Χατηοποφλου Μαρία. Αριςτοτϋλειο Πανεπιςτόμιο Θεςςαλονύκησ Σμόμα Υαρμακευτικόσ, Σομϋασ Υαρμακευτικόσ Φημεύασ

Transcript

1 Αριςτοτϋλειο Πανεπιςτόμιο Θεςςαλονύκησ Σμόμα Υαρμακευτικόσ, Σομϋασ Υαρμακευτικόσ Φημεύασ ΜΕΣΑΠΣΤΦΙΑΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΕΙΔΙΚΕΤΗ ΣΜΗΜΑΣΟ ΥΑΡΜΑΚΕΤΣΙΚΗ ΚΑΣΕΤΘΤΝΗ : ΥΑΡΜΑΚΟΦΗΜΕΙΑ, ΑΝΑΠΣΤΞΗ ΥΑΡΜΑΚΕΤΣΙΚΩΝ ΕΝΩΕΩΝ ΧΕΔΙΑΜΟ ΚΑΙ ΤΝΘΕΗ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΕΝΩΕΩΝ ΜΕ ΠΙΘΑΝΗ ΧΡΗΙΜΟΣΗΣΑ ΣΗΝ ΑΝΣΙΜΕΣΩΠΙΗ ΔΙΑΔΕΔΟΜΕΝΩΝ ΠΑΘΗΕΩΝ (ΟΠΩ ΑΚΧΑΡΩΔΗ ΔΙΑΒΗΣΗ ΚΑΙ ΚΑΡΚΙΝΟ) Χατηοποφλου Μαρία Ηεσσαλομίκη 2008

2 τθν Οικογζνειά μου 2

3 ΟΠΞΚΞΓΞΡ Η υλοπούηςη τησ παρούςασ μεταπτυχιακόσ εργαςύασ πραγματοποιόθηκε ςτον Σομϋα Υαρμακευτικόσ Φημεύασ του Σμόματοσ Υαρμακευτικόσ του Αριςτοτελεύου Πανεπιςτημύου Θεςςαλονύκησ. τα πλαύςια αυτόσ μου δόθηκε η ευκαιρύα να αςχοληθώ με τον ςχεδιαςμό και τη ςύνθεςη νϋων εν δυνϊμει φαρμακομορύων, ϋναν ερευνητικό τομϋα που μου ϋγειρε το ενδιαφϋρον κατϊ τη διϊρκεια των προπτυχιακών μου ςπουδών ςτο εν λόγω Πανεπιςτημιακό Σμόμα. Ευχαριςτώ από τα βϊθη τησ καρδιϊσ μου τον Λϋκτορα Ιωϊννη Νικολϊου, επιβλϋποντα τησ μεταπτυχιακόσ αυτόσ εργαςύασ για την υπόδειξη του θϋματοσ αυτόσ και την ουςιαςτικό του ςυμβολό ςε όλα τα ςτϊδια αυτόσ. Η ςυνεργαςύα μασ κατϊ τη διϊρκεια τησ εκπόνηςησ τησ εργαςύασ όταν ϊριςτη και οι υποδεύξεισ και παραινϋςεισ του καθοριςτικόσ ςημαςύασ. Σο καλό εργαςιακό περιβϊλλον όταν ϊλλωςτε και ϋνασ από τουσ λόγουσ που με ώθηςαν και ςτη ςυνϋχιςη των ςπουδών μου με ςκοπό την απόκτηςη Διδακτωρικού Διπλώματοσ. Ευχαριςτώ θερμϊ τον Αναπληρωτό Καθηγητό Βαςύλειο Δημόπουλο, μϋλοσ τησ τριμελούσ εξεταςτικόσ επιτροπόσ, για τισ ιδιαύτερα χρόςιμεσ υποδεύξεισ και ςυμβουλϋσ του κατϊ τη διϊρκεια τησ εκπόνηςησ τησ μεταπτυχιακόσ εργαςύασ, καθώσ και τισ εύςτοχεσ παρατηρόςεισ και διορθώςεισ ςτο κεύμενο αυτόσ. Ευχαριςτώ θερμϊ τον Αναπληρωτό Καθηγητό Ιωϊννη Βιζιριανϊκη, μϋλοσ τησ τριμελιύσ εξεταςτικόσ επιτροπόσ, για την πολύτιμη βοόθεια του και τισ εποικοδομητικϋσ παρατηρόςεισ και υποδεύξεισ κατϊ τη διόρθωςη του κειμϋνου τησ μεταπτυχιακόσ εργαςύασ. Επύςησ ευχαριςτώ την Αναπληρώτρια Καθηγότρια Αθηνϊ Γερονικϊκη, την Αναπληρώτρια Καθηγότρια Ελϋνη Ρϋκκα, την Αναπληρώτρια Καθηγότρια Δόμητρα Φατζηπαύλου-Λύτινα και τον Ομότιμο Καθηγητό Παναγιώτη Κουρουνϊκη για τισ ςημαντικϋσ παραινϋςεισ και ςυμβουλϋσ κατϊ τη διϊρκεια των ςπουδών μου, καθώσ και τον Dr Αντώνη Γαβαλϊ και όλουσ όςουσ εργϊζονται ςτον Σομϋα Υαρμακευτικόσ Φημεύασ για τη δημιουργύα ευχϊριςτου κλύματοσ εργαςύασ και την επύ καθημερινόσ βϊςεωσ βοόθειϊ τουσ. Ευχαριςτώ επύςησ ολόψυχα τη Λϋκτορα Παπαγιαννοπούλου Διονυςύα για την ςημαντικό βοόθειϊ τησ κατϊ τη λόψη φαςμϊτων 13 C-NMR, καθώσ και για τισ πολύτιμεσ ςυμβουλϋσ και παραινϋςεισ κατϊ τη διϊρκεια των ςπουδών μου. Θα όθελα ακόμη να ευχαριςτόςω ολόψυχα το Εργαςτόριο Υαρμακολογύασ του τομϋα Υαρμακολογύασ-Υαρμακογνωςύασ του Σμόματοσ Υαρμακευτικόσ του Αριςτοτελεύου Πανεπιςτημύου Θεςςαλονικόσ και ιδιαύτερα τον υποψόφιο διδϊκτορα Ιωϊννη Μπονοβόλια για την τϋλεςη μϋρουσ των βιολογικών πειραμϊτων ςε κυτταροκαλλιϋργειεσ που περιλαμβϊνονται ςτη μεταπτυχιακό αυτό εργαςύα. Η βοόθειϊ του όταν καταλυτικόσ ςημαςύασ τόςο ςτην εκτϋλεςη των πειραμϊτων όςο και ςε παραινετικό επύπεδο κατϊ τη ςυγγραφό τησ μεταπτυχιακόσ εργαςύασ. Η ςυνεργαςύα μασ όταν ϊριςτη και οδόγηςε ςτην παρουςύαςη μϋρουσ τησ ωσ προφορικόσ ανακούνωςησ ςτο 13 ο Πανελλόνιο υμπόςιο Υαρμακοχημεύασ, Αθόνα Δε θα μπορούςα να παραλεύψω τισ ευχαριςτύεσ μου προσ τουσ Dr Ivana Papežiková, τον Assoc. Prof. Antonín Lojek και την υποψόφιο διδϊκτορα Michaela Pekarová του Department of Free 3

4 Radical Pathophysiology, Institute of Biophysics, Academy of Sciences of the Czech Republic, Brno, Czech Republic όπου ςτα πλαύςια του ερευνητικού και τεχνολογικού προγρϊμματοσ COST-B35 όρθα ςε επαφό με νϋεσ τεχνικϋσ και μου δόθηκε η ευκαιρύα να διευρύνω τισ ερευνητικϋσ μου δραςτηριότητεσ. Η ϊψογη ςυνργαςύα μασ οδόγηςε ςτην παρουςύαςη προφορικόσ ανακούνωςησ ςτο TOXCON, Interdisciplinary Toxicology Conference, Slovakia Επύςησ θα όθελα να ευχαριςτόςω το ερευνητικό και τεχνολογικό πρόγραμμα COST B35 για την υποτροφύα ςυμμετοχόσ και τη δυνατότητα να παρουςιϊςω μϋροσ τησ μεταπτυχιακόσ αυτόσ εργαςύασ ςτο SFRR-E Free Radical Summer School, Spetses 2008 καθώσ και για την ευγενικό τουσ χορηγεύα κατϊ τη διϊρκεια τησ επιςτημονικόσ μου επύςκεψησ ςτο ανωτϋρω εργαςτόριο τησ Σςϋχικησ Δημοκρατύασ. Σϋλοσ ευχαριςτώ τισ υποψηφύουσ διδϊκτορεσ Πολυξϋνη Αλεξύου, Άννα Μαρύα Κατςώρη και Κυριακό Πεγκλύδου, τουσ Dr Φρόςτο Κοντογιώργη και Dr Ελϋνη Ποντύκη, καθώσ και όλουσ τουσ μεταπτυχιακούσ φοιτητϋσ και υποψηφύουσ διδϊκτορεσ του Σομϋα Υαρμακευτικόσ Φημεύασ για την ςε καθημερινό επύπεδο ϊριςτη ςυνεργαςύα και τη δημιουργύα φιλικού περιβϊλλοντοσ κατϊ τη διϊρκεια των μεταπτυχιακών μου ςπουδών. Ήταν πϊντα κοντϊ μου με υποδεύξεισ, παρατηρόςεισ και φιλικϋσ ςυμβουλϋσ και με ενθϊρρυναν τόςο ςε εργαςιακό όςο και ςε φιλικό επύπεδο. 4

5 ΟΔΠΘΔΥΞΛΔΜΑ Περίλθψθ... 9 Ειςαγωγι Αναγωγάςθ τθσ Αλδόηθσ (ALR2) Δομικά ςτοιχεία τθσ ALR Μεταβολικι οδόσ των Πολυολϊν Θεωρίεσ για τθν εμπλοκι τθσ ALR2 ςτθν εμωάνιςθ των χρόνιων επιπλοκϊν του ςακχαρϊδουσ διαβιτθ Φυςιολογικόσ ρόλοσ τθσ ALR Ζνηυμο τθσ αναγωγάςθσ των αλδεχδϊν (ALR1) Γενικά ςτοιχεία τθσ ALR Αναςτολείσ τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ (ARI) Περί καρκίνου και κυτταρικισ διαωοροποίθςθσ Οι λευχαιμίεσ ωσ διαταραχζσ τθσ διαωοροποίθςθσ και απόπτωςθσ των αιμοποιθτικϊν κυττάρων Ερυκρολευχαιμικά κφτταρα μυόσ... (MEL, Murine Erythroleukemia cells) Αναπτυξιακά προγράμματα και υποπρογράμματα διαωοροποίθςθσ ςτα MEL κφτταρα Επαγωγείσ τθσ διαωοροποίθςθσ των λευχαιμικϊν κυττάρων Αντικείμενο κοπόσ Πειραματικό Μζροσ υςκευζσ και όργανα που χρθςιμοποιικθκαν φνκεςθ Ενϊςεων Πρϊτεσ Τλεσ φνκεςθ τθσ 2,6-διωκορο-4-νιτρο-ωαινόλθσ (1) φνκεςθ τθσ 2,6-διωκορο-4-νιτρο-ανιςόλθσ (2) φνκεςθ τθσ 3,5-διωκορο-4-μεκοξυ-ανιλίνθσ (3) φνκεςθ τθσ 3,5-διωκορο-2-ιωδο-4-μεκοξυ-ανιλίνθσ (4)

6 φνκεςθ τθσ 2,6-διωκορο-3-ιωδο-ανιςόλθσ (5) φνκεςθ τθσ Μορωολινο-(ωαινυλο)-μεκανόνθσ (6) φνκεςθ τθσ ωαινυλο-(1h-πυρρολ-2-υλο)-μεκανόνθσ (7) φνκεςθ τθσ ωαινυλο-(1η-πυρρολ-3-υλο)-μεκανόνθσ (8) φνκεςθ Ενϊςεων - Πρότυπεσ ενϊςεισ: 5-(1Η-πυρρολ-1-υλ)-1Η-τετραηόλιο και παράγωγά του φνκεςθ του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλo)-1Η-τετραηολίου (CHAC-0) Γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των α-(ω-βρωμοαλκυλο)-5-(1h-πυρρολ-1-υλο)-2hτετραηολίων Γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των α,ω-δις*5-(1h-πυρρολ-1-υλο)-2h-τετραηολ-2- υλ+αλκανίων Μζκοδοσ ςφνκεςθσ του 1,6-δις*5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολ-2-υλ+εξανίου με απευκείασ αντίδραςθ με το 1,6-διβρωμοεξάνιο Γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των S-[5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2Η-τετραηολ-2-υλ+αλκυλ ακετυλκειεςτζρων φνκεςθ Ενϊςεων Πρότυπεσ ενϊςεισ παράγωγα τθσ 2,6-διωκορο-3-(1Η-πυρρολ-1- υλ)-ωαινόλθσ φνκεςθ τθσ *1-(2,4-διωκορο-3-μεκοξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-3- υλο+ωαινυλμεκανόνθσ (CAR-1A) φνκεςθ τθσ *1-(2,4-διωκορο-3-υδροξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-3- υλο+ωαινυλμεκανόνθσ (CAR-1) Προςπάκεια φνκεςθσ τθσ *1-(2,4-διωκορο-3-μεκοξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-2- υλο+ωαινυλμεκανόνθσ (CAR-2A) φνκεςθ τθσ *1-(2,4-διωκορο-3-μεκοξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-2- υλο+ωαινυλμεκανόνθσ (CAR-2A) Προςπάκεια φνκεςθσ τθσ *1-(2,4-διωκορο-3-υδροξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-2- υλο+ωαινυλομεκανόνθσ (CAR-2) φνκεςθ τθσ *1-(2,4-διωκορο-3-υδροξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-2- υλο+ωαινυλομεκανόνθσ (CAR-2) Iν vitro μελζτθ τθσ ικανότθτασ αναςτολισ τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ (ALR2) Τλικά - Διαλφματα Ιn vitro πειραματικό πρωτόκολλο προςδιοριςμοφ τθσ ικανότθτασ αναςτολισ του ενηφμου αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ (ALR2)

7 Ανάλυςθ δεδομζνων και ςτατιςτικι επεξεργαςία In vitro μελζτθ τθσ ικανότθτασ αναςτολισ τθσ αναγωγάςθσ των αλδεχδϊν (ALR1). 58 Τλικά - Διαλφματα In vitro πειραματικό πρωτόκολλο προςδιοριςμοφ τθσ ικανότθτασ αναςτολισ του ενηφμου αναγωγάςθ των αλδεχδϊν (ALR1) Ανάλυςθ δεδομζνων και ςτατιςτικι επεξεργαςία Ικανότθτα αναςτολισ τθσ κυτταρικισ ανάπτυξθσ κυττάρων MEL και επαγωγισ τθσ διαωοροποίθςισ τουσ Καλλιζργειεσ των ερυκρολευχαιμικϊν κυττάρων MEL Προςδιοριςμόσ του ρυκμοφ τθσ κυτταρικισ ανάπτυξθσ των κυττάρων MEL Προςδιοριςμόσ των διαωοροποιθμζνων κυττάρων MEL με τθ χρϊςθ βενηιδίνθσ- Η 2 Ο Αποτελζςματα - υηιτθςθ φνκεςθ Ενϊςεων Πρϊτεσ Yλεσ φνκεςθ τθσ 2,6-διωκορο-3-ιωδο-ανιςόλθσ (5) φνκεςθ τθσ ωαινυλο-(1h-πυρρολ-2-υλο)-μεκανόνθσ φνκεςθ τθσ ωαινυλο-(1η-πυρρολ-3-υλο)-μεκανόνθσ φνκεςθ Ενϊςεων - Πρότυπεσ ενϊςεισ: 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηόλιο και παράγωγά του φνκεςθ του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου (CHAC-0) Γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των α-(ω-βρωμοαλκυλο)-5-(1h-πυρρολ-1-υλο)-2hτετραηολίων Γενικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ των S-[5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2Η-τετραηολ-2-υλ+αλκυλ ακετυλκειεςτζρων φνκεςθ Ενϊςεων Πρότυπεσ ενϊςεισ παράγωγα τθσ 2,6-διωκορο-3-(1Η-πυρρολ-1- υλο)-ωαινόλθσ φνκεςθ τθσ *1-(2,4-διωκορο-3-μεκοξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-3- υλο+ωαινυλομεκανόνθσ (CAR-1A) φνκεςθ τθσ *1-(2,4-διωκορο-3-μεκοξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-2- υλο+ωαινυλομεκανόνθσ (CAR-2A) φνκεςθ τθσ *1-(2,4-διωκορο-3-υδροξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-3- υλο+ωαινυλομεκανόνθσ (CAR-1)

8 φνκεςθ τθσ [1-(2,4-διωκορο-3-υδροξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-2- υλο+ωαινυλομεκανόνθσ (CAR-2) Ικανότθτα των παραγϊγων τθσ 2,6-διωκορο-3-(1Η-πυρρολ-1-υλο)ωαινόλθσ να αναςτζλουν τθν αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ (ALR2) Ικανότθτα των παραγϊγων τθσ 2,6-διωκορο-3-(1Η-πυρρολ-1-υλο)ωαινόλθσ να αναςτζλουν τθν αναγωγάςθ των αλδεχδϊν (ALR1), Εκλεκτικότθτα των ενϊςεων ςτα δφο ζνηυμα Ικανότθτα των παραγϊγων του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου να αναςτζλλουν τθν κυτταρικι ανάπτυξθ κυττάρων MEL και να επάγουν τθ διαωοροποίθςι τουσ υμπεράςματα Βιβλιογραφία Abstract

9 ΟΔΠΘΚΖΦΖ A. Η αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ (ALR2), το πρϊτο ζνηυμο τθσ οδοφ των πολυολϊν, ζχει βρεκεί να κατζχει μια πλθκϊρα ρόλων ςε ωυςιολογικζσ και πακολογικζσ καταςτάςεισ (ςφςτθμα αποτοξίνωςθσ από τοξικζσ αλδεψδεσ, ωςμορυκμιςτικόσ ρόλοσ ςτουσ νεωροφσ, ρυκμιςτικόσ ρόλοσ επί τθσ ωρίμανςθσ του ςπζρματοσ κακϊσ και εμπλοκι ςε καρδιακζσ διαταραχζσ, ωλεγμονι, διαταραχζσ τθσ διάκεςθσ, νεωρικι ανεπάρκεια και ανωμαλίεσ των ωοκθκϊν). Πζρα από αυτά, θ ALR2 αρχικά ταυτοποιικθκε ωσ ζνηυμο που εμπλζκεται ςτισ χρόνιεσ επιπλοκζσ του ςακχαρϊδουσ διαβιτθ και αυτό ζδωςε το ζναυςμα για τθν ανάπτυξθ αναςτολζων τθσ (ARI), ωσ κεραπευτικοφσ παράγοντεσ. Πολλοί ARI ζχουν ωτάςει ςε ςτάδια κλινικϊν δοκιμϊν, ωςτόςο μόνο ζνασ είναι εμπορικά διακζςιμοσ (επαλρεςτάτθ, Ιαπωνία). Οι ςυχνότερα απαντϊμενοι χθμειότυποι ςτουσ ARI αωοροφν παράγωγα καρβοξυλικϊν οξζων ι υδαντοϊνϊν. Με ςκοπό τθν παράκαμψθ τθσ τοξικότθτασ και τθσ κακισ ωαρμακοκινθτικισ με τισ οποίεσ ςχετίηονται αυτοί οι χθμειότυποι, αναηθτϊνται παράγωγα διαωορετικισ χθμικισ δομισ. Η [1-(3,5-διωκορο-4-υδροξυωαινυλ)-1H-πυρρολ-3-υλ]ωαινυλ-εκανόνθ ζχει αναωερκεί ωσ ARI, βιοϊςοςτερζσ προθγοφμενου παραγϊγου καρβοξυλικοφ οξζοσ, με IC 50 τθσ τάξθσ των μμ και ςτθν παροφςα εργαςία αναωζρεται θ ςφνκεςθ τθσ [1-(2,4-διωκορο-3-υδροξυωαινυλ)-1H-πυρρολ-3-υλ]ωαινυλμεκανόνθσ, και τθσ ιςομεροφσ τθσ ζνωςθσ [1-(2,4-διωκορο-3-υδροξυωαινυλ)-1Hπυρρολ-2-υλ]ωαινυλμεκανόνθσ. Επίςθσ, εξετάςτθκε θ αναςταλτικι επί τθσ αναγωγάςθσ των αλδεχδϊν δράςθ ωσ μζτρο εκλεκτικότθτασ των ενϊςεων. υμπεραςματικά, οι ενϊςεισ που ςυντζκθκαν εμωανίηουν επίςθσ δράςθ τθσ τάξθσ των μμ, γεγονόσ που τισ κακιςτά οδθγοφσ ενϊςεισ και με περαιτζρω βελτιςτοποίθςθ τθσ δομισ κα μποροφςαν να αποδϊςουν ιςχυροφσ ARI. B. Οι λευχαιμίεσ αποτελοφν μια μεγάλθ μερίδα των κακοικων νεοπλαςιϊν του αιμοποιθτικοφ ςυςτιματοσ. τοιχεία υποδεικνφουν ότι αυτζσ αναδφονται από ανωμαλίεσ επί τθσ κυτταρικισ αυτό-ανανζωςθσ και διαωοροποίθςθσ των εμβρυονικϊν κυττάρων του αιμοποιθτικοφ ςυςτιματοσ ι/και των προγονικϊν κυττάρων αυτοφ. Ζτςι, δθμιουργικθκε θ ςκζψθ ότι επαγωγι υθσ διαωοροποίθςθσ λευχαιμικϊν κυττάρων κα μποροφςε να οδθγιςει ςε παφςθ του ανεξζλεγκτου κυτταρικοφ πολλαπλαςιαςμοφ ι/και να οδθγιςει ςε απόπτωςθ. Αυτι θ νζα προςζγγιςθ αποκαλείται διαμζςου τθσ διαωοροποίθςθσ κεραπεία του καρκίνου και 9

10 ζχει εωαρμοςτεί επιτυχϊσ ςτθν οξεία προμυελωτικι λευχαιμία (ATRA) και ςε λζμωωμα των Σ-κυττάρων (SAHA). Η ζρευνα επί των επαγωγζων τθσ διαωοροποίθςθσ απζδωςε μια πλθκϊρα ενϊςεων διαωορετικϊν χθμικϊν δομϊν, γεγονόσ που υποδεικνφει τθν φπαρξθ πολλαπλϊν μοριακϊν ςτόχων ι/και βιοχθμικϊν μονοπατιϊν που εμπλζκονται. Βαςιηόμενοι ςτισ ςχζςεισ δομισ-δράςθσ γνωςτϊν επαγωγζων, το 5-(1H-πυρρολ-1- υλ)-1h-τετραηόλιοκαι παράγωγα αυτοφ ςχεδιάςτθκαν, ςυντζκθκαν και αξιολογικθκαν για τθν ικανότθτά τουσ να αναςτζλλουν τθν ανάπτυξθ κυττάρων MEL και να επάγουν τθ διαωοροποίθςι τουσ. Η αντιλευχαιμικι δράςθ κάποιων παραγϊγων βρζκθκε ενκαρρυντικι για περαιτζρω διερεφνθςθ. 10

11 ΔΘΡΑΓΩΓΖ τθ μεταπτυχιακι αυτι εργαςία εξετάηεται θ ςφνκεςθ και θ βιολογικι δραςτικότθτα πυρρολικϊν παραγϊγων ςτθν αντιμετϊπιςθ διαδεδομζνων πακιςεων όπωσ ο ςακχαρϊδθσ διαβιτθσ και ο καρκίνοσ. τόχο αποτζλεςε θ ςφνκεςθ ενϊςεων με πικανι δράςθ επί των χρόνιων επιπλοκϊν του ςακχαρϊδουσ διαβιτθ και ενϊςεων με πικανι αντιλευχαιμικι δράςθ. υγκεκριμζνα εξετάηονται παράγωγα τθσ 2,6-διωκορο-3-(1Η-πυρρολ-1-υλο)ωαινόλθσ για τθν δραςτικότθτα και εκλεκτικότθτά τουσ ωσ αναςτολείσ τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ και παράγωγα του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-τετραηολίου για τθν κυτταροτοξικι τουσ δράςθ και τθν ικανότθτά τουσ να προκαλοφν επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ ςε ερυκρολευχαιμικά κφτταρα μυόσ (MEL). ΑΜΑΓΩΓΑΡΖ ΖΡ ΑΚΔΞΕΖΡ (ALR2) Η αρχικι ανακάλυψθ ότι θ αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ εμπλζκεται διαμζςου τθσ οδοφ των πολυολϊν ςτθν πακογζνεςθ των χρόνιων επιπλοκϊν του ςακχαρϊδουσ διαβιτθ (Sheetz and King 2002) και ςτθ ςυνζχεια θ ςυμμετοχι τθσ ςε άλλεσ πακολογικζσ καταςτάςεισ (Petrash 2004) τθν κατζςτθςαν ζναν ςθμαντικό ωαρμακοκεραπευτικό ςτόχο. Σο ενδιαωζρον ςυγκεντρϊνεται ςτθν ανεφρεςθ αναςτολζων κακϊσ οι πακολογικζσ καταςτάςεισ ςτισ οποίεσ εμπλζκεται ςυνοδεφονται από αυξθμζνθ λειτουργία του ενηφμου. Παρά το γεγονόσ ότι ζχει αναωερκεί θ ςφνκεςθ πολλϊν αναςτολζων (Strupczewski and Ellis 1993) και μερικοί από αυτοφσ ζχουν ωτάςει και ςε ςτάδια κλινικϊν δοκιμαςιϊν, κανζνασ αναςτολζασ δεν ζχει καταωζρει να πάρει τθν ζγκριςθ του FDA εξαιτίασ των ανεπικφμθτων ενεργειϊν που προκαλοφν και τθσ ωαρμακοκινθτικισ τουσ ςυμπεριωοράσ. Μζχρι ςιμερα ο μοναδικόσ αναςτολζασ που χρθςιμοποιείται κεραπευτικά, είναι θ επαλρεςτάτθ (Ono Pharmaceutical, Ιαπωνία) ςτθ κεραπεία τθσ διαβθτικισ νευροπάκειασ (Nicolaou and Demopoulos 2003). Για τθν εμωάνιςθ των ανεπικφμθτων ενεργειϊν ζχει ενοχοποιθκεί θ παράλλθλθ αναςτολι του ενηφμου αναγωγάςθ των αλδεχδϊν και πλζον οι ερευνθτικζσ προςπάκειεσ εςτιάηουν ςτθν εφρεςθ εκλεκτικϊν αναςτολζων. Επίςθσ, οι προςπάκειεσ βελτίωςθσ τθσ ωαρμακοκινθτικισ ςυμπεριωοράσ των αναςτολζων εντοπίηονται ςτθν εφρεςθ 11

12 χθμειότυπων εκτόσ των παραγϊγων καρβοξυλικϊν οξζων και υδαντοϊνϊν που αποτελοφν τουσ ςυνθκζςτερουσ μζχρι ςιμερα. Κακϊσ μελζτεσ με διαγονιδιακά ποντίκια υποδεικνφουν τθ ςθμαςία τθσ οδοφ των πολυολϊν ςτθν εμωάνιςθ των διάωορων χρόνιων επιπλοκϊν (Ho, et al. 2006, Vikramadithyan, et al. 2005, Ho, et al. 2000), και ζχουν λθωκεί και ενκαρρυντικά δεδομζνα από τελευταίεσ κλινικζσ μελζτεσ με αναςτολείσ τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ (Mylari, et al. 2005), θ αναηιτθςι τουσ ςυνεχίηει να παραμζνει ςτο προςκινιο. ΔΞΛΘΙΑ ΡΞΘΥΔΘΑ ΖΡ ALR-2 ΕΙΚΟΝΑ 1 Η αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ (AR, ALR2, EC ) είναι ζνα NADPHεξαρτϊμενο ζνηυμο που καταλφει τθν αναγωγι αλδεχδϊν και κετονϊν ςτισ αντίςτοιχεσ αλκοόλεσ. Σο ζνηυμο και ο ρόλοσ του ςτο μεταβολικό μονοπάτι των πολυολϊν αναωζρκθκε πρϊτθ ωορά από τον Hers (Hers 1960). Πρόκειται για κυτοςολικό ζνηυμο που απαντάται κυρίωσ ςτο ωακό και τον αμωιβλθςτροειδι, ςτουσ νεωροφσ, τα επινεωρίδια και ςε αναπαραγωγικά όργανα (Kumar and Reddy 2007). Η πρωτεΐνθ είναι τθσ τάξθσ των 36 kda και ανικει ςτθν υπεροικογζνεια των αλδο-κετο αναγωγαςϊν (AKR) (Zhao, et al. 2008). Είναι μονομερισ πρωτεΐνθ 315 αμινοξζων τθσ δομισ (β/α) 8 (Εικόνα 1, PDB 2INE] (Várnai and Warshel 2000), με το ενεργό τθσ κζντρο να εντοπίηεται ςτο καρβοξυτελικό άκρο, ςτον πυκμζνα μιασ βακειάσ ελλειψοειδοφσ υδρόωοβθσ κοιλότθτασ διαςτάςεων περίπου 4x15x15 Å (Urzhumtsev, et al. 1997). 12

13 Από τθ μελζτθ των ςυμπλόκων τθσ ALR2 με υποςτρϊματά τθσ και με αναςτολείσ, το ζνηυμο ωαίνεται να λαμβάνει διαωορετικζσ διαμορωϊςεισ και ςε αυτζσ διακρίνονται μια περιοχι ςφνδεςθσ του υποςτρϊματοσ και δφο περιοχζσ ςφνδεςθσ των αναςτολζων. Η περιοχι ςφνδεςθσ του ςυνενηφμου NADPH/NADP + είναι ςτακερι και ςτα δφο ςφμπλοκα, (Singh, et al. 2000). φνδεςθ του ςυνενηφμου ςτο αποζνηυμο προκαλεί αλλαγι ςτθ διαμόρωωςθ και ςχθματιςμό του καταλυτικοφ κζντρου (Constantino, et al. 1999). ΕΙΚΟΝΑ 2 Ο νικοτιναμιδικόσ δακτφλιοσ του ςυνενηφμου εντοπίηεται ςτθ βάςθ του καταλυτικοφ κζντρου. Σα υπόλοιπα αμινοξζων που ορίηουν το ενεργό κζντρο μποροφν να χωριςτοφν ςε δφο ομάδεσ: τθν πρϊτθ ομάδα απαρτίηουν τα πολικά αμινοξζα Asp43, Tyr 48, Lys77, His 110, Ser159, Asn160, Gln183 και Tyr209 και ςυνδζονται με το νικοτιναμιδικό ςυνζνηυμο με δεςμοφσ υδρογόνου. Η δεφτερθ ομάδα αποτελείται από υπόλοιπα υδρόωοβων αμινοξζων και ςυγκεκριμζνα των Trp20, Trp79, Trp111, Phe122, Pro218, Trp219, Cys298, Leu300 και Val47. Σα αμινοξζα Trp20, Phe122 και Trp219 ωζρονται απζναντι από το ενεργό κζντρο και είναι αυτά που πικανότατα εμωανίηουν υδρόωοβεσ αλλθλεπιδράςεισ με το υπόςτρωμα (Urzhumtsev, et al. 1997). ε μελζτθ που ζγινε με 14 ςφμπλοκα τθσ ALR2 με διάωορουσ αναςτολείσ βρζκθκε ότι το καταλυτικό κζντρο αποτελείται από τα αμινοξζα Trp20, Tyr48, Val47, His110, Trp79, Trp111 και το ςυνζνηυμο NADP +. ε αντίκεςθ με τθ ςτακερότθτα ςτθ δομι και τουσ δεςμοφσ αναςτολζα-ενηφμου αυτισ τθσ περιοχισ, ςε μια δεφτερθ περιοχι ςφνδεςθσ (specifity pocket, Εικόνα 2), οι δεςμοί αναςτολζα και ενηφμου παρουςιάηουν ςθμαντικι μεταβλθτότθτα (Klebe, et al. 2004). Οι Trp219 και Leu300 βρίςκονται ςτθν specifity pocket (περιοχι 13

14 εκλεκτικότθτασ) του ενηφμου (El-Kabbani and Podjarny 2007) και θ αλλθλεπίδραςθ με αυτά αποδίδει χαρακτθριςτικά εκλεκτικότθτασ ςτουσ αναςτολείσ ζναντι τθσ αναγωγάςθσ των αλδεχδϊν (αναωζρεται εκτενζςτερα παρακάτω). Σα αμινοξζα του ενεργοφ κζντρου που κεωροφνται κυρίωσ υπεφκυνα για τθν αλλθλεπίδραςθ με τουσ αναςτολείσ είναι τα Tyr48, His110, Trp111 [Εικόνα 2, (Klebe, et al. 2004). Από τισ αλλθλεπιδράςεισ με αυτά κρίνεται θ αποτελεςματικότθτα του εκάςτοτε αναςτολζα (Zhao, et al. 2008). Η ενηυμικι αντίδραςθ ξεκινά με τθ ςφνδεςθ του ςυνενηφμου NADPH ςτο αποζνηυμο και ακολουκεί θ ςφνδεςθ του υποςτρϊματοσ και θ ζναρξθ τθσ κατάλυςθσ. Σζλοσ το ανθγμζνο υπόςτρωμα απελευκερϊνεται και το οξειδωμζνο NADP + αποδεςμεφεται από το ςφμπλοκο *Εικόνα 3, (Constantino, et al. 1999)+. Η κατάλυςθ αωορά μεταωορά υδριδίου από το ςυνζνηυμο και ςτθ ςυνζχεια πρωτονίωςθ από τθν Tyr48. τθ διαδικαςία ςυμμετζχει θ His110 που κακιςτά το ωαινολικό -ΟΗ πολικότερο (El- Kabbani, et al. 2004). Άλλοι ςυγγραωείσ προτείνουν και τθν ςυμμετοχι τθσ Lys77 και Asp43. Η Asp43 βρίςκεται ςτθν ιονιςμζνθ τθσ μορωι ςχθματίηοντασ εςωτερικό άλασ με τθν Lys77 και θ τελευταία με τθν ςειρά τθσ ςχθματίηει δεςμό υδρογόνου με τθν Tyr48 κακιςτϊντασ ευκολότερθ τθν απόςπαςθ του ωαινολικοφ πρωτονίου (Petrash 2004). ΕΙΚΟΝΑ 3 ΛΔΑΒΞΚΘΙΖ ΞΔΞΡ ΩΜ ΟΞΚΣΞΚΩΜ Η ALR2 είναι το πρϊτο ζνηυμο τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν και καταλφει τθν αντίδραςθ αναγωγισ τθσ γλυκόηθσ προσ ςορβιτόλθ χρθςιμοποιϊντασ ωσ ςυνζνηυμο το NADPH. Η οδόσ περιλαμβάνει και μια δεφτερθ αντίδραςθ, αωυδρογόνωςθσ, που καταλφεται από τo ζνηυμο αωυδρογονάςθ τθσ ςορβιτόλθσ 14

15 (SDH, EC ) και οδθγεί ςτθν παραγωγι ωρουκτόηθσ (Εικόνα 4). Κακοριςτικό για το ρυκμό τθσ μεταβολικισ οδοφ είναι το πρϊτο ςτάδιο του μονοπατιοφ (Petrash 2004). Πρζπει να τονιςτεί ότι θ οδόσ αυτι εμωανίηεται ενεργι και εμπλζκεται ςε πακολογικζσ καταςτάςεισ των κυττάρων, ενϊ εμωανίηεται ιςςονοσ ςθμαςίασ ωυςιολογικά (James and Crabbe 1991). ΕΙΚΟΝΑ 4 Τπό ωυςιολογικζσ ςυνκικεσ, το ζνηυμο που ευκφνεται για το μεταβολιςμό τθσ γλυκόηθσ είναι θ εξoκινάςθ. ε ςυνκικεσ υπεργλυκαιμίασ ωςτόςο, και ιδιαιτζρωσ ςε μθ ινςουλινο-εξαρτϊμενουσ ιςτοφσ, θ αφξθςθ τθσ ενδοκυτταρικισ γλυκόηθσ προκαλεί τον κορεςμό τθσ εξoκινάςθσ και ποςοςτό μεγαλφτερο του 30% τθσ γλυκόηθσ μεταβολίηεται από τθ χαμθλισ ςυγγζνειασ ALR2, διαμζςου τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν (Yabe-Nishimura 1998). Η παραγόμενθ ςορβιτόλθ μεταβολίηεται ςτθν ςυνζχεια προσ ωρουκτόηθ από το δεφτερο ζνηυμο τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν, τθν SDH. Η SDH χρθςιμοποιεί ωσ ςυνζνηυμο το NAD + και ο ρυκμόσ κατάλυςισ τθσ είναι ςαωϊσ χαμθλότεροσ αυτοφ τθσ ALR2 με αποτζλεςμα τθν ενδοκυτταρικι αφξθςθ και ςυςςϊρευςθ ςορβιτόλθσ, που ωσ πολικι πολυαλκοόλθ δεν διαχζεται εφκολα διαμζςου των μεμβρανϊν (James and Crabbe 1991). ΗΔΩΠΘΔΡ ΓΘΑ ΖΜ ΔΛΟΚΞΙΖ ΖΡ ALR2 ΡΖΜ ΔΛΤΑΜΘΡΖ ΩΜ ΥΠΞΜΘΩΜ ΔΟΘΟΚΞΙΩΜ ΞΣ ΡΑΙΥΑΠΩΔΞΣΡ ΔΘΑΒΖΖ Ο ςακχαρϊδθσ διαβιτθσ είναι μια πολυπαραγοντικι μεταβολικι νόςοσ που εμωανίηεται ςτο 6-20% του πλθκυςμοφ των Δυτικϊν χωρϊν, και αναμζνεται να επθρεάηει τισ ηωζσ 220 εκατομμυρίων ανκρϊπων ζωσ και το 2010 (Zimmet, et al. 2001). Σο διαβθτικό άτομο, πζρα από τισ οξείεσ επιπλοκζσ (όπωσ θ διαβθτικι κετοοξείδωςθ) που ςχετίηονται με τθν ζλλειψθ ινςουλίνθσ, ζχει τθν τάςθ προσ ανάπτυξθ των χρόνιων επιπλοκϊν που είναι κυρίωσ υπεφκυνεσ για τα υψθλά επίπεδα κνθςιμότθτασ που παρατθροφνται ςε διαβθτικοφσ αςκενείσ (Fujisawa, et al. 2004). 15

16 Οι χρόνιεσ επιπλοκζσ του διαβιτθ μποροφν να διαχωριςτοφν ςε αγγειακισ και μθ προζλευςθσ. Οι αγγειακισ προζλευςθσ υποδιαιροφνται ςε μικροαγγειακζσ (μικροαγγειοπάκειεσ) όπωσ θ ρετινοπάκεια, νευροπάκεια και θ νεωροπάκεια, και μακροαγγειακζσ (μακροαγγειοπάκειεσ) όπωσ θ ςτεωανιαία νόςοσ, οι περιωερικζσ αγγειοπάκειεσ και αγγειοπάκειεσ του εγκεωάλου (Constantino, et al. 1999). Οι μθ αγγειακζσ επιπλοκζσ αωοροφν πακολογικζσ καταςτάςεισ όπωσ θ γαςτροπάρεςθ, θ ςεξουαλικι δυςλειτουργία και δερματοπάκειεσ (Tripathy and Srivastava 2006). Ωσ ςυνδετικόσ κρίκοσ μεταξφ του ςακχαρϊδουσ διαβιτθ και των χρόνιων επιπλοκϊν του κεωρείται θ υπεργλυκαιμία, που προκαλείται από τθν αδυναμία ρφκμιςθσ των επιπζδων γλυκόηθσ (Rolo and Palmeira 2006). Σο κοινό ςτοιχείο που παρουςιάηουν τα πλθγζντα κφτταρα είναι θ ανικανότθτα μείωςθσ τθσ μεταωοράσ γλυκόηθσ ςτο κφτταρο όταν υπάρχει εξωκυτταρικό πλεόναςμα (Nishikawa, et al. 2000). Οι προτεινόμενοι μοριακοί μθχανιςμοί που εμπλζκονται είναι κυρίωσ τζςςερισ: 1) Αυξθμζνθ ροι διαμζςου τθσ μεταβολικισ οδοφ των πολυολϊν, 2) Αυξθμζνοσ ςχθματιςμόσ τελικϊν προϊόντων γλυκοηυλίωςθσ (AGEs) 3) Επαγόμενθ από τθ γλυκόηθ ενεργοποίθςθ των ιςομορωϊν τθσ πρωτεϊνικισ κινάςθσ C (PKC) και 4) Αυξθμζνθ παραγωγι ενεργϊν μορωϊν οξυγόνου (ROS) (Nishikawa, et al. 2007, De Vriese, et al. 2000). Ο Nishikawa και οι ςυνεργάτεσ του πρότειναν ότι θ οδόσ των πολυολϊν ι ο ςχθματιςμόσ ROS κα μποροφςαν να αποτελοφν τθν απαρχι όλων των βιοχθμικϊν ανωμαλιϊν που παρατθροφνται (Nishikawa, et al. 2000). Ο Brownlee αποτζλεςε υποςτθρικτι τθσ δεφτερθσ άποψθσ, και ςυγκεκριμζνα υποςτιριξε ότι θ υπερπαραγωγι ρίηασ ανιόντοσ οξυγόνου ςτθν αλυςίδα μεταωοράσ θλεκτρονίων ςτα μιτοχόνδρια είναι το κοινό ςτοιχείο που ςυνδζει τουσ τζςςερισ μθχανιςμοφσ (Brownlee 2001). Ωςτόςο, αυτι θ κεϊρθςθ δεν υποςτθρίηεται από πειραματικά δεδομζνα όςον αωορά τθν οδό των πολυολϊν και ο Obrosova και οι ςυνεργάτεσ του κεϊρθςαν πικανότερο θ οδόσ των πολυολϊν να ζχει αυτό το ρόλο (Obrosova, et al. 2003). Η προκφπτουςα αντιπαράκεςθ προκφπτει πικανόν από τουσ πολλαπλοφσ αλλθλοςυςχετιςμοφσ και απαιτείται περαιτζρω ζρευνα για τθ διαλεφκανςθ του ηθτιματοσ. Οι πρωτογενείσ ςυνζπειεσ τθσ υψθλισ ενδοκυτταρικισ ροισ γλυκόηθσ διαμζςου τθσ οδοφ των πολυολϊν (Εικόνα 5) μποροφν να ςυνοψιςκοφν ςτα: 1) ωςμωτικό stress 2) οξειδωτικό stress, 3) αναγωγικό stress, 4) γλυκοηυλιωτικό (glycative) stress και 5) stress που προζρχεται από τθν ενεργοποίθςθ τθσ πρωτεϊνικισ κινάςθσ C (PKC) (Mylari, et al. 2005). 1) Σο ωςμωτικό stress προκαλείται από ςυςςϊρευςθ ςορβιτόλθσ ενδοκυτταρικά, που οδθγεί ςε υπερενυδάτωςθ των κυττάρων, διαταραχζσ τθσ ιςορροπίασ θλεκτρολυτϊν και ςυνεπϊσ ςε διόγκωςι τουσ και ςε διαταραχζσ τθσ 16

17 κυτταρικισ μεμβράνθσ (Demopoulos, et al. 2005, Srivastava, et al. 2005). Επιπρόςκετα, θ ςθμαντικι ελάττωςθ ςτα επίπεδα ταυρίνθσ και μυοϊνοςιτόλθσ δρουν ςυνεργιςτικά ςτον εκωυλιςμό των κυττάρων. ΕΙΚΟΝΑ 5 2) Οξειδωτικό stress. Η μείωςθ των επιπζδων του NADPH επθρεάηει τθν διατιρθςθ του αντιοξειδωτικοφ ςυςτιματοσ τθσ αναγωγάςθσ τθσ γλουτακειόνθσ (GSH), που διατθρεί ςτακερά τα επίπεδα τθσ γλουτακειόνθσ ςτουσ ιςτοφσ (Yabe- Nishimura 1998). Σο ςυνολικό αποτζλεςμα είναι περιοριςμόσ των αντιοξειδωτικϊν ςυςτθμάτων του κυττάρου, αωινοντασ το ευάλωτο ςτθν προςβολι από ελεφκερεσ ρίηεσ που παράγονται κατά τθ διάρκεια ωυςιολογικϊν κυτταρικϊν λειτουργιϊν όπωσ θ μεταωορά θλεκτρονίων ςτθν αναπνευςτικι αλυςίδα ςτα μιτοχόνδρια. Επιπλζον, θ ςυςςϊρευςθ τθσ ςορβιτόλθσ και το ςχετικό ωςμωτικό stress που προκαλείται είναι ακόμθ ζνασ παράγοντασ ςτθν πρόκλθςθ οξειδωτικοφ stress διαμζςου και τθσ ενεργοποίθςθσ τθσ οξειδάςθσ του NADH που αυξάνει τθν παραγωγι ριηϊν ανιόντοσ υδροξειδίου (Vincent, et al. 2004). 3) Αναγωγικό stress (ψευδοχποξία). Όπωσ προαναωζρκθκε, θ υπερβολικι κατανάλωςθ NADPH και NAD + διαμζςου τθσ οδοφ των πολυολϊν ςε ςυνδυαςμό με τθν αυξθμζνθ ροι μπορεί να οδθγιςει ςε αντιςτροωι τθσ οξειδοαναγωγικισ κατάςταςθσ των πυριδινικϊν ςυνενηφμων. Επιπρόςκετα, το πλεόναςμα NADH ςε ςχζςθ με το NAD + (κατανάλωςθ του τελευταίου ςτο δεφτερο ςτάδιο αντιδράςεων τθσ οδοφ των πολυολϊν) και θ ςυνεπαγόμενθ αλλαγι τθσ 17

18 αναλογίασ τουσ ενδοκυτταρικά, εγκακιςτά ζνα μεταβολικό ωαινότυπο υποξίασ (Demopoulos, et al. 2005, Srivastava, et al. 2005). Η ψευδοχποξία πυροδοτεί μια διαδοχι βιοχθμικϊν αλλαγϊν που ςυνειςωζρουν ςτθν ανάπτυξθ των χρόνιων επιπλοκϊν ςτουσ διαβθτικοφσ ιςτοφσ που προςβάλλουν. 4) Γλυκοηυλιωτικό (Glycative) stress. Η ωρουκτόηθ, ωσ προϊόν τθσ οδοφ των πολυολϊν μετατρζπεται ςε 3-ωωςωορικι ωρουκτόηθ από τθν δράςθ του ενηφμου 3-ωωςωοκινάςθ, οδθγϊντασ ςτο ςχθματιςμό τθσ 3-δεοξυγλυκοηόνθσ (3- deoxyglucosone), το κυρίωσ πρόδρομο μόριο ςτο ςχθματιςμό των τελικϊν προϊόντων γλυκοηυλίωςθσ (Advanced Glycation End products) AGEs (Yan, et al. 2003). Ο ςχθματιςμόσ AGE διαμζςου AR-εξαρτϊμενων και μθ μθχανιςμϊν και θ αλλθλεπίδραςι τουσ με τον RAGE (Receptor for AGE, υποδοχζασ των AGE) αποτελεί τθν ενεργοποίθςθ μονοπατιϊν μεταγωγισ ςθμάτων (Yan, et al. 2003), εξαιτίασ τθσ ενεργοποίθςθσ πλειάδασ μεταγραωικϊν παραγόντων καταλιγοντασ τελικά ςτθν παραγωγι ελευκζρων ριηϊν και ςτθν πρόκλθςθ πακολογικϊν αλλαγϊν ςτθν ζκωραςθ γονιδίων (Tripathy and Srivastava 2006). 5) Προκαλοφμενο από τθν PKC stress. Η αφξθςθ ςτο λόγο NADH:NAD +, εξαιτίασ τθσ αωυδρογονάςθσ τθσ ςορβιτόλθσ, ενεργοποιεί τθν αναγωγι τθσ ωωςωορικισ διυδροξυακετόνθσ προσ 3-ωωςωορικι γλυκερόλθ που αποτελεί πρόδρομο μόριο τθσ διακυλογλυκερόλθσ (DAG) (Ramana, et al. 2006). Αφξθςθ των επιπζδων τθσ DAG ενεργοποιεί τισ ιςομορωζσ τθσ PKC (Ramana, et al. 2004) και οδθγεί ςτθν ενεργοποίθςθ των MAPKs που ωωςωορυλιϊνουν μεταγραωικοφσ παράγοντεσ και ζτςι τροποποιοφν τθν ιςορροπία τθσ ζκωραςθσ γονιδίων γονίδια stress όπωσ αυτά των heat shock πρωτεϊνϊν και τθσ c-jun κινάςθσ αυξάνονται μετά τθν ενεργοποίθςθ τθσ PKC και μποροφν να οδθγιςουν ςε απόπτωςθ (Vincent, et al. 2004). Με ποιον τρόπο και ςε ποιο βακμό οι βιοχθμικζσ αυτζσ ανωμαλίεσ επθρεάηουν τα κφτταρα εξαρτάται από τισ διαωορζσ μεταξφ των κυττάρων-ςτόχων ςτουσ ιςτοφσ και ςτα όργανα. υνεπϊσ, θ επίδραςθ τθσ αυξθμζνθσ ροισ διαμζςου τθσ οδοφ των πολυολϊν εξετάηεται ςε κακεμιά από τισ χρόνιεσ επιπλοκζσ του διαβιτθ. ΔΘΑΒΖΘΙΖ ΑΛΤΘΒΚΖΡΠΞΔΘΔΞΟΑΗΔΘΑ ΙΑΘ ΙΑΑΠΠΑΙΖΡ Σο ωςμωτικό stress ςτο ωακό του οωκαλμοφ διαταράςςει τθν κυτταρικι μεμβράνθ, προκαλϊντασ διαρροι αμινοξζων, GSH και μυοϊνοςιτόλθσ οδθγϊντασ τελικά ςτο ςχθματιςμό καταρράκτθ (Yabe-Nishimura 1998). Επιπρόςκετα, θ AR εμπλζκεται ςτθν αμωιβλθςτροειδοπάκεια (ρετινοπάκεια) διαμζςου μιασ πλθκϊρασ μονοπατιϊν μεταγωγισ ςθμάτων όπωσ θ ενεργοποίθςθ του πυρθνικοφ παράγοντακβ [Nuclear Factor-κΒ (NF-κΒ)+ κακϊσ επίςθσ και θ ρφκμιςθ τθσ χθμειοτακτικισ πρωτεΐνθσ των μονοκυττάρων [Monocyte Chemotactic Protein-1 (MCP-1)] που 18

19 ςυντελεί ςτον ςχθματιςμό μεμβρανϊν επί του αμωιβλθςτροειδοφσ ςτον οωκαλμό διαβθτικϊν (Harada, et al. 2006). Επίςθσ, ςτον αμωιβλθςτροειδι, αυξθμζνθ δραςτθριότθτα τθσ AR διευρφνει το οξειδωτικό stress και αυξάνει τθ μεταγραωι του ενδοκθλιακοφ παράγοντα ανάπτυξθσ [Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)]. Οι αλλαγζσ ςτθ διαπερατότθτα των αγγείων και το οξειδωτικό stress μποροφν να αποωευχκοφν με τθ χριςθ ARI (Obrosova, et al. 2003). Άλλοσ ζνασ τρόποσ με τον οποίο θ AR εμπλζκεται ςτον αμωιβλθςτροειδι των διαβθτικϊν είναι διαμζςου τθσ ενεργοποίθςθσ τθσ πολυ(adp-ριβοηυλο)πολυμεράςθσ (PARP). Η ενεργοποίθςθ τθσ PARP τείνει να κεωρθκεί ωσ ο κεμελιϊδθσ μθχανιςμόσ όχι μόνο ςτθν πακογζνεςθ τθσ διαβθτικισ αμωιβλθςτροειδοπάκειασ, αλλά και ςτθν ενδοκθλιακι δυςλειτουργία ι/και ςτθ δυςλειτουργία του μυοκαρδίου, κακϊσ και ςτθν περιωερικι νευροπάκεια (Obrosova, et al. 2006). ΑΓΓΔΘΑΙΔΡ ΔΟΘΟΚΞΙΔΡ Η ενεργοποίθςθ τθσ οδοφ των πολυολϊν μπορεί να προκαλζςει τοξικότθτα ςτα ενδοκθλιακά κφτταρα διαμζςου επαγωγισ οξειδωτικοφ stress αλλά όχι μζςω ωςμωτικοφ stress (Oyama, et al. 2006). Η μείωςθ των επιπζδων του NADPH, εξαιτίασ τθσ μεγάλθσ κατανάλωςισ του από τθν οδό των πολυολϊν, μπορεί να προκαλζςει δυςλειτουργίεσ ςε NADPH-εξαρτϊμενα ζνηυμα ςυμπεριλαμβανομζνων των NO-ςυνκετάςθ και αναγωγάςθ τθσ γλουτακειόνθσ. (De Vriese, et al. 2000, Rösen, et al. 2001). Επιπλζον, θ ARL-2 ενεργοποιεί τθν PKC, τον NF-κB και τθν AP-1 (Activator Protein 1) που οδθγοφν ςε αφξθςθ τθσ ωλεγμονισ των αγγείων και τθσ ςυγκόλλθςθσ παραγόντων του αιμοποιθτικοφ (Ramana, et al. 2004). Όλα τα προθγοφμενα υποςτθρίηονται από τθν πρόςωατθ ανακάλυψθ ότι θ υπερζκωραςθ τθσ ALR-2 ςε ποντικοφσ που απουςιάηει ο LDL υποδοχζασ οδθγεί ςε αφξθςθ του μεγζκουσ των ακθρωματικϊν πλακϊν όταν τα ποντίκια καταςτάκθκαν διαβθτικά με αγωγι ςτρεπτοηοτοςίνθσ (Gleissner, et al. 2008). ΔΘΑΒΖΘΙΖ ΜΔΣΠΞΟΑΗΔΘΑ Πειραματικζσ μελζτεσ υποδεικνφουν τθν πολυπαραγοντικι πακογζνεςθ τθσ διαβθτικισ νευροπάκειασ με πολφπλοκεσ αλλθλεπιδράςεισ μεταξφ των μεταβολικϊν και αγγειακϊν ανωμαλιϊν. Η νευροπάκεια μπορεί να προκλθκεί από βλάβθ του παρεγχφματοσ των νευρικϊν κυττάρων και από νευρωνικι ιςχαιμία που οδθγεί ςε βλάβεσ τθσ μικροκυκλοωορίασ (Tripathy and Srivastava 2006). Ο Rösen και οι ςυνεργάτεσ του κεωροφν ότι θ ψευδοχποξία μπορεί να ζχει κραταιό ρόλο, ςυνοδευόμενθ από οξειδωτικό stress (Rösen, et al. 2001). Εξετάηοντασ από μια άλλθ οπτικι γωνία, ο Vincent και οι ςυνεργάτεσ του, υποδεικνφουν τον κυρίαρχο ρόλο του οξειδωτικοφ stress ςτθν πακογζνεςθ τθσ διαβθτικισ νευροπάκειασ. Σο 19

20 οξειδωτικό stress μπορεί να προζρχεται από υπερβολικι ροι διαμζςου τθσ οδοφ των πολυολϊν, από AGE, από ενεργοποίθςθ τθσ PKC και από αποςφηευξθ τθσ αναπνευςτικισ αλυςίδασ ςτα μιτοχόνδρια (Vincent, et al. 2004). τοιχεία για τθ ςυμμετοχι τθσ οδοφ των πολυολϊν προκφπτουν και από μελζτεσ του γονιδίου τθσ ανκρϊπινθσ ALR2 (ΑΚΡ1Β1) και πολυμορωιςμϊν αυτοφ που υποδεικνφουν ότι γονότυποσ όπου υπερκεωράηεται θ ALR2 ςυνοδεφεται από αυξθμζνεσ αγγειακζσ επιπλοκζσ και πρϊιμουσ δείκτεσ νευροπάκειασ, ενϊ αυτά εμωανίηουν ωκίνουςα πορεία ςε γονότυπουσ που θ ALR2 ζχει ελαττωμζνθ ζκωραςθ (Edwards, et al. 2008). ΔΘΑΒΖΘΙΖ ΜΔΤΠΞΟΑΗΔΘΑ Αλλαγζσ ςτθ μορωολογία και λειτουργικότθτα των κυττάρων προκαλοφνται ςε κυτταρικό επίπεδο ςε ςωλθνοειδείσ και ςωαιροειδείσ περιοχζσ κατά το διαβιτθ, ςυχνά προθγοφμενα δυςλειτουργίασ. Η PKC ωαίνεται να ζχει κραταιό ρόλο ςτθ διαβθτικι νεωροπάκεια, κακϊσ θ ενεργοποίθςι τθσ επάγει αφξθςθ ςτθν παραγωγι προςταγλανδινϊν ςτισ ςωαιροειδείσ περιοχζσ και απϊλεια τθσ ςυςταλτικισ ικανότθτασ των κυττάρων οδθγϊντασ ςε υπερδιικθςθ και δυςλειτουργία (Dunlop 2000). Επίςθσ ο ςχθματιςμόσ AGE και θ περαιτζρω αλλθλεπίδραςι τουσ με τον RAGE ωαίνεται πολφ μεγάλθσ ςθμαςίασ όπωσ υποςτθρίηουν πειραματικά δεδομζνα (Suzuki, et al. 1999, Horie, et al. 1997). Σζλοσ, μείωςθ ςτθ ςωαιροειδικι διικθςθ μπορεί να εμπλζκει και τον νεωρικό VEGF, κακϊσ τα επίπεδά του αυξάνονται ςε προκλινικά μοντζλα του διαβιτθ (Tripathy and Srivastava 2006). ΤΣΡΘΞΚΞΓΘΙΞΡ ΠΞΚΞΡ ΖΡ ALR2 Κινθτικζσ και δομικζσ μελζτεσ επί τθσ ALR2 υποδεικνφουν ότι θ γλυκόηθ δεν αποτελεί το κυρίωσ υπόςτρωμά τθσ. Για τον λόγο αυτό ςε ωυςιολογικζσ ςυνκικεσ θ αναγωγι τθσ γλυκόηθσ από τθν ALR2 ζχει μόνο επικουρικό ρόλο. Επιπλζον, οι κφριοι δεςμοί ςυνάωειασ που αναπτφςςονται ανάμεςα ςτο ζνηυμο και τα υποςτρϊματά του είναι υδρόωοβεσ αλλθλεπιδράςεισ και όχι δεςμοί υδρογόνου όπωσ ςτθν περίπτωςθ τθσ γλυκόηθσ (Wilson, et al. 1992, Rondeau, et al. 1992). τον οργανιςμό, καλά υποςτρϊματα τθσ ALR2 αποτελοφν βιογενείσ αλδεψδεσ, παράγωγα του μεταβολιςμοφ ςτεροειδϊν, κατεχολαμινϊν και ωωςωολιπιδίων. Η ALR2 εμωανίηεται ιδιαιτζρωσ δραςτικι ςτθν αναγωγι αλδεχδϊν C6-C18 (υδροξυνονενάλθ, μεκυλγλυοξάλθ, 3-δεοξυγλυκοηόνθ), που παράγονται κατά τθ λιπιδικι υπεροξείδωςθ και των προϊόντων ςφηευξθσ αυτϊν με γλουτακειόνθ. Επίςθσ εμωανίηεται δραςτικι ζναντι τοξικϊν αλειωατικϊν και αρωματικϊν αλδεχδϊν. Η αναγωγι των παραπάνω από τθν ALR2 υποδεικνφει ζναν τρόπο αποτοξίνωςθσ του οργανιςμοφ από τισ ιςχυρά δραςτικζσ αλδεψδεσ (Kumar and Reddy 2007, Vander Jagt, et al. 1992, Petrash 2004). 20

21 Η ALR2, επίςθσ, ωαίνεται να εμπλζκεται ςτθν κινθτικότθτα, διαμζςου τθσ παραγωγισ ωρουκτόηθσ ωσ πθγισ ενζργειασ, και ωρίμανςθ των ςπερματοηωαρίων, όπου αν και ςε βοοειδι ωαίνεται να παίηει ςθμαντικό ρόλο δεν ζχει αποδειχκεί κάτι τζτοιο και για το ανκρϊπινο είδοσ όπου ωαίνεται να ςυμμετζχουν περιςςότερο άλλοι παράγοντεσ (Frenette, et al. 2006). Σζλοσ, ωαίνεται να ζχει ωςμορυκμιςτικό ρόλο ςτουσ νεωροφσ όπου θ διαμζςου τθσ οδοφ των πολυολϊν παραγωγι ςορβιτόλθσ ςε ςυνεργαςία με τθν μυο-ινοςιτόλθ και άλλουσ ωςμολφτεσ ρυκμίηουν τθν απόκριςθ των κυττάρων τθσ μυελϊδουσ μοίρασ ςε αλλαγζσ τθσ τονικότθτασ (Yancey, et al. 1982). Σζλοσ θ ALR2 ωαίνεται να εμπλζκεται και ςε πακολογικζσ καταςτάςεισ πζραν του ςακχαρϊδουσ διαβιτθ. Σζτοια παραδείγματα αποτελοφν καρδιαγγειακζσ πακιςεισ (Ramasamy, et al. 1999, Hwang, et al. 2002), διαταραχζσ τθσ διάκεςθσ (Viinamäki, et al. 1995), νεωρικι ανεπάρκεια (Hasuike, et al. 2007), ανωμαλίεσ των ωοκθκϊν (Meyer, et al. 1992), κακϊσ επίςθσ και ςε ωλεγμονϊδεισ διεργαςίεσ (Yang, et al. 1998). Σζλοσ θ υπερζκωραςθ τθσ ALR2 ζχει βρεκεί να ςυςχετίηεται με μθχανιςμοφσ αντίςταςθσ ςε αντικαρκινικά ωάρμακα (Petrash 2004) και γενικότερα υπάρχει ςυςχζτιςθ με τθν ALR2 και καρκινϊματα κακϊσ θ πρϊτθ εμπλζκεται ςε μονοπάτια μεταγωγισ ςθμάτων που ςχετίηονται με τθν κυτταρικι ανάπτυξθ και τον κυτταρικό πολλαπλαςιαςμό (Kumar and Reddy 2007). ΈΜΕΣΛΞ ΖΡ ΑΜΑΓΩΓΑΡΖΡ ΩΜ ΑΚΔΔΫΔΩΜ (ALR1) ΓΔΜΘΙΑ ΡΞΘΥΔΘΑ ΖΡ ALR-1 Η αναγωγάςθ των αλδεχδϊν (ALR1, EC ) αναγνωρίςτθκε από τον Hers (Hers 1960) ωσ ζνηυμο που ανάγει τθ γλυκεριναλδεψδθ και άλλεσ αλδόηεσ (αλλά όχι τθ γλυκόηθ), και απομονϊκθκε από τον Mano και τουσ ςυνεργάτεσ του από ιπαρ αρουραίου λίγο αργότερα (Mano, et al. 1961). Κακϊσ εμωανίηει ευρφ ωάςμα υποςτρωμάτων, ζχει αναωερκεί με διάωορα ονόματα μερικά εκ των οποίων είναι υψθλισ K m αναγωγάςθ των αλδεχδϊν, L-εξανοϊκι αωυδρογονάςθ (L-hexonate dehydrogenase) και αναγωγάςθ του γλυκουρονικοφ οξζοσ (Poulsom 1986). Απαντάται ςε κθλαςτικά, αμωίβια, ωυτά, μφκθτεσ, πρωτόηωα και βακτιρια και μεταβολίηει ζνα ευρφ ωάςμα υποςτρωμάτων όπωσ αλειωατικζσ και αρωματικζσ αλδεψδεσ, μονοςακχαρίτεσ, ςτεροειδι, προςταγλανδίνεσ, πολυκυκλικοφσ αρωματικοφσ υδρογονάνκρακεσ και ιςοωλαβονοειδι (Jez, et al. 1997). ε κθλαςτικά, εντοπίηεται κυρίωσ ςτουσ νεωροφσ και το ιπαρ, κακϊσ και ςε μικρότερθ 21

22 ζκταςθ ςτθν καρδιά και τον εγκζωαλο (Davidson, et al. 1978), όπου ζχει αναωερκεί και ο ρόλοσ τθσ ςτον μεταβολιςμό βιογενϊν αλδεχδϊν παραγόμενων από τθ δράςθ τθσ μονοαμινοξειδάςθσ (Turner, et al.1974). ΕΙΚΟΝΑ 6 Επίςθσ, μεταξφ των διαωόρων υποςτρωμάτων τθσ ALR1 ςυγκαταλζγονται και τοξικζσ αλδεχδικζσ μορωζσ και κυρίωσ 2-οξοαλδεψδεσ όπωσ θ 3-δεοξυγλυκοηόνθ (3- DG) (Ratliff, et al. 1996, Van Zandt, et al. 2005). Σο δικαρβονυλικό αυτό παράγωγο αποτελεί προϊόν αποικοδόμθςθσ τθσ γλυκόηθσ και τθσ ωρουκτόηθσ (δθλαδι ςχθματίηεται κατά τθν αυξθμζνθ ροι διαμζςου τθσ οδοφ των πολυολϊν) αλλά αποτελεί και ενδιάμεςο προϊόν τθσ γλυκοηυλίωςθσ. Είναι δυνατό να αλλθλεπιδράςει με πρωτεΐνεσ με αποτζλεςμα το ςχθματιςμό των τελικϊν προϊόντων γλυκοηυλίωςθσ κακϊσ και να προκαλζςει οξειδωτικό ςτρεσ ςτα κφτταρα τροποποιϊντασ αντιοξειδωτικά ζνηυμα. Η 3-DG μεταβολίηεται προσ 3-δεοξυωρουκτόηθ από τθν ALR1. Επομζνωσ, θ ALR1 μπορεί να χαρακτθριςτεί ωσ ζνα ζνηυμο αυτοάμυνασ του οργανιςμοφ ζναντι τοξικϊν δικαρβονυλίων (Sakiyama, et al. 2006). Πρόκειται για κυτοςολικι πρωτεΐνθ 35 kda που αποτελείται από 325 αμινοξζα (Εικόνα 6) και ανικει ςτθν υπεροικογζνεια των αλδο-κετοαναγωγαςϊν (AKR) (Barski, et al. 1996). Σα μζλθ τθσ υπεροικογζνειασ των AKR αποτελοφνται από αμινοξζα, που ςυνκζτουν μονομερείσ πρωτεΐνεσ που ζχουν πολλά δομικά και λειτουργικά χαρακτθριςτικά (El-Kabbani and Podjarny 2007). υγκεκριμζνα θ τεταρτοταγισ τουσ δομι είναι τθσ μορωισ α/β barrel, ςυνδζονται με το ςυνζνηυμο NADPH, το ενεργό τουσ κζντρο εντοπίηεται ςτο C-τελικό άκρο και ο καταλυτικόσ τουσ μθχανιςμόσ εμπλζκει τθ μεταωορά πρωτονίου από μια τυροςίνθ του ενεργοφ κζντρου (Barski, et al. 1996). 22

23 Σο ςθμείο διαωοροποίθςθσ των διαωόρων μελϊν τθσ υπεροικογζνειασ των AKR εντοπίηεται ςτο C-τελικό άκρο, ςτο ςθμείο όπου εντοπίηεται και το καταλυτικό κζντρο των ενηφμων. Ζτςι, παρόλο που θ ALR1 και θ ALR2 εμωανίηουν 65% δομικι ομοιότθτα και ομοιότθτα αλλθλουχίασ (Jez, et al. 1997), κακοριςτικόσ για τθν εφρεςθ εκλεκτικϊν αναςτολζων είναι ο εντοπιςμόσ των διαωορϊν ςτα καταλυτικά τουσ κζντρα. Οι ομοιότθτεσ μεταξφ τθσ ALR1 και ALR2 εντοπίηονται ςτα παρακάτω ςθμεία: 1. Δομικι ομοιότθτα. Όπωσ ιδθ αναωζρκθκε αποτελοφνται από παραπλιςιο αρικμό αμινοξζων, εμωανίηουν αντίςτοιχθ τεταρτοταγι δομι, ενϊ διαωοροποιιςεισ εντοπίηονται ςτο C-τελικό άκρο (καταλυτικό κζντρο). 2. Λειτουργικι ομοιότθτα. υνδζονται με το ςυνζνηυμο NADPH και καταλφουν τθν αναγωγι αλδεχδικϊν υποςτρωμάτων. Η κατάλυςθ αωορά μεταωορά υδριδίου από το νικοτιναμιδικό ςυνζνηυμο και μεταωορά πρωτονίου από μια τυροςίνθ του καταλυτικοφ κζντρου (Tyr50 ςτθν περίπτωςθ τθσ ALR1 και Tyr48 τθσ ALR2). ΕΙΚΟΝΑ 7 Κρυςταλλογραωικζσ μελζτεσ και μελζτεσ μοριακισ προςομοίωςθσ με αναςτολείσ, υποδεικνφουν μια περιοχι εκλεκτικότθτασ επί του C-τελικοφ άκρου τθσ ALR2. θμαντικά υπόλοιπα τθσ περιοχισ αυτισ αποτελοφν τα αμινοξζα Trp111, Phe122 και Leu300 (Urzhumtsev, et al. 1997). Η τολρεςτάτθ και θ ηοπολρεςτάτθ 23

24 (εκλεκτικοί επί τθσ ALR2 αναςτολείσ, Εικόνα 8) κατά τθ ςφνδεςι τουσ ςτο καταλυτικό κζντρο τθσ ALR2 προκαλοφν αλλαγζσ ςτθ διαμόρωωςθ του ενηφμου, που οδθγοφν ςε ιςχυρότερθ ςφνδεςθ. Κάτι τζτοιο δεν παρατθρείται ςτθν περίπτωςθ τθσ ALR1 εξαιτίασ διαωορϊν ςτθν αλλθλουχία των αμινοξζων. Επίςθσ δεν παρατθρείται θ αυτι ςυμπεριωορά και ςτθν περίπτωςθ των μθ εκλεκτικϊν αναςτολζων όπωσ θ ςορβινίλθ. τθ κζςθ τθσ Leu300 που εντοπίηεται ςτθν περιοχι εκλεκτικότθτασ τθσ ALR2 βρίςκεται υπόλοιπο προλίνθσ (Pro301), επομζνωσ δεν είναι δυνατόσ ο ςχθματιςμόσ δεςμοφ υδρογόνου με αναςτολείσ (El-Kabbani and Podjarny 2007). Ακόμθ ζνα ςθμείο που μπορεί να χρθςιμοποιθκεί για τθν αφξθςθ εκλεκτικότθτασ είναι θ αλλθλεπίδραςθ με τθν Trp219, π.χ. ςτθν περίπτωςθ τθσ ωινταρεςτάτθσ (Εικόνα 9) ο εξωκυκλικόσ αμιδικόσ δεςμόσ τθσ τελευταίασ ςχθματίηει δεςμοφσ Van der Waals με τθν Trp219 (El-Kabbani, et al. 2005). Σζλοσ, θ προτίμθςθ τθσ ALR1 για αρνθτικά ωορτιςμζνα υποςτρϊματα, όπωσ το γλυκουρονικό οξφ, ζχει αποδοκεί ςε αλλθλεπίδραςθ με τθν Arg311 (Barski, et al. 1996). τθν Εικόνα 7 ωαίνονται τα ςθμαντικότερα αμινοξζα του ενεργοφ κζντρου τθσ ALR1. ΑΜΑΡΞΚΔΘΡ ΖΡ ΑΜΑΓΩΓΑΡΖΡ ΖΡ ΑΚΔΞΕΖΡ (ARI) Σο πρϊτο μόριο, που βρζκθκε πωσ μπορεί να παρζμβει ςτθν διαδικαςία του καταρράκτθ διαμζςου αναςτολισ τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ, ιταν το τετραμεκυλογλουταρικό οξφ (Kador, et al. 1985). θμαντικόσ αρικμόσ ενϊςεων ςυντζκθκαν που ωαίνεται να είναι αποτελεςματικοί αναςτολείσ τθσ ALR2 (Demopoulos, et al. 2005). Ωςτόςο, μόνο δυο τάξεισ αναςτολζων, υδαντοΐνεσ και καρβοξυλικά οξζα, ζχουν προχωριςει ςε κλινικζσ δοκιμζσ ωάςθσ ΙΙΙ και μονάχα μια ζνωςθ κυκλοωορεί ωσ ωάρμακο και μονάχα ςτθν Ιαπωνία, θ επαλρεςτάτθ (Nikolaou and Demopoulos 2003). υνοψίηοντασ δεδομζνα που αναωζρκθκαν παραπάνω, οι ARI που ζχουν αναωερκεί εμωανίηουν τα εξισ χαρακτθριςτικά: ωζρουν όξινο υδρογόνο προσ ςχθματιςμό ιοντικισ αλλθλεπίδραςθσ επί του καταλυτικοφ κζντρου του ενηφμου που ωζρει τα υπόλοιπα των αμινοξζων Tyr48, His110, Trp111 και το ςυνζνηυμο NADP +, κακϊσ επίςθσ ωζρουν και ζνα λιπόωιλο τμιμα το οποίο εμωανίηει υδρόωοβεσ αλλθλεπιδράςεισ με λιπόωιλθ περιοχι του ενηφμου. Με βάςθ τθ χθμικι τουσ δομι μποροφμε να κατατάξουμε τουσ ARI ςε τρεισ κατθγορίεσ: 1. Παράγωγα καρβοξυλικϊν οξζων 2. Παράγωγα υδαντοϊνϊν 24

25 3. Ποικίλθσ δομισ ARI ΟΑΠΑΓΩΓΑ ΙΑΠΒΞΝΣΚΘΙΩΜ ΞΝΔΩΜ Η αλρεςτατίνθ, θ τολρεςτάτθ, θ επαλρεςτάτθ και θ ηοπολρεςτάτθ (Εικόνα 8) είναι μερικοί από τουσ πιο γνωςτοφσ ARI ςε αυτιν τθν κατθγορία. Αυτοί οι ARI εμωανίηουν χαμθλι in vivo δραςτικότθτα λόγω τθσ μειωμζνθσ τουσ ικανότθτασ διαπζραςθσ μεμβρανϊν, που αποδίδεται ςτισ μικρζσ τιμζσ pka που εμωανίηουν και ωσ εκ τοφτου ςτον εκτεταμζνο τουσ ιονιςμό ςε ωυςιολογικό ph (7,4) (Bruno, et al. 2002). ΕΙΚΟΝΑ 8 Επιπλζον ζχουν αναωερκεί παράγωγα καρβοξυλικϊν οξζων όπωσ [1,2,4]τριαηινο[4,3-a]βενηιμιδαηολ-4(10H)-ον-3-υλ)οξικά οξζα (Da Settimo, et al. 2001), πυρρολ-1-υλ-οξικά οξζα (Nicolaou and Demopoulos 2003, Zaher, et al. 2002), κειενοκινολινονικά καρβοξυλικά οξζα (Pau, et al. 2004), και ωαινυλοξικά οξζα (Rakowitz, et al. 2006). ΟΑΠΑΓΩΓΑ ΣΔΑΜΞΪΜΖΡ Η ςορβινίλθ και θ ωινταλρεςτάτθ (Εικόνα 9) είναι από τισ πιο δραςτικζσ ενϊςεισ τθσ κατθγορίασ αυτισ. Η ανάπτυξθ υδαντοϊνικϊν παραγϊγων ξεκίνθςε ςαν λφςθ προσ τθν ανεπαρκι ωαρμακοκινθτικι των καρβοξυλικϊν οξζων, κακϊσ παρουςιάηουν υψθλότερεσ τιμζσ pka από τα τελευταία. Σα υδαντοΐνικά παράγωγα είναι αςκενϊσ όξινα (pka>8) με αποτζλεςμα να είναι κατά κφριο λόγο μθ ιονιςμζνα ςτο ωυςιολογικό ph και ζτςι να εμωανίηουν μεγάλθ διαπερατότθτα διαμζςου μεμβρανϊν, άρα να εμωανίηουν μεγάλθ βιοδιακεςιμότθτα και ευρφ ωάςμα ενεργειϊν ςτουσ ιςτοφσ. Ωςτόςο, μζλθ αυτισ τθσ ομάδασ, ςυμπεριλαμβανόμενθσ και τθσ ςορβινίλθσ, είναι γνωςτό πωσ προκαλοφν αντιδράςεισ υπερευαιςκθςίασ ι θπατοτοξικότθτα και ωσ εκ τοφτου δεν είναι δυνατι θ κλινικι τουσ χριςθ (Pau, et al. 2004). 25

26 ΕΙΚΟΝΑ 9 ΟΞΘΙΘΚΖΡ ΔΞΛΖΡ ARI Για να ξεπεραςτοφν τα προβλιματα που ςυνόδευαν τισ δφο ανωτζρω κατθγορίεσ ARI οι προςεγγίςεισ προσ νζουσ ARI περιλαμβάνουν χθμειότυπουσ που δεν είναι καρβοξυλικά οξζα οφτε υδαντοΐνεσ. Από τισ περιςςότερο γνωςτζσ ενϊςεισ αυτοφ του τφπου είναι θ μιναλρεςτάτθ και θ ρανιρεςτάτθ (Εικόνα 10), ωσ παράγωγα ςπειροςουκινιμιδίων. Επιπλζον, ζχουν αναωερκεί τετραχδροπυρρολο- [1,2-a]πυραηιν-1,3-διόνεσ (Negoro, et al. 1998), 5-αρυλιδεν-2,4-κειαηολιδινενδιόνεσ (Bruno, et al. 2002) και κειοπυρανο[2,3-b]πυριδιν-4(4h)-όνεσ (Da Settimo, et al. 2005). Άλλοι αντιπροςωπευτικοί χθμειότυποι είναι N-νιτρομεκυλςουλωονιλιδικά παράγωγα (Inoue, et al. 2000), ςουλωονυλπυριδαηι-νόνεσ (Mylari, et al. 2005), N- διωκοροωαινολικά παράγωγα (Nicolaou, et al. 2004, Alexiou, et al. 2008) και καρβοξυμεκυλο πυριδοϊνδόλικά παράγωγα (Stefek, et al. 2008). ΕΙΚΟΝΑ 10 26

27 ΟΔΠΘ ΙΑΠΙΘΜΞΣ ΙΑΘ ΙΣΑΠΘΙΖΡ ΔΘΑΤΞΠΞΟΞΘΖΡΖΡ Οι γνϊςεισ που ζχουν ςυςςωρευτεί μζχρι ςιμερα για τθν βιολογία των νεοπλαςματικϊν κυττάρων δείχνουν ότι ο καρκίνοσ αποτελεί μια νόςο όπου θ κυτταρικι ανάπτυξθ και διαωοροποίθςθ εμωανίηονται αςφηευκτεσ (Dinnen and Ebisuzaki 1992). Ακόμθ, ςφμωωνα με τθν άποψθ ότι θ νεοπλαςματικι εξαλλαγι ξεκινά από ζνα κφτταρο (κλϊνοσ), ο καρκίνοσ κεωρείται ότι ξεκινά ςτο επίπεδο των προγονικϊν κυττάρων (stem cells αλλά και early progenitors), που υπάρχουν ςχεδόν ςε όλουσ τουσ ιςτοφσ και ζχουν τθν δυνατότθτα να αναπαράγουν τον εαυτό τουσ (self-renew), να πολλαπλαςιάηονται και να διαωοροποιοφνται. Αρχικά, το καρκίνωμα αναπτφςςεται τοπικά, ςτθ ςυνζχεια διειςδφει ςτουσ περιβάλλοντεσ ιςτοφσ και τζλοσ κάνει μετάςταςθ ςε απομακρυςμζνα όργανα μζςω του ενδοκθλίου των τριχοειδϊν αγγείων και τθσ λζμωου όπου ςχθματίηεται δευτερογενισ εςτία. Οι μεταςτατικοί καρκίνοι αυξάνονται ανεξζλεγκτα και τελικά ςκοτϊνουν τον ωορζα (Tsiftsoglou, et al. 2003b). φμωωνα με τθν κεωρία τθσ πολυςταδιακισ (multistep) καρκινογζνεςθσ, ο καρκίνοσ αναπτφςςεται ςταδιακά διαμζςου τθσ ςυςςϊρευςθσ γενετικϊν αλλαγϊν ςε μοριακό επίπεδο (μεταλλάξεων) που δρουν προοδευτικά από τθ μθ-διειςδυτικι ςε διειςδυτικι νόςο. Η νεοπλαςτικι μεταμόρωωςθ ωαίνεται ότι προκφπτει ςε ςυγκεκριμζνθ αναπτυξιακι ωάςθ και οδθγεί ςτθν απορρφκμιςθ του κυτταρικοφ πολλαπλαςιαςμοφ και ςε αδυναμία των κυττάρων να διαωοροποιθκοφν ςτα τελικά ςτάδια διαωοροποίθςθσ, όπωσ κα ςυνζβαινε ωυςιολογικά (Rifkind, et al. 1996). Πρόςωατα, μια άλλθ κεωρία, αυτι των αρχζγονων καρκινικϊν κυττάρων (cancer stem cells), αποδίδει το ςφνολο των νεοπλαςματικϊν κυττάρων ωσ απογόνουσ (progeny) ενόσ μικροφ πλθκυςμοφ αρχζγονων καρκινικϊν κυττάρων, που ελζγχουν και τθν ανάπτυξθ του όγκου. Σα αρχζγονα καρκινικά κφτταρα μπορεί να προζρχονται είτε από μεταμορωωμζνα ωυςιολογικά αρχζγονα κφτταρα ι από τα περιςςότερο διαωοροποιθμζνα προγονικά (early progenitors) κφτταρα που απζκτθςαν τθν ικανότθτα να αναπαράγουν τον εαυτό τουσ ωσ αποτζλεςμα μεταλλάξεων που οδθγοφν ςε ανεξζλεγκτθ κυτταρικι αναπαραγωγι. Παράλλθλα, τα αρχζγονα καρκινικά κφτταρα μποροφν, όπωσ και τα ωυςιολογικά, να αναπαράγουν τον εαυτό τουσ και να διαωοροποιθκοφν ςε άλλα κφτταρα (Massard, et al. 2006). Οι τελευταίεσ αυτζσ ιδιότθτεσ μποροφν να αποτελζςουν μια καλι εξιγθςθ για τθν ςθμαντικι ετερογζνεια των όγκων, τόςο ςε ωαινοτυπικό επίπεδο όςο και ςτο επίπεδο του δυναμικοφ αναπαραγωγισ, ςυμπλθρωματικι ωσ προσ τθν ιςχφουςα κεωρία των γενετικϊν μεταλλάξεων. 27

28 Ήδθ από το 1968 διατυπϊκθκε θ κεϊρθςθ ότι κάποιεσ νεοπλαςίεσ είναι άμεςα ςχετιηόμενεσ με τισ διαδικαςίεσ που αωοροφν τθν κυτταρικι διαωοροποίθςθ (Markert 1968). Αν και δεν υπάρχει ςαωισ οριςμόσ για τθν διαωοροποίθςθ, ο R. S. Scott τθν ορίηει ωσ τθν πολυςταδιακι αυτι διαδιακαςία όπου διαμζςου τθσ δζςμευςθσ (commitment, determination), ο γενετικόσ προγραμματιςμόσ προσ ζνα ςυγκεκριμζνο είδοσ κυττάρων, εμωανίηει ςτακερι ζκωραςθ (Scott 1997). Ανωμαλίεσ τθσ ωυςιολογικισ διαωοροποίθςθσ, υπό τθν επίδραςθ παραγόντων όπωσ χθμικά καρκινογόνα, ακτινοβολία κ.α. ςυνεπάγονται απϊλεια του ελζγχου τθσ κυτταρικισ αναπαραγωγισ κακϊσ τα κφτταρα παφουν να ακολουκοφν το μονοπάτι που τα οδθγεί ςε τελικι διαωοροποίθςθ και περιοριςμό του αρικμοφ των διαιρζςεϊν τουσ. Τπάρχει αωκονία ςτοιχείων που υποδθλϊνουν ότι οι ωαινοτυπικζσ ςυνζπειεσ τθσ νεοπλαςματικισ μεταμόρωωςθσ (neoplastic transformation) δεν είναι απαραίτθτα μθ αναςτρζψιμεσ, αν και οι γενετικζσ τροποποιιςεισ παραμζνουν ωσ ζχουν. Διάωορεσ ενϊςεισ μποροφν να επάγουν ςτα «μεταμορωωμζνα» κφτταρα τθν ζκωραςθ διαωορετικοφ ωαινοτφπου, ςυμπεριλαμβανομζνθσ τθσ ζναρξθσ του τερματιςμοφ των κυτταρικϊν διαιρζςεων. Επιπλζον, υπάρχουν ςθμαντικά ςτοιχεία που δείχνουν ότι αυτζσ οι ενϊςεισ μποροφν να αποκαταςτιςουν τθν δυνατότθτα προσ διαωοροποίθςθ ςε καρκινικά κφτταρα, και ζτςι να είναι αποτελεςματικοί αντικαρκινικοί παράγοντεσ (Rifkind, et al. 1996). Η άποψθ που άρχιςε να διαμορωϊνεται ςτα τζλθ τθσ δεκαετίασ του 60 ότι ο βακμόσ διαωοροποίθςθσ ενόσ νεοπλάςματοσ είναι κακοριςτικόσ για τθν ζκταςθ τθσ κακοικειασ και τθν πρόγνωςθ τθσ νόςου, ζδωςε το ζναυςμα ςε οριςμζνουσ ερευνθτζσ να υποκζςουν ότι οριςμζνα νεοπλάςματα πικανόν να προζρχονται από πρόδρομα κφτταρα κάκε ιςτοφ, που λόγω γενετικϊν ι επιγενετικϊν μεταβολϊν δεν κατάωεραν να διαωοροποιθκοφν, με αποτζλεςμα να ςυνεχίςουν να αναπτφςςονται αδιαωοροποίθτα. Αποτζλεςμα αυτϊν των απόψεων ιταν να γίνει αποδεκτό ότι υπάρχει κάποια ςτενι ςχζςθ ανάμεςα ςτθ διαωοροποίθςθ και ςτθ νεοπλαςία. Η νζα αυτι τάςθ ςτθ κεραπευτικι του καρκίνου εμπλζκει τθν επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ των κακοικων κυττάρων ςε κφτταρα με μειωμζνο δυναμικό αναπαραγωγισ. Ο ακριβισ μθχανιςμόσ τθσ διαωοροποίθςθσ δεν είναι γνωςτό αν προκφπτει από επαγωγι τθσ τελικισ διαωοροποίθςθσ (παφςθ του κυτταρικοφ κφκλου ςτθ ωάςθ G 0 ), από επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ προσ προθγοφμενθ, μθ κακοικθ μορωι του κυττάρου, ι από ενεργοποίθςθ αποπτωτικϊν (προγραμματιςμζνου κυτταρικοφ κανάτου) μθχανιςμϊν. Είναι επίςθσ πικανό να εμπλζκονται όλα αυτά τα μονοπάτια (Spira and Carducci 2003). H κεραπεία του καρκίνου που ςτθρίηεται ςτθν υπόκεςθ ότι θ μετατροπι των κακοικων κυττάρων ςε τελικϊσ διαωοροποιθμζνα κφτταρα μειϊνει το υψθλό δυναμικό αναπαραγωγισ τουσ και τθν ικανότθτά τουσ να διαπερνοφν ιςτοφσ, μπορεί να παρζχει μια 28

29 εναλλακτικι κεραπεία ςε αντιπαράκεςθ με τθ ςυμβατικι κυτταροτοξικι κεραπεία. Αυτι θ προςζγγιςθ ονομάηεται «διαμζςου τθσ διαωοροποίθςθσ κεραπεία του καρκίνου» ι «κεραπεία διαωοροποίθςθσ» (Differentiation therapy of cancer) (Ishiguro and Sartorelli 2008). Η ςτρατθγικι αυτι είναι ιδιαίτερα ελκυςτικι κακϊσ ςτόχοσ του ωαρμάκου είναι ζνασ επιλεγμζνοσ πλθκυςμόσ κυττάρων και επιτυγχάνεται ςθμαντικι αφξθςθ τθσ εκλεκτικότθτασ, ςε αντίκεςθ με τθν πλειονότθτα των αντικαρκινικϊν ωαρμάκων που είναι κυτταροτοξικά και περιορίηουν τον πολλαπλαςιαςμό των κυττάρων γενικά, ςυμπεριλαμβανομζνων των ωυςιολογικϊν και των ραγδαίωσ αναπτυςςόμενων καρκινικϊν. Η διαμζςου τθσ διαωοροποίθςθσ κεραπεία του καρκίνου μζχρι ςτιγμισ ζχει αποδειχκεί αποτελεςματικι κυρίωσ ςε μθ ςυμπαγείσ όγκουσ. Δφο επαγωγείσ κυτταρικισ διαωοροποίθςθσ, το ATRA (All Trans Retinoic Acid, ρετινοϊκό οξφ) και το SAHA (suberoylanilide hydroxamic acid) ιδθ ζχουν βρει κλινικι εωαρμογι. Σο ATRA χρθςιμοποιείται ιδθ ςτθν οξεία προμυελωτικι λευχαιμία (Tsiftsoglou, et al. 2003b) και υπάρχουν ενκαρρυντικά ςτοιχεία για τθν χρθςιμότθτά του ςε άλλα είδθ οξείων μυελογενϊν λευχαιμιϊν (Waxman 2000). Επίςθσ, τον τελευταίο χρόνο, το SAHA (Vorinostat ) εωαρμόςκθκε κλινικά ςτθν κεραπεία του λεμωϊματοσ των Σ- κυττάρων (Smith and Wilson 2008). Ωςτόςο, αρχζγονα καρκινικά κφτταρα ζχουν πλζον βρεκεί και ςε καρκίνουσ μαςτοφ και ςε οριςμζνα είδθ καρκίνου του εγκεωάλου (Jordan 2004). Επομζνωσ δε κα προκαλζςει ζκπλθξθ θ μελλοντικι εωαρμογι επαγωγζων τθσ διαωοροποίθςθσ και ςτθ κεραπευτικι αυτϊν των νεοπλαςιϊν. Θα πρζπει επίςθσ να επιςθμανκεί θ ςυνδυαςτικι χριςθ κλαςικϊν χθμειοκεραπευτικϊν και κεραπειϊν ακτινοβόλθςθσ με τθν κεραπεία διαμζςου τθσ διαωοροποίθςθσ. Κάποια καρκινικά κφτταρα με μεταςτατικό δυναμικό, εμωανίηονται ανκεκτικά ςτθ χθμειοκεραπεία εξαιτίασ του μειωμζνου δυναμικοφ αναπαραγωγισ τουσ βρίςκονται ςτθν λεγόμενθ κυτταρικι ωάςθ «θρεμίασ». Η κατάςταςθ αυτι ονομάςτθκε «λικαργοσ» (dormancy). Η κατάςταςθ λθκάργου των όγκων ζχει υποτεκεί ότι αποτελεί ζνα κακοριςτικό γεγονόσ ςτθ κεραπεία των κακοικων νεοπλαςιϊν κακϊσ παρουςιάηεται ανκεκτικότθτα ςτουσ κυτταροτοξικοφσ παράγοντεσ. Αυτά τα κφτταρα μποροφν να επιβιϊςουν τθσ χθμειοκεραπείασ και να επιςτρζψουν ςτθν κατάςταςθ ανάπτυξθσ (Massard, et al. 2006). Επομζνωσ, με επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ ςε αυτά τα κφτταρα και τον παράλλθλο περιοριςμό του πολλαπλαςιαςμοφ των ταχζωσ πολλαπλαςιαηόμενων κυττάρων τθσ νεοπλαςίασ με τθν κλαςικι αντιμετϊπιςθ μπορεί να επιτευχκεί πολφ καλφτερο κεραπευτικό αποτζλεςμα. 29

30 ΞΘ ΚΔΣΥΑΘΛΘΔΡ ΩΡ ΔΘΑΑΠΑΥΔΡ ΖΡ ΔΘΑΤΞΠΞΟΞΘΖΡΖΡ ΙΑΘ ΑΟΞΟΩΡΖΡ ΩΜ ΑΘΛΞΟΞΘΖΘΙΩΜ ΙΣΑΠΩΜ Οι λευχαιμίεσ αντιπροςωπεφουν ζνα ςθμαντικό μζροσ των κακοικων νεοπλαςιϊν του αιμοποιθτικοφ ςυςτιματοσ που ςυμβαίνουν ωσ οξείεσ ι χρόνιεσ νόςοι ςε ςχετικά χαμθλι ςυχνότθτα. Αντιπροςωπεφουν μόλισ το 2-3% του ςυνόλου των κακοικων νεοπλαςιϊν ωςτόςο ευκφνονται για το 10% των κανατθωόρων περιςτατικϊν (Hayat, et al. 2007). Τπάρχουν ςτοιχεία που ςυνδζουν τισ λευχαιμίεσ με τθν απορρφκμιςθ τθσ ωυςιολογικισ διαωοροποίθςθσ των αιμοποιθτικϊν κυττάρων (Bonnet and Dick 1997, Tenen 2003). ΕΙΚΟΝΑ 11 Οξοεία ςηπ τσριξλξγικήπ ωοίμαμρηπ ςωμ αιμξπξιηςικώμ κσςςάοωμ και πξοεία ρυημαςιρμξύ λεσυαιμικώμ κσςςάοωμ. Άμερα εμπλεκόμεμεπ ταίμξμςαι αμωμαλίεπ επί ςηπ κσςςαοικήπ διατξοξπξίηρηπ (Tsiftsoglou, et al. 2003b) Ο μυελόσ των οςτϊν του ανκρϊπου περιζχει εμβρυονικά κφτταρα (LT-HSC, Long Term Hematopoietic Stem Cells) που ζχουν τθ δυνατότθτα να αναπαράγουν επ αόριςτον τον εαυτό τουσ (self-renewal) αλλά και να αποδίδουν τουσ διάωορουσ τφπουσ κυττάρων του αιμοποιθτικοφ ςυςτιματοσ (multipotency). Φυςιολογικά, τα LT-HSC αποδίδουν ST-HSC (Short Term Hematopoietic Stem Cells), τα οποία χάνουν 30

31 τθν ιδιότθτα τθσ επ αόριςτον αναπαραγωγισ αλλά διατθροφν τθν δυνατότθτα να είναι πολυδφναμα (ι παντοδφναμα, totipotent). Σα τελευταία διαωοροποιοφνται προσ τα πρϊιμα και τα φςτερα προγονικά κφτταρα του αιμοποιθτικοφ (early and late hematopoietic progenitors) εκ των οποίων τα δεφτερα είναι κφτταρα που ζχουν υποςτεί δζςμευςθ (ι δρομολόγθςθ, commitment) ςτο μονοπάτι τθσ διαωοροποίθςθσ, ζχουν περιοριςμζνο αρικμό κυτταρικϊν διαιρζςεων και αποδίδουν τελικϊσ τα ϊριμα κφτταρα του αιμοποιθτικοφ ςυςτιματοσ που είναι και τα τελικϊσ διαωοροποιθμζνα κφτταρα (Leszcyniecka, et al. 2001, Tsiftsoglou,et al. 2003b). υνοπτικά τα παραπάνω αποδίδονται ςτθν Error! Reference source not found.εικόνα 11 (Tsiftsoglou, et al. 2003b). Η ωρίμανςθ των αιμοποιθτικϊν κυττάρων ςυμβαίνει ωσ απόκριςθ ςε εξωτερικά και εςωτερικά ερεκίςματα, και ταυτόχρονα με τθν απόκτθςθ χαρακτθριςτικϊν διαωοροποιθμζνου κυττάρου επζρχεται όπωσ ιδθ αναωζρκθκε απϊλεια του δυναμικοφ κυτταρικισ διαίρεςθσ. Οι παράγοντεσ που ρυκμίηουν τθ διαωοροποίθςθ των αιμοποιθτικϊν κυττάρων δεν ζχουν πλιρωσ διευκρινιςτεί. Τπάρχουν τρεισ κυρίαρχεσ κεωρίεσ για να εξθγιςουν τθ μετάβαςθ ςε τελικϊσ διαωοροποιθμζνα κφτταρα: Η πρϊτθ υποςτθρίηει τθν επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ από εξωκυτταρικοφσ παράγοντεσ, θ δεφτερθ αντιμετωπίηει τθ διαωοροποίθςθ ωσ αποτζλεςμα γενετικοφ προγραμματιςμοφ των κυττάρων και θ τρίτθ τθν αποδίδει ςτθν τυχαιότθτα. Σα τρία αυτά μοντζλα μποροφν να αλλθλεπικαλφπτονται μεταξφ τουσ π.χ. ζνα γενετικά ρυκμιηόμενο πρόγραμμα διαωοροποίθςθσ μπορεί να ενεργοποιείται μόνο υπό τθ διζγερςθ ενόσ κατάλλθλου εξωτερικοφ ερεκίςματοσ (Leszcyniecka, et al. 2001). Η επικρατζςτερθ μζχρι ςτιγμισ κεωρία είναι θ πρϊτθ. τισ λευχαιμίεσ, τα προγονικά κφτταρα του αιμοποιθτικοφ αποτυγχάνουν να αποκρικοφν ςε εξωγενι ερεκίςματα από το μικροπεριβάλλον του μυελοφ των οςτϊν και να διαωοροποιθκοφν ςε κακοριςμζνουσ τφπουσ κυττάρων του αίματοσ. Σα λευχαιμικά κφτταρα αποκτοφν ακαναςία, αυτό-διαιωνίηονται και αυξάνονται ραγδαία ςτο μυελό των οςτϊν εισ βάροσ των άλλων κυττάρων ϊςπου τελικά βγαίνουν ςτθν κυκλοωορία. Σο γεγονόσ ότι τα λευχαιμικά κφτταρα δεν υωίςτανται προγραμματιςμζνο κυτταρικό κάνατο (απόπτωςθ) και αποτυγχάνουν να διαωοροποιθκοφν, κακιςτά τισ λευχαιμίεσ πακοωυςιολογικζσ διαταραχζσ τθσ διαωοροποίθςθσ αλλά και απόπτωςθσ των αιμοποιθτικϊν κυττάρων (Tsiftsoglou, et al. 2003a). Σα λευχαιμικά κφτταρα ςυνικωσ επιδεικνφουν χαρακτθριςτικζσ ανωμαλίεσ ςτον καρυότυπό τουσ, εκωράηοντασ μοναδικά αντιγόνα επιωανείασ και δθμιουργοφν κυτταρικζσ αποικίεσ (foci) ςτθν επιωάνεια τρυβλίων άγαρ. Ο βακμόσ τθσ διαωοροποίθςθσ είναι αντιςτρόωωσ αναλόγωσ τθσ κακοικειασ. Αυτι θ ςχζςθ 31

32 υποδεικνφει ότι θ διαωοροποίθςθ είναι άμεςα ςυνδεδεμζνθ με τθν κυτταρικι ανάπτυξθ ςτισ λευχαιμίεσ (Tsiftsoglou, et al. 2003b). Για το λόγο αυτό, θ επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ κα μποροφςε να μειϊςει ι να εξαλείψει το κακοικεσ δυναμικό των λευχαιμικϊν κυττάρων. ΔΠΣΗΠΞΚΔΣΥΑΘΛΘΙΑ ΙΣΑΠΑ ΛΣΞΡ (MEL, MURINE ERYTHROLEUKEMIA CELLS) Διάωορα λευχαιμικά κφτταρα ζχουν χρθςιμοποιθκεί ωσ πρότυπα για τθ μελζτθ του μθχανιςμοφ τθσ κυτταρικισ διαωοροποίθςθσ π.χ. HL-60 (κφτταρα προμυελωτικισ λευχαιμίασ ανκρϊπου, Human promyelotic leukemia), K562 (ερυκρολευχαιμικά κφτταρα ανκρϊπου, Human Leukemia), MEL (ερυκρολευχαιμικά κφτταρα μυόσ, Murine Erythroleukemia), U397 (κφτταρα λεμωϊματοσ, Lymphotic Leukemia). Από αυτά τα κφτταρα MEL αντιπροςωπεφουν μια από τισ ευρφτερα χρθςιμοποιοφμενεσ κυτταρικζσ ςειρζσ. Σα κφτταρα MEL ι κφτταρα Friend απομονϊκθκαν από τθ Charlotte Friend και τουσ ςυνεργάτεσ τθσ από κυτταρικζσ αποικίεσ ςε ςπλινα πειραματόηωων (ποντίκια DAB/2J), τα οποία είχαν εμβολιαςκεί προθγουμζνωσ με τον λευχαιμικό ιό Friend (Friend Leukemia Virus) (Patuleia and Friend 1967). Σα κφτταρα αυτά ζχουν τα μορωολογικά χαρακτθριςτικά των προερυκροβλαςτϊν (ωυςιολογικϊν πρόδρομων ερυκροκυττάρων), διαωζροντασ με αυτά ςτθν δυνατότθτα να διαωοροποιθκοφν ςε ερυκροκφτταρα που παρατθρείται κατά τθ ωυςιολογικι αιμοποίθςθ των προερυκροβλαςτϊν. Σα κφτταρα MEL αναπτφςςονται ςε υγρζσ καλλιζργειεσ, ςε ςυγκεκριμζνεσ και ελεγχόμενεσ ςτείρεσ ςυνκικεσ, και με τθν επίδραςθ επαγωγζων υωίςτανται τελικι διαωοροποίθςθ ςε ερυκροκφτταρα που προςομοιάηουν τουσ ορκοχρωματικοφσ ερυκροβλάςτεσ. Εναλλακτικά μπορεί να υποςτοφν διαωοροποίθςθ προσ μεγακαρυωκφτταρα (Tsiftsoglou, et al. 2003b). ΑΜΑΟΣΝΘΑΙΑ ΟΠΞΓΠΑΛΛΑΑ ΙΑΘ ΣΟΞΟΠΞΓΠΑΛΛΑΑ ΔΘΑΤΞΠΞΟΞΘΖΡΖΡ ΡΑ MEL ΙΣΑΠΑ Μετά από ςειρά μελετϊν με κφτταρα MEL ςε υγρζσ καλλιζργειεσ, θ διαδικαςία τθσ διαωοροποίθςθσ που ακολουκείται μετά από επϊαςθ των κυττάρων με χθμικοφσ επαγωγείσ αποδίδεται ςυνοπτικά ςτα παρακάτω: Μετά τθν ζκκεςθ των κυττάρων ςε χθμικό επαγωγζα για ςυγκεκριμζνο χρονικό διάςτθμα (12-18 h, λανκάνουςα περίοδοσ) τα κφτταρα δρομολογοφνται μθ αντιςτρεπτά προσ 32

33 διαωοροποίθςθ ςε κφτταρα που ομοιάηουν με δικτυοερυκροκφτταρα και κάτω από οριςμζνεσ ςυνκικεσ ςε ερυκροκφτταρα που αποβάλλουν τον πυρινα τουσ. Μετά από αυτό το χρονικό διάςτθμα είναι δυνατόν να διαωοροποιθκοφν και απουςία επαγωγζα (εμωάνιςθ του ωαινομζνου τθσ μνιμθσ). Η δρομολόγθςθ αυτι, μζχρι τθν ολοκλιρωςι τθσ, οδθγεί ςε περιοριςμό τθσ κυτταρικισ διαίρεςθσ ςε μερικζσ μόνο διαιρζςεισ (4-5 ςτον αρικμό) και ςτθν ζκωραςθ δεικτϊν, ειδικϊν για τα κφτταρα τθσ ερυκράσ ςειράσ. Επίςθσ λαμβάνουν χϊρα και μορωολογικζσ αλλαγζσ όπωσ ςταδιακι ελάττωςθ του μεγζκουσ των κυττάρων και ςυμπφκνωςθ του πυρινα, ςε μερικζσ περιπτϊςεισ μζχρι απόρριψθσ και απόδοςθ κυττάρων που ομοιάηουν τα δικτυοερυκροκφτταρα, όπωσ ιδθ αναωζρκθκε (Εικόνα 12). Η επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ ωαίνεται να ενεργοποιείται ςτο επίπεδο τθσ κυτταρικισ μεμβράνθσ μζςω διεργαςιϊν που ρυκμίηονται από ιόντα Ca 2+ και καταλιγει ςτον πυρινα διαμζςου ςθμάτων. τθν όλθ διαδικαςία ωαίνεται να εμπλζκεται και κάποιοσ κυτταροπλαςματικόσ υποδοχζασ (Tsiftsoglou, et al. 2003b). ΕΙΚΟΝΑ 12 α αμαπςσνιακά σπξποξγοάμμαςα ςωμ κσςςάοωμ MEL. Ρςημ εικόμα ταίμξμςαι υημικέπ εμώρειπ πξσ καςαογξύμ ςη μμήμη ςωμ κσςςάοωμ (π.υ, κσκλξενιμίδιξ, δεναμεθαζόμη) καθώπ και εμώρειπ πξσ αμαρςέλλξσμ ςη βιξρύμθερη αιμξρταιοίμηπ (ιμιδαζόλιξ, ρξσκιμσλξακεςόμη) ή επάγξσμ ςξ Σπξποόγοαμμα ΘΘ (αιμίμη) (Tsiftsoglou, et al. 2003a) τθν εφλογθ απορία αν θ ζκωραςθ ειδικϊν κυτταρικϊν δεικτϊν τθσ ερυκροποίθςθσ και θ δρομολόγθςθ προσ τελικά διαωοροποιθμζνα κφτταρα αποτελοφν μια ενιαία διαδικαςία ι αωορά δφο διαωορετικά υποπρογράμματα, πειράματα με εκλεκτικοφσ αναςτολείσ τθσ βιοςφνκεςθσ αιμοςωαιρίνθσ δείχνουν ότι θ δρομολόγθςθ προσ τελικι διαωοροποίθςθ είναι δυνατι, ενϊ το αναπτυξιακό πρόγραμμα μετατροπισ των κυττάρων MEL ςε δικτυοερυκροκφτταρα αποτελείται 33

34 από δφο τουλάχιςτον υποπρογράμματα: ζνα για τθν δρομολόγθςθ προσ τελικι διαωοροποίθςθσ και το άλλο για τθν ζκωραςθ των ειδικϊν δεικτϊν τθσ ερυκροποίθςθσ. Είναι πάντωσ ενδιαωζρον και κα πρζπει να επιςθμανκεί ότι μζροσ των τελικϊσ διαωοροποιθμζνων κυττάρων οδθγοφνται ςε αποπτωτικά μονοπάτια, ενϊ παραμζνει αδιευκρίνιςτο προσ το παρόν αν θ προκαλοφμενθ απόπτωςθ (Diffenrentiation Dependent Apoptosis, DDA) είναι μζροσ του γενετικοφ προγράμματοσ των MEL κυττάρων ι αποτελεί μια ανεξάρτθτθ διαδικαςία (Tsiftsoglou, et al. 2003b, Tsiftsoglou, et al. 2003a). Οι πικανοί μθχανιςμοί με τουσ οποίουσ ρυκμίηεται επιγενετικά ο προγραμματιςμόσ τθσ διαωοροποίθςθσ των λευχαιμικϊν κυττάρων είναι: α) ςτο επίπεδο δικτφων μεταγωγισ ςθμάτων που διαμεςολαβοφνται από τθν κυτταρικι μεμβράνθ και επθρεάηουν τθ μεταωορά Ca 2+ και άλλων, β) διαμζςου υπομεκυλίωςθσ του DNA, γ) αποακετυλίωςθσ και μεκυλίωςθσ των ιςτονϊν που επθρεάηουν τθ δομι τθσ χρωματίνθσ, δ) ςτο επίπεδο μεταγραωικϊν παραγόντων και ε) βιοςυνκετικϊν μονοπατιϊν τθσ ςφνκεςθσ του DNA και RNA. Επιπλζον, θ τελικι διαωοροποίθςθ ζχει βρεκεί να ςχετίηεται με αλλαγζσ ςτο δυναμικό τθσ μιτοχονδριακισ μεμβράνθσ και μια δραματικι μείωςθ ςτθ βιοςφνκεςθ των πρωτεϊνϊν. Η φπαρξθ, τζλοσ, μακρομορίων με λειτουργία ωσ υποδοχείσ ςτουσ οποίουσ προςδζνονται οι χθμικοί επαγωγείσ ςε λευχαιμικά κφτταρα (όπωσ του ρετινοϊκοφ οξζοσ) υποδεικνφει ότι ςε μερικζσ περιπτϊςεισ θ ζναρξθ τθσ διαωοροποίθςθσ ρυκμίηεται από κυτοπλαςμικοφσ και/ι πυρθνικοφσ υποδοχείσ. Δυςτυχϊσ προσ το παρόν δεν ζχει υποδειχκεί κάποια ενοποιθμζνθ κεωρία που να εξθγεί το μθχανιςμό με τον οποίο μια πλθκϊρα διαωορετικϊν χθμικά ενϊςεων επάγει τθ διαωοροποίθςθ λευχαιμικϊν κυττάρων in vitro και in vivo (Tsiftsoglou 2008). ΔΟΑΓΩΓΔΘΡ ΖΡ ΔΘΑΤΞΠΞΟΞΘΖΡΖΡ ΩΜ ΚΔΣΥΑΘΛΘΙΩΜ ΙΣΑΠΩΜ Από τθν ανακάλυψθ του DMSO ωσ επαγωγζα διαωοροποίθςθσ ςε λευχαιμικά κφτταρα MEL (Friend, et al. 1971), ζχουν βρεκεί μια πλθκϊρα παραγόντων ωυςικισ, χθμικισ και βιολογικισ προζλευςθσ με τθν αυτι δράςθ. Οι ενϊςεισ αυτζσ είναι ποικίλθσ χθμικισ δομισ και ωυςικοχθμικϊν ιδιοτιτων και μπορεί να διαωζρουν ωσ προσ τον τφπο κυττάρων ςτα οποία δρουν κακϊσ και ςτον μθχανιςμό με τον οποίο επάγουν τθ διαωοροποίθςθ των λευχαιμικϊν κυττάρων. Μερικζσ κατθγορίεσ μπορεί να μοιράηονται κοινά δομικά χαρακτθριςτικά και ωσ 34

35 εκτοφτου αςκοφν τθ δράςθ τουσ μζςω κοινοφ μθχανιςμοφ δράςθσ. Ενδεικτικά αναωζρονται: Πολικζσ επίπεδεσ ενϊςεισ και υβριδικζσ πολικζσ ενϊςεισ (ι πολικζσ/άπολεσ ενϊςεισ): Σουσ κφριουσ εκπροςϊπουσ αυτισ τθσ κατθγορίασ αποτελοφν το DMSO (Εικόνα 13) και διάωορα διςακεταμίδια με ςθμαντικότερο το εξαμεκυλενοδιςακεταμίδιο, HMBA (Εικόνα 13), που αποτελοφν τισ περιςςότερο μελετθμζνεσ ενϊςεισ. τισ πολικζσ ενϊςεισ ανικει το DMSO, το οποίο ωαίνεται να εμπλζκεται με αλλαγζσ ςτθν διαπερατότθτα ιόντων τθσ κυτταρικισ μεμβράνθσ, ιδιότθτα που ςχετίηεται άμεςα με τθν επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ κυττάρων MEL (Ruddon 1995). Σο ΗΜΒΑ προζκυψε από τθ μελζτθ μια ςειράσ διςακεταμιδίων και αποτελεί πρότυπθ ζνωςθ των υβριδικϊν πολικϊν ενϊςεων (Reuben, et al. 1976). Πρόκειται για ενϊςεισ που ςτο μόριο τουσ ζχουν ζνα πολικό τμιμα, ςυνικωσ ςτο άκρο, και ζνα άπολο τμιμα που ςυνικωσ είναι πολυμεκυλενικι αλυςίδα. Διάωοροι μθχανιςμοί δράςθσ ζχουν προτακεί για τθν επαγωγι διαωοροποίθςθσ λευχαιμικϊν κυττάρων από αυτζσ. Επί παραδείγματι, ζχει αναωερκεί θ επαγωγι διαωοροποίθςθσ μζςω διαωοροποιιςεων επί του δυναμικοφ, τθσ ρευςτότθτασ και τθσ διαπερατότθτασ τθσ κυτταρικισ μεμβράνθσ (Arcangeli, et al. 1993) αλλά και πικανι ςφνδεςι τουσ επί πρωτεϊνϊν (Pappas, et al. 2005). Ανεξάρτθτα από το αρχικό ςιμα, οι επαγωγείσ αυτοφ του τφπου προκαλοφν παφςθ του κυτταρικοφ κφκλου ςτθ ωάςθ G 1 /S ενζργεια διαμεςολαβοφμενθ από ςθματοδοτικά μονοπάτια που ςυμμετζχουν κυκλίνεσ (Marks, et al. 1994), πρωτεϊνικζσ κινάςεσ (Mallia, et al. 1999) και ωωςωατάςεσ (Kume, et al. 1994). Ανάλογα πουρινϊν και πυριμιδινϊν: Παράγωγα πουρινϊν ωσ επαγωγείσ διαωοροποίθςθσ αναωζρονται εκτεταμζνα από τουσ Gusella και Hausman (Gusella and Hausman 1976). Όςον αωορά τα πυριμιδινικά παράγωγα αναωζρεται θ Ara-C ωσ ιςχυρόσ επαγωγζασ ςε κφτταρα HL-60 (Griffin, et al. 1982) και Κ562 (Bianchi Scarrà, et al. 1986) και θ 5-FU ςε κφτταρα Κ562 (Yang and Chang 1995). Αυτι θ κατθγορία επαγωγζων ωαίνεται να ςυςχετίηουν τθ δράςθ τουσ με αναςταλτικι δράςθ επί ενηφμων που εμπλζκονται ςτον μεταβολιςμό νουκλεοηιτϊν κατά τθν βιοςφνκεςθ του DNA και RNA (Hatse, et al. 1999). Παράγωγα ουρίασ - κειουρίασ, και καρβονυλικζσ ενϊςεισ: παράγωγα τθσ ουρίασ αλλά και περιςςότερο ςφνκετεσ ενϊςεισ που ωςτόςο περιζχουν τθν ουρεϊδο-ομάδα (Robert, et al. 1979) ζχουν βρεκεί να ςχετίηονται με αντιλευχαιμικι δράςθ. Μελζτθ ςε υποκατεςτθμζνα παράγωγα ουρίασ και κειουρίασ, αλειωατικά και κυκλικά, αποκάλφψε ότι ζχουν τθ δυνατότθτα να επάγουν τθν ερυκροειδι διαωοροποίθςθ κυττάρων MEL (Li, et al. 1981). Ακόμθ διευρεφνθςθ καρβονυλικϊν παραγϊγων για τθν ικανότθτα τουσ ωσ επαγωγείσ ζδωςε επίςθσ κετικά αποτεζλεςματα (Ebert, et al. 1981, Malinin and Ebert 1980). Αυτά τα αποτελζςματα 35

36 ςε ςυνδυαςμό και με ςχζςεισ δμισ δράςθσ των πολικϊν επαγωγζων, κζτουν τθν ομάδα -NHCO- ωσ ζνα δομικό ςτοιχείο που ςχετίηεται με τθ βιολογικι δράςθ (Tsiftsoglou and Wong 1985). Ρετινοειδι: Σο ATRA (Εικόνα 13), όπωσ προαναωζρκθκε ιδθ, χρθςιμοποιείται κλινικά ςτθν κεραπεία τθσ οξείασ προμυελωτικισ λευχαιμίασ (Degos and Wang 2001). Σα ρετινοειδι ζχουν βρεκεί να προκαλοφν επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ μζςα από αλλθλεπίδραςθ με τον πυρθνικό τουσ υποδοχζα RAR (Retinoic Acid Receptor) (Chambon 1996). Ενϊςεισ που επιδροφν ςτθ δομι τθσ χρωματίνθσ: Αλλαγζσ ςτθν τεταρτοταγι δομι τθσ χρωματίνθσ μποροφν να προκφψουν από υπομεκυλιωτικοφσ επί τθσ χρωματίνθσ παράγοντεσ, αναςτολείσ των αποακετυλαςϊν των ιςτονϊν και αναςτολείσ τθσ τοποϊςομεράςθσ. Η 5-αηακυτιδίνθ ανικει ςτισ υπομεκυλιωτικζσ ενϊςεισ και ζχει βρεκεί να επάγει τθ διαωοροποίθςθ κυττάρων HL-60 (Christman, et al. 1983), Κ562 (Gambari, et al. 1984) και MEL (Creusot, et al. 1982) ςε μικρότερθ ζκταςθ. τουσ αναςτολείσ των αποακετυλαςϊν των ιςτονϊν ανικει το SAHA (Εικόνα 13). Πρόκειται για πολφ ιςχυρό επαγωγζα, κακϊσ αςκεί τθ δράςθ του επί των κυττάρων MEL ςε μικρομοριακζσ ςυγκεντρϊςεισ (Richon, et al. 1996). Σζλοσ θ νοβοβιοκίνθ, αναςτολζασ τθσ τοποϊςομεράςθσ ΙΙ, ωαίνεται να προκαλεί τθν επαγωγι διαωοροποίθςθσ ςε κφτταρα HL-60 (Constantinou, et al. 1989) και ο επίςθσ αναςτολζασ τθσ τοποϊςομεράςθσ ΙΙ dexrazoxane επάγει τθν ζναρξθ διαωοροποίθςθσ και απόπτωςθσ ςε κφτταρα Κ562 (Hasinoff, et al. 2001). Σα παραδείγματα που αναωζρκθκαν αποτελοφν ζνα μικρό μόνο κομμάτι των ενϊςεων που ζχουν μελετθκεί και γενικότερα θ ςυγκεκριμζνθ κατεφκυνςθ ωαίνεται να οδθγεί ςε κετικά αποτελζςματα κακϊσ επιδράςεισ ςτθ δομι και διαμόρωωςθ τθσ χρωματίνθσ προκαλοφν τθν ςυνεπαγόμενθ ςιϊπθςθ ι ζκωραςθ γονιδίων που ςχετίηονται με τθν κυτταρικι ανάπτυξθ και διαωοροποίθςθ. Αιμίνθ: θ αιμίνθ, που αποτελεί ζνα ωυςιολογικό ρυκμιςτικό μόριο τθσ ερυκροποίθςθσ, βρζκθκε να επάγει τθν ερυκροειδι διαωοροποίθςθ κυττάρων K562 (κφτταρα χρόνιασ μυελογενοφσ λευχαιμίασ ανκρϊπου) (Rutherford, et al. 1979). Η αιμίνθ μεταωζρεται εντόσ των κυττάρων Κ562 από τθν αιμοπθξίνθ (hemopexin) και ςυνδζεται με πυρθνικζσ και κυτταροπλαςματικζσ πρωτεϊνεσ που ονομάηονται πρωτεΐνεσ που ςυνδζεται θ αιμίνθ (hemin binding proteins, HeBP) (Tsiftsoglou, et al. 1993). Εκτόσ από τα παραπάνω ζχουν γίνει αναωορζσ και για γνωςτζσ ωαρμακευτικζσ ενϊςεισ που προκαλοφν επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ λευχαιμικϊν κυττάρων. Μερικζσ από αυτζσ είναι οι παρακάτω: κινιδίνθ και άλλα κινολινικά παράγωγα ςε κφτταρα MCF-7 (καρκινικά κφτταρα μαςτοφ ανκρϊπινθσ προζλευςθσ) (Martirosyan, et al. 2004), ακτινομυκίνθ D ςε κφτταρα MEL (Terada, et al. 1978), 36

37 ανκρακυκλίνεσ ςε κφτταρα Κ562 (Steinheider, et al. 1986), βενηοδιαηεπίνεσ ςε κφτταρα MEL (Wang, et al. 1984), βιταμίνθ D 3 ςε κφτταρα HL-60 (Miyaura, et al. 1981) και Β 12 ςε κφτταρα K562 (Rowley, et al. 1981). ΕΙΚΟΝΑ 13 Η ετερογζνεια ςτθ δομι αλλά και ςτθ λειτουργικότθτα των επαγωγζων που αναωζρκθκαν υποδεικνφει τθν φπαρξθ πολλϊν μοριακϊν ςτόχων επί των λευχαιμικϊν κυττάρων όπου δρουν οι παραπάνω παράγοντεσ. Εναλλακτικά μπορεί να υποδεικνφουν τθν φπαρξθ πολλαπλϊν μονοπατιϊν που οδθγοφν ςε τελικι διαωοροποίθςθ. Και ςτισ δφο περιπτϊςεισ είναι απαραίτθτεσ περαιτζρω μελζτεσ για τθ διευκρίνιςθ των πικανϊν μοριακϊν ςτόχων και των μοριακϊν μθχανιςμϊν που εμπλζκονται. 37

38 ΑΜΘΙΔΘΛΔΜΞ ΡΙΞΟΞΡ τθ διερεφνθςθ κεραπευτικϊν μεκόδων για τθν αντιμετϊπιςθ των χρόνιων επιπλοκϊν του ςακχαρϊδουσ διαβιτθ μια ςθμαντικι κζςθ καταλαμβάνουν οι αναςτολείσ τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ. Πρόκειται για μια προςζγγιςθ που δεν ζχει χρίςει τθσ ςθμαςίασ που τθσ αρμόηει από τθ ωαρμακευτικι βιομθχανία λόγω τθσ περιοριςμζνθσ ωαρμακοκινθτικισ των αναςτολζων και των ανεπικφμθτων παρενεργειϊν που προκαλοφν, εξαιτίασ κυριϊσ τθσ παράλλθλθσ αναςτολισ τθσ αναγωγάςθσ των αλδεχδϊν. Επομζνωσ ςυνεχίηει να αποτελεί ζναν τομζα που μζνουν να ανακαλυωκοφν ανςτολείσ ςυγκεκριμζνθσ χθμικισ δομισ με ςθμαντικι αποτελεςματικότθτα και διάρκεια δράςθσ ϊςτε να «μπλοκάρουν» τθν αυξθμζνθ ροι διαμζςου τθσ οδοφ των πολυολϊν ςε αςωαλείσ δόςεισ ςτθν κλινικι πράξθ. ειρά ενδείξεων δζιχνουν πωσ πρζπει να είμαςτε αιςιόδοξοι. Ενκαρρυντικζσ κλινικζσ μελζτεσ επιδεικνφουν βελτίωςθ τθσ διαβθτικισ νευροπάκειασ με ARI. Σζτοια παραδείγματα αποτελοφν θ δοςοεξαρτϊμενθ βελτίωςθ τθσ ταχφτθτασ αγωγισ νευρικϊν ϊςεων από τθν ηεναρεςτάτθ (Gabbay 2004), θ μείωςθ των επιπζδων ςορβιτόλθσ και ωρουκτόηθσ ςε βιοψία νευρικϊν κυττάρων από τθν μιναλρεςτάτθ (ARI-509), ςπειροϊμίδιο που μοιάηει με τισ υδαντοΐνεσ, όπου επίςθσ ςε μικρισ περιόδου κλινικζσ μελζτεσ ωαίνεται και να βελτιϊνει τθν προβλθματικι νευρωνικι ταχφτθτα ςε πολφ χαμθλζσ δόςεισ, ενϊ δεν εμωανίηονται τα προαναωερόμενα προβλιματα των υδαντοϊνϊν *Hofman et al 1997], κακυςτζρθςθ τθσ ζναρξθσ και εξζλιξθσ νευροπάκειασ από τθν επαλρεςτάτθ (Hotta, et al. 2006) και κετικά αποτελζςματα ωάςθσ ΙΙ από τθν ρανιρεςτάτθ που πλζον βρίςκεται ςε κλινικζσ δοκιμζσ ωάςθσ ΙΙΙ αλλά ζχουν δθμιουργθκεί επιπλοκζσ λόγω υψθλϊν αποκρίςεων ςτον ζλεγχο με placebo (Bril and Buchanan 2006, Oates 2008). Πρόςωατα, ζχει αναωερκεί θ ςφνκεςθ παραγϊγων τθσ 2,6-διωκορο-4-(1Hπυρρολ-1-υλ)ωαινόλθσ με αναςταλτικι επί τθσ ALR-2 δράςθ (Nicolaou, et al. 2004). τθν παροφςα εργαςία ςυντζκθκαν και ελζγχκθκαν για τθν ικανότθτά τουσ να αναςτζλλουν τθν αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ ενϊςεισ παράγωγα τθσ 2,6-διωκορο-3- (1H-πυρρολ-1-υλ)ωαινόλθσ (Εικόνα 14) και διερευνάται θ αποτελεςματικότθτά τουσ ςε ςχζςθ με τα προαναωερόμενα παράγωγα. Επιπρόςκετα εξετάςτθκε θ ικανότθτα των παραπάνω ενϊςεων να αναςτζλλουν τθν ALR-1 ωσ κριτιριο εκλεκτικότθτασ των ενϊςεων. 38

39 Η αρχικι ιδζα ςφνκεςθσ παραγϊγων διωκοροωαινόλθσ προζκυψε από το γεγονόσ ότι θ ομάδα αυτι κεωρείται λιπόωιλθ βιοϊςοςτερισ ομάδα των καρβοξυλικϊν οξζων (Qui, et al. 1999). Επομζνωσ, θ ειςαγωγι αυτισ ςτα μόρια κα διατθριςει τθν ικανότθτα ιοντικισ αλλθλεπίδραςθσ με το καταλυτικό κζντρο τθσ ALR2, με το επιπλζον πλεονζκτθμα τθσ πικανισ βελτίωςθσ τθσ ωαρμακοκινθτικισ τθσ ζνωςθσ, ζνα από τα ςυχνότερα απαντϊμενα προβλιματα ςτουσ ARI. ΕΙΚΟΝΑ 14 Επίςθσ ςτόχο τθσ ςυγκεκριμζνθσ μεταπτυχιακισ εργαςίασ, αποτελεί θ ςφνκεςθ παραγϊγων του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου με πικανι αντιλευχαιμικι δράςθ. Οι λευχαιμίεσ, που αποτελοφν τμιμα των νεοπλαςιϊν του αιμοποιθτικοφ ςυςτιματοσ, αντιπροςωπεφουν μόνο το 2-3% του ςυνόλου των κακοικων νεοπλαςιϊν, αλλά ευκφνονται για το 10% των κανάτων που προκαλοφνται από νεοπλαςματικζσ αςκζνειεσ. Πειραματικά και κλινικά δεδομζνα δείχνουν ότι οι λευχαιμίεσ προκφπτουν ςε μεγάλο βακμό από διαταραχζσ ςτθν ικανότθτα για αυτο-ανανζωςθ (self-renewal) και διαωοροποίθςθ των αρχζγονων βλαςτικϊν κυττάρων του αιμοποιθτικοφ ςυςτιματοσ. Λόγω μεταλλάξεων, τα λευχαιμικά κφτταρα αποτυγχάνουν να ανταποκρικοφν ςτα ερεκίςματα από αναπτυξιακοφσ παράγοντεσ και ςυνεχίηουν τθν ανάπτυξι τουσ ςε βάροσ των υπόλοιπων κυττάρων του αιμοποιθτικοφ ςυςτιματοσ. Ο βακμόσ διαωοροποίθςθσ των λευχαιμικϊν κυττάρων βρζκθκε να ζχει ςχζςθ αντιςτρόωωσ ανάλογθ με το μζγεκοσ τθσ κακοικειασ. Ζτςι δθμιουργικθκε θ ςκζψθ ότι επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ ςε λευχαιμικά κφτταρα κα μποροφςε να μειϊςει ι και να εξαλείψει το κακοικεσ δυναμικό τουσ. H επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ ςε λευχαιμικά κφτταρα ςταματά τθν αυτό-ανανζωςθ των κυττάρων ι/ και οδθγεί ςε προγραμματιςμζνο κυτταρικό κάνατο, πετυχαίνοντασ με αυτόν τον τρόπο ςτοχευμζνθ καταςτροωι των λευχαιμικϊν κυττάρων (απόπτωςθ). 39

40 Αυτι θ κεραπευτικι προςζγγιςθ αποτελεί μια νζα τάςθ ςτθ χθμειοκεραπευτικι του καρκίνου και ονομάηεται διαμζςου τθσ διαωοροποίθςθσ κεραπεία του καρκίνου. τα πλαίςια τθσ εφρεςθσ νζων αντιλευχαιμικϊν παραγόντων ςτοχευμζνθσ δράςθσ, ςυντζκθκαν τα παράγωγα του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου και ελζγχκθκαν ςε ερυκρολευχαιμικά κφτταρα MEL ωσ προσ τθν ικανότθτά τουσ αωενόσ να αναςτζλλουν τον κυτταρικό πολλαπλαςιαςμό και αωετζρου να επάγουν τθ διαωοροποίθςθ. Ο ςχεδιαςμόσ των ενϊςεων ςτθρίχκθκε ςτθν παρατιρθςθ ότι ενϊςεισ με πυρινα τετραηολίου εμωανίηουν αντινεοπλαςτικι δράςθ. Επιπλζον, ο τετραηολικόσ πυρινασ εμωανίηει αντοχι ςτθ βιοαποικοδόμθςθ (Myznikov, et al. 2007), ιδιότθτα που μπορεί να αποδειχκεί ιδιαίτερα χριςιμθ όςον αωορά τθ ωαρμακοκινθτικι τθσ ζνωςθσ. τθ κζςθ 5 του τετραηολικοφ πυρινα ειςάχκθκε ωσ υποκαταςτάςτθσ δακτφλιοσ πυρρολίου. Σο πυρρόλιο είναι ζνασ αρωματικόσ πυρινασ με ςθμαντικι διπολικι ροπι, γεγονόσ που τον κακιςτά ιδιαίτερα δραςτικό ςε αλλθλεπιδράςεισ με ζνηυμα. Σο απλό αυτό παράγωγο ελζγχκθκε για τθν αντιλευχαιμικι του δράςθ ςε κφτταρα MEL και κακϊσ βρζκθκε δραςτικό, ςυντζκθκαν τα παράγωγα που ωαίνονται ςτθν Εικόνα 15. ΕΙΚΟΝΑ 15 Επιλζχκθκε θ δομι τθσ μορωισ: αρωματικόσ πυρινασ-μεταβαλλόμενου μικουσ αλειωατικι αλυςίδα-κειεςτερικό άκρο με τθν προοπτικι να υπάρχουν ομοιότθτεσ με τισ υβριδικζσ πολικζσ/άπολεσ ενϊςεισ. Με αυτι τθ λογικι ςυντζκθκε ο επαγωγζασ τθσ διαωοροποίθςθσ SAHA όπου δοκιμάςτθκε θ ειςαγωγι υδρόωοβθσ αρωματικισ ομάδασ ςτο ζνα άκρο τθσ αλειωατικισ αλυςίδασ (Richon, et al. 1998). 40

41 Σα παράγωγα που ςυντζκθκαν ζχουν πλευρικι αλειωατικι αλυςίδα με αρικμό ατόμων άνκρακα που ποικίλλει από 5-7 C, με ςκοπό τθν εκτίμθςθ του βζλτιςτου μικουσ. το άκρο επιλζχκθκε θ κειο-ακετυλο-ομάδα, θ οποία πικανόν να υδρολφεται από εςτεράςεσ In vivo για να αποδϊςει κειολικι ομάδα. Οι κειόλεσ είναι γνωςτζσ για τισ αλλθλεπιδράςεισ τουσ με μζταλλα ενηφμων, κακϊσ και για τθ χθμειοπροςτατευτικι δράςθ τουσ ςτθν καρκινογζνεςθ (Huber and Parzefall 2007), ςτοιχεία που μποροφν να αποδειχκοφν ευεργετικά για βζλτιςτθ αντινεοπλαςματικι δράςθ. Ωςτόςο, και χωρίσ υδρόλυςθ θ ζνωςθ κα μποροφςε να εμωανίςει δράςθ κακϊσ θ καρβονυλικι ομάδα ωαίνεται να είναι βαςικό ςυςτατικό τθσ δομισ για τθν εμωάνιςθ βιολογικισ δραςτικότθτασ (Malinin and Ebert 1980). Κατά τθ ςφνκεςθ των παραπάνω ενϊςεων παραλάβαμε τα διμερι CHAC-1a και CHAC-2a, τα οποία και αξιολογιςαμε επίςθσ, κακϊσ αυτι θ ςκζψθ είχε οδθγιςει και παλιότερα ςτθ ςφνκεςθ ομάδασ διςακεταμιδίων, από τα οποία το ΗΜΒΑ ξεχϊριςε και χρθςιμοποιείται μζχρι και ςιμερα ωσ πρότυποσ ζνωςθ για τθν επαγωγι διαωοροποίθςθσ λευχαιμικϊν κυττάρων (Terada, et al. 1978). Κακϊσ τα αποτελζςματα ιταν ενκαρρυντικά, ςυνκζςαμε και το CHAC-3a εωόςον δεν παριχκθκε ςε ςθμαντικι ποςότθτα από τθν παραπάνω αντίδραςθ. Εξετάςτθκε θ ικανότθτα των ενϊςεων να αναςτζλλουν τθν ανάπτυξθ κυτταρων MEL κακϊσ και θ ενδεχόμενθ επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ των ανωτζρω κυττάρων προσ κφτταρα ομοιάηοντα τα ερυκροκφτταρα. 41

42 ΟΔΘΠΑΛΑΘΙΞ ΛΔΠΞΡ ΡΣΡΙΔΣΔΡ ΙΑΘ ΞΠΓΑΜΑ ΟΞΣ ΥΠΖΡΘΛΞΟΞΘΖΗΖΙΑΜ Για τον προςδιοριςμό των ςθμείων τιξθσ χρθςιμοποιικθκε ςυςκευι υάλινων ανοιχτϊν τριχοειδϊν τφπου Mel-Temp II. Σα ωάςματα υπερφκρου (IR) λιωκθκαν με ωαςματοωωτόμετρο διπλισ δζςμθσ τφπου Hitachi U Σα ωάςματα πυρθνικοφ μαγνθτικοφ ςυντονιςμοφ 1 Η-NMR λιωκθκαν με ωαςματοωωτόμετρο τφπου Bruker AW80 ςτα 80 MHz. Οι τιμζσ χθμικισ μετατόπιςθσ δίνονται ςε μονάδεσ δ, με εςωτερικό πρότυπο τετραμεκυλοςιλάνιο (δ TMS =0). Σα ωάςματα πυρθνικοφ μαγνθτικοφ ςυντονιςμοφ 13 C-NMR λιωκθκαν με ωαςματοωωτόμετρο τφπου Bruker ςτα 300 MHz. Οι μετριςεισ ςτο υπεριϊδεσ ορατό (UV-Vis) ζγιναν με ωαςματοωωτόμετρο τφπου Hitachi U Οι ςτοιχειακζσ αναλφςεισ πραγματοποιικθκαν με αυτόματο αναλυτι τφπου Perkin-Elmer Για τθ χρωματογραωία ςτιλθσ (flash chromatography) χρθςιμοποιικθκε silica gel Merck Ο πετρελαϊκόσ αικζρασ αναωζρεται ςτο κλάςμα ς.η o C. ΡΣΜΗΔΡΖ ΔΜΩΡΔΩΜ ΟΠΩΔΡ ΣΚΔΡ ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ 2,6-ΔΘΤΗΞΠΞ-4-ΜΘΠΞ-ΤΑΘΜΞΚΖΡ (1) Κατά τθ μζκοδο τθσ βιβλιογραωίασ (Qui, et al. 1999), ςε διάλυμα τθσ 2,6- διωκορο-ωαινόλθσ (5 g, 38 mmol) ςε παγόμορωο οξικό οξφ (15 ml) που βρίςκεται υπό ανάδευςθ ςε ατμόςωαιρα Ν 2 και ψφχεται με παγόλουτρο ςτουσ 0 o C, προςτίκεται ςτάγδθν για 1 h ατμίηων νιτρικό οξφ (2 ml). Μετά τθν προςκικθ, απομακρφνεται το παγόλουτρο από τθν αντίδραςθ και αωινεται υπό ανάδευςθ ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ για 1 h. Ακολοφκωσ, λαμβάνει χϊρα εξαλάτωςθ με κορεςμζνο διάλυμα NaCl, ενϊ το μίγμα τθσ αντίδραςθσ είναι ςε παγόλουτρο, και ακολουκεί εκχφλιςθ με CH 2 Cl 2 (3x20 ml). Η οργανικι ωάςθ ςυλλζγεται, προςτίκεται ξθραντικό Na 2 SO 4 και οι διαλφτεσ εξατμίηονται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Για τθν πλιρθ απομάκρυνςθ του οξικοφ οξζοσ προςτίκεται n-επτάνιο με το οποίο ςχθματίηει αηεοτροπικό μίγμα. υλλζχκθκαν 5,493 g 2,6-διωκορο-3-νιτρο-ωαινόλθσ 42

43 Απόδοςθ: 82% ς.τ.: 104 ο C *ς.τ βιβλιογραωίασ 105 ο C (Qui, et al. 1999)] Φάςμα 1 H-NMR (CDCl 3 ): δ 7.92 (m, 2H), 6.0 (s, 1H, -OH) (Qui, et al. 1999) ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ 2,6-ΔΘΤΗΞΠΞ-4-ΜΘΠΞ-ΑΜΘΡΞΚΖΡ (2) Κατά τθ μζκοδο τθσ βιβλιογραωίασ (Qui, et al. 1999), ςε διάλυμα 2,6- διωκορο-3-νιτρο-ωαινόλθσ (5,493 g, 31 mmol) ςε ακετόνθ (42 ml) προςτίκενται 9,631 g (63 mmol) K 2 CO 3 και τίκενται υπό ανάδευςθ ςε ατμόςωαιρα Ν 2. Ακολοφκωσ προςτίκενται 5,55 ml CH 3 I (12,65 g, 89,09 mmol) και θ αντίδραςθ κερμαίνεται ςε κερμοκραςία βραςμοφ για 6 h. το πζρασ των 6 h το μίγμα τθσ αντίδραςθσ ςυμπυκνϊνεται μζχρι ςτερεοφ υπολείματοσ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ και το προϊόν παραλαμβάνεται με Et 2 O. Ακολοφκωσ, ξθραίνεται (Na 2 SO 4 ) και ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. υλλζχκθκαν 5,295 g 2,6-διωκορο-4-νιτρο-ανιςόλθσ Απόδοςθ: 89 % ς.τ.: ο C *ς.τ βιβλιογραωίασ ο C (Qui, et al. 1999)] Φάςμα 1 H NMR (CDCl 3 ): δ 7.85 (m, 2H), 4.17 (s, 3H) (Qui, et al. 1999) ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ 3,5-ΔΘΤΗΞΠΞ-4-ΛΔΗΞΝΣ-ΑΜΘΚΘΜΖΡ (3) Ακολουκϊντασ τθ μζκοδο τθσ βιβλιογραωίασ (Entwistle 1975) ςε διάλυμα 4,240 g (22,42 mmol) 2,6-διωκορο-4-νιτρο-ανιςόλθσ ςε 60 ml EtOH προςτίκενται 15 ml κυκλοεξζνιο (11,8 g) και τίκενται υπό ανάδευςθ ςε ατμόςωαιρα Ν 2. τθ ςυνζχεια, και υπό ζντονθ ροι αηϊτου προςτίκενται 2,11 g Pd/C. Η αντίδραςθ κερμαίνεται ςε κερμοκραςία βραςμοφ (78 o C) και αωινεται για 3 h. το τζλοσ των 3 h λαμβάνει χϊρα διικθςθ με θκμό Whatman για τθν απομάκρυνςθ του Pd/C και ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. υλλζχκθκαν 3,970 g 3,5-διωκορο-4-μεκοξυ-ανιλίνθσ Απόδοςθ: 90% ς.τ.: o C *ς.τ βιβλιογραωίασ o C (Qui, et al. 1999)] Φάςμα 1 H NMR (CDCl 3 ): δ 6.20 (m, 2H), 3.75 (s, 3H) (Qui, et al. 1999) 43

44 ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ 3,5-ΔΘΤΗΞΠΞ-2-ΘΩΔΞ-4-ΛΔΗΞΝΣ-ΑΜΘΚΘΜΖΡ (4) ε διάλυμα NaHCO 3 4,4 g (52,4 mmol) ςε 73 ml H 2 O που βρίςκεται υπό ανάδευςθ, προςτίκενται 3,888g (24,84 mmol) τθσ 3,5-διωκορο-4-μεκοξυ-ανιλίνθσ και θ αντίδραςθ τίκεται υπό ατμόςωαιρα N 2. Σζλοσ προςτίκενται 7,82 g (30,79 mmol) Ι 2 και θ αντίδραςθ αωινεται ςε κερμοκραςία δωματίου με παγίδα NaOH όλθ νφχτα. Ακολουκεί εκχφλιςθ με οξικό αικυλεςτζρα (4x50 ml) και οι ενωμζνεσ οργανικζσ ωάςεισ πλζνονται με 20% Na 2 S 2 O 3 (50 ml) για τθν απομάκρυνςθ του Ι 2. τθ ςυνζχεια λαμβάνει χϊρα πλφςθ με brine, ξιρανςθ με Na 2 SO 4 και απομάκρυνςθ των διαλυτϊν υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Σο προϊόν απομονϊνεται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash ςε ςφςτθμα διαλυτϊν πετρελαϊκοφ αικζρα/οξικοφ αικυλεςτζρα 6:1 (Qui, et al. 1999). υλλζχκθκαν 3,563 g 3,5-διωκορο-2-ιωδο-4-μεκοξυ-ανιλίνθσ Απόδοςθ: 45% ς.τ.: o C *ς.τ βιβλιογραωίασ o C (Qui, et al. 1999)] Φάςμα 1 H NMR (CDCl 3 ): δ 6.38 (dd, J= 10, 1.8 Hz, 1H), 3.86 (s, 3H) (Qui, et al. 1999) ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ 2,6-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΘΩΔΞ-ΑΜΘΡΞΚΖΡ (5) Διάλυμα τθσ 3-5,διωκορο-2-ιωδο-4-μεκοξυ-ανιλίνθσ (3,563 g, 12,5 mmol) ςε H 2 SO 4 (4,3 ml ςε 65 ml Η 2 Ο) τίκεται ςε παγόλουτρο και προςτίκεται ςτάγδθν διάλυμα g NaNO 2 (18.53 mmol) ςε 21 ml Η 2 Ο ςε διάςτθμα 30 min. Η αντίδραςθ αωινεται για επιπλζον 30 min ςε ατμόςωαιρα N 2 και ςτουσ 0 ο C. τθ ςυνζχεια απομακρφνεται το παγόλουτρο και προςτίκεται ςκόνθ Cu (0,862 g, 13,56 mmol), προπλυμμζνου με Et 2 O, και 65 ml EtOH. Σο μίγμα τθσ αντίδραςθσ κερμαίνεται ςτουσ 75 ο C για 1 h και κατόπιν ςτουσ 65 ο C για 2 h. Ακολοφκωσ λαμβάνει χϊρα ψφξθ ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ και εκχφλιςθ με Et 2 O (3x100 ml). Οι ενωμζνεσ οργανικζσ ωάςεισ πλζνονται με brine, προςτίκεται ξθραντικό Na 2 SO 4 και οι διαλφτεσ απομακρφνονται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Σο προϊόν απομονϊνεται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash ςε πετρελαϊκό αικζρα (Qui, et al. 1999). υλλζχκθκαν 2,062 g 2,6-διωκορο-3-ιωδο-ανιςόλθσ (κιτρινωπό υγρό) Απόδοςθ: 61% Φάςμα 1 H-NMR: δ 7,37 (m, 2H), 6,74 (dt, J=6,0, 1,6 Hz, 1H), 4,0 (s, 3H) (Qui, et al. 1999) ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ ΛΞΠΤΞΚΘΜΞ-(ΤΑΘΜΣΚΞ)-ΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (6) ε διάλυμα 3 gr μορωολίνθσ ςε 100 ml CH 2 Cl 2 που βρίςκεται υπό ανάδευςθ προςτίκενται 14,4 ml (103,32 mmol) τριαικυλαμίνθσ και ςτθ ςυνζχεια προςτίκενται 44

45 ςτάγδθν 4,8 ml βενηοχλοχλωριδίου (41,33 mmol). Η αντίδραςθ αωινεται ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ με παγίδα CaCl 2 για 30 min από το τζλοσ τθσ προςκικθσ του βενηοχλοχλωριδίου. το τζλοσ των 30 min λαμβάνει χϊρα διικθςθ υπό κενό για τθν απομάκρυνςθ του υδροχλωρικοφ άλατοσ τθσ τριαικυλαμίνθσ. Σο διικθμα πλζνεται με νερό (2x100 ml) και ακολουκεί πλφςθ με brine, προςκικθ ξθραντικοφ Na 2 SO 4 και ςυμπφκνωςθ μζχρι ξθροφ υπολείμματοσ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Σζλοσ το υπόλειμμα ανακρυςταλλϊνεται με CH 2 Cl 2 /πετρελαϊκό αικζρα. ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ ΤΑΘΜΣΚΞ-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-2-ΣΚΞ)-ΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (7) Η αντίδραςθ πραγματοποιικθκε ςφμωωνα με τθ δθμοςιευμζνθ μζκοδο (White and McGillivray 1977). ε πρϊτθ ωάςθ ςχθματίηεται το ςφμπλοκο POCl 3 - μορωολινο-(ωαινυλ)-μεκανόνθσ: 4,665 g (24,39 mmol) μορωολινο-(ωαινυλ)- μεκανόνθσ και 6,3 ml (10,55 g, 68,81 mmol) POCl 3 τίκενται υπό ανάδευςθ ςε ατμόςωαιρα N 2 και κερμοκραςία περιβάλλοντοσ για 6 h. το πζρασ των 6 h προςτίκεται ςτο ςφμπλοκο διάλυμα πυρρολίου 1,636 g (24,39 mmol) ςε 200 ml 1,2- διχλωροαικάνιο. Η αντίδραςθ τίκεται ςε ατμόςωαιρα N 2 και κερμοκραςία περιβάλλοντοσ και αωινεται όλθ τθ νφχτα. Ιδιαίτερθ προςοχι πρζπει να δοκεί ϊςτε να τθρθκοφν άνυδρεσ ςυνκικεσ. Σθν επόμενθ μζρα λαμβάνει χϊρα υδρόλυςθ με 200 ml 10% υδατικό διάλυμα Na 2 CO 3 και κζρμανςθ για 2 h ςε κερμοκραςία βραςμοφ. Ακολουκεί διαχωριςμόσ τθσ οργανικισ ςτιβάδασ και πλφςεισ τθσ υδατικισ με 2x50 ml 1,2-διχλωροαικάνιο. Σζλοσ πλφςθ των ενωμζνων οργανικϊν ωάςεων με brine, προςκικθ ξθραντικοφ Na 2 SO 4 και ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ μζχρι ξθροφ υπολείμματοσ. Σο προϊόν απομονϊνεται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash ςε ςφςτθμα πετρελαϊκοφ αικζρα/οξικοφ αικυλεςτζρα 6:1. Ακολουκεί ανακρυςτάλλωςθ του προϊόντοσ με πετρελαϊκό αικζρα υψθλοφ ςθμείου ηζςεωσ. 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ 6,70-6,88 (m, 2H), 7,21-7,57 (m, 4H), 7,69-7,93 (m, 2H) ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ ΤΑΘΜΣΚΞ-(1Η-ΟΣΠΠΞΚ-3-ΣΚΞ)-ΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (8) ε εναιϊρθμα άνυδρου AlCl 3 4 g (30 mmol) ςε 50 ml 1,2-διχλωροαικανίου ςτουσ 25 O C, προςτίκενται αργά 3,936 g βενηοχλοχλωριδίου (28 mmol) και αναδεφονται για 10 min. τθ ςυνζχεια, προςτίκεται διάλυμα 5,581 g (25 mmol) 1- ωαινυλοςουλωονυλο-1η-πυρρολίου ςε 10 ml 1,2-διχλωροαικάνιο και το μίγμα αναδεφεται για 90 min, υπό τθν προςταςία παγίδασ CaCl 2. Σο μίγμα αποχφνεται ςε 100 ml Η 2 Ο και περίπου ίςου όγκου πάγου, θ οργανικι ωάςθ ςυλλζγεται και θ υδατικι εκχυλίηεται με χλωροωόρμιο (2x100 ml). Οι ενωμζνεσ οργανικζσ ωάςεισ πλζνονται με κορεςμζνο υδατικό διάλυμα NaCl, ξθραίνονται με Να 2 SO 4 και οι διαλφτεσ εξατμίηονται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Σο υπόλειμμα διαλφεται ςε 100 ml 45

46 1,4-διοξανίου και ςτθ ςυνζχεια προςτίκενται 100 ml υδατικοφ διαλφματοσ 5Ν NaOH. Σο μίγμα αναδεφεται ζντονα για 17 h ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ. υλλζγεται θ οργανικι ωάςθ και θ υδατικι ωάςθ εκχυλίηεται με οξικό αικυλεςτζρα (2x100 ml). Οι ενωμζνεσ οργανικζσ ωάςεισ εκπλφνονται με κορεςμζνο υδατικό διάλυμα NaCl, ξθραίνονται με Να 2 SO 4 και οι διαλφτεσ εξατμίηονται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Σο υπόλειμμα ανακρυςταλλϊνεται από τολουόλιο/πετρελαϊκό αικζρα (Anderson, et al. 1985). 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ 6,71-6,87 (m, 2H), 7,28-7,52 (m, 4H), 7,67-7,80 (m, 2H) ΡΣΜΗΔΡΖ ΔΜΩΡΔΩΜ - ΟΠΞΣΟΔΡ ΔΜΩΡΔΘΡ: 5-(1Η-ΟΣΠΠΞΚ-1- ΣΚ)-1Η-ΔΠΑΕΞΚΘΞ ΙΑΘ ΟΑΠΑΓΩΓΑ ΞΣ ΡΣΜΗΔΡΖ ΞΣ 5-(1Η-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚO)-1Η-ΔΠΑΕΞΚΘΞΣ (CHAC-0) Πρόκειται για εωαρμογι τθσ αντίδραςθσ Clauson-Kaas, τροποποιθμζνθ από τον Cardinaud (Cardinaud, et al. 1993, Nicolaou and Demopoulos 2003). Ακολουκϊντασ τθ δθμοςιευμζνθ διαδικαςία, ςε διάλυμα 5-αμινοτετραηολίου (2,5 g, 29,4 mmol) ςε 210 ml διοξανίου προςτίκενται 5,24 ml (40,6 mmol) 2,5-διμεκοξυτετραχδροωουρανίου και 6,79 g (45,3 mmol) υδροχλωρικοφ άλατοσ τθσ 4- χλωροπυριδίνθσ. Η αντίδραςθ πραγματοποιείται ςε ατμόςωαιρα N 2, υπό ανάδευςθ και με κζρμανςθ ςτουσ 110 ο C (ςθμείο ηζςεωσ του διοξανίου) για 3 h. τθ ςυνζχεια, το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αωινεται να ψυχκεί ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ και ακολουκεί ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ μζχρι ξθροφ. Σο υπόλειμμα κατεργάηεται με 20 ml οξικό αικυλεςτζρα και διθκείται υπό κενό. Σο διικθμα ςυμπυκνϊνεται εκ νζου μζχρι ξθροφ, το υπόλειμμα κατεργάηεται με 20 ml NaHCO 3 και ακολουκεί εκχφλιςθ με οξικό αικυλεςτζρα. Η υδατικι ςτιβάδα οξινίηεται με HCl (ςε παγόλουτρο) και ακολουκεί δεφτερθ εκχφλιςθ με 20 ml οξικοφ αικυλεςτζρα. Οι οργανικζσ ωάςεισ ενϊνονται και πραγματοποιείται πλφςθ με brine, προςκικθ ξθραντικοφ Na 2 SO 4 και ακολουκεί ςυμπφκνωςθ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ μζχρι ξθροφ. Σο προϊόν λαμβάνεται με ανακρυςτάλλωςθ από οξικό αικυλεςτζρα/πετρελαϊκό αικζρα. Λαμβάνονται 2,491 gr 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου (ροη-κιτρινωπό ςτερεό). Απόδοςθ αντίδραςθσ: 63% ς.τ. : 214 ο C 46

47 1 Η-NMR (CDCl 3, DMSO-d 6 ): δ 6,36 (s, 2H) 7,47 (s, 2H) τοιχειακι ανάλυςθ C 5 H 5 N 5 : κεωρθτικά υπολογιςμζνεσ τιμζσ C: 44.44, H: 3.73, N: 51.83, ευρεκζντα αποτελζςματα: C: 44.80, H: 3.42, N: ΓΔΜΘΙΖ ΛΔΗΞΔΞΡ ΡΣΜΗΔΡΖΡ ΩΜ Α-(Ω-ΒΠΩΛΞΑΚΙΣΚΞ)-5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1- ΣΚΞ)-2H-ΔΠΑΕΞΚΘΩΜ ε διάλυμα 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου (3,7 mmol) ςε ξθρό THF (20 ml) που βρίςκεται υπό ανάδευςθ και ςε ατμόςωαιρα Ν 2 προςτίκενται α,ωδιβρωμοαλκανίου (5,93 mmol) και καταλυτικι ποςότθτα χλωριοφχου άλατοσ τθσ τριβουτυλοβενηυλαμίνθσ (95 mg, 0,32 mmol). Ακολοφκωσ λαμβάνει χϊρα θ προςκικθ του NaH (60% ςε παραωινζλαιο) (220 mg, 5,5 mmol, 1,485 geq) υπό ψφξθ και με ςυνεχι ανάδευςθ. τθ ςυνζχεια, απομακρφνεται το παγόλουτρο και θ αντίδραςθ αωινεται ςε ατμόςωαιρα Ν 2 και κερμοκραςία περιβάλλοντοσ για 24 h. το τζλοσ των 24 h, το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αποχφνεται ςε ποτιρι ηζςεωσ που ζχει 50 ml 5% ΗCl με πάγο και 50 ml CH 2 Cl 2 και βρίςκεται υπό ανάδευςθ. Ακολουκεί διαχωριςμόσ των δφο ωάςεων και εκχφλιςθ τθσ υδατικισ ωάςθσ με 2x50 ml CH 2 Cl 2. υλλζγεται θ οργανικι ωάςθ και κατεργάηεται με NaHCO 3 προσ εξουδετζρωςθ εναπομείναντοσ HCl. Ακολουκεί πλφςθ με brine και προςκικθ ξθραντικοφ Na 2 SO 4. Σζλοσ, θ οργανικι ωάςθ ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ μζχρι ξθροφ. Απομονϊνονται το κυρίωσ προϊόν και ζνα δεφτερο με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και κατάλλθλο ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ: πετρελαϊκόσ αικζρασ/ οξικόσ αικυλεςτζρασ (CHAC-1b 10:1 για τθν παραλαβι του κυρίωσ προϊόντοσ και ςτθ ςυνζχεια για τθν παραλαβι του προϊόντοσ 5:1, CHAC-2b 15:1 και ςτθ ςυνζχεια 8:1, CHAC-3b 19:1 και ςτθ ςυνζχεια 10:1). 2-(5-ΒΠΩΛΞΟΔΜΣΚΞ)-5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-2H-ΔΠΑΕΞΚΘΞ (CHAC- 1B) Από αρχικά 500 mg 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου ςυλλζγονται 550 mg 2-(5-βρωμοπεντυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολίου (άχρωμο υγρό) και 136 mg του δεφτερου προϊόντοσ που ταυτοποιικθκε ωσ το 1,5-δις(5-(1H-πυρρολ-1- υλο)-2h-τετραηολ-2-υλο)πεντάνιο (λευκό ςτερεό). Απόδοςθ αντίδραςθσ: 52% 2-(5-βρωμοπεντυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολίου και 13% 1,5-δις(5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολ-2-υλο)πεντανίου 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ 1,35-2,3 (m,6η), 3,41 (t,2h), 4,58, (t,2h), 6,26-6,50, (m,2h), 7,35-7,62 (m,2h) 47

48 2-(6-ΒΠΩΛΞΔΝΣΚΞ)-5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-2H-ΔΠΑΕΞΚΘΞ (CHAC-2B) Από αρχικά 500 mg 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου ςυλλζγονται 460 mg 2-(6-βρωμοεξυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολίου (άχρωμο υγρό) και 85 mg του δεφτερου προϊόντοσ που ταυτοποιικθκε ωσ το 1,6-δις(5-(1H-πυρρολ-1- υλο)-2h-τετραηολ-2-υλ)εξάνιο (λευκό ςτερεό). Απόδοςθ αντίδραςθσ: 41% 2-(6-βρωμοεξυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολίου και 14% 1,6-δις(5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολ-2-υλ)εξανίου 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ 1,10-2,24 (m, 8Η), 3,39 (t, 2H), 4,56 (t, 2H), 6,24-6,50 (m, 2H), 7,33-7,62 (m, 2H). 2-(7-ΒΠΩΛΞΔΟΣΚΞ)-5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-2H-ΔΠΑΕΞΚΘΞ (CHAC-3B) Από αρχικά 1000 mg 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου ςυλλζγονται 557 mg 2-(7-βρωμοεπτυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολίου (άχρωμο υγρό). Σο διμερζσ προϊόν παράχκθκε ςε πολφ χαμθλό ποςοςτό και για τθν αφξθςθ τθσ απόδοςισ του δοκιμάςτθκε θ μζκοδοσ που ακολουκεί παρακάτω. Απόδοςθ αντίδραςθσ: 24% 2-(7-βρωμοεπτυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολίου και 2% 1,7-δις(5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολ-2-υλ)επτανίου 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ 1,15-2,06 (m, 10Η), 4,56 (t, 2H), 6,26-6,49 (m, 2H), 7,35-7,58 (m, 2H) Σα διμερι παράγωγα που παραλιωκθκαν αρχικά ωσ δευτερεφοντα προϊόντα των αντιδράςεων ςφνκεςθσ των α-(ω-βρωμοαλκυλο)-5-(1h-πυρρολ-1-υλο)-2hτετραηολίων, κακϊσ παραλαμβάνονται ςε μικροποςότθτεσ, ςτθ ςυνζχεια παραςκευάςτθκαν ςε μεγαλφτερεσ ποςότθτεσ με τθ μζκοδο που ακολουκεί. ΓΔΜΘΙΖ ΛΔΗΞΔΞΡ ΡΣΜΗΔΡΖΡ ΩΜ Α,Ω-ΔΘΡ[5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-2H- ΔΠΑΕΞΚ-2-ΣΚ]ΑΚΙΑΜΘΩΜ ε διάλυμα του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου (2 geq) ςε ξθρό THF που βρίςκεται υπό ανάδευςθ και ςε ατμόςωαιρα N 2, προςτίκεται το 2-(βρωμοαλκυλο)- 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-2Η-τετραηόλιο και καταλυτικι ποςότθτα χλωριοφχου άλατοσ τθσ τριβουτυλοβενηυλαμίνθσ. Ακολοφκωσ, λαμβάνει χϊρα προςκικθ του NaH (3 geq) υπό ψφξθ και με ςυνεχι ανάδευςθ. τθ ςυνζχεια, απομακρφνεται το παγόλουτρο και θ αντίδραςθ αωινεται ςε ατμόςωαιρα Ν 2 και κερμοκραςία βραςμοφ για 14 h. το τζλοσ των 14 h, το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αποχφνεται ςε ποτιρι ηζςεωσ που ζχει 50 ml 5% ΗCl με πάγο και 50 ml CH 2 Cl 2 και βρίςκεται υπό ανάδευςθ. Ακολουκεί διαχωριςμόσ των δφο ωάςεων και εκχφλιςθ τθσ υδατικισ 48

49 ωάςθσ με 2x50 ml CH 2 Cl 2. υλλζγεται θ οργανικι ωάςθ και κατεργάηεται με NaHCO 3 προσ εξουδετζρωςθ εναπομείναντοσ HCl. Ακολουκεί πλφςθ με brine και προςκικθ ξθραντικοφ Na 2 SO 4. Σζλοσ, θ οργανικι ωάςθ ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ μζχρι ξθροφ. Απομονϊνονται το κυρίωσ προϊόν και ζνα παραπροϊόν με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και κατάλλθλο ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ: πετρελαϊκόσ αικζρασ/ οξικόσ αικυλεςτζρασ (CHAC-1a 5:1, CHAC-2a 8:1, CHAC-3a 10:1). 1,5-ΔΘΡ[5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-2H-ΔΠΑΕΞΚ-2-ΣΚΞ]ΟΔΜΑΜΘΞ (CHAC- 1Α) Από αρχικά 204 mg (0,72 mmol) 2-(5-βρωμοπεντυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)- 2H-τετραηολίου ςε 10 ml THF, 195 mg (1,44 mmol) 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Ητετραηολίου, 86 mg (2,16 mmol) NaH (60%) και 51 mg (0,17 mmol) χλωριοφχου άλατοσ τθσ τριβουτυλoβενηυλαμίνθσ ςυλλζγονται 160 mg 1,5-δις(5-(1H-πυρρολ-1- υλo)-2h-τετραηολ-2-υλo)πεντανίου. Αναλυτικό δείγμα του λαμβάνεται μετά από ανακρυςτάλλωςθ με CH 2 Cl 2 / πετρελαϊκό αικζρα. Απόδοςθ αντίδραςθσ: 66% ς.τ.: 85 ο C 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ (m, 6H), 4,56 (t, 4H), 6,24-6,52 (m, 4H), 7,32-7,60 (m, 4H) τοιχειακι ανάλυςθ C 15 H 18 N 10 : κεωρθτικά υπολογιςμζνεσ τιμζσ C: 53.24, H: 5.36, N: 41.39, ευρεκζντα αποτελζςματα: C: 53.29, H:5.24, N: ,6-ΔΘΡ[5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚO)-2H-ΔΠΑΕΞΚ-2-ΣΚ]ΔΝΑΜΘΞ (CHAC-2Α) Από αρχικά 99 mg (0,33 mmol) 2-(6-βρωμοεξυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2Hτετραηολίου ςε 5 ml THF, 89 mg (0,66 mmol) 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου, 31 mg (0,77 mmol) NaH (60%) και 12 mg (0,04 mmol) χλωριοφχου άλατοσ τθσ τριβουτυλοβενηυλαμίνθσ ςυλλζγονται 79 mg 1,6-δις(5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2Hτετραηολ-2-υλ)εξανίου. Αναλυτικό δείγμα του λαμβάνεται μετά από ανακρυςτάλλωςθ με CH 2 Cl 2 / πετρελαϊκό αικζρα. Απόδοςθ αντίδραςθσ: 68% ς.τ.: 108 ο C 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ 1,21-2,36 (m, 8H), 4,55 (t, 4H), 6,27-6,52 (m, 4H), 7,34-7,60 (m, 4H) τοιχειακι ανάλυςθ C 16 H 20 N 10 : κεωρθτικά υπολογιςμζνεσ τιμζσ C: 54.53, H: 5.72, N: 39.75, ευρεκζντα αποτελζςματα: C: 54.38, H:5.45, N:

50 1,7-ΔΘΡ[5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-2H-ΔΠΑΕΞΚ-2-ΣΚ]ΔΟΑΜΘΞ (CHAC- 3Α) Από αρχικά 175 mg (0,56 mmol) 2-(6-βρωμοεπτυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)- 2H-τετραηολίου ςε 10 ml THF, 151 mg (1,12 mmol) 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Ητετραηολίου, 69 mg (0,99 mmol) NaH (60%) και 40 mg (0,13 mmol) χλωριοφχου άλατοσ τθσ τριβουτυλβενηυλαμίνθσ, παραλάβαμε 194 mg 1,7-δις(5-(1H-πυρρολ-1- υλο)-2h-τετραηολ-2-υλ)επτανίου το οποίο ςτθ ςυνζχεια κρυςταλλϊκθκε με πετρελαϊκό αικζρα υψθλοφ ςθμείου ηζςεωσ ( o C). Απόδοςθ αντίδραςθσ: 95% ς.τ.: 60 ο C 1 Η-NMR (CDCl 3 ): 1,11-1,55 (m, 6H), 1,79-2,25 (m, 4Η), 4,55 (t, 4H), 6,27-6,49 (m, 4H), 7,35-7,58 (m, 4H) τοιχειακι ανάλυςθ C 17 H 22 N 10 : κεωρθτικά υπολογιςμζνεσ τιμζσ ( εξάνιο) C: 56,11, H: 6,20, N: 37,69, ευρεκζντα αποτελζςματα: C: 56,47, H:6,06, N: 37,82 Σο πιο δραςτικό μζλοσ τθσ ςειράσ αυτισ των παραγϊγων ςυντζκθκε και με απευκείασ αντίδραςθ του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου με το αντίςτοιχο α,ω-διβρωμοαλκάνιο. ΛΔΗΞΔΞΡ ΡΣΜΗΔΡΖΡ ΞΣ 1,6-ΔΘΡ[5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-2H- ΔΠΑΕΞΚ-2-ΣΚ]ΔΝΑΜΘΞΣ ΛΔ ΑΟΔΣΗΔΘΑΡ ΑΜΘΔΠΑΡΖ ΛΔ Ξ 1,6- ΔΘΒΠΩΛΞΔΝΑΜΘΞ ε διάλυμα του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου (200 mg, 1,48 mmol) ςε ξθρό THF (10 ml) που βρίςκεται υπό ανάδευςθ και ςε ατμόςωαιρα N 2 προςτίκεται το 1,6-διβρωμοεξάνιο (120 mg, 0,49 mol) και καταλυτικι ποςότθτα χλωριοφχου άλατοσ τθσ τριβουτυλoβενηυλαμίνθσ (22 mg, 0,07 mmol). Ακολοφκωσ, λαμβάνει χϊρα προςκικθ του NaH (60%) (133 mg, 3,33 mmol) υπό ψφξθ και με ςυνεχι ανάδευςθ. τθ ςυνζχεια απομακρφνεται το παγόλουτρο και θ αντίδραςθ αωινεται ςε ατμόςωαιρα N 2 και κερμοκραςία βραςμοφ για 22 h. το τζλοσ των 22 h το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αποχφνεται ςε ποτιρι ηζςεωσ που ζχει 50 ml 5% ΗCl με πάγο και 50 ml CH 2 Cl 2 και βρίςκεται υπό ανάδευςθ. Ακολουκεί διαχωριςμόσ των δφο ωάςεων και εκχφλιςθ τθσ υδατικισ ωάςθσ με 2x50 ml CH 2 Cl 2. υλλζγεται θ οργανικι ωάςθ και κατεργάηεται με NaHCO 3 προσ εξουδετζρωςθ εναπομείναντοσ HCl. Ακολουκεί πλφςθ με brine και προςκικθ ξθραντικοφ Na 2 SO 4. Σζλοσ, θ οργανικι ωάςθ ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ μζχρι ξθροφ. Σο προϊόν απομονϊνεται 50

51 με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και κατάλλθλο ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ: πετρελαϊκόσ αικζρασ/ οξικόσ αικυλεςτζρασ 8:1. Λαμβάνονται 125 mg 1,6-δις(5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολ-2-υλ)εξανίου Απόδοςθ αντίδραςθσ: 72% ΓΔΜΘΙΖ ΛΔΗΞΔΞΡ ΡΣΜΗΔΡΖΡ ΩΜ S-[5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-2Η- ΔΠΑΕΞΚ-2-ΣΚ]ΑΚΙΣΚ ΑΙΔΣΚΗΔΘΔΡΔΠΩΜ φμωωνα με τθ δθμοςιευμζνθ μζκοδο (Suzuki, et al. 2005), ςε αικανολικό διάλυμα (10 ml) του 2-(6-βρωμοαλκυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολίου (1 mmol) που βρίςκεται υπό ανάδευςθ ςε ατμόςωαιρα N 2, προςτίκενται 3,6 mmol, μετά καλλίου άλατοσ του ακετυλκειεςτζρα και θ αντίδραςθ αωινεται ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ για 24 h. Με τθν ολοκλιρωςθ των 24 h, το μίγμα τθσ αντίδραςθσ αραιϊνεται με οξικό αικυλεςτζρα (περίπου 40 ml) και πραγματοποιοφνται πλφςεισ με νερό (3x20 ml) και διαχωριςμόσ των δφο ωάςεων. Η οργανικι ωάςθ ςυλλζγεται και υπόκειται ςε πλφςθ με brine, προςκικθ ξθραντικοφ Na 2 SO 4 και ςυμπφκνωςθ μζχρι ξθροφ. Η απομόνωςθ πραγματοποιείται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash και κατάλλθλο ςφςτθμα διαλυτϊν ζκλουςθσ: πετρελαϊκόσ αικζρασ/ οξικόσ αικυλεςτζρασ (CHAC-1 10:1, CHAC-2 15:1, CHAC-3 19:1). S-5-[5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚO)-2Η-ΔΠΑΕΞΚ-2-ΣΚO]ΟΔΜΣΚ ΑΙΔΣΚΗΔΘΔΡΔΠΑΡ (CHAC-1) Από αρχικά 300 mg 2-(6-βρωμοπεντυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολίου ςυλλζγονται 224 mg 6-[5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2Η-τετραηολ-2-υλο+πεντυλ ακετυλκειεςτζρα (ρευςτό λάδι καςτανζρυκρου χρϊματοσ) Απόδοςθ αντίδραςθσ: 76% 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ 1,21-2,19 (m, 6Η), 2,29 (s, 3H), 2,85 (t, 2H), 4,55 (t, 2H), 6,23-6,43 (m, 2H), 7,39-7,60 (m, 2H) IR (neat): 1978 cm -1 τοιχειακι ανάλυςθ C 12 H 17 N 5 OS: κεωρθτικά υπολογιςμζνεσ τιμζσ (+ 0,18 CH 2 Cl 2 ) C: 49.65, H: 5.94, N: 23.77, ευρεκζντα αποτελζςματα: C: 49.90, H:5.70, N:

52 S-6-[5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-2Η-ΔΠΑΕΞΚ-2-ΣΚ]ΔΝΣΚ ΑΙΔΣΚΗΔΘΔΡΔΠΑΡ (CHAC-2) Από αρχικά 310 mg 2-(6-βρωμοπεντυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2H-τετραηολίου ςυλλζγονται 240 mg 6-[5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2Η-τετραηολ-2-υλο+πεντυλ ακετυλκειεςτζρα (ρευςτό λάδι καςτανζρυκρου χρϊματοσ) Απόδοςθ αντίδραςθσ: 81% 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ 1,31-1,73 (m, 6Η), 1,89-2,15 (m, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,85 (t, 2H), 4,53 (t, 2H), 6,29-6,50 (m, 2H), 7,35-7,61 (m, 2H) IR (neat): 1960 cm -1 τοιχειακι ανάλυςθ C 13 H 19 N 5 OS: κεωρθτικά υπολογιςμζνεσ τιμζσ C: 53.22, H: 6.53, N: 23.87, ευρεκζντα αποτελζςματα: C: 53.07, H:6.25, N: S-7-[5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-2Η-ΔΠΑΕΞΚ-2-ΣΚ]ΔΟΣΚ ΑΙΔΣΚΗΔΘΔΡΔΠΑΡ (CHAC-3) Από αρχικά 305 mg 2-(6-βρωμοεπτυλο)-5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2Hτετραηολίου ςυλλζγονται 202 mg 6-[5-(1H-πυρρολ-1-υλο)-2Η-τετραηολ-2-υλ+επτυλ ακετυλκειεςτζρα (ρευςτό λάδι καςτανζρυκρου χρϊματοσ) Απόδοςθ αντίδραςθσ: 67% 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ 1,10-2,17 (m, 10H), 2,30 (s, 3H), 2,85 (t, 2H), 4,54 (t, 2H), 6,26-6,48 (m, 2H), 7,35-7,58 (m, 2H) IR (neat): 1975 cm -1 ΡΣΜΗΔΡΖ ΔΜΩΡΔΩΜ ΟΠΞΣΟΔΡ ΔΜΩΡΔΘΡ ΟΑΠΑΓΩΓΑ ΖΡ 2,6- ΔΘΤΗΞΠΞ-3-(1Η-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚ)-ΤΑΘΜΞΚΖΡ ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ [1-(2,4-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΛΔΗΞΝΣΤΑΘΜΣΚΞ)-1H-ΟΣΠΠΞΚ-3- ΣΚΞ]ΤΑΘΜΣΚΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (CAR-1A) Πρόκειται για τροποποίθςθ τθσ ςφηευξθσ Ullman, θ οποία πραγματοποιείται ςφμωωνα με δθμοςιευμζνθ μζκοδο (Antilla, et al. 2004). υγκεκριμζνα 1 g (3,7 mmol) 1,3-διωκορο-4-ιωδο-2-μεκοξυβενηολίου διαλφεται ςε 4 ml ξθροφ και απεςταγμζνου τολουολίου και τίκεται υπό ανάδευςθ ςε ατμόςωαιρα Ν 2. Προςτίκενται 528 mg (3,08 mmol) ωαινυλο(1h-πυρρολ-3-υλο)μεκανόνθσ, 1,373 g 52

53 (6,468 mmol), K 3 PO 4, 100 μl (88 mg, 0,616 mmol) trans-τετραμεκυλκυκλοεξανο-1,2- διαμίνθσ και τζλοσ 29 mg (0,154 mmol) CuI. Με τθν προςκικθ του τελευταίου το μίγμα παίρνει κυανοπράςινο χρϊμα και θ αντίδραςθ τίκεται ςτουσ 110 ο C για 24 h. Ακολουκεί ψφξθ ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ, προςκικθ 2-3 ml οξικοφ αικυλεςτζρα και διικθςθ με θκμό που ζχει ςτρϊμα ςίλικασ. Σο ίηθμα πλζνεται με επιπρόςκετα ml οξικοφ αικυλεςτζρα. τθ ςυνζχεια ςτο διικθμα προςτίκεται ίςοσ όγκοσ NaHCO 3 και διαχωριςμόσ των δφο ωάςεων. Η απομόνωςθ του προϊόντοσ πραγματοποιικθκε με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash ςε ςφςτθμα πετρελαϊκοφ αικζρα/οξικοφ αικυλεςτζρα 10:1. Παραλάβαμε 833 mg προϊόντοσ. Απόδοςθ: 86% ς.τ.: 60 o C 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ 4,05 (s, 3Η), 6,79-8,00 (m, 10Η) IR (nujol): 1978 cm -1 τοιχειακι ανάλυςθ C 18 H 13 F 2 NO 2 : κεωρθτικά υπολογιςμζνεσ τιμζσ (+ 0,02 CH 2 Cl 2 ) C: 68.71, H: 4.17, N: 4.45, ευρεκζντα αποτελζςματα: C: 68.75, H:4.00, N: 4.37 ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ [1-(2,4-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΣΔΠΞΝΣΤΑΘΜΣΚΞ)-1H-ΟΣΠΠΞΚ-3- ΣΚΞ]ΤΑΘΜΣΚΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (CAR-1) Πρόκειται για αντίδραςθ ςχάςθσ αικερικοφ δεςμοφ, θ οποία πραγματοποιικθκε ςφμωωνα με τθ δθμοςιευμζνθ μζκοδο (Qui, et al. 1999). 200 g [1-(2,4-διωκορο-3-μεκοξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-3-υλο+ωαινυλμεκανόνθσ τίκενται υπό ανάδευςθ με 3,5 ml παγόμορωου οξικοφ οξζοσ και προςτίκενται 3,5 ml HBr (48%). Η αντίδραςθ αωινεται ςε κερμοκραςία βραςμοφ 120 ο C και ατμόςωαιρα αηϊτου για 12 h. το τζλοσ των 12 h, το μίγμα τθσ αντίδραςθσ ψφχεται ςε κερμοκραςία δωματίου και ςυμπυκνϊνεται μζχρι ξθροφ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Η απομόνωςθ του τελικοφ προϊόντοσ πραγματοποιικθκε με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash ςε ςφςτθμα διαλυτϊν πετρελαϊκοφ αικζρα/ οξικοφ αικυλεςτζρα 4:1. Ακολοφκθςε ανακρυςτάλλωςθ με CH 2 Cl 2 / πετρελαϊκό αικζρα. υλλογι 89 mg [1-(2,4-διωκορο-3-υδροξυωαινυλo)-1H-πυρρολ-3-υλo+ωαινυλομεκανόνθσ Απόδοςθ: 45% ς.τ.: o C 53

54 1 Η-NMR (CDCl 3, DMSO-d 6 ): δ 6,79-7,08 (m, 4Η), 7,38-7,64 (m, 4Η), 7,76-7,98 (m, 4Η) IR (nujol): 1978 cm -1 τοιχειακι ανάλυςθ C 17 H 11 F 2 NO 2 : κεωρθτικά υπολογιςμζνεσ τιμζσ (+ 0,15 CH 2 Cl 2 ) C: 66.02, H: 3.65, N: 4.49, ευρεκζντα αποτελζςματα: C: 66.00, H:3.50, N: 4.42 ΟΠΞΡΟΑΗΔΘΑ ΡΣΜΗΔΡΖΡ ΖΡ [1-(2,4-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΛΔΗΞΝΣΤΑΘΜΣΚΞ)-1H- ΟΣΠΠΞΚ-2-ΣΚΞ]ΤΑΘΜΣΚΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (CAR-2A) Ακολουκϊντασ τθ μζκοδο που εωαρμόςτθκε για τθ ςφνκεςθ τθσ *1-(2,4-διωκορο-3- μεκοξυωαινυλο)-1η-πυρρολ-3-υλο+ωαινυλμεκανόνθσ με ακριβϊσ τισ ίδιεσ ποςότθτεσ αντιδρϊντων θ αντίδραςθ δεν προχϊρθςε. Ζλεγχοσ με χρωματογραωία λεπτισ ςτιβάδασ ζδειξε το ςχθματιςμό πολλϊν προϊόντων αλλά χωρίσ κάποιο κφριο κακϊσ και ότι ςθμαντικι ποςότθτα των αρχικϊν δεν αντζδραςε. Για το λόγο αυτό δοκιμάςτθκε θ εναλλακτικι μζκοδοσ που περιγράωεται παρακάτω. ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ [1-(2,4-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΛΔΗΞΝΣΤΑΘΜΣΚΞ)-1H-ΟΣΠΠΞΚ-2- ΣΚΞ]ΤΑΘΜΣΚΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (CAR-2A) φμωωνα με τθ δθμοςιευμζνθ μζκοδο (Zhu, et al. 2007b) 998 mg (3,7 mmol) 1,3-διωκορο-4-ιωδο-2-μεκοξυβενηολίου, 887 mg (5,18 mmol) ωαινυλο-(1η-πυρρολ- 2-υλο)-μεκανόνθσ, 141 mg (0,74 mmol) CuI, 2,412 g (7,4 mmol) Cs 2 CO 3 μαηί με διαλφτθ DMF (8 ml, ξθροφ και ελεφκερου διαλυμζνων αερίων) τίκενται υπό ανάδευςθ ςε ατμόςωαιρα Ν 2 και κερμοκραςία δωματίου για 30 min. τθ ςυνζχεια θ αντίδραςθ κερμαίνεται ςτουσ 120 o C για 40 h. Κατά τθν ζναρξθ, το μίγμα τθσ αντίδραςθσ ζχει ανοιχτό πράςινο χρϊμα το οποίο βακμιαία ςκουραίνει κατά τθ διάρκεια τθσ αντίδραςθσ μζχρι να γίνει ςκοφρο καωζ ςτο τζλοσ τθσ. τθ ςυνζχεια προςτίκενται ςτο μίγμα περίπου 10 ml AcOEt και ακολουκεί διικθςθ υπό κενό με θκμό που ζχει επιπλζον ςτρϊμα ςίλικασ. Σο ίηθμα πλζνεται πολλζσ ωορζσ με AcOEt, μζχρι να μθν εμωανίηεται προϊόν ςε ζλεγχο με χρωματογραωία λεπτισ ςτιβάδασ (TLC). Απομόνωςθ του τελικοφ προϊόντοσ πραγματοποιείται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash ςε ςφςτθμα διαλυτϊν πετρελαϊκόσ αικζρασ/ οξικόσ αικυλεςτζρασ 13:1. υλλογι 618 mg [1-(2,4-διωκορο-3-μεκοξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-2-υλο+ωαινυλομεκανόνθσ Απόδοςθ: 64% 1 Η-NMR (CDCl 3, DMSO-d 6 ): δ 4,00 (s, 3Η), 6,06-6,23 (m, 1Η), 6,63-6,80 (m, 2Η), 6,83-7,07 (m, 2H), 7,32-7,66 (m, 4H), 7,69-7,96 (m, 2H) 54

55 IR (nujol): 1974 cm -1 ΟΠΞΡΟΑΗΔΘΑ ΡΣΜΗΔΡΖΡ ΖΡ [1-(2,4-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΣΔΠΞΝΣΤΑΘΜΣΚΞ)-1H- ΟΣΠΠΞΚ-2-ΣΚΞ]ΤΑΘΜΣΚΞΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (CAR-2) Ακολουκϊντασ τθ μζκοδο που εωαρμόςτθκε για τθ ςφνκεςθ τθσ *1-(2,4-διωκορο-3- υδροξυωαινυλο)-1η-πυρρολ-3-υλο+ωαινυλομεκανόνθσ με ακριβϊσ τισ ίδιεσ ποςότθτεσ αντιδρϊντων θ αντίδραςθ δεν προχϊρθςε. Ζλεγχοσ με χρωματογραωία λεπτισ ςτιβάδασ ζδειξε το ςχθματιςμό πολλϊν προϊόντων αλλά χωρίσ κάποιο κφριο. Για το λόγο αυτό δοκιμάςτθκε θ εναλλακτικι μζκοδοσ που περιγράωεται παρακάτω. ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ [1-(2,4-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΣΔΠΞΝΣΤΑΘΜΣΚΞ)-1H-ΟΣΠΠΞΚ-2- ΣΚΞ]ΤΑΘΜΣΚΞΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (CAR-2) φμωωνα με τθ μζκοδο τθσ βιβλιογραωίασ (Mc Omie 1968), 100 mg (0.32 mmol) [1-(2,4-διωκορο-3-μεκοξυωαινυλο)-1Η-πυρρολ-2-υλο+ωαινυλομεκανόνθσ διαλφονται ςε 1 ml ξθρό CH 2 Cl 2. Σο διάλυμα τίκεται ςε ατμόςωαιρα Ν 2 ςτουσ -50 ο C και προςτίκενται 0,8ml (0,8 mmol) BBr 3 (διάλυμα 1Μ ςε CH 2 Cl 2 ). τθ ςυνζχεια απομακρφνεται θ ψφξθ και θ αντίδραςθ αωινεται ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ και ατμόςωαιρα αηϊτου για 24 h. το πζρασ των 24 h προςτίκενται 5 ml Η 2 Ο και θ αντίδραςθ αωινεται υπό ανάδευςθ για 30 min. Ακολουκεί εκχφλιςθ με 3x10 ml CH 2 Cl 2 και θ οργανικι ωάςθ ςυμπυκνϊνεται υπό ελαττωμζνθ πίεςθ. Απομόνωςθ του τελικοφ προϊόντοσ πραγματοποιείται με χρωματογραωία ςτιλθσ με τθ μζκοδο flash ςε ςφςτθμα διαλυτϊν πετρελαϊκόσ αικζρασ/ οξικόσ αικυλεςτζρασ 6:1. υλλογι 11 mg [1-(2,4-διωκορο-3-υδροξυωαινυλο)-1H-πυρρολ-2-υλο+ωαινυλομεκανόνθσ και 71 mg αρχικισ Απόδοςθ: 11% ς.τ.: 137 o C 1 Η-NMR (CDCl 3 ): δ 6,28-6,61 (m, 2Η), 6,74-7,10 (m, 4Η), 7,37-7,63 (m, 3Η), 7,74-8,00 (m, 2H) IR (nujol): 1975 cm -1 55

56 IΜ VITRO ΛΔΚΔΖ ΖΡ ΘΙΑΜΞΖΑΡ ΑΜΑΡΞΚΖΡ ΖΡ ΑΜΑΓΩΓΑΡΖΡ ΖΡ ΑΚΔΞΕΖΡ (ALR2) (Kador and Sharpless 1978, De Ruiter, et al. 1987, Demopoulos and Rekka 1995, Nicolaou and Demopoulos 2003, Nicolaou, et al. 2004) ΣΚΘΙΑ - ΔΘΑΚΣΛΑΑ Για τθν διεξαγωγι του πειράματοσ παραςκευάηονται τα ακόλουκα διαλφματα: Ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 0,067 M (ph=6,2), διάλυμα NADPH 0,104 mm (το διάλυμα γίνεται τθν θμζρα του πειράματοσ και διατθρείται ςε πάγο), διάλυμα DL-γλυκεραλδεψδθσ 10 mm (το διάλυμα γίνεται τθν θμζρα του πειράματοσ και διατθρείται ςε πάγο), κορεςμζνο διάλυμα (NH 4 ) 2 SO 4 και τζλοσ υδατικά διαλφματα 10% DMSO τθσ υπό εξζταςθσ ουςίασ ςε ςυγκεντρϊςεισ από 10-4 Μ ωσ 10-6 Μ. ΘN VITRO ΟΔΘΠΑΛΑΘΙΞ ΟΠΩΞΙΞΚΚΞ ΟΠΞΡΔΘΞΠΘΡΛΞΣ ΖΡ ΘΙΑΜΞΖΑΡ ΑΜΑΡΞΚΖΡ ΞΣ ΔΜΕΣΛΞΣ ΑΜΑΓΩΓΑΡΖ ΖΡ ΑΚΔΞΕΖΡ (ALR2) Σο ζνηυμο τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ απομονϊνεται από ωακοφσ επιμφων με τθ διαδικαςία τθσ κλαςματοποίθςθσ με χριςθ κειικοφ αμμωνίου (NH 4 ) 2 SO 4. Σα ηϊα υπόκεινται ςε ευκαναςία και ταχζωσ απομακρφνονται οι ωακοί από επιμφεσ Fisher-344 και των δυο ωφλων. Σο ακατζργαςτο ενηυμικό υπερκείμενο παραςκευάηεται με ομογενοποίθςθ 10 ωακϊν ςε 5 ml ψυχροφ δις-απιονιςμζνου νεροφ και το ομογενοποίθμα ωυγοκεντρείται ςτισ rpm για 15 ςε κερμοκραςία 4 C. Σο υπερκείμενο λαμβάνεται, προςτίκεται διάλυμα (NH 4 ) 2 SO 4 μζχρισ ότου επιτευχκεί κορεςμόσ 40 % και αναδεφεται ζντονα. Σο μίγμα που προκφπτει ωυγοκεντρείται ςτισ rpm για 15 ςε κερμοκραςία 4 C και λαμβάνεται το υπερκείμενο. Η δραςτικότθτα του ενηφμου αναγωγάςθ τθσ αλδόηθσ (ALR2), που εμπεριζχεται ςε πρόςωατα παραςκευαςμζνο 40 % υπερκείμενο κειικοφ αμμωνίου, μετράται ωαςματοωωτομετρικά ςτουσ 30 C με προςδιοριςμό τθσ μείωςθσ τθσ ςυγκζντρωςθσ του NADPH ςε λ = 340nm. Σο μίγμα τθσ αντίδραςθσ περιζχει 2,4ml ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 0,067 M (ph = 6,2), 100 μl διάλυμα NADPH 0,104 mm, 100 μl διάλυμα DL-γλυκεραλδεψδθσ 10 mm και 300 μl υπερκείμενο του ενηυμικοφ παραςκευάςματοσ ςε τελικό όγκο 1,1 ml. Σο δείγμα 56

57 αναωοράσ περιζχει όλα τα παραπάνω εκτόσ από το υπόςτρωμα DL-γλυκεραλδεψδθ, για τυχόν διόρκωςθ τθσ οξείδωςθσ του NADPH που δεν ςυνδζεται με τθν αναγωγι του υποςτρϊματοσ. Η καταλυόμενθ από το ζνηυμο αντίδραςθ αρχίηει με τθ προςκικθ του υποςτρϊματοσ και παρακολουκείται για χρονικό διάςτθμα 5 λεπτϊν, μετά από ιςορρόπθςθ τθσ αντίδραςθσ για 1 λεπτό. Η δραςτικότθτα του ενηφμου ρυκμίηεται με τθν αραίωςθ του υπερκείμενου με δις-απεςταγμζνο νερό, ζτςι ϊςτε θ ταχφτθτα τθσ αντίδραςθσ να είναι ~0,02 ι 0,01 μονάδεσ απορρόωθςθσ ανά λεπτό. Η επίδραςθ τω αναςτολζων ςτθν δραςτικότθτα του ενηφμου υπολογίηεται με τθ προςκικθ 100 μl υδατικό διάλυμα 10% DMSO του αναςτολζα ςτο μίγμα. Γίνεται επίςθσ προςκικθ του αντίςτοιχου αναςτολζα και ςτο δείγμα αναωοράσ, για τθ διόρκωςθ τυχόν απορρόωθςθσ που οωείλεται ςτον αναςτολζα. ΑΜΑΚΣΡΖ ΔΔΔΞΛΔΜΩΜ ΙΑΘ ΡΑΘΡΘΙΖ ΔΟΔΝΔΠΓΑΡΘΑ Σο ποςοςτό τθσ αναςτολισ του ενηφμου από κάκε αναςτολζα υπολογίηεται με ςφγκριςθ τθσ ταχφτθτασ αντίδραςθσ του διαλφματοσ που περιζχει υπόςτρωμα και αναςτολζα ςε ςχζςθ με το διάλυμα που περιζχει μόνο υπόςτρωμα (control), ςφμωωνα με τον ακόλουκο τφπο: % αναστολή = ταχφτθτα ( control) ταχφτθτα (αναςτολζα) ταχφτθτα ( control) 100 τθ ςυνζχεια προςδιορίηεται θ μζςθ αναςταλτικι ςυγκζντρωςθ (ΙC 50 ), δθλαδι θ ςυγκζντρωςθ τθσ ουςίασ που απαιτείται για να προκαλζςει αναςτολι του ενηφμου κατά 50 %. Για τον προςδιοριςμό των τιμϊν ΙC 50 οι ενϊςεισ μελετικθκαν ςε τουλάχιςτο 5 ςυγκεντρϊςεισ. Οι καμπφλεσ λογαρίκμου δόςθσ-βιολογικισ δράςθσ καταςκευάςτθκαν με ανάλυςθ παλινδρόμθςθσ του ευκφγραμμου τμιματοσ τθσ αντίςτοιχθσ καμπφλθσ, με χριςθ του προγράμματοσ Microsoft Office Excel

58 IN VITRO ΛΔΚΔΖ ΖΡ ΘΙΑΜΞΖΑΡ ΑΜΑΡΞΚΖΡ ΖΡ ΑΜΑΓΩΓΑΡΖΡ ΩΜ ΑΚΔΔΫΔΩΜ (ALR1) (Constantino, et al. 1999, Stefek, et al. 2008) ΣΚΘΙΑ - ΔΘΑΚΣΛΑΑ Για τθν διεξαγωγι του πειράματοσ παραςκευάηονται τα ακόλουκα διαλφματα: Ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 0,1 M (ph = 7,2) κακϊσ επίςθσ και ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 10 mm (ph=7,2) με αραίωςθ του προθγοφμενου 1:10, S-buffer (10 mm Phosphate buffer + 2 mm EDTA + 2 mm 2- μερκαπτοαικανόλθ), S-buffer + ςουκρόηθ (10 mm phosphate buffer + 0,25 Μ ςουκρόηθ + 2 mm EDTA + 2,5 mm 2-μερκαπτοαικανόλθ), διάλυμα NADPH 0,104 mm (το διάλυμα γίνεται τθν θμζρα του πειράματοσ και διατθρείται ςε πάγο), διάλυμα του μετά νατρίου άλατοσ του γλυκουρονικοφ οξζοσ 600 mm (το διάλυμα γίνεται τθν θμζρα του πειράματοσ και διατθρείται ςε πάγο), κορεςμζνο διάλυμα (NH 4 ) 2 SO 4 και τζλοσ 10% υδατικά διαλφματα DMSO τθσ υπό εξζταςθσ ουςίασ ςε διάωορεσ ςυγκεντρϊςεισ. IN VITRO ΟΔΘΠΑΛΑΘΙΞ ΟΠΩΞΙΞΚΚΞ ΟΠΞΡΔΘΞΠΘΡΛΞΣ ΖΡ ΘΙΑΜΞΖΑΡ ΑΜΑΡΞΚΖΡ ΞΣ ΔΜΕΣΛΞΣ ΑΜΑΓΩΓΑΡΖ ΩΜ ΑΚΔΔΫΔΩΜ (ALR1) Σο ζνηυμο τθσ αναγωγάςθσ των αλδεχδϊν απομονϊνεται από νεωροφσ επιμφων με τθ διαδικαςία τθσ κλαςματοποίθςθσ με χριςθ κειικοφ αμμωνίου (NH 4 ) 2 SO 4. Οι νεωροί απομακρφνονται γριγορα από επιμφεσ Fisher-344 του ίδιου ωφλου και βάρουσ όχι μεγαλφτερου από 250 g, μετά από ευκαναςία των πειραματόηωων με χριςθ αικζρα. τθ ςυνζχεια οι δυο νεωροί ηυγίηονται και ομογενοποιοφνται ςε τριπλάςιο όγκο (ml) διαλφματοσ S-buffer + ςουκρόηθ. Σο ομογενοποίθμα ωυγοκεντρείται ςτισ rpm για 30 ςτουσ 0-4 C. Σο υπερκείμενο λαμβάνεται, προςτίκεται διάλυμα (NH 4 ) 2 SO 4 μζχρισ ότου επιτευχκεί κορεςμόσ 40 % και αναδεφεται ζντονα. τθ ςυνζχεια το διάλυμα αωινεται ςε θρεμία για 30 και αναδεφεται ιπια ανά τακτά χρονικά διαςτιματα και ακολουκεί ωυγοκζντρθςθ του διαλφματοσ ςτα g για 30 ςτουσ 0-4 C. Λαμβάνεται το υπερκείμενο κλάςμα και αναμειγνφεται ξανά με κορεςμζνο διάλυμα (NH 4 ) 2 SO 4 και αναδεφεται ζντονα, ϊςτε να επιτευχκεί κορεςμόσ 50 %. τθ ςυνζχεια το διάλυμα αωινεται ςε θρεμία για 30 και αναδεφεται ιπια ανά τακτά χρονικά διαςτιματα και ακολουκεί ωυγοκζντρθςθ του διαλφματοσ ςτισ rpm για 30 ςτουσ 0-4 C. Λαμβάνεται το υπερκείμενο κλάςμα και αναμειγνφεται ξανά με κορεςμζνο 58

59 διάλυμα (NH 4 ) 2 SO 4 και αναδεφεται ζντονα, ϊςτε να επιτευχκεί κορεςμόσ 75 %. τθ ςυνζχεια το διάλυμα αωινεται ςε θρεμία για 30 και αναδεφεται ιπια ανά τακτά χρονικά διαςτιματα και ακολουκεί ωυγοκζντρθςθ του διαλφματοσ ςτισ rpm για 30 ςτουσ 0-4 C. Αποχφνεται το υπερκείμενο κλάςμα και γίνεται επαναδιάλυςθ του pellet ςε κατάλλθλθ ποςότθτα διαλφματοσ S-buffer ϊςτε θ ςυγκζντρωςθ του ενηφμου να είναι ~20 mg/ml. τθ ςυνζχεια γίνεται προςκικθ διαικυλαμινοαικυλοκελουλόηθσ (DEAE-cellulose) [330 mg/10ml+ και μετά από θρεμία του διαλφματοσ για 15 αυτό ωυγοκεντρείται ςτισ rpm για 15 ςτουσ 0-4 C. Σο υπερκείμενο διάλυμα αποτελεί το ενηυμικό παραςκεφαςμα που κα χρθςιμοποιθκεί περαιτζρω ςτο ενηυματικό πρωτόκολλο. Η δραςτικότθτα του ενηφμου (control) κακϊσ και θ ικανότθτα αναςτολισ αυτοφ από τισ εξεταηόμενεσ ενϊςεισ προςδιορίηεται ωαςματοωωτομετρικά ςτα 340 nm με προςδιοριςμό τθσ μείωςθσ τθσ απορρόωθςθσ που οωείλεται ςτθν οξείδωςθ του NADPH υπό τθν καταλυτικι δράςθ τθσ ALR1. Όλεσ οι μετριςεισ γίνονται εισ τριπλοφν. Η αποτίμθςθ τθσ δράςθσ του ενηφμου γίνεται ςτουσ 30 C ςε αντιδρϊν μίγμα που αποτελείται από 2,4 ml ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 0,01 M (ph = 7,2), 100 μl διάλυμα NADPH 0,104 mm, 300 μl ενηυμικό παραςκεφαςμα, 100μl διάλυμα του μετά νατρίου άλατοσ του γλυκουρονικοφ οξζοσ 600 mm και 100 μl υδατικό διάλυμα 10 % DMSO ςε τελικό όγκο 1,1 ml. Σο διάλυμα του μετά νατρίου άλατοσ του γλυκουρονικοφ οξζοσ προςτίκεται ςτο τζλοσ και ςθματοδοτεί τθν ζναρξθ τθσ αντίδραςθσ, θ οποία παρακολουκείται για 5 με λιψθ των απορροωιςεων ανά 30 αωοφ όμωσ ζχει προθγθκεί ιςορρόπθςθ τθσ αντίδραςθσ για 1. Σο δείγμα τθσ αναωοράσ περιζχει όλα τα προθγοφμενα εκτόσ από το υπόςτρωμα του γλυκουρονικοφ οξζοσ, ϊςτε να διορκωκεί τυχϊν οξείδωςθ του NADPH που δεν οωείλεται ςτθν αναγωγι του υποςτρϊματοσ. Η ταχφτθτα τθσ ενηυμικισ αντίδραςθσ πρζπει να είναι ~0,02 ι 0,01 μονάδεσ απορρόωθςθσ ανά λεπτό και γίνεται ρφκμιςθ ςτα προαναωερόμενα όρια με αραίωςθ του ενηυμικοφ παραςκευάςματοσ αν χρειαςτεί. Όμοια γίνεται και θ αποτίμθςθ τθσ αναςταλτικισ δράςθσ των υπό μελζτθ ενϊςεων ςτουσ 30 C ςε αντιδρϊν μίγμα που αποτελείται από 2,4 ml ρυκμιςτικό διάλυμα ωωςωορικϊν ιόντων 0,01 M (ph = 7,2), 100μl διάλυμα NADPH 0,104 mm, 300 μl ενηυμικό παραςκεφαςμα, 100 μl διάλυμα του μετά νατρίου άλατοσ του γλυκουρονικοφ οξζοσ 600 mm και 100 μl διάλυμα τθσ ουςίασ ςε τελικό όγκο 1,1 ml. Σο δείγμα τθσ αναωοράσ περιζχει όλα τα προθγοφμενα εκτόσ από το υπόςτρωμα, ϊςτε να διορκωκεί εκτόσ από τθν τυχόν οξείδωςθ του NADPH που δεν οωείλεται ςτθν αναγωγι του υποςτρϊματοσ και θ ενδεχόμενθ απορρόωθςθ τθσ ουςίασ. 59

60 ΑΜΑΚΣΡΖ ΔΔΔΞΛΔΜΩΜ ΙΑΘ ΡΑΘΡΘΙΖ ΔΟΔΝΔΠΓΑΡΘΑ Σο ποςοςτό τθσ αναςτολισ του ενηφμου από κάκε αναςτολζα υπολογίηεται με ςφγκριςθ τθσ ταχφτθτασ αντίδραςθσ του διαλφματοσ που περιζχει υπόςτρωμα και αναςτολζα ςε ςχζςθ με το διάλυμα που περιζχει μόνο υπόςτρωμα (control), ςφμωωνα με τον ακόλουκο τφπο: % αναστολή = ταχφτθτα ( control) ταχφτθτα (αναςτολζα) ταχφτθτα ( control) 100 τθ ςυνζχεια προςδιορίηεται θ μζςθ αναςταλτικι ςυγκζντρωςθ (ΙC 50 ), δθλαδι θ ςυγκζντρωςθ τθσ ουςίασ που απαιτείται για να προκαλζςει αναςτολι του ενηφμου κατά 50 %. Για τον προςδιοριςμό των τιμϊν ΙC 50 οι ενϊςεισ μελετικθκαν ςε τουλάχιςτο 5 ςυγκεντρϊςεισ. Οι καμπφλεσ λογαρίκμου δόςθσ-βιολογικισ δράςθσ καταςκευάςτθκαν με ανάλυςθ παλινδρόμθςθσ του ευκφγραμμου τμιματοσ τθσ αντίςτοιχθσ καμπφλθσ, με χριςθ του προγράμματοσ Microsoft Office Excel

61 ΘΙΑΜΞΖΑ ΑΜΑΡΞΚΖΡ ΖΡ ΙΣΑΠΘΙΖΡ ΑΜΑΟΣΝΖΡ ΙΣΑΠΩΜ MEL ΙΑΘ ΔΟΑΓΩΓΖΡ ΖΡ ΔΘΑΤΞΠΞΟΞΘΖΡΖΡ ΞΣΡ ΙΑΚΚΘΔΠΓΔΘΔΡ ΩΜ ΔΠΣΗΠΞΚΔΣΥΑΘΛΘΙΩΜ ΙΣΑΠΩΜ MEL Ο ζλεγχοσ για τθν αναςτολι τθσ ανάπτυξθσ και τθν επαγωγι διαωοροποίθςθσ των παραγϊγων του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλ)-1Η-τετραηολίου πραγματοποιικθκε ςε ερυκρολευχαιμικά κφτταρα μυόσ (Murine Erythroleukemia Cells, MEL cells, επίςθσ γνωςτά και ωσ κφτταρα Friend). Κάποια ςτοιχεία για τα κφτταρα MEL ζχουν ιδθ αναωερκεί. Ο κλϊνοσ που χρθςιμοποιικθκε ςε αυτιν τθν εργαςία ιταν ο MEL-745PC-4. Σα κφτταρα αυτά αναπτφςςονται ςε καλλιζργειεσ, χωρίσ να προςκολλϊνται ςτο ςτερεό υπόςτρωμα των ωιαλϊν (tissue culture flasks). Για τθ διατιρθςθ των καλλιεργειϊν ςε εκκετικι ωάςθ ανάπτυξθσ, γινόντουςαν κατάλλθλεσ αραιϊςεισ των καλλιεργειϊν κάκε ϊρεσ με νζο κρεπτικό υγρό. Σα κφτταρα αυτά διατθροφνται και αναπτφςςονται ςε κρεπτικό υγρό DMEM που περιείχε 10% ορό εμβρφου μόςχου (fetal calf serum, FCS), 100 μg/ml βενηυλοπεινικιλλίνθσ και 100 μg/ml ςτρεπτομυκίνθσ, ςε κατάλλθλο επωαςτιρα (water-jacketed incubator τθσ Forma Scientific, Inc., U.S.A.), ςτουσ 37 ο C, ςε κορεςμζνθ με υδρατμοφσ ατμόςωαιρα και με ςυνεχι παροχι 5% CO 2. ΟΠΞΡΔΘΞΠΘΡΛΞΡ ΞΣ ΠΣΗΛΞΣ ΖΡ ΙΣΑΠΘΙΖΡ ΑΜΑΟΣΝΖΡ ΩΜ ΙΣΑΠΩΜ MEL Για τον προςδιοριςμό του ρυκμοφ τθσ κυτταρικισ αναπαραγωγισ των κυττάρων MEL ςτισ καλλιζργειεσ, γινόταν μζτρθςθ του αρικμοφ των κυττάρων ανά ml κρεπτικοφ υγροφ ςε διάωορα χρονικά διαςτιματα (0, 48 και 96 ϊρεσ). Χρθςιμοποιικθκε θ μζκοδοσ του αιματοκυτταρομζτρου (πλάκα Neübauer) και θ μζτρθςθ των κυττάρων γινόταν ςε μικροςκόπιο (100%). ΟΠΞΡΔΘΞΠΘΡΛΞΡ ΩΜ ΔΘΑΤΞΠΞΟΞΘΖΛΔΜΩΜ ΙΣΑΠΩΜ MEL ΛΔ Ζ ΥΠΩΡΖ ΒΔΜΕΘΔΘΜΖΡ-Ζ 2 Ξ 2 Η μζκοδοσ αποτελεί τροποποίθςθ τθσ μεκόδου του Orkin και των ςυνεργατϊν του (Orkin, et al. 1975), και βαςίηεται ςτθν ιςτοχθμικι αντίδραςθ και χρϊςθ των κυττάρων MEL με διάλυμα βενηιδίνθσ και Η 2 Ο 2. Με τθ χρϊςθ αυτι τα 61

62 κφτταρα που περιζχουν αιμοςωαιρίνθ (διαωοροποιθμζνα) βάωονται κυανά, ενϊ τα αδιαωοροποίθτα δε χρωματίηονται. ΣΚΘΙΑ ΔΘΑΚΣΛΑΑ Διάλυμα Α Για τθ μζκοδο χρθςιμοποιικθκαν τα παρακάτω διαλφματα: Τδροχλωρικι βενηιδίνθ Παγόμορωο CH 3 COOH Η 2 Ο μζχρι 0,1 gr 1,5 ml 50.0 ml Σο διάλυμα αυτό διατθρικθκε ςε ςκοτεινόχρωμο ωιαλίδιο ςτουσ 4 ο C για 1-2 μινεσ Διάλυμα Β Η 2 Ο 2 (30%) 20 μl Η 2 Ο 5 ml Σο διάλυμα αυτό παραςκευάςτθκε πριν από κάκε προςδιοριςμό ΛΔΗΞΔΞΡ Για τθ χρϊςθ των κυττάρων προςτζκθκε ςε κατάλλθλθ υποδοχι (96 well plate) μια ςταγόνα καλλιζργειασ κυττάρων (1x10 6 κφτταρα/ml), μια ςταγόνα διαλφματοσ Α και ςτθ ςυνζχεια μια ςταγόνα διαλφματοσ Β. Μετά τθν ανακίνθςθ, το διάλυμα αωζκθκε ςε κερμοκραςία δωματίου για 5 min. Κατόπιν, απομακρφνκθκε μικρι ποςότθτα κυττάρων, τοποκετικθκε ςτο αιματοκυτταρόμετρο (Neübauer) και μετρικθκε κάτω από το μικροςκόπιο (100x), τόςο ο ςυνολικόσ αρικμόσ των κυττάρων ( κφτταρα), όςο και ο αρικμόσ των κυττάρων που χρωματίςτθκαν κυανά. Η αναςτολι τθσ ανάπτυξθσ αποδίδεται ωσ το επί τοισ εκατό (%) ποςοςτό των κυττάρων επί του control που επιβίωςαν, ενϊ θ επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ ωσ το επί τοισ εκατό ποςοςτό των κυττάρων που ζχουν υποςτεί χρϊςθ με βενηιδίνθ- H 2 O 2. Ωσ κετικό control χρθςιμοποιικθκε ο χθμικόσ επαγωγζασ HMBA (Hexamethylene Bisacetamide). Οι μετριςεισ αυτζσ πραγματοποιικθκαν επωάηοντασ αναπτυςςόμενα κφτταρα MEL ςε ζνα εφροσ ςυγκεντρϊςεων των ενϊςεων ( Μ), ϊςτε να αξιολογθκεί θ βζλτιςτθ ςυγκζντρωςθ για αναςτολι τθσ κυτταρικισ ανάπτυξθσ και επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ. 62

63 ΑΟΞΔΚΔΡΛΑΑ-ΡΣΕΖΖΡΖ ΡΣΜΗΔΡΖ ΔΜΩΡΔΩΜ ΟΠΩΔΡ YΚΔΡ ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ 2,6-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΘΩΔΞ-ΑΜΘΡΞΚΖΡ (5) Η ςυνκετικι ακολουκία των αντιδράςεων για τθν παραςκευι τθσ 2,6- διωκορο-3-ιωδο-ανιςόλθσ παρουςιάηεται ςυνοπτικά ςτθν Εικόνα 16. ΕΙΚΟΝΑ 16 το πρϊτο ςτάδιο πραγματοποιείται νίτρωςθ του δακτυλίου με ατμίηον HNO 3. Κακϊσ πρόκειται για εξϊκερμθ αντίδραςθ, θ προςκικθ του HNO 3 γίνεται ςτάγδθν και ςε παγόλουτρο προσ αποωυγι αφξθςθσ κερμοκραςίασ και του επικείμενου ςχθματιςμοφ παραπροϊόντων. Μετά το τζλοσ τθσ αντίδραςθσ και τθν κατεργαςία που προαναωζρκθκε, για τθν απομάκρυνςθ του οξικοφ οξζοσ υπό ελαττωμζνθ πίεςθ προςτίκεται επτάνιο. Σο επτάνιο ςχθματίηει αηεοτροπικό μίγμα με το οξικό οξφ, διευκολφνοντασ κατά πολφ τθν απομάκρυνςι του από το προϊόν. Σο δεφτερο ςτάδιο είναι θ αντίδραςθ προςταςίασ του ωαινολικοφ υδροξυλίου με μεκυλίωςι του. Η αντίδραςθ χωρεί ςε αλκαλικό περιβάλλον που διευκολφνει τθν απόςπαςθ του όξινου ωαινολικοφ υδρογόνου και κατόπιν τθν προςβολι από το CH 3 I. Η προςταςία είναι απαραίτθτθ ςε πρϊτθ ωάςθ λόγω τθσ αςτάκειασ τθσ 3,5-διωκορο-4-υδροξυ-ανιλίνθσ (Alexiou, et al. 2008), αλλά και ςτθ ςυνζχεια για τθν επίτευξθ ιωδίωςθσ χωρίσ τθν οξείδωςθ του ωαινολικοφ υδροξυλίου. 63

64 Κατά το τρίτο ςτάδιο, θ νιτρο-ομάδα ανάγεται ςε κυκλοεξζνιο και Pd/C. Σο κυκλοεξζνιο παρουςία του Pd/C μετατρζπεται ςε βενηόλιο με ταυτόχρονθ απόδοςθ υδρογόνου εν τω γεννάςκαι, που ανάγει τθν νιτρο- ςε αμινο-ομάδα. Η μζκοδοσ αυτι αποτελεί εναλλακτικι τθσ βιβλιογραωίασ μζκοδο (Qui, et al. 1999), όπου χρθςιμοποιείται υδρογόνωςθ με αζριο Η 2. Η αναγωγι με κυκλοεξζνιο (Entwistle 1975) καταργεί τθν επικινδυνότθτα τθσ κλαςικισ υδρογόνωςθσ και αποτελεί επίςθσ μζκοδο με τθν οποία επιτυγχάνονται υψθλζσ αποδόςεισ. τθ ςυνζχεια λαμβάνει χϊρα ιωδίωςθ του δακτυλίου με μεταλλικό Ι 2 ςε NaHCO 3. Σο NaHCO 3 ζχει διττό ρόλο. Αωενόσ δεςμεφει το ελευκεροφμενο HI προσ αποωυγι πρωτονίωςθσ τθσ αμινο-ομάδασ, όπου κα καταςτοφςε απενεργοποιθμζνο τον δακτφλιο και κα μείωνε τθν ικανότθτά του προσ αντίδραςθ. Αωετζρου, δεςμεφοντασ το ΗΙ καταργείται και ο κίνδυνοσ ιωδόλυςθσ τθσ μεκοξυ-ομάδασ. Για τουσ παραπάνω λόγουσ θ προςκικθ του Ι 2 πρζπει να γίνεται τελευταία. Μετά το πζρασ τθσ αντίδραςθσ και τθν παραλαβι του προϊόντοσ με AcOEt, θ πλφςθ με Na 2 S 2 O 3 αποςκοπεί ςτθν απομάκρυνςθ του ιωδίου που δεν αντζδραςε. το τελευταίο ςτάδιο τθσ ακολουκίασ των αντιδράςεων θ αμινο-ομάδα απομακρφνεται μζςω του ςχθματιςμοφ ενδιάμεςου διαηωνιακοφ άλατοσ. Ο ςχθματιςμόσ του αςτακοφσ διαηωνιακοφ άλατοσ λαμβάνει χϊρα ςτουσ 0 ο C και με αποβολι Ν 2 παρουςία Cu ςχθματίηεται το επικυμθτό προϊόν. ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ ΤΑΘΜΣΚΞ-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-2-ΣΚΞ)-ΛΔΗΑΜΞΜΖΡ Η ςφνκεςθ αυτισ τθσ πρϊτθσ φλθσ πραγματοποιείται ςε δφο ςτάδια: αρχικά ςχθματίηεται αμίδιο του βενηοχλοχλωριδίου με μορωολίνθ, το οποίο ςτθ ςυνζχεια δίνει τθν αντίδραςθ Vilsmeier-Haack με το πυρρόλιο. Οι αντιδράςεισ αποδίδονται ςχθματικά ςτθν Εικόνα 17 που ακολουκεί. ΕΙΚΟΝΑ 17 Ο μθχανιςμόσ τθσ αντίδραςθσ (Εικόνα 18) περιλαμβάνει τρία ςτάδια. το πρϊτο ςχθματίηεται το αντιδραςτιριο Vilsmeier-Haack με τθν προςβολι του POCl 3 64

65 ςτο καρβονφλιο. Ακολοφκωσ, πραγματοποιείται θ αντίδραςθ Vilsmeier-Haack με ςχθματιςμό ενδιάμεςου ςυμπλόκου με το πυρρόλιο και τζλοσ, ςτο τρίτο ςτάδιο, με υδρόλυςθ αποδίδεται το επικυμθτό προϊόν (White and McGillivray 1977). ΕΙΚΟΝΑ 18 Ιδιαίτερθ προςοχι πρζπει να δοκεί αρχικά ςτο ςχθματιςμό του ςυμπλόκου με τον POCl 3, όπου είναι βζλτιςτο να πραγματοποιείται απουςία διαλφτθ και γενικότερα ςτθ διατιρθςθ άνυδρων ςυνκθκϊν κατά τθ διάρκεια τθσ αντίδραςθσ κακϊσ οδθγοφν ςτο ςχθματιςμό παραπροϊόντων και ςε χαμθλζσ αποδόςεισ. ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ ΤΑΘΜΣΚΞ-(1Η-ΟΣΠΠΞΚ-3-ΣΚΞ)-ΛΔΗΑΜΞΜΖΡ Η παραςκευι τθσ ωαινυλο-(1η-πυρρολ-3-υλο)-μεκανόνθσ πραγματοποιείται με εωαρμογι τθσ αντίδραςθσ ακυλίωςθσ Friedel-Crafts (καταλφτθσ AlCl 3 ) ςτο προςτατευμζνο 1-(ωαινυλοςουλωονυλο)-πυρρόλιο (Εικόνα 19). τθ ςυνζχεια θ ωαινυλοςουλωονυλ-ομάδα απομακρφνεται με αλκαλικι υδρόλυςθ. ΕΙΚΟΝΑ 19 65

66 Με τθ μζκοδο αυτι επιτυγχάνεται υψθλι απόδοςθ ςε ωαινυλο-(1η-πυρρολ- 3-υλο)-μεκανόνθ κακϊσ αποωεφγεται ο ςχθματιςμόσ παραπροϊόντων λόγω πολυμεριςμοφ του πυρρολίου ςτισ όξινεσ ςυνκικεσ τθσ αντίδραςθσ και επιπλζον ο ςχθματιςμόσ του 2-ιςομεροφσ. Ο ςχθματιςμόσ του 2-ιςομεροφσ αποωεφγεται εξαιτίασ ςτερεοχθμικισ παρεμπόδιςθσ από τθν ογκϊδθ ωαινυλο-ςουλωονυλ-ομάδα αλλά και εξαιτίασ τθσ ιδιότθτάσ τθσ να είναι δζκτθσ θλεκτρονίων που δίνει προςανατολιςμό ςτθ 3-κζςθ του πυρρολικοφ δακτυλίου (Anderson, et al. 1985). ΡΣΜΗΔΡΖ ΔΜΩΡΔΩΜ - ΟΠΞΣΟΔΡ ΔΜΩΡΔΘΡ: 5-(1Η-ΟΣΠΠΞΚ-1- ΣΚΞ)-1Η-ΔΠΑΕΞΚΘΞ ΙΑΘ ΟΑΠΑΓΩΓΑ ΞΣ ΡΣΜΗΔΡΖ ΞΣ 5-(1Η-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-1Η-ΔΠΑΕΞΚΘΞΣ (CHAC-0) Οι τροποποιιςεισ που διαωοροποιοφν τθν αντίδραςθ αυτι από τισ κλαςικζσ ςυνκικεσ Clauson-Kaas αωοροφν το διαλφτθ, όπου αντί οξικοφ οξζοσ χρθςιμοποιείται διοξάνιο, και τθ χριςθ καταλφτθ υδροχλωρικισ 4-χλωρο-πυριδίνθσ (Cardinaud, et al. 1993, Nicolaou, et al. 2004)(Εικόνα 20). Η 4-χλωρο-πυριδίνθ προκαλεί αςκενϊσ μόνο όξινεσ ςυνκικεσ αντίδραςθσ, οπότε αποωεφγεται ο ζντονοσ πολυμεριςμόσ του πυρρολίου και επιτυγχάνεται ικανοποιθτικι απόδοςθ. ΕΙΚΟΝΑ 20 Ο μθχανιςμόσ τθσ αντίδραςθσ περιγράωεται ςτθν Εικόνα 21. ΕΙΚΟΝΑ 21 66

67 ΓΔΜΘΙΖ ΛΔΗΞΔΞΡ ΡΣΜΗΔΡΖΡ ΩΜ Α-(Ω-ΒΠΩΛΞΑΚΙΣΚΞ)-5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1- ΣΚΞ)-2H-ΔΠΑΕΞΚΘΩΜ Πρόκειται για αντίδραςθ κατάλυςθσ μεταωοράσ ωάςθσ, με καταλφτθ μεταωοράσ ωάςθσ τθν υδροχλωρικι τριβουτυλοβενηυλαμίνθ. Η αλκυλίωςθ του 5- (1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου πραγματοποιικθκε ςε απρωτικό διαλφτθ, THF, βαςικό περιβάλλον, NaH, και παρείχε εκλεκτικά το Ν 2 -βρωμοαλκυλ-ιςομερζσ και ζνα Ν 2 -διμερζσ (Εικόνα 22). Σο NaH ςχθματίηει άλασ ςτον τετραηολικό πυρινα, το οποίο ςτθ ςυνζχεια αντιδρά με το α,ω-διβρωμίδιο μζςω πυρθνόωιλθσ προςβολισ. n = 5-7 ΕΙΚΟΝΑ 22 Σο τετραηόλιο βρίςκεται ςε δφο ταυτομερείσ μορωζσ, με το 2Η-τετραηόλιο να είναι θ ςτακερότερθ (Lenda, et al. 2005). Οι περιςςότερεσ αντιδράςεισ αλκυλίωςθσ καταλιγουν ςε μίγματα Ν 1 - και Ν 2 -ιςομερϊν (Koldobskii and Kharbash 2003, Butler 1984) κακϊσ και τα δφο ανιόντα τετραηολίου μποροφν να πραγματοποιιςουν πυρθνόωιλθ προςβολι ςτο αλκυλαλογονίδιο. τισ ςυνκικεσ τθσ κατάλυςθσ μεταωοράσ ωάςθσ, θ regio-εκλεκτικότθτα που παρατθρείται οωείλεται ςτον ογκϊδθ καταλφτθ που παρεμποδίηει τθν υποκατάςταςθ ςτο Ν 1 άτομο του άλατοσ τετραηολίου (Myznikov, et al. 2002). n = 5-7 ΕΙΚΟΝΑ 23 Σα διμερι παράγονται ωσ αποτζλεςμα πυρθνόωιλθσ προςκικθσ του ανιόντοσ του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηολίου ςτα παραγόμενα βρωμίδια και για το λόγο αυτό οι αποδόςεισ τουσ παραμζνουν ςε χαμθλά επίπεδα (13%, 14%, 2% αντίςτοιχα για n = 5,6,7). Επειδι το διμερζσ με n = 7 δεν παριχκθκε ςε υψθλι απόδοςθ, ςυντζκθκε από τθν αντίδραςθ που ωαίνεται ςτθν Εικόνα 23. Κακϊσ θ δυςκολία αντίδραςθσ παρζμεινε ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ, ζγινε χριςθ 67

68 κζρμανςθσ που είχε ωσ αποτζλεςμα τθν επίτευξθ απόδοςθσ 90%. Η ίδια μζκοδοσ εωαρμόςτθκε τελικά για τθν ποςοτικι ςφνκεςθ και των άλλων δφο διμερϊν με καλζσ ςχετικά αποδόςεισ. Επίςθσ, θ δραςτικότερθ ζνωςθ CHAC-2a ςυντζκθκε και με μία επιπλζον μζκοδο, με απευκείασ αντίδραςθ του 5-(1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Ητετραηολίου με το 1,6-διβρωμοεξάνιο ςε ςτοιχειομετρία 3:1 Εικόνα 24. Η αντίδραςθ αυτι οδιγθςε ςε βελτίωςθ τθσ απόδοςθσ (72%, ζναντι 68% με τθν προθγοφμενθ μζκοδο). ΕΙΚΟΝΑ 24 Η regio-εκλεκτικότθτα των αντιδράςεων ταυτοποιικθκε με τθ λιψθ ωάςματοσ 13 C-NMR των προϊόντων. Οι χθμικζσ μετατοπίςεισ του C 5 του τετραηολίου ςτα προϊόντα των αντιδράςεων ωαίνονται ςτον Πίνακασ 1 μαηί με ενδεικτικζσ τιμζσ από 1- και 2-ιςομερι που ζχουν αναωερκεί ςτθ βιβλιογραωία (Πίνακασ 2). Η γενικι παρατιρθςθ είναι ότι τα 1-ιςομερι είναι περίπου ppm αριςτερά ςτο ωάςμα από τα αντίςτοιχα 2-ιςομερι. Σα 2,5-υποκατεςτθμζνα τετραηολικά παράγωγα εμωανίηονται ςτα ppm (Alami, et al. 1998). ΠΙΝΑΚΑ 1: Χθμικζσ μετατοπίςεισ τουτετραηολικοφ C 5 ςτα προϊόντα τθσ αντίδραςθσ αλκυλίωςθσ Ζνωςθ C 5 13 C-NMR (ppm) 2-(5-βρωμοπεντυλ)-5-(1H-πυρρολ-1-υλ)-2H-τετραηόλιο 161,77 (Εικόνα 25) 2-(6-βρωμοεξυλ)-5-(1H-πυρρολ-1-υλ)-2H-τετραηόλιο 161,74 (Εικόνα 26) 2-(7-βρωμοεπτυλ)-5-(1H-πυρρολ-1-υλ)-2H-τετραηόλιο 161,57 (Εικόνα 27) 1,5-δις(5-(1H-πυρρολ-1-υλ)-2H-τετραηολ-2-υλ)πεντάνιο 160,85 (Εικόνα 28) 1,6-δις(5-(1H-πυρρολ-1-υλ)-2H-τετραηολ-2-υλ)εξάνιο 161,48 (Εικόνα 29) 1,7-δις(5-(1H-πυρρολ-1-υλ)-2H-τετραηολ-2-υλ)επτάνιο 161,46 (Εικόνα 30) 68

69 ΠΙΝΑΚΑ 2: Χθμικζσ μετατοπίςθςεισ του τετραηολικοφ C 5 ςε υποκατεςτθμζνα παράγωγα που ζχουν αναωερκεί ςτθ βιβλιογραωία Ζνωςθ C 13 5 C-NMR (ppm) Βιβλιογραωία N 1 -γλυκουρονίδιο τθσ ιρβεςαρτράνθσ 155,5 (Byard and Herbert 1999) N 2 -γλυκουρονίδιο τθσ ιρβεςαρτράνθσ 166,1 (Byard and Herbert 1999) 1-μεκυλ-5-ωαινυλ-τετραηόλιο 154,3 (Alami, et al. 1998) 2-μεκυλ-5-ωαινυλ-τετραηόλιο 169,93 (Alami, et al. 1998) Παρακάτω παρατίκενται τα ωάςματα: ΕΙΚΌΝΑ 25 69

70 ΕΙΚΌΝΑ 26 ΕΙΚΟΝΑ 27 70

71 ΕΙΚΟΝΑ 28 ΕΙΚΟΝΑ 29 71

72 ΕΙΚΟΝΑ 30 Ανάμεςα ςτα τρία προϊόντα που ςυντζκθκαν παρατθρείται ότι με αφξθςθ τθσ ανκρακικισ αλυςίδασ μειϊνεται θ απόδοςθ ι με άλλεσ λζξεισ αυξάνεται θ δυςκολία αντίδραςθσ. ΓΔΜΘΙΖ ΛΔΗΞΔΞΡ ΡΣΜΗΔΡΖΡ ΩΜ S-[5-(1H-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-2Η- ΔΠΑΕΞΚ-2-ΣΚ]ΑΚΙΣΚ ΑΙΔΣΚΗΔΘΔΡΔΠΩΜ Οι ακετυλκειεςτζρεσ παράγονται με τθν αντίδραςθ πυρθνόωιλθσ υποκατάςταςθσ που ωαίνεται ςτθν Εικόνα 31. Η αντίδραςθ χωρεί με ευκολία ςε κερμοκραςία περιβάλλοντοσ και ςε ικανοποιθτικζσ αποδόςεισ. ΕΙΚΟΝΑ 31 72

73 ΡΣΜΗΔΡΖ ΔΜΩΡΔΩΜ ΟΠΞΣΟΔΡ ΔΜΩΡΔΘΡ ΟΑΠΑΓΩΓΑ ΖΡ 2,6- ΔΘΤΗΞΠΞ-3-(1Η-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)-ΤΑΘΜΞΚΖΡ ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ [1-(2,4-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΛΔΗΞΝΣΤΑΘΜΣΚΞ)-1H-ΟΣΠΠΞΚ-3- ΣΚΞ]ΤΑΘΜΣΚΞΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (CAR-1A) Η αντίδραςθ που χρθςιμοποιείται για τθ ςφνκεςθ τθσ πρότυπθσ αυτισ ζνωςθσ είναι μια βελτιςτοποιθμζνθ αντίδραςθ ςφηευξθσ Ullman όπου το πυρθνόωιλο είναι ετεροκυκλικόσ δακτφλιοσ (Εικόνα 32). Η κλαςικι αντίδραςθ Ullman πραγματοποιείται παρουςία Cu ςε αρυλ-αλογονίδια ωςτόςο μπορεί επίςθσ να ςυμβεί μεταξφ ενόσ αρυλ-αλογονιδίου και μιασ Ο- ι Ν-οφχου ζνωςθσ (γενικότερα ενόσ πυρθνόωιλου) με καταλφτθ ςκόνθ Cu, ςε βαςικό περιβάλλον (Lindley 1984). Πρόκειται για μια πολυμελετθμζνθ αντίδραςθ με πλοφςια βιβλιογραωία όπου μετά από εκτεταμζνθ μελζτθ βρζκθκε ότι: (1) χριςθ αρυλιωδιδίου αποδίδει τισ μεγαλφτερεσ αποδόςεισ, (2) κατάλυςθ αντίδραςθσ ςφηευξθσ με Ν-ετεροκυκλικοφσ δακτυλίουσ είναι αποδοτικότερθ παρουςία ςυμπλόκου CuIδιαμίνθσ (εναλλακτικά ζχουν χρθςιμοποιθκεί αμινοξζα για το ςκοπό αυτό, επομζνωσ είναι πικανόν ςθμαντικι θ φπαρξθ διδοτικοφ ςυναρμοτι για το ςχθματιςμό ςυμπλόκου), (3) θ επιλογι τθσ βάςθσ που κα χρθςιμοποιθκεί και του διαλφτθ εξαρτάται από τον Ν-ετεροκυκλικό δακτφλιο που χρθςιμοποιείται (Zhang, et al. 2005, Antilla, et al. 2004, Zhu, et al. 2007b, Klapars, et al. 2001, Zhu, et al. 2007a). ΕΙΚΟΝΑ 32 Οι μθχανιςμοί που ζχουν, προσ το παρόν, προτακεί για τον τρόπο με τον οποίο χωρεί θ ςφηευξθ Ullman παρουςία του ςυμπλόκου Cu-διαμίνθσ είναι τρεισ (Zhang, et al. 2005): 1. Μθχανιςμόσ οξειδωτικισ προςκικθσ/αναγωγικισ απόςπαςθσ. Μελετικθκε και περιγράωθκε από τον Cohen (Cohen, et al. 1974) και θ εωαρμογι του 73

74 μθχανιςμοφ αυτοφ ςτθν περίπτωςθ τθσ εωαρμοςκείςασ αντίδραςθσ απεικονίηεται ςτθν Εικόνα 33. ΕΙΚΟΝΑ 33 Ο ςχθματιςμόσ ςυμπλόκου του Cu(I) με τθ διαμίνθ κακιςτά τον Cu(I) πιο δραςτικό ςτθν οξειδωτικι προςκικθ ι κακιςτά το ενδιάμεςο ςφμπλοκο Β πιο ςτακερό, προωκϊντασ με τον τρόπο αυτό τθν αντίδραςθ ςφηευξθσ. 2. Μθχανιςμόσ του π-ςυμπλόκου. Σον μθχανιςμό αυτό κεϊρθςε πικανότερο ο Paine (Paine 1987) και τον μελζτθςε εκτεταμζνα ςτθ ςφνκεςθ τριαρυλαμινϊν. Η εωαρμογι αυτοφ του μθχανιςμοφ ςτθν περίπτωςθ τθσ αντίδραςθσ που χρθςιμοποιικθκε ωαίνεται ςτθν Εικόνα 34. ΕΙΚΟΝΑ 34 74

75 Σο ςφμπλοκο του Cu(Ι) με τθ διαμίνθ μπορεί να καταςτιςει τον αρωματικό δακτφλιο του π-ςυμπλόκου πιο «ωτωχό» ςε π θλεκτρόνια, διευκολφνοντασ τθν πυρθνόωιλθ προςβολι αμινϊν ι Ν-οφχων ετεροκυκλικϊν δακτυλίων. 3. Μθχανιςμόσ μζςω ριηϊν ι ανιονικϊν ριηϊν. Ο μθχανιςμόσ μζςω ελευκζρων ριηϊν αωορά κυρίωσ κατάλυςθ με μεταλλικό Cu και άλατά του αλλά όχι ςφμπλοκεσ χθλικζσ ενϊςεισ του (Zhang, et al. 2005, Lindley 1984). Επομζνωσ δεν κρίνεται ςκόπιμο να αναωερκεί αναλυτικά. Η ςφνκεςθ ζλαβε χϊρα παρουςία CuI και τθσ trans-τετραμεκυλκυκλοεξανο- 1,2-διαμίνθσ, ςε διαλφτθ τολουόλιο και ωσ βάςθ χρθςιμοποιικθκε το K 3 PO 4. ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ [1-(2,4-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΛΔΗΞΝΣΤΑΘΜΣΚΞ)-1H-ΟΣΠΠΞΚ-2- ΣΚΞ]ΤΑΘΜΣΚΞΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (CAR-2A) Η εωαρμογι τθσ παραπάνω αντίδραςθσ ςτθ ςφνκεςθ αυτισ τθσ πρϊτθσ ζνωςθσ δεν αποδείχκθκε καρποωόρα. Η πικανότερθ εξιγθςθ είναι ότι αυτό ςυνζβθ λόγω ςτερεοχθμικισ παρεμπόδιςθσ εξαιτίασ του ογκϊδουσ υποκαταςτάτθ ςτθ 2- κζςθ του πυρρολικοφ δακτυλίου που παρεμποδίηει το ςχθματιςμό του ενδιάμεςου ςυμπλόκου. ΕΙΚΟΝΑ 35 Για το λόγο αυτό χρθςιμοποιικθκε εναλλακτικι μζκοδοσ ςφνκεςθσ (Zhu, et al. 2007b) που δεν περιλαμβάνει ωσ καταλφτθ διαμίνθ αλλά μόνο CuI. Ωσ βάςθ χρθςιμοποιείται Cs 2 CO 3 και ωσ διαλφτθσ DMF (Εικόνα 35). Θα μποροφςε να υποτεκεί ότι οι αντιδράςεισ χωροφν μζςω διαωορετικοφ μθχανιςμοφ και ςτθν τελευταία περίπτωςθ θ αντίδραςθ πραγματοποιείται με μθχανιςμό ελευκζρων ριηϊν. Ωςτόςο απαιτείται περαιτζρω διερεφνθςθ για τθν εξαγωγι αςωαλϊν ςυμπεραςμάτων. 75

76 ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ [1-(2,4-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΣΔΠΞΝΣΤΑΘΜΣΚΞ)-1H-ΟΣΠΠΞΚ-3- ΣΚΞ]ΤΑΘΜΣΚΞΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (CAR-1) Πρόκειται για εωαρμογι μιασ από τισ κλαςικότερεσ μεκόδουσ ςχάςθσ αικερικοφ δεςμοφ όπωσ αυτι εωαρμόςτθκε και από τον Qui και τουσ ςυναδζλωουσ του για τθ ςχάςθ παραγϊγων τθσ διωκοροανιςόλθσ (Qui, et al. 1999). Η αντίδραςθ λαμβάνει χϊρα υπό κζρμανςθ (120 ο C) και για 12 h (Εικόνα 36). ΕΙΚΟΝΑ 36 ΡΣΜΗΔΡΖ ΖΡ [1-(2,4-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-ΣΔΠΞΝΣΤΑΘΜΣΚΞ)-1H-ΟΣΠΠΞΚ-2- ΣΚΞ]ΤΑΘΜΣΚΞΛΔΗΑΜΞΜΖΡ (CAR-2) Εωαρμογι τθσ προθγοφμενθσ αντίδραςθσ για τθν παραςκευι τθσ [1-(2,4- διωκορο-3-υδροξυωαινυλο)-1η-πυρρολ-2-υλο+ωαινυλομεκανόνθσ ζδωςε μίγμα πολυμερϊν. Για το λόγο αυτό εωαρμόςτθκε εναλλακτικι μζκοδοσ ςχάςθσ του αικερικοφ δεςμοφ (Εικόνα 37). Η μζκοδοσ που χρθςιμοποιικθκε περιλαμβάνει αντίδραςθ δφο ςταδίων: αρχικά ςχθματίηεται ενδιάμεςο προϊόν με το BBr 3, το οποίο ςτθ ςυνζχεια υδρολφεται προσ το επικυμθτό ωαινολικό παράγωγο. ΕΙΚΟΝΑ 37 Ο μθχανιςμόσ με τον οποίο λαμβάνει χϊρα θ αντίδραςθ ωαίνεται ςτθν Εικόνα 38. Για τθν πραγματοποίθςθ τθσ αντίδραςθσ χρθςιμοποιοφνται δφο ιςοδφναμα BBr 3 κακϊσ ςχθματίηεται ενδιάμεςο ςφμπλοκο και με το καρβονφλιο τθσ αρχικισ ζνωςθσ οπότε καταναλίςκεται (Mc Omie 1968). 76

77 ΕΙΚΟΝΑ 38 Κακϊσ θ απόδοςθ τθσ αντίδραςθσ ιταν πολφ χαμθλι, μόλισ 10%, και παραλάβαμε μεγάλθ ποςότθτα τθσ αρχικισ ζνωςθσ δοκιμάςκθκε θ παράταςθ του χρόνου αντίδραςθσ ςε 48 h αντί 24 h. Μετά το πζρασ των 48 h, ςτισ ίδιεσ ςυνκικεσ αντίδραςθσ, παρατθρικθκε ότι το προϊόν που ςχθματίςκθκε καταναλϊκθκε. Κακϊσ ζνα από τα προϊόντα τθσ εν λόγω αντίδραςθσ είναι το CH 3 Br κεωρείται ότι αυτό αντιδρά με τθν παραγόμενθ ωαινόλθ αποδίδοντασ τθν αρχικι ζνωςθ. Η ςυμπεριωορά αυτι μπορεί να εξθγιςει αωενόσ τθν χαμθλι απόδοςθ τθσ αντίδραςθσ και αωετζρου τθ μαηικι παραλαβι τθσ αρχικισ ζνωςθσ. 77

78 ΘΙΑΜΞΖΑ ΩΜ ΟΑΠΑΓΩΓΩΜ ΖΡ 2,6-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-(1Η- ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)ΤΑΘΜΞΚΖΡ ΜΑ ΑΜΑΡΔΚΞΣΜ ΖΜ ΑΜΑΓΩΓΑΡΖ ΖΡ ΑΚΔΞΕΖΡ (ALR2) Η μελζτθ τθσ ικανότθτασ αναςτολισ τθσ αναγωγάςθσ τθσ αλδόηθσ (ALR2) πραγματοποιικθκε ςε ενηυμικό παραςκεφαςμα από ωακοφσ επιμφων (Nicolaou, et al. 2004) και ςε ςυγκεντρϊςεισ του εφρουσ 10-4 ζωσ 10-7 Μ. Η ALR2 ωακϊν επιμφων εμωανίηει ςθμαντικό ποςοςτό ομολογίασ αμινοξζων και αλλθλουχίασ με τθν ανκρϊπινθ ALR2 (περίπου 85%), κακϊσ επίςθσ και το τμιμα του καταλυτικοφ κζντρου κεωρείται πανομοιότυπο (Gui, et al. 1995). Σα αποτελζςματα εκωράηονται ωσ ο μζςοσ όροσ των τιμϊν IC 50 τριϊν μετριςεων, και θ τυπικι απόκλιςθ αυτϊν (Πίνακασ 3). ΠΙΝΑΚΑ 3: Τπολογιςμζνεσ τιμζσ IC 50 επί τθσ ALR2 για τισ ενϊςεισ CAR-1 και CAR-2 κακϊσ και για τισ ςυγγενοφσ δομισ ενϊςεισ Ι και ΙΙ Ζνωςθ IC 50 (μμ) CAR-1 1,26 ± 0,04 CAR-2 2,83 ± 0,28 I (Εικόνα 39) 0,40 ± 0,02 (Nicolaou, et al. 2004) II (Εικόνα 39) 1,06 ± 0,17 1 ςορβινίλθ 48% αναςτολι ςε ςυγκζντρωςθ 10-7 Μ 2 Όλεσ οι ενϊςεισ αναςτζλλουν ικανοποιθτικά τθν ALR2. Οι πικανζσ αλλθλεπιδράςεισ των ενϊςεων με το καταλυτικό κζντρο του ενηφμου αωοροφν υδρόωοβεσ αλλθλεπιδράςεισ με το ΟΗ τθσ Tyr48 κακϊσ και υδρόωοβεσ αλλθλεπιδράςεισ με το αρωματικό τμιμα των ενϊςεων. ε ςφγκριςθ με τα 3- υποκατεςτθμζνα επί του πυρρολικοφ δακτυλίου ιςομερι, τα 2-ιςομερι εμωανίηουν ςχετικά μικρότερθ ικανότθτα αναςτολισ τθσ ALR2. Επιπλζον τα παράγωγα τθσ 2,6- διωκορο-3-(1η-πυρρολ-1-υλο)ωαινόλθσ εμωανίηουν μικρότερθ ικανότθτα αναςτολισ ςε ςχζςθ με τα αντίςτοιχα τθσ 2,6-διωκορο-4-(1Η-πυρρολ-1- υλο)ωαινόλθσ. Η ςυμπεριωορά αυτι κα μποροφςε να αποδοκεί ςτθ διάταξθ των ενϊςεων ςτο χϊρο ι/και ςτθν διαμόρωωςθ που λαμβάνουν οι ενϊςεισ ςτο καταλυτικό κζντρο του ενηφμου. Μελζτθ των διαμορωϊςεων ελαχίςτθσ ενζργειασ 1 Mamadou Eduard, personal communication 2 Δθμοςιευμζνεσ τιμζσ IC 50 : 0,25x10-6 M (Demopoulos and Rekka 1995) και 0,7-9x10-7 M (Zaher, et al. 2002) 78

79 των ενϊςεων με το πρόγραμμα Spartan 3 υποδεικνφει ότι ςτθν πιο δραςτικι ζνωςθ (Ι) θ απόςταςθ του ωαινολικοφ οξυγόνου από το κζντρο τθσ αρωματικισ επιωάνειασ είναι θ μεγαλφτερθ (7,01 Å). Επομζνωσ μπορεί να εικαςκεί ότι ενδεχόμενθ επζκταςθ τθσ αρωματικισ επιωάνειασ κα μποροφςε να οδθγιςει ςε ικανότερουσ αναςτολείσ. ΕΙΚΟΝΑ 39 Οι ενϊςεισ που ςυντζκθκαν εμωανίηουν αναςτολι τθσ ALR2 ςε μικρομοριακζσ ςυγκεντρϊςεισ, επομζνωσ μποροφν να κεωρθκοφν ικανζσ οδθγοφσ ενϊςεισ που με επιδράςεισ ςτθ δομι κα αποδϊςουν ιςχυρότερουσ αναςτολείσ. Επιπρόςκετα ςτθν παραπάνω παρατιρθςθ, και βαςιηόμενοι ςε μελζτθ παραγϊγων του πυρρολυλοξικοφ οξζωσ (Nicolaou and Demopoulos 2003) και ςουλωοναμιδίων τθσ 2,6-διωκοροωαινόλθσ (Alexiou, et al. 2008), που ζχουν δείξει ότι υποκαταςτάτεσ δότεσ θλεκτρονίων (+R ςυηυγιακό ωαινόμενο) προκαλοφν αφξθςθ τθσ δράςθσ, μποροφμε να υποκζςουμε ότι τζτοιου τφπου παρεμβάςεισ ςτθ χθμικι δομι πικανόν να αποδϊςουν ενϊςεισ χαμθλότερθσ IC 50 και επομζνωσ βελτιωμζνθσ αναςταλτικισ δράςθσ. 3 SPARTAN SGI, version OpenGL; Wavefunction, Inc., Von Karman Avenue, Suite 370, Irvine, CA

80 ΘΙΑΜΞΖΑ ΩΜ ΟΑΠΑΓΩΓΩΜ ΖΡ 2,6-ΔΘΤΗΞΠΞ-3-(1Η- ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)ΤΑΘΜΞΚΖΡ ΜΑ ΑΜΑΡΔΚΞΣΜ ΖΜ ΑΜΑΓΩΓΑΡΖ ΩΜ ΑΚΔΔΫΔΩΜ (ALR1), ΔΙΚΔΙΘΙΞΖΑ ΩΜ ΔΜΩΡΔΩΜ ΡΑ ΔΣΞ ΔΜΕΣΛΑ Η ικανότθτα των ενϊςεων να αναςτζλλουν τθν αναγωγάςθ των αλδεχδϊν (ALR1) μελετικθκε ςε ενηυμικό παραςκεφαςμα από νεωροφσ επιμφων (Constantino, et al. 1999, Stefek, et al. 2008) και ςε ςυγκεντρϊςεισ 10-4 ζωσ 10-6 Μ. Ωσ ζνωςθ αναωοράσ αναωζρεται το βαλπροϊκό οξφ που αποτελεί καλό αναςτολζα τθσ ALR1, ενϊ δεν ζχει ανάλογθ δράςθ για τθν ALR2 (ςυγκεκριμζνα εμωανίηει 20% αναςτολι ςε ςυγκζντρωςθ 1mM) (Poulsom 1986). Οι ιδιότθτεσ του αυτζσ το κακιςτοφν ικανι ζνωςθ αναωοράσ (Wermuth, et al. 1977). Σα αποτελζςματα εκωράηονται ωσ ο μζςοσ όροσ των τιμϊν IC 50 τριϊν μετριςεων, και θ τυπικι απόκλιςθ αυτϊν (Πίνακασ 4). ΠΙΝΑΚΑ 4: Τπολογιςμζνεσ τιμζσ IC 50 επί τθσ ALR1 για τισ ενϊςεισ CAR-1 και CAR-2 κακϊσ και για τισ ςυγγενοφσ δομισ ενϊςεισ Ι και ΙΙ Ζνωςθ IC 50 (μμ) CAR-1 1,61 ± 0,02 CAR-2 6,79 ± 0,64 I 13,4 ± 1,0 II 4,6± 0,3 βαλπροϊκό οξφ 98 Οι νεοςυντικζμενεσ ενϊςεισ CAR-1 και CAR-2, όπωσ ωαίνεται, αναςτζλλουν ςθμαντικά το ζνηυμο ALR1 και επομζνωσ δεν εμωανίηουν ικανοποιθτικι εκλεκτικότθτα. Η εμωάνιςθ εκλεκτικότθτασ μεταξφ των δφο ενηφμων κα αποτελοφςε ζνα ςθμαντικό χαρακτθριςτικό για νζουσ ARI, κακϊσ θ παράλλθλθ αναςτολι τθσ ALR1 ζχει ενοχοποιθκεί για τθν εμωάνιςθ ανεπικφμθτων ενεργειϊν, όπωσ προαναωζρκθκε. Η εκλεκτικότθτα εκωράηεται ωσ ο λόγοσ IC ALR1 50 /IC ALR2 50 και επομζνωσ θ εκλεκτικότθτα αυξάνει με αφξθςθ τθσ τιμισ του λόγου. Οι ενϊςεισ ωαίνεται να αναςτζλλουν με τθν ίδια ςχεδόν δραςτικότθτα τα δφο ομόλογα ζνηυμα (Πίνακασ 5). Μεταξφ των παραγϊγων τθσ 2,6-διωκορο-3-(1Ηπυρρολ-1-υλο)ωαινόλθσ το 2-υποκατεςτθμζνο επί του πυρρολικοφ δακτυλίου ιςομερζσ ωαίνεται να αναςτζλει τθν ALR2 με διπλάςια ιςχφ από τθν ALR1. τα παράγωγα τθσ 2,6-διωκορο-4-(1Η-πυρρολ-1-υλο)ωαινόλθσ παρατθρείται ωςτόςο θ (Poulsom 1986) 80

81 αντίκετθ ςυμπεριωορά και θ ζνωςθ Ι εμωανίηει τθν εκλεκτικότερθ δράςθ μεταξφ των παραγϊγων. ΠΙΝΑΚΑ 5: Εκλεκτικότθτα των ενϊςεων για τα ζνηυμα ALR1 και ALR2 Ζνωςθ IC ALR2 50 μμ IC ALR1 50 μμ IC ALR1 50 /IC ALR2 50 CAR-1 1,26 ± 0,04 1,61 ± 0,02 1,3 CAR-2 2,83 ± 0,28 6,79 ± 0,64 2,4 I 0,40 ± 0,02 13,4 ± 1,0 33,8 II 1,06 ± 0,17 4,6± 0,3 4,3 βαλπροϊκό οξφ > <0.03 Σζλοσ, κα πρζπει να τονιςτεί πωσ ςε διαβθτικζσ ςυνκικεσ παρατθρείται υπερζκωραςθ τθσ ALR2 ςτουσ περιςςότερουσ ιςτοφσ (Nakashima, et al. 2005) και αυτό πρζπει να λθωκεί υπόψθ ςτθν εκτίμθςθ τθσ εκλεκτικότθτασ. Επομζνωσ τα in vitro αποτελζςματα μπορεί να μειονεκτοφν ςε ςχζςθ με τθν in vivo κατάςταςθ και να επιτυγχάνεται ςθμαντικότερθ εκλεκτικότθτα. Σα ανωτζρω αποτελζςματα αποτελοφν ωςτόςο μόνο μια αρχικι εκτίμθςθ τθσ εκλεκτικότθτασ των ενϊςεων που μελετϊνται ςτθν παροφςα μεταπτυχιακι εργαςία και με κατάλλθλεσ παρεμβάςεισ ςτθ δομι (ειςαγωγι υποκαταςτατϊν επί του ωαινυλίου) κα μποροφςαν να επιτευχκοφν τόςο ιςχυρότερθ αναςτολι τθσ ALR2 όςο και αφξθςθ τθσ εκλεκτικότθτασ των ενϊςεων μεταξφ των ςυγγενοφσ δομισ ενηφμων ALR1 και ALR2. (Poulsom 1986) 81

82 ΘΙΑΜΞΖΑ ΩΜ ΟΑΠΑΓΩΓΩΜ ΞΣ 5-(1Η-ΟΣΠΠΞΚ-1-ΣΚΞ)- 1Η-ΔΠΑΕΞΚΘΞΣ ΜΑ ΑΜΑΡΔΚΚΞΣΜ ΖΜ ΙΣΑΠΘΙΖ ΑΜΑΟΣΝΖ ΙΣΑΠΩΜ MEL ΙΑΘ ΜΑ ΔΟΑΓΞΣΜ Ζ ΔΘΑΤΞΠΞΟΞΘΖΡΖ ΞΣΡ Σο ςφςτθμα των κυττάρων MEL επιλζχκθκε κακϊσ αποτελεί ζνα πολφ καλά μελετθμζνο ςφςτθμα για τθν ανάπτυξθ χθμικϊν επαγωγζων τθσ διαωοροποίθςθσ. ΠΙΝΑΚΑ 6: υγκεντρωτικά αποτελζςματα τθσ κυτταρικισ ανάπτυξθσ των κυττάρων MEL μετά από επϊαςθ με τισ διάωορεσ χθμικζσ ενϊςεισ Ζνωςθ υγκζντρωςθ ουςίασ Αρικμόσ κυττάρων % αναςτολι τθσ κυτταρικισ control CHAC control CHAC control CHAC-1a control CHAC control CHAC-2a control CHAC control CHAC-3a

83 % Αναςτολι κυτταρικισ ανάπτυξθσ % Αναςτολι κυτταρικισ ανάπτυξθσ Σα αποτελζςματα που λάβαμε μετά από επϊαςθ των κυττάρων MEL με το 5- (1Η-πυρρολ-1-υλο)-1Η-τετραηόλιο και τα παράγωγά του που αωοροφν τθν αναςτολι τθσ κυτταρικισ ανάπτυξθσ ςτισ 48 h αναγράωονται ςτον Πίνακασ 6 και ςχθματικι τουσ απεικόνιςθ αποδίδεται ςτα Γραωιματα 1-3. Όςον αωορά τθν επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ ςτα κφτταρα MEL μετά από 96 h, τα αποτελζςματα αποδίδονται ςτον Πίνακασ 7 και ςχθματικά ςτα Γραωιματα 4-6. Η αρχικι ζνωςθ (CHAC-0) παρατθροφμε ότι εμωανίηει μερικι αναςτολι τθσ κυτταρικισ ανάπτυξθσ, και για το ςκοπό αυτό προςπακιςαμε με τθν προςκικθ πλευρικισ αλυςίδασ να διατθριςουμε εν μζρει αυτι τθ δράςθ και να ενιςχφςουμε τθν ικανότθτα τθσ ζνωςθσ να επάγει τθ διαωοροποίθςθ των λευχαιμικϊν κυττάρων. Όπωσ ωαίνεται από τα αποτελζςματα όλεσ οι ενϊςεισ παρουςιάηουν ικανότθτα αναςτολισ τθσ ανάπτυξθσ των κυττάρων MEL, που ςε κάποιεσ αγγίηει μζχρι και το 80%. Ενδιαωζρον παρουςιάηει θ ζνωςθ CHAC-1 κακϊσ θ αναςτολι τθσ ανάπτυξθσ των κυττάρων δεν ακολουκεί το κλαςικό δοςοεξαρτϊμενο πρότυπο, ζνα ςτοιχείο που αξίηει να ςχολιαςτεί εκτενζςτερα παρακάτω (-8) 10(-7) 10(-6) 10(-5) 10(-4) CHAC-0 υγκζντρωςθ (Μ) ΓΡΑΦΗΜΑ 1: Δοςοεξαρτϊμενθ αναςτολι τθσ κυτταρικισ ανάπτυξθσ των κυττάρων MEL μετά από επϊαςθ με τθν ουςία CHAC CHAC-1a 0.00 CHAC-2a 10(-8) 10(-7) 10(-6) 10(-5) 10(-4) CHAC-3a υγκζντρωςθ (Μ) ΓΡΑΦΗΜΑ 2: Δοςοεξαρτϊμενθ αναςτολι τθσ κυτταρικισ ανάπτυξθσ των κυττάρων MEL μετά από επϊαςθ με τισ ουςίεσ CHAC-1a, CHAC-2a και CHAC-3a 83

84 % Αναςτολι κυτταρικισ ανάπτυξθσ CHAC CHAC-2 10(-8) 10(-7) 10(-6) 10(-5) 10(-4) CHAC-3 υγκζντρωςθ (Μ) ΓΡΑΦΗΜΑ 3: Δοςοεξαρτϊμενθ αναςτολι τθσ κυτταρικισ ανάπτυξθσ των κυττάρων MEL μετά από επϊαςθ με τισ ουςίεσ CHAC-1, CHAC-2 και CHAC-3 ΠΙΝΑΚΑ 7: υγκεντρωτικά αποτελζςματα για τθ δοςοεξαρτϊμενθ επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθςσ των κυττάρων MEL μετά από επϊαςθ με τισ διάωορεσ χθμικζσ ενϊςεισ Ζνωςθ υγκζντρωςθ ουςίασ Αρικμόσ κυττάρων Επαγωγι διαφοροποίθςθσ control x10-3 HMBA CHAC control 5x10-3 HMBA CHAC control 5x10-3 HMBA CHAC-1a control 5x10-3 HMBA CHAC control 5x10-3 HMBA CHAC-2a CHAC-3 control 5x10-3 HMBA

85 Διαφοροποίθςθ (%Bz+ κφτταρα) Διαφοροποίθςθ (%Bz+ κφτταρα) CHAC-3a control 5x10-3 HMBA Η αρχικι ζνωςθ CHAC-0 δεν παρατθρείται να παρουςιάηει επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ. Σα περιςςότερα παράγωγα επίςθσ είτε δεν εμωανίηουν επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ, είτε εμωανίηουν αλλά ςε πολφ χαμθλά επίπεδα. Ενδιαωζρον παρουςιάηει θ ζνωςθ CHAC-1, που όπωσ επιςθμάνκθκε προθγουμζνωσ δεν ακολουκεί το κλαςικό δοςοεξαρτϊμενο πρότυπο ςτθν αναςτολι τθσ ανάπτυξθσ των κυττάρων MEL. Όπωσ ωαίνεται και ςτο Γράωθμα 6 ςτθ ςυγκζντρωςθ 10-6 Μ παρουςιάηεται θ μζγιςτθ επαγωγι διαωοροποίθςθσ των κυττάρων κακϊσ και θ μζγιςτθ αναςτολι τθσ ανάπτυξισ τουσ. Αυτό μπορεί να αποτελεί ζνδειξθ για τθν διαμζςου τθσ διαωοροποίθςθσ επαγωγι τθσ απόπτωςθσ ςτα κφτταρα MEL (-8) 10(-7) 10(-6) 10(-5) 10(-4) CHAC-0 υγκζντρωςθ (Μ) ΓΡΑΦΗΜΑ 4: Δοςοεξαρτϊμενθ επαγωγι τθσ κυτταρικισ διαωοροποίθςθσ των κυττάρων MEL, ωσ % Bz+ κφτταρα ςε ςφγκριςθ με το κετικό πρότυπο ΗΜΒΑ, μετά από επϊαςθ με τθν ουςία CHAC CHAC-1a 0 CHAC-2a 10(-8) 10(-7) 10(-6) 10(-5) 10(-4) CHAC-3a υγκζντρωςθ (Μ) ΓΡΑΦΗΜΑ 5: Δοςοεξαρτϊμενθ επαγωγι τθσ κυτταρικισ διαωοροποίθςθσ των κυττάρων MEL, ωσ % Bz+ κφτταρα ςε ςφγκριςθ με το κετικό πρότυπο ΗΜΒΑ, μετά από επϊαςθ με τισ ουςίεσ CHAC-1a, CHAC-2a και CHAC-3a 85

86 Διαφοροποίθςθ %Bz+ κφτταρα CHAC (-8) 10(-7) 10(-6) 10(-5) 10(-4) CHAC-2 CHAC-3 υγκζντρωςθ (Μ) ΓΡΑΦΗΜΑ 6: Δοςοεξαρτϊμενθ επαγωγι τθσ κυτταρικισ διαωοροποίθςθσ των κυττάρων MEL, ωσ % Bz+ κφτταρα ςε ςφγκριςθ με το κετικό πρότυπο ΗΜΒΑ, μετά από επϊαςθ με τισ ουςίεσ CHAC-1, CHAC-2 και CHAC-3 Επίςθσ ενδιαωζρον παρουςιάηει θ ζνωςθ CHAC-2a που εμωανίηει ςθμαντικι ανάμεςα ςτθ ςειρά αυτι των παραγϊγων επαγωγι τθσ διαωοροποίθςθσ. Η ενδιάμεςθ εξαμεκφλενο αλυςίδα ωαίνεται να αποτελεί και το βζλτιςτο μικοσ αλφςου. Αυτι θ παρατιρθςθ βρίςκεται ςε ςυμωωνία με τα αποτελζςματα παλαιότερων μελετϊν που οδιγθςαν ςτθ ςφνκεςθ ςθμαντικϊν χθμικϊν επαγωγζων τθσ διαωοροποίθςθσ όπωσ το HMBA και το SAHA (Terada, et al. 1978, Richon, et al. 1998). 86