ΠΑΝΕΠΙΣΘΜΙΟ ΠΑΣΡΩΝ ΧΟΛΘ ΕΠΙΣΘΜΩΝ ΤΓΕΙΑ-ΣΜΘΜΑ ΙΑΣΡΙΚΘ. ΠΜ ςτισ ΒΑΙΚΕ ΙΑΣΡΙΚΕ ΕΠΙΣΘΜΕ ΕΡΓΑΣΘΡΙΟ ΑΙΜΑΣΟΛΟΓΙΑ-ΑΙΜΟΔΟΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΣΙΚΘ ΕΡΓΑΙΑ

Transcript

1 ΠΑΝΕΠΙΣΘΜΙΟ ΠΑΣΡΩΝ ΧΟΛΘ ΕΠΙΣΘΜΩΝ ΤΓΕΙΑ-ΣΜΘΜΑ ΙΑΣΡΙΚΘ ΠΜ ςτισ ΒΑΙΚΕ ΙΑΣΡΙΚΕ ΕΠΙΣΘΜΕ ΕΡΓΑΣΘΡΙΟ ΑΙΜΑΣΟΛΟΓΙΑ-ΑΙΜΟΔΟΙΑ ΔΙΠΛΩΜΑΣΙΚΘ ΕΡΓΑΙΑ «Μελζτθ τθσ ςυςτθματικισ ανοςοτροποποίθςθσ που προκαλεί θ εφαρμογι του φαρμάκου imiquimod ςε αςκενείσ με RHL (recurrent herpes labialis) και HPV (human papilloma virus) λοιμϊξεισ.» ΡΟΔΘ ΜΑΡΙΑ ΒΙΟΛΟΓΟ ΕΠΙΒΛΕΠΟΤΑ ΚΑΘΘΓΘΣΡΙΑ: ΜΟΤΗΑΚΘ ΑΘΑΝΑΙΑ 2011

2 Τριμελόσ ςυμβουλευτικό επιτροπό 1. Ακαναςία Μουηάκθ, Κακθγιτρια Εργαςτθριακισ Αιματολογίασ- Αιμοδοςίασ, Τμιμα Ιατρικισ Ρανεπιςτθμίου Ρατρϊν (Επιβλζπουςα Κακθγιτρια) 2. Τςαμπάοσ Διονφςιοσ, Κακθγθτισ Δερματολογίασ, Τμιμα Ιατρικισ Ρανεπιςτθμίου Ρατρϊν (Μζλοσ Τριμελοφσ Επιτροπισ) 3. Ραςματηι Ευςτακία, Επίκουρθ Κακθγιτρια Δερματολογίασ, Τμιμα Ιατρικισ Ρανεπιςτθμίου Ρατρϊν (Μζλοσ Τριμελοφσ Επιτροπισ) 2

3 Ευχαριςτύεσ Θ εργαςία αυτι εκπονικθκε ςτο Εργαςτιριο Εργαςτθριακισ Αιματολογίασ ςε ςυνεργαςία με τθν Δερματολογικι Κλινικι. Στθν ολοκλιρωςι τθσ ςυνζβαλαν πολλοί τουσ οποίουσ και κα ικελα να ευχαριςτιςω. Τθν κα Μουηάκθ Ακαναςία για τθ ςωςτι κακοδιγθςθ, τθν αμζριςτθ ςυμπαράςταςθ και τθν εμπιςτοςφνθ που μου ζδειξε. Τον κ. Τςαμπάο Διονφςιο και τθν κα Ραςματηι Ευςτακία, μζλθ τθσ τριμελοφσ μου επιτροπισ, για τισ επιςθμάνςεισ και τισ διορκϊςεισ κατά τθν ςυγγραφι τθσ παροφςασ διατριβισ αλλά και για τθν ςφλλθψθ τθσ ιδζασ και τθν διεκπεραίωςθ τθσ κλινικισ πλευράσ αυτισ τθσ μελζτθσ. Τα μζλθ του εργαςτθρίου, και ιδιαιτζρωσ τθ Μεταδιδάκτορα κα Καλαβριηιϊτθ Διμθτρα και τθν Υποψιφια Διδάκτορα κα Δελαςτίκ Άννα Λίηα, για τθν υποςτιριξθ τουσ και τισ ςυμβουλζσ τουσ ςτα τόςα χρόνια ςυνεργαςίασ μασ. Θ μελζτθ αυτι χρθματοδοτικθκε από το Ρρόγραμμα Καρακεοδωρισ του Ρανεπιςτθμίου Ρατρϊν και τα πρϊτα αποτελζςματα τθσ ζχουν δθμοςιευκεί το 2011 ςτο επιςτθμονικό περιοδικό Antiviral Therapy με τίτλο «Long-term remission of recurrent herpes labialis following topical imiquimod application on distant healthy skin: a clinical and immunological study.» 3

4 Περιεχόμενα Ειςαγωγό Recurrent herpes labialis και human papillomavirus λοιμϊξεισ (ςελ. 12) Τoll-like receptors (ςελ. 14) 1.1. Θ ζκφραςθ των TLRs (ςελ.18) 1.2. Τρόποσ δράςθσ των TLRs (ςελ.18) 1.2.α. Μονοπάτι ςθματοδότθςθσ εξαρτϊμενο από τθν MyD88 (ςελ.20) 1.2.β. Μονοπάτι ςθματοδότθςθσ ανεξάρτθτο τθσ MyD88 (ςελ.20) Ιμικουϊμόδθ (ςελ.22) 1.3. Ο μθχανιςμόσ δράςθσ τθσ ιμικουϊμόδθσ (ςελ.22) 1.4. Θ ανοςορυκμιςτικι δράςθ τθσ ιμικουϊμόδθσ (ςελ.24) Σκοπόσ (ςελ.27) Υλικϊ και Μϋθοδοι 2.1. Μάρτυρεσ και αςκενείσ (ςελ. 30) 2.2. Θεραπευτικό ςχιμα (ςελ.31) 2.3. Βιολογικό υλικό (ςελ.31) 2.4. Ανοςοφαινοτφπιςθ των λεμφοκυτταρικϊν πλθκυςμϊν (ςελ.31) 2.5. Ρροςδιοριςμόσ ςυγκζντρωςθσ κυτταροκινϊν (ςελ.33) 2.6. Στατιςτικι επεξεργαςία (ςελ.34) Αποτελϋςματα 3.1.Κλινικι εικόνα των αςκενϊν μετά τθν κεραπεία (ςελ.36) 3.2. Φαινοτυπικι ανάλυςθ των περιφερικϊν λεμφοκυττάρων (ςελ.36) 3.3. Τ ρυκμιςτικά κφτταρα (ςελ. 41) 3.4. Κυτταροκινικό προφίλ (ςελ. 44) Συζότηςη (ςελ. 48) Βιβλιογραφύα (ςελ. 53) 4

5 Ευρετήριο εικόνων Εικόνα 1. Herpes labialis ςε 19 ετϊν άρρεν (ςελ.12) Εικόνα 2 Ο κφκλοσ ηωισ του HSV ςτον ανκρϊπινο ξενιςτι (ςελ. 13) Εικόνα 3. Καρκινογζνεςθ και HPV (ςελ. 15 ) Εικόνα 4. Εντοπιςμόσ των TLRs ςτο κφτταρο, προςδζτεσ και μονοπάτια ςθματοδότθςθσ αυτϊν (ςελ.20) Εικόνα 5. Θ δομι του TLR ςε ςφγκριςθ με τον υποδοχζα τθσ IL-1 (ςελ. 21) Εικόνα 6. H δράςθ των TLRs διαμεςολαβείται από 2 ξεχωριςτά μονοπάτια ςθματοδότθςθσ (ςελ.23) Εικόνα 7. Θ πλειοτροπικι δράςθ των αγωνιςτϊν των TLR7/8 (ςελ.27) Εικόνα 8. Θ μζκοδοσ CBA (ςελ. 35) Εικόνα 9. Ανάλυςθ κυτταρομετρίασ ροισ για τα Τ ρυκμιςτικά κφτταρα ςε ολικό αίμα (ςελ.44) Εικόνα 10. Γραφικι παράςταςθ των ποςοςτϊν (Α) και των απόλυτων αρικμϊν (Β) των Τ ρυκμιςτικϊν κυττάρων (ςελ.45) Εικόνα 11. Τα επίπεδα των προφλεγμονωδϊν κυτταροκινϊν, IFN-α και IFN-γ ςτον ορό αςκενϊν και υγειϊν πριν και μετά τθν ζναρξθ τθσ κεραπείασ με ιμικουϊμόδθ(ςελ.48) 5

6 Ευρετήριο πινάκων Ρίνακασ 1. Σφνοψθ των TLRs : θ δράςθ, τα προςδζματα και οι κυτταροκίνεσ που επάγουν. (ςελ.17-18) Ρίνακασ 2. Ρεριγραφικά χαρακτθρίςτθκα υγιϊν μαρτφρων και αςκενϊν, θ θλικία εκφράηεται ςε μζςθ τιμι ± τυπικι απόκλιςθ. (ςελ.32) Ρίνακασ 3. Κυτταρικοί πλθκυςμοί λευκοκυττάρων του αίματοσ και οι κυτταρικοί δείκτεσ αυτϊν. (ςελ. 34) Ρίνακασ 4 Στοιχεία των αντιςωμάτων που χρθςιμοποιικθκαν για τθν κυτταρομετρία ροισ. (ςελ. 34) Ρίνακασ 5. Θ ανάλυςθ FACS ςε ολικό αίμα αςκενϊν και υγειϊν μαρτφρων, κατά τθν διάρκεια του κεραπευτικοφ ςχιματοσ. (ςελ.41-42) 6

7 Summary In this study we investigate the influence of imiquimod, a topical applicable agonist of Toll-like receptor 7 (TLR7) in skin, on systemic immunity of patients with herpes simplex virus (HSV) and human papilloma virus (HPV) infections. We investigated whether the topical application of imiquimod affects cytokines which participate in mechanisms of innate and adaptive immune responses and cell populations, such as T-cells (helper, cytotoxic, naïve, memory, activated and regulatory), B-cells and natural killer cells (NK cells). TLRs help to bridge the gap between innate and adaptive immunity, since they recognize and bind pathogen associated molecular patterns of pathogens. The expression of TLRs has been detected on neutrophils, macrophages, dendritic cells, dermal endothelial cells, mucosal epithelial cells, T and B cells. Activation of TLRs mediates the release of cytokines and chemokines that recruit innate immune responses, which lead to the formation of adaptive immunity. Imidazoquinolines represent a group of nucleoside analogues that have been used as antiviral agents. Imiquimod belongs to imidazoquinolines and it has been used for the treatment of genital warts (caused by HPV) and cutaneous cancers. Imiquimod is a ligand of TLR7 and a patient-applied cream. It has been characterized as an immune response modifier, because through its binding to TLR7 it generates a cascade of reactions such as upregulation of cytotoxicity in NK cells, activation of macrophages to secrete cytokines, activation and migration of Langerhans cells from skin to lymph nodes and induction of proliferation and differentiation of T and B cells. Currently it is unknown if the topical application of imiquimod is able to exert, apart from a local, also a systemic immunomodulatory action. For this reason we tried to elucidate the effects of imiquimod on the immune system of patients with HSV and HPV infections at two levels. First we have measured the circulating cell populations in whole blood using flow cytometry and secondly we have determined the serum levels of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-α, IFN-α and IFN-γ with cytometric bead array. The results demonstrate that our hypothesis is correct and 7

8 imiquimod could be an alternative and effective treatment of cutaneous HSV and HPV infections. 8

9 Περύληψη Στόχοσ τθσ παροφςασ ερευνθτικισ εργαςίασ είναι να διερευνθκεί θ επίδραςθ τθσ ιμικουϊμόδθσ, ενόσ τοπικϊσ εφαρμοηόμενου ςτο δζρμα αγωνιςτοφ των Toll-like 7 υποδοχζων (Τoll-like receptors, ΤLRs), ςτθν ςυςτθματικι ανοςία ςε αςκενείσ με δερματικζσ HSV και HPV λοιμϊξεισ. Ριο αναλυτικά κζλουμε να διερευνιςουμε μιπωσ θ τοπικι χοριγθςθ ιμικουϊμόδθσ μπορεί να επθρεάςει τισ κυτταροκίνεσ που ςυμμετζχουν ςτουσ μθχανιςμοφσ φυςικισ και επίκτθτθσ ανοςίασ και τουσ κυτταρικοφσ πλθκυςμοφσ και όπωσ είναι τα Τ κφτταρα (βοθκθτικά, κυτταροτοξικά, παρκενικά, μνιμθσ, ενεργοποιθμζνα και ρυκμιςτικά), τα Β κφτταρα και τα φυςικά φονικά κφτταρα (ΝΚ). Οι TLRs είναι ο ςυνδετικόσ κρίκοσ μεταξφ φυςικισ και επίκτθτθσ ανοςίασ εφόςον είναι οι υποδοχείσ που αναγνωρίηουν και προςδζνουν μοριακζσ δομζσ των πακογόνων (pathogen associated molecular patterns-pamps). Θ ζκφραςθ TLRs ζχει εντοπιςτεί ςε πολλοφσ κυτταρικοφσ όπωσ ουδετερόφιλα, μακροφάγα, δεντριτικά κφτταρα, ενδοκθλιακά κφτταρα τθσ δερμίδασ, επικθλιακά κφτταρα των βλεννογόνων, Β και Τ κφτταρα. Θ ενεργοποίθςθ των TLRs οδθγεί ςε ζκκριςθ κυτταροκινϊν και χθμειοκινϊν που ζχουν ςαν ςτόχο τθν ενεργοποίθςθ τθσ φυςικισ ανοςίασ, που προκαλεί τελικά τθν δθμιουργία τθσ επίκτθτθσ ανοςίασ. Οι ιμιδαηοκινολίνεσ ςυνιςτοφν μία κατθγορία νουκλεοςιδικϊν αναλόγων που αναπτφχκθκαν ςαν αντιϊκοί παράγοντεσ. Θ ιμικουϊμόδθ είναι ζνασ εκπρόςωποσ των ιμιδαηοκινολινϊν που χρθςιμοποιείται για τθν κεραπεία των κονδυλωμάτων και των επικθλιακϊν καρκίνων του δζρματοσ. Θ ιμικουϊμόδθ (imiquimod) είναι προςδζτθσ των TLRs - πιο ειδικά του TLR-7 και χορθγείται τοπικά υπό τθν μορφι αλοιφισ. Ζχει χαρακτθριςτεί ςαν ανοςορρυκμιςτικόσ παράγοντασ, γιατί μζςω τθσ πρόςδεςθσ τθσ ςτον TLR-7 προκαλεί ζνα ςφνολο αντιδράςεων όπωσ θ αφξθςθ τθσ κυτταροτοξικότθτασ των φυςικϊν φονικϊν κυττάρων (ΝΚ), θ ενεργοποίθςθ των μακροφάγων να εκκρίνουν κυτταροκίνεσ, θ ενεργοποίθςθ και θ μετανάςτευςθ των κυττάρων του Langerhans από το δζρμα ςτουσ λεμφαδζνεσ και θ επαγωγι του πολλαπλαςιαςμοφ και τθσ διαφοροποίθςθσ των Τ και Β κυττάρων. 9

10 Επί του παρόντοσ παραμζνει άγνωςτο αν θ τοπικϊσ εφαρμοηόμενθ ιμικουϊμόδθ είναι ςε κζςθ να εξαςκεί επιπλζον τθσ τοπικισ και ςυςτθματικι ανοςοτροποποιθτικι δράςθ. Για τον λόγο αυτό ςτθν παροφςα εργαςία μελετιςαμε τθν επίδραςθ τθσ ιμικουϊμόδθσ ςτο ανοςοποιθτικό ςφςτθμα υγιϊν μαρτφρων και αςκενϊν με HSV και HPV λοιμϊξεισ τόςο ςε επίπεδο κυτταροκινϊν με τθν μζκοδο Cytometric bead array (CBA) όςο και ςε επίπεδο κυκλοφοροφντων κυτταρικϊν πλθκυςμϊν ςτο περιφερειακό αίμα με κυτταρομετρία ροισ (FACS). Τα αποτελζςματα μασ υποδεικνφουν ότι θ τοπικι εφαρμογι τθσ ιμικουϊμόδθσ είναι ικανι να προκαλζςει ςυςτθματικι ανοςοτροποποίθςθ και αυτό αποτελεί μια νζα και αποτελεςματικι εναλλακτικι κεραπεία. 10

11 Ειςαγωγή 11

12 Recurrent herpes labialis και human papillomavirus λοιμώξεισ Ο ιόσ του απλοφ ζρπθτα (herpes simplex labialis - HSV) και ο ιόσ των ανκρϊπινων κονδυλωμάτων (human papillomavirus HPV) είναι δφο ιοί που προςβάλουν πιο ςυχνά τον άνκρωπο. Ο επιχείλιοσ ζρπθσ προςβάλει κατά μζςο όρο παγκοςμίωσ 1.6 νζα άτομα ανά 1000 αςκενείσ ετθςίωσ και υπάρχει ςε 2.5 άτομα ανά 1000 αςκενείσ ετθςίωσ. Το ζνα τρίτο όλων των αςκενϊν με ζρπθ υποφζρουν από τθν υποτροπιάηουςα μορφι του ζρπθ (recurrent herpes labialis RHL) (Opstelten et al 2008). Πςον αφορά τον HPV ςφμφωνα με τον Αμερικάνικο Οργανιςμό Δθμόςιασ Υγείασ υπολογίηεται ότι περίπου το 75 με 80 % των ςεξουαλικά ενεργϊν Αμερικανϊν κάποια ςτιγμι ςτθν ηωι τουσ κα προςβλθκοφν από τον ιό που προκαλεί τα κονδυλϊματα. Μόλισ το 2000 υπιρχαν 6.2 εκατομμφρια Αμερικανοί με αυτιν τθν νόςο, οι οποίοι ιταν θλικίασ ετϊν και το 74% αυτϊν ιταν μεταξφ 15 και 24 ετϊν. Εικόνα 1 Herpes labialis ςε 19 ετϊν άρρεν (Raborn, Grace 2003). Ο HSV είναι ανικει ςτθν οικογζνεια των ιϊν Herpesviridae θ οποία περιλαμβάνει τον ιό του ζρπθ ηωςτιρα, τον κυτταρομεγαλοϊό, τον ιό Epstein Barr virus κ.α. Ρρόκειται για ζνα ιό με γραμμικό δίκλωνο DNA, που ζχει τθν ικανότθτα να αρχικά προςβάλει τα κφτταρα του δζρματοσ δθμιουργϊντασ χαρακτθριςτικζσ δερματικζσ αλλοιϊςεισ (εικόνα 1). Οι αλλοιϊςεισ αυτζσ περιζχουν προϊόντα από τθν λφςθ των κυττάρων που ζχουν μολυνκεί από τον ιό και εξαφανίηονται μετά από 1-2 εβδομάδεσ. Ο HSV μπορεί να εγκαταςτακεί ςτον ξενιςτι για πάντα ςε λανκάνουςα 12

13 κατάςταςθ και να δθμιουργεί υποτροπζσ μετά από διζγερςθ. Ρρόκειται για ζνα νευροτρόπο ιό, κακϊσ μετά τθν μόλυνςθ μεταναςτεφει από το βλεννογόνο του ςτόματοσ ςτα αιςκθτικά νευρικά γάγγλια (γάγγλια του τριδφμου νεφρου) και είτε μεταπίπτει ςε λανκάνουςα φάςθ είτε πολλαπλαςιάηεται κατά τισ υποτροπζσ ( Fatahzadeh και Schwartz 2007, Steiner et al 2007). Θ μόλυνςθ των χειλιϊν από τον HSV εμφανίηεται υπό τθν μορφι του επιχείλιου ζρπθ, θ οποία ςε πολλοφσ αςκενείσ είναι υποτροπιάηουςασ μορφισ και ονομάηεται recurrent herpes labialis-rhl. Εικόνα 2 Ο κφκλοσ ηωισ του HSV ςτον ανκρϊπινο ξενιςτι. (Steiner et al 2007) 13

14 Ο HSV λόγω τθσ φφςθσ του ζχει τθν ικανότθτα να προςβάλει εκτόσ από τα χείλθ και άλλεσ περιοχζσ του ςϊματοσ όπωσ είναι τα οφλα, ο οιςοφάγοσ, τα μάτια, τα νφχια, τα γεννθτικά όργανα ακόμα και το κεντρικό νευρικό ςφςτθμα. Δφναται να προκαλζςει αρκετά ςοβαρζσ αςκζνειεσ όπωσ είναι θ ερπθτικι εγκεφαλίτιδα θ οποία μπορεί να οδθγιςει ςε εκτεταμζνθ νζκρωςθ του φλοιοφ που επθρεάηει κυρίωσ τισ λειτουργίεσ του κροταφικοφ λοβοφ του εγκεφάλου. Θ ερπθτικι εγκεφαλίτιδα λόγω των μθ εξειδικευμζνων ςυμπτωμάτων δεν αναγνωρίηεται εγκαίρωσ για τθν κεραπεία και τα ποςοςτά κνθςιμότθτασ φτάνουν το 70% των περιπτϊςεων (Stahl et al, 2011). Ο HPV ταξινομείται ςτθν οικογζνεια των ιϊν Papillomaviridae. Ρροςβάλει και πολλαπλαςιάηεται ςτα κερατινοκφτταρα ςτθν εξωτερικι ςτοιβάδα τθσ επιφάνειασ του βλεννογόνου. Ο ιόσ μολφνει τα κφτταρα του πλακϊδουσ επικθλίου και οδθγεί ςτθν εμφάνιςθ των κονδυλωμάτων. Ραρομοίωσ με τον RHL, ζχει τθν ικανότθτα τα ειςζλκει ςε λανκάνουςα φάςθ και να παραμείνει ςτο ςθμείο τθσ μόλυνςθσ. Θ καρκινογζνεςθ αποτελεί μια διεργαςία που φαίνεται να είναι ςτενά ςυνδεμζνθ με προχπάρχουςεσ HPV μολφνςεισ. Μια παγκόςμια μελζτθ του 2002 για τθν ετιςια εμφάνιςθ περιςτατικϊν καρκίνου ζδειξε ότι ο HPV επάγει τθν εμφάνιςθ του 5.2% των νζων καρκίνων ετθςίωσ, ενϊ παράλλθλα ευκφνεται για το 84% των νζων περιςτατικϊν καρκίνων του τραχιλου τθσ μιτρασ (Parkin 2006) (εικόνα 3). Ζχει αποδειχκεί ότι με τα τθν εγκατάςταςθ του HPV ςτα επικθλιακά κφτταρα, το γενετικό υλικό του αντιγράφεται αυτόνομα ςτον πυρινα των επικθλιακϊν κυττάρων. Ραράλλθλα θ ζκφραςθ των γονιδίων του ιοφ Ε6 και Ε7, οδθγεί ςταδιακά ςτον κακοικθ μεταςχθματιςμό των επικθλιακϊν κυττάρων (Εinstein et al 2009). Οι μθχανιςμοί που οδθγοφν ςτθν καρκινογζνεςθ είναι πολλοί, ενδεικτικά αναφζρουμε τθν καταςτολι τθσ κυτταρικισ απόπτωςθσ, τθν απορφκμιςθ του κυτταρικοφ κφκλου και τθν επαγωγι τθσ γενετικισ αςτάκειασ. 14

15 Εικόνα 3. Καρκινογζνεςθ και HPV (Parkin 2006) Ππωσ περιγράφθκε παραπάνω, ο HSV και ο HPV μετά τθν μόλυνςθ ζχουν τθν ικανότθτα να παραμζνουν ςτον ξενιςτι τουσ διαφεφγοντασ τθν ανοςοεπαγρφπνθςθ. Το φαινόμενο αυτό οφείλεται ςε κφριουσ 2 λόγουσ, πρϊτον ςτα ςθμεία που εγκακίςτανται οι δφο ιοί δεν ζρχεται ςε άμεςθ επαφι με τθν κυκλοφορία του αίματοσ ζτςι ϊςτε να αναγνωριςτοφν από κφτταρα του ανοςοποιθτικοφ ςυςτιματοσ και δεφτερον θ ςυγκζντρωςθ τουσ είναι τόςο χαμθλι ϊςτε να μθν προκαλεί ανοςολογικζσ αντιδράςεισ. Ραράλλθλα ζχουν αναπτφξει μθχανιςμοφσ για να παρεμποδίςουν τθν αντίδραςθ του ανοςοποιθτικοφ ςυςτιματοσ (Einstein et al, 2009). Για τθν κεραπεία τουσ χρθςιμοποιοφνται φαρμακευτικζσ ουςίεσ που ςαν ςτόχο ζχουν να ξεπεράςουν τα παραπάνω εμπόδια. Στθν παροφςα μελζτθ πραγματοποιικθκε τοπικι εφαρμογι ενόσ αγωνιςτι του Tolllike receptor 7, τθσ ιμικουϊμόδθσ ςε αςκενείσ με HSV και HPV λοιμϊξεισ και εν ςυνεχεία παρατθρικθκαν οι τροποποιιςεισ που προκαλοφνται ςτο ανοςοποιθτικό ςφςτθμα. 15

16 Τoll-like receptors Το ανοςοποιθτικό ςφςτθμα διακρίνεται ςε δυο μζρθ ςτθν φυςικι ι εγγενι ανοςία και ςτθν επίκτθτθ ι προςαρμοςτικι ανοςία. Κατά τθν διάρκεια τθσ φυςικισ ανοςίασ ζχουμε τθν αναγνϊριςθ πακογόνων από φαγοκφτταρα και αυτό γίνεται είτε με τθν αναγνϊριςθ από υποδοχείσ, είτε μζςω του ςυμπλθρϊματοσ και ζπειτα ακολουκεί θ ενεργοποίθςθ τθσ αντίδραςθσ φλεγμονισ. Τθν φυςικι ανοςία υπθρετοφν κφτταρα όπωσ ουδετερόφιλα, μονοκφτταρα, φυςικά φονικά κφτταρα (Natural killer cells-nk cells), φυςικά φονικά Τ κφτταρα (ΝΚΤ cells), μαςτοκφτταρα και ουςίεσ όπωσ οι κυτταροκίνεσ, το ςυμπλιρωμα και αντιμικροβιακά πεπτίδια. Αργότερα μζςω μιασ ςειράσ αντιδράςεων τα αντιγονοπαρουςιαςτικά κφτταρα (antigen presenting cells-apcs) μζςω του κφριου ςυμπλόκου ιςτοςυμβατότθτασ κλάςθσ I και II παρουςιάηουν τα ξζνα αντιγόνα ςτα Τ λεμφοκφτταρα. Τα λεμφοκφτταρα ςαν αντίδραςθ ςτθν αναγνϊριςθ ενόσ ξζνου αντιγόνου πολλαπλαςιάηονται και δθμιουργοφν κλϊνουσ ειδικοφσ για το αντιγόνο. Αυτόσ ο αντιγονοειδικόσ τφποσ ανοςίασ ονομάηεται επίκτθτθ ανοςία. Το βαςικό ςτοιχείο που «γεφυρϊνει» τθν φυςικι με τθν επίκτθτθ ανοςία είναι οι Τoll-like υποδοχείσ (Τoll-like receptors-tlrs) (Takeda και Akira, 2005). Θ ανακάλυψθ των TLRs δεν ξεκίνθςε από μελζτεσ ςτο ανοςοποιθτικό ςφςτθμα αλλά από τθν μελζτθ του Τoll υποδοχζα ςε ζμβρυα ςτθν Drosophila melanogaster, ςτθν οποία παίηει ρόλο ςτον κακοριςμό του ραχιαιο-κοιλιακοφ άξονα του εμβρφου (Valanne et al 2011). Αργότερα μελζτεσ ςτισ μεταλλάξεισ του υποδοχζα ζδειξαν ότι ο τελευταίοσ προςδίδει ανκεκτικότθτα ζναντι των μυκθτιάςεων ςτισ μφγεσ (Hashimoto, Hudson, Anderson, 1988). Αυτι θ κομβικι παρατιρθςθ ζςτρεψε τουσ ερευνθτζσ ςτθν αναηιτθςθ ομόλογων ανκρϊπινων πρωτεϊνϊν. Το 1997 από τουσ Charles Janeway και Ruslan Medzhitov δθμοςιεφτθκαν τα αποτελζςματα τθσ μελζτθσ τουσ για μια ομόλογθ πρωτεΐνθ του Τoll υποδοχζα τθσ Drosophila melanogaster. Θ εργαςία αυτι ζδειξε ότι ο υποδοχζασ ζχει ικανότθτα ενεργοποίθςθσ του NF-κB και των γονιδίων που θ ζκφραςθ τουσ ελζγχεται από αυτόν όπωσ των προφλεγμονωδϊν κυτταροκινϊν IL-1, IL-6 και IL-8 (Medzhitov, Preston-Hurlburt, Janeway 1997). 16

17 TLR Δράςθ Ενδογενζσ πρόςδεμα 1 Άμυνα ζναντι Mycobacteria, οργανιςμϊν που εκφράηουν τριακετυλιωμζνθ λιποπρωτεΐνθ 2 Άμυνα ζναντι Mycobacteria, Mycoplasma, gram κετικϊν βακτθρίων, πρωτοηϊων, μφκθτων κ.α. Οξειδωτικό ςτρεσ και κυτταρικι νζκρωςθ Ενεργοποίθςθ οξειδωτικοφ ςτρεσ Επαγωγι του αντιμικροβιακοφ TLR4 προςδζματοσ, β-defensin-2 Δεν ζχει βρεκεί HSPgp96 HSP60 HSP70 Εξωγενζσ πρόςδεμα Τριακετυλιωμζνθ λιποπρωτεΐνθ(lp), λιποπρωτεΐνθ του μυκοβακτθριδίου Γλυκοπρωτεΐνθ των βακτθρίων, τρι- ι διακετυλιωμζνθ LP Lipoteichoic acid GPI anchors Ρρωτεΐνθ Α Διμαννοςίδια φωςφατιδυλοινοςιτόλθσ Γλυκολιπίδιο LAM Λιποπρωτεΐνθ μυκοβακτθριδίου Κυτταροκίνεσ που επάγονται TNF-α IL-12 Ενεργοποίθςθ μαςτοκυττάρων και αποκοκκίωςθ Επαγωγι απόπτωςθσ 3 Αντιϊκι άμυνα Δεν ζχει βρεκεί Δίκλωνο DNA IFN-β 4 Άμυνα ζναντι gram αρνθτικϊν βακτθρίων, μυκιτων, ιϊν Επαγωγι τθσ απόπτωςθσ 5 Άμυνα ζναντι μαςτιγοφόρων βακτθρίων Ωρίμανςθ δενδριτικϊν κυττάρων HSPgp96 HSPgp60 HSPgp70 Εξωκυττάρια περιοχι Α τθσ φιμπρονεκτίνθσ Β-ντεφενςίνθ-2 Ινοδωγόνο LPS F πρωτεΐνθ του RSV Ρρωτεΐνθ του φακζλου του ιοφ που προκαλεί τον καρκίνο του ςτικουσ ςτον μυ Γλυκοξυμαννάνθ του Cryptococcus neoformans Δεν ζχει βρεκεί Φλατηελλίνθ TNF-α IFN-γ IL-1β IL-6 IL-10 ΝΟ TNF-α IFN-β IL-1 IL-6 IL-10 IL-13 ΝΟ Λευκοτριζνια Ρροςτανοϊδι 6 Άμυνα ζναντι βακτθρίων, μυκιτων, μυκοπλάςματοσ, πρωτοηϊων Δεν ζχει βρεκεί Διακετυλιωμζνθ LP GPI anchors Μοντουλίνθ Ηυμοςάνθ του yeast TNF-α 17

18 7 Αντιϊκι και αντικαρκινικι δράςθ Ωρίμανςθ δεντριτικϊν κυττάρων Δεν ζχει βρεκεί Ιμιδαηοκινολίνεσ Μονόκλωνο RNA IFN-α IFN-β IFN-γ Ενεργοποίθςθ και μετανάςτευςθ των κυττάρων του Langerhans από το δζρμα ςτουσ λεμφαδζνεσ Τh1 πόλωςθ Ενεργοποίθςθ των φυςικϊν φονικϊν κυττάρων TNF-α IL-1 IL-6 IL-8 IL-12 IL-18 GM-CSF Ρολλαπλαςιαςμόσ Β-κυττάρων Υπεροξείδια Ενεργοποίθςθ θωςινόφιλων 8 Ραρόμοια με τον TLR7 Δεν ζχει βρεκεί Ιμιδαηοκινολίνεσ Μονόκλωνο RNA Ραρόμοια με τον TLR7 9 Αντιβακτθριακι και αντιϊκι δράςθ Τh1 πόλωςθ Ρολλαπλαςιαςμόσ Β-κυττάρων Ανοςοςφμπλοκα χρωματίνθσ Απομεκυλιωμζνθ κυτοςίνθγουανίνθ του DNA Ηωντανόσ ι απενεργοποιθμζνοσ HSV-2 IFN-α IFN-β IFN-γ IL-6 IL-12 Ωρίμανςθ δεντριτικϊν κυττάρων 10 Άγνωςτθ Δεν ζχει βρεκεί Δεν ζχει βρεκεί 11 Ουροπακογόνα βακτιρια Δεν ζχει βρεκεί Δεν ζχει βρεκεί Πίνακασ 1. φνοψθ των TLRs : θ δράςθ, τα προςδζματα και οι κυτταροκίνεσ που επάγουν (Martin και Gaspari, 2008) 18

19 Σιμερα είναι γνωςτοί 11 TLRs ςτον άνκρωπο (πίνακασ 1) αν και μπορεί να είναι 13 όπωσ και ςτο μυ (Martin και Gaspari, 2008 και Zarember και Godowski, 2002). Πλοι οι TLRs αναγνωρίηουν και προςδζνουν ςυγκεκριμζνα μοριακζσ δομζσ ςτα πακογόνα γνωςτζσ ςαν PAMPs (pathogen associated molecular patterns) και προκαλοφν αντιδράςεισ ζναντι αυτϊν, όπωσ θ επαγωγι τθσ ζκφραςθσ προφλεγμονωδϊν κυτταροκινϊν. 1.1 Η έκφραςη των TLRs Θ ζκφραςθ των TLRs εντοπίηεται ςε πλθκϊρα κυττάρων του ανκρϊπινου ςϊματοσ, όπωσ τα ουδετερόφιλα (TLR 2-4, 6, 7,9), τα μακροφάγα (TLR 1-9), τα δενδριτικά κφτταρα (TLR1-10), ενδοκθλιακά κφτταρα του δζρματοσ (TLR 2-5,9), ινοβλάςτεσ (TLR 1-9). Ζχουν εντοπιςτεί ςτα Τ και ςτα Β κφτταρα (TLR 1-2, 4, 6, 9) του ανοςοποιθτικοφ ςυςτιματοσ κακϊσ και ςτα ρυκμιςτικά Τ κφτταρα (Tregs, TLR 4, 5, 7, 8) και ςτον φυςικά φονικά Τ κφτταρα (ΝΚΤ, TLR 2-6, 8, 9). Τζλοσ ανιχνεφονται και ςε πλικοσ άλλων κυτταρικϊν πλθκυςμϊν όπωσ κερατινοκφτταρα, μελανοκφτταρα, κφτταρα του Langerhans, μαςτοκφτταρα, βαςεόφιλα κ.α Τρόποσ δράςησ των TLRs Οι TLRs αποτελοφν τθν γζφυρα μεταξφ φυςικισ και επίκτθτθσ ανοςίασ. Ουςιαςτικά θ ενεργοποίθςθ τουσ οδθγεί ςε αντιδράςεισ που ζχουν ςαν απϊτερο ςτόχο τθν απόκτθςθ τθσ επίκτθτθσ ανοςίασ. Θ ενεργοποίθςθ των TLRs διαμεςολαβείται από προςδζτεσ ενδογενοφσ και εξωγενοφσ προζλευςθσ. Ενδογενείσ προςδζτεσ είναι μόρια όπωσ οι heat shock πρωτεΐνεσ, θ φιμπρονεκτίνθ, το ινωδογόνο, θ β-ντεφενςίνθ και τα ανοςοςφμπλοκα χρωματίνθσ. Από τθν άλλθ εξωγενι προςδζματα αποτελοφν τα ςυςτατικά του βακτθριακοφ τοιχϊματοσ, το DNA και RNA ιϊν, φαρμακευτικζσ ουςίεσ όπωσ οι ιμιδαηοκινολίνεσ κ.α. 19

20 Ανάλογα με τθν φφςθ του προςδζματοσ οι TLRs εντοπίηονται είτε ςτθν κυτταρικι μεμβράνθ είτε ςτα ενδοςϊματα. Στα ενδοςϊματα εμφανίηονται οι TLRs 3, 7, 8 και 9, οι οποίοι αναγνωρίηουν δίκλωνο DNA, μονόκλωνο RNA και CpG μοτίβα ςτο DNA αντίςτοιχα (εικόνα 4). Οι TLRs ςαν υποδοχείσ ανικουν ςτθν κλάςθ Ι των διαμεμβρανικϊν υποδοχζων, οι οποίοι αποτελοφνται από τθν εξωκυττάρια πλοφςια ςε λευκίνθ (Leukine-rich-repeat regions-lrrs) περιοχι, ζνα διαμεμβρανικό τμιμα και ζνα κυτταροπλαςματικό τμιμα που ονομάηεται cytoplasmic Toll/interleukin (IL-1) receptor domain (TIR), το όποιο είναι παρόμοιο με τθν αντίςτοιχθ περιοχι των υποδοχζων τθσ οικογζνειασ IL-1 (εικόνα 5). Εικόνα 4. Εντοπιςμόσ των TLRs ςτο κφτταρο, προςδζτεσ και μονοπάτια ςθματοδότθςθσ αυτϊν (Akasi-Takamura και Miyake, 2006) H δράςθ των TLRs διαμεςολαβείται από 2 διακριτά μονοπάτια ςθματοδότθςθσ. Το πρϊτο γίνεται μζςω τθσ πρωτεΐνθσ-προςαρμογζα MyD88 (myeloid differentiation factor 88) και το άλλο είναι ανεξάρτθτο αυτισ (εικόνα 6)(Akira και Takeda, 2004). Επίςθσ θ ενεργοποίθςθ ςυγκεκριμζνων TLRs οδθγεί ςε διαφορετικι προφίλ ζκφραςθσ γονιδίων. Για παράδειγμα θ ενεργοποίθςθ των TLR3 και TLR4 προκαλεί τθν επαγωγι του τφπου Ι ιντερφερονϊν (IFNs), αλλά θ ενεργοποίθςθ των TLR2 και TLR5 όχι. Τζλοσ μπορεί θ ενεργοποίθςθ διαφορετικϊν TLRs να οδθγεί ςε ζκφραςθ των ίδιων γονιδίων αλλά από διαφορετικά ςθματοδοτικά μονοπάτια, 20

21 όπωσ ςυμβαίνει με τουσ TLRs των ενδοςωμάτων 7,8 και 9 που ενεργοποιοφν τθν ζκφραςθ τφπου Ι IFNs αλλά με διαφορετικό μθχανιςμό από τουσ TLRs 3 και 4. Εικόνα 5. Θ δομι του TLR ςε ςφγκριςθ με τον υποδοχζα τθσ IL-1 (Akira και Takeda, 2004) 21

22 1.2.α. Μονοπάτι ςηματοδότηςησ εξαρτώμενο από την MyD88 Μετά τθν δζςμευςθ του προςδζτθ ςτον TLR ξεκινά ζνασ καταρράκτθσ αντιδράςεων μζςω τθσ περιοχισ TIR, θ οποία αλλθλεπιδρά με τθν MyD88. Μελζτεσ ςε μφεσ με ζλλειψθ τθσ MyD88 ζδειξαν ότι θ πρωτεΐνθ αυτι παίηει κρίςιμο ρόλο ςε αντιδράςεισ που ςχετίηονται με τουσ TLRs και τθν IL-1. Σε αυτό το πειραματικό μοντζλο τα μακροφάγα κφτταρα είναι ανίκανα να παράγουν φλεγμονογόνεσ κυτταροκίνεσ παρουςία διαφόρων προςδετϊν όπωσ πεπτιδογλυκάνεσ, λιποπρωτεΐνεσ, δίκλωνο DNA και ιμιδαηοκινολίνεσ. Θ MyD88 μετά τθν ενεργοποίθςθ τθσ φωςφορυλιϊνει μια κινάςθ ςερίνθσ/κρεονίνθσ τθν IRAK (IL-1R-associated kinase). Εν ςυνεχεία θ IRAK αλλθλεπιδρά με τθν TRAF6 (TNF receptor-associated factor 6) και προκαλείται θ ενεργοποίθςθ δυο ξεχωριςτϊν μονοπατιϊν ςθματοδότθςθσ. Το πρϊτο οδθγεί ςτθν ενεργοποίθςθ του μεταγραφικοφ παράγοντα NF-κB (nuclear factor κb) και το δεφτερο οδθγεί μζςω του μονοπατιοφ τθσ JNK (c-jun N-terminal kinase) και τθσ κινάςθσ MAPK (mitogen-activated protein kinase), ςτθν ενεργοποίθςθ ενόσ άλλου μεταγραφικοφ παράγοντα του AP-1. Ωςτόςο και οι δυο μεταγραφικοί παράγοντεσ επάγουν τθν ζκφραςθ φλεγμονωδϊν κυτταροκινϊν. Τζλοσ μια δεφτερθ πρωτεΐνθπροςαρμογζασ γνωςτι ςαν TIRAP (TIR-associated protein / MyD88-adaptor like) ζχει προςδιοριςτεί και εμπλζκεται ςτα εξαρτϊμενα μονοπάτια από τθν TLR1/2, TLR2/6 και TLR4. (Akira και Takeda, 2004) MyD88 των 1.2.β. Μονοπάτι ςηματοδότηςησ ανεξάρτητο τησ MyD88 Θ MyD88 είναι το πιο ςθμαντικό μόριο για τθν παραγωγι των φλεγμονωδϊν κυτταροκινϊν ςαν απόκριςθ ζναντι μιασ μεγάλθσ ποικιλίασ μικροβιακϊν ςυςτατικϊν. Ραρόλα αυτά ζχει δειχκεί ότι τα μακροφάγα κφτταρα μυϊν με ζλλειψθ τθσ MyD88 ζχουν τθν ικανότθτα να αντιδροφν ςτο ερζκιςμα του LPS. Στα μακροφάγα κφτταρα αυτϊν των ηϊων δείχκθκε ότι ο LPS επάγει τθν ενεργοποίθςθ του NF-κB και τθσ JNK, που οδθγοφν ςτθν ζκφραςθ φλεγμονωδϊν κυτταροκινϊν. 22

23 Το μονοπάτι αυτό περιλαμβάνει ζνα άλλο μόριο-προςαρμογζα που ονομάηεται TRIF (TIR domain-containing adaptor-inducing interferon-β). Θ TRIF παίηει ςθμαντικό ρόλο ςτθν ςθματοδότθςθ μζςω των TLR3 και TLR4, που οδθγεί ςτθν ενεργοποίθςθ του μεταγραφικοφ παράγοντα τθσ IFN-β, IRF-3 (IFN regulatory factor). Άλλο ζνα μόριο-προςαρμογζασ είναι θ TRAM (TRIF-related adaptor molecule), θ οποία αλλθλεπιδρά ειδικά με τον TLR4 και οδθγεί ςτθν παραγωγι IFN-β. (Akira και Takeda, 2004) Εικόνα 6. H δράςθ των TLRs διαμεςολαβείται από 2 ξεχωριςτά μονοπάτια ςθματοδότθςθσ (Akira και Takeda, 2004) 23

24 Ιμικουΰμόδη Τθν δεκαετία του 1980 μια νζα ομάδα νουκλεοςιδικϊν αναλόγων, γνωςτζσ ςαν ιμιδαηοκινολίνεσ αναπτφχκθκαν με απϊτερο ςτόχο τθν χριςθ τουσ ωσ αντιϊκοί παράγοντεσ. Τα πρϊτα πειράματα με αυτά τα μόρια ςε ινδικά χοιρίδια με ζρπθ των γεννθτικϊν οργάνων ζδειξαν ότι είχαν πολφ μικρά αποτελζςματα in vitro ςτθν αντιγραφι του απλοφ ερπθτοϊοφ (HSV, herpes simplex virus) αλλά εμφάνιςαν ιςχυρι δράςθ in vivo. Μελζτεσ ζδειξαν ότι τα μόρια αυτά προκαλοφν τθν παραγωγι προφλεγμονωδϊν κυτταροκινϊν που εμφανίηουν αντιϊκι και αντικαρκινικι δράςθ και ζτςι χαρακτθρίςτθκαν ςαν ανοςορρυκμιςτικά μόρια. Θ ιμικουϊμόδθ (Aldara TM, R-837, S-26308) είναι θ πρϊτθ ιμιδαηοκινολίνθ που εγκρίκθκε από τον FDA, το Λόγω παρόμοιασ δομισ που εμφανίηει θ ιμικουϊμόδθ με τα νουκλεοςίδια μπορεί να προςδζνεται ςτον TLR7 και να προκαλεί ανοςολογικζσ αντιδράςεισ. Θ δράςθ τθσ οφείλεται ςτθν ενεργοποίθςθ ςθματοδοτικϊν μονοπατιϊν μζςω του TLR7, που προάγουν τθν μετακίνθςθ μεταγραφικϊν παραγόντων ςτον πυρινα των κυττάρων όπωσ ο NF-κB και θ AP-1. Με τθν ςειρά τουσ, οι μεταγραφικοί παράγοντεσ προκαλοφν τθν επαγωγι τθσ μεταγραφισ προφλεγμονωδϊν κυτταροκινϊν, όπωσ IFN-α, TNF-α, IL- 6, IL- 8, IL- 10 και IL- 12. Διατίκεται υπό μορφι κρζμασ και ενδείκνυται για τθν κεραπεία των κονδυλωμάτων που προκαλοφνται από τον ιό των ανκρωπίνων κθλωμάτων (HPV, human papilloma virus) και κακοικεισ επικθλιακοφσ καρκίνουσ του δζρματοσ. (Smits, Ponsaerts, Berneman et al, 2008) Ο μηχανιςμόσ δράςησ τησ ιμικουΰμόδησ Οι ιϊκζσ λοιμϊξεισ είναι δφςκολο να κεραπευτοφν γιατί ςυνικωσ τα επίπεδα των αντιγόνων ι θ διαδικαςία τθσ αντιγονοπαρουςίαςθσ δεν είναι επαρκι. Θ ιμικουϊμόδθ ωσ φαρμακευτικό ςκεφαςμα καλείται να επιτελζςει τον ρόλο τθσ φυςικισ ανοςίασ. Ουςιαςτικά προκαλεί τισ αντιδράςεισ ςε μεγαλφτερθ ζνταςθ ζτςι ϊςτε να γίνουν αντιλθπτζσ από το τα κφτταρα του ανοςοποιθτικοφ ςυςτιματοσ. Ο μθχανιςμόσ δράςθσ τθσ ιμικουϊμόδθσ δεν ζχει προςδιοριςτεί επακριβϊσ, όμωσ είναι 24

25 ςαφζσ ότι επθρεάηει και τα δυο ςυςτιματα τθσ ανοςίασ, το φυςικό και το επίκτθτο ανοςοποιθτικό ςφςτθμα. Θ ενεργοποίθςθ ξεκινά από τθν πρόςδεςθ τθσ ςτον TLR7, θ ζκφραςθ του οποίου εντοπίηεται κυρίωσ ςτα μακροφάγα και ςτα δεντριτικά κφτταρα αλλά και ςε ινοβλάςτεσ, ουδετερόφιλα, Β λεμφοκφτταρα, Τ ρυκμιςτικά κφτταρα κ.α. Ζπειτα προκαλείται θ ενεργοποίθςθ ςθματοδοτικϊν μονοπατιϊν που οδθγοφν ςτθν ενεργοποίθςθ των μεταγραφικϊν παραγόντων NF-κB και AP-1. Τελικό ςτάδιο αυτϊν είναι θ επαγωγι, ςφνκεςθ και απελευκζρωςθ των προφλεγμονωδϊν κυτταροκινϊν με κφριουσ αντιπροςϊπουσ τθν IFN-α, τον TNF-α και τθν IL- 6. Θ ζκκριςθ αυτϊν των κυτταροκινϊν οδθγεί ςτθν αντιϊκι και αντικαρκινικι δράςθ αυτοφ του φαρμάκου, θ οποία κα ςυηθτθκεί παρακάτω. Οι πρϊτεσ μελζτεσ που υποδεικνφουν τθν αντιϊκι δράςθ τθσ ιμικουϊμόδθσ πραγματοποιικθκαν ςτο τζλοσ τθσ δεκαετίασ του 80 από δυο διαφορετικζσ ερευνθτικζσ ομάδεσ. Ο Chen και οι ςυνεργάτεσ του ζδειξαν ςτα ινδικά χοιρίδια το ανάλογο S επάγει τθν ζκκριςθ ιντερφερόνθσ και καταςτζλλει τθν μολυςματικότθτα του κυτταρομεγαλοϊοφ(cytomegalovirus, CMV). Τα αποτελζςματα παρατθρικθκαν τόςο in vivo όςο και in vitro όταν το ανάλογο χρθςιμοποιικθκε προφυλακτικά (Chen et al, 1988). Λίγο αργότερα ο Harrison και οι ςυνεργάτεσ του δθμοςιεφουν τα αποτελζςματα από τθν μελζτθ του αναλόγου R-837 ςτο ίδιο πειραματόηωο με λοιμϊξεισ από HSV-2 (Herpes simplex virus-2). Ζδειξαν ότι παρόλο που in vitro τo R-837 δεν εμφάνιςε αντιϊκι δράςθ, θ χριςθ του in vivo ςαν κεραπεία κατά τθσ μόλυνςθσ HSV-2 παρουςιάηει ιςχυρι καταςταλτικι δράςθ ζναντι του ιοφ τόςο ςτθν αντιγραφι αυτοφ όςο και ςτθν επανεμφάνιςθ τθσ λοιμϊξεωσ. Επίςθσ παρατθρικθκε επαγωγι των επιπζδων ιντερφερόνθσ, θ οποία οδθγεί ςε ενίςχυςθ τθσ κυτταροτοξικότθτασ διαμεςολαβοφμενθσ από κφτταρα ζναντι του HSV-2. Τζλοσ ςτα αποτελζςματα τουσ ζδειξαν πολλαπλαςιαςμό περιφερικϊν μονοπφρθνων κυττάρων του αίματοσ και ζκκριςθ IL-2 που ςχετιηόταν με τθν φπαρξθ του ιοφ, γεγονόσ που οδθγεί ςτο ςυμπζραςμα ότι το R-837 προκαλεί τθν ανάπτυξθ κυτταρικισ ανοςίασ και κατ επζκταςθ ςτθν διαφοροποίθςθ παρκενικϊν κυττάρων ςε μνθμονικά (Harrison et al, 1988). Τισ αρχζσ τθσ δεκαετίασ του 90, οι Borden, Sidky και οι ςυνεργάτεσ τουσ ςτράφθκαν ςτθν διερεφνθςθ τθσ αντικαρκινικισ εφαρμογισ τθσ ιμικουϊμόδθσ. Ξεκινϊντασ από τον μφ ζδειξαν ότι θ ιμικουϊμόδθ ζχει τθν ικανότθτα να καταςτείλει 25

26 το MC-26 καρκίνωμα του κόλον, το ςάρκωμα RIF-1 και το καρκίνωμα των πνευμόνων Lewis, αλλά δεν εμφάνιςε καμία αντικαρκινικι δράςθ ζναντι τθσ λευχαιμίασ P388 (Sidky, Borden et al 1992). Ζπειτα ακολοφκθςαν οι κλινικζσ μελζτεσ τθσ ιμικουϊμόδθσ όπου θ διαπιςτϊκθκε ότι και ςτον άνκρωπο θ ιμικουϊμόδθ είναι επαγωγζασ τθσ ζκφραςθσ των κυτταροκινϊν IFN-α, TNF-α και IL- 6. Ραράλλθλα βρεκικαν αυξθμζνεσ ποςότθτεσ νεοπτερίνθσ ςτον ορό, θ οποία παράγεται και εκκρίνεται από τα μακροφάγα κφτταρα ζπειτα από διζγερςθ με IFN-γ και αποτελεί δείκτθ φλεγμονογόνου διεργαςίασ και ενεργοποίθςθσ τθσ κυτταρικισ ανοςίασ. Τζλοσ παρατθρικθκε αυξθμζνθ ενεργότθτα του ενηφμου 2-5 α ςυνκετάςθσ ςε περιφερικά μονοπφρθνα κφτταρα του αίματοσ. Το ζνηυμο αυτό ενεργοποιείται από ιντερφερόνεσ και οδθγεί μζςω ενόσ άλλου ενηφμου ςτθν καταςτροφι του ιϊκοφ RNA και ςτθν παρεμπόδιςθ τθσ αντιγραφισ του. (Witt et al, 1993, Tomai et al, 1995, Savage et al, 1996). Σιμερα θ ιμικουϊμόδθ χρθςιμοποιείται επιςιμωσ για τθν κεραπεία των εξωτερικϊν κονδυλωμάτων των γεννθτικϊν οργάνων, τθσ ακτινικισ υπερκερατϊςεωσ και του βαςικοκυτταρικοφ καρκινϊματοσ. Από κλινικζσ μελζτεσ ζχει αναφερκεί θ χριςθ τθσ και ςε άλλεσ περιπτϊςεισ όπωσ το οηϊδεσ βαςικοκυτταρικό καρκίνωμα, θ νόςοσ του Bowen, οι κακοικεισ φακζσ ςτθν ζναρξθ του μελανϊματοσ, θ ενδοεπικθλιακι νεοπλαςία του αιδίου, το δερματικό Τ λζμφωμα, ςε ειδικζσ περιπτϊςεισ μεταςτατικοφ μελανϊματοσ κ.α. (Gupta et al. 2004) 1.4 Η ανοςορρυθμιςτική δράςη τησ ιμικουΰμόδησ Θ ιμικουϊμόδθ ζχει χαρακτθριςτεί ωσ ανοςορρυκμιςτικόσ παράγοντασ ι ρυκμιςτισ του ανοςοποιθτικοφ ςυςτιματοσ. Ρολλά από τα αποτελζςματα που προκαλεί μετά από τθν πρόςδεςθ τθσ ςτον TLR7 εμφανίηονται ςτθν εικόνα 7. 26