DOLOČITEV PRIDOBLJENIH MUTACIJ V GENU BCR-ABL1 S SEKVENCIONIRANJEM PRI BOLNIKIH S KRONIČNO MIELOIČNO LEVKEMIJO

Transcript

1 UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO DOLOČITEV PRIDOBLJENIH MUTACIJ V GENU BCR-ABL1 S SEKVENCIONIRANJEM PRI BOLNIKIH S KRONIČNO MIELOIČNO LEVKEMIJO DETECTION OF ACQUIRED MUTATIONS IN BCR-ABL1 GENE BY SEQUENCING IN PATIENTS WITH CHRONIC MYELOID LEUKEMIA DIPLOMSKA NALOGA LJUBLJANA, 2011

2 Diplomsko nalogo sem opravljal v Specializiranem hematološkem laboratoriju Kliničnega oddelka za hematologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, pod mentorstvom prof. dr. Petra Černelča, dr. med. in somentorstvom asist. dr. Tadeja Pajiča, univ. dipl. inž. kem. inž., spec. med. biokem. Zahvala Na tem mestu bi se najlepše zahvalil celotnemu osebju Specializiranega hematološkega laboratorija. Zahvaljujem pa se tudi svoji družini in mojim najbližjim, ki so mi ves čas študija stali ob strani in mi pomagali. Izjava Izjavljam, da sem diplomsko nalogo samostojno izdelal pod mentorstvom prof. dr. Petra Černelča, dr. med. in somentorstvom asist. dr. Tadeja Pajiča, univ. dipl. inž. kem. inž., spec. med. biokem. Predsednik komisije: izr. prof. dr. Darko Černe, mag. farm. Član komisije: doc. dr. Anamarija Zega, mag. farm. Ljubljana, 2011 I

3 VSEBINA POVZETEK...VII SEZNAM OKRAJŠAV... VIII 1. UVOD KROMOSOMSKA NEPRAVILNOST T(9;22)(Q34;Q11) IN ZLITI GEN BCR-ABL MIELOPROLIFERATIVNE NOVOTVORBE KRONIČNA MIELOIČNA LEVKEMIJA UGOTAVLJANJE DIFERENCIALNA DIAGNOSTIKA PROGNOZA BOLEZNI ZDRAVLJENJE IMATINIB MEZILAT SPREMLJANJE USPEŠNOSTI ZDRAVLJENJA Z IMATINIBOM REZISTENCA NA IMATINIB VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO SEKVENCIONIRANJE NAMEN DELA PREISKOVANCI IN NAČINI DELA PREISKOVANCI METODE NAČIN DELA OSAMITEV LEVKOCITOV OSAMITEV RNA PREKO TRIZOLA PRIPRAVA KOMPLEMENTARNE DNA ČIŠČENJE PRODUKTOV REAKCIJE PCR Z HIDROLITIČNIMA ENCIMOMA ELEKTROFOREZA NUKLEINSKIH KISLIN OSAMITEV PCR PRODUKTOV IZ POSEBNIH AGAROZNIH GELOV DOLOČITEV MUTACIJ V FUZIJSKEMU GENU BCR-ABL1 S SEKVENCIONIRANJEM II

4 ČIŠČENJE PRODUKTOV SEKVENČNE REAKCIJE Z REAGENČNIM KOMPLETOM BIGDYE XTERMINATOR PURIFICATION KIT ČIŠČENJE PRODUKTOV SEKVENČNE REAKCIJE PO POSTOPKU ETANOLNE PRECIPITACIJE REZULTATI IN RAZPRAVA OPTIMIZACIJA POGOJEV PCR IN SEKVENCIONIRANJA PRVI PREIZKUS REZULTAT DRUGI PREIZKUS REZULTAT TRETJI PREIZKUS REZULTAT ČETRTI PREIZKUS REZULTAT PETI PREIZKUS REZULTAT ŠESTI PREIZKUS REZULTAT SEDMI PREIZKUS REZULTAT OSMI PREIZKUS REZULTAT DEVETI PREIZKUS REZULTAT IZSLEDKI MUTACIJSKE ANALIZE ZAKLJUČKI LITERATURA III

5 VSEBINA RAZPREDELNIC TABELA 1: MUTACIJE V GENU BCR-ABL1, KI JIH DOLOČAMO Z ALELNO SPECIFIČNIM PCR- JEM V SHL TABELA 2: PRIPRAVA REAKCIJSKE MEŠANICE ZA CDNA TABELA 3: POGOJI REAKCIJE SINTEZE CDNA S REAKCIJSKO MEŠANICO TABELA 4: SEZNAM IN ZAPOREDJA ZAČETNIH OLIGONUKLEOTIDOV TABELA 5: PRIPRAVA REAKCIJSKE MEŠANICE ZA PRVI PCR OB DOLOČITVI MUTACIJ V GENU BCR - ABL TABELA 6: POGOJI PRVE REAKCIJE PCR ZA DOLOČITEV MUTACIJ V FUZIJSKEM GENU BCR - ABL TABELA 7: REAKCIJSKE MEŠANICE ZA VGNEZDENI PCR OB DOLOČITVI MUTACIJ V GENU BCR - ABL1 OB POMNOŽEVANJU FRAGMENTOV B, C IN D TABELA 8: POGOJI DRUGE REAKCIJE - VGNEZDENEGA PCR ZA DOLOČITEV MUTACIJ V FUZIJSKEM GENU BCR - ABL1. POMNOŽEVALI SMO FRAGMENTE B, C IN D TABELA 9: POGOJI SEKVENČNE REAKCIJE PCR ZA DOLOČITEV MUTACIJ V FUZIJSKEM GENU BCR - ABL TABELA 10: PRIPRAVA REAKCIJSKE MEŠANICE ZA SEKVENČNO REAKCIJO TABELA 11: VOLUMEN REAGENTA SAM SOLUTION, KI GA DODAMO K PRODUKTOM REAKCIJE PCR TABELA 12: VOLUMEN REAGENTA BIGDYE XTERMINATOR SOLUTION, KI GA DODAMO K PRODUKTOM REAKCIJE PCR Z DODANIM REAGENTOM SAM TABELA 13: SESTAVA REAKCIJSKE MEŠANICE ZA FRAGMENT A (F1A IN F2A) TABELA 14: POGOJI PCR REAKCIJE (KLASIČEN PCR) TABELA 15: POGOJI PCR REAKCIJE (»TOUCHDOWN«PCR) TABELA 16: POGOJI ZA PCR REAKCIJO ZA FRAGMENT B, C IN D IV

6 TABELA 17: REAKCIJSKE MEŠANICE ZA VGNEZDENI PCR OB DOLOČITVI MUTACIJ V GENU BCR - ABL1 OB POMNOŽEVANJU FRAGMENTOV B, C IN D Z RAZLIČNIMI KONCENTRACIJAMI MGSO TABELA 18: POGOJI ZA PCR REAKCIJO ZA FRAGMENT D. RAZLIČNE TEMPERATURE PRILAGAJANJA OLIGONUKLEOTIDNIH ZAČETNIKOV TABELA 19: POGOJI PCR REAKCIJE (»TOUCHDOWN«PCR) ZA FRAGMENT D TABELA 20: REZULTATOV ANALIZE SEKVENC BCR-ABL VSEBINA SLIK SLIKA 1: PRIKAZ NASTANKA KROMOSOMA PHYLADEPHIA [21]... 2 SLIKA 2: PELGEROIDNA NEPRAVILNOST JEDROV NEVTROFILNIH GRANULOCITOV [22] SLIKA 3: STRUKTURNA FORMULA IMATINIB MESILATA.[23]... 8 SLIKA 4. PRIKAZ BCR-ABL1 MUTACIJI IN POLIMORFIZMOV [10] SLIKA 5: PRIKAZ ŠTIRIH VRST MUTACIJ V GENU ABL1.[15] SLIKA 6: SHEMATSKI PRIKAZ VERIŽNE REAKCIJE S POLIMERAZO.[25] SLIKA 7: MEHANIZEM DELOVANJA SEKVENCIONATORJA [16] SLIKA 8: IBASE SLIKA 9: SHEMATIČEN PRIKAZ REAKCIJ PCR OB DOLOČITVE MUTACIJ V GENU ABL SLIKA 10: SHEMATIČEN PRIKAZ ELEKTROFEROGRAMOV Z NORMALNIM IN SPREMENJENIM ENIM NUKLEOTIDOM V HETEROZIGOTNI OBLIKI. OBA ALELA STA PRISOTNA V PRIBLIŽNO ENAKI KOLIČINI - VRHOVA OBEH BARV STA ENAKO VISOKA SLIKA 11: SHEMATIČEN PRIKAZ ELEKTROFEROGRAMOV S SPREMENJENIM NUKLEOTIDNIM ZAPOREDJEM V HETEROZIGOTNI OBLIKI V RAZLIČNI KONCENTRACIJI ALELOV SLIKA 12: ELEKTROFOREZA NEOPTIMIZIRANEGA PCR-JA ZA FRAGMENT A V

7 SLIKA 13: ELEKTROFOREZA OPTIMIZIRANEGA PCR-JA ZA FRAGMENT A SLIKA 14: OPTIMIZACIJA PCR-JA ZA FRAGMENT D PRI RAZLIČNIH KONCETRACIJAH MGSO SLIKA 15: SLIKA ELEKTROFOREZNE LOČBE PCR PRODUKTOV ZA FRAGMENT B, C IN D SLIKA 16: SLIKA ELEKTROFOREZNE LOČBE PCR PRODUKTOV ZA FRAGMENT B, C IN D PO ČIŠČENJU S EXOSUPOM SLIKA 17: OPTIMIZACIJA FRAGMENTA D S RAZLIČNIMI KONCENTRACIJAMI OLIGONUKLEOTIDNIH ZAČETNIKOV SLIKA 18: ELEKTROFOREZA PCR PRODUKTA FRAGMENT B SLIKA 19:ELEKTROFOREZA PCR PRODUKTA FRAGMENT C SLIKA 20: ELEKTROFOREZA PCR PRODUKT FRAGMENT D SLIKA 21: ELEKTROFOREZA PO OSAMITVI PRODUKTOV B IN C Z SIZE SELECT 2 % GELI SLIKA 22: ELEKTROFOREZA PO OSAMITVI PRODUKTA D Z SIZE SELECT 2% GELI SLIKA 23: VZOREC 6, FRAGMENT B; ZA SEKVENCIONIRANJE SMO UPORABILI SMERNI OLIGONUKLEOTID ABL - F3B (GLEJ TABELO 20) SLIKA 24:VZOREC 20, FRAGMENT B; ZA SEKVENCIONIRANJE SMO UPORABILI SMERNI OLIGONUKLEOTID ABL - F3B (GLEJ TABELO 20) SLIKA 25:VZOREC 9, FRAGMENT C; ZA SEKVENCIONIRANJE SMO UPORABILI SMERNI OLIGONUKLEOTID ABL - F4C (GLEJ TABELO 20) VSEBINA PREGLEDNIC PREGLEDNICA I: RAZVRSTITEV MIELOPROLIFERATIVNIH NOVOTVORB PO SZO (2008) [1] 3 VI

8 POVZETEK V osemdesetih letih so raziskovalci odkrili, da je z nastankom kromosoma Philadelphia povezan zliti gen BCR - ABL1, ki se pojavlja pri več kot 95 % primerov kronične mieloične levkemije (KML). Zliti gen BCR - ABL1 kodira s citokini uravnavano tirozinsko kinazo, ki spodbuja celice k stalni proliferaciji, kar povzroči, da celice postanejo rakaste. Pri bolnikih s kronično mieloično levkemijo (KML), pri katerih kljub zdravljenju z inhibitorjem tirozinske kinaze s standardnimi preiskavami ne zaznamo odziva na zdravljenje ali pa je po uspešnem zdravljenju prišlo do ponovitve bolezni, obstaja velika verjetnost, da dokažemo prisotnost pridobljenih mutacij v odseku gena ABL1 zlitega gena BCR-ABL1. Mutacije lahko določimo s sekvencioniranjem dela odseka gena ABL1. Z načinom sekvencioniranja lahko kljub manjši občutljivosti metode ugotovimo vse klinično najpomembnejše mutacije v odseku gena ABL1. Namen naloge je bil vpeljava metode določitve pridobljenih mutacij v genu BCR-ABL1 s sekvencioniranjem pri bolnikih s KML. Postavili smo hipotezo, da lahko s sekvencioniranjem odseka gena ABL1 določimo vse klinično najpomembnejše mutacije. Da bi hipotezo dokazali, smo določili optimalno koncentracijo reagentov in pogoje verižne reakcije s polimerazo, ki smo jo izvedli v dveh stopnjah po obratnem prepisovanju RNA z encimom reverzno transkriptazo. Pridobili smo produkt segmenta gena ABL1 v zlitem genu BCR-ABL1, ki smo ga osamili iz posebnega agaroznega gela z elektroforezo in nato izvedli sekvenčno reakcijo ter očistili nastale produkte s komercialno pripravljenim reagentom. Z optimiziranim postopkom smo dobili kakovostne rezultate sekvencioniranja, ki nam v omogočajo analizo nukelotidnega zaporedja, ki kodira aminokisline od 202 do 521 mesta aminokislinskega zaporedja proteina BCR-ABL1. Optimiziran postopek smo preizkusili na 6 vzorcih bolnikov s KML, ki smo jih dobili s sodelovanjem v podprojektu projekta EUTOS, ugotavljanja pridobljenih mutacij v genu BCR-ABL1, ki je v času izdelave diplomske naloge še v teku. V treh od šestih vzorcih smo z načinom ugotovili prisotnost mutacij. V enem vzorcu smo določili prisotnost dveh mutacij, T315I in F317L. V drugem smo ugotovili mutacijo E255K in v tretjem mutacijo V359F aminokislinskega zaporedja proteina BCR-ABL1. Optimiziran postopek je primeren za redno delo v laboratoriju. VII

9 SEZNAM OKRAJŠAV AFL alkalna fosfataza granulocitov AL akutna levkemija AML akutna mieloična levkemija cdna komplementarna DNA DNA deoksiribonukleinska kislina DNaza encim, ki cepi DNA dntp deoksinukleotid ddntp dideoksinukleotid EDTA etilendiamintetraocetna kislina HLA tkivni antigeni, ki morajo biti skladni s prejemnikom kostnega mozga KML kronična mieloična levkemija M molarnost, koncentracija (mol/l) mrna informacijska RNA PBS fosfatni pufer s soljo PCR verižna reakcija s polimerazo Ph kromosom spremenjen kromosom 22 RNA ribonukleinska kislina Rnaza encim, ki cepi RNA SHL speciliziran hematološki laboratorij TK tirozin kinaza TKIs Inhibitorji tirozinske kinaze Touchdown PCR PCR s padajočo temperaturo prileganja začetnih oligonukleotidov VIII

10 1. UVOD 1.1. KROMOSOMSKA NEPRAVILNOST t(9;22)(q34;q11) IN ZLITI GEN BCR-ABL1 Nowel in Hungerford sta leta 1960 odkrila in opisala kromosom, ki sta ga našla pri kronični granulocitni levkemiji in ga imenovala Philadelphia (Ph) po mestu, kjer sta delala [27]. Leta 1973 je Rowley s posebnim proganjem kromosomov pokazala, da kromosom Ph nastane kot posledica uravnotežene tranlokacije med deloma kromosoma 9q34 in 22q11 [28]. To je bila prva konzistentna kromosomska nepravilnost, ki so jo povezali z malignim obolenjem. V osemdesetih letih so raziskovalci odkrili, da je z nastankom kromosoma Ph povezan zliti gen BCR ABL1, ki se pojavlja pri več kot 95 % primerov kronične mieloične levkemije (KML). Ta patološki kromosom in zliti gen BCR-ABL1 se pojavlja tudi v 25 % primerov odraslih bolnikov z akutno limfatično levkemijo (ALL) in v 3 % pri otrocih z ALL. Pri akutni mieloični levkemiji (AML) jo dokažemo v manj kot 1 %. Na molekularni ravni je kromosom Ph ali translokacija t(9;22) (q34;q11) posledica premestitve 5' konca gena BCR, ki se nahaja na kromosomu 22q34, na 3' del gena ABL1 na kromosomu 9q11. Kromosom Ph je skrajšan kromosom 22, po čemer ga tudi prepoznamo. Znotraj kromosoma 9 in 22 je znanih več področjih, kjer pride do preloma. Iz prelomov in translokacij v manjšem (minor) prelomnem območju mbrc, običajno nastane prepis e1- a2, ki kodira protein molekularne mase (p190). Iz prelomov in translokacij v večjem (makro) prelomnem področju napogosteje nastaneta prepisa e14-a2 (b3-a2) ali e13- a2 (b2-a2), ki kodirata protein molekularne mase (p210). Kot posledica prelomov v mikro prelomnem območju pa nastane protein p230. Možni so tudi drugi prepisi, kot so c3-a2, b2-a3, b3-a3, e6-a2, e1-a3, e8-a4 itd, ki so veliko redkejši. Različne oblike onkogena BCR-ABL1 so povezane z različnimi vrstami levkemij. Protein p190 je v % povezan z ALL, p210 je v 90 % povezan s KML in p230 s podskupino bolnikov s kronično nevtrofilno levkemijo [4]. 1

11 Novi himerni gen BCR-ABL1 (Slika 1) kodira s citokini uravnavano tirozinsko kinazo, ki spodbuja celice k stalni proliferaciji, kar povzroči, da celice postanejo rakaste in se neomejeno delijo. Zliti gen BCR-ABL1 je pod kontrolo promotorja gena BCR in je konstitutivno izražen. Proteini p190, p210 in p230 so konstitivno aktivne pleiotropne molekule, pri tem pa imajo proteini p190 višjo aktivnost tirozinske kinaze kot pa encima p210 in p230, ter so zato najverjetneje vpleteni v razvoj KML in ALL z agresivnejšim fenotipom. Pri posameznem bolniku se lahko sočasno pojavlja več različnih prepisov in fuzijskih proteinov, kot so e1-a2 (p190) in b3-a2 (p210), kar je redek pojav [7,26]. Slika 1: Prikaz nastanka kromosoma Phyladephia [21] MIELOPROLIFERATIVNE NOVOTVORBE Mieloproliferativne novotvorbe so skupina kronično potekajočih krvnih bolezni, pri katerih je zvečano nastajanje krvnih celic zaradi motnje na ravni matične krvotvorne celice. Zaradi učinkovite hematopoeze naraste število levkocitov, eritrocitov in trombocitov v periferni krvi. Razraščajo se celice kostnega mozga z znaki dozorevanja in brez displastičnih sprememb. Bolezen opredelijo na osnovi kliničnih znakov, krvni sliki in drugih laboratorijskih preiskavah, citoloških in histoloških preiskavah kostnega mozga in drugega tkiva, citogenetskih in v vse večjem obsegu na osnovi molekularno genetskih sprememb. Bolezni imajo precej skupnih kliničnih značilnosti. Potek je večinoma dolgotrajen, v 2

12 končnem obdobju pa pospešen ali pa ima značilnosti akutne levkemije. Ena oblika bolezni lahko prehaja v drugo, vendar to ni običajno. Bolniki so nagnjeni h krvavitvam in trombozam v skladu z znaki in simptomi, povezanih z razrastjo hematopoetske vrste. Preglednica 1 prikazuje razvrstitev mieloproliferativnih novotvorb po Svetovni zdravstveni organizaciji (SZO) [1]. Preglednica I: Razvrstitev mieloproliferativnih novotvorb po SZO (2008) [1]. kronična mieloična levkemija, BCR-ABL1 pozitivna (KML), kronična nevtrofilna levkemija (KNL), policitemija vera (PV), primarna mielofibroza (PMF), esencialna trombocitemija (ET), kronična eozinofilna levkemija BDO (KEL), mastocitoza, neklasificirane MPN 1.3. KRONIČNA MIELOIČNA LEVKEMIJA Kronična mieloična levkemija (KML) je maligna novotvorba krvotvorne matične celice in jo uvrščamo med mieloproliferativne novotvorbe [3]. Je klonska bolezen. Pojavnost bolezni je 1 do 2 bolnika na prebivalcev. Najbolj pogosta je med petdesetim in šestdesetim letom starosti. Pri otrocih je zelo redka. Pogosteje obolevajo moški. Pri večini bolnikov v spremenjenih celicah ugotovimo kromosom Philadelphia, oziroma zliti onkogen BCR-ABL1. Če je klon genetično nestabilen, lahko kasneje povzroči nastanek sekundarne akutne levkemije z drugimi kromosomskimi spremembami [1]. Naravni potek bolezni traja 3-5 let in gre skozi tri različna obdobja: kronično, v katerem odkrijejo 85 % bolnikov; pospešeno obdobje, ko nevtrofilni granulociti izgubljajo sposobnost diferenciacije, število levkocitov pa postopno narašča; blastno preobrazbo, stanje enako akutni levkemiji [1, 5, 6]. 3

13 UGOTAVLJANJE Za potrditev diagnoze KML potrebujejo celotno krvno sliko, punkcijo in biopsijo kostnega mozga za citološki in histološki pregled ter dokaz o prisotnosti Ph-kromosoma ali produkta Ph-kromosoma, zlitega gena BCR-ABL1. S standardno citogenetsko preiskavo (kariotip) dokažejo Ph-kromosom. Zliti gen BCR-ABL1 lahko dokažejo tudi s potrditvijo prisotnosti za zliti gen BCR-ABL1 značilnega mrna prepisa z obratnim prepisovanjem in verižno reakcijo s polimerazo (RT-PCR) ali s fluorescenčno hibridizacijo in situ (FISH) v vzorcu periferne krvi ali kostnega mozga. Pri bolnikih mlajših od 65 let je smiselna HLA tipizacija [3]. Pri KML število levkocitov v periferni krvi ponavadi naraste na 50 do 200 x 10 9 /L. Največ je zrelih nevtrofilnih granulocitov, najdemo pa vse stopnje dozorevanja do mieloblasta. V kronični fazi bolezni število mieloblastov in promileocitov v krvi ni višje od 20 %. Število eozinofilcev in bazofilcev pa le malo naraste. Morfološka zgradba celic je lahko povsem normalna. Občasno je prisotna pelgeroidna anomalija jeder nevtrofilnih granulocitov (slika 2). V obdobju blastne preobrazbe število promielocitov in mieloblastov naraste. Naraste pa lahko tudi število bazofilnih granulocitov. Anemije na začetku blastne preobrazbe še ni ali pa je blaga, kasneje pa se anemija s stopnjevanjem bolezni slabša. Anemija je normokromna in normocitna in je posledica zmanjšane eritropoeze. Zaradi povečane vranice pa je tudi zmanjšano preživetje eritrocitov. Število trombocitov je pri 50 % pacientov povišano. Če se normalno število trombocitov kasneje poviša, je to lahko to znak metamorfoze. Trombociti so morfološko normalni, ni pa normalna njihova funkcija [1,14]. 4

14 Slika 2: Pelgeroidna nepravilnost jedrov nevtrofilnih granulocitov [22]. V kronični fazi je pri 90 % pacientov v nevtrofilnih granulocitih zmanjšana ali popolnoma odsotna aktivnost alkalne fosfataze. V kostnem mozgu maščobnih celic ni, je pa povečana gostota celic. Prevladujejo celice granulocitne vrste, predvsem mielociti in metamielociti. Številni so tudi bazofilni granulociti in eozinofilni granulociti. Razmerje števila granulocitov proti eritroblastom je zvišano od 10:1 do 50:1. Številčnejši so tudi megakariociti. Celice nevtrofilne vrste kažejo znake motenj dozorevanja jedra, citoplazme in tudi granulacij. Zaradi zvečanja števila retikulinskih vlaken v obdobju blastne preobrazbe je lahko punkcija kostnega mozga suha, kar pomeni, da v punktatu ni krvotvornih matičnih celic. V blastni preobrazbi je v kostnem mozgu in tudi v krvi več kot 20 % levkemičnih blastnih celic. Blastne celice imajo v % morfološke, citokemične in imunološke značilnosti limfoblastov. Metamorfoza KML je pogosto podobna akutni mieloični levkemiji, redkeje monoblastni, eritrolevkemiji, megakariocitni levkemij in bazofilni levkemiji. Auerjevih palčk, ki so značilne promielocitno levkemijo pri KML nikoli ne vidijo. V krvi je lahko zvišana koncentracija sečne kisline in povišana aktivnost laktat dehidrogenaze. Pri pacientih z velikim številom levkocitov in trombocitov je lahko prisotna psevdohiperkaliemija zaradi povečanega sproščanja kalija iz celic. V serumu sta zvišani koncentraciji vitamina B 12 in transkobalmina [1]. 5

15 DIFERENCIALNA DIAGNOSTIKA Pri diferencialni diagnostiki KML je pomembno predvsem to, da KML ločijo od ostalih mieloproliferativnih novotvorb. Pomembno je da ločijo primarno mielofibrozo od KML. Pomembno je tudi, da KML ločijo od levkemoidnih reakcij, ki jih najdejo pri obsežnih krvavitvah, hemolizi in zdravljenju s kortikosteroidi, kjer kromosom Ph ni prisoten, vrednost alkalne fosfataze nevtrofilcev pa je povišana. Če se z bolnikom srečajo prvič šele v obdobju blastne preobrazbe, morajo ločiti KML od akutne levkemije. Pri KML je vranica bolj povečana kot pri akutni levkemiji. V periferni krvi ni prisotne eozinofilije in bazofilije, ne najdemo pa tudi vmesnih oblik nevtrofilcev [1] PROGNOZA BOLEZNI Dejavnike za oceno napoved izida bolezni razdelijo v dve skupini: - tiste ob odkritju bolezni in - dejavnike, ki jih spremljajo med zdravljenjem [29]. Glavna začetna dejavnika sta obdobje KML ob odkritju bolezni-kronično, pospešeno obdobje ali blastna preobrazba in relativno tveganje bolezni, ki ga izračunajo iz kliničnih in laboratorijskih podatkov po Sokalu ali/in Hasfordu [30, 31]. Med zdravljenjem je napovedno pomembno, kdaj dosežemo hematološki, citogenetski in molekularno genetski odgovor, ter stopnja odgovora. Čim boljši je rezultat, ki ga dosežejo v določenem obdobju, tem daljše je preživetje brez bolezni ZDRAVLJENJE Cilj zdravljenja KML je odstraniti Ph+ celice iz krvi in kostnega mozga. V zadnjem desetletju se je shema zdravljenja KML v celoti spremenila. Natančno razumevanje molekularne okvare je omogočilo razvoj selektivnih zaviralcev tirozinske kinaze, ki zavirajo BCR.ABL1 tirozinsko kinazo [3, 29]. 6

16 Imatinib mezilat, originalno imenovan STI571, je komercialno dostopen od maja Zdravilo je inhibitor tirozinskih kinaz. Selektivno preprečuje proliferacijo celic z onkogenom BCR-ABL1. Med inhibitorje tirozinske kinaze druge generacije uvrščajo dasatinib, nilotinib in bosutinib. Dasatinib (BMS ) je oralni, več-ciljni inhibitor tirozinskih kinaz. Je močnejši od imatiniba in vitro in je aktiven proti vsem znanim mutacijam BCR-ABL1, ki povzročajo rezistenco na imatinib, razen na prisotnost mutacije T315I. Nilotinib (AMN107) je strukturni derivat imatiniba. Vzame se ga peroralno in je visoko selektiven inhibitor BCR-ABL1 tirozinske kinaze. Je 20 do 50 krat močnejši od imatiniba, učinkovit pri mnogih mutacijah BCR-ABL1, razen za mutacijo T315I. Bosutinib (SKI606), SRC/ABL1 kinazni inhibitor, je še v postopku raziskovanja. Med inhibitorje tirozinskih kinaz tretje generacije uvrščajo aurora kinazne inhibitorje, ki so aktivni tudi proti mutaciji T315I, vendar je njihova uporaba prav tako še v fazi raziskovanja IMATINIB MEZILAT Mezilatna sol (Slika 3) imatiniba je tirozinski inhibitor s protineoplastično aktivnostjo. Imatinib zasede TK aktivno mesto. Tako prepreči vezavo ATP in posledično prepreči fosforilizacijo proteina. Zmanjša se aktivnost rastnih faktorjev in prenos njihovih signalov po signalnih poteh. Zdravilo inhibira aktivno mesto TK, kodirane z onkogenom BCR- ABL1, C-kitom in TK kodirane z onkogenom PDGFR. Inhibicija TK BCR-ABL1 se odraža v zmanjšani proliferaciji in okrepljeni apoptozi v Ph pozitivnih malignih celicah pri KML in ALL. Pri inhibiciji TK C-kit se zmanjša proliferacija mastocitov, kar se uporablja za zdravljenje mastocitoze in gastrointestinalnih stromalnih tumorjev [9]. 7

17 Slika 3: Strukturna formula imatinib mesilata.[23] SPREMLJANJE USPEŠNOSTI ZDRAVLJENJA Z IMATINIBOM Med zdravljenjem KML z imatinibom zdravnike zanima odgovor na zdravljenje, kjer so pomembni določeni dejavniki in mejniki, ki vključujejo trajanje zdravljenja, odmerek zdravila in odgovor na zdravljenje v določenem časovnem obdobju. Uspešnost zdravljenja spremljajo s hematološkim, citogenetskim in molekularnim odgovorom. Za ta namen bolnika redno spremljajo klinično in laboratorijsko. Uspešnost zdravljenja z imatinibom spremljajo s celotno krvno sliko, standardno citogenestko analizo celic kostnega mozga in z obratnim prepisovanjem in kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (RT-qPCR). Določanje števila kopij BCR-ABL1 mrna prepisa z RT-qPCR je najpomembnejša preiskava za spremljanje uspešnosti zdravljenja bolnikov s KML. Hematološki odgovor je popoln, kadar je normalna bela krvna slika in je v krvi manj kot /L levkocitov, normalna mora biti tudi koncentracija hemoglobina in število trombocitov ter netipljiva vranica pri fizikalnem pregledu. Citogenetični odgovor je ocenjen glede na delež metafaz s t(9; 22) v kostnem mozgu. Citogenetični odgovor Major (glavni) je kadar najdemo manj kot 35 % t(9; 22) pozitivnih metafaz v kostnem mozgu. Citogenetični odgovor je popoln kadar v kostnem teh metafaz ni [1, 20]. Molekularni odgovor pa določimo glede na stopnjo BCR-ABL1 prepisa določenega z RT-qPCR. Predlagana je bila standardizirano številčno mednarodno merilo (IS), kjer je izsledek podan 8

18 kot odstotek razmerja BCR-ABL1 in kontrolnega gena. Glavni molekularni odgovor je postavljen na 0,1 % vrednosti BCR-ABL1 kontrolni gen in ustreza zmanjšanju za 3 desetiške logaritme od standardne vrednosti (100 %), ki so jo določili laboratoriji v raziskavi IRIS [32]. V raziskavi IRIS so ugotovili, da velika večina bolnikov s KML, zdravljenih z imatinibom, doseže popolni citogenetski odgovor, in da imajo bolniki, ki dosežejo glavni molekularni odgovor po 12 mesecih zdravljenja z imatinibom zelo veliko verjetnost, da bolezen v 5 letih ne bo napredovala [32, 29]. Trenutno je mogoča ozdravitev KML, le s alogenično presaditvijo krvotvornih matičnih celic. Presaditev se običajno opravi v prvem letu bolezni, ko je pacient v kronični fazi bolezni. Pacient morajo biti mlajši od 55 let in morajo imeti HLA skladnega sorodnega darovalca. Pacienti, ki nimajo sorodnega darovalca morajo biti stari do 35 let, da lahko pri njih opravimo presaditev presaditev krvotvornih matičnih celic nesorodnega HLA skladnega darovalca. Za vsako presaditev kostnega mozga se odločamo individualno glede na citogenetične in molekularno genetske izvide. Uspešnost preseditve kostnega mozga je od % [1] REZISTENCA NA IMATINIB Imatinib je prvo uradno odobreno tarčno zdravilo za zdravljenje pacientov s kronično mieloično levkemijo. Zdravilo večini pacientov nudi pomembno izboljšanje stanja. Kljub temu je določeno število pacientov neodzivnih na zdravljenje z imatinibom, oziroma razvije rezistenco na zdravljenje. Točkovne mutacije v kinazni domeni gena ABL1 so glavni vzrok rezistence na zdravilo. Točkovne mutacije v genu ABL1 so bile določene pri več kot 45 % bolnikov, ki se jim je razvila rezistenca na zdravila - inhibitorje tirozin kinaz. Znani so tudi bolniki, ki se že na začetku slabše odzivajo na zdravljene. Pojavnost rezistence na imatinib, dasatinib in nilotinib je bolj pogosta pri bolnikih z bolj napredovano obliko bolezni. Znanih je že več kot 90 točkovnih mutacij, ki povzročajo spremembe aminokislin na 57 mestih (na Sliki 4 je prikaz nekaterih znanih mutacij in polimorfizmov v genu ABL1). V prvem stolpcu prikazana pozicija nukleotida, v drugem stolpcu kateri nukleotid je zamenjan in tretjem stolpcu katera aminokislina je zamenjana. Posamezne mutacije se pojavljajo z različno frekvenco in imajo tudi različen vpliv na zdravljenje KML. 9

19 Slika 4. Prikaz BCR-ABL1 mutaciji in polimorfizmov [10]. 10

20 Mutacije razdelimo v 4 skupine glede na kristalografsko strukturo ABL1 (Slika 5): Mutacije, ki neposredno otežujejo vezavo imatiniba na katalitično domeno onkogenega proteina BCR-ABL1. Mutacije v vezavnem mestu ATP. Mutacije v aktivacijski domeni, kar preprečuje, da kinaza doseže inaktivno konformacijo, katera je potrebna za vezavo imatiniba. Mutacije v katalitični domeni [8]. Slika 5: Prikaz štirih vrst mutacij v genu ABL1 [15]. Od vseh znanih mutacij, ki povzročajo rezistenco na imatinib, dasatinib in nilotinib, so najbolj pogoste mutacije, ki vključujejo ATP vezavno zanko (P-zanko). In vitro raziskave nakazujejo, da so te mutacije bolj onkogene od ostalih mutacije in divjega tipa BCR-ABL1. Za paciente, ki imajo razvito rezistenco na imatinib, sta bili odobreni novi zdravili dasatinib in nilotinib. Na delovanje slednjih dveh zdravil pa tudi vplivajo nekatere mutacije v genu ABL1. Obe zdravili delujeta pri nekaterih pacientih, ki so rezistentni na imatinib. Čeprav imata različno aktivnost glede na različne mutacije, tudi tiste v P- zanki. Klinične študije kažejo na to, da je dasatinib bolj učinkovit glede na nilotinib pri mutacijah v P- zanki. Ostale mutacije so različno občutljive na zdravljenje z inhibitorji tirozin kinaz druge 11

21 generacije (TKIs). Status P-zanke pri bolnikih s KML in uspešnost TKIs proti mutacijam P-zanke sta dve glavni determinanti, ki opredeljujeta uspešnost zdravljenja in prognozo bolezni [7]. Mutacije v genu ABL1 lahko določamo z reakcijo alelno specifičnega PCR (v Tabeli 1 je prikaz mutaciji, ki jih določamo v Specializiranem hematološkem laboratoriju (SHL)). Ker z omenjeno metodo ne moremo določiti vseh mutacij, ki so vpletene v razvoj rezistence na imatinib, temveč le naštete, želimo v SHL mutacije v genu ABL1 določati tudi z metodo sekvencioniranja. Najpomembnejša omejitev te metode je občutljivost. Zaznamo lahko le mutacije s več kot 20% deležem prisotnosti mutacije, medtem ko je občutljivost alelno specifičnega PCR-ja vsaj 1 %. Tabela 1: Mutacije v genu BCR-ABL1, ki jih določamo z alelno specifičnim PCR-jem v SHL. Mutacija M244V Y253F F317L F359V L248V E255K M343T H396R G250E E255V M351T F486S Y253H T315I E355G 12

22 1.4. VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO Verižna reakcija s polimerazo (PCR) je encimatska tehnika, ki omogoča pomnoževanje želenega specifičnega zaporedja DNA in vitro. S tem ga dejansko pomnožimo in ga lažje določimo ali kloniramo. Pri standardni reakciji PCR pripravimo vzorec DNA, ki ga preiskujemo in zmes reagentov (pufer, deoksiribonukleotidne trifostafe (dntp), par oligonukleotidnih začetnikov, polimerazo Taq DNA)). Začetna oligonukleotida sta zaporedji baznih parov od katerih vsak definira po en konec želenega zaporedja. Zaporedji nukleotidov v začetnih oligonukleotidih sta poznani vendar pa ne smeta biti komplementarni. Optimalna dolžina opazovanega zaporedja naj bi bila baznih paro [16]. Standardna PCR reakcija poteka v 3 stopnjah (Slika 6): 1. Stopnja denaturacije. Temperatura je C. DNA denaturira v dve ločeni vijačnici. 2. Stopnja vzporejanja. Temperaturo znižamo na C. Začetna oligonukleotida se pritrdita na komplementarno zaporedje, vsak na svojo verigo DNA, obrnjena drug proti drugemu s koncema 3`. 3. Stopnja podaljševanja. Temperatura je 72 C. Taq DNA polimeraza sintetizira komplementarno verigo DNA vsaki verigi v smeri 5` 3`. Reakcija poteka hitro, v minuti se sintetizira komplementarno zaporedje, dolžina je odvisna od polimeraze. 13

23 Slika 6: Shematski prikaz verižne reakcije s polimerazo.[25] Taq DNA polimeraza je značilna DNA polimeraza termofilne bakterije Thermus aquaticus in je optimalno aktivna pri temperaturi od 70 do 80 C. V reakciji PCR dobimo dve dvojni vijačnici DNA, obe vključujeta oligonukleotidna začetnika. Isti sklop treh reakcij se ponovi in že po dveh ponovitvah dobimo dve dvojni vijačnici DNA (od osmih), ki sta dolgi toliko kot opazovano zaporedje plus na obeh konci daljši za začetnika. V vsaki ponovitvi je vedno več takšnih produktov. Ponavadi opravimo približno ponovitev, dokler je v mešanici dovolj dntp in oligonuklotidnih začetnikov. Na koncu je potrebno opraviti še zaznavo pridobljenih produktov reakcije PCR, kar običajno storimo z elektroforezo. Detekcija pa lahko poteka že med samo reakcijo PCR, PCR v realnem času [11,12]. 14

24 1.5. SEKVENCIONIRANJE Določanje nukleotidnega zaporedja preiskovanega fragmenta nukleinskih kislin imenujemo sekvencioniranje. Nukleinske kisline običajno najprej pomnožimo z reakcijo PCR. Nato napravimo tako imenovano»sekvenčno reakcijo«kjer poleg običajnih dntp-jev (deoksinukleotidov) uporabljamo tudi (ddntp) dideoksinukleotide. Področje nukleinskih kislin, ki mu želimo določiti nukleotidno zaporedje določimo z izbiro začetnega oligonukleotida, ki se prilega na preiskovani del nukleinske kisline. Z enim poskusom lahko običajno določimo nukleotidno zaporedje nukleinskih kislin, ki je od začetnega oligonukleotida oddaljeno 50 do 500 bp. Običajno za potrditev rezultatov uporabimo dva različna začetna oligonukleotida, tako da določimo nukleotidno zaporedje na obeh verigah. Dideoksinukleotidi so sintetični nukleotidi, ki nimajo OH skupine na 3' ogljikovem atomu sladkorja, in zato se nanje ne morejo več vezati nukleotidi in je tako veriga DNA zaključena in se ne more nadaljevati. Zaradi tega nastanejo fragmenti DNA, ki so različno dolgi. Nastale produkte PCR po reakciji PCR najprej očistimo in nato ločimo v električnem polju s kapilarno elektroforezo, kjer pride do ločitve fragmentov nukleinskih kislin zaradi različne velikosti. Najprej iz kolone pridejo krajši in nato še daljši fragmenti. Običajno za sekvencioniranje uporabljamo dideoksinukleotide, ki so označeni z različnimi flourescentnimi barvili, le-ta po vzbujanju z lasersko svetlobo flourescirajo pri različnih valovnih dolžinah, kar zazna kamera v aparatu za sekvencioniranje (Slika 7). Rezultat sekvencioniranja se izpiše kot elektroferogram. Pridobljene podatke analiziramo z bioinformatičnimi orodji. Slika 7: Mehanizem delovanja sekvencionatorja [16]. 15

25 Aparat (sekvenator) je sestavljen iz kapilare, kjer poteče ločitev nastalih produktov po velikosti. Laserja in kamere, delujeta kot detektor - zaznata flourescentno označene dideoksinukleotide. Poleg elektroferograma dobimo tudi izpisano zaporedje nukleotidov - sekvenca. Zaporedje nukleotidov analiziramo ročno ali pa z različnimi programskimi orodji in ga primerjamo z znanimi nukleotidnimi zaporedji in tako lahko določimo spremembe v zaporedju DNA. Meja detekcije pri sekvencioniranju genskih sprememb je 25 %. Kar pomeni, da mora 25 % molekul nukleinskih kislin vsebovati gensko spremembo, da jo lahko zaznamo [13, 26]. 16

26 2. NAMEN DELA Pridobljene točkovne mutacije v odseku ABL1 zlitega gena BCR-ABL1 vplivajo na odzivnost bolnikov na zdravljenje z inhibitorji tirozinskih kinaz. Z načinom sekvencioniranja lahko kljub manjši občutljivosti metode ugotovimo vse klinično najpomembnejše mutacije v odseku gena ABL1 zlitega gena BCR-ABLI Namen našega dela je bila vpeljava metode določitve mutacij v odseku gena ABL1 zlitega gena BCR-ABL1 s sekvencioniranjem z modificiranjem načina opisanega v članku Ernst in sod [10]. Metodo bomo optimizirati tako, da bomo najprej določili optimalno koncentracijo reagentov in pogoje verižne reakcije s polimerazo v PCR reakciji. Izbrali bomo tudi ustreznejši način osamitve in čiščenja produktov PCR reakcije. Dokazati želimo naslednjo hipotezo: - sekvencioniranje omogoča določitev vseh klinično najpomembnejših mutacij v odseku gena ABL1. Da bi hipotezo dokazali, smo vpeljali in optimizirali postopke določitve pridobljenih mutacij v genu BCR-ABL1 s sekvencioniranjem pri bolnikih s kronično mieloično levkemijo. K delu bomo pristopili tako, da bomo osamili levkocite iz venske krvi. Iz le-teh bomo osamili RNA s trizola. S reverzno transkriptazo bomo sinetetizirali cdna in izvedli PCR reakcije za določitev mutacij v genu BCR-ABL1. Pridobili bomo produkt segmenta gena ABL1 v zlitem genu BCR-ABL1 in nato izvedli sekvenčno reakcijo ter očistili nastale produkte. Metoda določitve mutacij v genu ABL1 zlitega gena BCR-ABL1 s sekvencioniranjem pri bolnikih s KML bo pripomogla k določitvi vseh pridobljenih mutacij v genu ABL1. Rezultati sekvencioniranja bodo v pomoč zdravnikom pri odločitvi o nadaljnem zdravljenju bolnikov, ki so neodzivni na inhibitorje tirozinskih kinaz. 17

27 3. PREISKOVANCI IN NAČINI DELA 3.1. PREISKOVANCI Vpeljavo načina določitve pridobljenih mutacij v genu BCR-ABL1 s sekvencioniranjem smo izvedli na šestih bolnikih s KML, zdravljenih v Hematološki ambulanti kliničnega oddelka za hematologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana, pri katerih je bila raven izražanja fuzijskega gena BCR - ABL1 približno 5 % ali več po mednarodnem merilu. V končnem koraku smo način preverili na naključno izbranih 6 vzorcih od 20 vzorcev cdna bolnikov s KML, ki smo jih dobili s sodelovanjem v podprojektu projekta EUTOS, ugotavljanja pridobljenih mutacij v genu BCR-ABL1, ki je v času izdelave diplomske naloge še v teku METODE Osamitev nukleinskih kislin iz vzorcev venske krvi: Odvzem venske krvi v 10 ml epruveto z antikoagulantom EDTA. Osamitev levkocitov iz venske krvi s hladnim centrifugiranjem in liznim pufrom. Osamitev RNA iz levkocitov s pomočjo trizola. Sinteza cdna Metode določanja mutacij v genu BCR-ABL1 s sekvencioniranjem: Pomnoževanje fragmentov A, B, C in D z reakcijo PCR z modifikacijo načina Ernesta s sodelavci [10]. o Čiščenje produktov reakcije PCR s hidrolitičnima encimoma, ki razgradita enoverižne nukleinske kisline in preostale gradnike DNA, dntp-je. 18

28 o Osamitev produtov reakcije PCR z elektroforezo na posebnih gelih (SIZE SELECT 2 %). Elektroforeza detekcije nukleinskih kislin. Izvedba sekvenčne reakcije PCR. Čiščenje produktov sekvenčne reakcije s Na-acetat, EDTA in etanolom. Čiščenje produktov sekvenčne reakcije s reagenčnim kompletom BigDye XTerminator Purification kit. Sekvencioniranje. Bioinformatična analiza rezultatov NAČIN DELA OSAMITEV LEVKOCITOV RNA smo osamili iz levkocitov, njihovo število smo določili s štetjem na hematološkem analizatorju. Levkocite smo osamili iz venske krvi, tako da smo s pufrom za lizo eritrocitov hemolizirali eritrocite, katerih ostanke smo odstranili med spiranjem s fosfatnim pufrom. Levkociti so se med spiranjem s pufrom PBS centrifugirali na dno centrifugirke. Pripravljene celice smo nato raztopili v reagentu Trizol, iz katerega smo kasneje izolirali RNA. 19

29 Reagenti: Fosfatni pufer s soljo (PBS) 1 x pufer PBS uporabljamo za razredčenje vzorcev periferne krvi in kostnega mozga, za spiranje mononuklearnih celic ter granulocitov in za raztapljanje celic na koncu osamitve. Pripravimo ga iz 10 x pufra PBS 10 x pufer PBS vsebuje 2,0 g KCl, 2,0 g KH 2 PO 4, 80,0 g NaCl in 21,6 g Na 2 HPO 4 x 7 H 2 0. PBS shranjujemo v hladilniku. Voda Uporabljamo sterilno vodo, prosto RNaz in DNaz. Raztopina za lizo eritrocitov Je pufer, ki povzroči lizo eritrocitov in nam tako omogoči izolacijo čistih granulocitov brez eritrocitov ml raztopine vsebuje 8,26 g NH 4 Cl, 1,00 g KHCO 3 in 0,037 g EDTA. Pripravimo 1000 ml raztopine, ki jo shranjujemo v hladilniku. Trizol Je monofazna raztopina, ki se lahko neposredno uporablja za osamitev DNA, RNA in proteinov. Neoporečen reagent je bistra rožnata raztopina, ki vsebuje 50 % fenola in 20 % tiocianatnih spojin. Trizol deluje tako, da ohranja integriteto RNA, uniči pa celične membrane in druge celične strukture. S pomočjo kloroforma kasneje iz trizola naredimo ekstrakcijo RNA in DNA. Reagent je občutljiv na svetlobo in se zato shranjuje v temni steklenički v zaprti omari na sobni temperaturi. Trizol ima zelo močan vonj in je zaradi fenola in tiocianatnih spojin, ki jih vsebuje, močno toksičen. 1 ml reagenta je potrebnega za osamitev celotne RNA iz celic. Pribor in aparature: Sterilne 50 ml centrifugirke, sterilne injekcijske igle in brizge, 1,5 ml sterilne mikrocentrifugirke, viale za zamrzovanje, proste DNaz, sterilni nastavki (prosti RNaz in DNaz), nosilci za epruvetke in pipete, pipete (10, 100 in 1000 µl), sistemi za sterilno filtracijo tekočin (TPP), centrifuge (Biofuge 22-R), orbitalni mešalniki - vorteksi, komore, 20

30 ki omogočajo sterilno delo (Iskra Pio LFVP 12), hematološki analizator (Beckman coulter Coulter LH 750 Analyzer), tehtnica (Tehtnica AX 304), ph meter. Postopek: 1. Naredili smo hemogram in iz tega izračunali volumen krvi z levkocitov. 2. Volumen krvi z levkocitov smo prenesli v 50 ml sterilno centrifugirko. 3. Vzorec smo dopolnili do 45 ml z raztopino za lizo eritrocitov. 4. Premešali z obračanjem. 5. Nato smo inkubirali 10 minut na ledu (eritrociti so popokali), med inkubacijo smo vzorce nekajkrat premešali z obračanjem. 6. Centrifugirali smo 10 minut pri 1700 obr / min, pri + 4 ºC, da so se levkociti posedli na dno centrifugirke. 7. Supernatant smo nato previdno odlili. 8. Oborino celic pa smo raztopili v preostali tekočini. 9. Dodali smo še 25 ml pufra za lizo eritrocitov in ponovno inkubirali 10 min na na ledu. 10. Nato smo centrifugirali 10 minut pri 1700 obr / min pri + 4 ºC. 11. Supernatant smo nato previdno odlili. 12. Celice pa smo raztopili v preostali tekočini. 13. Dodali smo 20 ml hladnega 1 x pufra PBS, premešali z obračanjem, trdno zaprte centrifugirke in centrifugirali 10 min 1700 obr / min + 4 ºC. 14. Nato smo previdno odlili supernatant, in raztopino nad celicami popolnoma odstranili, ter posušili, s tem da smo centrifugirke obrnili navzdol 15. V centrifugirko smo dodali 1 ml Trizola ter celice in Trizol nekajkrat premešali s pipeto. 21

31 16. Vzorec smo homogenizirali, tako da smo celice vsaj 5 do 6 krat aspirirali preko injekcijske igle v brizgo, dokler raztopina ni bila homogena. 17. Homogenizirana vzorce smo nato prenesli v sterilne 1,5 mikrocentrifugirke (proste Dnaz in Rnaz). 18. Mikrocentrifugirke s homogenatom celic v Trizol-u smo shranili v zamrzovalniku pri -20 ºC OSAMITEV RNA PREKO TRIZOLA Lizo celic smo izvedli z pipetiranjem celic v TRIZOL-u. Sočasno s tem smo onemogočili delovanje encimov RNAz, ki razgradijo RNA. DNA in proteini pa so med ekstrakcijo ostali v fenolni fazi ali pa v fazni meji med zgornjo vodno in spodnjo fenolno rožnato obarvano fazo. Tako pripravljena RNA je bila primerna za obratno prepisovanje in verižno reakcijo s polimerazo. Reagenti: Trizol Kloroform Je topilo, ki ga dodamo med izolacijo RNA z TRIZOL - om in omogoča ekstrakcijo RNA iz fenolne faze. Kloroform (triklormetan, CHCl 3 ) je brezbarvna in lahko hlapna tekočina. 100 in 75 % etanol Etanol se uporablja za obarjanje RNA. 75 % etanol pripravimo iz 100 % etanola, tako da k 7,5 ml 100 ali 96 % etanola dodamo 2,5 ml sterilne nukleaz proste vode. Sterilna voda 22

32 Pribor in aparature: 1,5 ml sterilne epruvete, proste RNaz in DNaz, sterilni nastavki (prosti RNaz in DNaz), nosilci za epruvetke in pipete, sterilne pincete, pipete (10, 100 in 1000 µl), centrifuge Hereaus Biofuge Pico in Hereaus Biofuge 22 R, orbitalni mešalniki - vorteksi, komore, ki omogočajo sterilno delo (Holten Laminar Air, Iskra Pio LFVP 12), spektrofotometer UV/VIS Spektrofotometer Lambda Bio 20. Postopek: 1. 1 do 2 krat 10 7 celic (levkocitov) smo raztopili v 1 ml TRIZOL-a. 2. Vzorec smo homogenizirali s pipetiranjem in prebrizgavanjem skozi injekcijsko iglo. 3. Vzorec smo nato zmrznili čez noč. Ko so vzorci temeljito premešani v TRIZOL-u, jih lahko tudi shranimo celo za več mesecev na -20 C v zamrzovalniku. 4. Vzorec smo odtalili in inkubirali 10 min na sobni temperaturi. 5. Nato smo vzorec inkubirali 10 min na 37 C, vmes smo ga večkrat vorteksirali in tako omogočili celotno disociacijo nukleoproteinskega kompleksa. 6. Dodali smo 0,2 ml kloroforma in premešali z vorteksiranjem (15-45 s). 7. Nato smo centrifugirali 10 minut na 10,600 rpm pri 8 C. 8. Zgornjo vodno fazo z RNA smo prenesli v novo mikrocentrifugirko in ponovno dodali 0,2 ml kloroforma. 9. Rahlo smo vorteksirali in centrifugirali na 10,600 rpm 10 min pri 8 C. 10. Ponovno smo odstranili zgornjo - vodno fazo z RNA in jo prenesli v novo mikrocentrifugirko. 11. Dodali smo 0,5 ml ledenega 100 % etanola in vorteksirali. Nato smo inkubirali, 30 minut na -20 C. 12. Po končani inkubaciji smo centrifugirali na 10,600 rpm 10 min pri 8 C. 23

33 13. Odstranili smo supernatant in sprali pelet z 1 ml 75 % etanola in vorteksirali. 14. Centrifugirali smo na 8,400 rpm, 5 min na 8 C in nato odstranili supernatant. 15. RNA smo posušili v termobloku na 37 C, 2-5 min. Alkohol je moral popolnoma izhlapeti, pri tem pa smo morali paziti, da pelet RNA ni bil več bel, biti je moral želatinast. 16. RNA smo takoj raztopili v 24 l RNaze - proste vode. 17. Raztopljeno RNA smo shranili v zamrzovalniku pri -20 o C. 18. Koncetracijo in čistost RNA smo preverili spektrofotometrično PRIPRAVA KOMPLEMENTARNE DNA cdna (komplementarna DNA) smo pripravili v postopku obratnega prepisovanja RNA z encimom reverzna transkriptaza. cdna se uporablja za določanje ravni izražanja genov, preverjanje prisotnosti različnih prepisov mrna in analize PCR. Reagenti: Nukleotidi - 10 mm dntp Pri delu smo uporabljali mešanico 10 mm nukleotidov, kjer so prisotni vsi 4 dntp; datp, dctp, dgtp in dttp v omenjeni koncentraciji. Heksamerni oligonukleotidi - random hexameri (hexanucleotide mix) 10 x koncentrat V laboratoriju smo večinoma uporabljali heksamerne oligonukleotide proizvajalca Applied Biosystems. Komercialno dostopna raztopina heksamernih oligonukleotidov Applied Biosystems je 10 x, kar pomeni, da jih v reakcijo dodamo 0,1 končnega volumna reakcije. Naključni heksamerni nukleotidi so shranjeni v raztopini (0,5 M Tris-HCl (ph 7,2 pri 20 o C), 0,1M MgCl 2, 1 mm ditioeritol (DTE), 2 mm BSA. Encim reverzna transriptaza SuperScript II (200 U / μl) 24

34 Uporabljali smo encim reverzna transkriptaza SuperScript II RT z aktivnostjo 200 U / μl. Shranjen je v pufru s sestavo: 20 mm Tris-HCl (ph 7,5), 100 mm NaCl, 0,1 mm EDTA, 1 mm DTT, 0,01 % (v/v) NP-40, 50 % glicerol. Encim SuperScript II optimalno deluje pri 42 C. Uvršča se v skupino RNA - odvisnih DNA polimeraz in deluje na matrici enoverižnih RNA in DNA ter na hibridih RNA - DNA. 5 x First Strand Buffer Je 5 x pufer, ki omogoča optimalno delovanje encima SuperScript II. Njegove sestavine so: 250 mm Tris-HCl (ph 8,3), 375 mm KCl in 15 mm MgCl 2. V reakcijo priprave cdna smo ga dodali 1/5 končnega volumna reakcije. 0,1 M DTT DTT deluje kot reducent in je potreben za optimalno delovanje encima reverzne transkriptaze SuperScript II. Inhibitor RNaz (20 U/μl) Ta protein preprečuje razgradnjo RNA z encimi RNAzami, kot so RNAza A, RNAza B, RNAza T2. Inhibitor RNAz prepreči razgradnjo RNA med pripravo cdna, reakcijami in vitro prepisovanja in prevajana, izolacijami RNA. Inhibitor RNAz ne moti večine metod, ki se uporabljajo med pripravo in analizo RNA. Te metode so izolacija RNA, obratno prepisovanje in prevajanje RNA, priprava cdna, reakcije PCR (tudi reakcija PCR v realnem času). Uporabljali smo inhibitor RNAz proizvajalca Applied Biosystems. Inhibitor RNAz je shranjen v pufru s sestavo 20 mm Hepes-KOH, 50 mm KCl, 8 mm ditioeritol (DTE), 50 % glicerol, ph pufra je 7,6 pri 4 o C in ima aktivnost 20 U/μl. Inhibitor RNaz inhibiramo s segrevanjem nad 65 o C. Pribor in aparature: 1,5 ml in 0,2 ml sterilne epruvete, proste RNaz in DNaz, sterilni nastavki (prosti RNaz in DNaz), nosilci za epruvetke in pipete, sterilne pincete, pipete (10, 100 in 1000 µl), centrifuge Hereaus Biofuge Pico in Hereaus Biofuge 22 R, aparati za PCR Perkin Elmer Gene Amp 9700 ali Veriti, orbitalni mešalniki vorteksi, komore, ki omogočajo sterilno 25

35 delo (Holten Laminar Air, Iskra Pio LFVP 12, DNA/RNA UVT-cleaner box UVC/T-M- AR, spektrofotometer UV/VIS Spektrofotometer Lambda Bio 20. Postopek: Tabela 2: Priprava reakcijske mešanice za cdna. Reakcijska mešanica Reagent/količina na vzorec Delovna koncentracija reagenta Reakcijska mešanica 1 dntp 1 µl naključni heksameri 2 µl 0,5 mm (0,125 mm vsak posamezni dntp) 5 μm Reakcijska mešanica 2 5 x RT PCR pufer 4 µl 100 mm DTT 2 µl Inhibitor RNaz 1 µl RT encim - Super Script II 1 µl 1 x 2 mm 1 U / μl 10 U / μl 1. Reakcijski mešanici I smo dodali 9 l RNA. Koncentracija RNA je podana v μg / ml. Količino (V) RNA(1000 / c RNA), ki smo jo dodali v reakcijo priprave cdna smo zaokrožili navzgor na celo številko. Vode pa smo dodali do 9 l. Vzorce smo nato prenesli v aparat PCR na program 65 o C, 5 min. 2. Po končani PCR reakciji smo vzorcem dodali 8 l reakcijske mešanice 2 ter mikrocentrifugirke stresali in centrifugirali. Ponovno smo jih prenesli v aparat PCR na program v Tabeli 3. Tabela 3: Pogoji reakcije sinteze cdna s reakcijsko mešanico 2. Korak T ( o C) čas min min min

36 ČIŠČENJE PRODUKTOV REAKCIJE PCR Z HIDROLITIČNIMA ENCIMOMA Produkte reakcije PCR je za nekatere aplikacije potrebno očistiti snovi, ki bi lahko motile nadaljne analize, kot so sekvencioniranje, genotipizacija, kloniranje, in vitro prepisovanj. Te snovi so neporabljeni nukleotidi, začetni oligonukleotidi in enoverižne molekule nukleinskih kislin. Reagenčni komplet ExoSap - IT je mešanica dveh hidrolitičnih encimov: eksonukleaze 1 (exonuclease I) in alkalne fosfataze morskega rakca (shrimp alkaline phosphatase). Oba encima sta optimalno aktivna pri 37 ºC in sta temperaturno labilna in ju lahko deaktiviramo z inkubacijo pri 80 ºC. Prav tako sta encima aktivna v pufrih, ki se uporabljajo med reakcijami PCR in zato ni potrebno dodajati dodatnih pufrov za čiščenje produktov PCR ob uporabi reagenčnega kompleta ExoSap - IT. Eksonukleaza I razgradi enoverižne začetne oligonukleotide in druge enoverižne molekule nukleinskih kislin, alkalna fosfataza pa hidrolizira preostale neporabljene dntpje. Reagenčni komplet ne razgradi dvoverižne DNA, ki jo lahko predstavljajo produkti reakcije PCR ali pa dimeri začetnih oligonukleotidov. Prav tako ne pride do razgradnje nespecifičnih produktov reakcije PCR. Reagenčni komplet ExoSap - IT lahko uporabljamo za čiščenje produktov reakcij PCR, ki so krajši od 100 bp, pa tudi daljših od 20,000 bp. Postopek čiščenja produktov reakcije PCR je hiter (30 min) in poteka v eni mikrocentrifugirki, ki jo lahko uporabimo v nadaljnjih analizah, pri tem pa ne pride do izgube vzorcev. Reagenti: Reagenčni komplet ExoSap Pri delu smo uporabljali reagenčni komplet ExoSap - IT proizvajalca USB, ki ga predstavlja viala z 1 ml mešanice encimov eksonukleaze I in alkalne fosfataze morskih rakcev. Reagenčni komplet deluje z večino pufrov, ki se uporabljajo za izvedbo reakcij PCR. Reagenčni komplet predstavlja ena viala z 1 ml raztopine encimov in zadostuje za 1000 postopkov čiščenja produktov reakcij PCR. Reagenčni komplet ExoSap shranjujemo v zamrzovalniku pri -20 o C. 27

37 Pribor in aparature: Uporabili smo 0,2 ali 1,5 ml sterilne mikrocentrifugirke, proste RNaz in DNaz, sterilne nastavke (proste RNaz in DNaz), nosilce za mikrocentrifugirke in pipete, sterilne pincete, pipete (10 µl), centrifuge Mini spin eppendorf, Hereaus Biofuge Pico in Hereaus Biofuge 22 R, BioSan MSC , orbitalni mešalniki - vorteksi, sistem za elektroforezo nukleinskih kislin, termoblok TDB - 120, sistem za agarozno gelsko elektroforezo. Postopek: 1. 8 µl produktov reakcije PCR smo analizirali z agarozno gelsko elektroforezo. Če smo na gelu zaznali prisotnost produktov PCR v količini večji od 20 ng, smo se odločili za čiščenje produktov reakcije PCR z reagenčnim kompletom ExoSap - IT. 2. V sterilne 0,2 ml mikrocentrifugirke, ki smo jih predhodno označili, smo dodali 3,5 µl produktov reakcije PCR. 3. Iz zamrzovalnika smo vzeli reagenčni komplet ExoSap - IT in ga prenesli v hladilni blok, ki smo ga ohladili na -20 C. 4. K vzorcem smo dodali 1 µl reagenčnega kompleta ExoSap - IT 5. Mikrocentrifugirke s produkti reakcije PCR in reagenčnim kompletom ExoSap IT smo premešali in kratko centrifugirali. 6. Vzorce smo inkubirali 15 min v termoblkoku pri 37 C. 7. Reagenčni komplet smo nato inaktivirali z 15 min inkubacijo pri + 80 C. 8. Vzorce smo nato ohladili in kratko centrifugirali. 9. Vzorce smo tako pripravili za nadaljnje analize, kot so reakcije PCR, sekvencioniranje ELEKTROFOREZA NUKLEINSKIH KISLIN Elektroforeza omogoča ločitev delcev z nabojem v električnem polju. Molekule nukleinskih kislin imajo močan negativen naboj in zato potujejo od katode proti anodi. Na hitrost potovanja snovi v agaroznem gelu vplivajo zamreženost in gostota gela ter velikost, oblika in naboj molekul. Proizvajalec Invitrogen je razvil serijo EX - gelov, ki so 1, 2 in 4 %. Ti geli imajo le eno vrsto žepkov. Lahko pa uporabljamo tudi gele s dvema vrstama žepkov in tako sočasno analiziramo več vzorcev. Vzorce negativno nabitih NK smo 28

38 nanesli na agarozni gel, kjer pod vplivom električnega polja potujejo od katode (negativna) proti anodi (pozitivna) v odvisnosti od svoje velikosti. Hitrost potovanja je odvisna tudi od koncentracije agaroze v gelu, več je agaroze počasnejše je potovanje NK. V agarozni gel je med pripravo dodano flourescentno barvilo etidijev bromid ali pa njegov analog SybrGreen, ki po osvetlitvi z UV svetlobo flourescirajo, kar omogoča detekcijo NK. Molekule flourescentnih barvil se interkalirajo med baze nukleinskih kislin in imajo močnejšo flourescenco kot proste molekule barvil in nukleinskih kislin. Flourescenco zaznamo s foto-dokumentacijskim sistemom, ki je sestavljen iz aparata Bio-Rad - Gel-Doc 100 in računalniškega programa Molecular Analyst. Reagenti: EX - gel (Invitrogen) Uporabljali smo predhodno pripravljene agarozne EX gele, ki vsebujejo 1 %, 2 % in 4 % agaroze. Standardi velikosti nukleinskih kislin (Ladder) Uporabljali smo standarde za določitev velikosti nukleinskih DNA Superladder - low 100 bp (UBgene, UK). Reagent vsebuje fragmente DNA z velikostjo 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 in 1000 bp in koncentracijo 100 μg/ml, ki so shranjeni v pufru Tris/EDTA. 6 x nanašalni pufer (loading buffer) 6 x nanašalni pufer (0,05 % bromfenol modro; 0,05 % ksilen cianol; 50 % glicerol) nam je zaradi barvil omogočal, da smo spremljali potek elektroforeze. Barvili (ksilen cianol in bromfenol modro) olajšata nanos vzorca in sta nam služila kot indikatorja položaja nukleinskih kislin določene velikosti v gelu. Dodani glicerol poveča gostoto vzorca in s tem omogoči, da ta potone na dno žepka. Pribor in aparature: Base Ibase, Sistem za fotodokumentacijo, računalnik, tiskalnik. 29

39 Postopek: 1. Preko priloženega adaptarja smo priklopili bazo ibase (slika 9) na električno omrežje. 2. EX-Gel smo vzeli iz paketa in odstranili glavniček ter ga vložili najprej na desno stran ibbaze PowerBase in nato spustili na bazo še levi del gela. Del gela z žepki naj bo pri vrhu baze pri delu z indikatorsko lučko. 3. Močno smo pritisnili na vrh in dno, da se je gel dobro ulegel v bazo ibase. Če je bil gel pravilno vstavljen, se je na bazi prižgala rdeča luč. 4. V žepek z oznako M smo nanesli 20 µl pripravljene raztopine standardov v ostale žepke pa smo nanesli 20 µl vzorcev (2,5 µl vzorca in 17,5 µl vode). 5. Nato smo še v prazne, nezasedene žepke nanesli 20 µl vode. 6. Takoj po nanosu vzorcev smo s krajšim pritiskom na tipko ' Mode stikalo za iskanje programov ' in stikaloma za pomik po programih in nastavitev časa nastavili program elektroforeze. 7. S pritiskom na tipko ' Go stikalo za vklop in izklop 'smo pričeli elektroforezo. 8. Vrstni red nanosa vzorčkov smo si zabeležili. 9. Po končanem preteku nastavljenega časa elektroforeze, se je le - ta avtomatično izključila in oglasil se je zvočni signal. 10. V primeru, da smo želeli sprotno spremljati potek elektroforeze ali pa ob uporabi SizeSelect gelov, smo ibase položili na transiluminator in ibase pokrov transiluminatorja. Transliluminator smo priključili na omrežno napetost. Če smo želeli pogledati vzorce preko transiluminatorja, smo pritisnili na tipko ' za vklop transiluminatorja '. Detekcija in foto - dokumentacija rezultatov ločbe NK z elektroforezo: 1. Gel smo vzeli iz baze in ga prenesli v komoro foto - dokumentacijskega sistema Bio- Rad Gel Doc Vrata komore smo zaprli in prižgali UV luč. 30

40 3. Na računalniku smo zagnali program ' Molecular Analyst '. 4. V programskem oknu ' File ' smo kliknili ' new ', kar je povzročilo odprtje novega okna - Gel Doc 1000, kjer smo na desni strani zaslona preverili, da je označeno polje ' integrate ' in smo nastavili ' integration time ' v intervalu med 0,8-5 s. Mi smo izbrali 2 s. Pokazala se je slika gela. 5. To sliko smo shranili s klikom na ikono ' save ', kjer smo kot ime datoteke izbrali datum (ddmmll), če smo na isti dan shranili več kot eno datoteko, smo dodali k številkam še črke. 6. Sliko smo označili z datumom. Posamezne vzorčke pa smo označili z oznako, ki smo si jo predhodno izbrali. 7. Rezultat smo še natisnili z ukazom ' print ' OSAMITEV PCR PRODUKTOV IZ POSEBNIH AGAROZNIH GELOV E-Geli SizeSelect so zaosnovani na sistemu E-Gel agaroznih gelov so popolnoma brezpufrni elektroforezni sistemi za agarozno gelsko elektroforezo vzorcev nukleinskih kislin. Sistem za elektroforetsko ločbo vključuje že pripravljene gele z dodanim barvilom, ki so pripravljeni za takojšnjo uporabo. E-Gel SizeSelect geli pospešijo in poenostavijo prečiščevanje DNA na gelih. E-Gel SizeSelect 2 % omogočajo hitro, enostavno in učinkovito elektroforetsko ločitev (8-20 min) in s tem čiščenje fragmentov DNA v razponu velikosti od 50 bp bp. Geli omogočajo detekcijo do 1 ng/fragment DNA. Očiščeni produkti PCR so primerni za nadaljnjo uporabo pri kloniranju in sekvenciranju. E-Gel SizeSelect agarozni geli imajo, ko je barvilo vezano v nukleinske kisline maksimum vzbujanja pri 490 nm, maksimum emisije pa pri 552 nm. Ker je za vizualizacijo produktov PCR potrebna modra svetloba in ne UV-svetloba, je možnost razgradnje produktov PCR zmanjšana. Če želimo, lahko plastično ogrodje gela odpremo s pomočjo noža (' gel knife ') in ustrezne produkte PCR izrežemo ali prenesemo na membrano (' blotting '). Značilnost E-Gel SizeSelect 31

41 agaroznih gelov je široka uporabnost: za analizo in čiščenje produktov PCR, fragmentov DNA po delovanju restrikcijskih encimov (RFLP) in produktov RT-PCR. Reagenti: Standardi velikosti nukleinskih kislin ('Ladder') označevalci DNA 6x nanašalni pufer ('Loading buffer') Sterilna voda (RNaz in DNaz prosta voda) E-Gel ibase Power System and Safe Imager Real-time Transilluminator Pribor in aparature: RNaz in DNaz sterilne epruvete (1,5 ml in 0,2 ml), sterilni nastavki (RNaz in DNaz prosti), nosilci za epruvete in pipete, sterilne pincete, pipete (10, 100 in 1000 l), centrifuge (Hereaus Biofuge Pico in Hereaus Biofuge 22 R, ). Postopek: 1. Na E-Gel SizeSelect agarozne gele smo nanesli 20 μl vzorca in 10 μl DNA označevalca (M). Za dosego dobrih rezultatov smo na gel nanesli enak volumen za vse vzorce. Če pa nismo imeli dovolj vzorca, smo ga redčili s sterilno vodo. V prazne luknjice pa smo nanesli identični volumen sterilne vode. 2. ibase smo namestili neposredno na E-Gel Safe Imager Real-time Transilluminator, tako da se je usedel na ibase. 3. Nato smo vklopili krajši električni kabel E-Gel Safe Imager Real-time Transilluminator v vhod za napajanje na ibase (Slika 8) in vklopili povezovalni električni kabel v vhod za napajanje transformatorja Safe Imager. 32

42 Slika 8: ibase 4. E-Gel SizeSelect agarozni gel smo vstavili v E-gel ibase Power System. Pri tem se je pojavila opozorilna rdeča lučka, ki je potrdila pravilni vnos gela v sistem. 5. Po nanosu vzorcev smo vklopili elektroforezo. 6. Nato smo namestili oranžni filter na E-Gel ibase. 7. S pomočjo stikal smo nastavili na LCD zaslonu program ' Run SizeSelect 2 % ' in čas poteka elektroforeze s pritiskom na ustrezne tipke. 8. Osnovni program E-Gel SizeSelect je imel nastavljen čas poteka elektroforeze na 8 minut, ki smo ga lahko spremenili s pritiskom na ustrezne gumbe. Elektroforezo smo pustili teči do referenčne črte. 9. Signalni pisk je opozoril na konec elektroforeze in utripanje rdeče lučke. Če fragment ni dosegel referenčne črte smo pustili teči elektroforezo dalje toliko časa, dokler ni dosegla črte. 10. Ko je fragment dosegel referenčno črto, ponovno dopolnimo zbiralne luknjice do 25 l s sterilno vodo. 11. Nato smo vnesli ustrezni čas poteka elektroforeze, da so fragmenti dosegli zbiralne luknjice. 12. Ko se je potovanje fragmentov končalo, smo pritisnili gumb Go. 13. Iz zbiralnih luknjic smo s pipeto prenesli želene fragmente DNA v ustrezno označene sterilne epice. 33

43 DOLOČITEV MUTACIJ V FUZIJSKEMU GENU BCR-ABL1 S SEKVENCIONIRANJEM Metoda določitve mutacij v genu BCR - ABL1 s sekvencioniranjem je opisana v članku Ernst in sod. (2008, Haematologica) in optimizirana v specializiranem hematološkem laboratoriju. Vzorec: Vzorec za določitev genskih sprememb v fuzijskem genu BCR - ABL1 je bila cdna, ki smo jo pripravili iz RNA levkocitov periferne krvi bolnikov s KML, pri katerih je raven izražanja fuzijskega gena BCR - ABL1 bila približno 5 % po mednarodnem merilu. Reagenti: Nukleotidi - 10 mm dntp Pri delu smo uporabljali mešanico 10 mm nukleotidov, kjer so prisotni vsi 4 dntp; datp, dctp, dgtp in dttp v omenjeni koncentraciji. Delovna koncentracija dntp med reakcijo je bila 200 μm. 10 x Reaction Buffer Je raztopina - pufer, ki omogoča optimalno delovanje encima Optimase DNA polimeraze in ne vsebuje magnezijevih ionov. V reakcijo smo ga dodali 0,1 končnega volumna reakcije PCR. Encim Optimase DNA polimeraza Pri delu smo uporabljali DNA polimerazo Optimase (Transgenomic), ki je DNA polimeraza izolirana iz arhej, ki so jih našli v toplih vrelcih Pacifika. Encim je zanesljiv in naredi le malo napak med prepisovanjem in ima 5'-3' eksonukleazno aktivnost. 25 mm MgSO 4 Magnezijevi ioni so kofaktorji encima DNA polimeraze in določajo specifičnost DNA polimeraze. Eno vialo MgSO 4 smo dobili v kompletu z encimom Optimase DNA polimerazo. Delovna koncentracija magnezijevih ionov med reakcijo PCR je bila 1,5-4 mm in smo jo optimizirali. 34

44 Sterilna voda Začetni oligonukleotidi Začetni oligonukleotidi omejujejo področje DNA, ki ga pomnožujemo med reakcijo PCR, pri čemer vedno potrebujemo par smernega in protismernega začetnega oligonukleotida, izjemo predstavlja sekvenčni PCR. V tabeli 4 so podana zaporedja začetnih oligonukleotidov, ki smo jih uporabljali za določitev mutacij v genu BCR ABL1. V reakcijo PCR smo dodali razredčene začetne oligonukleotide (10 pmol / μl). Ob določitvi mutacij pri bolnikih s prisotnimi prepisi vrste p210 smo uporabljali v prvem koraku začetna oligonuleotida BCR - f1a in ABL - r1a. Način omogoča tudi uporabo oligonukleotidov BCR - f2a in ABL - r1a za prepis vrste p190. V drugem koraku PCR-primerji Za pripravo sekvenčne reakcije pa je koncentracija začetnih oligonukleotidov 5 pmol / l. V sekvenčni reakciji uporabimo samo en oligonukleotid, bodisi smerni ali protismerni. Tako smo za fragment B uporabili oligonukleotide, za fragment C in za fragment D. Oligonukleotidne začetnike s koncentracijo 100 pmol / μl smo pripravili, tako da smo raztopili oligonukleotidne začetnike v liofilizirani obliki. Oligonukleotidne začetnike s koncentracijo 10 pmol / μl pa smo pripravili iz koncentrirane raztopine, tako da k 90 μl vode dodali 10 μl koncentrirane raztopine začetnih oligonukleotidov. 35

45 Tabela 4: Seznam in zaporedja začetnih oligonukleotidov. Ime ZON Nukleotidno zaporedje ZON 5' - 3' Dolžina ZON (bp) Dolžina produkta PCR Kodoni v genu ABL1 BCR - f1a (p210) BCR - f2a (p190) ABL - r1a ABL - f3b ABL - r3b ABL - f4c ABL - r4c ABL - f5d ABL - r5d ACA GCA TTC CGC TGA CCA TCA ATA AG ACC GCA TGT TCC GGG ACA AAA G ATG GTC CAG AGG ATC GCT CTC T TGG TTC ATC ATC ATT CAA CGG TGG GTT GCA CTC CCT CAG GTA GTC AAG ACC TTG AAG GAG GAC ACC AT AGA CGT CGG ACT TGA TGG AGA ACT ACC ACT TGG TGA AGG TAG CTG CCT GCA GCA AGG TAC TCA CA bp bp bp bp Pribor in aparature: 1,5 ml in 0,2 ml sterilne epruvete, proste RNaz in DNaz, sterilni nastavki (prosti RNaz in DNaz), nosilci za epruvetke in pipete, sterilne pincete, pipete (10, 100 in 1000 µl), centrifuge Hereaus Biofuge Pico in Hereaus Biofuge 22 R, aparati za PCR Perkin Elmer Gene Amp 9700 in Veriti, orbitalni mešalniki - vorteksi, komore, ki omogočajo sterilno delo (Holten Laminar Air, Iskra Pio LFVP 12, DNA/RNA UVT-cleaner box UVC/T-M- AR), sistem za izvedbo agarozne elektroforeze, foto - dokumentacijski sistem. 36

46 Postopek: Slika 9: Shematičen prikaz reakcij PCR ob določitve mutacij v genu ABL1 PRIPRAVA PRVEGA PCR-JA: 1. S pinceto smo pobrali toliko 0,2 ml sterilnih mikrocentrifugirk iz petrijevke kot smo imeli reakcij PCR-ja (bolniki + NTC). Mikrocentrifugirke smo zaprli ter jih označili z oznako vzorca. Označene mikrocentrifugirke smo nato postavili v stojalo za 0,2 ml mikrocentrifugirke. 2. Pripravili smo si 1,5 ml sterilno mikrocentrifugirko. 3. V skladu s tabelo 5 smo si pripravili reakcijsko mešanico. 4. Reakcijsko mešanico smo premešali z obračanjem ali rahlim vorteksiranjem, nato smo jo kratko centrifugirali - ' spin down ' in jo alikvotirali po 45 μl v 0,2 ml mikrocentrifugirke 5. K reakcijski mešanici smo dodali 5 μl raztopine razredčene cdna in premešali z rahlim vorteksiranjem. 37

47 6. Kratko smo centrifugirali»spin down«. 7. Nato smo vse skupaj prenesli v aparat za PCR, kjer smo nastavili pogoje reakcije PCR-ja, ki so napisani v tabeli 6. Tabela 5: Priprava reakcijske mešanice za prvi PCR ob določitvi mutacij v genu BCR - ABL1. Reagent μl 10 x Reakcijski PCR pufer 6 25 mm MgSO 4 2 0,2 mm dntp 1 10 pmol ZON f1a ali f2a 2 10 pmol ZON r1a 2 2,5 U / l Optimase polimeraza 0,5 Voda 32,5 vsota 45 Tabela 6: Pogoji prve reakcije PCR za določitev mutacij v fuzijskem genu BCR - ABL1. KML sekvenčna reakcija 1 korak T ( o C) Čas št. ponovitev min 1 ' touch down ' protokol s vsak cikel za 0,5ºC navzdol 3 66,2 30 s s s 6 59,2 30 s s min

48 PRIPRAVA DRUGEGA PCR-JA IN SEKVENČNEGA PCR-JA. 1. V skladu s Tabelo 7 smo si pripravili tri reakcijske mešanice, ki so se medsebojno razlikovale v začetnih oligonukleotidih, ki smo jih dodali v mešanico. V posamezno reakcijsko mešanico smo vedno dodali začetna oligonukleotida, ki sta bila označena z enako črko B, C ali D. Reakcijske mešanice smo označili s črkami B, C in D. 2. Reakcijske mešanice smo premešali z obračanjem ali z rahlim vorteksiranjem, nato smo kratko centrifugirali - ' spin down ' in jo alikvotirali po 49 μl v 0,2 ml mikrocentrifugirke. 3. K reakcijskim mešanicam smo dodali 1 μl produktov prve reakcije PCR ali vode. 4. Nato smo premešali z rahlim vorteksiranjem in nato kratko centrifugirali - ' short spin '. 5. Vse smo prenesli v aparat za PCR, kjer smo nastavili pogoje reakcije PCR-ja, ki so napisani v tabeli 8. Tabela 7: Reakcijske mešanice za vgnezdeni PCR ob določitvi mutacij v genu BCR - ABL1 ob pomnoževanju fragmentov B, C in D. Reagent μl 10 x Reakcijski PCR pufer 5 25 mm MgSO 4 2 0,2 mm dntp 1 10 pmol ZON fb, fc ali fd 2 10 pmol ZON rb, rc ali rd 2 2,5 U / l Optimase polimeraza 0,5 Voda 36,5 vsota 49 39

49 Tabela 8: Pogoji druge reakcije - vgnezdenega PCR za določitev mutacij v fuzijskem genu BCR - ABL1. Pomnoževali smo fragmente B, C in D. Korak T ( o C) čas št. ponovitev min 1 x s 3 63,5 30 s 29 x s min 1 x Na 2 % EX agarozni gel smo nanesli 2,5 µl produktov druge reakcije PCR in tako smo preverili ali so se pomnožili fragmenti B, C in D µl produktov druge reakcije PCR očistimo na gelih Size select 2%. 3. Pripravili smo si mikrotitrsko ploščico, a pri tem smo pazili, da smo vsak fragment sekvencionirali z f in r začetnim oligonukleotidom. 4. Reakcijsko mešanico smo pripravili kot je opisano v tabeli Reakcijsko mešanico smo alikvotirali na mikrotitrsko ploščico. 6. Dodali smo 0,64 l samo enega začetnega oligonukleotida (konc. 5 pmol/ l) bodisi forward ali rewerse. 7. Nato smo dodali še prečiščene fragmente B, C ali D. 8. Mikrotitrsko ploščico smo prekrili s samolepilno folijo, vzorce smo premešali in kratko centrifugirali. 9. Vzorce smo nato prenesli v aparat PCR, kjer smo nastavili pogoje reakcije PCR, kot so prikazani v tabeli 9. 40

50 Tabela 9: Pogoji sekvenčne reakcije PCR za določitev mutacij v fuzijskem genu BCR - ABL1. Korak T ( o C) čas št. ponovitev min 1 x s s 25 x min 5 4 Tabela 10: Priprava reakcijske mešanice za sekvenčno reakcijo Reagent / število reakcij 1 Ready reaction premix (μl) 1 BigDye sek. pufer (μl) 3,5 voda (μl) 12,9 Vsota (μl) 17, ČIŠČENJE PRODUKTOV SEKVENČNE REAKCIJE Z REAGENČNIM KOMPLETOM BIGDYE XTERMINATOR PURIFICATION KIT Reagenčni komplet BigDye XTerminator Purification kit (Applied Biosystems) je namenjen čiščenju produktov sekvenčne reakcije pred nanosom vzorcev na sekvenator. Celotni reagenčni komplet se shranjuje v hladilniku in se ne sme zamrzovati. Reagenti BigDye XTerminator solution Sestavljen je iz dveh vial z BigDye XTerminator solution (2 ml) in raztopine (9 ml). Natančnejša sestava ni znana. 41

51 SAM 9 ml raztopina. Natančnejša sestava ni znana. Pribor in aparature: 1,5 ml in 0,2 ml sterilne epruvete proste RNaz in DNaz, mikrotitrska ploščica, sterilni nastavki (prosti RNaz in DNaz), nosilci za epruvetke in pipete, sterilne pincete, pipete (10, 100 in 1000 µl), centrifuge Hereaus Biofuge Pico in Hereaus Biofuge 22 R, orbitalni mešalniki - vorteksi, komore, ki omogočajo sterilno delo (Holten Laminar Air, Iskra Pio LFVP 12, DNA/RNA UVT-cleaner box UVC/T-M-AR) Postopek: 1. Po končani drugi reakciji PCR smo mikrotitrsko ploščico vzeli iz aparata PCR in jo kratko centrifugirali. 2. Preverili smo, da v reagentu SAM Solution ni precipitatov, če so bili prisotni, smo ga segreli na 37 ºC, premešali ter ohladili na sobno temperaturo. 3. Vsakemu produktu PCR smo dodali reagent SAM Solution glede na volumen reakcije (tabela 11). Tabela 11: Volumen reagenta SAM solution, ki ga dodamo k produktom reakcije PCR Volumen reakcije PCR Volumen dodanega reagenta SAM Solution 10 µl 45 µl 20 µl 90 µl 1. Reagent BigDye Xterminator Solution smo stresali na orbitalnem mešalniku vsaj 10 sekund, da so se delci v raztopini porazdelili. 2. K produktom sekvenčne reakcije z dodanim reagentom SAM smo s širokimi nastavki dodali reagent BigDye Xterminator Solution (Tabela 12). Pri dodajanju 42

52 reagenta BigDye Xterminator Solution je bilo potrebno reagent premešati z orbitalnim stresalnikom po dodatku k dvema vzorcema. Tabela 12: Volumen reagenta BigDye Xterminator Solution, ki ga dodamo k produktom reakcije PCR z dodanim reagentom SAM. Volumen reakcije PCR Volumen dodanega reagenta BigDye Xterminator 10 µl 10 µl 20 µl 20 µl 3. Mikrotitrsko ploščico smo nato prelepili s prozorno folijo in preverili, da je zatesnjena vsaka luknjica. 4. Mikrotitrsko ploščico smo nato stresali 30 minut na maksimalni hitrosti stresalnika v hladilniku. 5. Nato smo centrifugirali ploščico 2 minuti pri 2000 obr./min µl supernatanta smo prenesli v čiste trakove centrifugirk stripe in jih nato prenesli v sekvenator ČIŠČENJE PRODUKTOV SEKVENČNE REAKCIJE PO POSTOPKU ETANOLNE PRECIPITACIJE Reagenti: 125 mm EDTA Uporabljamo jo za čiščenje produktov sekvenčne reakcije. Pripravimo smo jo, tako da smo k 37,5 μl sterilne vode dodali 12,5 μl 0,5 M raztopine EDTA (ph 8,0). 3 M Natrijev acetat, ph 4,6 5,0 Uporabljamo ga za čiščenje produktov sekvenčne reakcije. Pripravili smo ga tako, da smo zatehtali 24,61 g natrijevega acetata (CH 3 COONa, brezvodni), dodali smo vode do 80 ml, 43

53 mešali, da se je sol natrijevega acetata raztopila. ph smo uravnali na 4,6-5,0 in dopolnili z vodo do končnega volumna 100 ml. Pripravljeno raztopino smo nato sterilno filtrirali. 70 in 100 % etanol 70 in 100 % etanol uporabljamo v postopku čiščenja produktov sekvenčne reakcije. 70 % etanol pripravimo iz 96 % ali 100 % etanola (7 ml 100 % etanola in 3 ml sterilne vode, proste DNaz in RNaz). Formamid Formamid uporabljamo za raztapljanje in denaturacijo očiščenih produktov sekvenčne reakcije. Uporabljamo formamid proizvajalca Applied Biosystems. Ko raztopino prvič odtalimo, jo alikvotiramo po 500 l v 1,5 ml sterilne mikrocentrifugirke, ki jih shranimo v zamrzovalniku. Raztopino pipetiramo v digestoriju ali v laminariju z odvodom zraka. Pri delu smo nosili rokavice in pazili smo, da raztopina ni prišla v stik z kožo, očmi in da je nismo vdihavali direktno. Pribor in pripomočki: 1,5 ml in 0,2 ml sterilne mikrocentrifugirke (proste RNaz in DNaz), sterilni nastavki (prosti RNaz in DNaz), nosilci za epruvetke in pipete, sterilne pincete, pipete (10, 100 in 1000 µl), centrifuge Hereaus Biofuge Pico in Hereaus Biofuge 22 R, aparata za PCR Perkin Elmer Gene Amp 9700, Veriti, orbitalni mešalniki - vorteksi, digestorij, komore, ki omogočajo sterilno delo (Holten Laminar Air, Iskra Pio LFVP 12, DNA/RNA UVT-cleaner box UVC/T-M-AR, sekvenator ABI PRISM 310. Postopek: 1. Po končani reakciji PCR smo mikrocentrifugirke vzeli iz aparata PCR in jih kratko centrifugirali. 2. Vzorec smo prenesli v 1,5 ml sterilno mikrocentrifugirko, ki smo jih označili z oznako vzorca. 3. Vzorcu smo dodali 2 l 125 mm EDTA. 4. Nato smo dodali 2 l 3 M natrijevega acetata. 44

54 5. Na koncu smo dodali 50 L 100 % etanola. 6. Vzorec z dodanimi reagenti smo temeljito premešali z obračanjem (vsaj 4-krat) in centrifugirali ' spin down '. 7. Inkubirali smo 15 min na sobni temperaturi in nato centrifugirali (14,000 rpm, 30 min, 4ºC). 8. Po končanem centrifurgiranju smo odstranili supernatant. 9. Nato smo dodali 200 l 70 % etanola in temeljito premešali z obračanjem. 10. Centrifugirali smo (14,000 rpm, 15 min, 4 ºC). 11. Supernatant smo odstranili in obenem smo pazili, da nismo poškodovali produktov sekvenčne reakcije, ki so bili na dnu in ob steni mikrocentrifugirke. 12. Ponovno smo kratko centrifugirali in odstranili tekočino. 13. Odprto mikrocentrifugirko smo vstavili v termoblok in posušili vsebino pri 90 C. Vsa tekočina je morala izpareti. 14. Mikrocentrifugirke smo shranili v zamrzovalnik ali pa smo jih takoj pripravili za sekveniranje na aparatu. 15. Posušenemu pridelku sekvenčne reakcije smo dodali 20 l formamida (Hi-Di TM Formamide, AB). Vzorec smo premešali z orbitalnim mešalnikom (vorteks) in kratko centrifugirali. 16. V termobloku smo denaturirali vzorce (inkubirali smo 2 minuti, 95 ºC). 17. Po segrevanju smo dali vzorce takoj na led, kjer so se ohladili. 18. Ohlajene vzorce smo premešali z orbitalnim mešalnikom in kratko centrifugirali. Produkti sekvenčne reakcije so bili tako pripravljeni za sekvenciranje na aparatu. 19. Vzorce smo prenesli v ' trakove mikrocentifugirk - stripe ', pri tem smo pazili, da v vzorcih ni bilo zračnih mehurčkov. 45

55 Analiza podatkov Določitev ' točkovnih mutacij ' 1. Po končanem ' mehanskem ' sekvencioniranju smo podatke analizirali. Vedno smo si pridobili elektroferogram in tudi elektronsko verzijo rezultatov. 2. Razmerje S/N (izpis v zgornjem levem kotu elektroferograma) je moralo biti vsaj 10 za vse nukleotide, če so bile vrednosti pod določeno so bili rezultati nezanesljivi in neuporabni. 3. Nato smo preverili elektroferogram. Med prvimi nukleotidi je lahko bilo veliko N (aparat ni uspel identificirati pravega nukleotida), nato pa je moralo biti nukleotidno zaporedje brez N, razen, če so bile v preiskovanem področju prisotne mutacije. S sekvencioniranjem lahko določamo prisotnost ' točkovnih mutacij ', kjer so spremenjeni, vrinjeni ali izpuščeni le posamezni nukleotidi ali manjše število le - teh, lahko pa določamo tudi nukleotidno zaporedje fuzijskih genov. 4. Nato smo preverili ektroferogram in ga primerjali z normalnim (wt) zaporedjem. Slika 10: Shematičen prikaz elektroferogramov z normalnim in spremenjenim enim nukleotidom v heterozigotni obliki. Oba alela sta prisotna v približno enaki količini - vrhova obeh barv sta enako visoka. 46

56 Slika 11: Shematičen prikaz elektroferogramov s spremenjenim nukleotidnim zaporedjem v heterozigotni obliki v različni koncentraciji alelov 1. Nato smo v programu BioEdit odprli elektroferogram, kjer smo lahko natančno pregledali nukleotidno zaporedje, izrezali in odstranili začetni del ' sekvence ' in v primeru nejasnosti lahko še popravili nukleotide, kjer aparat ni uspel razbrati posameznega nukleotida 2. Nukleotidno zaporedje smo prekopirali v Wordov dokument in ga kasneje analizirali na internetni strani ( Uporabili smo program BLAST in primerjali našo nukleotidno zaporedje z referenčnim nukleotidnim zaporedjem mrna gena ABL1 z oznako NM_ Celoten končni izpis smo natisnili in shranili. 4. Če bolnik ni imel prisotne genske spremembe, se je nukleotidno zaporedje ujemalo z normalnim - wt zaporedjem (NM_ ). Ob mutaciji se zaporedje ni ujemalo. 5. Na koncu smo preiskovano nukleotidno zaporedje po prevedbi v aminokislinskega, kar nam omogoča poseben del programa BLAST, primerjali z referenčnim proteinskim zaporedjem ABL1 z oznako NP_ Na ta način smo določili mesto mutacije v aminokislinskem zaporedju. 47

57 4. REZULTATI IN RAZPRAVA Za optimizacijo metode smo uporabili vzorce, ki smo jih označili od 1 do 6, pridobljene v speciliziranemu hematološkemu laboratoriju, ki so imeli raven izražanja gena vsaj 5 % po IS. V zaključni fazi optimizacije pa smo metodo preverili z naključno izbranimi šestimi vzorci cdna bolnikov s KML, ki smo jih dobili s sodelovanjem v podprojektu projekta EUTOS, ugotavljanja pridobljenih mutacij v genu BCR-ABL1, ki je v času izdelave diplomske naloge še v teku. Preizkusi predstavljajo korake, ki smo jih naredili, da smo prišli do končnega postopka, ki nam je zagotavljal, da smo v vzorcih lahko določili mutacije s sekvencioniranjem OPTIMIZACIJA POGOJEV PCR IN SEKVENCIONIRANJA Optimizacijo PCR-jev in sekvencioniranja smo izvedli na vzorcih RNA bolnikov s KML, ki so imeli raven izražanja gena BCR-ABL1 vsaj 5 % na mednarodnem merilu (IS). Najprej smo izvedli optimizacijo pogojev PCR za fragment A. V tem koraku pomnožimo specifični odsek cdna zlitega gena BCR-ABL1. V naslednjem koraku uporabimo pomnožen fragment A kot osnovo za pridobitev specifičnih PCR produktov, kjer pomnožimo tri fragmente (B, C in D), ki pokrivajo samo odsek ABL1 v zlitem cdna segmentu BCR-ABL1. S tem načinom pomnožimo nukleotidno zaporedje, ki pokriva aminokisline od mesta 202 do 521 aminokislinskega zaporedja proteina BCR-ABL1 (refrenčno zaporedje proteina NP_ ), kjer se nahajajo najpomembnejše pridobljene mutacije PRVI PREIZKUS Prvi preizkus smo opravili na osnovi in priporočil članka Ernst in sod [10]. Uporabili smo cdna, ki smo jo pripravili po standardnih postopkih opisanih v metodah. Sestava reakcijske mešanice je opisana v Tabeli 13. Preizkusili smo klasičen PCR protokol (tabela 48

58 14) in»touchdown«pcr protokol (Tabela 15). Oba protokola sta bila pripravljena glede na sestavo oligonukleotidnih začetnikov. Priprava reakcijske mešanice je opisana v metodah in načinih dela. Tabela 13: Sestava reakcijske mešanice za fragment A (f1a in f2a) Reagent μl / število reakcij 1 10 x Reakcijski PCR pufer 1x 6 MgSO 4 25 mm 2 dntp 0,2mM 1 ZON f1a ali f2a 10 pmol 2 ZON r1a 10 pmo 2 Optimase polimeraza 2,5 U / l 0,5 Voda 32,5 vsota 45 Tabela 14: Pogoji PCR reakcije (klasičen PCR). Korak T ( o C) čas št. ponovitev min 1 x s 3 62,2 30 s 29 x s min 1 x

59 Tabela 15: Pogoji PCR reakcije (»touchdown«pcr). KML sekvenčna reakcija 1 korak T ( o C) Čas št. ponovitev min 1 ' touch down ' protokol s vsak cikel za 0,5ºC navzdol 3 66,2 30 s s s 6 59,2 30 s s min REZULTAT Primerjava elektroforez produkta PCR (fragment A) za klasičen PCR in»touchdown«pcr kaže na to, da se fragment A pri navadnemu PCR-ju pomnožuje nespecifično. Specifičnost je večja pri»touchdown«protokolu. S»touchdown«PCR protokolom se oligonukleotidni začetniki vežejo bolj specifično zaradi ostrejših pogojev prileganja oligonukleotidnih začetnikov. Pri»touchdown«PCR protokolu se prileganje začne pri višji temperaturi. Višja temperatura prileganja oligonukleotidnih začetnikov pomeni večjo specifičnost vezave. Primerjava elektroforez optimiziranega (slika 13) in neoptimiziranega (Slika 14) PCR-ja za fragment A. 50

60 Slika 12: Elektroforeza neoptimiziranega PCR-ja za fragment A Slika 13: Elektroforeza optimiziranega PCR-ja za fragment A 51

61 4.3. DRUGI PREIZKUS Pri drugemu poskusu smo optimizirali koncentracijo MgSO 4, ki je vstopal v PCR reakcijo za vgnezdeni PCR ob določitvi mutacij v genu BCR - ABL1 ob pomnoževanju fragmentov B, C in D (Tabela 17). Uporabili smo priporočene pogoje za PCR reakcijo (v Tabeli 16). Postopek je opisan v metodah in načinih dela. Tabela 16: Pogoji za PCR reakcijo za fragment B, C in D. Korak T ( o C) čas št. ponovitev min 1 x s 3 63,5 30 s 29 x s min 1 x 6 4 Tabela 17: Reakcijske mešanice za vgnezdeni PCR ob določitvi mutacij v genu BCR - ABL1 ob pomnoževanju fragmentov B, C in D z različnimi koncentracijami MgSO 4. Reagent (μl) / konc. MgSO 4 10 x Reakcijski PCR pufer 1X 5 MgSO 4 25 mm 2 l/1 mm 2,5 l/ 1,25 mm 3 l/1,5 mm dntp 0,2 mm 1 ZON fb, fc ali fd 10 pmol 2 ZON rb, rc ali rd 10 pmol 2 Optimase polimeraza 2,5 U / l 0,5 Voda 36, ,5 vsota 49 52

62 REZULTAT Glede na elektroforezo PCR produktov (fragmenti B, C in D) pri različnih koncentracijah MgSO 4 smo se odločili, da je najoptimalnejša koncentracija MgSO 4, ki vstopa v reakcijo, 1 mm. Vendar ker, so se pri fragmentu D pojavljale še dodatne nespecifične vezave produktov PCR reakcije, smo se odločili, da bomo še dodatno poskusili optimizirati koncetracijo MgSO 4 za fragment D. Nižja koncentracija MgSO 4 naj bi pripomogla k večji specifičnosti vezave oligonukleotidnih začetnikov TRETJI PREIZKUS Pri tretjemu poskusu smo dodatno optimizirali koncentracijo MgSO 4, ki je vstopal v PCR reakcijo za vgnezdeni PCR ob določitvi mutacij v genu BCR - ABL1 ob pomnoževanju fragmenta D. Uporabili smo koncentracije MgSO 4 (1,75 mm, 2,0 mm, 2,25 mm in 2,5 mm). Postopek je opisan v metodah in načinih dela. Uporabili smo PCR pogoje opisane v Tabeli REZULTAT Glede na elektroforezo PCR produktov (fragment D) pri različnih koncentracijah MgSO 4 smo se odločili, da je najoptimalnejša koncetracija MgSO 4, ki vstopa v reakcijo 1,75 mm. Na elektroforezi so od leve proti desni nanešeni Leader, 1mM, 1,75mM, 1,25mM, 1,5mM, 2,0 mm, 2,25 mm in 2,5 mm MgSO 4. Ker so se pri fragmentu D pojavljale še dodatne nespecifične vezave zato smo se odločili, da bomo še dodatno poskusili optimizirati temperaturo prileganja oligonukleotidnih začetnikov za fragment D. 53

63 Slika 14: Optimizacija PCR-ja za fragment D pri različnih koncentracijah MgSO ČETRTI PREIZKUS Ker nam z optimiziranjem koncentracije MgSO 4, ki vstopa v reakcijo, ni uspelo izboljšati specifičnosti vezave oligonukleotidnih začetnikov za fragment D, smo se odločili, da bomo poskusili izboljšati specifičnost z optimizacijo temperature prilaganja oligonukleotidnih začetnikov. Z dodatnim zniževanjem koncentracije MgSO 4 bi dosegli le, da reakcija PCR ne bi stekla, kajti encim Optimeraza potrebuje za svoje delovanje zadostno koncentracijo MgSO 4. Uporabili smo 1,75 mm MgSO 4. Pogoji za PCR reakcijo pri različnih temperaturah prilaganja oligonukleotidnih začetnikov so opisani v Tabeli

64 Tabela 18: Pogoji za PCR reakcijo za fragment D. Različne temperature prilagajanja oligonukleotidnih začetnikov. Korak T ( o C) T 1( o C) T 2( o C) T 3( o C) T 4( o C) čas št. ponovitev min 1 x s 3 63, s 29 x s min 1 x REZULTAT Glede na elektroforezno ločbo PCR produkta fragmenta D, smo ugotovili, da je najbolj idealna temperatura prilagajanja oligonukleotidnih začetnikov 63,5 o C. Vendar se kljub temu na elektroforezni ločbi pojavlja dodatna lisa poleg PCR produkta fragmenta D, a je njena izraženost šibkejša kot pri ostalih temperaturah. Zato smo se odločili, da bomo poskusili povečati specifičnost vezave oligonukleotidnih začetnikov z»touchdown«protokolom za vezavo fragmenta D PETI PREIZKUS Ker kljub ostrejšim pogojem vezave oligonukleotidnih začetnikov še vedno nismo uspeli odstraniti nespecifične vezav, smo se odločili, da bomo poskusili s»touchdown«protokolom za pomnoževanje fragmenta D. Pri»touchdown«protokolu so pogoji vezave ostrejši in tako smo pričakovali, da se bomo znebili nespecifičnih vezav. Pri petem poskusu smo uporabili pogoje vezave za vgnezdeni PCR ob določitvi mutacij v genu BCR - ABL1 ob pomnoževanju fragmenta D, kjer smo uporabili koncentracijo MgSO 4 1,75 mm. Uporabili smo priporočene pogoje za touchdown protokol za PCR reakcijo (Tabela 19). 55

65 Tabela 19: Pogoji PCR reakcije (»touchdown«pcr) za fragment D. KML sekvenčna reakcija2 korak T ( o C) Čas št. ponovitev min 1 ' touch down ' protokol s vsak cikel za 0,5ºC navzdol s s s 6 59,2 30 s s min REZULTAT Kljub ostrejšim pogojem vezave so se še vedno pojavljale nespecifične vezave. Videle so se dodatne lise na elektroforezni ločbi. Kljub vsemu smo se odločili, da bomo poskusili sekvencionirati PCR produkte fragmenta B, C in D ŠESTI PREIZKUS Kljub še vedno prisotnim nespecifičnim vezavam na fragmentu D smo se odločili za sekvencioniranje PCR produktov B, C in D. Izvedli smo standardno sekvenčno reakcijo opisano v metodah in načinih dela, nato smo izvedli čiščenje PCR produktov sekvenčne reakcije z etanolno precipitacijo in sekvencioniranje. ter analiza pridobljenih podatkov opisano v metodih in načinih dela REZULTAT Kljub temu, da smo predvidevali, da so PCR produkti fragmentov B in C čisti in da ni prisotnih nespecifičnih vezav se je pri sekvencioniranju pokazalo, da so očitno prisotne nespecifične vezave, tako da sekvencioniranje ni uspelo. Za sekvencioniranje produkta D 56

66 smo predvidevali, da sekvencioniranje ne bo uspelo zaradi že videnih dodatnih lis na elekroforezni ločbi. Naša predvidevanja so se izkazala za pravilna. Odločili smo se, da bomo poizkusili poiskati alternativni način odstranitve nespecifičnih vezav oziroma nespecifičnih produktov PCR reakcije SEDMI PREIZKUS Ker nam kljub ostrejšim pogojem ni uspelo zmanjšati vpliva nespecifičnih vezav na rezultate sekvencioniranja smo poiskali alternativni način odstranitve PCR produktov, ki bi lahko motili sekvencioniranje. Odločili smo se za čiščenje produktov z hidrolitičnima encimoma (reagent ExoSup). Z ExoSupom smo očistili vse tri produkte PCR (B, C in D). Izvedli smo standardno sekvenčno reakcijo in nato izvedli čiščenje PCR produktov sekvenčne reakcije, sekvencioniranje. Postopki in analiza pridobljenih podatkov so opisani v metodah in načinih dela. Slika 15: Slika elektroforezne ločbe PCR produktov za fragment B, C in D. 57

67 Slika 16: Slika elektroforezne ločbe PCR produktov za fragment B, C in D po čiščenju s Exosupom REZULTAT Glede na elektroforezno ločbo PCR produktov B, C in D je ExoSup pri produktih B in C odstranil nespecifične vezave. Pri PCR produktu D pa le zmanjšal intenziteto dodatne lise prisotne na elektroforezni ločbi. Sekvencioniranje je pokazalo, da so pri produktih B in C sekvence boljše, vendar še vedno ne dovolj dobre za kvalitetno analizo. Medtem ko sekvencioniranje PCR produkta D še vedno moti nespecifična vezava vidna na elektroforezni ločbi produkta D. Odločili smo se, da bomo poskusili dodatno optimizirati koncetracijo oligonukleotidnih začetnikov, ki vstopajo v PCR reakcijo za fragment D OSMI PREIZKUS Ker ExoSup ni dal zadovoljivih rezultatov, smo se odločili dodatno optimizirati količino oligonukleotidnih začetnikov, ki vstopajo v PCR reakcijo za fragment D. Zmanjšana količina oligonukleotidnih začetnikov poveča specifičnost vezave v PCR reakciji. Uporabili smo priporočen»touchdown«protokol za PCR reakcijo (tabela 19). Ker izbrana koncentracija za MgSO 4 ni izboljšala specifičnosti vezave smo uporabili isto koncetracijo MgSO 4 kot v prvem poskusu (1,0 mm), preizkusili pa smo različne koncentracije 58

68 oligonukleotidnih začetnikov (20 pmol, 15 pmol, 10 pmol, 9 pmol, 8 pmol, 7 pmol, 6 pmol, 5 pmol) REZULTAT Tudi zmanjšana količina oligonukleotidnih začetnikov ni pripomogla k temu, da bi odstranili nespecifične vezave za fragment D vidne na elektroforezni ločbi. Na elektroforezi so vzorci nanešeni od leve proti desni v padajočih koncentracijah (od 20pmol do 5pmol) Tako, da smo se odločili, da bomo uporabili osnovni PCR protokol za fragmente A, B, C in D. Poskusili bomo tudi osamiti produkte PCR reakcij in izboljšati čiščenje produktov sekvenčne PCR reakcije. Slika 17: Optimizacija fragmenta D s različnimi koncentracijami oligonukleotidnih začetnikov. 59

69 4.10. DEVETI PREIZKUS Odločili smo se, da bomo uporabili osnovni PCR protokol (opisan v metodah in načinih dela) za fragmente A, B, C in D (slike 19, 20 in 21). Isti PCR pogoji za produkte B, C in D so bili izbrani zaradi tega, da bi olajšali postopek in s tem zmanjšali možnost napak. Pri predhodni optimizaciji pa se je tudi izkazalo, da različne koncentracije reagentov, ki vstopajo v reakcijo ne izboljšajo rezultata sekvence. Izboljšave teh protokolov je v tem, da bomo poskusili osamiti produkte PCR reakciji B, C in D na posebnih agaroznih gelih SIZE SELECT 2. Izboljšava pa je tudi v tem, da smo poskusili izboljšati čiščenje PCR produktov sekvenčne reakcije z reagenčnim kompletom BIGDYE XTERMINATOR PURIFICATION KITOM (opisano v metodah in načinih dela). Slika 18: Elektroforeza PCR produkta fragment B. 60

70 Slika 19:Elektroforeza PCR produkta fragment C. Slika 20: Elektroforeza PCR produkt fragment D REZULTAT Ker smo osamili produkte PCR reakcij fragmente B, C in D na gelih SIZE SELECT 2 %, ni bilo po elektroforezni ločbe le teh očiščenih PCR produktov vidnih dodatnih nespecifičnih vezav (Sliki 22 in 23). Produkte sekvenčne reakcije pa smo očistili z reagenčnim kompletom BIGDYE XTERMINATOR PURIFICATION KITOM (postopek je opisan v metodah in načinih dela). To je olajšalo postopek čiščenja, ker smo zmanjšali 61

71 število korakov v postopkih čiščenja, s tem pa se je zmanjšala možnost dodatnih napak. Sekvenčna analiza le teh PCR produktov je pokazala, da so sekvence kvalitetne in primerne za nadaljnjo analizo. S tem smo končali optimiziranje postopka za določanje mutacij v genu BCR-ABL1 s sekvencioniranjem pri bolnikih s kronično mieloično levkemijo. Slika 21: Elektroforeza po osamitvi produktov B in C z SIZE SELECT 2 % geli. Slika 22: Elektroforeza po osamitvi produkta D z SIZE SELECT 2% geli. 62