧ-13 αναςτζλλει τθν ALR2 ςε ποςοςτό τθσ τάξθσ του 32% ςε ςυγκζντρωςθ 100μΜ ενϊ ςτθ ςυνζχεια παρατθρείται πτϊςθ τθσ αναςτολισ ςτο 10% ςε υποδεκαπλάςια ςυγκζντρωςθ. Λδιαίτερο ενδιαωζρον παρουςιάηουν τα παράγωγα τθσ κυκλοςερίνθσ ΑΧ-15 και ΑΧ-17. Ενϊ το D-ιςομερζσ δεν εμωανίηει αναςταλτικι δράςθ, το L-ιςομερζσ ΑΧ-17 είναι δραςτικότερο και ιταν δυνατόσ ο υπολογιςμόσ τθσ τιμισ IC 50 = 71.2(±1.3)μΜ. Θ αποτελεςματικότερθ λοιπόν βιοϊςοςτερισ αντικατάςταςθ τθσ ομάδασ του οξικοφ οξζοσ διαπιςτϊκθκε πωσ είναι αυτι τθσ διωκοροωαινόλθσ και αναπτφχκθκε ςειρά ςουλωοναμιδίων, παραγϊγων αυτισ τθσ λειτουργικισ ομάδασ (πίνακασ 6). 130

131 ΠΙΝΑΚΑ 6: in vitro ικανότητα αναςτολήσ τησ ALR2 από τα διφθοροφαινολικά παράγωγα AX ζνωςθ R 1 R 2 % αναςτολι ςε C=10-4 M IC 50 (±SD)μΜ AX-1 Θ H 71.3(±1.2) 32.9(±0.04) AX-2 OCH 3 H 79.5(±2.1) 15.5 (±0.12) AX-3 NO 2 H 63.9(±0.8) 44.4(±1.91) AX-4 NH 2 H 84.1(±1.6) 14.1(±0.46) AX-5 πυρρόλιο H 61.1(±3.1) 57.1(±2.90) AX-6 NHCOPh H 87.7(±1.3) 7.9(±0.72) AX-7 CF 3 H 55.8(±1.3) 91.5 (±3.24) AX-8 NHCONHCH 2 CH 3 H 63.6 (±1.8) 37.8 (±1.10) AX-9 NHCO-C 6 H 4 - poch 3 H 77.9 (±0.8) 12.0 (±0.32) AX-18 H 74.6(±3.6) 5.7(±0.05) AX-19 NO (±2.4) 9.0 (±0.07) AX-20 NH (±4.7) 0.397(±0.015) AX-21 H 65.1(±1.1) 28.1(±1.94) Σορβινίλθ: 44.67(±4.374)% αναςτολι ςε C=0.25μΜ ((δθμοςιευμζνεσ τιμζσ IC 50 : 0.25μΜ (Demopoulos and Rekka, 1995) Από τθν μελζτθ των δομϊν χαμθλότερθσ ενζργειασ των ενϊςεων Α, ΑΧ-1, ΑΧ-10, ΑΧ-13, ΑΧ- 15 και ΑΧ-17 (ςχιμα 48) προκφπτει πωσ οι αποςτάςεισ των γεωμετρικϊν κζντρων (centroids) των ωαινυλοςουλωονικϊν δακτυλίων, κακϊσ και οι αποςτάςεισ των κζντρων βάρουσ του ςυνόλου των βαρζων ατόμων, από το ωαινολικό και καρβοξυλικό (όξινο) υδρογόνο αντίςτοιχα των ενϊςεων ΑΧ- 1 και Α είναι πανομοιότυπεσ. Ρροτείνεται λοιπόν πωσ ςτθ βελτιωμζνθ αναςταλτικι δράςθ ςτθν περίπτωςθ του διωκοροωαινολικοφ παραγϊγου ςυμβάλλει θ διατιρθςθ των προαναωερόμενων αποςτάςεων ςε κακοριςμζνα όρια, κάτι που ζρχεται ςε ςυμωωνία με προθγοφμενεσ αναωορζσ (Nicolaou et al., 2004) αλλά και με τον κακοριςμό τθσ ωαρμακοωόρου δομισ από τουσ Kador και ςυνεργάτεσ (Kador and Sharpless, 1983). Επίςθσ, ςθμαντικό ρόλο ςτθν αυξθμζνθ δραςτικότθτα 131

132 διαδραματίηει και θ αφξθςθ τθσ μοριακισ επιωάνειασ (SA) ι θ επιωάνεια θλεκτρονιακισ πυκνότθτασ (EDSA) όπωσ ζχει αναωερκεί και ςε άλλεσ μελζτεσ (Nicolaou and Demopoulos, 2003). ΧΘΜΑ 48 Ρριν ξεκινιςει ο ςχολιαςμόσ των αποτελεςμάτων για τα δραςτικά διωκοροωαινολικά παράγωγα κρίνεται απαραίτθτθ θ ςφγκριςθ αυτϊν με τα αντίςτοιχα in vitro δεδομζνα των γνωςτϊν αναςτολζων, παραγϊγων τθσ γλυκίνθσ (DeRuiter and Mayfield, 1990; DeRuiter et al., 1987; Mayfield and DeRuiter, 1987), όπου ςτθρίχκθκε ο ςχεδιαςμόσ των νζων ενϊςεων. Ππωσ ωαίνεται και ςτο διάγραμμα που ακολουκεί (διάγραμμα 2) ςε όλεσ τισ περιπτϊςεισ παρατθρικθκε βελτίωςθ τθσ δράςθσ, ςχεδόν διπλαςιαςμόσ και κατά περιπτϊςεισ τριπλαςιαςμόσ (περίπτωςθ ζνωςθσ ΑΧ-1), εκτόσ από τθν περίπτωςθ των παραγϊγων ΑΧ-6 και ΑΧ-9, ενϊ ςτθν περίπτωςθ του παραγϊγου ΑΧ-4 θ δράςθ δεν παρουςιάηει διαωορά ςε ςχζςθ με το αντίςτοιχο παράγωγο τθσ γλυκίνθσ. Κα πρζπει να τονιςτεί όμωσ πωσ και ςτισ τρεισ ςυγκεκριμζνεσ περιπτϊςεισ πρόκειται για υπολογιςμζνεσ τιμζσ IC 50 τθσ τάξθσ των 7-14μΜ ενϊ για τα αντίςτοιχα παράγωγα τθσ γλυκίνθσ τθσ τάξθσ των μΜ, διαωορζσ που ςτατιςτικά δεν κεωροφνται ςθμαντικζσ. ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 2 132

133 Ροιοτικι αξιολόγθςθ των προαναωερόμενων in vitro αποτελεςμάτων για τισ ενϊςεισ που δεν ζχουν υποκαταςτάτθ ςτο άηωτο του ςουλωοναμιδίου (R 2 =H) δείχνει πωσ υποκαταςτάτεσ R 1 που διακζτουν μονιρεσ ηεφγοσ θλεκτρονίων (δότεσ θλεκτρονίων, +R ωαινόμενο) ζχουν ωσ αποτζλεςμα να επεκτείνεται το ςυηυγιακό ωαινόμενο του ωαινυλοςουλωονυλο-δακτυλίου ςε αυτοφσ και να προκαλοφν αφξθςθ τθσ δράςθσ (περιπτϊςεισ ΑΧ-2 και ΑΧ-4) όπωσ αναωζρεται και για τα παράγωγα τθσ γλυκίνθσ (DeRuiter et al., 1987). Επιπρόςκετα, ςτθν περίπτωςθ των ςυγκεκριμζνων ενϊςεων είναι πικανό οι υποκαταςτάτεσ OCH 3 και ΝΘ 2 να ςχθματίηουν δεςμοφσ υδρογόνου ςτο ενεργό κζντρο του ενηφμου, αυξάνοντασ περιςςότερο τθν αποτελεςματικότθτα τουσ. Αντίκετα, υποκαταςτάτεσ δζκτεσ θλεκτρονίων (περιπτϊςεισ ΑΧ-3 και ΑΧ-7) δεν προκαλοφν ουςιαςτικι βελτίωςθ τθσ δράςθσ, ενϊ ςθμαντικό ρόλο ωαίνεται να διαδραματίηει και θ λιποωιλικότθτα ςτο προαναωερόμενο αποτζλεςμα. Ζτςι, ενϊ οι υποκαταςτάτεσ ςτισ δυο αυτζσ ενϊςεισ ζχουν παρόμοιο θλεκτραρνθτικό χαρακτιρα (ςτακερά Hammet ς π =0,78 και 0,54 αντίςτοιχα για ΝΟ 2 και CF 3 ), εμωανίηουν ςθμαντικι διαωορά ςτθ λιποωιλικότθτα τουσ (τιμζσ π= - 0,28 και 0,88 αντίςτοιχα) και θ ζνωςθ ΑΧ-7 ωσ περιςςότερο λιπόωιλθ εμωανίηει εξαςκενθμζνθ δράςθ όχι μόνο ςε ςχζςθ με τθν ΑΧ-3 αλλά και με το μθ υποκατεςτθμζνο παράγωγο ΑΧ-1. Τζλοσ θ μεγαλφτερθ δραςτικότθτα τθσ AX-3 ςε ςχζςθ με τθν ΑΧ-7 μπορεί να αποδοκεί και ςτθν ικανότθτα τθσ πρϊτθσ να ςχθματίηει περιςςότερουσ δεςμοφσ υδρογόνου και επομζνωσ να ζχει περιςςότερα πικανά ςθμεία αλλθλεπίδραςθσ με το ενεργό κζντρο του ενηφμου (Costantino et al., 2002), με αρικμό κζςεων ςχθματιςμοφ δεςμϊν υδρογόνου ωσ δζκτεσ (ΘΑ) 7 και 4 αντίςτοιχα. Πςο αωορά τθν ζνωςθ ΑΧ-5, θ παρουςία του «πλοφςιου» ςε π θλεκτρόνια πυρρολικοφ δακτυλίου ςτο μόριο διευρφνει τθν αρωματικι επιωάνεια ταυτόχρονα με τθν ςυνολικι λιποωιλικότθτα αλλά δεν παρατθρείται βελτίωςθ τθσ δράςθσ. Αυτό πικανά να οωείλεται ςτθν φπαρξθ περιοχισ ςτερεοχθμικισ παρεμπόδιςθσ ςτο ενεργό κζντρο του ενηφμου, με αποτζλεςμα να μειϊνεται θ ικανότθτα ςφνδεςθσ τθσ ζνωςθσ με αυτό. Το παράγωγο τθσ ουρίασ (ζνωςθ AX-8) δεν παρουςιάηει βελτίωςθ ςε ςχζςθ με το μθ υποκατεςτθμζνο παράγωγο ενϊ άλλεσ υποκαταςτάςεισ ςτθν ανιλίνθ τθσ ζνωςθσ ΑΧ-4 (ενϊςεισ ΑΧ-6 και ΑΧ-9) προκαλοφν βελτίωςθ τθσ δράςθσ, αν και οι ςυγκεκριμζνεσ διαωορζσ των τιμϊν IC 50 (ΑΧ-4: 14.1, ΑΧ-6: 7.9 και ΑΧ-9: 12.0 μμ) δεν μποροφν να κεωρθκοφν ςθμαντικζσ. Φαίνεται όμωσ πωσ ςτθν περίπτωςθ τθσ ΑΧ-6 και ΑΧ-9 θ ειςαγωγι ενόσ επιπλζον αρωματικοφ δακτυλίου βελτιϊνει τθ δράςθ ακόμα και ςε ςχζςθ με τθν περίπτωςθ ειςαγωγισ πυρρολικοφ δακτυλίου (ζνωςθ ΑΧ-5). Από τθν μελζτθ των δομϊν χαμθλότερθσ ενζργειασ των παραπάνω ενϊςεων προκφπτει πωσ θ γωνία που ςχθματίηουν τα επίπεδα των προαναωερόμενων αρωματικϊν δακτυλίων με τον ωαινυλοςουλωοναμιδικό δακτφλιο ςτισ ενϊςεισ ΑΧ-6 και ΑΧ-9 είναι 43 και 42 αντίςτοιχα ενϊ μεταξφ των επιπζδων του πυρρολικοφ και ωαινυλοςουλωοναμιδικοφ δακτυλίου ςτθν ζνωςθ ΑΧ-5 είναι μόλισ 15. Θ διαωορά ςτθ διαμόρωωςθ των μορίων επομζνωσ είναι μεγάλθ και ενδεχόμενα διαδραματίηει ςθμαντικό ρόλο ςτθν ςφνδεςθ με το ενεργό κζντρο του ενηφμου. Κα πρζπει να τονιςτεί πωσ ςτθν περίπτωςθ των ΑΧ-6 και ΑΧ-9 μεταξφ των δυο αρωματικϊν δακτυλίων παρεμβάλλεται ζνα καρβονφλιο, θ παρουςία του οποίου ζχει βρεκεί πωσ ςυμβάλλει ςθμαντικά ςτθν αλλθλεπίδραςθ με το ενεργό κζντρο αωοφ μπορεί να λειτουργιςει ωσ «γζωυρα μεταωοράσ ωορτίου» charge-transfer bridge μεταξφ όξινων και βαςικϊν ομάδων των 133

134 υπολοίπων του ενηφμου (Kador and Sharpless, 1983; Kador et al., 1995), επιτρζποντασ με αυτό τον τρόπο τθν καλφτερθ αλλθλεπίδραςθ/ςφνδεςθ με το ενεργό κζντρο τθσ ALR2 και επομζνωσ καλφτερθ in vitro δράςθ. Στισ δομζσ τθσ ελάχιςτθσ ενζργειασ υπολογίςτθκαν οι αποςτάςεισ των γεωμετρικϊν κζντρων (centroids) των αρωματικϊν δακτυλίων εκατζρωκεν του καρβονυλίου από αυτό (από το γεωμετρικό του κζντρο) και βρζκθκαν ςε πλιρθ ςυμωωνία με τθσ απαιτιςεισ τθσ ωαρμακοωόρου όπωσ αυτι προςδιορίςτθκε από τθν ερευνθτικι ομάδα των Kador και Sharpless (Kador and Sharpless, 1983) (εικόνα 6). Συγκεκριμζνα οι αποςτάςεισ d 1 και d 2 για τθν ζνωςθ ΑΧ-6 είναι 3.62 και 4.07Å αντίςτοιχα ενϊ για τθν ζνωςθ ΑΧ-9 είναι 3.06 και 4.07 αντίςτοιχα. Επίςθσ και θ απόςταςθ d 4 είναι ανάλογθ (ΑΧ-6: 10.7 Å, ΑΧ-9: Å). ΕΙΚΟΝΑ 6 Θ επιλογι τθσ ομάδασ του 4-βρωμο-2-ωκορο-μεκυλοβενηολίου ωσ μια πικανι προνομιοφχα δομι privileged scaffold που κα μποροφςε να ενςωματωκεί ςτο χθμειότυπο των προαναωερόμενων διωκοροωαινολικϊν παραγϊγων ωσ υποκατάςταςθ ςτο άηωτο του ςουλωοναμιδίου, οδιγθςε ςτθν ανάπτυξθ δραςτικϊν αναςτολζων (ενϊςεισ ΑΧ-18, ΑΧ-19 και ΑΧ- 20), κάτι που ζρχεται ςε ςυμωωνία και με άλλεσ μελζτεσ που αωοροφν ςε ARIs με παρόμοια υποκατάςταςθ (Rakowitz et al., 2006). Οι εν λόγω ενϊςεισ ςυγκαταλζγονται μεταξφ των δραςτικότερων από τισ ΑΧs που αναπτφχκθκαν ςτα πλαίςια τθσ παροφςασ διδακτορικισ διατριβισ, με δραςτικότερθ τθν ΑΧ-20 με IC 50 =0.397μΜ. Οι δομικζσ διαωορζσ των τριϊν αυτϊν ενϊςεων εντοπίηονται ςτθν υποκατάςταςθ R 1. Δεν παρατθρείται βελτίωςθ τθσ δράςθσ με τθν παρουςία ωσ υποκαταςτάτθ του ΝΟ 2 (ζνωςθ ΑΧ-19) ενϊ ςτθν περίπτωςθ τθσ ΝΘ 2 υποκατάςταςθσ (ζνωςθ ΑΧ- 20) παρατθρείται θ ιςχυρότερθ αναςταλτικι δράςθ. Ο τρόποσ επίδραςθσ τθσ υποκατάςταςθσ R 1 ακολουκεί παρόμοια λογικι με αυτι που αναπτφχκθκε παραπάνω για τα μθ υποκατεςτθμζνα ςτο άηωτο του ςουλωοναμιδίου παράγωγα ΑΧ-1, AX-3 και AX-4. Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να γίνει αναωορά ςτα κριτιρια για το κατά πόςο οι ενϊςεισ ΑΧs πλθροφν τισ προχποκζςεισ ςχετικά με τα απαραίτθτα ωυςικοχθμικά χαρακτθριςτικά πικανϊν υποψθωίων ωαρμάκων ( drug likeness ). Ενϊ ςτο ςφνολο τουσ οι ενϊςεισ AXs δεν παραβιάηουν τον «κανόνα των 5» (αναλυτικά δεδομζνα ςτον πίνακα 4, ςελ ), θ ζνωςθ ΑΧ

135 παρουςιάηει μια παραβίαςθ ςχετικά με τθν τιμι τθσ λιποωιλικότθτασ ενϊ θ ζνωςθ ΑΧ-19 δυο παραβιάςεισ ςχετικά με τθν λιποωιλικότθτα και το μοριακό βάροσ. Οι παραβιάςεισ αυτζσ εξαλείωτθκαν ςτθν ζνωςθ ΑΧ-20 αωοφ θ παρουςία τθσ αμινομάδασ μείωςε τθν λιποωιλικότθτα και το μοριακό βάροσ κυμαίνεται ςτα αποδεκτά όρια (Muegge, 2003). Τζλοσ, με βάςθ τα κετικά αποτελζςματα από τθν παραπάνω υποκατάςταςθ ςτο άτομο του αηϊτου του ςουλωοναμιδίου, αναπτφχκθκε ακόμα ζνασ αναςτολζασ, θ ζνωςθ ΑΧ-21 που ωζρει μια ωαινυλοςουλωονυλο-ομάδα ωσ υποκαταςτάτθ R 2. Δεν παρατθρείται βελτίωςθ τθσ δράςθσ οφτε ςε ςχζςθ με το μθ υποκατεςτθμζνο παράγωγο ΑΧ-1 αλλά οφτε και με τα παράγωγα ΑΧ-18, ΑΧ-19 και ΑΧ-20 που ωζρουν το 4-βρωμο-μεκυλο-2-ωκοροβενηόλιο ωσ R 2 υποκαταςτάτθ ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣOY ENZYMOY ΑΝΑΓΨΓΑΗ ΣΨΝ ΑΛΔΕΫΔΨΝ (ALR1) ΚΑΙ ΠΡΟΔΙΟΡΙΜΟ ΣΗ ΕΚΛΕΚΣΙΚΟΣΗΣΑ ΜΕ ΣΟ ΟΜΟΛΟΓΟ ΕΝΖΤΜΟ ΑΝΑΓΨΓΑΗ ΣΗ ΑΛΔΟΖΗ (ALR2) Θ ικανότθτα των τελικϊν ενϊςεων κακϊσ και του βαλπροϊκοφ οξζοσ (ζνωςθ αναωοράσ) να αναςτζλλουν το ζνηυμο τθσ αναγωγάςθσ των αλδεχδϊν (ALR1) μελετικθκε ςε ςυγκεντρϊςεισ από 5x10-4 M ωσ 10-9 Μ (ανάλογα με τθ δραςτικότθτα των ενϊςεων), ςε ενηυμικό παραςκεφαςμα από νεωροφσ επιμφων (Costantino et al., 1999; Stefek et al., 2008). Το βαλπροϊκό οξφ αποτελεί καλό αναςτολζα τθσ ALR1 (όπωσ και θ ωαινοβαρβιτόνθ που είναι τυπικόσ αναςτολζασ αυτισ), ενϊ δεν ζχει ανάλογθ δράςθ για τθν ALR2 (μόνο 20% αναςτολι ςε ςυγκζντρωςθ 1mM) και γι αυτοφσ τουσ λόγουσ μπορεί να χρθςιμοποιθκεί ωσ ζνωςθ αναωοράσ (Wermuth et al., 1982). Τα αποτελζςματα εκωράηονται ωσ ο μζςοσ όροσ των τιμϊν IC 50 από τρεισ μετριςεισ με τθν τυπικι απόκλιςθ αυτϊν (πίνακασ 7) ενϊ ςτισ περιπτϊςεισ των λιγότερο δραςτικϊν ενϊςεων που δεν ιταν δυνατόσ ο προςδιοριςμόσ των τιμϊν IC 50 παρατίκενται τα ποςοςτά αναςτολισ ςε ςυγκζντρωςθ 100μΜ ωσ ο μζςοσ όροσ από τρεισ μετριςεισ και θ τυπικι απόκλιςθ αυτϊν (πίνακασ 8). ΠΙΝΑΚΑ 7: in vitro ικανότητα αναςτολήσ τησ ALR1 από τα διφθοροφαινολικά παράγωγα AX ζνωςθ R 1 R 2 IC 50 (±SD)μΜ AX-1 Θ H 19.6(±1.4) AX-2 OCH 3 H 23.8(±1.0) AX-3 NO 2 H 132.9(±12.9) AX-4 NH 2 H 10.3(±0.23) AX-5 πυρρόλιο H 280.7(±2.12) 135

136 AX-6 NHCOPh H 6.9(±0.9) AX-7 CF 3 H 105.2(±2.61) AX-8 NHCONHCH 2 CH 3 H 25.51(±3.02) AX-9 NHCO-C 6 H 4 -poch 3 H 12.37(±0.23) AX-18 H 11.9(±0.58) AX-19 NO (±0.06) AX-20 NH (±0.013) AX-21 H 9.7(±0.68) Βαλπροϊκό οξφ: 56.1(±2.7)μΜ ((δθμοςιευμζνεσ τιμζσ IC 50 : 98μΜ (Poulsom, 1986)) ΠΙΝΑΚΑ 8: in vitro ικανότητα αναςτολήσ τησ ALR1 από μη διφθοροφαινολικά παράγωγα AX ζνωςθ % αναςτολι ςε 100μΜ (±SD) AX (±0.72) AX (±0.69) AX (±2.15) AX (±1.73) AX (±0.57) Βαλπροϊκό οξφ: 56.1(±2.7)μΜ ((δθμοςιευμζνεσ τιμζσ IC 50 : 98μΜ (Poulsom, 1986)) 136

137 Ροιοτικι αξιολόγθςθ των in vitro αποτελεςμάτων του πίνακα 8 δεν μπορεί να υποδείξει ξεκάκαρα τον τρόπο με τον οποίο θ R 1 υποκατάςταςθ επθρεάηει ενδεχόμενα τθ δράςθ. Στισ περιπτϊςεισ R 1 υποκατάςταςθσ ςτα μθ υποκατεςτθμζνα ςτο άηωτο του ςουλωοναμιδίου παράγωγα από τισ ομάδεσ -ΝΟ 2,- CF 3 και πυρρόλιο, προκαλείται ςθμαντικι μείωςθ τθσ δράςθσ. Στισ περιπτϊςεισ υποκατάςταςθσ ςτο άηωτο του ςουλωοναμιδίου θ αναςταλτικι δράςθ προσ τθν ALR1 είναι αρκετά ςθμαντικι και ειδικά ςτθν περίπτωςθ τθσ ζνωςθσ ΑΧ-20. Ρροκειμζνου να γίνει εκτίμθςθ των αποτελεςμάτων ςε ςχζςθ με τα in vitro αποτελζςματα που αωοροφν ςτθν αναςτολι τθσ ALR2 αρχικά αυτά παρουςιάηονται ςυνολικά (διάγραμμα 3 και 4) και ςτθ ςυνζχεια προςδιορίηεται θ εκλεκτικότθτα των υπό εξζταςθ ενϊςεων ωσ ο λόγοσ (IC 50 ) ALR1 /(IC 50 ) ALR2 (όςο μεγαλφτεροσ είναι αυτόσ, τόςο μεγαλφτερθ και θ εκλεκτικότθτα τθσ υπό μελζτθ ζνωςθσ) για τα δραςτικά παράγωγα τθσ διωκοροωαινόλθσ (διάγραμμα 5) ενϊ για τισ περιπτϊςεισ των λιγότερο δραςτικϊν ενϊςεων υπολογίηεται ο λόγοσ % αναςτολι ALR1 / % αναςτολι ALR2 (διάγραμμα 6) (όςο μικρότεροσ είναι αυτόσ, τόςο μεγαλφτερθ και θ εκλεκτικότθτα τθσ υπό μελζτθ ζνωςθσ). Στθν περίπτωςθ των δραςτικϊν τελικϊν ενϊςεων, παραγϊγων τθσ διωκοροωαινόλθσ ςτισ περιςςότερεσ των περιπτϊςεων (με εξαίρεςθ τισ ενϊςεισ ΑΧ-1, ΑΧ-8 και ΑΧ-21) προκαλείται μεγαλφτερθ αναςτολι τθσ ALR2 ςε ςχζςθ με τθν ALR1 ενϊ παρατθροφνται και περιπτϊςεισ που θ διαωορζσ ςτθν αναςτολι είναι αμελθτζεσ (περιπτϊςεισ ενϊςεων ΑΧ-4, ΑΧ-6, ΑΧ-9 και ΑΧ-20). ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 3 137

138 AX-1 AX-2 AX-3 AX-4 AX-5 AX-6 AX-7 AX-8 AX-9 AX-18 AX-19 AX-20 AX Ρολυξζνθ Αλεξίου ALR2 vs ALR1 των λιγότερο δραςτικών ενώςεων % αναςτολι (C=100μΜ) A AX-10 AX-13 AX-15 AX-16 AX-17 ενώςεισ ΑΧ % αναςτολι (ALR2) % αναςτολι (ALR1) ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 4 Πςο αωορά τα λιγότερο δραςτικά μόρια, παρατθρείται μεγαλφτερθ ςυγκριτικά αναςτολι τθσ ALR2 με αξιοπρόςεκτο παράδειγμα τθσ ζνωςθσ ΑΧ-17, που διαωοροποιείται ςθμαντικά ςε ςχζςθ με τθν ιςομερι ζνωςθ ΑΧ-15. εκλεκτικότθτα δραςτικών ενώςεων ΙC 50 ALR1 /IC 50 ALR ενώςεισ ΑΧ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 5 138

139 εκλεκτικότθτα των λιγότερο δραςτικών ενώςεων % αναςτολι C=100μΜ ALR1 /% αναςτολι C=100μΜ ALR A AX-10 AX-13 AX-15 AX-16 AX-17 ενώςεισ ΑΧ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 6 Οι δραςτικοί ARIs που αναπτφχκθκαν ςτα πλαίςια τθσ παροφςασ διδακτορικισ διατριβισ κατά περιπτϊςεισ παρουςιάηουν καλι εκλεκτικότθτα (ενϊςεισ ΑΧ-3 και ΑΧ-5) ενϊ αναωορικά με τουσ δραςτικότερουσ αναςτολείσ (ΑΧ-18, ΑΧ-19 και ΑΧ-20) θ εκλεκτικότθτα μειϊνεται παράλλθλα με τθν αφξθςθ τθσ αναςταλτικισ δράςθσ όςο αωορά τθν ALR2 αλλά είναι βελτιωμζνθ ςε ςχζςθ με τα μθ υποκατεςτθμζνα ςτο άηωτο του ςουλωοναμιδίου παράγωγα. Στο ςθμείο αυτό κα πρζπει να τονιςτεί πωσ θ αποτελεςματικότθτα/τοξικότθτα εκλεκτικϊν ARIs δεν ζχει αξιολογθκεί in vivo ςε ςχζςθ με μθ εκλεκτικοφσ αναςτολείσ και θ κεωρία τθσ εκλεκτικότθτασ μεταξφ ALR1 και ALR2 απαιτεί περαιτζρω διερεφνθςθ. Τα ςτοιχεία που ενιςχφουν τζτοιου είδουσ προβλθματιςμό είναι τα ακόλουκα: Σε περιπτϊςεισ διαβιτθ παρατθρείται υπερζκωραςθ τθσ ALR2 ςτουσ περιςςότερουσ ιςτοφσ (Ghahary et al., 1991; Henry et al., 1999a; Henry et al., 1999b; Nakashima et al., 2005), κάτι που δεν παρατθρείται ςτθν περίπτωςθ τθσ ALR1. Ζχει προτακεί πωσ για τθν παραγωγι πολυολϊν ςτουσ νεωροφσ ευκφνονται τόςο θ ALR2 όςο και θ ALR1 που εντοπίηεται ςε αυτοφσ (Barski et al., 2005), και μάλιςτα θ δράςθ τθσ ALR1 ςυμβάλλει ςθμαντικά ςτθν αφξθςθ των επιπζδων τθσ ςορβιτόλθσ που ωσ αποτζλεςμα ζχει τθν πρόκλθςθ διαβθτικϊν νεωροπακειϊν (Sato, 1992). Τα παραπάνω ςτοιχεία κα πρζπει να λθωκοφν υπόψθ ςτθν αξιολόγθςθ των αποτελεςμάτων τθσ εκλεκτικότθτασ αωοφ αωενόσ μεν τα αποτελζςματα από τθν in vitro μελζτθ τθσ αναςτολισ των ενηφμων ALR1 και ALR2, και ειδικά τθσ ALR2, να μθν είναι απόλυτα ςφμωωνα με τθν επικρατοφςα in vivo κατάςταςθ, και αωετζρου μικροφ βακμοφ αναςτολι τθσ ALR1 ίςωσ να είναι επικυμθτι. 139

140 ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΡΨΗ ΣΗ ΕΛΕΤΘΕΡΗ ΡΙΖΑ DPPH Θ ικανότθτα των τελικϊν ενϊςεων ΑΧ, κακϊσ και τθσ τρολόξθσ (ζνωςθσ αναωοράσ, υδατοδιαλυτό ανάλογο τθσ βιταμίνθσ Ε που εμωανίηει ιςχυρι αντιοξειδωτικι δράςθ), να αλλθλεπιδροφν με τθν ελεφκερθ ρίηα DPPH, τελικισ ςυγκζντρωςθσ 0,2mM, μελετικθκε ςε ςυγκεντρϊςεισ από 0,2mM ωσ 0,0125mM. Ωσ διαλφτθσ τόςο του DPPH όςο και των ουςιϊν χρθςιμοποιικθκε θ απόλυτθ αικανόλθ. Θ ιςχφσ τθσ αντίδραςθσ εξαρτάται ςθμαντικά από τον χρθςιμοποιοφμενο διαλφτθ και είναι ιδιαίτερα αυξθμζνθ όταν αυτόσ είναι αλκοόλθ(valgimigli et al., 1995). Τα μθ ωαινολικά παράγωγα (ενϊςεισ ΑΧ-10, ΑΧ-13, ΑΧ-15, ΑΧ-16 και ΑΧ-17) δεν ζδειξαν ικανότθτα αλλθλεπίδραςθσ με τθν ελεφκερθ ρίηα DPPH (~10% αλλθλεπίδραςθ ςε ιςομοριακζσ ςυγκεντρϊςεισ 0.2mM με το DPPH) και για το λόγο αυτό θ μελζτθ που ακολουκεί δεν περιλαμβάνει τισ ενϊςεισ αυτζσ. Θ αλλθλεπίδραςθ των ωαινολικϊν παραγϊγων με το DPPH οωείλεται κυρίωσ ςτθν απόςπαςθ του ωαινολικοφ υδρογόνου (ςτοιχειομετρία τθσ αντίδραςθσ 1:1), ςχθματίηοντασ αντίςτοιχθ ρίηα, όπωσ ωαίνεται και ςτο ςχιμα που ακολουκεί (ςχιμα 49) (Ancerewicz et al., 1998). ΧΘΜΑ 49 Σφμωωνα με τον μθχανιςμό αυτόν, θ ελεφκερθ ρίηα του DPPH μετατρζπεται ςε ζνα ςτακερό, διαμαγνθτικό μόριο, με τθν πρόςλθψθ ενόσ ατόμου υδρογόνου. Θ αναγωγι αυτι οδθγεί ςτθν ςφηευξθ του μονιρουσ θλεκτρονίου και αποχρωματιςμό του διαλφματοσ τθσ. Για τισ εξεταηόμενεσ ενϊςεισ θ επίτευξθ τθσ ςτακερισ κατάςταςθσ, όπου δεν παρατθρείται περαιτζρω μεταβολι τθσ αλλθλεπίδραςθσ με το DPPH, επιτυγχάνεται μετά τθν πάροδο 4.5 ωρϊν και τα αποτελζςματα παρουςιάηονται παρακάτω (πίνακασ 9). Πλεσ οι μετριςεισ ζγιναν εισ τριπλοφν και οι τυπικζσ αποκλίςεισ των τιμϊν είναι <10%. Στθν περίπτωςθ τθσ τρολόξθσ κα πρζπει να αναωερκεί πωσ θ επίτευξθ τθσ ςτακεροποιθμζνθσ κατάςταςθσ πραγματοποιείται μετά τθ πάροδο 30 λεπτϊν (ςτθν βιβλιογραωία αναωζρεται χρόνοσ 20 λεπτϊν (Silva et al., 2006). 140

141 ΠΙΝΑΚΑ 9: in vitro ικανότθτα αλλθλεπίδραςθσ των παραγώγων AX με τθν ελεφκερθ ρίηα DPPH C(mM) AX-1 AX-2 AX-3 AX-4 AX-5 AX-6 AX-7 AX-8 AX-9 AX-18 AX-19 AX-20 AX-21 τρολόξθ Με βάςθ τισ μετριςεισ ςε αυτι τθ χρονικι ςτιγμι, προςδιορίςτθκαν οι τιμζσ IC 50, δθλαδι οι ςυγκεντρϊςεισ των ουςιϊν που απαιτοφνται για να προκαλζςουν αλλθλεπίδραςθ με το DPPH κατά 50% (διάγραμμα 7). Οι τιμζσ IC 50 όμωσ εξαρτϊνται από τθ ςυγκζντρωςθ του DPPH που χρθςιμοποιείται ςτο πρωτόκολλο και γι αυτό το λόγο αντικειμενικότερο μζγεκοσ αποτελεί θ τιμι αποτελεςματικισ ςυγκζντρωςθσ EC 50, που ορίηεται ωσ ο λόγοσ τθσ ςυγκζντρωςθσ του αντιοξειδωτικοφ που επιωζρει 50% ελάττωςθ του DPPH ωσ προσ τθ ςυγκζντρωςθ του χρθςιμοποιοφμενου DPPH (Ancerewicz et al., 1998)(διάγραμμα 8). ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 7 δθμοςιευμζνεσ τιμζσ IC 50 για τρολόξθ : 0,010mM (Lehuede et al., 1999); 0,009mM (Silva et al., 2006) 141

142 ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 8 δθμοςιευμζνθ τιμι EC 50 για τρολόξθ: 0,19 (Ancerewicz et al., 1998) Οι εξεταηόμενεσ ενϊςεισ που είναι παράγωγα τθσ 2,6-διωκοροωαινόλθσ παρουςιάηουν ιςχυρι αντιοξειδωτικι δράςθ, ςυγκρίςιμθ με αυτι του ιςχυροφ αντιοξειδωτικοφ τρολόξθ, με δραςτικότερο παράγωγο αυτό του Ν-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλο)-4-αμινοβενηολο ςουλωοναμιδίου (ΑΧ-4). Ζχει προτακεί (Ancerewicz et al., 1998) πωσ εάν διπλαςιαςτεί θ τιμι EC 50, προκφπτει μια κατά προςζγγιςθ ςτοιχειομετρία που είναι ενδεικτικι κατά πόςο α) θ αντίδραςθ ακολουκεί απλι απόςπαςθ υδρογόνου (μθχανιςμόσ ςχιματοσ 49) και θ ςτακεροποιθμζνθ κατάςταςθ επιτυγχάνεται γριγορα (ς αυτι τθν περίπτωςθ θ ςτοιχειομετρία ιςοφται με τον αρικμό των δραςτικϊν υδροξυλικϊν υδρογόνων) ι β) θ αντίδραςθ ακολουκεί περιςςότερο πολφπλοκουσ μθχανιςμοφσ (ς αυτι τθν περίπτωςθ θ ςτοιχειομετρία ιςοφται με αρικμό μικρότερο των διακζςιμων υδροξυλικϊν υδρογόνων) και θ ςτακεροποιθμζνθ κατάςταςθ επιτυγχάνεται ςε μεγάλο χρονικό διάςτθμα που ποικίλει ανάλογα με τθ δομι τθσ ζνωςθσ. Στθν δεφτερθ περίπτωςθ, θ ςχθματιηόμενθ ρίηα, ςυνικωσ ωαινοξυλίου, υωίςταται δυνθτικά ςφηευξθ, διάςπαςθ ι διμεριςμό, με τελικό αποτζλεςμα ζνα μόριο τθσ ζνωςθσ να αντιδρά με περιςςότερα του ενόσ μορίου DPPH. Στθν περίπτωςθ των μορίων ΑΧ ο διπλαςιαςμόσ των τιμϊν EC 50 δίνει τιμζσ <1 και ςυγκεκριμζνα εφροσ μεταξφ 0.44 και 0.62, δθλαδι ωαίνεται πωσ αντιδρά ζνα μόριο τθσ ζνωςθσ με περίπου δφο μόρια DPPH και ςυγκεκριμζνα μεταξφ 1.6 ωσ 2,27 μόρια (ο αρικμόσ των μορίων DPPH ς που αλλθλεπιδροφν με ζνα μόριο ζνωςθσ δίνεται από τον τφπο 1 2 EC ςτοιxειομετρία αυτι μπορεί να δικαιολογθκεί αν δεχτοφμε τθν πικανότθτα ότι ο μθχανιςμόσ είναι πολυπλοκότεροσ και ςυμβαίνουν ωαινόμενα που αναωζρονται ςτθν περίπτωςθ β ι είναι πολφ πικανό να αλλθλεπιδρά απευκείασ με τθν ελεφκερθ ρίηα και το υδρογόνο του ςουλωοναμιδίου (όπου αυτό είναι διακζςιμο), αωοφ μπορεί επίςθσ να αποςπαςτεί και να προκφψει ρίηα αηϊτου που ςτακεροποιείται με ωαινόμενα δζκτθ-δότθ θλεκτρονίων ( capto-dative effect ) (Togo, 2004). 50 ). Θ 142

143 Ζχει μελετθκεί ο μθχανιςμόσ αλλθλεπίδραςθσ τθσ ευγενόλθσ (ς~2), κακϊσ και άλλων αντιοξειδωτικϊν με ς>2 (Bondet et al., 1997) και ςε αναλογία με αυτοφσ, ο προτεινόμενοσ μθχανιςμόσ για τισ ενϊςεισ ΑΧ που δεν ζχουν υποκατάςταςθ ςτο άηωτο του ςουλωοναμιδίου (ενϊςεισ ΑΧ-18, ΑΧ-19, ΑΧ-20 και ΑΧ-21) είναι αυτόσ που παρουςιάηεται ςτθ ςυνζχεια (ςχιμα 50). ΧΘΜΑ

144 Τζλοσ μελετικθκε θ κινθτικι τθσ αντίδραςθσ των μορίων ΑΧ με ςκοπό να διευκρινιςτεί καλφτερα θ αντιοξειδωτικι ικανότθτα τουσ, και τα αποτελζςματα παρουςιάηονται ςτθ ςυνζχεια ωσ μείωςθ τθσ απορρόωθςθσ του αικανολικοφ διαλφματοσ του DPPH, παρουςία των εξεταηόμενων ενϊςεων (διάγραμμα 9). ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 9 Θ μείωςθ τθσ απορρόωθςθσ τα πρϊτα 30 και 60, όπου θ μείωςθ είναι γραμμικι αποτελοφν τισ τιμζσ τθσ αρχικισ ταχφτθτασ αλλθλεπίδραςθσ (initial velocity)(stefek et al., 2008) (διάγραμμα 10). Ο προςδιοριςμόσ τθσ αρχικισ ταχφτθτασ αλλθλεπίδραςθσ (initial velocity) αποτελεί κριτιριο αξιολόγθςθσ τθσ αντιοξειδωτικισ δράςθσ, αωοφ ενϊςεισ που εμωανίηουν παραπλιςιεσ τιμζσ IC 50 είναι δυνατό να εκδθλϊνουν τθ δράςθ τουσ ςε ςθμαντικά διαωορετικά χρονικά πλαίςια. Αυτό ωαίνεται ξεκάκαρα μετά από ςφγκριςθ τθσ κινθτικισ των μορίων ΑΧ με τθν τρολόξθ, που δρα ταχφτατα (διάγραμμα 9). 144

145 ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ 10 Θ ζνωςθ ΑΧ-4 βρζκθκε ωσ θ δραςτικότερθ με βάςθ τθ τιμι IC 50, δεν προκαλεί όμωσ και τθν μεγαλφτερθ αρχικι ταχφτθτα αλλθλεπίδραςθσ ςτα 30 και ςτα 60. Τθν μεγαλφτερθ αρχικι ταχφτθτα αλλθλεπίδραςθσ προκαλοφν τα υποκατεςτθμζνα ςτο άηωτο του ςουλωοναμιδίου παράγωγα, αναδεικνφοντασ και πάλι το γεγονόσ πωσ ο μθχανιςμόσ αλλθλεπίδραςθσ ςε αυτζσ τισ περιπτϊςεισ αωορά κυρίωσ ςτθν απλι απόςπαςθ ατόμου υδρογόνου που ςυμβαίνει ταχφτερα ΕΚΣΙΜΗΗ ΣΗ ΙΚΑΝΟΣΗΣΑ ΑΝΑΣΟΛΗ ΣΗ ΛΙΠΙΔΙΚΗ ΤΠΕΡΟΞΕΙΔΨΗ DOPC ΛΙΠΟΨΜΑΣΨΝ Θ ικανότθτα των τελικϊν και δραςτικϊν ενϊςεων (τόςο από άποψθ ικανότθτασ αναςτολισ τθσ ALR2 αλλά και οι ταυτόχρονα κατζχουςεσ ιςχυρό αντιοξειδωτικό μθχανιςμό ςτο ομογενζσ ςφςτθμα του DPPH), κακϊσ και τθσ τρολόξθσ (ζνωςθσ αναωοράσ, υδατοδιαλυτό ανάλογο τθσ βιταμίνθσ Ε), μελετικθκαν ωσ προσ τθν ικανότθτα τουσ να αναςτζλλουν τθν υπεροξείδωςθ μονόςτοιβων λιποςωμάτων διελαϊκισ L-α-ωωςωατιδυλοχολίνθσ (C18:1, [cis]-9) (L-αphosphatidylochlorine dioleoyl (C18:1, [cis]-9) unilamellar DOPC liposomes) (ςχιμα 51) (Stefek et al., 2008). ΧΘΜΑ

146 Στισ μεμβράνεσ (ετερογενι ςυςτιματα) το αντιοξειδωτικό δυναμικό διαωοροποιείται ςε ςχζςθ με ομογενι ςυςτιματα εξαιτίασ του ςθμαντικοφ ρόλου που διαδραματίηουν παράγοντεσ όπωσ ο εντοπιςμόσ του αντιοξειδωτικοφ μορίου και των ελευκζρων ριηϊν ςτο ςφςτθμα που κακορίηεται από τον ςυντελεςτι κατανομισ μεταξφ υδρόωιλων και λιπόωιλων περιοχϊν. Ωσ ετερογενζσ ςφςτθμα επιλζχτθκε αυτό των DOPC λιποςωμάτων, που υωίςτανται οξειδωτικι προςβολι από υπεροξειδικζσ ρίηεσ που παράγονται ςτθν υδατικι ωάςθ κατά τθ κερμικι διάςπαςθ του υδρόωιλου αηω-εκκινθτι 2,2 -αηωδισ(2-αμινοπροπάνιου) AAPH (εικόνα 7). ΕΙΚΟΝΑ 7 Οι υπό μελζτθ ενϊςεισ εξετάςτθκαν ςε ςυγκεντρϊςεισ από 10 ωσ 300μM (διάγραμμα 11 και 12) και προςδιορίςτθκαν οι τιμζσ IC 50 από τρεισ μετριςεισ, θ τυπικι απόκλιςθ των οποίων είναι <10% (πίνακασ 10). Θ τελικι ςυγκζντρωςθ των DOPC λιποςωμάτων είναι 0.8mM. Στον προαναωερόμενο πίνακα εμπεριζχονται και οι τιμζσ λιποωιλικότθτασ ClogP, για λόγουσ που κα αναλυκοφν ςτθ ςυνζχεια. 146

147 % λιπιδικι υπεροξείδωςθ % αναςτολι Ρολυξζνθ Αλεξίου αναςτολι τθσ υπεροξείδωςθσ των DOPC λιποςωμάτων από τα διφκοροφαινολικά παράγωγα ΑΧs C(μΜ) AX-1 AX-2 AX-3 AX-4 AX-5 AX-6 AX-7 AX-8 AX-9 AX-18 AX-19 AX-20 AX-21 τρολόξθ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ αναςτολι τθσ λιπιδικισ υπεροξείδωςθσ παρουςία των διφκοροφαινολικών ενώςεων AXs AX-1 AX-2 AX-3 AX-4 AX-5 AX-6 AX-7 AX-8 AX-9 AX-18 ΑΧ-19 ΑΧ-20 ΑΧ-21 τρολόξθ C(μΜ) ΔΙΑΓΡΑΜΜΑ

148 ΠΙΝΑΚΑ 10: in vitro ικανότητα αναςτολήσ τησ λιπιδικήσ υπεροξείδωςησ DOPC λιποςωμάτων από τα διφθοροφαινολικά παράγωγα AXs ζνωςθ R 1 R 2 IC 50 (±SD)μΜ ClogP AX-1 Θ H 95.95(±8.47) AX-2 OCH 3 H 55.08(±2.58) AX-3 NO 2 H 45.71(±0.74) AX-4 NH 2 H 48.10(±4.31) AX-5 πυρρόλιο H 97.07(±3.43) AX-6 NHCOPh H 68.57(±1.55) AX-7 CF 3 H 66.02(±1.31) 3.64 AX-8 NHCONHCH 2 CH 3 H 81.69(±4.31) AX-9 NHCO-C 6 H 4 -poch 3 H 70.66(±3.91) AX-18 H 66.02(±9.11) AX-19 NO (±5.42) AX-20 NH (±6.86) AX-21 H (±13.07) Τρολόξθ: 93.5(±8.5)μΜ (Stefek et al., 2008) Από τα παραπάνω in vitro αποτελζςματα προκφπτει πωσ οι εξεταηόμενεσ ενϊςεισ παρουςιάηουν ιςχυρό αντιοξειδωτικό δυναμικό ςτο ετερογενζσ ςφςτθμα των DOPC λιποςωμάτων και μάλιςτα καλφτερο από τθν τρολόξθ ςτθν πλειοψθωία των ενϊςεων ςε αντίκεςθ με τα αντίςτοιχα αποτελζςματα ςτο ομογενζσ ςφςτθμα του DPPH. Τα προκφπτοντα αποτελζςματα τονίηουν τθ ςθμαςία τθσ λιποωιλικότθτασ ςτθν εκδιλωςθ τθσ δράςθσ κακϊσ και το γεγονόσ πωσ ςτο ετερογενζσ ςφςτθμα το αντιοξειδωτικό δυναμικό μιασ ζνωςθσ δεν αποτελεί απλά ζνα χθμικό ωαινόμενο αλλθλεπίδραςθσ ριηϊν όπωσ ςτθν περίπτωςθ του ομογενοφσ ςυςτιματοσ του DPPH. 148

149 5.3. ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ & ΤΖΗΣΗΗ ΣΗ IN SILICO ΜΕΛΕΣΗ ΔΙΑΜΟΡΥΨΗ ΦΕΕΨΝ 2D-QSAR ΣΨΝ ΕΝΨΕΨΝ ΑΦs ΠΟΤ ΑΝΑΠΣΤΦΘΗΚΑΝ ΣΑ ΠΛΑΙΙΑ ΣΗ ΠΑΡΟΤΑ ΔΙΔΑΚΣΟΡΙΚΗ ΔΙΑΣΡΙΒΗ Από τθν ανάλυςθ όλων των τελικϊν ενϊςεων που μελετικθκαν ωσ προσ τθν ικανότθτα τουσ να αναςτζλλουν in vitro τθν ALR2 που απομονϊκθκε από ωακοφσ επιμφων, προζκυψε θ ακόλουκθ εξίςωςθ ποςοτικισ ςυςχζτιςθσ δομισ-δράςθσ: log% αναςτολι C=100μΜ = 0.035(0.028)ClogP (0.058)pKa (0.367) (Ι) n = 16, r = 0.893, r 2 = 0.798, q 2 = 0.683, s = 0.075, F 2, 13 = , α = 0.001, F 1, 14 = , α= 0.001, F 2, 14 = , α=0.01 (ζλεγχοσ αλλθλοεπικάλυψθσ παραμζτρων εξίςωςθσ: ClogP vs pka r 2 = 0.323) (ςθμαντικότθτα/ ςυνειςωορά παραμζτρων ςτθν εξίςωςθ (Λ) : pka > ClogP) Στθ διαμόρωωςθ τθσ εξίςωςθσ (Λ) δεν ςυμπεριλαμβάνονται ωσ ζκτροπεσ τιμζσ (outliers) οι ενϊςεισ 12 και 13. Τα δεδομζνα τθσ εξίςωςθσ δίνονται ςτον πίνακα που ακολουκεί (πίνακασ Λ). πίνακας Ι α/α R 1 Η logx πειρ. logx υπολ. Δlogx ClogP pka 1 ΑΧ-1 Θ ΑΧ-2 OCH ΑΧ-3 NO ΑΧ-4 NH ΑΧ-5 πυρρόλιο ΑΧ-6 NHCOPh

150 7 ΑΧ-7 CF ΑΧ-8 NHCONHCH 2 CH ΑΧ-9 NHCO-C 6 H 4 -poch ΑΧ-10 Θ ΑΧ-13 Θ *12 ΑΧ-15 Θ *13 ΑΧ-16 Θ ΑΧ-17 Θ ΑΧ-18 H ΑΧ-19 NO ΑΧ-20 NH ΑΧ-21 H όπου x=% αναςτολι C=100μΜ 150

151 Από τθν εξίςωςθ Λ προκφπτει πωσ θ αναςταλτικι δράςθ των διαωόρων χθμικϊν κατθγοριϊν ενϊςεων προσ τθν ALR2 επθρεάηεται κετικά από τθ λιποωιλικότθτα αλλά κυρίωσ από τθν τιμι pka του όξινου υδρογόνου τθσ εκάςτοτε ιςοςτεροφσ ομάδασ του οξικοφ οξζοσ. Θ τιμι pka αποτελεί μζτρο τθσ ιςχφσ ενόσ οξζοσ και τθσ ικανότθτασ διάςταςθσ και ωαίνεται από τθν προκφπτουςα εξίςωςθ πωσ μεγάλεσ τιμζσ pka (αςκενισ όξινοσ χαρακτιρασ) ευνοοφν τθν αναςταλτικι δράςθ. Από τθν ανάλυςθ μόνο των ωαινολικϊν παραγϊγων (εκτόσ ανάλυςθσ οι ενϊςεισ ΑΧ-10, ΑΧ- 13, ΑΧ-15, ΑΧ-16 και ΑΧ-17 με α/α 10-14) που μελετικθκαν ωσ προσ τθν ικανότθτα τουσ να αναςτζλλουν in vitro τθν ALR2 που απομονϊκθκε από ωακοφσ επιμφων, προζκυψε θ ακόλουκθ εξίςωςθ ποςοτικισ ςυςχζτιςθσ δομισ-δράςθσ: log1/ic 50 = (0.092)ESP max (0.125)MR-Η (6.819) (ΙΙ) n = 11, r = 0.909, r 2 = 0.826, q 2 = 0.594, s = 0.296, F 2, 8 = , α = 0.01, F 1, 9 = , α= 0.01, F 1, 8 = , α=0.01 (ζλεγχοσ αλλθλοεπικάλυψθσ παραμζτρων εξίςωςθσ: ESP max vs MR-Η r 2 = 0.010) (ςθμαντικότθτα/ ςυνειςωορά παραμζτρων ςτθν εξίςωςθ (ΛΛ) : MR-Η > ESP max ) Στθ διαμόρωωςθ τθσ εξίςωςθσ (IΛ) δεν ςυμπεριλαμβάνονται ωσ ζκτροπεσ τιμζσ (outliers) οι ενϊςεισ 3 και 6. Τα δεδομζνα τθσ εξίςωςθσ δίνονται ςτον πίνακα που ακολουκεί (πίνακασ ΛΛ). πίνακας ΙΙ α/α R 1 Η log1/ic 50 πειρ. log1/ic 50 υπολ. Δlog1/IC 50 ESP max MR-Η 1 ΑΧ-1 Θ ΑΧ-2 OCH *3 ΑΧ-3 NO ΑΧ-4 NH

152 5 ΑΧ-5 πυρρόλιο *6 ΑΧ-6 NHCOPh ΑΧ-7 CF ΑΧ-8 NHCONHCH 2 CH ΑΧ-9 NHCO-C 6 H 4 -poch *10 ΑΧ-10 Θ *11 ΑΧ-13 Θ *12 ΑΧ-15 Θ *13 ΑΧ-16 Θ *14 ΑΧ-17 Θ ΑΧ-18 H ΑΧ-19 NO ΑΧ-20 NH

153 18 ΑΧ-21 H Από τθν παραπάνω ςυςχζτιςθ προκφπτει πωσ θ αναςταλτικι δράςθ επθρεάηεται αρνθτικά από το μζγιςτο θλεκτροςτατικό δυναμικό (ESP max ) και κετικά από τθ μοριακι διακλαςθμότθτα του υπόλοιπου Η (MR-Z). Το κετικό πρόςθμο τθσ παραμζτρου MR-Z υποδθλϊνει πωσ δεν είναι ξεκάκαροσ ο ρόλοσ των ςτερεοχθμικϊν παραγόντων ςτθν διαμόρωωςθ τθσ εξίςωςθσ και ενδεχομζνωσ να εμπλζκονται και υδρόωοβοι παράγοντεσ. Για το λόγο αυτό ζγινε ζλεγχοσ αλλθλοεπικάλυψθσ των παραμζτρων τθσ λιποωιλικότθτασ ClogP με τον MR-Z και προζκυψε ςθμαντικι αλλθλοεπικάλυψθ (r 2 = 0.640). Ενδεικτικά παρατίκεται παρακάτω θ αντίςτοιχθ εξίςωςθ τθσ ΛΛ με τθ ClogP ςτθ κζςθ τθσ MR-Z, που επιβεβαιϊνει τα παραπάνω: log1/ic 50 = (0.116)ESP max (0.220)ClogP (8.403) (ΙII) n = 11, r = 0.841, r 2 = 0.708, q 2 = 0.361, s = 0.368, F 2, 8 = 9.697, α = 0.01, F 1, 9 = 5.387, α= 0.05, F 1, 8 = 9.136, α=0.05 (ζλεγχοσ αλλθλοεπικάλυψθσ παραμζτρων εξίςωςθσ: ESP max vs ClogP r 2 = 0.375) (ςθμαντικότθτα/ ςυνειςωορά παραμζτρων ςτθν εξίςωςθ (III) : ESP max > ClogP) Στθ διαμόρωωςθ τθσ εξίςωςθσ (ΛII) δεν ςυμπεριλαμβάνονται ωσ ζκτροπεσ τιμζσ (outliers) οι ενϊςεισ 3 και 5. Τα δεδομζνα δείχνουν ότι θ ςχζςθ αυτι υςτερεί τθσ (II) ωσ προσ τα ςτατιςτικά τθσ ςτοιχεία και θ λιποωιλικότθτα δεν μπορεί να υποκαταςτιςει τθν μοριακι διακλαςτικότθτα ςτθν εξίςωςθ (II). Συμπεραςματικά, θ αναςτολι τθσ ALR2 επθρεάηεται από θλεκτρονιακά ωαινόμενα που ςτθ ςυγκεκριμζνθ περίπτωςθ εκωράηονται ωσ το μζγιςτο θλεκτροςτατικό δυναμικό ενϊ ο ρόλοσ του υπόλοιπου Η αναδεικνφεται ςθμαντικόσ. 153

154 ΔΙΑΜΟΡΥΨΗ ΓΕΝΙΚΨΝ ΦΕΕΨΝ 2D-QSAR ΑΝΑΣΟΛΕΨΝ ΣΗ ALR2 (ARIs) ΠΟΤ ΑΝΑΥΕΡΟΝΣΑΙ ΣΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΥΙΑ Οι δομζσ, τιμζσ βιολογικισ δράςθσ κακϊσ και οι υπολογιςμζνεσ φυςικοχθμικζσ ιδιότθτεσ όλων των εξεταηόμενων μορίων παρουςιάηονται ςτουσ πίνακεσ του παραρτιματοσ Γ φαινολικά παράγωγα Από τθν ανάλυςθ 19 ωαινολικϊν παραγϊγων που μελετικθκαν από τουσ Costantino και ςυνεργάτεσ (Costantino et al., 2002) ωσ προσ τθν ικανότθτα τουσ να αναςτζλλουν in vitro τθν ALR2 που απομονϊκθκε από ωακοφσ βοοειδϊν, προζκυψε θ ακόλουκθ εξίςωςθ ποςοτικισ ςυςχζτιςθσ δομισ-δράςθσ: log1/ic 50 = 0.576(0.262)ClogP (0.141)HA (1.185) (Α) n = 17, r = 0.885, r 2 = 0.783, q 2 = 0.641, s = 0.287, F 2, 14 = , α = 0.01, F 1, 15 = , α= 0.01, F 1, 14 = , α=0.01 (ζλεγχοσ αλλθλοεπικάλυψθσ παραμζτρων εξίςωςθσ: ClogP vs HA r 2 = 0.074) (ςθμαντικότθτα/ ςυνειςωορά παραμζτρων ςτθν εξίςωςθ (Α) : HA>ClogP) Στθ διαμόρωωςθ τθσ εξίςωςθσ Α δεν ςυμπεριλαμβάνονται ωσ ζκτροπεσ τιμζσ (outliers) οι ενϊςεισ 11 (R 1 =NO 2, R 2 =H, R 3 =COOC 2 H 5, R 4 =R 5 =H, R 6 =OH, X=S) και 19 (R 1 =NO 2, R 2 =R 3 =R 4 =R 5 =H, R 6 =OH, X=OCH 3 ). Τα δεδομζνα τθσ εξίςωςθσ δίνονται ςτον πίνακα που ακολουκεί (πίνακασ A). πίνακας A πειρ. α/α log1/ic 50 υπολ. log1/ic 50 Δlog1/IC 50 CLogP HA *

155 * Ππωσ ωαίνεται από τθν εξίςωςθ θ δράςθ επθρεάηεται κετικά από τθν λιποωιλικότθτα (ClogP) αλλά κυρίωσ από ομάδεσ δζκτεσ πρωτονίων (ΘΑ). Θ ςθμαςία και θ κετικι ςυνειςωορά ομάδων-δεκτϊν πρωτονίου ζρχεται ςε ςυμωωνία με πλικοσ μελετϊν που αναωζρονται ςτα υπόλοιπα Tyr48 και His110 του ενεργοφ κζντρου τθσ ALR2 που δρουν ωσ δότεσ πρωτονίου κατά τθν αλλθλεπίδραςθ με τον προςδζτθ αλλά και τθ γενικότερθ κεϊρθςθ πωσ ςε αλλθλεπιδράςεισ υποςτρϊματοσ-ενηφμου κακοριςτικό ρόλο διαδραματίηουν οι δεςμοί υδρογόνου. Επίςθσ, υδρόωοβεσ αλλθλεπιδράςεισ αναπτφςςονται με το ιδιαίτερα υδρόωοβο ενεργό κζντρο του ενηφμου (Kador et al., 1995) παράγωγα 1-βενζοπυραν-4-όνησ Θ ανάλυςθ 27 παραγϊγων τθσ 1-βενηοπυραν-4-όνθσ που μελετικθκαν από τουσ Costantino και ςυνεργάτεσ (Costantino et al., 2001; Costantino et al., 1999) ωσ προσ τθν ικανότθτα τουσ να αναςτζλλουν in vitro τθν ALR2 που απομονϊκθκε από ωακοφσ βοοειδϊν, οδιγθςε ςτθν ακόλουκθ QSAR εξίςωςθ: log1/ic 50 = (0.150)ClogP (8.194)E HOMO (0.024)ESP MIN (0.033)WAVOL (3.419) (Β) n = 23, r = 0.912, r , q 2 = 0.681, s = 0.239, F 4, 18 = , α = 0.01 F 1,21 = και α = 0.05, F 2,20 = και α = 0.05, F 3,19 = 8.06 και α = 0.01, F 3,18 = 2.46 και α =0.1 (ζλεγχοσ αλλθλοεπικάλυψθσ παραμζτρων εξίςωςθσ: ClogP vs EHOMO r 2 = 0.009, ClogP vs ESP MIN r 2 = 0.036, ClogP vs WAVOL r 2 = 0.324, ESP MIN vs E HOMO r 2 = 0.001, WAVOL vs E HOMO r 2 = 0.033, WAVOL vs ESP MIN r 2 = 0.003) (ςθμαντικότθτα/ ςυνειςωορά παραμζτρων ςτθν εξίςωςθ (Β) : WAVOL>ESP MIN >ClogP>E HOMO,) 155

156 Για τθ διαμόρωωςθ τθσ εξίςωςθσ Β δεν ςυμπεριλαμβάνονται οι ενϊςεισ 7 (R 1 =6,7- ΟΘ,R 2 =Ph, R 3 =H), 8 (R 1 =6-NO 2, 7-ΟΘ,R 2 =Ph, R 3 =H), 13 (R 1 =7-ΟΘ, R 2 =-(CH 2 ) 2 -C 6 H 4 -poh, R 3 =H) και 26 (X=CH 2, R 4 =NO 2 ). Τα δεδομζνα τθσ εξίςωςθσ δίνονται ςτον πίνακα που ακολουκεί (πίνακασ B). πίνακας B α/α πειρ. log1/ic 50 υπολ. log1/ic 50 Δlog1/IC 50 ClogP E HOMO ESP MIN WAVOL * * * * Με βάςθ τθν προκφπτουςα εξίςωςθ Β θ αναςταλτικι δράςθ των υπό εξζταςθ ενϊςεων επθρεάηεται αρνθτικά από τισ θλεκτρονιακζσ ιδιότθτεσ E HOMO και ESP min, ενϊ επθρεάηεται κετικά από τον όγκο προςιτό ςτο νερό WAVOL. Χαμθλζσ τιμζσ λιποωιλίασ οδθγοφν ςε δραςτικότερα παράγωγα. 156

157 μη υδαντοΰνικά και μη καρβοξυλικά παράγωγα, παράγωγα αροώλοςουλφονυλο-πυριδαζιν-3(2η)-όνησ Από τθν ανάλυςθ 15 παραγϊγων τθσ πυριδαηιν-3-όνθσ που μελετικθκαν από τουσ Mylari και ςυνεργάτεσ (Mylari et al., 2003) ωσ προσ τθν ικανότθτα τουσ να αναςτζλλουν in vitro τθν ανκρϊπινθ αναςυνδυαςμζνθ ALR2 δεν προζκυψε κάποια ικανοποιθτικι QSAR εξίςωςθ. Κρίκθκε ςκόπιμοσ λοιπόν ο χωριςμόσ των ενϊςεων ςε 2 υποομάδεσ: i) ενϊςεισ 1-9 (ωαινυλο-υποκατεςτθμζνα παράγωγα) και ii) (βενηοωουρανο-, βενηοκειοωαινυλο-, βενηοκειαηολυλο- ι ινδολο-υποκατεςτθμζνα παράγωγα) για τθν περαιτζρω ανάλυςθ κάκε ομάδασ. (Ε): Από τθν ανάλυςθ των 6 μορίων τθσ δεφτερθσ υποομάδασ προκφπτει θ ακόλουκθ εξίςωςθ log1/ic 50 = 0.275(0.055)WASA (5.847) (Ε) n = 5, r = 0.994, r , q 2 = 0.974, s = 0.199, F 1,3 = , α = Θ ζνωςθ 13 παραλιωκθκε από τθν ανάλυςθ και τα δεδομζνα τθσ εξίςωςθσ δίνονται ςτον πίνακα που ακολουκεί (πίνακασ Γ). Επίςθσ δεν ςυμπεριλαμβάνονται οι ενϊςεισ 1-9 τθσ άλλθσ υποομάδασ. πίνακας Γ πειρ. α/α log1/ic 50 υπολ. log1/ic 50 Δlog1/IC 50 WASA * * * * * * * * * *