«Ταυτοποίηση κλώνων Μαύρης πεύκης (Pinus nigra Arn.) µε χρήση βιοχηµικών δεικτών»

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΔΑΣΟΛΟΓΙΑΣ & ΦΥΣΙΚΟΥ ΠΕΡΙΒΑΛΛΟΝΤΟΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΔΑΣΙΚΗΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ ΚΑΙ ΒΕΛΤΙΩΣΗΣ ΔΑΣΟΠΟΝΙΚΩΝ ΕΙΔΩΝ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ «Ταυτοποίηση κλώνων Μαύρης πεύκης (Pinus nigra Arn.) µε χρήση βιοχηµικών δεικτών» Τσολακίδης Γ. Παναγιώτης Δασολόγος ΕΠΙΒΛΕΠΟΥΣΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ: ΤΣΑΚΤΣΙΡΑ ΜΑΡΙΑ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ, ΟΚΤΩΒΡΙΟΣ 2011

2

3 Στο γιό µου, τη γυναίκα µου και τους γονείς µου 3

4 ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Η Μεταπτυχιακή αυτή διατριβή αποτελεί ουσιαστικά ένα εκπόνηµα, όχι τόσο δικό µου, όσο των ανθρώπων που βρίσκονται γύρω µου, εγώ αποτέλεσα τον κοινό αποδέκτη. Η πορεία των 3 ετών, υπήρξε µία διαρκής αλληλεπίδραση µε τους ανθρώπους, την έρευνα και το εργαστήριο όπου έγιναν οι εργαστηριακές αναλύσεις των ενζυµικών συστηµάτων, µία διαρκής αναζήτηση της γνώσης αλλά και της ατοµικής ολοκλήρωσης. Χάρη στη συνεχή συµπαράσταση της γυναίκας µου, αλλά και την οικονοµική και ηθική ενίσχυση των γονέων µου κατάφερα να φτάσω ως εδώ, πρακτικά αλλά και ηθικά. Η γυναίκα µου, εκτός από συνοδοιπόρος µου, υπήρξε και στενός σύµβουλός µου δίνοντάς µου σωστές κατευθύνσεις και µένοντας δίπλα µου ακόµα και στις δύσκολες στιγµές. Δε µπορώ προτίστως, να µην αναφέρω τη συµβολή του Καθηγητή και Διευθυντή του Εργαστηρίου Σκαλτσογιάννη Απόστολο, καθώς και µέλος της τριµελούς επιτροπής, ο οποίος µέχρι και τελευταίας στιγµής ενίσχυε τις προσπάθειές µου για την ολοκλήρωσή της. Οι οδηγίες του και κατευθύνσεις βοήθησαν στο να φτάσουµε στο τελικό αυτό αποτέλεσµα. Ευχαριστίες να απευθύνω και στην Επ. Καθηγήτρια Τσουλφά Παρθένα, µέλος της τριµελούς επιτροπής, µε την οποία καθόλη τη διάρκεια των σπουδών στο µεταπτυχιακό πρόγραµµα συνεργαστήκαµε άψογα. Τέλος να ευχαριστήσω και τα υπόλοιπα µέλη ΔΕΠ του εργαστηρίου, που 3 χρόνια είχαµε συχνές επαφές και από τους οποίους διδάχτηκα πολλά πράγµατα, τον Καθηγητή Αραβανόπουλο Φίλιππο, τον Επ. Καθηγητή Μπάρµπα Βαγγέλη και την Επ. Καθηγήτρια Αλιζώτη Εύη. Παράλληλα, να ευχαριστήσω τους συνάδελφους µεταπτυχιακούς φοιτητές του Εργαστηρίου µε τους οποίους εκτός από τους καφέδες που ήπιαµε, είχαµε και πλήθος επιστηµονικών (και µη) συζητήσεων: το Μιαούλη Μιχάλη, το Μήτρα Δηµήτρη, το Νικολάου Γιώργο, τον Καρανίκα Χριστόφορο, την Παπαγρηγοράκη Λεµονιά, την Παπαδήµα Αγλαϊα, τη Κατσίδη Ελίζα και το Τσιµόπουλο Δηµήτρη. Θεωρώ περιττό να ευχαριστήσω την επιβλέπουσά µου Επ. Καθηγήτρια Τσακτσίρα Μαρία, η οποία στάθηκε δίπλα µου καθόλη τη διάρκεια των µεταπτυχιακών µου σπουδών αλλά και µε ενίσχυσε και καθοδήγησε κατά τη σύνταξη της διατριβής. 4

5 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ... 4 ΠΕΡΙΛΗΨΗ... 7 SUMMARY... 8 ΕΙΣΑΓΩΓΗ... 9 ΜΑΥΡΗ ΠΕΥΚΗ (PINUS NIGRA ARN.)... 9 Βιολογία και Οικολογία... 9 Εξάπλωση Ταξινόµηση... 9 Σηµαντικότητα και Χρήσεις Γενετική ποικιλότητα του είδους στα ισοένζυµα Απειλές στη γενετική ποικιλότητα της µαύρης πεύκης ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΔΑΣΙΚΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ Απειλές για τους Δασικούς Γενετικούς Πόρους Στρατηγικές για τη Διατήρηση των Δασικών Γενετικών Πόρων Τράπεζες γονιδίων Κλωνική Δασοπονία Γενετικοί Δείκτες ΙΣΟΕΝΖΥΜΑ Πλεονεκτήµατα - Μειονεκτήµατα ως γονιδιακοί δείκτες Αρχές ισοενζύµων Εφαρµογές ισοενζύµων Ταυτοποίηση γενοτύπων µε χρήση ισοενζύµων (και ειδικά της MDH) Μηλική αφυδρογονάση ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Προετοιµασία φυτικού υλικού Τεχνική της ηλεκτροφόρησης Χρώση των ενζύµων ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΗΣ ΜΗΛΙΚΗΣ ΑΦΥΔΡΟΓΟΝΑΣΗΣ

6 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΜΗΛΙΚΗΣ ΑΦΥΔΡΟΓΟΝΑΣΗΣ Έλεγχος Μενδελικού διαχωρισµού ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΑΤΟΜΩΝ (ΚΛΩΝΩΝ) ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ

7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Η Μαύρη πεύκη (Pinus nigra) είναι ένα κωνοφόρο µε πολύ ευρεία εξάπλωση, που εκτείνεται από τη Βορειοδυτική Αφρική και µέσω της Ανατολικής Ευρώπης φτάνει έως τη Μικρά Ασία και τη Κριµαία. Παράλληλα, η εµφάνισή της, ξεκινά από τα 250 µ., παρόλο που χαρακτηρίζεται ψυχρόβιο, και φτάνει έως και τα 1800 µ. υψόµετρο, ενώ οι οικολογικές απαιτήσεις της είναι ελάχιστες. Τα στοιχεία αυτά, καθώς και το ότι θεωρείται λείψανο του Τριτογενούς, αφενός της προσδίδουν µεγάλη γενετική ποικιλότητα και αφετέρου, µεγάλη πλαστικότητα που σε περιβάλλον κλιµατικής αλλαγής θα επιτρέψει την επιβίωση του είδους και θα προσδώσει δυναµικότητα στην προσαρµογή του. Παράλληλα µε την επιτακτικότητα της προστασίας των γενετικών πόρων, επιβάλλεται η ταυτοποίηση του προστατευόµενου υλικού για τη σωστή διαχείριση και προώθησή του. Η παρούσα εργασία επιχείρησε να ταυτοποιήσει τους κλώνους µίας τράπεζας γονιδίων / φυτείας µαύρης πεύκης και να ταυτοποιήσει την τοποθεσία του κάθε κλώνου στη φυτεία αυτή µε τον οικονοµικότερο και ταχύτερο τρόπο. Επιλέχθηκε η χρήση ισοενζύµων και ειδικότερα του ενζυµικού συστήµατος της µηλικής αφυδρογονάσης (MDH) διότι είναι ένα σηµαντικό ένζυµο για κάθε έµβιο οργανισµό. Επίσης, παρουσιάζει µεγάλη ποικιλοµορφία στα κωνοφόρα και έχει χρησιµοποιηθεί για την ταυτοποίηση ειδών, ποικιλιών και προελεύσεων της µαύρης πεύκης. Η ερµηνεία της MDH επιτεύχθηκε µε τη χρήση 2 ηλεκτροφορητικών συστηµάτων και βρέθηκε ότι ακολουθεί µεντελική κληρονόµηση. Τα 34 άτοµα που µελετήθηκαν παρουσίασαν 4 γονιδιακές θέσεις εκ των οποίων οι 2 (MDH-A και MDH-D) ήταν µονοµορφικές και οι υπόλοιπες (MDH-B και MDH-C) παρουσίασαν 4 και 3 αλληλόµορφα αντίστοιχα, που µας επιτρέπουν να υπολογίσουµε τους δυνητικά ταυτοποιούµενους γενοτύπους σε 60 για το παρόν δείγµα, ενώ σχηµατίστηκαν και ετεροδιµερή. Η αρχική υπόθεση για τον τρόπο σχεδιασµού της υποτιθέµενης φυτείας κλώνων, καθώς και άλλες επόµενες υποθέσεις απορρίφθηκαν και πρέπει να πραγµατοποιηθεί µία διαφορετική προσέγγιση. 7

8 SUMMARY Black Pine (Pinus nigra) is a conifer with very wide distribution, extending from North-western Africa, through Eastern Europe to Asia Minor and Crimea. Moreover, its altitudinal appearance, starting at 250m (sometimes near the sea) goes up to 1800m altitude and its ecological requirements are minimal. These data, while that is a relic of Tertiary, confer great genetic diversity and great plasticity to the species that in a climate change environment will allow its survival and the capacity to adapt. Alongside the imperative to protect genetic resources is identification of the protected genetic material for proper management and promotion. This research paper attempted to identify clones of a black pine gene bank / plantation and the location of each clone in the plantation with the cheapest and fastest way. The genetic analysis was conducted with the use of isozymes and particularly the enzymic system of malate dehydrogenase (MDH) due to its importance in every living organism and its great diversity that demonstrates in conifers. MDH has also been used to identify species, varieties and populations of black pine. The interpretation of MDH was achieved using 2 electrophoretic systems and the identified polymorphic genotypes appeared to follow Mendelian inheritance (x 2 ). The 34 individuals that were studied showed 4 locus of which 2 (MDH-A and MDH-D) were monomorphic and the remaining 2 (MDH-B and MDH-C) showed 4 and 3 alleles, respectively, which allows us to calculate the potential of identification for this sample to 60 genotypes; the least also formed a heterodimer. The initial hypotheses of the design of the alleged clone plantation and all subsequent cases taken were rejected and a different approach must be made. 8

9 ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΜΑΥΡΗ ΠΕΥΚΗ (PINUS NIGRA ARN.) Βιολογία και Οικολογία Η ευρωπαϊκή µαύρη πεύκη (Pinus nigra Arnold) αυξάνει έως περίπου τα 30 µ. (σπανίως τα 40 µε 50 µ.) σε ύψος, µε συνήθως ευθυτενή κορµό. Το χρώµα του φλοιού ποικίλει από ανοιχτό γκρίζο έως σκούρο γκρι-καφέ, µε βαθιές επιµήκεις πτυχώσεις στα γηραιότερα δέντρα. Η κόµη είναι πλατιά κωνική στα νεαρά άτοµα και οµπρελοειδής στα ωριµότερα άτοµα, ειδικά σε αυτά που φύονται σε ρηχά και πετρώδη εδάφη. Τα ακροκλάδια των νεαρών δέντρων έχουν ελαφρά κλίση προς τα πάνω, ενώ στα µεγαλύτερα δέντρα µόνο τα κλαδιά στο κορυφαίο τµήµα της κόµης έχουν κλίση προς τα πάνω. Οι βελόνες είναι σχετικά σκληρές µήκους 8-16 εκ., 1-2 χιλ. διαµέτρου, ευθύγραµµες ή περιεστραµµένες, ελαφρά οδοντωτές. Η µαύρη πεύκη είναι ένα µόνοικο κωνοφόρο που γονιµοποιείται µε ανεµοεπικονίαση και οι σπόροι του διασπείρονται µε τον άνεµο. Εκβάλει άνθη κάθε χρόνο, παρόλο που η παραγωγή είναι άφθονη κάθε 2-4 χρόνια. Τα δέντρα φτάνουν σε ηλικία ωρίµανσης στα χρόνια στο φυσικό τους περιβάλλον. Τα άνθη εµφανίζονται κατά το Μάιο (Isajev et al., 2004). Η µαύρη πεύκη θεωρείται ψυχρόβιο κωνοφόρο αλλά σποραδικά φύεται και κοντά στη θάλασσα (Ακτές Αδριατικής, Πετρωτά Κοµοτηνής) (Τσακτσίρα,1998). Στην Ισπανία, την Κορσική και την Ιταλία φύεται σε ύψος µέτρων ενώ στη Γαλλία τη βρίσκουµε στα µέτρα (Isajev et al., 2004). Στην Αυστρία και Γιουγκοσλαβία βρίσκεται στα µέτρα ενώ στην Ελλάδα και Τουρκία φτάνει η εξάπλωσή της στα 1300 µέτρα. Στα Νότια Όρη του Ταύρου στην Τουρκία βρίσκεται πάνω από τα 1800 µέτρα και στην Κύπρο τη βρίσκουµε στα µέτρα (Isajev et al., 2004). Εξάπλωση Ταξινόµηση Η µαύρη πεύκη εκτείνεται σε περισσότερα από 3,5 εκατοµµύρια εκτάρια από τη δυτική Βόρειο Αφρική µέσω της ανατολικής Ευρώπης έως τη Μικρά Ασία. Χάρη 9

10 σε αυτή την κατά τα άλλα διακοπτόµενη περιοχή οφείλεται η µεγάλη γενετική και φαινοτυπική παραλλακτικότητα, θεωρείται ως ένα συλλογικό είδος (Isajev et al., 2004). Παρόλο που δεν υπάρχει κάποια κοινά αποδεκτή άποψη για την ταξινόµησή της, έξι είναι τα κύρια υποείδη που αναγνωρίζονται από τη Βόρεια Αφρική ως την Κριµέα (Isajev et al., 2004): Η Pinus nigra sb. mauretanica (Maire et Peyerimh.) Heywood καλύπτει µονάχα µερικά εκτάρια από τα όρη Rif του Μαρόκο και τα όρη Djurdjura της Αλγερίας. Η Pinus nigra sb. salzmannii (Dunal) Franco (syn: P. n. clusiana, P. n. pyrenaica) καλύπτει εκτεταµένες περιοχές στην Ισπανία (περισσότερα από ha από την Ανδαλουσία στην Καταλονία και στις νοτιότερες πλαγιές των Πυρηναίων) και βρίσκεται σε µερικούς αποµονωµένους πληθυσµούς των Πυρηναίων και Σεβέν στη Γαλλία. Συχνά αναφέρεται και ως Πυρηναϊκή πεύκη. Εικόνα 1: Η γεωγραφική εξάπλωση της µαύρης πεύκης (Isajev et al., 2004) Η Pinus nigra sb. laricio (Poiret) βρίσκεται στην Κορσική (Corsican pine) σε περισσότερα από ha, στην Καλαβρία (που παρόµοια αναγνωρίζεται ως P. n. l. calabrica, Calabrian pine) και στη Σικελία. Η Pinus nigra sb. nigra (συν: P.n. austriaca, P.n. nigricans Host, Austrian pine) βρίσκεται από την Ιταλία στα Απέννινα, έως τη βορειότερη Ελλάδα µέσω των 10

11 Ιουλιανών Άλπεων και των βαλκανικών ορέων, καλύπτοντας περισσότερα από ha. Η Pinus nigra sb. dalmatica (Vis.) Franco (Dalmatian pine) βρίσκεται σε µερικά νησιά στις ακτές της Κροατίας και στις βορειότερες πλαγιές των Διναρικών Άλπεων. Η Pinus nigra sb. pallasiana (Lamb.) Holmboe καλύπτει εκτεταµένες περιοχές, κυρίως στην Ελλάδα και Τουρκία (2.5 εκατοµµύρια ha, 8% της συνολικής δασωµένης έκτασης) και πιθανόν έως τη Βουλγαρία. Μπορεί επίσης να βρεθεί στην Κύπρο και την Κριµέα ενώ κάποιες φορές αναφέρεται και ως Crimean pine. Ειδικότερα στην Ελλάδα, καταλαµβάνει µεγάλη έκταση ( ha), ιδιαίτερα στην οροσειρά της Πίνδου από τα βόρεια σύνορα µε την Αλβανία και το FYROM µέχρι τον Πάρνωνα και τον Ταύγετο. Στη Βόρεια Ελλάδα απαντάται στο συγκρότηµα Ολύµπου, Πιερίων, Βερµίου και ασυνεχώς στα όρη Βόρας, στη Χαλκιδική (Σιθωνία, Άγιο Όρος), στο συγκρότηµα της Ροδόπης (Γρανίτης, Παρανέστι), στον Έβρο (Δαδιά) και στην Κοµοτηνή (Πετρωτά). Απαντάται επίσης στα νησιά Θάσος Μυτιλήνη, Σάµος και Εύβοια (Τσακτσίρα,1998). Σηµαντικότητα και Χρήσεις Η µαύρη πεύκη είναι ένα από τα οικονοµικώς πιο σηµαντικά εγγενή κωνοφόρα στη νότια Ευρώπη. Η αρχική ανάπτυξη είναι µάλλον γρήγορη και έχει ευρέως φυτευτεί πέραν της φυσικής του περιοχής. Το ξύλο του είναι ανθεκτικό και πλούσιο σε ρητίνη µε εύκολη κατεργασία. Η P.nigra laricio χρησιµοποιείται ιδιαίτερα για την οικοδόµηση και στέγαση, λόγω της ευθύτητας του ξύλου και των λεπτών κλαδιών. Το ξύλο της P. nigra nigra είναι κατώτερης ποιότητας και, συνεπώς, περιορίζεται σε χαµηλότερης ποιότητας ξύλου δόµησης και την κατασκευή κιβωτίων. Η µαύρη πεύκη έχει µέση παραγωγικότητα 8 έως 20 m 3 ha -1 yr -1, όταν καλλιεργείται ως µονοκαλλιέργεια σε γόνιµα εδάφη. Σε φυσικές συνθήκες, η παραγωγικότητα είναι 6 έως 10 m 3 ha -1 yr -1 και σε λιγότερα από 3 m 3 ha -1 yr -1 για τις ξηρότερες περιοχές. Λόγω της ικανότητάς της να αναπτύσσεται σε ανοικτά εδάφη και σε υψηλών οικολογικών απαιτήσεων καταστάσεις, χρησιµοποιήθηκε εντατικά σε προγράµµατα αναδάσωσης κατά τη διάρκεια του 19ου και στις αρχές του 20ου αιώνα (Isajev et al., 2004). Η µαύρη πεύκη επίσης εκτιµάται για τον εξωραϊσµό, τόσο σε πάρκα (µεµονωµένα δένδρα ή σε οµάδες) όσο και σε αστικά και βιοµηχανικά περιβάλλοντα 11

12 λόγω της ανοχής της στη ρύπανση. Άλλες χρήσεις περιλαµβάνουν: χριστουγεννιάτικα δέντρα, ξύλο για καύσιµα κ.α. Η µαύρη πεύκη περιλαµβάνεται στην ντιρεκτίβα του Ευρωπαϊκού Συµβουλίου 1999/105/CE (22 Δεκ. 1999) σχετικά µε την εµπορία του δασικού πολλαπλασιαστικού υλικού όπου πρέπει να πληρούνται οι ελάχιστες συνθήκες (γνώση προέλευσης) προτού µπορεί να πωληθεί σπόρος για αναδάσωσεις µαύρης πεύκης. Γενετική ποικιλότητα του είδους στα ισοένζυµα Οι Aguinagalde και Bueno (1994) µελέτησαν τη φαινοτυπική και ηλεκτροφορετική ποικιλότητα σπόρων από δύο πληθυσµούς της µαύρης πεύκης. Η φαινοτυπική σύγκριση των σπόρων αποκάλυψε σηµαντικές διαφορές µεταξύ των δύο πληθυσµών, που όµως θα µπορούσαν αν έχουν προκλιθεί από τις διαφορετικές περιβαλλοντικές καταπονήσεις. Η γενετική ανάλυση, που πραγµατοποιήθηκε µε ισοένζυµα (8 ισοενζυµικούς δείκτες, µεταξύ αυτών και της µηλικής αφυδρογονάσης), έδειξε σηµαντική διαφοροποίηση των δύο πληθυσµών σε δύο γονιδιακές θέσεις, µία της GOT και µία της ACO. Αναγνώρισαν τέσσερις γονιδιακές θέσεις στη µηλική αφυδρογονάση, εκ των οποίων οι 2 (MDH-2, MDH-3) παρόλο που έδειξαν σηµαντικά επίπεδα πολυµορφισµού εντός των πληθυσµών δεν ήταν στατιστικώς σηµαντικά και η µία (MDH-4) ήταν µονοµορφική (Aguinagalde & Bueno, 1994). Οι Scaltsoyiannes κ.α. (1994) µελέτησαν την αλλοενζυµική κατανοµή των συχνοτήτων σε 5 Ευρωπαϊκούς πληθυσµούς της µαύρης πεύκης (Αυστρία, Βουλγαρία, Ελλάδα, Κορσική, Καλαβρία) κάνοντας χρήση 10 ενζυµικών συστηµάτων (MDH, 6PGD, MR, IDH, PGM, DIA, AAT, LAP, PGI, GDH). Από τα αποτελέσµατα φάνηκε πως η µηλική αφυδρογονάση είναι ένα από τα καταλληλότερα συστήµατα για την κατηγοροποίηση των υπό µελέτη πληθυσµών, παρουσιάζοντας 4 γονιδιακές θέσεις και δηµιουργίας ετεροδιµερών σε 2 θέσεις (MDH-B, MDH-C). Σύµφωνα µε τους ερευνητές, η επεξήγηση του ζυµογράµµατος της µηλικής αφυδρογονάσης είναι πολύπλοκη, διότι: α) η 2η γονιδιακή θέση δηµιουργεί µία πολύ ασθενή χρώση ( µπάντα ), σε αντίθεση µε την πρώτη που είναι έντονη, β) οι 2 γονιδιακές θέσεις (MDH-A, MDH-B) εµφανίζονται συχνά σαν µία διευρυµένη µπάντα και γ) ένα από τα πιο κοινά αλληλόµορφα της 3 ης γονιδιακής θέσης (MDH- C4) καλυπτόταν από την έντονη χρώση της 4 ης γονιδιακής θέσης και επιπλέον των προηγουµένων, ισχύουν ότι: α) η ποικιλότητα της θέσης MDH-B και/ή της θέσης 12

13 MDH-C συντελούν στην αλλαγή της θέσης της µπάντας του ετεροδιµερούς ώστε να βρίσκεται πάντα στη µέση της απόστασης των θέσεων MDH-B και MDH-C και β) η ποικιλότητα της θέσης MDH-A καθώς και η παρουσία ανενεργού αλληλοµόρφου στη τέταρτη γονιδιακή θέση, αποκαλύπτουν την παρουσία των αλληλοµόρφων MDH-B1 και MDH-C4 αντίστοιχα. Οι Silin και Goncharenko (1996) µελέτησαν οκτώ πληθυσµούς που βρίσκονται στη Κριµαιϊκή χερσόνησο, χρησιµοποιώντας 14 ενζυµικά συστήµατα (µεταξύ αυτών και η MDH) και παρατηρήθηκαν 70 αλληλόµορφα σε 24 γονιδιακές θέσεις. Τα αποτελέσµατα της ανάλυσης της γενετικής ποικιλότητας, γενετικής διαφοροποίησης και ροής γονιδίων δείχνουν ότι οι υπό µελέτη πληθυσµοί έχουν παρόµοια γενετική δοµή. Επιπλέον, οι εκτιµούµενες παράµετροι γενετικής ποικιλότητας έδειξαν ότι η µαύρη πεύκη είναι πολυµορφική σε περισότερες από το 66% των γονιδιακών θέσεων, οι τιµές της µέσης αναµενόµενης και παρατηρούµενης ετεροζυγωτίας ήταν και αντίστοιχα, κάτι που επιτρέπει το χαρακτηρισµό του είδους ως ένα από πιο έντονα διαφοροποιούµενα του γένους Pinus (Silin & Goncharenko, 1996). Οι Aguinagalde κ.α. (1997) ανέλυσαν πέντε ευρωπαϊκούς πληθυσµούς, που ανήκουν σε τρία υπο-είδη της µαύρης πεύκης, σε 4 µορφοµετρικά χαρακτηριστικά των σπόρων, όπου εντοπίστηκαν σηµαντικές διαφορές µεταξύ των πληθυσµών, καθώς και για 23 ισοενζυµικές θέσεις, ενώ διαγνωστική αξία παρουσίασαν τα 5 ισοενζυµικά συστήµατα (µεταξύ αυτών και η MDH). Η µεγαλύτερη γενετική ποικιλότητα (σε σχέση µε το σύνολο των υπο-ειδών) εντοπίστηκε εντός των πληθυσµών και το δενδρόγραµµα που καταρτίσθηκε έδειξε την ύπαρξη τριών οµάδων, που ανταποκρινόντουσαν στα τρία υπο-είδη. Τη µεγαλύτερη απόσταση γενετικά την είχε ο πληθυσµός της Κορσικής, καθώς επίσης και σχετική έλλειψη γενετικής ποικιλότητας, που δικαιολογούνται από τη γεωγραφική αποµόνωση του πληθυσµού (Aguinagalde et al., 1997). Οι Ηengel κ.α. (2000) ερεύνησαν τη γενετική δοµή πληθυσµών µαύρης πεύκης από την περιοχή Kazdagi της Τουρκίας, µε τη χρήση 16 ενζυµικών συστηµάτων, απ όπου προέκυψαν 29 γονιδιακές θέσεις, µε το µέσο αριθµό αλληλοµόρφων ανά γονιδιακή θέση (1,65 1,69) και πολυµορφισµών (51,7 58,6%) να µην έχουν σηµαντική ποικιλοµορφία. Από τις 4 εµφανιζόµενες γονιδιακές θέσεις της MDH, η MDH2 ήταν µονοµορφική (Ηengel et al., 2000). 13

14 Οι Scaltsoyiannes κ.α. (2009) ερεύνησαν τον τύπο, τη σηµαντικότητα και το µοτίβο της ποικιλότητας µεταξύ 13 πληθυσµών της µαύρης πεύκης σε 14 γονιδιακές θέσεις που έδωσαν 61 αλληλόµορφα, πολυµορφικά σε όλες τις θέσεις. Τα αποτελέσµατα της ανάλυσης έδειξαν µεγάλα επίπεδα ποικιλότητας του είδους, ενώ υπήρχε χαµηλή ροή γονιδίων στους αποµονωµένους πληθυσµούς της Ισπανίας εν αντιθέση µε τους πληθυσµούς των Βαλκανίων που είχαν υψηλότερες τιµές (Scaltsoyiannes et al., 2009). Απειλές στη γενετική ποικιλότητα της µαύρης πεύκης Η µαύρη πεύκη δεν αναγνωρίζεται ως απειλούµενο είδος αν και ορισµένοι από τους υπο-µεσογειακούς ενδηµικούς πληθυσµούς αποτελούν οικοτόπους προτεραιότητας στο πλαίσιο της ντιρεκτίβας της ΕΕ Natura 2000 (Habitat Directive αριθ. 92/43/ΕΟΚ, 21 Μαΐου 1992). Εκτεταµένες φυτείες έγιναν συχνά σε όλη την Ευρώπη τους τελευταίους δύο αιώνες µε υλικό από άγνωστες ή/και πολύ αποµακρυσµένους πληθυσµούς για τους οποίες δεν υπάρχουν ιστορικά στοιχεία. Αυτό πιθανώς να οδήγησε σε εκτεταµένη ανάµιξη των τοπικών και των εισαγόµενων γονιδιακών αποθεµάτων σε όλη την περιοχή κατανοµής της µαύρης πεύκης (Isajev et al., 2004). Σε περιοχές όπου η µαύρη πεύκη είναι ευρέως διαδεδοµένη και πολύ σηµαντική για τη δασοκοµία, παράγοντες όπως οι δασικές πυρκαγιές και η παράνοµη υλοτοµία προκαλούν σοβαρές βλάβες. Σε περιοχές όπου εµφανίζεται σε µικρούς αποµονωµένους πληθυσµούς, µεγάλοι κίνδυνοι προέρχονται από κάθε παράγοντα που µπορεί να προκαλέσει εξαφάνιση σε τοπική κλίµακα, είτε µέσω της παράνοµης υλοτοµίας και τις πυρκαγιές, είτε µέσω υβριδισµού («γενετική µόλυνση») από φυτεµένη µαύρη πεύκη που ανήκει σε άλλα υποείδη (Isajev et al., 2004). Σπάνιες προελεύσεις, όπως η P. nigra var. pyramidalis ή P. nigra var. sheneriana στην Τουρκία βρίσκονται υπό τις ίδιες απειλές. 14

15 ΠΡΟΣΤΑΣΙΑ ΔΑΣΙΚΩΝ ΓΕΝΕΤΙΚΩΝ ΠΟΡΩΝ Η σπουδαιότητα των γενετικών πόρων στο περιβάλλον και την αειφορία θα πρέπει να γίνει κατανοητή για την προστασία των γενετικών πόρων, ο λόγος δηλαδή για τον οποίο πρέπει να διαφυλαχθούν οι γενετικοί πόροι και να προστατευτούν από τους κινδύνους που ελλοχεύουν (White et al., 2007). Παρακάτω θα επεξηγηθούν οι λόγοι αυτοί. Η σπουδαιότητα των γενετικών πόρων είναι εµφανής από πολλά σηµεία, άλλοτε από οικονοµικής σκοπιάς, άλλοτε οικολογικής, κοινωνικής αλλά και αισθητικής. Η γενετική ποικιλότητα επιτρέπει στα δασικά είδη να προσαρµόζονται στις αλλαγές του περιβάλλοντος και των συνθηκών. Η γενετική ποικιλότητα επιτρέπει στα φυτά να ανταπεξέλθουν σε νέες συνθήκες, µε διαφορετικές οικολογικές λειτουργίες ή ακόµα και µε βελτιωµένο εύρος (χωρικά) ανάπτυξης (Eriksson et al., 1993) και τελικά να επιτευχθεί η προσαρµογή και η αύξηση της παραγωγικότητας. Ο ρόλος της είναι δε, ακόµα µεγαλύτερος όταν µιλάµε για τα δασικά οικοσυστήµατα, όπου τα δέντρα είναι οι κύριοι δοµικοί συντελεστές των οικοσυστηµάτων, εκεί όπου όλα τα υπόλοιπα έµβια όντα στηρίζονται για την επιβίωσή τους. Στη γενετική ποικιλότητα των δασικών ειδών οφείλεται η παραγωγικότητα των δασών, είτε πρωτογενές επίπεδο (ξύλο), είτε σε δευτερογενές (χαρτί, ρητίνη κα). Η γενετική ποικιλότητα είναι αυτή που επιτρέπει την επιβίωση των δασών από τις περιβαλλοντικές καταπονήσεις, δηλαδή τα έντοµα, τους µύκητες, τις ασθένειες κ.α. σε αυτήν στηρίζονται οι βελτιωτές για να παράγουν βελτιωµένο γενετικό υλικό, αλλά και υλικό τελικών προϊόντων µε ειδικά χαρακτηριστικά (Thomas Ledig, 1986; White et al., 2007). Τέλος, θα πρέπει να τονισθεί και η αισθητική αξία των ειδών, που οφείλεται στη γενετική ποικιλότητα (µεταλλάξεις), καθώς και η µελλοντική αξία των ειδών, όπου κάποια χαρακτηριστικά τα οποία σήµερα µπορεί να µην έχουν αναγνωρισµένη αξία, στο µέλλον µπορεί να αναδειχθούν. Ως προστασία γενετικών πόρων ορίζεται η πολιτική των διαχειριστικών δράσεων στις οποίες καταφεύγουµε για να εξασφαλίσουµε συνεχή διαθεσιµότητα και ύπαρξη της γενετικής ποικιλότητας (White et al., 2007). 15

16 Απειλές για τους Δασικούς Γενετικούς Πόρους Οι κυριότερες απειλές της γενετικής ποικιλότητας στους δασικούς φυσικούς πληθυσµούς, αυτές οι οποίες είναι και αµεσότερα ορατές, είναι η απώλεια του φυσικού περιβάλλοντος, η αποψίλωση και ο κατακερµατισµός των δασών, η απώλεια επικονιαστών και ξενιστών και άλλα (Falk, 1990; White et al., 2007). Όπως αναφέρουν οι ερευνητές, τα παραπάνω προέρχονται από πολλές αιτίες, όπως η αύξηση της δραστηριοποίησης του ανθρώπινου πληθυσµού η οποία επέφερε αλλαγή των χρήσεων της γης, υπερβόσκηση, ανάγκες σε καυσόξυλα και βιοµηχανική ξυλεία, που έχουν ως αποτέλεσµα την αποψίλωση των δασικών οικοσυστηµάτων. Όλα αυτά συντελούν στην απώλεια επικονιαστών και φορέων διασποράς, ξενιστών και συµβιοτών, ή ακόµα στην παρέκκλιση, οµοµειξία και σε όλες τις συνέπειες που έχουν οι πληθυσµοί µε µικρό µέγεθος και αριθµό, καθώς και στον ανταγωνισµό και στην εισαγωγή ξενικών ειδών. Οι δραστηριότητες αυτές είναι ιδιαίτερα καταστροφικές για τους γενετικούς πόρους διότι ακολουθούν την αποτύπωση του εδάφους, το οποίο είναι αντίστοιχο και µε την κατανοµή της προσαρµοστικής γενετικής ποικιλότητας η οποία, αντίστοιχα, σχετίζεται µε την τοπογραφία του εδάφους (White et al., 2007). Με αυτό το τρόπο, ο ρυθµός απώλειας των γονιδίων που ελέγχουν προσαρµοστικά γνωρίσµατα είναι µεγαλύτερος από αυτών που ελέγχουν ουδέτερα γνωρίσµατα, που µπορεί επίσης να προκύπτει από µεροληπτική υλοτοµία. Με τον κατακερµατισµό του φυσικού περιβάλλοντος µεταβάλλονται πολλοί συσχετιζόµενοι οικολογικοί και γενετικοί παράγοντες και διαδικασίες, παραλλάσσονται οι φυτοκοινωνίες αποδυναµώνοντας τους πληθυσµούς και δηµιουργείται µία αρνητική δύναµη στη γενετική δοµή και δηµογραφία των δασικών ειδών. Αυτά έχουν ως αποτέλεσµα την αυξηµένη εξαφάνιση ειδών, επηρεάζεται η ροή των γονιδίων και τελικά προκαλείται γενετική εκτροπή και οµοµιξία. Τα παθογόνα σε ένα συγκεκριµένο τόπο περιβάλλον συνηθίζεται να βρίσκονται σε ισορροπία µε τον πληθυσµό των ξενιστών τους, κάτι το οποίο οφείλεται στην συνεξέλιξη των ειδών και την ταυτοποίηση των τοξικών γονιδίων του παθογόνου µε αντίστοιχα γονίδια ανθεκτικότητας στον ξενιστή. Θα µπορούσε όµως ένας παθογόνος οργανισµός, ακόµα και ενδηµικός, να εξαφανίσει τελείως έναν ξενιστή, κάτι που συνηθίζεται µε µη ντόπια παθογόνα για τα οποία δεν έχουν εξελιχθεί κάποια αντίστοιχα γονίδια από τα ενδηµικά είδη. Οι επιδηµίες που θα προκληθούν από τα παθογόνα διαβρώνουν τη γενετική ποικιλότητα. Ωστόσο, είναι 16

17 πιθανό να υπάρχουν γονίδια αντοχής στα παθογόνα που βρίσκονται όµως σε χαµηλή συχνότητα. Αυτό αποτελεί και ένα επιπλέον λόγο προστασίας του συνόλου της γενετικής παραλλακτικότητας, ακόµα και των γονιδίων χαµηλής συχνότητας και όχι µόνο αυτών µε υψηλή συχνότητα (Thomas Ledig, 1986; White et al., 2007). Τα ξενικά είδη όταν εισάγονται σε µία περιοχή που υπάρχουν ήδη ενδηµικά είδη µπορεί να έχει δύο κύριες επιπτώσεις. Αφενός µπορεί να εκτοπίσουν τα αυτόχθονα είδη και αφετέρου µπορεί να υβριδίσουν µε αυτά, τα οποία µπορεί να είναι σπάνια είδη (Falk, 1990). Η µετακίνηση γενετικού υλικού στα όρια εξάπλωσης των ειδών, όταν δεν ακολουθείται από κάποιες συνθήκες εγκυµονεί κινδύνους για τη γενετική ποικιλότητα. Αυτό συµβαίνει κυρίως στις αναδασώσεις, που όµως αν χρησιµοποιηθεί ντόπιο γενετικό υλικό δεν υπάρχει αλλοίωση. Στην αντίθετη περίπτωση µπορεί να προκύψουν αδύναµα, µη παραγωγικά δάση. Επίσης, σηµαντική απειλή για τη γενετική ποικιλότητα για τις βιοµηχανοποιηµένες χώρες και εκείνες τις περιοχές που παρουσιάζουν έντονη βιοµηχανική δραστηριότητα, είναι η ρύπανση. Οι ρύποι αυτοί λόγω της τοξικότητάς τους προκαλούν µεγάλη θνησιµότητα στα φυτικά είδη και ακόµα περισσότερο στα δέντρα λόγω του µεγάλου περίτροπου χρόνου τους. Ακόµα, προκαλείται ένα είδος επιλογής για αντοχή στη ρύπανση µε συνέπειες στη γενετική δοµή των πληθυσµών. Τέλος, η αλλαγή του κλίµατος µπορεί να επιφέρει πολλές αλλαγές στη γενετική παραλλακτικότητα. Βάσει διαφόρων µοντέλων πρόβλεψης, οι κατανοµές των δασικών ειδών θα µετακινηθούν βορειότερα γεωγραφικά και σε µεγαλύτερα υψόµετρα, που σηµαίνει πως υπάρχει αυξηµένος κίνδυνος στα είδη τα οποία δεν έχουν χώρο να µετακινηθούν προς αυτές τις κατευθύνσεις. Στρατηγικές για τη Διατήρηση των Δασικών Γενετικών Πόρων Η στρατηγική διατήρησης της γενετικής ποικιλότητας που είναι καταλληλότερη για κάθε είδος, εξαρτάται από το µέγεθος της γεωγραφικής του εξάπλωσης, τη γενετική δοµή του πληθυσµού και τα τοπικά γνωρίσµατα. Οι βασικές στρατηγικές διατήρησης είναι η in situ και η ex situ. Η µέθοδος in situ περιλαµβάνει την προστασία του είδους είτε ως διαχείριση των φυσικών δασών ως φυσικά αποθέµατα, είτε µε τη µετατροπή εναποµείναντων συστάδων της περιοχής εξάπλωσης του είδους (όπως είναι οι προστατευόµενες 17

18 περιοχές, οι αδιατάρακτες περιοχές, τα φυσικά αποθέµατα και τα εθνικά πάρκα). Το πλεονέκτηµα της µεθόδου αυτής είναι το χαµηλό κόστος ίδρυσης και συντήρησης και το µειονέκτηµά της, το χαµηλό ποσοστό επιτυχίας λόγω κοινωνικών συνθηκών σε χώρες όπου δεν υπάρχει δυνατότητα προστασίας των περιοχών αυτών. Η µέθοδος ex situ περιλαµβάνει είτε διατήρηση γενετικού υλικού (σπόρο, γύρη, βλαστ. ιστούς) σε κατάψυξη και χαµηλές θερµοκρασίες, είτε τη δηµιουργία φυτειών έξω από την περιοχή εξάπλωσης του είδους (τράπεζες γονιδίων). Αυτό πραγµατοποιείται µετά από δειγµατοληψία στο φυσικό πληθυσµό. Η µέθοδος αυτή είναι δαπανηρή, όµως κάποιες περιπτώσεις την επιβάλλουν όπως όταν υπάρχουν πιθανότητες να εντοπιστούν χαρακτηριστικά µέσω των προγραµµάτων βελτίωσης ή στην περίπτωση που δε θα µπορούσαν να προστατευτούν οι πόροι µε την in situ µέθοδο. Το µέγεθος του πληθυσµού είναι ένα πολύ σηµαντικό στοιχείο στο τρόπο διατήρησης της γενετικής ποικιλότητάς του. Όταν στόχος της στρατηγικής διατήρησης είναι να διατηρηθούν και τα γονίδια χαµηλής συχνότητας τότε πρέπει να ληφθεί ένας µεγάλος αριθµός ατόµων του πληθυσµού, ενώ σε άλλη περίπτωση ένας µικρός αριθµός ατόµων επαρκεί (White et al., 2007). Το µέγεθος του πληθυσµού φαίνεται να παίζει επίσης, καθοριστικό ρόλο στην ποικιλότητα. Η γενετική εκτροπή (genetic drift), δηλαδή η τάση των συχνοτήτων των αλληλοµόρφων να µεταβάλλονται µε το χρόνο λόγω τυχαίων γεγονότων, είναι αντιστρόφως ανάλογη του µεγέθους του πληθυσµού (Kimura and Ohta, 1971). Όταν ο πληθυσµός ενός είδους είναι αρκετά µεγάλος και συνεχής, ο ρυθµός µε τον οποίο τα γονίδια γίνονται µονοµορφικά (gene fixation) εξαιτίας της γενετικής εκτροπής είναι πολύ πιο αργός από ένα µικρό πληθυσµό. Ως προϋπόθεση στη διατήρηση γονιδίων αποτελεί η δέσµευση τουλάχιστον ενός αντιγράφου του 95% των γονιδίων που υπάρχουν σε ένα πληθυσµό σε συχνότητες µεγαλύτερες από 0,05, κάτι το οποίο βάσει µαθηµατικών θεωριών µπορεί να επιτευχθεί µε ένα µέγεθος δείγµατος από 50 έως και 160 δείγµατα, ανάλογα µε τις προϋποθέσεις του προτύπου. Για τη διατήρηση και των γονιδίων χαµηλής συχνότητας ο αριθµός των 1000 ατόµων είναι ο ελάχιστος, ανάλογα και µε το µέγεθος του πληθυσµού. Βέβαια, εγείρονται ερωτήµατα για το ποια γονίδια θα πρέπει να επιλεχθούν για διατήρηση καθώς στη γενετική ποικιλότητα δε συνεισφέρουν µονάχα τα συχνώς εµφανιζόµενα γονίδια αλλά και τα σπανίως (Krusche & Geburek, 1991). Οι αριθµοί που αναφέρονται, προφανώς απευθύνονται στο µέσο όρο των πληθυσµών, άλλωστε υπάρχουν πολλοί αποµακρυσµένοι και 18

19 µεµονωµένοι πληθυσµοί για τους οποίους αρκούν ελάχιστα δείγµατα για τη διατήρηση του συνόλου της γενετική ποικιλότητάς τους. Τράπεζες γονιδίων Τράπεζα γονιδίων είναι µία ex-situ (ή, εκτός της τοποθεσίας) συλλογή γενετικού υλικού που διατηρείται για τη µακροπρόθεσµη ασφάλεια του υλικού ή για την ευκολία της πρόσβασης σε αυτό (Linington & Pritchard, 2001). Συνήθως, το γενετικό υλικό στις τράπεζες γονιδίων είναι µε τη µορφή ζώντος πολλαπλασιασµένου υλικού ή γαµετών, ενώ υπάρχει µία αυξάνουσα πορεία στη χρήση της µεθόδου διατήρησης καθαρού DNA. Μία τράπεζα µπορεί να είναι και µία φυτεία φυτών, της οποίας τα άτοµα αντιπροσωπεύουν την ποικιλότητα ενός είδους, ή ακόµα σε µία πιο διευρυµένη έννοια, περιλαµβάνονται και οι βοτανικοί κήποι και τα ζωολογικά πάρκα (Linington & Pritchard, 2001). Η ως άνω µορφή διατήρησης του γενετικού υλικού, αποτελεί µία επιπλέον εγγύηση για τα συνολικά µέτρα διατήρησης που ακολουθούν την in-situ πρακτική και παρέχουν κέντρα από τα οποία µπορεί να συλλεχθεί γενετικό υλικό για έρευνα, βελτίωση ή (επανα-) εισαγωγή σε έναν τόπο. Άλλες µορφές ex-situ διατήρησης είναι οι τράπεζες σπόρων, οι τράπεζες γυρεοκόκκων ή σπορίων, η κρυοδιατήρηση σωµατικών και ζυγωτικών εµβρύων, αγενώς πολλαπλασιαζόµενων ιστών και µικροοργανισµών, οι τράπεζες DNA και οι βοτανικοί και ζωολογικοί κήποι. Μία τράπεζα γονιδίων, πέρα από την προστασία και ασφάλεια που παρέχει για το γενετικό υλικό, αποκτά επιπρόσθετη αξία µε την έρευνα που επιτελείται σε αυτό το υλικό εκ των υστέρων. Επιπρόσθετη αξία στην διατήρηση του γενετικού υλικού µε τις τράπεζες γονιδίων δίνεται από τον κίνδυνο, στην in-situ διατήρηση, της γενετικής διάβρωσης των ειδών, ως το αποτέλεσµα της ανθρώπινης δραστηριότητας που έχει προηγουµένως αναφερθεί, καθώς και τις πολλές δυσκολίες διαχείρισης που παρουσιάζουν οι πληθυσµοί in-situ προστασίας (Linington & Pritchard, 2001). Τα δασικά δέντρα έχουν γενικά βρεθεί να διαθέτουν ένα µεγάλο επίπεδο γενετικής παραλλακτικότητας τόσο στα ουδέτερα αυξητικά γνωρίσµατα, όσο και στα ποσοτικά γονιδιακά γνωρίσµατα (Hamrick, 2004). Έχουν συχνά επίσης αυξηµένη δυνατότητα διασποράς και υψηλά επίπεδα ροής γονιδίων, η οποία προωθεί την εγκαθίδρυση καλύτερα προσαρµοσµένων γενοτύπων στους τοπικούς πληθυσµούς 19

20 (Aitken et al., 2008, Austerlitz et al., 2000, Davis and Shaw, 2001, Savolainen et al., 2007). Ενώ όµως τα υψηλά επίπεδα γενετικής διαφοροποίησης και ροής γονιδίων θα έπρεπε να βοηθούν τα δέντρα να προσαρµοστούν στις κλιµατικές αλλαγές, η προσαρµογή τους παραµένει αργή λόγω των µεγάλων χρόνων αναπαραγωγής (Aitken et al., 2008, Petit and Hampe, 2006, Savolainen et al., 2004). Τα χαρακτηριστικά των δέντρων που επιδεικνύουν τη δυνατότερη κλιµατική προσαρµογή, είναι αυτά που ρυθµίζουν το συγχρονισµό της αύξησης, το σταµάτηµα της αύξησης και την αντοχή στους παγετούς (Howe et al., 2003, Howe et al., 2000, Rehfeldt, 1989, Savolainen et al., 2007). Σε πολλά είδη, η επιλογή αυτών των χαρακτηριστικών είναι πολύ δύσκολη στο στάδιο του σποροφύτου (τα σπορόφυτα που παύουν να αυξάνουν πολύ νωρίς πιθανόν να υπερκεραστούν εν αντιθέσει µε τα σπορόφυτα που δεν σταµατούν την αύξηση πριν τους παγετούς και πεθαίνουν). Από την άλλη πλευρά, τα εγκαθιδρυµένα δέντρα είναι σχετικώς ανεκτικά στις ζηµίες των παγετών (Savolainen et al., 2007). Έτσι, η χαµηλή θνησιµότητα των µη προσαρµοσµένων δέντρων µπορεί να επιβραδύνει την παραγωγή και την εισαγωγή καλύτερα προσαρµοσµένων σποροφύτων (Kramer et al., 2008, Savolainen et al., 2004). Οι σχετικοί ρόλοι της ηλικίας ωρίµανσης, ικανότητας διασποράς και θνησιµότητας στην εξελικτική προσαρµοστικότητα των δέντρων σε νέες περιβαλλοντικές συνθήκες είναι ακόµα άγνωστες (Kuparinen et al., 2010). Με την πρόοδο της επιστήµης και την ανάπτυξη νέων βιοτεχνολογικών µεθόδων, η βελτίωση των δασοπονικών ειδών προχώρησε σε νέα επίπεδα και απαγκιστρώθηκε από τα προβλήµατα που η κλασική βελτίωση αδυνατούσε να ξεπεράσει, λόγω των γνωστών συνθηκών που επικρατούν στα δασικά ξυλώδη είδη. Οι νέοι τοµείς έρευνας της γενωµικής, πρωτεωµικής και µεταβολωµικής, καθώς και του αγενούς πολλαπλασιαµού, αποτελούν τα εργαλεία των βελτιωτών των δασοπονικών ειδών για την περαιτέρω αύξηση του γενετικού κέρδους και την εκπλήρωση των µελλοντικών αναγκών της κοινωνίας. Τα εργαλεία αυτά, όπως φαίνεται και από την ιστορική τους πορεία και εξέλιξη, µεταβλήθηκαν, τροποποιήθηκαν και θα συνεχίσουν και στο µέλλον καθώς θα ανακαλύπτονται νέα αναλυτικότερα εργαλεία και µέθοδοι. Σε αυτό το σηµείο έρχεται να δράσει η Δασική Βιοτεχνολογία, που ουσιαστικά αποτελεί µία υποσχόµενη εναλλακτική διαχειριστική µέθοδο στην καλλιέργεια των δασών και θα µπορούσε να µειώσει την πίεση που αυτά δέχονται για παραγωγή (Canadian Forest Service, 2000). Η Δασική Βιοτεχνολογία έχει ακόµα πολλά να προσφέρει στη βελτίωση των δασοπονικών ειδών, όµως αυτό 20

21 που απαιτείται από τους ερευνητές είναι η ολοκληρωµένη αντιµετώπιση και πολύπλευρη αντίληψη στην επίλυση των προβληµάτων που τίθενται. Κλωνική Δασοπονία Με την ευρεία έννοια, ο όρος «Κλωνική Δασοπονία» αναφέρεται στη χρήση αγενώς πολλαπλασιασµένων φυτών για την αναγέννηση του δάσους και αποτελεί έναν όρο συγκρινόµενο µε τον παραδοσιακό «Δασοπονία Σποροφύτων», όπου χρησιµοποιούνται σπόροι για την παραγωγή φυτών (Canadian Forest Service, 2000), παρόλα ταύτα, οι White κ.α. (2007) αναφέρουν ότι η Κλωνική Δασοπονία αποτελεί µία βελτιωτική στρατηγική και την καθορίζουν ως τη «µαζική αξιοποίηση σχετικά λίγων γνωστών κλώνων, των οποίων η υπεροχή έχει αποδειχθεί σε κλωνικές δοκιµές». Τα τελευταία χρόνια υπάρχει µία κορύφωση της χρήσης βλαστικώς πολλαπλασιαζόµενου και βελτιωµένου γενετικού υλικού µε σκοπό την αύξηση του γενετικού κέρδους και της παραγόµενης βιοµάζας για την ικανοποίηση των αυξανόµενων αναγκών της κοινωνίας. Η χρήση της έχει εντατικοποιηθεί µε αυτό το σκοπό σε αρκετές χώρες της Αµερικής και της Ωκεανίας, µεταξύ αυτών Καναδά, ΗΠΑ, Νέα Ζηλανδία και Βραζιλία, κυρίως σε είδη που µπορούν να πολλαπλασιαστούν βλαστικά κατά την ηλικία επιλογής και σε µαζική κλίµακα. Στην Ευρώπη, η χρήση της κλωνικής δασοπονίας πραγµατοποιήθηκε µονοµερώς σε µερικά είδη, όπως η καρυδιά και ο ευκάλυπτος (Ισπανία και Πορτογαλία), ενώ σε άλλα σηµεία, παρουσιάζεται ως η αλλαγή των τάσεων από µία πιο συστηµατική (εντατική) σε µία πιο φυσική και ασφαλή (βιοποικιλότητα) διαχείριση. Η Κλωνική Δασοπονία παρέχει τη δυνατότητα ανάπτυξης των γνωστών αξιόπιστων κλώνων για πολλά χρόνια καθώς και τη χρήση εξειδικευµένων διαχειριστικών πρακτικών για κάθε κλώνο, αλλά αυτό που τη διαφοροποιεί είναι η σε ευρεία κλίµακα αξιοποίηση και πολλαπλασιασµός ατοµικών κλώνων των οποίων η αξία έχει εξακριβωθεί. Επιπλέον, η Κλωνική Δασοπονία πλεονεκτεί, σε σχέση µε την αύξηση του γενετικού κέρδους, στην ύπαρξη καλύτερου ελέγχου της γενετικής ποικιλότητας στις φυτείες καθώς και στη βελτίωση της ίδιας της επιχειρησιακής διαχείρισης. 21

22 Γενετικοί Δείκτες Σύµφωνα µε τους White κ.α. (2007), ως γενετικός δείκτης ορίζεται «κάθε ορατό γνώρισµα ή κάθε µετρήσιµος φαινότυπος, για τον οποίο τα αλληλόµορφα µίας γονιδιακής θέσης διαχωρίζονται κατά τους µενδελικούς νόµους». Οι γενετικοί δείκτες χρησιµοποιούνται στους φυσικούς και στους καλλιεργούµενους πληθυσµούς για τη µελέτη των παραγόντων που επηρεάζουν τους πληθυσµούς αυτούς, όπως την περιγραφή του τρόπου διασταύρωσης, τη µοντελοποίηση της γεωγραφικής ποικιλότητας, τη µεταξύ των ειδών και ποικιλιών ταξινοµική και φυλογενετική σχέση, τις επιπτώσεις της βελτίωσης και διαχείρισης στη γενετική σύσταση, την κατασκευή γενετικών χαρτών σύνδεσης, τη βελτίωση µε βάση τους γενετικούς δείκτες και τέλος την ταυτοποίηση γενοτύπων και γενετικού υλικού στους βελτιωτικούς και πολλαπλασιαστικούς πληθυσµούς (White et al., 2007). Υπάρχουν τριών ειδών γενετικοί δείκτες: οι µορφολογικοί δείκτες, οι µοριακοί και οι βιοχηµικοί δείκτες. Οι µορφολογικοί δείκτες βασίζονται στα µορφολογικά γνωρίσµατα ενός είδους αλλά είναι ελάχιστοι οι µενδελικά κληρονοµούµενοι και αφορούν κυρίως µεταλλάξεις που παρατηρήθηκαν σε αρτίφυτρα (White et al., 2007). Οι µοριακοί δείκτες είναι δείκτες που βασίζονται στο DNA, σε αυτούς που στηρίζονται στην αλυσιδωτή αντίδραση της πολυµεράσης (PCR) και σε αυτούς που στηρίζονται στον υβριδισµό DNA-DNA. Στην πρώτη κατηγορία κατατάσσονται οι δείκτες Τυχαίου Ενισχυµένου Πολυµορφικού DNA (RAPD), Απλών Επαναλαµβανόµενων Αλληλουχιών ή Μικροδορυφόρων (SSR), ESTP και Πολλαπλασιαµοί Πολυµορφικών Τµηµάτων εκ Περιορισµού (AFLP), ενώ στη δεύτερη κατηγορία κατατάσσονται οι δείκτες Πολυµορφισµού Μήκους Θραυσµάτων εκ Περιορισµού ή Περιοριστικού Τµήµατος (RFLP). Οι βιοχηµικοί δείκτες στηρίζονται στα τελικά προϊόντα του µεταβολισµού για την αναγνώρισή τους και µε τη σειρά τους κατατάσσονται στις εξής κατηγορίες: στα µονοτερπένια, στα αλλοένζυµα και σε άλλους πρωτεϊνικούς δείκτες. Τα µονοτερπένια που βρίσκονται στη ρητίνη καθώς και στα αρωµατικά έλαια των φυτών είναι υποοµάδα των τερπενοειδών. Τα αλλοένζυµα είναι αλληλοµορφικοί τύποι ενζύµων και υπήρξαν από τους σηµαντικότερους δείκτες στα δασικά φυτά και έχουν χρησιµοποιηθεί εκτενώς (Conkle, 1981; Adams et al., 1992). Ένας άλλος τύπος πρωτεϊνικού δείκτη είναι η δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση (2-D PAGE) κατά την οποία πραγµατοποιείται 22

23 ηλεκτροφόρηση των ενζύµων σε δύο άξονες και µπορεί να αναλύσει ταυτόχρονα πολλούς γενετικούς δείκτες στην ίδια πηκτή. 23

24 ΙΣΟΕΝΖΥΜΑ Τα ισοένζυµα είναι ένζυµα τα οποία ενώ διαφέρουν στην αλληλουχία των αµινοξέων από τα οποία προέρχονται, καταλύουν την ίδια αντίδραση. Συνήθως διαφέρουν στις κινητικές παραµέτρους ή στις ρυθµιστικές τους ιδιότητες. Τα ισοένζυµα µπορούν να διαχωριστούν το ένα από το άλλο από τις βιοχηµικές τους ιδιότητες, όπως η ηλεκτροφορητική τους ικανότητα. Παρόλο που έχει µειωθεί η χρήση των ισοενζύµων µε την εισαγωγή νέων αναλυτικότερων µεθόδων που βασίζονται στο DNA, αποτελούν ακόµα έναν από τους οικονοµικότερους και γρηγορότερους δείκτες και παραµένουν µία καλή επιλογή για τον εντοπισµό χαµηλών επιπέδων γενετικής ποικιλότητας και ποσοτικοποίηση συστηµάτων γονιµοποίησης. Πλεονεκτήµατα - Μειονεκτήµατα ως γονιδιακοί δείκτες Η τεχνική των ισοενζύµων παρουσιάζει ορισµένα πλεονεκτήµατα και µειονεκτήµατα (Rothe, 1990; Bergmann, 1991; Τσακτσίρα, 1998). Τα πλεονεκτήµατα είναι τα ακόλουθα: - Τα ισοένζυµα θεωρούνται άµεσα προϊόντα της έκφρασης των γονιδίων. Ο τρόπος κληρονόµησής τους ακολουθεί την µενδελική κληρονόµηση και η έκφρασή τους είναι συγκυρίαρχη. - Ο φαινότυπός τους δεν επηρεάζεται από το περιβάλλον. - Η ερµηνεία των ζυµογραµµάτων στις περισσότερες περιπτώσεις είναι εύκολη. - Σε σύγκριση µε τις πιο καινούριες τεχνικές γενετικής ανάλυσης (RAPDS, AFLPS, SSR κλπ) το χρηµατικό κόστος της όλης διαδικασίας είναι µικρότερο. - Μπορούν εύκολα να υπολογιστούν οι συχνότητες των αλληλοµόρφων των γονιδίων στους πληθυσµούς. - Η ποσότητα του δείγµατος (ιστού) που είναι απαραίτητη για τις αναλύσεις είναι µικρή (αλλά µεγαλύτερη σε σχέση µε τις µοριακές τεχνικές). Σε µία ηλεκτροφόρηση, µπορούν να φορτωθούν αρκετά δείγµατα και ταυτόχρονα να εµφανιστούν αρκετά (µέχρι και πέντε ή έξι) ένζυµα (multiplexing). 24

25 - Η αξιοπιστία τους, όσον αφορά στην επαναληψιµότητα των αποτελεσµάτων, είναι πολύ υψηλή (Glaubitz & Moran, 2000). Από την άλλη όµως υπάρχουν και µειονεκτήµατα τα οποία οδηγούν σε πάρα πολλές περιπτώσεις στην εφαρµογή νεώτερων τεχνικών: - Οι γονιδιακές θέσεις των ενζύµων που αναγνωρίζονται στα ζυµογράµµατα, συνιστούν ένα πολύ µικρό και ταυτόχρονα µη-τυχαίο δείγµα όλων των δοµικών (που κωδικοποιούν για κάποια πρωτεΐνη) γονιδιακών θέσεων στο γένωµα ενός είδους. Αυτή η ελλιπής αντιπροσώπευση του γενώµατος, έχει ως αποτέλεσµα πολλές φορές τη λάθος εκτίµηση της ποικιλότητας και της ετεροζυγωτίας. - Μόνο ένα ποσοστό νουκλεοτιδικών αντικαταστάσεων έχει ως αποτέλεσµα αµινοξέα διαφορετικού φορτίου. Αρχές ισοενζύµων Τα ισοένζυµα είχαν αρχικά περιγραφεί από τους R. L. Hunter και Clement Markert (1957) οι οποίοι τα καθόρισαν ως διαφορετικές µορφές του ίδιου ενζύµου, µε ταυτόσηµες λειτουργίες και παρουσία στο ίδιο άτοµο. Αυτός ο ορισµός περιλαµβάνει (1) τις ενζυµικές παραλλαγές που είναι παράγωγα διαφορετικών γονιδίων και συνεπώς αντιπροσωπεύουν διαφορετικές γονιδιακές θέσεις (που χαρακτηρίζονται ισοένζυµα) και (2) ένζυµα που είναι παράγωγα διαφορετικών αλληλοµόρφων του ίδιου γονιδίου (που χαρακτηρίζονται αλλοένζυµα). Στη βιοχηµεία, τα ισοένζυµα είναι ισόµορφα των ενζύµων. Σε πολλές περιπτώσεις κωδικοποιούνται από οµόλογα γονίδια που έχουν διαφοροποιηθεί. Τα ισοένζυµα συγκαταλέγονται στα βιοχηµικά χαρακτηριστικά, τα δευτερογενή προϊόντα µεταβολισµού. Η παρουσία των ισοενζύµων επιτρέπει τη ρύθµιση του µεταβολισµού για την αντιµετώπιση των διαφόρων ειδικών αναγκών ενός ιστού ή ενός αναπτυξιακού σταδίου. Δηµιουργία πρωτεϊνών και ενζύµων Ο σχηµατισµός της πρωτεΐνης εξαρτάται εξολοκλήρου από την αρχική αλληλουχία των νουκλεοτιδίων του κάθε γονιδίου, συνεπώς, αν σε µια γονιδιακή θέση συµβεί κάποια µετάλλαξη, τότε είναι πολύ πιθανό να είναι διαφορετική η πρωτεϊνη που τελικά θα παραχθεί. Η αλλαγή αυτή µπορεί να γίνει είτε µε τη 25

26 διαγραφή, είτε µε την προσθήκη ή ακόµη και µε την αντικατάσταση ενός νουκλεοτιδίου από κάποιο άλλο στην αλληλουχία. Κατά τη διάρκεια της µετάφρασης, οι αλλαγές των νουκλεοτιδίων πολλές φορές οδηγούν σε προσθήκη διαφορετικών αµινοξέων οπότε και δηµιουργούνται τα διαφορετικά τελικά προϊόντα. Αυτά τα τελικά προϊόντα, τα οποία και καλούνται αλληλόµορφα, έχουν συνήθως ελαφρώς διαφορετική λειτουργία, ειδικότερα, στην περίπτωση των ενζύµων, όπου οι µεταλλάξεις οδηγούν πολύ συχνά σε αλλαγή του ηλεκτρικού φορτίου του ενζύµου καθώς επίσης και σε αλλαγή του σχήµατός του. Οι διαφορετικοί αυτοί τύποι ενός ενζύµου που καταλύουν την ίδια αντίδραση ονοµάζονται ισοένζυµα (isozymes ή isoenzymes). Τα ισοένζυµα που προέρχονται από τα διαφορετικά αλληλόµορφα του ίδιου γονιδίου ονοµάζονται αλλοένζυµα (alloenzymes ή allozymes) (Markert and Moller, 1959). Αν ένα είδος παρουσιάζει περισσότερα από ένα αλληλόµορφα για µια γονιδιακή θέση τότε η συγκεκριµένη θέση ή το γονίδιο ονοµάζονται πολυµορφικά. Αντιθέτως, αν σε µια γονιδική θέση εµφανίζεται µόνο ένα αλληλόµορφο, τότε η θέση ονοµάζεται µονοµορφική. Κινητικότητα των ενζύµων Οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες συνίστανται από αµινοξέα που αποτελούνται από µια καρβοξυλοµάδα -COOH, µια αµινοµάδα NH2 και µια πλευρική οµάδα R, τα οποία όλα µαζί ενώνονται σε ένα κεντρικό άτοµο άνθρακα C. Κάθε αµινοξύ διαφέρει στην πλευρική οµάδα R, από την οποία και εξαρτάται κυρίως το φορτίο του κάθε αµινοξέος, είναι θετικά ή αρνητικά ιονισµένη όταν βρίσκεται µέσα σε διάλυµα ή δεν είναι καθόλου ιονισµένη. Κάθε πολυπεπτιδική αλυσίδα θα έχει φορτίο αυτό που θα προκύπτει από το άθροισµα των επιµέρους αµινοξέων που τη συνιστούν. Στην περίπτωση µετάλλαξης ενός νουκλεοτιδίου σε µία πρωτεΐνη (σε µια πολυπεπτιδική αλυσίδα της), τότε αν αλλάξει το αµινοξύ της συγκεκριµένης περιοχής µε κάποιο άλλο διαφορετικού φορτίου, θα αλλάξει το συνολικό φορτίο της πρωτεΐνης και µαζί θα αλλάξει και η ηλεκτροφορητική κινητικότητά της. Που σηµαίνει πως όταν εφαρµόσουµε διαφορά δυναµικού σε κάποιο µέσο πάνω στο οποίο µπορεί να κινηθεί η πρωτεΐνη (ηλεκτροφόρηση), αυτή επειδή είναι φορτισµένη, θα κινηθεί µέχρι ενός ορισµένου σηµείου. Η απόσταση στην οποία θα κινηθεί η πρωτεΐνη εξαρτάται από το φορτίο που φέρει και συνεπώς όταν µεταβληθεί το φορτίο, θα µεταβληθεί και η απόσταση που θα διανύσει (στο µέσο) η πρωτεΐνη. Αλλά δεν οδηγεί κάθε µετάλλαξη σε µεταβολή του συνολικού φορτίου και εποµένως αυτές οι αλλαγές 26

27 δεν µπορούν να ανιχνευθούν µε την τεχνική της ηλεκτροφόρησης. Σε αυτές τις περιπτώσεις, είναι πιθανό, το αµινοξύ που δηµιουργείται να παραµένει το ίδιο εξαιτίας του εκφυλισµού του γενετικού κώδικα. Είναι επίσης πιθανό το αµινοξύ που προκύπτει από το νέο (δεύτερο) αλληλόµορφο, να έχει το ίδιο φορτίο, οπότε και πάλι δεν θα είναι δυνατή η ανίχνευσή του. Γενικότερα, υπολογίζεται πως περίπου το ένα-τρίτο των µεταλλάξεων στις πολυπεπτιδικές αλυσίδες ανιχνεύονται µε την τεχνική της ηλεκτροφόρησης των ισοενζύµων, όµως πέρα από τις αλλαγές σε πρωτοταγές επίπεδο που δεν γίνονται εµφανείς στην ηλεκτροφόρηση, υπάρχει περίπτωση να διαφέρει η τριτοταγής δοµή. Οποιεσδήποτε αλλαγές σε αυτό το επίπεδο µπορεί να οδηγήσει στην αλλαγή του συνολικού φορτίου της πρωτεϊνης εξαιτίας της αλλαγής της αναλογίας των ιονισµένων πλευρικών οµάδων R. Επιπλέον, κάθε πρωτεΐνη έχει ένα συγκεκριµένο αριθµό πολυπεπτιδικών αλυσίδων στις οποίες γίνεται ενζυµατικά λειτουργική (οι πρωτεΐνες µπορεί να αποτελούνται από µία, δύο ή τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, οι οποίες µπορεί να είναι ίδιες ή διαφορετικές) και πολλές φορές, ενώ είναι ενζυµατικά λειτουργική όταν αποτελείται από τέσσερις πολυπεπτιδικές αλυσίδες, εµφανίζει περιορισµένη λειτουργικότητα ακόµη και όταν αποτελείται από δύο ή µία πολυπεπτιδική αλυσίδα. Σε αυτή την περίπτωση, οι κινητικότητες των µορίων είναι διαφορετικές καθώς αποτελούνται από διαφορετικό αριθµό πολυπεπτιδικών αλυσίδων. Αυτές οι µετατροπές της δευτερογενούς και τριτογενούς δοµής περιγράφονται ως αλλαγές διαµόρφωσης (conformational changes) (Markert & Whitt, 1968) και οφείλονται σε µετα-µεταφραστικούς παράγοντες. Η κινητικότητα των ενζύµων επηρεάζεται, πέρα από τη δοµή των ενζύµων, και από τις πειραµατικές συνθήκες. Τα πολυπεπτίδια µπορούν να έχουν διαφορετικό φορτίο που εξαρτάται από το ph του µέσου στο οποίο βρίσκεται το ένζυµο (πηκτή) ή του ρυθµιστικού διαλύµατος των ηλεκτροδίων και ανάλογα µε το ph, ένα συγκεκριµένο πολυπεπτίδιο µπορεί να κινηθεί προς την άνοδο, την κάθοδο ή να παραµείνει στο σηµείο που φορτώθηκε. Το ph στο οποίο όπου ένα ένζυµο δε µετακινείται και εποµένως έχει µηδενικό φορτίο, ονοµάζεται ισοηλεκτρικό (ή ισοϊονικό) σηµείο, το οποίο µπορεί να αλλάξει σε ένα ένζυµο µε την παρουσία ουδέτερων αλάτων (επηρεάζουν το επίπεδο ιονισµού των πλευρικών οµάδων R). Ο ρυθµός µετακίνησης ενός ενζύµου εξαρτάται επίσης και από τη δύναµη του ηλεκτρικού πεδίου, όσο µεγαλύτερη ένταση ρεύµατος εφαρµόζεται, τόσο γρηγορότερα µετακινείται ένα ένζυµο. Τέλος, σηµαντικό ρόλο παίζει το 27

28 ηλεκτροφορητικό µέσο στο οποίο λαµβάνει χώρα η διαδικασία, το οποίο συνήθως είναι η πηκτή (gel) η οποία µπορεί να παρασκευάζεται µε αγαρόζη, άµυλο ή πολυακρυλαµίδιο. Στην περίπτωση του πολυακρυλαµίδιου, τα ένζυµα µετακινούνται δια µέσου των πόρων της πηκτής όπου το µέγεθος και το σχήµα των µορίων καθιστά δυνατή ή όχι τη µετακίνησή τους και όσο µικρότεροι είναι οι πόροι της πηκτής τόσο περισσότερο δυσκολεύεται η µετακίνηση των µορίων. Η παρουσία των ισοενζύµων και αλλοενζύµων µπορεί να ανιχνευθεί στην πηχτή µετά από την προσθήκη των κατάλληλων χρωστικών και το αποτέλεσµα που προκύπτει ονοµάζεται ζυµόγραµµα (Hunter & Markert, 1957). Διαβάζοντας το ζυµόγραµµα καταγράφονται τα αλληλόµορφα που υπάρχουν στους ιστούς που χρησιµοποιήθηκαν στην ηλεκτροφόρηση. Τα αλληλόµορφα εµφανίζονται µε τη µορφή των κουκίδων (spots) ή ζωνών (bands). Εφαρµογές ισοενζύµων Το µεγαγαµετόφυτο αποτελεί ένα πολύ καλό εργαλείο στους γενετιστές στην έρευνα των κωνοφόρων µε τα ισοένζυµα, το οποίο είναι ένας απλοειδής ιστός, πλούσιος σε ένζυµα µε µεγάλη δραστηριότητα. Ένα µεγαγαµετόφυτο µπορεί να χρησιµοποιηθεί στην εξακρίβωση του τρόπου κληρονοµικότητας των διαφόρων ενζύµων (µε τη βοήθεια διπλοειδών ιστών του ίδιου ατόµου), ενώ πολλά µαζί (του ίδιου ατόµου) µπορούν να αποκαλύψουν το γενότυπο του ατόµου (στα συγκεκριµένα γονίδια-ένζυµα). Ακόµη, αν σε µια ηλεκτροφόρηση τρέξει το µεγαγαµετόφυτο πλάιπλάι µε το αντίστοιχο έµβρυο, µπορούµε να δούµε τόσο τα µητρικά όσο και τα πατρικά αλληλόµορφα. Στα κωνοφόρα, πειράµατα δοκιµής προελεύσεων έχουν αποκαλύψει µεγάλη ποικιλότητα σε αρκετούς χαρακτήρες όπως είναι η αύξηση, η αντοχή σε παγετούς, το µέγεθος κώνων, βελόνων κλπ. Η ανάλυση του πολυµορφισµού των πρωτεϊνών ποσοτικοποιεί το βαθµό γεωγραφικής ποικιλότητας των γενετικών χαρακτήρων και υπολογίζει τη γενετική ποικιλότητα µέσα σε ένα είδος. Βέβαια, η ύπαρξη του πολυµορφισµού υποδηλώνει την ύπαρξη υψηλής γενετικής ποικιλότητας. Μεταξύ των φυτικών ειδών, εκείνα που παρουσιάζουν µεγαλύτερη γενετική ποικιλότητα συνήθως είναι µακρόβια, έχουν µεγάλη γεωγραφική εξάπλωση, επικονιάζονται µε τον άνεµο, βρίσκονται σε προχωρηµένα στάδια της φυτοκοινωνιολογικής τους εξέλιξης και είναι ιδιαίτερα γόνιµα. Τα κωνοφόρα παρουσιάζουν αρκετά από αυτά τα 28

29 χαρακτηριστικά οπότε αναµένεται να παρουσιάζουν υψηλή γενετική ποικιλότητα οπότε και υψηλότερο βαθµό πολυµορφισµού. Οι πολυµορφισµοί των πρωτεϊνών και κατ επέκταση των ισοενζύµων, µπορούν να δώσουν αρκετά στοιχεία στη διερεύνηση του τρόπου γονιµοποίησης των ατόµων ενός είδους, αν έχουν αυτογονιµοποιηθεί, αν γονιµοποιήθηκαν µε συγγενικά άτοµα ή µε γύρη που προήλθε από ξένα άτοµα. Τα ισοένζυµα, µε την εξέταση του µητρικού και πατρικού γενετικού υλικού καθώς και των απογόνων, µπορούν να µας δώσουν στοιχεία για την εξακρίβωση του συστήµατος γονιµοποίησης. Τα αυτογονιµοποιούµενα άτοµα φαίνεται να παρουσιάζουν κάποια προβλήµατα έναντι των ατόµων που προέρχονται από ελεύθερη επικονίαση µη συγγενών ατόµων (inbreeding depression), προβλήµατα που εντοπίζονται στο βάρος του σπόρου, στη φυτρωτικότητά του, στο ρυθµό ανάπτυξης του ατόµου καθώς και στη βιωσιµότητά του (Franklin, 1970; Sorensen, 1969, 1970, 1982; Sorensen and Miles, 1974). Οι συγκεκριµένοι απόγονοι, πιθανόν, κάτω από ορισµένες περιβαλλοντικές συνθήκες, θα υστερούν σε σχέση µε απογόνους όπου δεν υπάρχει τέτοιο πρόβληµα. Η χρήση των ισοενζύµων µπορεί να χρησιµοποιηθεί και στη µελέτη της ροής γονιδίων από ένα άτοµο σε κάποιο άλλο ή από ένα πληθυσµό σε έναν άλλο. Η ροή γονιδίων στα κωνοφόρα επιτυγχάνεται µέσω της µεταφοράς της γύρης και την παραγωγή βιώσιµων σπόρων και εν συνεχεία σποροφύτων. Ο Muller (1977) σύστησε ένα τρόπο για τη µέτρηση της ροής γονιδίων: να αναγνωριστεί ένα άτοµο που φέρει ένα µοναδικό γονίδιο και στη συνέχεια να ελεγχθούν διπλανά και γειτονικά άτοµα ώστε να βρεθεί το εύρος της διασποράς του. Ένας άλλος τρόπος για να µετρηθεί η ροή γονιδίων είναι να βρεθούν οι συχνότητες γονιδίων των ατόµων µιας περιοχής και στη συνέχεια να υπολογιστεί το ποσοστό των σπόρων που έχει γονιµοποιηθεί µε γύρη άλλης περιοχής (Friedman & Adams, 1981). Με τις ισοενζυµικές αναλύσεις είναι δυνατό να βρεθούν οι όποιες συσχετίσεις µεταξύ των γειτονικών ατόµων και εν συνεχεία να εξηγηθούν φαινόµενα όπως µειωµένη ανάπτυξη φυτών που προέρχονται από διασταύρωση συγγενών ατόµων (Ledig, 1974), επιλεκτική προσβολή οµάδας ατόµων από έντοµα και ασθένειες (Berryman, 1982) κλπ., δηλαδή να γίνει ανάλυση της κατανοµής των γονιδίων στα άτοµα του πληθυσµού (δοµή πληθυσµού). Γενικότερα για τα δασικά είδη αλλά και ειδικά για τα κωνοφόρα, θεωρείται πως τα άτοµα ενός δάσους ή µιας συστάδας προέρχονται από διασταυρώσεις µεταξύ ασυσχέτιστων (µη-συγγενών) ατόµων, κάτι που όµως παραµένει σε θεωρητικό επίπεδο αφού παρατηρείται τα γειτονικά δέντρα 29

30 να είναι πολλές φορές συγγενικά άτοµα (Lenin & Kerster, 1974) µε συνέπεια να δηµιουργούνται οµάδες οικογενειών µέσα στο δάσος. Βέβαια, τέτοιες ανοµοιογενείς οµάδες µπορούν να δηµιουργηθούν και εξαιτίας του περιβάλλοντος. Η χρήση των ισοενζύµων µπορεί σχετικά εύκολα να διακρίνει την ύπαρξη υβριδίου σε φυσικούς πληθυσµούς (Mitton and Andalora, 1981; Panetsos et al., 1997) ή φυτείες (Korol et al., 1995), µία όµως από τις σηµαντικότερες χρήσεις των ισοενζύµων είναι στις φυλλογενετικές µελέτες. Σε σχέση µε τα µορφολογικά γνωρίσµατα, οι εξελικτικές αλλαγές των πρωτεϊνών ήταν σηµαντικές µε αποτέλεσµα τη διαφοροποίηση τους και τη χρήση τους στη συστηµατική και ταξινόµηση (Wheeler et al., 1983). Οι ισοενζυµικές µελέτες προσδίδουν µεγάλη γενετική ποικιλότητα στα κωνοφόρα (Hamrick and Godt, 1990) αλλά παρόλα ταύτα, λίγα είναι γνωστά για τη σχέση συγκεκριµένων αλλοενζυµικών αλληλοµόρφων και φαινοτυπικών χαρακτήρων και συνεπώς για το κατά πόσο οι ισοενζυµικοί δείκτες επηρεάζονται και σε ποιό βαθµό από το περιβάλλον και ειδικότερα από την προσαρµογή του είδους (ή την προσαρµογή ορισµένων ατόµων µέσα στο κάθε είδος). Παρόλο που παρουσιάζεται µια οµολογία µεταξύ της γεωγραφικής ποικιλότητας σε µορφολογικούς χαρακτήρες και σε αλλοεζυµικές γονιδιακές θέσεις (Grant & Mitton, 1977; Mitton et al., 1977; Bergmann, 1978 και Lundkvist, 1979), δεν υπάρχει µια ξεκάθαρη συσχέτιση µεταξύ των αλλοενζύµων και της περιβαλλοντική ποικιλότητας (El-Kassaby & Sziklai, 1982; Knowles & Grant, 1985; Neale & Adams, 1985 και Alden & Loopstra, 1987). Επίσης, φαίνεται να υπάρχει µία συσχέτηση µε τη συχνότητα σπάνιων αλληλοµόρφων και την ανάπτυξη των δέντρων, όπου οι Schmidtling κ.α. (1999) βρήκαν πως ένα σπάνιο αλληλόµορφο στη γονιδιακή θέση IDH της Pinus taeda, συνδέεται µε βραδύτερη αύξηση των ατόµων που φέρουν αυτό το σπάνιο αλληλόµορφο και δίνουν ως πιθανή εξήγηση την περίπτωση υβριδισµού µε το πιο βραδυαυξές είδος Pinus echinata Mill.. Τα ισοένζυµα στην ταυτοποίηση γενοτύπων Τα ισοένζυµα στηρίζονται στην αρχή του αποκλεισµού για την ταυτοποίηση ατόµων (εν αντιθέσει µε τις νέες µοριακές µεθόδους), όπου δύο άτοµα θεωρούνται διαφορετικά αν τα ζυµογράµµατά τους είναι διαφορετικά, αλλά δεν θεωρούνται ταυτόσηµα όταν τα ζυµογράµµατά τους είναι ίδια. Σύµφωνα µε τους Cheliak και Pitel (1984), στην εύρεση ενός µοναδικού γενοτύπου τρεις παράγοντες παίζουν σηµαντικό ρόλο: α) ο αριθµός των γονιδιακών θέσεων που αναλύονται, β) ο αριθµός των 30

31 αλληλοµόρφων που παρατηρούνται στην κάθε γονιδιακή θέση και γ) η συχνότητα των αλληλοµόρφων στον πληθυσµό που µελετάται. Στατιστικά, όσο µεγαλύτερος είναι ο αριθµός των γονιδιακών θέσεων που µελετώνται και όσο µεγαλύτερος ο αριθµός των αλληλοµόρφων στην κάθε γονιδιακή θέση, τόσο πιο πιθανό είναι να παρατηρηθεί κάποιος µοναδικός γενότυπος. Ο αριθµός των γενοτύπων που µπορούν να παρατηρηθούν όταν τα αλληλόµορφα εκφράζονται συγκυρίαρχα, προκύπτει από τον ακόλουθο τύπο (Cheliak & Pitel, 1984): Όπου, είναι ο αριθµός των µοναδικών γενοτύπων, είναι ο αριθµός των αλληλοµόρφων που ανιχνεύονται στην i-οστή γονιδιακή θέση, i=1,..,l και L είναι ο αριθµός των γονιδιακών θέσεων που αναλύονται. Η ταυτοποίηση ατόµων µπορεί να χρησιµοποιηθεί στην αναγνώριση σπόρων, στη σύγκριση δέντρων σε προγράµµατα βελτίωσης και στην παρακολούθηση της ποικιλότητας των επιλεγµένων πληθυσµών/ατόµων µέσα από διαδοχικούς κύκλους επιλογής (Conkle & Adams, 1977). Ταυτοποίηση γενοτύπων µε χρήση ισοενζύµων (και ειδικά της MDH) Οι πρωτοπόροι στη χρήση των ισοενζύµων ως µεθόδου ταυτοποίησης γενοτύπων υπήρξαν οι Conkle και Adams (1977) οι οποίοι µελέτησαν τη δυνατότητα αυτή σε κλώνους της πεύκης Pinus taeda χρησιµοποιώντας 10 γονιδιακές θέσεις από 6 ενζυµικά συστήµατα (GDH, GOT, LAP, 6-PGDH, PGI, και PGM) όπου και εντόπισαν 48 µοναδικούς γενότυπους σε σύνολο 50 και κατέληξαν πως η ταυτοποίηση ήταν σχεδόν πλήρης. Έκτοτε έγιναν εκτενής έρευνες ταυτοποίησης κλώνων µε τη χρήση ενζυµικών συστηµάτων, εκ τις οποίες θα αναφερθούν παρακάτω οι σηµαντικότερες και πιο ενδιαφέρουσες. Οι Cheliak και Pitel (1984) ταυτοποίησαν κλώνους τρέµουσας λεύκης χρησιµοποιώντας 16 γονιδιακές θέσεις προερχόµενα από 11 ενζυµικά συστήµατα που ήταν αδύνατη να πραγµατοποιηθεί µε τη χρήση µορφοµετρικών χαρακτηριστικών, αλλά η µηλική αφυδρογονάση δεν αποτέλεσε διαγνωστικό χαρακτηριστικό λόγω της παραλλακτικότητάς της, ενώ ο Rajora (1989) ταυτοποίησε κλώνους υβριδίων λεύκης (Populus deltoides Marsh. X P. nigra L.) µε τη χρήση 10 ισοενζυµικών συστηµάτων, 31

32 µεταξύ αυτών και της MDH, στην οποία διέκρινε 6 γονιδιακές θέσεις από τις οποίες οι 5 ήταν µονοµορφικές. Οι Breitenbach κ.α. (1992) θέλησαν να ταυτοποιήσουν κλώνους ελάτης που προορίζονται για σκοπούς διατήρησης, µε τη χρήση 4 ηλεκτροφορητικών συστηµάτων, µεταξύ των οποίων και των δύο που χρησιµοποήθηκαν στην παρούσα εργασία όπως και της µηλικής αφυδρογονάσης, η οποία παρουσίασε και στη συγκεκριµένη έρευνα υψηλά ποσοστά πολυµορφισµού και αδυναµία στην γενετική τους επεξήγηση. Οι Aguinagalde κ.α. (1997) µε τη χρήση πέντε ισοενζυµικών συστηµάτων (PGM, MDH, 6-PGD, SOD και EST) και σε σύνολο 23 γονιδιακών θέσεων, ταυτοποίησαν τρία υπο-είδη της µαύρης πεύκης (που ανήκουν σε 5 πληθυσµούς). Η µηλική αφυδρογονάση παρουσίασε 4 γονιδιακές θέσεις, 2 εκ των οποίων (MDH-2, MDH-3), σχηµατίζουν ετεροδιµερή. Ο Scaltsoyiannes (2004) ταυτοποίησε είδη του γένους Pinus που χρησιµοποιούνται ως καλλωπιστικά µε τη χρήση ισοενζυµικών δεικτών και ειδικότερα της µηλικής αφυδρογονάσης και της ρεδουκτάσης της µεναντιόνης. Σε κάθε υπο-γένος (Strobus-Haploxylon και Pinus-Diploxylon) ένα είδος είχε διακριτότητα από τα υπόλοιπα είτε µε την ύπαρξη µοναδικών αλληλοµόρφων είτε µε τη µεγάλη ποικιλότητα των συχνοτήτων των αλληλοµόρφων. Εικόνα 2: Η χηµική αντίδραση της µηλικής αφυδρογονάσης στον κύκλο του κιτρικού οξέος Μηλική αφυδρογονάση Η µηλική αφυδρογονάση (EC ) (MDH) είναι ένα ένζυµο του κύκλου του κιτρικού οξέος και καταλύει τη µετατροπή του µηλικού σε οξαλοξικό (χρησιµοποιώντας NAD+) και αντιστρόφως (mmdh). Η µηλική αφυδρογονάση εµπλέκεται και στην γλυκονεογένεση (cmdh), δηλαδή στη διαδικασία της σύνθεσης της γλυκόζης από µικρότερα µόρια. 32

33 Εικόνα 3: Ο Κύκλος του Κιτρικού Οξέος ή Κύκλος του Κρεµπς Η MDH καταλύει τη µετατροπή του οξαλοξικού και µηλικού χρησιµοποιώντας το NAD / NADH σύστηµα συνενζύµων. Η MDH είναι ένα µάλλον πανταχού παρόν ένζυµο, για το οποίο έχουν αναγνωριστεί πολλές ισοµορφές, διαφέροντας στο υποµοριακό εντοπισµό τους και στην εξειδίκευσή τους για το συνένζυµο NAD και NADP. Σε ευκαρυωτικά κύτταρα, τουλάχιστον δύο µορφές του ενζύµου µπορεί να βρεθούν, όπου η µία ισοµορφή είναι ένα κύριο ένζυµο της λειτουργίας του κύκλου του κιτρικού οξέως µέσα στα µιτοχόνδρια, ενώ το άλλο βρίσκεται στο κυτόπλασµα, όπου συµµετέχει στο σύστηµα shuttle του µηλικού / ασπαρτικού. Αυτό το σύστηµα shuttle ανταλλάσει µειώνοντας το ισοδύναµο σε όλες τις µιτοχονδριακές µεµβράνες µε τη µορφή του µηλικού / οξαλοξικού και όχι ως NAD / NADH. Ένα τρίτο ισοένζυµο βρέθηκε στα γλυοξισώµατα της ζύµης, όπου µετατρέπει το µηλικό που παράγεται από τη γλυκόζη στο γλυκολικό κύκλο (Minard & McAlister-Henn, 1991). Όλες οι MDHs είναι εξαρτώµενες του NAD εκτός του χλωροπλαστικού ενζύµου που απαιτεί NADP ως συνένζυµο (Goward & Nicholls, 33

34 1994; Minarik et al., 2002). Στην εικόνα παρακάτω εµφανίζονται σχηµατικά τα σηµεία δράσης της µηλικής αφυδρογονάσης στο κύτταρο. Η µιτοχονδριακή µηλική αφυδρογονάση (mmdh), παρότι βρίσκεται µέσα στο µιτοχόνδριο κωδικοποιείται από ένα πυρηνικό γονίδιο και στα ανώτερα φυτά (Longo and Scandalios, 1969) και στα σπονδυλωτά ζώα (Davidson and Cortner, 1967; Shows et al., 1970). Εικόνα 4: Τα σηµεία δράσης των ισοµορφών της µηλικής αφυδρογονάσης στα µιτοχόνδρια και στο κυτόπλασµα Πρωτογενής και δευτερογενής δοµή Οι µηλικές αφυδρογονάσες ανήκουν στις εξαρτώµενες του NAD αφυδρογονάσες, οι οποίες είναι από τις µεγαλύτερες και καλύτερα µελετηµένες οικογένειες πρωτεϊνών που συνενώνουν νουκλεοτίδια και έχουν ήδη αναγνωριστεί πάνω από 100 διαφορετικά µέλη. Σε γενικές γραµµές, οι αφυδρογονάσες είναι µεγάλα πρωτεϊνικά µόρια, όπως οι γαλακτικές αφυδρογονάσες (LDHs) ή οι γλυκεραλδεύδη- 3-φωσφορικές αφυδρογονάσες (GAPDHs) που είναι τετραµερή, ενώ οι MDHs είναι διµερής. Τα µήκη των πολυπεπτιδικών τους αλυσίδων διαφέρουν ελαφρώς (Goward & Nicholls, 1994; Minarik et al., 2002). 34

35 Οι ακολουθίες αµινοξέων των MDH παρουσιάζουν διαφοροποίηση σε δύο κύριες φυλογενετικές οµάδες στενά σχετιζόµενων ενζύµων. Η εξέλιξη των MDH, όπως προκύπτει από συγκρίσεις ακολουθιών αµινοξέων, συνάδει το µοτίβο / σχέδιο που προβλέπεται από την ενδοσυµβιοτική θεωρία για την προέλευση των µιτοχονδρίων και των χλωροπλαστών (Minarik et al., 2002). Στην οικογένεια των MDH, το ένζυµο των µιτοχονδρίων είναι πιο στενά συνδεδεµένο µε τον προκαρυωτικό οµόλογό του από ότι µε το κυτταροπλασµατικό ένζυµο MDH, πράγµα που σηµαίνει µια πιο πρόσφατη απόκλιση από ένα κοινό προγονικό γονίδιο (McAlister-Henn, 1988). Τριτογενή και τεταρτογενή δοµή Οι τρισδιάστατες δοµές του µηλικών αφυδρογονάσων έχουν καθοριστεί σε υψηλή ανάλυση και διαπιστώθηκε ότι οι MDH έχουν οµόλογες ενεργές θέσεις, συνενζυµική θέση δέσµευσης και τεταρτοταγή δοµή. Σε γενικές γραµµές, οι MDH είναι σταθερές ως διµερής, που δείχνουν την σηµαντικότητα της σύνδεσης της σταθερότητας των πρωτεϊνών και της ενζυµικής δραστηριότητάς τους. Κρυσταλλογραφικές µελέτες έχουν δείξει ότι η διασύνδεση του διµερούς αποτελείται κυρίως από Εικόνα 5: Η υποµονάδα του ενζύµου της µηλικής αφυδρογονάσης (Hall et al., 1992) αλληλεπιδρούσες α-έλικες που ενώνονται συµπαγώς µεταξύ τους. (Goward & Nicholls, 1994; Minarik et al., 2002) Οι ενεργές θέσεις σε αυτές τις διµερής πρωτεΐνες διαχωρίζονται αρκετά µεταξύ τους (Breiter et al., 1994). 35

36 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ταυτοποίηση κλώνων µαύρης πεύκης από φυτεία του είδους αγνώστου ταυτότητας, µε απότερο σκοπό τη ταυτοποίηση του γενετικού υλικού και κατ επέκταση του σχεδιασµού εγκατάστασής της. Παράλληλα, η εργασία αυτή, επιθυµεί να διερευνήσει τη διακριτότητα του ενζυµικού συστήµατος της µηλικής αφυδρογονάσης στην ταυτοποίηση γενοτύπων του είδους. 36

37 ΜΕΘΟΔΟΙ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΔΕΙΓΜΑΤΟΛΗΨΙΑ Το υλικό που χρησιµοποιήθηκε προήλθε από την τράπεζα γονιδίων Μαύρης Πεύκης ο οποίος βρίσκεται εντός του προαυλίου χώρου της Διεύθυνσης Δασών Χαλκιδικής / Δασαρχείου Πολυγύρου στον Πολύγυρο, όπως φαίνεται και από τις παρακάτω εικόνες του δορυφόρου ( Χαλκιδική Πολύγυρος Δασαρχείο Πολυγύρου Εικόνα 6: Στιγµιότυπα από αεροφωτογραφίες της περιοχής όπου είναι εγκατεστηµένη η φυτεία µε τα άτοµα της µαύρης πεύκης. 37

38 Είσοδος στον περίβολο του Δασαρχείου / Διεύθυνσης Πολυγύρου Εικόνα 7: Το τµήµα της φυτείας το οποίο µελετήθηκε και δίπλα, ο τρόπος αρίθµησης των ατόµων της φυτείας Tο γενετικό υλικό από όπου προήλθε η τράπεζα γονιδίων περιλαµβάνει άριστους γενοτύπους της µαύρης πεύκης από διάφορες προελεύσεις της Βορείου Ελλάδας. Η ταυτοποίηση των ατόµων πραγµατοποιήθηκε αρχικά µε ένα σύστηµα συντεταγµένων του κάθε ατόµου στο διάγραµµα (από τη µία πλευρά 1 έως 24 και από την άλλη Α έως Ζ) και έπειτα αριθµήθηκαν σε αύξοντα αριθµό όπως φαίνονται στο σχήµα. Τα άτοµα που λείπουν

39 από το σχεδιάγραµµα δεν αριθµήθηκαν καθόλου και η αρίθµηση συνέχιζε από το επόµενο (εν ζωή) άτοµο. Βάση των αρχικών πληροφοριών για τη δηµιουργίας της τράπεζας γονιδίων, η κάθε σειρά αποτελείται από άτοµα του ίδιου κλώνου, οπότε και συλλέχθηκαν κώνοι από δύο άτοµα σε κάθε σειρά, δηλαδή σύνολο 22 ατόµων ώστε να επιβεβαιωθεί ή όχι το σχέδιο αυτό. Οι κώνοι συλλέχθηκαν κατά τους µήνες Νοέµβριο και Δεκέµβριο του 2009 και έπειτα τοποθετήθηκαν σε φούρνο για να χάσουν την υγρασία τους και να ανοίξουν τα βράκτια, στους 45 ο C. Στη συνέχεια αφαιρέθηκαν τα πτερύγια και ταξινοµήθηκαν οι σπόροι του κάθε ατόµου χωριστά σε σχέση µε τις συντεταγµένες του στην επιφάνεια όπως φαίνεται και στο σχέδιο (οι πράσινοι κύκλοι είναι άτοµα απ όπου συλλέχθηκε γενετικό υλικό, οι κόκκινοι κύκλοι είναι τα άτοµα από τα οποία δεν συλλέχθηκε γενετικό υλικό για κάποιο λόγο, ενώ τα κίτρινα σηµεία είναι άτοµα που δεν υφίστανται πλέον στην επιφάνεια). Διατηρήθηκαν σε θερµοκρασία δωµατίου και σε χαµηλή υγρασία µέχρι και τη χρήση τους. Η ανάλυση των ενζύµων στα απλοειδή ενδοσπέρµια σπόρων µε την τεχνική της οριζόντιας ηλεκτροφόρησης σε άµυλο, τα διαλύµατα των ηλεκτροφορητικών συστηµάτων, η παρασκευή και οι χρώσεις των ενζύµων έγιναν σύµφωνα µε τα πρωτόκολλα των Concle et al. (1982) και Cheliak & Pitel (1985) (Παράρτηµα). 39

40 ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ Προετοιµασία φυτικού υλικού Φύτρωση σπόρων Το φυτικό υλικό που χρησιµοποιήθηκε στις ηλεκτροφορήσεις προερχόταν από το ενδοσπέρµιο φυτρωµένων σπόρων. Η φύτρωσή τους επιτεύχθηκε σε διάστηµα 3 έως 7 ηµερών, ανάλογα µε την προέλευση του κλώνου και σε θερµοκρασία 23±2 C σε petri που περιείχαν διηθητικό χαρτί εµποτισµένο µε νερό. Εκχύλιση ενδοσπερµίων Τα ενδοσπέρµια οµογενοποιήθηκαν σε µικρά γουδάκια, τα οποία είχαν προηγουµένως τοποθετηθεί σε κατάψυξη, µε τρεις σταγόνες ρυθµιστικού διαλύµατος εκχύλισης. Τα εκχυλίσµατα των ενδοσπερµίων τοποθετήθηκαν σε σωληνάρια eppendorf και καταψύχθηκαν στους -25 C έως ότου χρησιµοποιηθούν στις ηλεκτροφορήσεις. Χρησιµοποιήθηκε το 0.2Μ Phosphate buffer ph 7.5 ρυθµιστικό διάλυµα εκχύλισης για τα ενδοσπέρµια (Conkle et al., 1982) (Παράρτηµα). Τεχνική της ηλεκτροφόρησης Για την ηλεκτροφόρηση των ενζύµων χρησιµοποιήθηκαν τα ηλεκτροφορητικά συστήµατα των Cheliak & Pitel (1985) (α) και Conkle κ.α. (1982) (β): α) ηλεκτροφορητικό σύστηµα Histidine-HCl (Η) β) ηλεκτροφορητικό σύστηµα Morpholine-Citrate (D) Παρασκευή πηκτής Για την παρασκευή της πηκτής χρησιµοποιήθηκαν δύο συστατικά: άµυλο διαλυµένο στο ειδικό ρυθµιστικό διάλυµα της πηκτής, και ζάχαρη. Η συγκέντρωση του αµύλου ήταν 11,5% w/v και της ζάχαρης 3%. Για κάθε ηλεκτροφορητικό σύστηµα η σύνθεση του ρυθµιστικού διαλύµατος της πηκτής ήταν διαφορετική (Παράρτηµα). Μετά τη ζύγισή του για ποσότητα ανάλογη των 500 ml, το άµυλο αναµείχθηκε µε το 1/3 του ρυθµιστικού διαλύµατος, σε κωνική φιάλη κενού και το υπόλοιπο µπήκε σε φούρνο µικροκυµάτων για 3 λεπτά. Μετά από το χρονικό αυτό διάστηµα βγήκε από το φούρνο αναµείχθηκε µε το υπόλοιπο και ξαναµπήκε στο 40

41 φούρνο για άλλα δύο λεπτά και δέκα δευτερόλεπτα. Στο στάδιο αυτό σταµατούσε η θέρµανση και γινόταν απαέρωση της πηκτής µε τη βοήθεια µιας αντλίας κενού. Κριτήριο µιας καλής απαέρωσης ήταν η εξαφάνιση των µικρών φυσαλίδων και η αντικατάστασή τους από άλλες µεγάλες. Μετά την απαέρωση, το διάλυµα αδειάστηκε σε ένα οριζοντιωµένο πιάτο από plexiglass (εσωτερικές διαστάσεις 17 x 17 x 12 cm). Η πηκτή κρύωνε για δύο ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου και µετά καλυπτόταν µε διαφανή µεµβράνη για την αποφυγή της αφυδάτωσής της. Κατόπιν µεταφερόταν στο ψυγείο (4 C) και την επόµενη µέρα ήταν έτοιµη να χρησιµοποιηθεί. Τοποθέτηση ρυθµιστικού διαλύµατος ηλεκτροδίων Στην περίπτωσή µας οι ηλεκτροφορήσεις πραγµατοποιήθηκαν σε εργοστασιακές συσκευές ηλεκτροφόρησης SIGMA. Κάθε συσκευή αποτελείται από δύο δεξαµενές - όπου µπαίνει το διάλυµα των ηλεκτροδίων - και µεταξύ των δύο δεξαµενών υπάρχει ο χώρος όπου τοποθετείται η πηκτή. Για κάθε ηλεκτροφορητικό σύστηµα χρησιµοποιήσαµε διαφορετικό διάλυµα ηλεκτροδίων (Παράρτηµα). Το ρυθµιστικό διάλυµα των ηλεκτροδίων, µετά την παρασκευή του και τη ρύθµιση του ph του, τοποθετήθηκε στη συσκευή, αφού τοποθετήθηκαν µέσα στις δεξαµενές τα σφουγγάρια, τα οποία χρησιµοποιούνται ως γέφυρες του ηλεκτρικού ρεύµατος µεταξύ του διαλύµατος των ηλεκτροδίων και της πηκτής. Η συσκευή τοποθετούνταν στο ψυγείο. Τοποθέτηση δειγµάτων Η κρύα πηκτή κόπηκε µε ένα νυστέρι παράλληλα προς την κάθοδο και σε µια απόσταση από την αρχή του πιάτου 2,5 cm. Στην τοµή αυτή τοποθετούνται τα εκχυλίσµατα των ενδοσπερµίων σε φυτιλάκια διηθητικού χαρτιού (Whatman 3ΜΜ). Ηλεκτροφόρηση Το πιάτο που περιέχει την πηκτή και τα φυτιλάκια τοποθετήθηκε µέσα στη συσκευή που βρισκόταν στο ψυγείο (4 C). Τα σφουγγάρια τοποθετούνται έτσι, ώστε η µια άκρη να βρίσκεται µέσα στο διάλυµα των ηλεκτροδίων και η άλλη άκρη να σκεπάζει 2,5 cm της πηκτής. Ειδικότερα το σφουγγάρι που βρίσκεται από την πλευρά της καθόδου φτάνει ακριβώς πίσω από τα φυτιλάκια. Πάνω στα σφουγγάρια τοποθετήθηκε µια γυάλινη πλάκα που χάρη στο βάρος της εξασφαλίζει τη συνεχή 41

42 επαφή των σφουγγαριών και της πηκτής, µε συνέπεια την αδιάκοπη ροή του ρεύµατος. Η συσκευή έκλεινε µε το καπάκι της και συνδεόταν µε το τροφοδοτικό ρεύµατος. Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης, η συσκευή παρέµενε στη θερµοκρασία των τεσσάρων βαθµών Κέλσιου προς αποφυγή της υπερθέρµανσης της πηκτής εξαιτίας της υψηλής τάσης. Η ηλεκτροφόρηση αρχίζει µε σταθερή ένταση 30 ma, και 15 λεπτά αργότερα ρυθµίζεται στα 60 ma. Το µέγιστο της τάσης ρυθµίζεται στα 320 V. Η διάρκεια της ηλεκτροφόρησης εξαρτάται από το σύστηµα µε το οποίο δουλεύουµε. Με το ηλεκτροφορητικό σύστηµα D η ηλεκτροφόρηση διαρκεί 7 ώρες, µε το σύστηµα Η, η διάρκεια είναι 8 ώρες, µετά το διπλασιασµό της έντασης του ρεύµατος. Χρώση των ενζύµων Κοπή της πηκτής Με το τέλος της ηλεκτροφόρησης, η πηκτή βγαίνει από τη συσκευή και µε ένα νυστέρι κόβεται το µέρος της πηκτής που είναι καλυµµένο από το σφουγγάρι της ανόδου. Η πηκτή αµέσως µετά τοποθετείται σε µια επιφάνεια λεία µεταξύ δύο γυάλινων πλακών πάχους 1.8 εκατοστών η καθεµιά. Με µια πετονιά καλά τεντωµένη, η οποία εφάπτεται στις γυάλινες πλάκες, κόβουµε την πηκτή σε φέτες. Οι φέτες που κόβονται τοποθετούνται σε γυάλινα πιάτα όπου θα γίνει και η χρώση τους. Χρώση των ενζύµων Οι χρώσεις µε τις οποίες τα ένζυµα θα εµφανιστούν σαν διάφορες µπάντες (ζώνες) είναι µίγµατα που αποτελούνται από ένα ρυθµιστικό διάλυµα χρώσης και διάφορα αντιδραστήρια. Συνήθως τα ρυθµιστικά διαλύµατα της χρώσης και αρκετά αντιδραστήρια παρασκευάζονται από πιο νωρίς και φυλάσσονται στο ψυγείο και στο σκοτάδι µέχρι να χρησιµοποιηθούν, διότι πολλά από αυτά τα συστατικά είναι φωτοευαίσθητα. Αυτά τα διαλύµατα πρέπει να ανανεώνονται κάθε 4 εβδοµάδες γιατί αλλοιώνονται (οξειδώνονται ή σχηµατίζουν άλατα) µε το χρόνο. Μετά την εµφάνιση των ζωνών δράσης των ενζύµων, οι φέτες ξεπλένονται καλά µε τρεχούµενο νερό για να ανασταλεί η περαιτέρω χρώση και διατηρούνται στο 42

43 εξής µέσα σε καθαρό νερό. Είναι καλό να φωτογραφίζονται και να αναλύονται οι ζώνες σ' αυτό το στάδιο, για να αποφευχθεί η διάχυση των ενζύµων µέσα στην πηκτή Ενζυµικά συστήµατα Κατά τις προκαταρκτικές µελέτες χρησιµοποιήθηκαν τα ενζυµικά συστήµατα: 6PGD, MDH, PGI, MR, ACP, ADH. Η συνταγή χρώσης για κάθε ενζυµικό σύστηµα, οι συνθήκες του περιβάλλοντος, η διάρκεια και οι χειρισµοί που χρειάζονται για τη χρώση δίνονται στο Παράρτηµα (Cheliak & Pitel, 1985). Οι γονιδιακές θέσεις και τα αλληλόµορφα αριθµήθηκαν µε αύξουσα σειρά από την άνοδο προς την κάθοδο. Τα ισοένζυµα που δεν έδωσαν χρωµατισµένες ζώνες θεωρήθηκαν ανενεργά (null). Εικόνα 8: Τα βήµατα της λειτουργίας της τεχνικής της ηλεκτροφόρησης (White et al., 2007) 43

44 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ - ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΕΠΙΛΟΓΗ ΤΗΣ ΜΗΛΙΚΗΣ ΑΦΥΔΡΟΓΟΝΑΣΗΣ Όπως αναφέρθηκε στο προηγούµενο κεφάλαιο, δοκιµάστηκαν κατά τις προκαταρκτικές µελέτες τα ενζυµικά συστήµατα: 6PGD, MDH, PGI, MR, ACP, ADH. Παρόλα ταύτα, µεταξύ όλων, επιλέχθηκε η µηλική αφυδρογονάση (MDH), η οποία αποτελεί ένα ένζυµο το οποίο χαρακτηρίζεται ως ένα πανταχού παρών ένζυµο και δρα στα µιτοχόνδρια συµµετέχοντας στη διαδικασία παραγωγής ενέργειας σε όλους τους οργανισµούς, από τα φύτα έως και τον άνθρωπο (Minard & McAlister- Henn, 1991; Goward & Nicholls, 1994; Minarik et al., 2002), στο κύκλο του κιτρικού οξέος (κύκλος του Krebs). Το ενζυµικό σύστηµα της µηλικής αφυδρογονάσης αντιπροσωπεύει ένα πολύπλοκο, µε µεγάλη ποικιλότητα ενζυµικό σύστηµα για τα κωνοφόρα δέντρα και µεγάλη σπουδαιότητα (Yang & Scandalios, 1974). Στη µαύρη πεύκη δε, η συµµετοχή του ενζυµικού συστήµατος της µηλικής αφυδρογονάσης παίζει µεγάλο ρόλο στη θεώρηση του είδους ως ένα εκ των πιο ποικιλόµορφων ευρωπαϊκών ειδών πεύκης (Τσακτσίρα & Σκαλτσογιάννης, 1998; Τσακτσίρα, 1998). Την τελευταία δεκαετία, η χρήση του ενζύµου απέκτησε νέα διάσταση για τους δασικούς πληθυσµούς των κωνοφόρων (Silin & Goncharenko, 1996; Kara et al., 1997; Σκαλτσογιάννης, 2001), καθώς φαίνεται πως η διακριτότητα του ενζυµικού συστήµατος δεν αποτελεί αντιπροσωπευτικό δείγµα για τη γενετική ποικιλότητα 10 Ευρωπαϊκών ειδών πεύκης (Σκαλτσογιάννης, 2001) µόνο, αλλά µπορεί να χρησιµοποιηθεί αποκλειστικά για την αναγνώριση κάθε είδους πεύκης και των υβριδίων τους (Σκαλτσογιάννης, 2001). Το ένζυµικό σύστηµα της µηλικής αφυδρογονάσης παρουσιάζει µεγάλη ποικιλότητα, από 1 έως και 5 γονιδιακές θέσεις έχουν αναγνωριστεί στη βιβλιογραφία (Breitenbach et al., 1992; Aguinagalde et al., 1997; Scaltsoyiannes, 2004), καθώς και έως 21 αλληλόµορφα (επιπλέον το ετεροδιµερές), ένα επιπλέον στοιχείo που ενισχύει την εξαιρετική ποικιλότητα του είδους στο ενζυµικό σύστηµα. Ο Scaltsoyiannes (2004) εµφάνισε 5 η γονιδιακή θέση η οποία αποτέλεσε και διαγνωστικό χαρακτηριστικό (η εµφάνιση της 5ης γονιδιακής θέσης) για το υπογένος strobus των pinus. Επίσης, ο 44

45 ίδιος ερευνητής, έκανε διάκριση των ειδών µε τη αποκλειστική χρήση της µηλική αφυδρογονάσης (Scaltsoyiannes, 2004), ενώ η Τσακτσίρα (1998) πραγµατοποίησε ταυτοποίηση προελεύσεων µε τη χρήση της ποικιλότητας του ενζυµικού συστήµατος της µηλικής αφυδρογονάσης. Συνεπώς, υποθέσαµε ότι η επιλογή του ενζυµικού συστήµατος της µηλικής αφυδρογονάσης θα µπορούσε να οδηγήσει στη γενετική ταυτοποίηση των κλώνων µαύρης πεύκης της φυτείας αγνώστου ταυτότητας και να διευκολύνει το διαχωρισµό και την αναγνώρισή τους. ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΤΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ Μετά τις προκαταρκτικές µελέτες η µέθοδος της ηλεκτροφόρησης βελτιστοποιήθηκε και αυτή που τελικά εφαρµόστηκε στην παρούσα εργασία είναι η εξής: Κατά την παρασκευή της πηκτής τα δύο συστατικά που χρησιµοποιήθηκαν διατήρησαν τη συγκέντρωσή τους (συγκέντρωση αµύλου: 11,5% w/v και ζάχαρης: 3%), αλλά η ποσότητα που παραγόταν ήταν για ποσότητα 250 ml. Αυτό επιλέχθηκε για την οικονοµία υλικών, αφού, θα χρωµατίζονταν το γενετικό υλικό µόνο για το ένζυµο της µηλικής αφυδρογονάσης. Χρησιµοποιήθηκε ένα οριζοντιωµένο πιάτο από plexiglass µε εσωτερικές διαστάσεις 17 x 17 x 6 cm, όπου αρκούσε µία ώρα για να κρυώσει η πηκτή σε θερµοκρασία δωµατίου. Κατά τη διάρκεια της ηλεκτροφόρησης, η ηλεκτροφόρηση αρχίζει µε σταθερή ένταση 30 ma, και 15 λεπτά αργότερα ρυθµίζεται στα 60 ma, όµως η διάρκειά της (που εξαρτάται από το σύστηµα µε το οποίο δουλεύουµε) για το ηλεκτροφορητικό σύστηµα D ήταν 3 ώρες και µε το σύστηµα Η ήταν 2 ώρες και 15 λεπτά, µετά το διπλασιασµό της έντασης του ρεύµατος. Οι τροποποιήσεις που πραγµατοποιήθηκαν στο πρωτόκολλο της ηλεκτροφορητικής ανάλυσης ήταν απαραίτητες, διότι αφενώς έπρεπε να µειωθεί η κατανάλωση υλικών και αντιδραστηρίων για τις αναλύσεις και αφετέρου να υπάρχει προσαρµογή στις νέες συνθήκες. Η χρήση πιάτου βάθους 6 χιλιοστών και όχι 12 χιλ, απέφερε µείωση της κατανάλωσης αµύλου κατά 50%, όπως και µείωση της κατανάλωσης της ζάχαρης κατά 50%, ενώ επίσης συνετέλεσε και στη µείωση του συνολικού χρόνου εφαρµογής ηλεκτρικού φορτίου σε περισσότερο από το µισό. Το αρχικό πρωτόκολλο απαιτούσε 7 ώρες για το ηλεκτροφορητικό σύστηµα D, ενώ τώρα 45

46 χρειάστηκαν 3 ώρες και 8 ώρες για το ηλεκτροφορητικό σύστηµα Η, ενώ τώρα χρειάστηκαν 2 ώρες και 15 λεπτά. ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ ΤΗΣ ΜΗΛΙΚΗΣ ΑΦΥΔΡΟΓΟΝΑΣΗΣ Το ενζυµικό σύστηµα της µηλικής αφυδρογονάσης παρουσιάζει µεγάλη πολυπλοκότητα στην επεξήγησή της που οφείλεται (Τσακτσίρα, 1998): α) στο µεγάλο αριθµό γονιδιακών θέσεων, β) στο µεγάλο αριθµό αλληλοµόρφων σε κάθε γονιδιακή θέση, γ) στη συχνή αλληλοεπικάλυψη των ισοµορφών του, δ) στη διµερή του δοµή και ε) στην εµφάνιση ετεροδιµερών προϊόντων. Το ενζυµικό σύστηµα της MDH έδωσε την κωδικοποίηση 4 γονιδιακών θέσεων (MDH-A, MDH-B, MDH-C, MDH-D) που ονοµατίστηκαν σε σειρά σε σχέση µε τη µειούµενη κινητικότητά τους από την άνοδο, και καταγράφηκαν συνολικά 15 αλληλόµορφα. Μεταξύ της δεύτερης (MDH-B) γονιδιακής θέσης και της τρίτης (MDH-C) υπήρχε η παρουσία ετεροδιµερών. Τα δύο ηλεκτροφορητικά συστήµατα παρουσίασαν διαφορετικό φαινότυπο, και στο ένα σύστηµα (Η) τα αλληλόµορφα µε τη µεγαλύτερη συχνότητα συνέπιπταν στις γονιδιακές θέσεις, MDH-A µε MDH-B και MDH-C µε MDH-D, ώστε η µπάντα να παρουσιάζει έντονη χρώση. Συνεπώς, η επεξήγηση του ενζυµικού συστήµατος εξαρτάται από τις θέσεις που έχουν τα ετεροδιµερή. Αντίθετα, στο άλλο ηλεκτροφορητικό σύστηµα (D) οι γονιδιακές θέσεις, MDH-A µε MDH-B και MDH-C µε MDH-D, διαχωρίζονται πλήρως και παράλληλα, το πρώτο αλληλόµορφο προηγούνταν του δευτέρου. Βέβαια, σε αυτό το σύστηµα, συχνά υπήρχε επικάλυψη του ετεροδιµερούς µε τη θέση MDH-A, µε συνέπεια να δυσχεραίνει την µετάφραση του µοντέλου. Η παραπάνω διαδικασία (η χρήση δύο ηλεκτροφορητικών συστηµάτων) έχει αποδειχτεί ιδιαίτερα επιτυχής στην µετάφραση των ζυµογραµµάτων της µηλικής αφυδρογονάσης (Τσακτσίρα, 1998; Σκαλτσογιάννης & Τσακτσίρα, 1998; Σκαλτσογιάννης, 2001; Scaltsoyiannes et al., 2009). Oι Sharma & von Wuehlisch (1998) εφήρµοσαν µία διαφορετική µέθοδο για την ερµηνεία του ενζυµικού συστήµατος της µηλικής αφυδρογονάσης, κατά την οποία χρησιµοποίησαν δύο διαφορετικές νέες χρώσεις. Οι παρακάτω φωτογραφίες, αποτελούν ενδεικτικές φωτογραφίες των ηλεκτροφορητικών συστηµάτων Η και D, αντίστοιχα. Στην δεξιά φέτα της πηκτής, 46

47 είναι εµφανές το άτοµο 37 (τα 7 ενδοσπέρµια µετά από το πρώτο, το οποίο είναι ο µάρτυράς µας) καθώς και η διαφοροποίηση της µηλικής αφυδρογονάσης στα δύο ηλεκτροφορητικά συστήµατα. Εικόνα 9: Η εµφάνιση της πηκτής στο ηλεκτροφορητικό σύστηµα Η Εικόνα 10: Η εµφάνιση της πηκτής στο ηλεκτροφορητικό σύστηµα D Οι MDH-A και MDH-D ήταν µονοµορφικές στο δείγµα µας, ενώ οι MDH-B και MDH-C παρουσίασαν 4 και 3 αλληλόµορφα αντίστοιχα. Σύµφωνα µε τον τύπο των Cheliak και Pitel (1984): η MDH-B που εµφάνισε 4 αλληλόµορφα, µπορεί να δώσει 10 πιθανούς γενοτύπους, ενώ η MDH-C που εµφάνισε 3 αλληλόµορφα, µπορεί να δώσει 6 πιθανούς γενοτύπους. Ο συνδυασµός των δύο αυτών γονιδιακών θέσεων µπορεί να παρέχει µία διακριτότητα του γινοµένου των δύο πιθανοτήτων, δηλαδή µπορούν δυνητικά να αποδώσουν διακριτότητα 60 διαφορετικών γενοτύπων. 47

48 Έλεγχος Μεντελικού διαχωρισµού Για τους πέντε γενοτύπους που προέκυψαν στο δείγµα µας, οι δύο παρουσίασαν χαµηλή εµφάνιση και δεν εξετάστηκαν για το κριτήριο x 2. Οι υπόλοιποι τρεις γενότυποι ακολούθησαν την αναµενόµενη συχνότητα (1:1) σύµφωνα µε το µεντελικό διαχωρισµό. Στον Πίνακα 1 παρουσιάζεται η ανάλυση των θέσεων κατά το κριτήριο x 2. Το αλληλόµορφο b3 βρέθηκε σε 44 ενδοσπέρµια για τη γονιδιακή θέση MDH-B και το γενότυπο b3b5 και το b5 βρέθηκε σε 61. Το αλληλόµορφο c3 βρέθηκε σε 75 ενδοσπέρµια της γονιδιακής θέσης MDH-C και του γενοτύπου c3c6 και το c6 σε 72 ενδοσπέρµια. Πίνακας 1: Το κριτήριο x 2 για τα πολυµορφικά γονίδια που εµφανίστηκαν. ΓΕΝΟΤΥΠΟΣ Παρατήρ. Αναµεν. x 2 Πιθανότ. b3b5 44: : b5b6 17: : c3c6 75: : Στον Πίνακα 2 παρουσιάζονται οι συχνότητες των αλληλοµόρφων για κάθε γονιδιακή θέση. Όπως αναφέραµε νωρίτερα, οι γονιδιακές θέσεις MDH-Α και MDH- D ήταν µονοµορφικές στο δείγµα µας. Τα αποτελέσµατα που µας δίνει η ανάλυση κατά το κριτήριο x 2 των γονιδιακών θέσεων µας επιτρέπει να επιβεβαιώσουµε την ύπαρξη µεντελικού διαχωρισµού και συνεπώς την ύπαρξη µεντελικής κληρονόµησης. Σε πολλές µελέτες σε άλλους έµβιους οργανισµούς έχει βρεθεί ότι η µηλική αφυδρογονάση (mmdh), παρόλο που δρα µέσα στα µιτοχόνδρια ελέγχεται από γονίδιο του πυρήνα (Longo and Scandalios, 1969; Davidson and Cortner, 1967; Shows et al., 1970) και συνεπώς ακολουθεί µεντελική κληρονόµηση, αντίστοιχα µε τα αποτελέσµατά µας. 48 Πίνακας 2: H συχνότητα της εµφάνισης των αλληλοµόρφων. ΓΟΝΙΔΙΑΚΗ ΘΕΣΗ ΣΥΧΝΟΤΗΤA ΑΛΛΗΛΟΜΟΡΦΩΝ MDH-A 1 MDH-B MDH-B MDH-B MDH-B MDH-C MDH-C MDH-C MDH-D 1

49 ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΑΤΟΜΩΝ (ΚΛΩΝΩΝ) Τα αποτελέσµατα ανάλυσης των συχνοτήτων των αλληλοµόρφων, δεν απέδωσαν τα αναµενόµενα αποτελέσµατα, σε σχέση µε την αρχική υπόθεσή µας. Πίνακας 3: Παρουσιάζονται όλοι οι φαινότυποι που εµφανίστηκαν σε κάθε άτοµο της φυτείας σύµφωνα µε την αρχική αρίθµηση. Α/Α A/A ατόµου Γενότυπος MDH-A MDH-B MDH-C MDH-D a2a2 b4b5 c3c6 d2d a2a2 b5b5 c3c6 d2d a2a2 b3b5 c3c6 d2d a2a2 b5b6 c3c3 d2d a2a2 b5b5 c3c6 d2d a2a2 b3b3 c6c6 d2d a2a2 b5b5 c3c6 d2d a2a2 b3b5 c6c6 d2d a2a2 b3b3 c6c6 d2d a2a2 b5b5 c3c6 d2d a2a2 b4b5 c3c6 d2d a2a2 b5b6 c3c3 d2d a2a2 b5b6 c3c6 d2d a2a2 b3b5 c3c6 d2d a2a2 b5b6 c3c6 d2d a2a2 b3b5 c6c6 d2d a2a2 b5b5 c3c6 d2d a2a2 b3b5 c3c6 d2d a2a2 b3b5 c3c6 d2d a2a2 b3b5 c6c6 d2d a2a2 b3b5 c4c6 d2d a2a2 b3b5 c6c6 d2d a2a2 b3b5 c3c6 d2d a2a2 b3b5 c3c6 d2d a2a2 b5b5 c3c6 d2d a2a2 b5b5 c3c6 d2d a2a2 b3b5 c3c6 d2d a2a2 b5b5 c3c6 d2d a2a2 b5b5 c3c6 d2d a2a2 b5b6 c6c6 d2d a2a2 b3b5 c6c6 d2d a2a2 b3b5 c3c6 d2d a2a2 b3b5 c6c6 d2d a2a2 b3b5 c6c6 d2d2 49

50 Η πρώτη παρατήρηση, αφορά τη διάταξη µε την οποία φυτεύτηκαν οι υποτιθέµενοι κλώνοι στη φυτεία, που αποδεικνύεται ότι δεν αποτελούσε η κάθε σειρά ατόµων τον ίδιο κλώνο, δηλαδή δεν ήταν γραµµική. Στη συνέχεια όµως, υπάρχουν κάποια δεδοµένα που πρέπει να εξετάσουµε ειδικότερα: Α) αναγνωρίστηκαν 2 µοναδικοί γενότυποι / άτοµα στο δείγµα µας, οι 71 και 47, Β) 8 άτοµα δηµιούργησαν ζεύγη των δύο, µε 4 διαφορετικούς γενότυπους (14 µε 37, 60 µε 116, 62 µε 125, 105 µε 113) και Γ) δηµιουργήθηκαν 3 µεγάλες οµάδες ατόµων µε όµοιους γενοτύπους, όπου η µία οµαδοποίηση αφορά 9 άτοµα (12, 16, 39, 67, 81, 96, 117, 120, 121), η δεύτερη οµαδοποίηση αφορά 8 άτοµα (20, 23, 25, 44, 70, 92, 114, 124) και η τρίτη οµαδοποίηση αφορά 7 άτοµα (17, 29, 35, 58, 76, 104, 109). Παρόλο που είδαµε ότι δεν ισχύει γραµµική διάταξη των υποτιθέµενες κλώνων στη φυτεία, πραγµατοποιήσαµε έλεγχο για την περίπτωση στην οποία είχε χρησιµοποιηθεί κάποιου είδους άλλη διάταξη παράταξης των κλώνων στη φυτεία ώστε η πλήρης τυχιαοποιηµένη διάταξη να αποτελέσει και τελική περίπτωση. Στα παρακάτω σχήµατα, φαίνεται η χωρική διάταξη των όµοιων γενοτύπων στη φυτεία. Δρόµος είσοδος Εικόνα 12: Στο σχήµα, κάθε χρωµατισµός αναπαριστά ένα διαφορετικό γενότυπο σύµφωνα µε την ταυτοποίηση που έγινε µε την ανάλυση του ενζυµικού συστήµατος της µηλικής αφυδρογονάσης. Με κίτρινο χρώµα είναι άτοµα του γενοτύπου (a2a2-b3b5-c6c6-d2d2), µε µαύρο χρώµα του γενοτύπου (a2a2-b3b5-c3c6-d2d2), µε άσπρο χρώµα του γενοτύπου (a2a2-b5b5-c3c6- d2d2), µε µωβ χρώµα του γενοτύπου (a2a2-b5b6-c3c6-d2d2), µε πορτοκαλί χρώµα του γενοτύπου (a2a2-b4b5-c3c6-d2d2), µε µπλε χρώµα του γενοτύπου (a2a2-b3b3-c6c6-d2d2), και οι µοναδικοί γενότυποι (a2a2-b3b5-c4c6-d2d2) και (a2a2-b5b6-c6c6-d2d2) είναι µε γκρι και µπορντώ χρώµα αντίστοιχα. 50

51 Δοκιµάστηκαν τα γειτονικά ζεύγη, ανά 2, 3 και 4 άτοµα, για να εξετάσουµε µήπως υπήρχε κάποιος διαφορετικός φυτευτικός σύνδεσµος από αυτόν που αρχικά υποθέσαµε αλλά όπως φαίνεται και από το σχήµα, δε επιβεβαιώνεται κάποια άλλη υπόθεση, αφού δεν υπάρχει οποιαδήποτε κανονικότητα. Εικόνα 13: Μία τρισδιάστατη απεικόνιση της χωροθέτησης των γενοτύπων (το ύψος της κάθε µπάρας δεν σχετίζεται µε κάποιο δεδοµένο αλλά για να βοηθήσει την αναγνώριση πιθανών µοτίβων). 51