Lucrarea nr. 1 Măsurarea concentraţiei de glucoză din sânge

Transcript

1 Lucrarea nr. 1 Măsurarea concentraţiei de glucoză din sânge Introducere Sangele uman are o structura extrem de complexa, continand numeroase substante organice (proteine, grasimi, glucoza, enzime, hormoni, vitamine) si substante minerale (calciu, fosfor, sodiu, potasiu, etc). Analizele biochimice cerceteaza compozitia chimica fie a sangelui total, fie numai a serului sau plasmei sanguine. Glucoza este una din componentele sângelul uman alături de alte zaharuri: fructoza şi lactoza. Glucoza este cea mai importanta zaharida care se gaseste in mod normal in organele si sangele omului si constituie combustibilul cel mai pretios pentru obtinerea energiei necesare activitatii omului. Din arderea unui gram de glucoza, de catre organism, rezulta 4 calorii. Glucoza in organism provine din alimentele consumate de catre om. Cele mai bogate alimente in glucoza sunt dulciurile (zaharul, produsele zaharoase, mierea), precum si alimentele care contin amidon (faina de cereale si produsele cerealifere, cartofii etc.) care in organism se transforma prin actiunea enzimelor hidrolitice in glucoza. Organismul poate fabrica zahar din orice nutriment, chiar din proteine si grasimi prin procesul de gluconeogeneza. Pentru aprecierea cantitatii de zahar din organism, in laborator se analizeaza zaharul din sangele total ori din ser sau plasma. Valori normale ale glucozei din sange: mg la 100 ml sange. La persoanele de peste ani, valorile medii ale glicemiei sunt mai crescute decat la tineri, deoarece la ele si consumul de glucoza in organism este mai redus. Scaderea sau cresterea glicemiei in afara acestor valori produce perturbari grave organismului. Astfel, scaderea glicemiei prea mult sub valorile normale (hipoglicemie) poate produce ca simptome slabiciune, tremuraturi, transpiratii si chiar pierderea constientei (coma hipoglicemica). Acest lucru se intampla cand organismul este subalimentat cu alimente ce contin glucoza (glucide) sau in caz de infometare (inanitie). Eforturile fizice mari, mai ales pe munte, care consuma rezervele de glucide din ficat (in special la bolnavii de ficat) pot predispune la hipoglicemie. Hipoglicemia se intalneste mai rar in bolile unor glande endocrine care secreta hormoni insuficienti (hipofiza, tiroida, suprarenale), precum si la bolavii de diabet care se trateaza cu doze prea mari de insulina sau alte medicamente antidiabetice. Cresterea glicemiei (hiperglicemie) se intalneste si la persoanele sanatoase daca analiza sangelui se face dupa un consum crescut de dulciuri. De asemenea, persoanele care au avut un traumatism fizic sau psihic (stres) sau care s-au tratat cu anumite medicamente, pot avea o glicemie crescuta, fara a fi bolnavi de diabet. In aceste situatii glicemia revine la normal dupa ce a disparut si cauza care i-a provocat cresterea. O glicemie marita se intalneste in bolile glandelor endocrine care au rolul de a regla concentratia glucozei in sange. Astfel, secretia in exces a hormonilor unor glande (hiopofiza, tiroida, suprarenalele) produce hiperglicemie. Dar cea mai mare crestere a glicemiei se intalneste in diabetul zaharat sau diabetul pancreatic. Pancreasul este o glanda mixta, cu secretie endocrina de insulina si exocrina de enzime digestive ce se elimina in duoden. Insulina este un hormon ce are rolul de a ajuta la consumul si la arderea glucozei din sange si celule (insulina ajută la transportul zahărului spre celule). In unele boli ale pancreasului acesta secreta mai putina insulina sau nu mai secreta deloc si din aceasta cauza glucoza, in loc sa se consume, sa se arda, se acumuleaza in sange, crescand glicemia. Astfel, glicemia poate ajunge la mg% si chiar mai mult, ceea ce

2 duce la coma diabetica (coma hiperglicemica) mai ales la acele persoane care nu stiu ca au diabet. In afara de modificarile valorilor glucozei, in diabet sunt perturbate si alte componente ale sangelui. Astfel ca si in cazul subnutritiei, pentru a face fata cheltuielilor de energie organismul recurge la rezervele de grasime, pe care le mobilizeaza din depozite si le trece in sange spre a le utiliza in locul glucozei. De aceea, sangele diabeticilor este gras, laptos si analiza arata valori crescute ale grasimilor totale si ale colesterolului sanguin. Dar acest efort al organismului de a suplini prin grasimi lipsa glucozei este sortit esecului caci grasimile nu se ard pentru a da energia necesara decat in prezenta zaharului, a glucozei. Se spune ca grasimile ard in flacara produsa de glucoza drept urmare grasimile sunt arse incomplet rezultand substante toxice pentru organism (corpi cetonici, acetona). Prezenta acestor substante in sangele si urina unei persoane arata aproape sigur ca este vorba de un diabet grav, nedescoperit sau netratat corect. Intoxicatia organismului cu acetona si alte substante cetonice poate duce la coma diabetica. De notat ca acetona din sange creste asa de mult incat se elimina pe cale respiratorie, astfel ca aerul expirat de un bolnav de diabet in aceasta faza sau de un bolnav in coma diabetica miroase a acetona sau a mere coapte. In aceasta situatie analiza corpilor cetonici din sange si urina are o mare importanta pentru diagnosticul de diabet. In diabetul grav, pentru a face rost de glucoza organismul mobilizeaza nu numai grasimile ci si proteinele corpului. Din aceasta cauza, cu toate ca manaca mult diabeticul slabeste, caci isi consuma propriile lui proteine (diabetul cu slabire). Drept urmare, cresc si deseurile proteinice din sange: acidul uric, ureea, creatinina. Datorita iritatiei cronice a rinichiului de catre glucoza crescuta ce ajunge la acel nivel, se produce alterarea filtrului renal, care lasa sa treaca albumina din sange in urina (albuminurie). În esenţă, diabetul este o boală în care corpul uman nu produce suficientă insulină. Există două tipuri majore de diabet: diabet tipul I si tipul II. Diabetul de tipul I apare atunci când corpul nu mai produce deloc insulină, iar diabetul de tipul II apare atunci când corpul nu mai produce suficientă insulină, combinat cu scăderea nuvelului de insulină din corp. Diabetul de tipul II afectează 90% din bolnavii de diabet. Cauzele apariţiei diabetului sunt încă necunoscute. Se ştie doar că un rol esenţial în apariţia lui îl au: cauze de natură genetică, obezitatea, lipsa de exerciţii fizice. În momentul de faţă diabetul nu poate fi vindecat, singura soluţie fiind administrarea de medicamente pe toată durata vieţii pacientului. Tratamentul constă în măsurarea nivelului glicemiei în sânge şi administrarea unei doze de insulină combinate cu o alimentaţie săracă în glucide şi exerciţii fizice. Potrivit datelor de la Organizaţia Mondială a Sănătăţii, în jur de de persoane sunt bolnave de diabet de tip 2, în România Cea mai simplă şi populară metodă de măsurare a nuvelului glicemiei în sânge o reprezintă glucometrele portabile. Acestea sunt de dimensiuni din ce în ce mai mici, alimentate la baterii şi necesită cantităţi infime de sânge pentru a determina nivelul de glicemie din corp. Există mai multe metode de determinare a concentraţiei de glucoză din sânge: - amperometrice - optice Metodă de măsurare amperometrică a glicemiei. Metoda cea mai folosită pentru determinarea nivelului de glucoză din întreg sistemul sangvin este metoda amperometrică. Ea presupune recoltarea unei cantităţi de sânge venos de la pacient. Senzorul de glucoză este un strip (bandeletă) de diagnoză electrochimic care foloseşte o enzimă numită oxidaza glucozei şi trei electrozi. Doi dintre electrozi sunt electrozii de lucru ei fiind electrozii de măsură, iar cel de-al treile electrod fiind electrodul de

3 referinţă. Impedanţa ridicată a electrozilor îi face să fie adecvaţi măsurătorilor de tip amperometric. Măsurarea se face în felul următor: stripul (bandeleta) se introduce în instrumentul de măsură, iar instrumentul de măsură aplică un curent de 1µA între electrozii de lucru şi electrodul de referinţă. Diferenţele sunt monitorizate constant de către alaratul de măsură. Enzima depusă pe strip este plasată într-o arie numită zona de reacţie. Atunci când o picătură de sânge este aplicată corect pe această zonă, enzima împreună cu substratul mediator transferă electroni spre electrozi. Aceasta umple golul dintre electrozi şi are loc o scădere rapidă a tensiunii dintre electrozi. Atunci când tensiunea scade sub un nivel predeterminat, se iniţiază procesul de măsurare. În faza a doua, o tensiune constantă de 300mV este aplicată strip-ului şi se măsoară răspunsul electric pe o durată de timp predeterminată. Dacă există o diferenţă de 10% între cei doi electrozi de lucru se generează o eroare. În acest caz picătura de sânge a fost prea mică şi electrozii nu au fost acoperiţi cu cantitatea de sânge necesară realizării unei măsurători corecte. Este necesară fie adăugarea unei noi picături de sânge, fie repetarea măsurătorii cu un nou strip. Curentul care circulă între electrozi (la o aplicare corectă a picăturii de sânge) este proporţional cu nivelul de glucoză din sânge. Determinarea nivelului de glucoză se face comparând curentul care circulă prin electrozii de lucru cu curentul determinat în prima etapă (înainte de plasarea picăturii de sânge pe strip). Relaţia curent-concentraţie de glucoză devine liniară după 3 secunde de la iniţierea măsurătorii. Pentru obţinerea unor valori corecte, sunt necesare cam 5 secunde. Fig. 1. Strip conductiv pentru măsurarea glicemiei Pentru a asigura corecta măsurare a nivelului de glucoză din sânge, glucometrele au nevoie de o calibrare (pentru a compensa erorile şi offset-urile diverselor componente implicate în procesul de măsurare). Calibrarea se face prin trecerea instrumentului de măsură în modul calibrare şi plasarea unei picături dintr-o soluţie de glucoză co o concentraţie de 100mg/dl pe strip-ul de test. Instrumentul realizează măsurătoarea ca şi cum ar fi o picătură de sânge e strip, doar că în loc să afişeze rezultatul, îl foloseşte pentru a realiza o calibrare internă a algoritmului de măsurare.

4 Metode optice de măsurare a glicemiei a. Metoda spectrofotometrică folosind transmisia luminii (neinvazivă) Pentru determinarea optică a concentraţiei de glucoză se foloseşte un circuit format dintr-o diodă LED şi mai multe fotocelule (acordate pe diferite lungimi de undă). Fotocelulele sunt conectate le un circuit de amplificare şi apoi la convertorul A/D ale unui microcontroller, formând un spectrofotometru. Senzorul (ce cuprinde led-ul şi fotodiodele) este plasat pe lobul urechii pacientului. LED-ul iluminează ţesutul cu lumină în spectrul infraroşu (2-2.5µm). Radiaţia infraroşie trece prin ţesut unde este absorbită de diversele componente ale acestuia (piele, cartilagii, sânge, fluid interstiţial), fiecare având un spectru de absorbţie specific. Trei vârfuri importante se pot observa (Fig. 2) la 2.12 µm, 2.27 µm şi 2.32 µm. Fig. 2. Spectrul de absorbţie al glucozei Folosind curbe de calibrare determinate pe baza cunoaşterii concentraţiilor de glucoză şi a altor componente se poate determina concentraţia de glucoză pe baza absorbanţei ţesutului. Spectrul de absorbţie al glucozei este extras din spectrul de mai sus aplicând o curbă de calibrare ca în figura 3. Fig. 3. Spectru de calibrare al glucozei

5 Pentru a realiza măsurarea nivelului glicemiei dein sânge se plasează senzorul pe lobul urechii şi se măsoară spectrul de absorbţie. Celulele fotodetectoare au amplasate în faţă nişte filtre pe lungimile de undă de 2.12 μm, 2.27 μm, şi 2.32 μm. Fotocelulele vor înregistra nivelurile de absorbţie şi vor face o medie pentru a elimina din măsurătoare curgerea sângelui prin ţesuturi. Semnalul este apoi procesat de microcontroller, acesta indicând concentraţia de glucoză din sânge. Fig. 4. Spectrul de absorbţie al pielii Există mulţi factori care pot infuenţa măsurarea glicemiei prin metoda spectroscopică, printre care se numără şi componentele sângelui cu spectre de absorbţie apropiate de cele ale glucozei. Fig. 5. Spectrele de absorbţie ale diverselor componente sangvine

6 b. Metoda reflectometrică (invazivă) În esenţă metoda este tot una spectrofotometrică, dar se bazează pe reflexia luminii, nu pe transmiterea ei. Schema este prezentată în figura 6. Sursa de lumină a sistemului de măsurare este o diodă LED de intensitate mare. Pentru a genera 2 lungimi de undă diferite, se folosesc 2 diode LED. Lumina celor două diode LED este proiectată pe un strip pe care a fost depus în prealabil un reactiv. Lumina reflectată de pe reactiv este preluată de un fotodetector a cărui ieşire (curent) va fi proporţională cu lumina reflectată de reactiv. Timpul necesar citirii este de aproximativ 0.2 secunde. Semnalul preluat de la fotodetector este amplificat şi convertit în semnal digital care va fi procesat cu ajutorul unui microcontroller. Fig. 6. Schema bloc a unui instrument de măsură a glicemiei prin reflexia luminii. Metoda de măsurare este simplă: se aplică pe suprafaţa strp-ului o picătură de sânge. Strip-ul conţine o membrană hidrofilă, reflectantă şi poroasă. Pe lângă acestea mai conţine şi un substrat format din enzima oxidază a glucozei, peroxidază şi un colorant. Aceste componente reacţionează cu glucoza formând un colorant. Sistemul de măsură determină în permanenţă reflectivitatea reactivilor pentru a detecta o creştere a acesteia. Pentru a elimina interferenţele ce pot apărea (cauzate de prezenţa celorlalte elemente din sânge (de ex. hematocritul)) se folosec două lungimi de undă diferite: 635nm şi 700nm. Înainte de aplicarea picăturii de sânge pe strip se realizează o primă măsurătoare. După aplicarea picăturii de sânge se mai realizează mai multe măsurători la intervale de timp prestabilite şi la lungimi de undă diferite, rezultatele fiind comparate şi procesate de către microcontroller. Indicele de reflexie al colorantului este direct proporţional cu cantitatea de glucoză din sânge. Pentru concentraţii de glucoză sub 250mg/dl e nevoie de 20 de secunde pentru a se stabiliza reacţia chimică, iar pentru concentraţii de glucoză peste 450mg/dl e nevoie de 30 de secunde. Partea practică: - pentru un strip de tipul conductiv se măsoară rezistenţa dintre electrodul de referinţă şi electrozii de lucru în cazul în care nu s-a aplicat nici o picătură de substanţă pe el, în cazul în care s-a aplicat o soluţie de 100mg/dl, şi în cazul aplicării unei soluţii de 200mg/dl. Se măsoară conductivitatea în toate cele 3 cazuri. - Pentru un strip de tipul reflectiv se urmăreşte procesul de formare a colorantului în cazul aplicării unei soluţii de glucoză 100mg/dl şi în cazul unei soluţii de glucoză cu o concentraţie de 200mg/dl. Cu ajutorul unui laser cu lungimea de undă de 633 nm şi a unui indicator de intensitate luminoasă se determină reflectivitatea stripului.