Termostat. Coloană de gardă. Fluxul informaţional în sistem. Senzor de. presiune. Pompă de mare. presiune. Purjare de fază mobilă

Transcript

1 Sistemul de distribuire a solvenţilor Sistemul de distribuire a solvenţilor (SDS) este alcătuit din mai multe componente principale, a cărui configuraţie şi loc în cadrul sistemului general HPLC sunt redate schematic în Fig [18] Calculator Termostat SDS Injector Coloana Detector Proba Coloană de gardă Fluxul fazei mobile în sistem Fluxul informaţional în sistem SDS: A Senzor de presiune Cabinet de solvenţi (incluzând degazor) Sistem de proporţionare cu valve Pompă de mare presiune Damper Precoloană Purjare de fază mobilă B Senzor de presiune Cabinet de solvenţi (incluzând degazor) Pompa 1 Pompa Mixer Damper Precoloană Purjare de fază mobilă Fig Configuraţia unui sistem HPLC, cu două variante SDS. Funcţiile SDS, în una din variantele date în figura de mai sus, sunt următoarele: a) condiţionarea componentelor (apoase şi organice) din faza mobilă; b) amestecarea acestora în proporţia necesară separării cromatografice; 07

2 c) pomparea fazei mobile cu compoziţia realizată spre coloana cromatografică, cu un debit stabilit şi fără variaţii (pulsuri) ale acestuia; d) măsurarea presiunii în interiorul sistemului cromatografic, care poate da indicaţii privitoare la funcţionarea unor elemente ale sale; e) protejarea coloanei cromatografice de posibile deteriorări cauzate de faza mobilă. ecipienţii pentru solvenţi sunt utilizaţi pentru stocarea, filtrarea on-line şi degazarea solvenţilor stocaţi. De regulă, aceşti recipienţi sunt vase de sticlă, de volume şi geometrii variabile. In cazul (mai rar) în care amestecul de solvenţi este sensibil la prezenţa luminii, se recomandă vase de sticlă brune. Degazorul are rolul de a îndepărta aerul dizolvat în solvenţii utilizaţi pentru faza mobilă, care poate influenţa negativ detecţia (în special prin fluorescenţă) sau procesul de retenţie. Degazarea se poate face prin ultrasonare, înaintea începerii experimentelor cromatografice, sau prin barbotarea de He, care ar antrena cu el componenţii aerului, dizolvaţi în solvenţi. Cea mai utilizată metodă este aplicarea vidului, la trecerea fazei mobile prin dreptul unei membrane permeabile, aşa după cum se poate observa din figura următoare. [18] Membrană Pompă de vid Faza mobilă Spre pompa HPLC Fig Componentele unui degazor ale unei configuraţii HPLC. Pompele de înaltă presiune au rolul de a pune în mişcare fluxul fazei mobile de la vasele de stocare, până la ieşirea fazei mobile din sistemul cromatografic. Faza mobilă întâmpină o rezistenţă mare în coloana cromatografică datorită compactităţii fazei staţionare şi astfel se realizează presiuni mari la intrarea fazei mobile în coloana cromatografică. Se cunosc multe variante constructive de pompe de înaltă presiune pentru sistemele HPLC. In principiu, mişcarea unui piston în corpul pompei (de formă cilindrică) asigură distribuirea fazei mobile în sistemul cromatografic. Pistonul este confecţionat din safir sintetic sau oxid de zirconiu, iar corpul pompei este realizat din titan, oţel inoxidabil sau chiar materiale polimerice rezistente la frecarea pistonului (PEEK). olul damperului este acela de a atenua fluctuaţiile de debit ale fazei mobile în sistem. Principiul de funcţionare se bazează pe atenuarea fluctuaţiilor de debit al fazei mobile cu ajutorul unei membrane elastice ce separă două cavităţi. In una se găseşte un lichid având o compresibilitate joasă (un ulei), iar prin cealaltă trece faza mobilă. Mixerul are rolul de a omogeniza faza mobilă constituită din cel puţin două componente (una apoasă şi alta organică). Amestecarea se poate face static, prin trecerea solvenţilor printr-o coloana umplută cu bile mici de oţel inoxidabil, sau dinamic, prin utilizarea agitării magnetice. Precoloana menţionată în configuraţiile de mai sus este opţională, atunci când se utilizează în separarea cromatografică mecanismul de separare în fază normală. In acest caz, solvenţii organici trebuie să nu conţină urme de apă, care s-ar reţine în coloana 08

3 cromatografică (cu faza staţionară - silicagel) modificând drastic proprietăţile sale adsorbante. Sistemul de injecţie Injectorul în HPLC este o interfaţă realizând transferul exact şi reproductibil al volumul de probă între sistemul operator şi coloana cromatografică într-un front (bandă) cât mai îngustă posibil. Injectorul este poziţionat între sistemul de pompe şi coloana cromatografică. De regulă, proba în analiza prin HPLC este lichidă. Tubulatura folosită pentru conectarea injectorului cu coloana cromatografică trebuie să minimizeze pierderea de eficienţă (prin lărgirea frontului probei injectate). Unul dintre cei mai importanţi parametrii în analiza cromatografică este volumul de injecţie. In funcţie de acest parametru, metodele LC pot fi clasificate în următoarele clase: a) micro (cu un volum de injecţie în intervalul nl); b) analitice (0,5 μl 1 ml); c) preparative (0,1 10 ml). Solventul probei trebuie să fie în concordanţă cu mecanismul aplicat în separarea cromatografică, iar de cele mai multe ori compoziţia sa este identică (în special la volume mari de probă) sau foarte asemănătoare cu cea a fazei mobile. Injectorii în HPLC se mai numesc şi valve de comutare ( switching valves ). Ele sunt compuse din două părţi principale: statorul şi rotorul. Statorul are rolul de a face legătura cu celălalte componente ale sistemului HPLC, prin intermediul tubulaturii şi elementelor de etanşeitate (ferule sau nuturi). otorul este o piesă mobilă care face conexiunea cu diferitele porturi ale statorului. După cum se poate observa din Fig operaţia de injecţie cuprinde două etape: încărcarea buclei de injecţie ( LAD )şi apoi rotirea valvei pentru ca volumul probei să se situeze în direcţia fluxului fazei mobile ( IJECT ). Acestea pot fi efectuate manual sau automat. Încărcarea buclei Injectarea în coloană Bucla de injecţie Spre coloană Bucla de injecţie Spre coloană Probă Pompa Probă Pompă eziduu eziduu Fig Schema valvei cu 6 porturi (tip heodyne), utilizată în injecţia HPLC. 09

4 Detectori în cromatografia de lichide Detectorul în cromatografia de lichide trebuie să îndeplinească cel puţin două condiţii: 1) să aibă un răspuns rapid (în timp real); ) proprietatea măsurată trebuie să fie diferită pentru analiţii de interes care eluează din coloană şi componentele fazei mobile. Primul detector realizat în cromatografia de lichide a fost cel bazat pe măsurarea indicelui de refracţie. Deşi este un detector universal, sensibilitatea acestuia este foarte slabă, putând fi utilizat la determinarea concentraţiilor mari de analiţi din probe (peste 10 ppm). Cei mai importanţi detectori în HPLC sunt cei spectrometrici UV-VIZ. Principiul de detecţie poate fi absorbţia moleculară sau emisie moleculară (fluorescenţa). Detectorii de absorbţie moleculară UV-VIZ se bazează pe măsurarea absorbanţei unui fascicul monocromatic în concordanţă cu legea Lambert-Beer. Analiţii trebuie să conţină în structura lor un cromofor. Limita de detecţie a detectorilor bazaţi pe absorbţie moleculară este de 0,1 1 ng analit injectat în coloană. Detectorii bazaţi pe absorbţie moleculară în domeniul UV-VIZ sunt în principal de două feluri: 1) detectori cu lungime de undă variabilă, de tip dispersiv: ) detectori bazaţi pe reţea de diode ( diode-array detector DAD). Detectorul cu lungime variabilă utilizează o sursă de radiaţie continuă pe domeniul UV/VIZ, iar selectarea lungimii de undă la care are loc detecţia se face cu ajutorul unei reţele de difracţie (holografică). Alegerea lungimii de undă pentru înregistrarea cromatogramei se face cunoscând spectrele de absorbţie ale analiţilor detectaţi. schemă a acestui detector este redată în figura de mai jos. Sursa de radiaţie eţea holografică Faza mobilă Celula de cuarţ 1 Fotodiode Fig Detector în ultraviolet cu lungime de undă variabilă, în care 1 este fotodioda pentru detecţie, iar este fotodioda de referinţă. Sistemele de detecţie cu reţea de diode sunt cele mai performante în analiza HPLC (tehnica este abreviată cu HPLC-DAD). Tehnica spectrometrică DAD este un caz particular de caracterizare spectrală a interacţiei dintre radiaţia electromagnetică şi probă (în cazul HPLC, fluxul mobil care ajunge în celulă), prin măsurarea simultană a intensităţii 10

5 luminii pe intervale de lăţime spectrală egală. Aceasta se realizează prin câteva etape secvenţiale, după cum urmează: [19] - interacţia probei cu un fascicul policromatic de radiaţie; - dispersia spaţială a radiaţiei transmise (eventual reflectată sau emisă de probă) după lungime de undă prin utilizarea unui element optic fix; - focalizarea radiaţiei dispersate într-un plan focal plat; - eşantionarea simultană a radiaţiei dispersate la intervale egale cu ajutorul unor detectori fotosensibili, poziţionaţi precis în planul focal plat. Fiecare dintre detectori de tip fotodiodă, aranjaţi unul lângă altul, are capacitatea de măsurare a intensităţii de radiaţie pe intervale spectrale. ezoluţia măsurătorilor spectrale depinde de numărul de fotodiode utilizate. Dacă de exemplu, pe domeniul spectral nm rezoluţia măsurătorilor spectrale este de 1 nm, numărul de fotodiode plasate în reţea este de 900. In felul acesta, acest detector poate surprinde spectrul de absorbţie UV-VIZ în timp real (instantaneu). Schema unui detector bazat pe reţea de diode este redată în figura următoare. Lentilă Faza mobilă Celula de cuarţ eţea holografică Sursa UV-VIZ: lampă cu deuteriu + lampă cu halogeni Celulă în flux eţea de fotodiode Fig Detector în ultraviolet cu reţea de fotodiode (DAD). Spectrele înregistrate prin DAD pot fi utilizate la identificarea compuşilor eluaţi, prin compararea spectrelor obţinute cu cele din librăria spectrală. Gradul de similaritate ( similarity index SI) între două spectre, notate cu A (cel experimental) şi B (cel din librăria spectrală), exprimat procentual, în domeniul UV-VIZ se calculează cu ajutorul relaţiei: 1 [ A(λi ) B(λ i ) A(λi ) B(λ i )] i n i i SI = 100 (11.1) 1 1 { A(λi ) [ A(λi )] } { B(λ i ) [ B(λ i )] } i n i i n i, unde λ i este lungimea de undă în care se măsoară absorbanţele celor două spectre de comparat, A(λ i ) şi B(λ i ). In funcţie de valorile lui SI putem distinge următoarele situaţii: 11

6 1) SI = 0, unul dintre spectre este linia de bază ( A (λi ) = 0, sau B (λi ) = 0, oricare λ i i i din UV-VIZ); ) SI = 100, cele două spectre sunt identice; 3) SI > 99, cele două spectre sunt similare; 4) 90 < SI < 99, există similaritate între cele două spectre, dar interpretarea trebuie făcută cu atenţie; 5) SI < 90, practic cele două spectre sunt diferite. bs.: cu cât numărul de puncte este mai mare, cu atât gradul de similaritate este mai obiectiv în compararea celor două spectre. Detecţia de fluorescenţă (FLD) este utilizată în cazul analiţilor fluorescenţi. Abrevierea acestei tehnici analitice este HPLC-FLD. In felul acesta selectivitatea determinărilor este asigurată şi de proprietatea analiţilor de a emite radiaţie în vizibil, atunci când sunt excitaţi cu radiaţie în ultraviolet. Parametrii detecţiei de fluorescenţă sunt λ excitaţie şi λ emisie. Exemple de compuşi organici cu proprietăţi fluorescente sunt hidrocarburile aromatice polinucleare (de exemplu cele 16 PAHs din Tabel.5). In cazul compuşilor fără proprietăţi fluorescente se poate aplica o reacţie de derivatizare, prin care în structura analiţilor să se introducă o grupare fluorogenă (grupare cu proprietăţi fluorescente). Detecţie de fluorescenţă este influenţată de o serie de factori care ţin de natura analiţilor sau de condiţiile experimentale ale separărilor cromatografice. Aceşti ultimi parametri sunt redaţi şi discutaţi în tabelul Lampă cu Xe Fante de colimare glindă eţea holografică excitare eţea holografică 1 Lentilă Celulă în flux Fotomultiplicator Fig Schema unui detector de fluorescenţă cu monocromator, utilizat în HPLC. 1

7 Tabel Influenţa unor parametrii experimentali asupra detecţiei de fluorescenţă. Parametrul fazei Efectul asupra fluorescenţei mobile Atât lungimea de undă a emisiei, cât şi intensitatea fluorescenţei, în cazul compuşilor aromatici cu grupări funcţionale disociabile sunt ph puternic dependente de valoarea ph-ului, precum şi de interacţiile prin legături de hidrogen. Influenţă cu un ordin de mărime asupra intensităţii şi deplasarea lungimii de undă de emisie maximă datorită interacţiunilor puternice cu solventul. deplasare a benzii de emisie către lungimea de undă mai mare se Solvent observă la creşterea constantei dielectrice a solventului. Dacă solventul absoarbe fie la lungimea de undă de excitaţie, fie de emisie, atunci are loc o scădere a sensibilităţii detecţiei analiţilor din probă. andamentul de fluorescenţă este influenţat de temperatură: prin Temperatura creşterea temperaturii randamentul de fluorescenţă scade de ordinul 1- %/ C. Prezenţa impurităţilor, în special a oxigenului dacă solvenţii nu sunt corespunzător degazaţi, poate produce un efect de stingere Impurităţi (quenching) a semnalului de fluorescenţă, în special atunci când concentraţiile analiţilor sunt mici, la limita domeniului de detecţie. Sursele cu intensitate mare a radiaţiei utilizate pentru excitare pot produce în unele cazuri descompunerea unor analiţi, proces care Debit depinde de timpul de staţionare al analiţilor în celula de detecţie, care, la rândul lui, depinde de debitul fazei mobile. Un detector aproape universal, dar cu sensibilitate scăzută, este detectorul bazat pe măsurarea radiaţiei împrăştiate ( evaporative light scattering detector ELSD). Acesta este utilizat cu precădere pentru detecţia compuşilor organici nevolatili. Este considerat un detector de tip distructiv şi de aceea într-o configuraţie cu mai mulţi detectori va fi plasat ultimul în serie. Schema unui astfel de detector este redată în Fig elaţia dintre aria picului cromatografic obţinut cu un astfel de detector pentru un compus i (A i ) şi cantitatea de analit injectată în coloana cromatografică (m i ) este nelineară, fiind printre puţinele relaţii de nelinearitate în chimia analitică între cantitate de analit şi răspunsul detecţiei. elaţia dintre calibrare între aria de pic (A i ) şi cantitatea de analit injectată în coloană (m i ) este următoarea: A n i = ζ m i (n > 1) (11.), care prin logaritmare devine: lg A i = lgζ + n lg m i (11.3) sau: lg A i = ai + bi lgmi (11.4), în care parametrii de regresie a i şi b i se stabilesc din procedura de calibrare a metodei. Parametrii experimentali care influenţează sensibilitatea şi precizia determinărilor sunt: temperatura din camera de nebulizare şi debitul de introdus. 13

8 Efluent din coloană Cameră de nebulizare sau aer Celulă de detecţie Sursă de radiaţie Fotomultiplicator Achiziţie de date Fig Elementele componente ale unui detector ELSD Derivatizarea în analiza HPLC Scopurile derivatizării în analiza HPLC sunt următoarele: - modificarea retenţiei analiţilor de interes: a) analiţii foarte hidrofobi care vor elua din coloană cromatografică la timpi de retenţie foarte mari vor suferi o modificare structurală astfel încât să devină mai puţin hidrofobi ce vor elua la timpi de retenţie mai mici; b) analiţii hidrofili eluează din coloană foarte repede (uneori aproape de timpul mort), iar prin modificarea structurală se va urmări introducerea unor grupări hidrocarbonate, compuşii rezultaţi fiind mai puţin polari vor elua la timpi de retenţie mai mari. - îmbunătăţirea detecţiei analiţilor: dacă analiţii de interes nu conţin în structura lor un cromofor, prin reacţia de derivatizare se vor introduce grupări de cromofori, astfel încât aceştia să absoarbă în domeniul ultraviolet sau vizibil. De asemenea, prin derivatizare pot fi introduse grupări structurale cu proprietăţi fluorescente, astfel încât detecţia produşilor formaţi va fi şi mai sensibilă. Din acest punct de vedere reacţiile de derivatizare pot fi clasificate în: reacţii pentru creşterea sensibilităţii pentru absorbţia UV-VIZ; reacţii pentru introducerea de grupări fluorescente în structura analiţilor; reacţii pentru detecţia prin chemiluminiscenţă; reacţii pentru detecţia electrochimică; reacţii pentru îmbunătăţirea detecţiei prin spectrometrie de masă. - îmbunătăţirea selectivităţii separării cromatografice, prin modificarea proprietăţilor hidrofob/hidrofile doar a unora dintre analiţi, astfel încât în final aceştia să poată fi separaţi cromatografic între ei, sau faţă de componenţii matricei probei. Dintre cele mai importante aplicaţii analitice ale derivatizărilor moleculelor de analiţi din diverse probe se vor prezenta în continuare următoarele exemple. A) Compuşii carbonilici alifatici pot fi derivatizaţi conform procedurii bazate pe reactivul,4-dinitrofenilhidrazina (,4-DPH) pentru ai face detectaţi prin spectrometrie de absorbţie în ultraviolet şi atunci când 1 sau sunt foarte lungi (hidrofobicitate mare) mai puţin hidrofobi. 14

9 1 1 - H C + H H C H eacţia are loc în mediu acid, în prezenţa unui solvent organic (acetonitrilul este cel mai recomandabil, deoarece poate fi regăsit ca modificator organic în compoziţia fazei mobile a separării cromatografice). B) Clorura de dansil este un reactiv foarte comun pentru derivatizarea aminelor, fenolilor sau tiolilor. Compuşii rezultaţi prin derivatizare sunt fluorescenţi. H 3 C CH 3 S Cl + H SH H - HCl H 3 C CH 3 C) Aminele primare alifatice, care nu absorb în ultraviolet pot fi derivatizare cu ajutorul o-ftalaldehidei (PA), în prezenţa unui compus tiolic (cel mai recomandat este mercaptoetanolul), prin care rezultă un compus fluorescent. CH CH + H + HS ' - H S S H ' D) Cloroformiatul de fluorenilmetil (FMC) este un reactiv de derivatizare larg utilizat pentru detecţia prin fluorescenţa a compuşilor hidroxilici. H C C Cl H C C + H - HCl E) Fenilizotiocianat reacţionează cu α-aminoacizii, conducând la derivaţi cu nucleu tiohidantoinic, compus care va absorbi radiatie in ultraviolet. S C + CH C H H - H S F) Un reactiv pentru introducerea unei grupări flurorescente puternice în special în molecule cu grupări amino secundare este 7-clor-4-nitrobenzo--oxa-1,3,-diazol: Cl + H 1 - HCl 1 15

10 Cromatografia în strat subţire Cromatografia în strat subţire (thin-layer chromatography TLC) este o variantă a cromatografiei planare, în care faza staţionară solidă este depusă pe o suprafaţă inertă (de regulă, o placă de sticlă). Datorită simplităţii sale, această tehnică este încă utilizată cu destul succes în laboratoare pentru separarea unor amestecuri de compuşi organici. Dintre toate tehnicile cromatografice, aceasta oferă posibilitatea separării simultane a unui număr foarte mare de probe (până la de probe). Astfel, Farmacopeile Europeană, Britanică sau Americană încă prevăd metode TLC pentru determinarea unor impurităţi corelate în unele substanţe active din formulaţii farmaceutice. Proba este aplicată pe aşa-numita linie de start de pe placa cromatografică sub forma unui spot, cât mai puţin întins cu putinţă. Capătul inferior al plăcii este apoi plasat într-un tanc ce conţine faza mobilă necesară separării. Aceasta va migra vertical prin stratul de faza staţionară. Componenţii probei vor participa la procesul de partiţie între faza mobilă şi faza staţionară; cei care vor avea o afinitate mai mare faţă de faza mobilă vor fi mai apropiaţi de frontul fazei mobile, iar cei care vor avea o afinitate mai mare faţă de faza staţionară vor migra mai puţin de-a lungul direcţiei în care se deplasează faza mobilă pe placa cromatografică. Din acest punct de vedere retenţia în cromatografia pe strat subţire este asemănătoare celei care are loc pe o coloană cromatografică. Factorul de retenţie (notat cu f,i ) al unui compus (i) se calculează cu ajutorul parametrilor de retenţie, descrişi în Fig. 11.3, utilizând următoarea relaţie: z i f,i = (11.5) zfm Valorile lui f,i variază între 0 (analitul nu migrează) şi 0,999 (analitul migrează odată cu frontul solventului fazei mobile, faţă de care are o mare afinitate/solubilitate). Frontul fazei mobile Componenţi neseparaţi z fm z i Linia de start Fig Parametri cromatografici măsuraţi din separarea TLC a unui amestec (z i măsurat din linia de start până în centrul spotului analitului i). 16

11 Cu ajutorul factorului de retenţie se poate calcula un alt parametru (descriptor) care să descrie procesul de retenţie, notat cu M,i şi calculat prin relaţia: 1 f,i M,i = log (11.6) f,i Din punctul de vedere al mecanismului de separare, cromatografia în strat subţire se împarte ca şi cromatografia pe coloana în doua clase principale: 1) separări TLC în fază normală (P-TLC); ) separări TLC în fază inversă (P-TLC). Faza staţionară în P-TLC este un adsorbant anorganic (de exemplu, silicagel, alumina sau Florisil), sau silicagel chimic modificat cu grupări cian sau diol. In acest mecanism faza mobilă este organică fără urme de apă. Faza staţionară şi faza mobilă în cazul P-TLC sunt asemănătoare aceluiaşi mecanism desfăşurat în cromatografia pe coloană. Martin şi Synge au propus un model simplu care să descrie procesul de partiţie cromatografic pe strat subţire, pornind de la relaţia ce defineşte factorul de retenţie pentru un analit: f n = m (11.7) nm + ns, în care n m şi n s reprezintă numărul de moli de analit din faza mobilă, respectiv faza staţionară. Aceste mărimi se corelează cu concentraţiile respective şi volumele de fază mobilă (V m ) şi fază staţionară (V s ), astfel că formula de mai sus poate fi modificată astfel: f cmvm 1 = = (11.8) cmvm + csvs csv 1+ s cmvm Considerând că echilibrul de partiţie a analitului între faza mobilă şi faza staţionară este caracterizat de constanta de echilibru K = c s /c m, relaţia 11.7 poate fi scrisă în forma: f = 1 1+ φ K (11.9), în care ϕ reprezintă raportul V s /V m, numit raportul volumetric al celor două faze care iau parte la procesul de separare TLC. Detecţia în TLC se face prin spectrometrie de absorbţie moleculară UV-VIZ (când compuşii sunt coloraţi ori absorb în ultraviolet, sau când se aplică reacţii de derivatizare cu introducerea unui cromofor), spectrometrie de emisie moleculară UV-VIZ (când compuşii sunt fluorescenţi sau când se aplică o reacţie de derivatizare cu introducerea sau inducerea unei grupări fluorogene), prin spectrometrie în infraroşu (un fascicol I este focalizat cu ajutorul unei oglinzi reflectante pe spotul analitului, iar fascicolul reflectat este direcţionat de o altă oglindă către detectorul spectrometrului), prin spectrometrie aman (bazat pe măsurarea radiaţiei împrăştiate), sau spectrometrie de masă (o porţiune a spotului analitului este ionizat cu ajutorul unui fascicul laser, sub vid, şi direcţionat către separatorul şi apoi detectorul de ioni al spectrometrului de masă). [130] 17