PREUČEVANJE VEZAVNEGA MESTA ABL TIROZIN-KINAZE Z NAČRTOVANO IN SITU KLIK KEMIJO

Transcript

1 Fakulteta za kemijo in kemijsko tehnologijo Seminarska naloga PREUČEVANJE VEZAVNEGA MESTA ABL TIROZIN-KINAZE Z NAČRTOVANO IN SITU KLIK KEMIJO Mentor: doc. dr. Gregor Gunčar Avtor: Andrej Høivik

2 KAZALO UVOD... 3 ZGODOVINA... 3 VEZAVNO MESTO ABL TIROZIN-KINAZE... 4 TEORETIČNA PREDPOSTAVKA... 4 EKSPERIMENTALNI DEL... 5 SELEKTIVNA SINTEZA INHIBITORJA... 5 ZAKLJUČEK... 6 VIRI IN LITERATURA... 6 TEKST... 6 SLIKOVNO GRADIVO

3 UVOD Kronična mieloična levkemija (KML ang. CML) je kronična maligna bolezen, ki jo opredeljuje proliferacija (nekontrolirana razrast) in motena regulacija nastajanja granulocitov v kostnem mozgu. Posledično se tudi v periferni krvi poveča število levkocitov, kar je prvi laboratorijski znak te bolezni. [1] Moderna kombinatorna kemija poskuša z načrtovano in situ klik kemijo med azidom in alkinom doseči deaktivacijo (zaviranje) BCR-ABL citoplazemske tirozin-kinaze (ang. Bcr-Abl), ki je odgovorna za rakotvornost v organizmu. [2] ZGODOVINA Že v začetku 19. stoletja so bili v nekaterih evropskih državah z arzenikom zdravljeni bolniki s povečanim številom levkocitov v krvi. Te znake bolezni so kasneje pripisali prav kronični mieloični levkemiji, ki pa so jo šele leta 1960 opredelili kot genetsko bolezen, za katero je odgovoren skrajšan kromosom 22 kromosom Philadelphia (Ph). [3] Trinajst let kasneje so znanstveniki na podlagi raziskav ugotovili, da gre pravzaprav za mutacijo med dvema kromosomoma; natančneje recipročno translokacijo (dvojno zamenjavo) dveh genov ( ABL1 in BCR) s kromosomov 9 in 22. Posledica slednje je zliti gen BCR-ABL1, ki nosi zapis za citoplazemsko tirozin-kinazo (beljakovino BCR-ABL1). Ta kinaza vzdržuje stalno aktivacijo signalnih poti v celici, kar povzroči pospešeno proliferacijo matičnih celic, njihovo moteno dozorevanje in preprečuje apoptozo (celično smrt). [4] V 90. letih prejšnjega stoletja je na področju zdravljenja kronične mieloične levkemije prišlo do ugotovite, da je najučinkovitejše zdravljenje te bolezni prav z zaviranjem rekombinirane ABL tirozin-kinaze (BCR-ABL tirozin-kinaze). [5] Prva sintetizirana spojina z lastnostmi zaviralca tirozin-kinaz (TKI, ang. tyrosine kinase inhibitor) je bila imatinib mesilat (komercialno ime Gleevec). Zdaj so na voljo že TKI-ji tretje generacije, ki z razliko od prejšnjih še bolje zavirajo rekombinirane tirozin-kinaze kljub prisotnosti drugih mutacij. [6] povečano število granulocitov translokacija kromosom Philadelphia nastanek proteina BCR-ABL Slika 1: Proces nastanka pospešene proliferacije granulocitov 3

4 Biokemiki so dokazali, da ima molekula N-[2-metil-5-(4-{4-[(4-metilpiperazin-1-il)metil]fenil}-1H- 1,2,3-triazol-1-il)fenil]-4-(piridin-3-il)pirimidin-2-amin (FA030) podobne učinkovite lastnosti inhibicije kot Gleevec. [7] ADME ne predpostavlja nobene pomembne razlike v obnašanju organizma zaradi vpliva FA030. Razlaga je v tem, da se FA030 in Gleevec po kemijski strukturi razlikujeta le po amidni skupini (v Gleevecu), ki je v FA030 zamenjana s triazolnim obročem. [8] VEZAVNO MESTO ABL TIROZIN-KINAZE TEORETIČNA PREDPOSTAVKA Zastavljen cilj je bila sinteza FA030 preko kemijske reakcije dveh fragmentov azida in alkila, ki bi jih ABL tirozin-kinaza vezala na mesto»normalno«vezane ATP molekule. Za preučevanje zmožnosti te vezave je bil uporabljen računalniški program Glide. Najprej se na ATP vezavno mesto z vodikovimi vezmi na aminokislinska konca Met318 in Thr315 veže azid, podobno kot FA030. Zatem se azidu sedaj v vlogi receptorja približa alkin (trojna vez). Njuna medsebojna razdalja je 4,4 Å. Na podlagi teoretičnih izračunov je predpostavljena domneva, da se oba fragmenta vežeta na aktivno mesto ABL tirozin-kinaze, ki sproži klik reakcijo. Poteče 1,3-dipolarna cikloadicija (Huisgenova reakcija), v kateri se iz azida in trojne vezi alkina ustvari triazolni obroč. Slednji je na kinazo povezan z dvema vodikovima vezema na karbonilni skupini Asp318 in His361. Novonastala molekula FA030 je v interakciji s kinazo tudi preko mnogih van der Waalsovih interakcij. [9] Slika 2: Vezava alkina in azida na ABL tirozin-kinazo Slika 3: Vezana molekula FA030 na ABL tirozin-kinazo 4

5 EKSPERIMENTALNI DEL Najprej sta bili v fosfatni pufer dodani dve različni koncentraciji določenega azida in alkina (0,25 in 0,370 μm) kot tudi ABL tirozin-kinaze (0,0185 in 0,370 μm). Za kontrolni vzorec sta bili dodani enaki koncentraciji azida in alkina brez dodane kinaze. Reakcijske zmesi so bile inkubirane in termostatirane na 37 C za 4 dni ter nato preučevane z masno spektrometrijo (ICP-FT-MS). Pri obeh reakcijskih zmeseh z dodano ABL tirozin-kinazo je bil zaznan odziv inštrumenta na novo sintetizirani FA030. Prisotnost FA030 je bila dokazana tudi s tekočinsko kromatografijo (HPLC). Da bi izključili vsakršno možno katalitsko aktivnost zaradi nepričakovane prisotnosti bakra, ki se nahaja v pufrih, je bila s spektrometrijo določena koncentracija tega in še drugih prehodnih kovin. Zaključek je, da so bile koncentracije v pufrih mnogo manjše od dokazano potrebne katalitske koncentracije za sintezo triazola po Sharplessu. [10] SELEKTIVNA SINTEZA INHIBITORJA Da bi določili efektivnost sinteze najboljšega inhibitorja, so v naslednjem eksperimentu namesto enega dodali dva različna azida in pet različnih alkinov. V fosfatni pufer so bile pod enakimi pogoji skupaj dodane enake koncentracije vseh reaktantov (370 μm) in kinaza (0,370 μm). Za kontrolni vzorec je služila reakcijska zmes vseh reaktantov brez prisotnosti kinaze. S tekočinsko kromatografijo (HPLC) in masno spektrometrijo (HR-ESI MS) je bil dokazan le FA030 brez katerih koli drugih spojin, za katere je znano, da so neaktivne pri zaviranju ABL aktivnosti. Ker tudi kontrolna raztopina ni potrdila nobenih novonastalih molekul, je bila znova dokazana zmožnost klik reakcije v prisotnosti kinaze. Po teh opažanjih lahko potrdimo, da je ABL tirozin-kinaza zmožna selektivno sintetizirati najboljšega inhibitorja. [11] in situ klik Slika 4: Rezultati meritev MS (levo zgoraj) in HPLC (desno zgoraj, spodaj), viala z reakcijsko zmesjo (levo spodaj) 5 Slika 5: Selektivna in situ klik reakcija

6 ZAKLJUČEK Z danimi rezultati lahko potrdimo pomembnost sintezne in situ klik kemije. Z njo bodo v prihodnosti možne še druge selektivno izbrane sinteze pri zaviranju tudi drugih tirozinskih kinaz. Vendar je pomembno poudariti, da izbiranje gradnikov oz. fragmentov, ki reagirajo v inhibitorje, ne sme biti naključno, saj lahko to vodi neželene deaktivacije drugih tirozin-kinaz, pomembnih za signalizacijo v celicah. Detekcija želenih spojin z instrumentalno masno spektrometrijo (HR-ESI MS) odpira več poti za pripravo in preučevanje molekul v vlogi glavnih gradnikov bioloških makrosistemov. Sintezni produkti klik kemije, v kateri nastanejo triazolni obroči, se lahko še naprej substituirajo z amidnimi ali drugimi skupinami. Te bi še izboljšale biološko delovanje v organizmih, s tem pa bi se okrepil imunski sistem in zmanjšal verjetnost za nastanek novih obolenj. [12] VIRI IN LITERATURA TEKST [1], [4], [6] Pajič, T.; Marc, J.; Preložnik Zupan, I. Farm. vestn. 2013, 64, [2], [8], [9], [10], [11], [12] Peruzzotti, C.; Borrelli, S.; Ventura, M.; Pantano, R.; Fumagalli, G.; S. Christodoulou, M.; Monticelli D.; Luzzani, M.; Fallacara, A. L.; Tintori, C.; Botta, M.; Passarella, D. ACS Med. Chem. Lett., 2013, 4 (2), [3], [5] Goldman, J. M. Semin. Hematol., 2010, 47 (4), [7] Arioli, F.; Borrelli, S.; Colombo, F.; Falchi, F.; Fillipi, I.; Crespan,E.; Naldini, A.; Scalia, G.; Silvani, A.; Maga, G.; Carraro, F.; Botta, M.;Passarella, D. Chem. Med. Chem. 2011, 6, SLIKOVNO GRADIVO Naslovna slika: Peruzzotti, C.; Borrelli, S.; Ventura, M.; Pantano, R.; Fumagalli, G.; S. Christodoulou, M.; Monticelli D.; Luzzani, M.; Fallacara, A. L.; Tintori, C.; Botta, M.; Passarella, D. ACS Med. Chem. Lett., 2013, 4 (2), Slika 1: The BCR-ABL Gene and its Effects on the Body dostopno na: ( ) Slike 2, 4 in 5: Peruzzotti, C.; Borrelli, S.; Ventura, M.; Pantano, R.; Fumagalli, G.; S. Christodoulou, M.; Monticelli D.; Luzzani, M.; Fallacara, A. L.; Tintori, C.; Botta, M.; Passarella, D. ACS Med. Chem. Lett., 2013, 4 (2), Slika 3: Arioli, F.; Borrelli, S.; Colombo, F.; Falchi, F.; Fillipi, I.; Crespan,E.; Naldini, A.; Scalia, G.; Silvani, A.; Maga, G.; Carraro, F.; Botta, M.;Passarella, D. Chem. Med. Chem. 2011, 6,