ביולוגיה מולקולרית סמסטר חורף 2017/2018

Transcript

1 1 ביולוגיה מולקולרית סמסטר חורף 2017/2018

2 2 תוכן העניינים: עמוד שם המרצה הרצאה 3 עמי אהרונהיים מבנה ה DNA 1 13 עמי אהרונהיים שכפול 2 23 עמי אהרונהיים שיטות בביולוגיה מולקולרית 3 26 עמי אהרונהיים תיקון DNA 4 36 מרדכי חודר אורגניזמים כמודל מחקרי שמר 5 38 אמיר אורין אורגניזמים כמודל מחקרי זבוב 6 41 מרדכי חודר שעתוק 7 65 רעות שלגי תרגום 8 81 אמיר אורין שינויים פוסט תרגומיים 9

3 3 דנה לינדר שחם ביולוגיה מולקולרית ד"ר עמי אהרונהיים, ד"ר מוטי חודר, פרופ' אמין אוריאן, ד"ר רעות שלגי. מבנה ה- DNA מנדל היה הראשון שהבין כי ישנו חומר גנטי, אשר קובע את התכונות של האורגניזם, אבל הוא לא ידע כיצד הוא נראה. פרדריק גריפית' ערך ניסוי שהראה כי חלבונים אינם אחראים על התורשה. הוא עבד עם חיידקי סטרפטוקקוס משני סוגים- חיידקים מחוללי מחלה, שלהם מבנה מעטפת של קפסולה חלקה,)S-smooth( וחיידקים שאינם מחוללי מחלה, שלהם מבנה מעטפת של קפסולה מחוספסת.)R-rough( הוא שם לב שאם הוא לוקח חיידקים חיים בעלי מעטפת חלקה, הם מדביקים עכברים במחלה, ואם הוא לוקח חיידקים מחוספסים חיים, העכברים אינם נדבקים. לאחר מכן הוא החדיר לעכברים חיידקים מתים מסוג S, והעכברים לא נדבקו במחלה; אבל כאשר הוא לקח עכברים והחדיר להם חיידקי R חיים עם חיידקי S מתים שעברו הרתחה )לצורך הרס החלבונים(, העכברים כן נדבקו. הוא הסיק מכך כי ישנו חומר שעובר מהחיידקים החלקים המתים אל החיידקים המחוספסים, וכי זה לא חלבון. הרשי וצ'ייס עבדו עם בקטריופאג'ים, שהם וירוסים שמדביקים חיידקים. הם סימנו אצל הבקטריופאג'ים בחומר רדיואקטיבי מבנים המכילים פוספט )זה ה- DNA ( ובחומר רדיואקטיבי אחר מבנים המכילים גופרית )אלו חלבונים במעטפת של הבקטריה(. לאחר מעבר בצנטריפוגה, בתאי החיידק מצאו רק את הסימונים לפוספט ולא לגופרית. מכאן הסיקו כי החומר הנכנס לחיידק ומדביק אותו הוא זה שמכיל פוספט ולא גופרית. בהמשך התברר שזה.DNA יחידות הבניין של ה- DNA ה- DNA מורכב מנוקלאוטידים. כל נוקלאוטיד מכיל 3 מרכיבים עיקריים: פוספט, סוכר, ובסיס חנקני. יחידת הבסיס עם הסוכר נקרא נוקלאוסיד, ויחד עם הפוספט הוא נקרא נוקלאוטיד. הסוכר נקרא פנטוז או ריבוז. הוא מורכב משרשרת בעלת 5 פחמנים וחמצן. על פחמנים 2 ו- 3 יש קבוצת הידרוקסיד )קבוצת.)OH פחמן 5 קשור אל קבוצת הפוספט הטעונה שלילית ב- ph פיסיולוגי. לכן גם ה- DNA שלילי. מתאימה. כאשר חסרה לו קבוצת הידרוקסיל בעמדה 2, הוא נקרא דה-אוקסי ריבוז. מאחר וה- DNA הוא חומצה, הוא יכול למסור פרוטון בסביבת ph

4 4 הנוקלאוטידים קשורים זה לזה בקשר פוספו-די-אסטרי. קשר אסטרי הוא בין פחמן לחמצן, לכן מדובר בשני קשרים פחמן-חמצן: פחמן 3 של הסוכר, נקשר לחמצן של קבוצת הפוספט של מהנוקלאוטיד הבא, שהוא קשור לפחמן 5 של הסוכר מאותו נוקלאוטיד. מה שיוצא זה שרשרת בה פחמן 3 של נוקלאוטיד אחד מחובר אל פחמן 5 של הנוקלאוטיד הבא דרך קבוצת פוספט. הבסיסים לא מעורבים בקישור השרשרת בתוך אותו הגדיל. ישנם ארבעה בסיסים חנקניים ב- DNA :.A,G,C,T הם מתחלקים לשתי משפחות: פורינים )A,G( ופירמידינים.)T,C( לשתי המשפחות מבנה שונה- לפירמידינים טבעת אחת של 6, ולפורינים ושתי טבעות מחוברות - של 5 ושל 6. )צריך לזכור את המבנים האלו בע"פ(. ישנו בסיס נוסף הנקרא U, אשר מצוי ב- RNA והוא מחליף את ה- T.

5 לC 5 קראגף עסק בניקוי,DNA ובחן את השכיחות של כל אחד מהבסיסים ב- DNA בקרב זנים שונים. הוא שם לב כי בכל הזנים שבדק, היחס בין גואנין לציטוזין ובין אדנין לטימין הוא תמיד זהה, בכל הפרטים מאותו הזן. כלומר כמות ה- G שווה לכמות ה- C וכמות ה- A שווה לכמות ה- T, בכל יצור חי, ומה שמשתנה בין היצורים הוא היחס בין AT ו- CG. סינתזת DNA קישור של נוקלאוטיד אחד לשרשרת דורש השקעה של שתי מולקולות.ATP תחילה נוקלאוזיד-מונו-פוספט )שזה סוכר+בסיס+פוספט אחד( קושרים עוד 2 פוספטים ליצירת dntp-.deoxyribonucleotide triphosphate זה דורש השקעת 2 מולקולות ATP )שהופכות ל-.)ADP ה- dntp הוא תוצר ביניים גבוה מאוד באנרגיה. הוא יקשר אל השרשרת הפולינוקלאוטידית תוך שהוא יאבד את 2 הפוספטים שנוספו. בעצם הוא ישאר רק עם פוספט אלפא )שהכי קרוב לפחמן 5(, שיקשר אל ההידרוקסיל של פחמן 3 מהשרשרת. ביצירת הקשר הפוספו-די-אסטרי יוצאת מול' מים. מבנה ה- DNA ווסטון וקריק, בעזרתם של פרנקלין ו-וילקיס, פיצחו את מבנה ה- DNA. הבחינו כי מדובר בסליל כפול המסתובב פנימה. לצורך הסיבוב, כל בסיס נמצא בזוית של הבסיסים החנקניים נמצאים במרכז- בפנים הסליל, והחלק החיצוני הוא הסוכר והפוספט. הבסיסים החנקניים קשורים בקשרי מימן אשר סוגרים את הסליל הכפול. בין ה- A וה- T יש 2 קשרי מימן ובין ה- -G יש 3 קשרי מימן. רוחב הקשרים האלו הוא זהה ולכן המבנה הוא מאוד סדור: רוחב בין סלילים,2nm מרחק בין נוקלאוטידים,0.34nm כל סיבוב של הוא 10.4 בסיסים, ואורכו 3.4 ננומטר.

6 6 הגדילים הם אנטי-פרללים. המשמעות היא ששניהם הולכים מ-' 5 ל-' 3. זהות הקצה תלויה בקבוצה החופשית. כאמור, הקשר הפוספו די-אסטרי הוא בין פוספט )של פחמן 5 בריבוז( להידרוקסיד )של פחמן 3 בריבוז(. בקצה ה- '5 יש פוספט לא קשור, ובקצה ה- '3 יש הידרוקסיד לא קשור. בחלקו החיצוני, כל גדיל DNA הוא: (5') phosphate-sugar-phosphate-sugar. -phosphate-sugar (3') נוקלאוטיד נוקלאוטיד נוקלאוטיד קשר פוספו-די אסטרי בסכמות, רצף של DNA נקרא משמאל לימין. המוסכמה היא שצד שמאל הוא צד ה-' 5. בחלק החיצוני של הסליל, שפונה לנוזל, יש שקעים הנקראים.groove ישנו חלק עם שטח פנים יותר רחב הנקרא,major groove וחלק עם שטח פנים יותר קטן הנקרא.minor groove אזורים אלו יכולים ליצור אינטראקציות של קשרי מימן עם פקטורי שעתוק. החלבונים שעל גדיל ה- DNA נקראים,cis regulatory factors והחלבונים שמייצרים אינטראקציה איתם בתהליכים תאיים שונים נקראים.trans regulatory factors למבנה הסליל הכפול יש תפקיד בהורשה של ה- DNA מדור לדור ובקידוד לחלבונים, וזאת בגלל העובדה שהגדילים קומפלמנטרים. ווטסון וקריק כבר במאמרם הראשון שיערו כי הסליל נפתח, וכל גדיל משמש תבנית לשכפול של ה- DNA. מבנה ה- RNA מבנה ה- RNA דומה ל- DNA, הוא כולל סוכר, פוספט ובסיס חנקני, אבל עם כמה שינויים: הסוכר הוא ריבוז ולא דה-אוקסי ריבוז. לכן, יש קבוצת הידרוקסיל על עמדה 2. גם מולקולת RNA היא שורה של נוקלאוטידים הקשורים בקשר פוספו-די-אסטרי, באותם המקומות כמו ב- DNA. בבסיסים החנקניים לא קיים טימין אלא אורציל )U(, שדומה מאוד לטימין, עם הבדל של קבוצת מתיל אחת. ה- RNA הוא חד גדילי. לכן הוא פחות יציב בהשוואה ל- DNA. כך למשל, בסביבה בסיסית מתפרק הוא יתפרק בעוד שה- DNA נותר יציב תפקידיו של ה- RNA מעביר את המידע הגנטי מהגרעין לציטופלסמה. מסייע ביצירת חלבונים..1.2 תחת משפחת RNA נמצא את ה- mrna, rrna,trna )שממנו נוצרים הריבוזומים( ו- RNA non coding שחשובים לרגולציה.

7 7 סידור הגנים בגנום הגנים מסודרים על פני הכרומוזומים, אשר מאורגנים בזוגות. לכל יצור יש מספר שונה של כרומוזומים. הגנום האנושי מכיל כ- 3 מיליארד נוקלאוטידים, ורק כ- 1.5% מהגנום מקודד לחלבונים. מתברר כי ליצורים פשוטים, כמו השמר, יש הרבה פחות אזורים לא מקודדים מאשר לבני אדם, והרבה פחות חזרות. אצל בני אדם, מספר הגנים הלא מקודדים הוא כ )גן לא מקודד הוא גן אשר משועתק ל- RNA אך לא מתורגם לחלבון. יש לו תפקיד רגולטורי או אנזימתי(, ומספר הגנים המקודדים הוא כ- 20,000. בנוסף, יש עוד כ- 20,000 פסואודו-גנים. גנים יכולים להתפרש על אזור עצום בכרומוזום )דהיינו המון )bp וגם על אזורים קטנים )מעט.)bp אין קשר בין גודל החלבון לבין גודל האזור ב- DNA שעליו יושב הגן התואם, וזאת בגלל האינטרונים. ה- DNA נמצא בגרעין התא, שהוא אברון בעל מעטפת כפולה. ישנם תאים שאין להם גרעין, כמו תאי דם אדומים )ולהם אין גם,)DNA ותאים פרוקריוטים )שם ה- DNA נמצא בציטופלסמה(. באאוקריוטים, ה- DNA מעוגן בגרעין ואינו יכול לצאת. הכרומוזומים הם דחוסים מאוד, ומכילים בנוסף ל- DNA גם חלבונים ו- RNA. לכרומוזום שלושה מבניים עיקרים: הטלומר, אשר נמצא בקצה של הכרומוזום. אזור זה צריך להיות מוגן כדי שהתא לא יחשוב שהוא כרומוזום שנשבר ויטפל בו בהתאם. הצנטרומר. אזור זה הוא בעל משמעות מיוחדת בשכפול ה- DNA. הוא יודע להיקשר לסיבי הקישור במיטוזה..Origin of replication אזור שאחראי על הרפליקציה של הכרומוזום. יש מספר אזורים כאלו על הכרומוזום במידה והוא ארוך בקריוטיפ צובעים את ה- DNA כדי לבחון אותו, ולחפש שינויים כרומוזומלים. הצביעה עושה שימוש באזורים שהם מיוחדים לכל כרומוזום )מבחינת רצף של בסיסים(. מסמנים בסיסים בצבעים פלורסנטים שונים, גורמים לגדילים להיפתח, ואז הבסיסים הצבועים משלימים אותם ליצירת דו-גדיל חדש. צביעה זו חשובה לזהות טרנסלוקציות. בטרנסלוקציות יש שבירה ואיחוי של חלקים בכרומוזום אחד אל כרומוזום אחר, וצביעה זו מאפשרת לזהות את זה, כי היא מראה שהכרומוזומים ההומולוגים אינם זהים. אם מסתכלים על קריוטיפים של חיות שונות מוצאים כי הגנום הוא מאוד שונה מבחינת מספר וסידור הכרומוזומים, ואפילו בין זנים שונים של אותה החיה ניתן למצוא הבדלים. כמות הכרומוזומים לא מעידה על מורכבות היצור. על אף השוני בכרומוזומים, הרצפים המקודדים לחלבונים הם כן דומים כי הם שמורים.

8 8 אריזה של ה- DNA האריזה של ה- DNA היא מאוד צפופה וזאת על מנת שהוא יוכל להיכנס אל הגרעין הקטן. ה- DNA הארוז מסודר במבנה שנקרא כרומטין. הכרומטין הוא כ- 1/3,DNA 1/3 חלבונים הנקראים היסטונים, ו- 1/3 חלבונים אחרים שאינם היסטונים אבל חשובים לאריזה. הדחיסה של ה- DNA מקטינה אותו בערך פי מהגודל שלו. הצורה של ה- DNA הארוז היא שרשרת עם חרוזים. החרוזים הם ההיסטונים, וה- DNA מלופף עליו. יחידה של היסטון עם DNA נקרא נוקלאוזום. ה- DNA בין הנוקלאוזומים נקרא.linker DNA מתברר כי יש באופן קבוע רצף של 146 בסיסים המלופפים סביב היסטון אחד. תכונות של היסטונים: היסטון מורכב מארבעה חלבונים שונים:.H2A, H2B,,H3 H4 יחד הם יוצרים אוקטמר )מבנה של 8 חלבונים, כל חלבון מופיע פעמיים(. H1 אינו חלק מההיסטון בכרומטין. הוא נקשר במקביל ל- DNA ולהיסטון, ומכתיב את כיוון היציאה של ה- DNA הדו גדילי מהנוקלאוזום. תפקידו לא ברור עד הסוף. ההיסטונים הם חלבונים טעונים חיובית )לכן עשירים בארגינין ובליזין( כי ה- DNA טעון שלילי. ההיסטונים הם רצפים מאוד שמורים והם נמצאים בכמות מאוד גדולה בתא. לכל תת חלבון של היסטון יש אזור שנקרא,histone fold שעליו נקשר ה- DNA. זה האזור הכי טעון חיובית, והוא מאוד שמור מבחינת הרצף. מה שמבדיל בין ההיסטונים הוא הקצה ה- N טרמינלי. הקצוות הללו פונים כלפי חוץ ויש להם תפקיד ביצוב הנוקלאוזום ודחיסת הנוקלאוזום )דבר שמאוד ישפיע על מידת השעתוק(. כדי ליצור את האוקטמר, תחילה יווצרו שני דימרים של היסטונים 3-4, אשר יתחברו לטטרמר. אליהם יתחברו שני דימרים של,2A. 2B להיסטונים יש תפקיד בבקרה על ביטוי גנים. ההיסטונים קושרים את ה- DNA באופן אלקטרוסטטי )קשירה בין מטען חיובי לשלילי(, וקישור זה הוא הפיך- בזמן שעתוק הוא נפתח ע"י,chromatin remodeling proteins תוך ניצול.ATP הדחיסות של ה- DNA תשפיע באופן קריטי על ביטוי הגנים. ככל שהוא יותר דחוס )הזמן הכי דחוס זה במיטוזה(, לא יתבצע שעתוק. האזור הדחוס נקרא הטרוכרומטין. האזור הפחות דחוס אשר פנוי לשעתוק נקרא u כרומטין.

9 9 קיים רווח בין נוקלאוזום לנוקלאוזום על מנת לאפשר את הדחיסה של ה- DNA. למארז אין ספציפיות מבחינת הרצף, אלא רק מרווחים קבועים- של 80 בסיסים. ה- proteins chromatin remodeling יכולים להחליף תת יחידות בהיסטון שבונה את הנוקלאוזום )H4 )H2A/B,,H3 בהתאם לצרכי התא. יש תת יחידות שונות של היסטונים שלכל אחת תפקיד אחר. זה משתנה בין תא לתא, ואפילו בתוך אותו התא בזמנים שונים. היסטון 3.3 מוכנס לאזורים שיותר פעילים מבחינת שעתוק. היסטון CENP-A נמצא באזור הצנטרומר, ואחד מתפקידיו הוא למשוך את הכישור. היסטון.DNA H2AX מגויס ל- DNA רק כאשר צריך תיקון של ה- היסטון H2AZ אחראי על שעתוק. היסטון macroh2a אחראי על השתקה של שעתוק, כמו באינאקטיבציה של כרומוזום X בבנות. האזור ה- N טרמינלי בהיסטון נתון לבקרה על ידי מודיפיקציות פוסט תרגומיות. יש מספר סוגים של מודיפיקציות: הוספת קבוצת אציטל לחומצת האמינו ליזין. ליזין היא חומצה טעונה חיובית. האצטילציה חוסמת את המטען וכך מחלישה את הקשר ל- DNA השלילי. זה הופך את האזור לפחות דחוס, ומאפשר שעתוק. הוספת קבוצת מתיל. מתילציה יכולה לקרות עד 3 פעמים על אותה חומצה אמינית, ולכל הוספה יש משמעות. המתילציה והאצטילציה על הליזין מתחרות זו עם זו- עושות פעולות הפוכות. ליזין שעבר מתילציה לא יעבור אצטילציה. באופן כללי מתילציה תוביל להשפעות שונות כאשר היא תתרחש על חומצות אמינו שונות. מתילציה של חומצות אמינו מסוימות תקדם שעתוק, ובמקומות אחרים תפחית. הוספת קבוצת פוספט על חומצה אמינית סירין. הוספת יוביקוויטין על פני ההיסטון עצמו הבנה של משמעות המודיפיקציות תאפשר לנו להבין את הבקרה האפיגנטית. המגוון של המודיפיקציות מאפשרת קוד כמעט אינסופי בגודלו מבחינת האפיגנטיקה. קיים "קוד היסטונים" שבו ניתן לראות מה המשמעות של כל מודיפיקציה על חומצות אמינו שונות. למשל- טרימתילציה על ליזין 9 גורמת להשתקה של הגן, בעוד שטרימתילציה על ליזין 4 +אציטלציה על ליזין 9 תוביל לביטוי של גן. כל המודיפיקציות האלו הן רברסביליות. יש אנזימים שיודעים לעשות דה-אצטילציה, ואנזימים שעושים דה-פוספורילציה ודה-מתילציה. צריך להבדיל בין מתילציה של היסטונים ומתילציה של ה- DNA עצמו. יש אנזימים שיודעים להוסיף מתיל על ציטוזין. זה עושה בקרה על ה- DNA עצמו. מתילציה על ה- DNA היא בקורלציה שלילית עם ביטוי גנים )ככל שיש יותר מתילציה יש פחות ביטוי(.

10 10 ישנם חלבונים הנקראים readers שיודעים לזהות את המודיפיקציות על פני הקצה ה- N טרמינלי של ההיסטון. הם יודעים לגייס אנזימים וחלבונים אחרים בתא, אשר יבצעו את התהליך שאמור להתבצע עקב המודיפיקציה. חלבוני ה- readers "משתפים פעולה" עם חלבוני writer )אלו חלבונים שעושים את המודיפיקציות(. כאשר חלבון reader מזהה מודיפיקציה, הוא מסמן לחלבון writer להגיע, ולעשות מודיפיקציה גם להיסטון הבא. יחד הם מעבירים את הסיגנל לאורך הכרומוזום. זה ימשך עד שיגיעו חלבונים רגולטורים שיעצרו את התהליך. החלבונים הרגולטורים יודעים לזהות רצפים ב- DNA שבהם צריך לפעול ולעצור את הסיגנל. הרצפים שמסמנים עצירה הם barrier.sequence החלבונים שמזהים אותם הם.barrier proteins מדובר בחלבונים מאוד מאוד שמורים. בתהליך הזה נוצרים אזורים של הטרוכרומטין ואזורים של u כרומטין. דוגמא היא הרצף HS4 בגן לביתא-גלובולין. זה barrier sequence שמונע דחיסה באזור. אם ישנה מוטציה ברצף הזה, האזור הזה יהיה דחוס במקום משוחרר, ולכן הגן לא יתבטא. התוצאה היא אנמיה חמורה. חלבוני ה- barrier יכולים לעבוד בכמה מנגנונים:.A reader- להיקשר אל הממברנה של הגרעין ולהפריע פיזית לקומפלקס writer ליצור את ההטרוכרומטין..B ההטרוכומטין..C הטרוכרומטין. להיקשר לנוקלאוזומים ספציפיים ולהגן עליהם מפני התפשטות סיגנל לגייס אנזימים שיבטלו מודיפיקציות היסטוניות שמאפיינות פיזור הטרוכרומטין ו- u כרומטין בגרעין: DNA שנמצא בקצוות הגרעין הוא במבנה יותר דחוס ואינו מתבטא )צבוע באדום(. זה ההטרוכרומטין. DNA שנמצא בלופים מחוץ לדחיסות הקשה כן מתבטא )צהוב וירוק( זה היו- כרומטין. יש קורלציה בין המיקום של ה- DNA והביטוי של הגנים שהוא מקודד. הצביעה הזו נעשתה על ידי צביעה של אלמנטי.Alu הם רצפים לא מקודדים, שלא נמחקו באבולוציה ומקורם בוירוסים. הם נמצאים הרבה באזורי יו-כרומטין וכמעט בכלל לא באזורי הטרו- כרומטין, וזאת משום הוירוסים נכנסו באזורים שכן עוברים שעתוק- שהם אזורי ה-יו-כרוטמין, ולכן ריכוזים גבוה שם.

11 11 בעת שכפול ה- DNA ההיסטונים נפרדים, ה- DNA משתכפל, ואז ההיסטונים צריכים להיקשר חזרה באופן רנדומלי בין שני הגדילים החדשים. זה יוצר "מיהול" של ההיסטונים המקוריים )שעליהם יש מודיפיקציות( עם היסטונים חדשים )נטולי מודיפיקציות(. כדי להשלים את החסר יש פעולה של הקומפלקס.reader-writer מכך יוצא שהמודיפיקציות על ההיסטונים עוברות מתא אב לתא בת, ולכן לתאים רבים בגוף שלנו יש את אותן המודיפיקציות. זה לא עובר בתורשה בין-דורית. אצל פרוקריוטים ה- DNA הוא מעגלי ואינו נמצא בגרעין. מאחר והוא מעגלי, אין לו טלומרים שצריך להגן עליהם. אותו DNA ארוז בצורה הנקראת supercoiled )צורה של סליל(. גם לו יש חלבונים דמויי היסטונים שאורזים אותו. אנזימי רסטריקציה אקסונוקלאזות הם אנזימים שיודעים לעכל.DNA האנזים יודע לבצע את העיכול רק מהקצוות. יש כאלו שיודעים לעכל מ-' 5 ל-' 3 וכאלו שיודעים לעכל מ-' 3 ל-' 5. כמו כן, יש אקסונוקלאזות שיודעות לעכל DNA חד גדילי וכאלו אחרות לדו גדילי, ויש כאלו שיודעות לעכל את שניהם. אנדונוקלאזות הם אנזימי רסטריקציה, שיודעים לחתוך את שרשרת ה- DNA במרכזה, ולא בקצוות. במקור הם הגיעו מחיידקים. חיידקים שהותקפו על ידי וירוסים, השתמשו באנדונוקלאזות כדי לעכל את ה- DNA הויראלי. ידועים כ אנזימים כאלו. לכל אנזים יש שם שמעיד על המקור שלו )נניח,EcoR1 מגיע מאי-קולי. הוא הראשון שנגלה בחיידק זה ולכן הוא 1(. כל אנזים מכיר רצף ספציפי וייחודי של,DNA לרוב של 4-8 בסיסים. למשל ה- EcoR1 מכיר את הרצף GAATTC הנקרא מ-' 5 ל-' 3 בלבד, ב- DNA דו גדילי. אנזימים יכולים להכיר רצפים יותר ארוכים ויותר קצרים, וככל שרצף ההכרה ארוך יותר, האנזים הוא יותר נדיר. הזכרנו את המתילציה שיכולה להיות על בסיסי ה-.DNA אצל יוקריוטים זה על ציטוזין ואצל חיידקים על אדנוזין. יש אנזימי רסטריקציה שרגישים למודיפיקציה הזו. יש כאלו שברגע שהמתילציה מופיעה על רצף ה- DNA הם אינם יכולים לעבוד, ויש כאלו שיכולים לעבוד רק אם יש מתילציה.

12 12 רצף פלינדרומי- 3' 5' GAATTC.. 3' CTTAAG 5 ניתן לשים לב שהתאמה בין הרצפים המשלימים, יוצרת את הרצף ההפוך )אם נקרא את הרצף העליון הפוך, נקבל את הרצף המשלים(. זה רצף פלינדרומי. אנזימי רסטריקציה לרוב מכירים את הרצף ואת הרצף הפלינדרומי. לכל אנדונוקלאזה יש דרך ייחודית לחתוך את ה- DNA. למשל EcoR1 מבצע את החיתוך בין G ל- A בגדיל העליון ובין A ל- G בגדיל התחתון. הוא תמיד חותך בין הבסיסים הללו. אחרי החיתוך יוותר על ה- DNA אזורים של sticky ends )מסומן בירוק(. אלו הם אותה בסיסים בגדיל התחתון, שבקצה של ה-' 5 הם חשופים, ללא גדיל משלים. זה נקרא.5' overhang *כעקרון בגלל שיש שני תוצרי חיתוך- בתחתון. ימני )תכלת( ושמאלי )סגול( [ ] יהיה '5 overhang גם בגדיל העליון וגם באופן דומה יש גם '3, overhang כאשר הבסיסים ללא הגדיל המשלים הם בצד של ה-' 3. *גם פה בשני תוצרי החיתוך יוצא '3. overhang במקרים בהם החיתוך הוא באותו מקום, יהיו blunt ends במקום :sticky ends מעבר לייחוד של הרצף שכל אנדונוקלאזה מזהה, גם אופן החיתוך הוא ייחודי. למשל, יש שני איזוסכיזומרים XmaI( ו- SmaI (, שחותכים את אותו הרצף בדיוק, אבל הראשון חותך בין ה- C הראשון ל- C שני, והאנזים השני חותך בין C השלישי ל- G הראשון. לכן האנזים הראשון יצור קצה '5 overhang והשני יצור קצה חלק. תופעה נוספת היא שקיימים שני אנזימים שחותכים רצפים שונים, אבל יוצא כי הקצוות הדביקים שהם יוצרים תואמים. אנזימים שנקראים ליגזים יודעים לחבר קצוות של DNA בעלי אותו קצה דביק, במידה והם נעמדים זה מול זה. למשל יש אנזים שיודע לחתוך בין A ל- G ברצף הבא: '3 '5 AGATCT 3' TCTAGA 5' ואנזים אחר שיודע לחתוך בין G ל- G ברצף הבא: '3 '5 GGATCC ואז הזנב הצהוב העליון יכול להתחבר לזנב הירוק התחתון. 3' CCTAGG 5'

13 13 המשמעות היא, שניתן לחבר בין כל שני סוגי,DNA במידה והקצוות הדביקים מתאימים- אפילו בין DNA אנושי לזה של תירס. כל מה שצריך הוא ליגז ו- ATP. במקרים בהם יש,blunt ends ליגזים גם יוכלו לחבר ביניהם. אנזימי רסטריקציה חותכים בקשר הפוספו-דיאסטרי -בין הפוספט של נוקלאוטיד אחד להידרוקסיל של הסוכר מהנוקלאוטיד השני. הליגז יודע לאחד בין קצה פוספט לקצה הידרוקסילי. ATP הליגז יקח.OH מצב בו יש שבר רק בגדיל 1. פה בדוגמא יש לנו בקצה השמאלי פוספט ובקצה הימני -nicked DNA ויאחה בין הקצוות הללו. פלסימידים של חיידקים מכילים בדר"כ מספר אתרים לאנזימי רסטריקציה, כדי שיהיה אפשר להחדיר שם גנים חדשים. לאחר שגן חדש חודר לפלסמיד, ליגזים מאחים אותו חזרה. לאנזימי רסטריקציה יש שימושים רבים בביולוגיה מולקולרית, כמו בשיבוט שהוזכר לעיל, במיפוי DNA ועוד. שכפול DNA הכפלת ה- DNA צריכה להיות תהליך מאוד מדויק. יש אומנם מוטציות, אבל זה בשיעור נמוך )אצל חיידקים מדובר בממוצע של 3 טעויות כל בסיסים, ואצל בני אדם טעות 1 על 10 8 בסיסים(. מוטציות לא בהכרח משפיעות על תפקוד החלבון, וכידוע הן חשובות ליצירת שונות.

14 14 יש כמה עקרונות לתהליך ההכפלה: 1. היא נעשית בצורה סמי-קונסרבטיבית. הכפלה סמי קונסרבטיבית היא כזו בה ה- DNA נפ תח, וכל גדיל משמש תבנית לבניית גדיל משלים. באופן זה, כל תא בת יהיה עם גדיל אחד מתא האב וגדיל אחד חדש. לפני שמצאו את מנגנון השכפול, היו היפותזות שונות לגבי המנגנון. היפותזה אחת הייתה שהשכפול הוא קונסרבטיבי- באופן זה ה- DNA בתא האב משתכפל בשלמותו, ואז בתא בשני תא הבת יש DNA שונה- האחד ישן והשני חדש. היפותזה שנייה הייתה שהשכפול הוא דיספרסיבי- הגדילים נחתכים באמצע, ונחלקים בין תאי הבת, ואז בכל תא בת הם מושלמים. 2. ההכפלה עובדת לשני הכיוונים. ההכפלה מתחילה מנקודה מסוימת, ומתקדמת ימינה ושמאלה בו זמנית. היתרון של הכפלה כזו הוא שהיא מהירה יותר, אבל היא מצריכה 2 מערכות מתואמות שיעבדו יחד. בניסוי שהראו את זה, החוקרים עקבו אחרי בועית ההכפלה בעזרת חומר רדיואקטיבי. הם לקחו DNA רגיל, ושמו במבחנה DNA פולימרז ובסיסים מסומנים בחומר רדיואקטיבי. הבסיסים המסומנים הם אלו שמתווספים עם התקדמות השכפול, ולכן ניתן לעקוב אחרי מזלג ההכפלה. החוקרים הבחינו הבועית הולכת וגדלה משני הכיוונים.

15 15 3. יש מקום בו היא מתחילה ומקום בו היא מסתיימת. -Origin of replication רצף מיוחד שה- DNA פולימרז יודע לזהות, ושם להתחיל את השכפול. ב- DNA סגור )מעגלי( יש גם אזור שמציין איפה להפסיק, הנקרא.termination site ביוקריוטים, שה- DNA הוא מאוד ארוך, יש מספר origin of replication על גבי הכרומוזום. השכפול נעשה במקביל, בצורה מסונכרנת. המרחק בין origin אחד לשני הוא כ- 30,000 בסיסים. תהליך ההכפלה בתא יו-קריוטי לוקח כ- 8 שעות. בשמרים זה כ- 40 דקות. כאשר מתחיל שכפול, צריך למצוא את ה-,origin of replication לפתוח את הדו-גדיל וליצור את בועית ההכפלה. האנזים שעושה זאת נקרא הליקאז. ה- replication origin of מסומן על ידי מודיפיקציות של מתיל. ההליקאז מזהה אותו רק כשהוא.fully methylated אזורי ה- origin עשירים ברצף,GATC כי זה רצף שמסמן לאנזים שעושה מתילציה היכן לבוא. האזורים שמהווים את רצפי ההכרה נקראים.cis regulatory elements החלבונים המזהים את רצפי ההכרה נקראים.trans regulatory factor כאשר גדיל משוכפל באזור ה- origin, הגדיל החדש הוא עדיין ללא מתילציות, גדיל זה אינו יכול לעבור הכפלה. רק כאשר הוא יהיה ממותל במלואו, יתאפשר עוד פעם סבב שכפול. המתילציות לא יופיעו במלואן עד אשר בתא יש מספיק מאגרים מכל הנחוץ לעוד סבב של שכפול DNA )מספיק בסיסים, אנרגיה וכו'(. בשמרים המנגנון של ההכרה והשכפול הוא קצת אחר. יש פוספורילציה ולא מתילציה. הציס רגולטורי עובר פוספורילציה בתחילת סבב שכפול, ולא יתרחש סבב חדש עד אשר יעבור דה-פוספורילציה.

16 16 ההליקאזות עובדים עם חלבוני עזר שמסייעים להם, ולכן בסמוך לרצפי ההכרה להליקאז יש רצפים שמסמנים לחלבוני העזר היכן להיקשר. מיד אחרי רצפי ההכרה יש רצפים שעשירים ב- A וב- T. בין A ו- T יש שני קשרי מימן )לעומת ששם יש 3 קשרי מימן( ולכן קל יותר לשבור את הקשר הזה ולפרום את ה- DNA. C-G הפתיחה של הגדילים היא תהליך שמצריך.ATP 4. היא תמיד נעשית מ-' 5 ל-' 3. כשה- DNA נפתח ונוצר מזלג ההכפלה, לכאורה גדיל אחד שצריך להיות מסונתז מ-' 5 ל-' 3 )זה העליון(, וגדיל אחר צריך להיות מסונתז מ-' 3 ל-' 5 )זה התחתון(. הארכה בכיוון '5 ל-' 3 שונה מהותית מ-' 3 ל- '5, כי באחד צריך להביא בסיסים עם קצה פוספט ובשני צריך להביא בסיסים עם קצה הידרוקסיל. צריך גם שני אנזימים שונים לכל אחת מהפעולות הללו. ידוע שיש רק אנזים אחד שעושה את השכפול- ה- DNA פולימרז, והוא משכפל רק מ-' 5 ל-' 3 )לכן מביא בסיסים רק עם קצה פוספט(. מה שקורה בפועל הוא שהגדיל העליון מתארך באופן רגיל, עם הפתיחה של המזלג. הגדיל התחתון מתארך בחלקים, כל פעם מתארך מקטע מסוים קצר מ-' 5 ל-' 3 ואז ליגזות מחברות בין המקטעים האלו. המקטעים נקראים מקטעי.okazaki הגדיל המתארך ישר נקרא,leading strand והגדיל השני נקרא.lagging strand יש מנגנונים שדואגים לסנכרן את הקצב של שני התהליכים. אורכם של מקטעי אוזאקי ביוקריוטים הוא כ- 200 בסיסים. זה מתואם עם האורך של הנוקלאוזום.

17 17 כאן יש דוגמא לבועית הכפלה דו-כיוונית, וסימון של ה- leading וה- lagging בכל כיוון: חשוב לשים לב שזה הולך הפוך מימין ומשמאל של המזלג. תמיד מול leading יהיה.lagging למה דווקא הכיוון הנבחר הוא מ מ-' 5' 3 ולא מ-' 3' 5? זה קשור לפעולת ההגהה בעת השכפול, שעליה נרחיב בהמשך. אבל בקצרה, במידה ונקשר נוקלאוטיד לא נכון, מסירים אותו כדי להוסיף את הנוקלאוטיד הנכון. אילו ההוספה הייתה מ-' 3' 5, בעת יצירת הקשר הפוספו-דיאסטרי לנוקלאוטיד המתוקן, לא היה נשבר הקשר p-p שהוא קשר עתיר אנרגיה, ול- DNA פולימרז לא הייתה את האנרגיה הדרושה להמשיך את הפילמור. זה תיאור סכמטי בו מתוארת בימין הארכה מ-' 5' 3 ובשמאל והארכה היפותטית מ-' 3' 5. בשלב לפני האחרון רואים שבעת הוספה של נוקלאוטיד מ- 3' 5 אין צורך בשבירה של הקשר הטרי-פוספט, שנחוצה כדי לקבל אנרגיה.

18 18 ארתור קורנברג בודד בצורה ביוכימית את האנזים.DNA polymerase1 אנזים זה יודע לעשות את הקשר הפוספו-דיאסטרי בין הפוספט להידרוקסיל של הסוכר. האנרגיה שנוצרת בעקבות שחרור שתי מולקולות הפוספט משחררת את ה- DNA פולימרז ומאפשרת לו להתקדם עוד צעד קדימה. ה- DNA פולימרז 1 צריך לדעת לבחור את הבסיס הנכון. לאנזים צורה של כף יד, הוא תופס את הגדיל הכפול בחלל שלו, בחלק הנקרא אצבעות. המבנה של הפולימרז הוא כזה שמאפשר יצירת קשר פוספו-דיאסטרי, רק אל מול הבסיס הנכון. כאשר הבסיס הוא לא נכון, תהיה הפרעה סטארית וההתקפה הנוקלאופילית שנחוצה ליצירת קשר פוספו-דיאסטרי לא תוכל להתרחש. הקצב של הפולימרז מאוד נמוך אבל הוא עובד כמעט ללא טעויות, כי מעבר לכך שהוא יוצר קשרים פוספו-דיאסטרים הוא עושה תיקון טעויות, מעין הגהה לשכפול. פעולה זו נעשית באתר שונה על גבי הפולימרז מזו של ההארכה. ההחסרה של בסיסים, נעשית דווקא מ-' 3 ל-' 5. )אם כי ידוע שלפולימרז יש אפשרות גם לפעולה של אקסונוקלאזה מ-' 5 ל-' 3 (. בתהליך ההגהה, הפולימרז מזהה שנוקלאוטיד לא נכון הוסף, כי יש הפרעה סטארית שלא מאפשרת את ההארכה של השרשרת. במקרה זה, אקסונוקלאזה החותכת מ-' 3 ל-' 5 נצמדת לפולימרז ומוציאה את הנוקלאוטיד השגוי, ומותירה את השרשרת עם קצה '3 חשוף. אז הפולימרז מוסיף את הנוקלאוטיד הנכון.

19 19 אנזימים וחלבונים הנחוצים להכפלה: הזכרנו את הפולימרז ואת ההליקאז. בנוסף אליהם יש עוד מספר אנזימים וחלבונים. ו- CAFs NAPs.1 מזלג ההכפלה צריך להתגבר על הנוקלאוזומים וההיסטונים. הוא חושף כ- 600 בסיסים בכל פעם. האוקטומר של ההיסטונים מתפרק, ומתפצל בין הגדיל הקיים וזה הנבנה. בשלב הזה יש יצירה של המון היסטונים בתא )זה השלב היחיד בחיי התא בו יש תרגום של היסטונים( כדי להשלים את האוקטומורים מחדש. ההרכבה של האוקטומרים מחדש לאחר השכפול נעשית על ידי חלבונים הנקראים )CAFs( chromatin assembly factors ו- factors.)naps( Nucleosome assembly Topoisomerases.2 ה- DNA הוא כאמור בצורה של סליל, ושני הגדילים מלופפים אחד סביב השני. כדי שתתרחש הכפלה, הליפוף צריך להשתחרר. במידה ופתיחת הליפוף לא הצליחה, נוצר פלונטר ונבנה מתח. אנזים בשם topoisomerase1 פותח את הפלונטר הזה. זה אנזים שבאתר הפעיל שלו יש טירוזין, שזו חומצה אמינית עם הידרוקסיל. ההידרוקסיל נקשר לגדיל אחד באזור של הפוספט ויוצר ניק )חיתוך בגדיל אחד של ה- DNA (. זה מאפשר ל- DNA להסתובב סביב הקשר הדי-אסטרי והמתח משתחרר. הקשר בין הטירוזין של האנזים לפוספט של הגדיל אוגר את האנרגיה של הקשר הפוספו-דיאסטרי שנפתח, ובזכות זה הריאקציה היא הפיכה והקשר הפוספו-די-אסטרי יכול להיווצר מחדש באופן ספונטני. אנזים Topoisomerase2 פותח סלילים יותר בעייתים, כאשר יש פלונטר בין 2 גדילים )האדום והכתום(. הוא מזהה את הפלונטר ונקשר באופן קוולנטי והפיך אל אחד הגדילים )הכתום( וחותך אותו. נוצר פתח )מעין שער חלבוני( שמאפשר מעבר של הגדיל השני )האדום( ושחרור של הפלונטר. אז האנזים סוגר חזרה את ה- DNA שחתך. זה תהליך שמצריך 2 מולקולות.ATP

20 ה. 20 SSB- single strand DNA binding proteins.3 במזלג ההכפלה יש DNA חד גדילי שיכול ליצור מבנים שניוניים ולהאט את תנועת הפולימרז. לכן, מיד כשה- DNA נפתח קופצים עליו ה- SSB, ובצורה קואפרטיבית נקשרים אחד לשני ומיישרים את ה- DNA החיצוני של ה- DNA. נמצא יותר SSB בגדיל ה- lagging, כי לוקח יותר זמן לשכפל. SSB- נקשרים לשלד הסוכרי-פוספטי Primases.4 פרימזות הם אנזימים שמניחים את הבסיסים הראשונים בשכפול- יוצרים פריימר של בסיסים, שהפולימרז יכול להמשיך אותו. הפולימרז חייב התחלה קיימת של שרשרת כדי לעבוד. הוא יודע להאריך שרשרת אבל לא להתחיל אחת. הפרימזות מתיישבים על DNA חד גדילי, ויודעים לחבר נוקלאוטידים ללא הימצאות של נוקלאוטיד אחר. הם יוצרים את קצה ה- OH )'3( שהפולימרז יודע להאריך. הפרימזות מניחות נוקלאוטידים של RNA ולא,DNA אשר בסופו של דבר מוסרים ומוחלפים בנוקלאוטידים הנכונים. אבל הם יוצרים את ההתחלה של הגדיל כדי שפולימרז יוכל לחבר אליהם את הבסיסים שיביא )איור תחתון משמאל: פריימר RNA בתכלת. בסיסי DNA באדום שמחליפים אותם אחרי ההשלמה של הגדיל(. נמצא יותר פרימזות על ה- strand lagging כי שם כל הזמן צריך להתחיל מקטעים משלימים חדשים. ההסרה של נוקלאוטיד ה- RNA היא על ידי.RNAse הוא מכיר DNA-RNA היבריד, ואוכל את ה- RNA מ-' 5 ל-' 3, ונוצר ניק ב- DNA. את הבסיסים החסרים משלים הפולימרז על ידי ה- template של ה- DNA שיש לו, כאשר ה- DNA החתוך יכול לשמש כפריימר. בסוף הליגז מחבר את הניק. אחת הסיבות לכך שהפריימר הוא של RNA ולא של DNA היא שהפרימזות הם אנזימים לא מדויקים )עושים טעויות בהארכה(. מאחר וצריך להחליף את הפריימר RNA ב- DNA, אפשר לתקן את הטעויות הללו. Polymerase 1, 2, 3.5 הקצב של ה- DNA פולימרז 1 הוא מאוד איטי- הוא עושה פחות מ- 80 בסיסים בשנייה. לפי הקצב המקסימלי שלו, אמור לקחת לו ימים לשכפל DNA שלם אחד.

21 21 אחריו נמצאו שני אנזימים אחרים- פולימרז 2 ופולימרז 3. הם יותר נדירים בתא. פעולתו של הפולימרז 3 היא הרבה יותר מהירה מזה של הפולימרז 1- הוא עושה כ בסיסים בשנייה. אבל הפולימרז 3 לא יודע להאריך את השרשראות של הפריימר. לכן הפולימרז 1 הוא זה שמתחיל את ההארכה, ואז הפולימרז 3 מחליף אותו. פולימרז 2 יעשה תיקוני חירום בהגהה של ה- DNA. השוואה בין הפולימרזים: -Processivity מספר הבסיסים שהאנזים יאריך לפני שישתחרר מה- DNA. ניתן לראות כי לפולימרז 3 יש פרוססיביות מאוד גבוהה. מה שמקנה לו אותה הן שתי תת יחידות שיש לו מעבר ליחידות הליבה, שעושות את ההארכה והתיקון. יחידות אלו נקראות ביתא וגמא, או sliding clamp ו- clamp loading בהתאמה. ה- loading גורם ל- sliding להיתפס על ה- DNA. וה- sliding תופס את הפולימרז 3 ומקל עליו את התנועה על פני ה- DNA, וכך הוא ממשיך לסנתז. ה- clamp sliding ישחרר את הפולימרז 3 כאשר הוא ירגיש שיש עיכוב בפעולה שלו. זה מעיד על כך שהפולימרז סיים להשלים מקטע.okazaki

22 22 פולימרזים באאוקריוטים: באאוקריוטים יש יותר סוגים של פולימרזים מאשר 1-3 אצל הפרוקריוטים. לאאוקריוטים יש פולימרז שונה ל- strand leading ול- strand.lagging הפולימרז היחיד שיודע להמשיך את הפריימר הוא פולימרז אלפא. האלונגציה באאוקריוטים היא איטית יותר מאשר בפרוקריוטים בגלל ההיסטונים )?(. פעילות ההגהה היא רק על ידי אקסונוקלאזות שמפרקות מ-' 3' 5. אין אקסונוקלאזות שמפרקות מ-' 5' )בפרוקריוטים ראינו אותם כשהיה צריך לפרק את הפריימר.)RNA לא ברור עדיין איך הפריימר הזה מוסר. 6. אנזימים שמפסיקים הכפלה בבקטריות, ה- DNA מעגלי, וצריך 2 אזורי טרמינציה- אחד מכל כיוון. מקטעי ה- DNA שמסמנים סיום של שכפול נקראים TerA ו- TerB ה. אחד עוצר הכפלה עם כיוון השעון והשני עוצר הכפלה נגד כיוון השעון. הרצפים האלו הם חד כיוונים, כך שרק פולימרז שבא מכיוון מסוים יזהה אותם. פולימרז שעובד עם כיוון השעון לא יעצר ב- TerA אלא רק ב- TerB ולהיפך. כך יווצר אזור החפיפה. overlap zone מקטעי ה- Ter הם ציס רגולטורי והם מסמנים לחלבוני טרנס רגולטורי, הנקראים Tus איפה להיקשר. חלבוני ה- Tus הם אלו שמונעים פיסית את השכפול בפני הפולימרז, אבל רק בכיוון הרלוונטי. ב- DNA ליניארי, אצל אאוקריוטים, הטלומר שנמצא בקצה הכרומוזום מהווה בעייה. בגדיל של ה- lagging יש צורך כל הזמן בפריימר והארכה בכיוון ההפוך למזלג ההכפלה. לכן בגדיל זה, בחלק האחרון ביותר, יוצב פריימר RNA שיוסר בהמשך, ולא תהיה אפשרות להאריך אותו- כי כדי להאריך אותו צריך לעבוד מ-' 3 ל-' 5. לכן, עקרונית, עם כל חלוקה אמור להיות חסר של כ- 20 בסיסים בגדיל אחד של הטלומר. הפתרון הוא על ידי אנזים בשם טלומרז שעליו יש רצף של.RNA על הכרומוזום, באזור הטלומר, יש רצף DNA אופייני. ה- RNA על גבי הטלומרז הוא כזה שתואם ומשלים את הרצף האופייני של הטלומר. הוא נקשר לקצה ה-' 3 של הגדיל התקין )שהיה,)leading ואז הגדיל הזה מתארך לפי ה- template של ה- RNA )זה החלק הורוד בתמונה(. כעת שהקצה של ה- leading הוא ארוך יותר, מתאפשרת סינתזה של החלק החסר בגדיל ה- lagging על ידי DNA פולימרז )זה החלק הירוק בתמונה(.

23 23 שיטות בביולוגיה מולקולרית הופכים אותו ל- cdna (. )אם ו- RNA DNA שיטה המאפשרת לנו להגביר קטעים של.PCR-polymerase chain reaction ה- PCR מחקה את שכפול ה- DNA במבחנה, רק שהיא נעשית המון המון פעמים- בסבבים,)cycles( ורק עבור הגן שמעניין אותנו, ולא כל הגנום. לשם כך לוקחים,DNA שמים אותו במבחנה עם DNA פולימרז ונוקלאוטידים חופשיים, ופריימרים ספציפיים שיאפשרו הגברה של רק הגן שמעניין אותנו. בכל cycle מחממים את ה- DNA כדי לפתוח את הדו-גדיל, אז מאפשרים לפריימרים להידבק ולפולימרז להאריך את הגן, וכך מכפילים את כמותו. התהליך חוזר על עצמו כמה פעמים, בכל cycle כמות ה- DNA גדלה פי 2. לצורך ההגברה צריך שני פריימרים: forward ו- reverse. הראשון יקשר לגדיל עליו נמצא הגן )נניח העליון(, והשני יקשר לגדיל המשלים )נניח התחתון(. שני הפריימרים יקשרו לקצה ה-' 3 של הקטע שצריך להגביר, וכך תתאפשר הארכה מ- 5' 3 )רואים בציור(. כל cycle של ה- PCR מורכב שלושה שלבים: שלב ראשון- דנטורציה- מחממים את ה- DNA ל- 90 מעלות כדי שהגדילים יפרדו. שלב שני- annealing -הדבקה של הפריימרים אל הקצה ה-' 3 של כל גדיל. זה נעשה ב מעלות )תלוי בפריימר- יוסבר בהמשך(. שלב שלישי-אלונגציה/פולימריזציה-הארכה של הגדיל על סמך הפריימר וה- template. נעשה ב- 72 מעלות. פריימר צריך להיות באורך של כ- 20 בסיסים. עליו להיות מספיק ארוך כדי שיתן רצף ספציפי ייחודי לגן )שסטטיסטית אין סיכוי סביר שיופיע בלוקוסים אחרים(, אבל לא ארוך מדי, כי אז נצטרך טמפ' גבוהה מדי כדי לבצע את ה- annealing. הטמפ' בה מתבצעת ההדבקה של הפריימר נקראת.annealing temperature היא מבוססת על הטמפ' הנחוצה לשבור קשרי C-G ) 0 4) ו-( 2) 0.A-T כדי לקבוע אותה נספור את מספר קשרי ה- A-T וה- C-G הצפויים להיווצר בין הפריימר למקטע, עבור כל קשר A-T שצריך להיווצר נוסיף 2 מעלות ועבור כל קשר שצריך להיווצר בין C ל- G נוסיף 4 מעלות. למשל, אם המקטע הוא,ATTACGGGCT אז צפויים להיות 5 קשרי A-T ו- 5 קשרי.C-G הטמפ' תהיה = 30 5*2.5*4 + זו הטמפ' המקסימלית בה אפשר לבצע את ההדבקה של הפריימר למקטע, אם נעבור אותה, ההדבקה לא תתרחש, כי במערכת תהיה מספיק אנרגיה )חום( לשבור את כל הקשרים בין הפריימר למקטע. אם הטמפ' תהיה נמוכה מדי, הפריימר יקשר אבל הוא לא יהיה מספיק ספציפי- הוא יוכל להיקשר גם למקטעים אחרים דומים. למשל- אם ניקח את המקטע מהדוגמא למעלה, ונחליף C אחד ב- A, אז הטמפ' הקריטית עבורו היא 28. ולכן עריכת הריאקציה ב- 30 תמנע מהפריימר שלנו להיקשר אל המקטע הדומה הזה. לסיכום, הספציפיות של הפריימר היא גם ברצף וגם בטמפ' בה נבצע את הריאקציה. השאיפה היא לתכנן פריימר שיזדקק לטמפ' הדבקה של כ- 56 מעלות.

24 24 אפשר להחדיר לפריימר "זנב" שיהווה רצף הכרה לאנזימי רסטריקציה. הוא לא יתאים לרצף שרוצים להגביר, אבל אחרי ההגברה הוא יאפשר לנו להכניס את הרצף לתוך פלסמידים. שיטת PCR מאפשרת לנו לזהות מקטעי DNA גם ברקמה מאוד מאוד קטנה- כמו טיפה אחת של דם. היא משמשת לזיהוי פלילי, למחקר, לבדיקה נוכחות נגיף ה- HIV בדם )צריך להפוך את ה- RNA הויראלי ל- cdna ואז לבצע את ההגברה( ועוד. אחרי האמפליפיקציה מריצים את ה- DNA שהוגבר בג'ל אגרוז בשדה חשמלי, שמפריד בין מקטעים לפי אורך )מספר בסיסים(. ה- DNA הוא שלילי, ובג'ל הוא רץ אל עבר הקתודה. הפרגמנטים הקטנים ירוצו יותר קדימה מהפרגמנטים הארוכים. משתמשים בצבען שפלורסנטי )EtBr( שנדבק ל- DNA ואז אפשר לראות את ההפרדה בין הבנדים. DNA סגור מעגלי רץ יחסית מהר. DNA דחוס רץ מהר מ- DNA ליניארי. אם יש בו ניק הוא רץ מאוד לאט כי הוא מאוד מסורבל. אם הוא חתוך ב- 2 הגדילים הוא ירוץ יותר מהר מהניק. ריצוף DNA בשיטת סנגר- ה- DNA פולימרז עובד בצורה די מדויקת, כך שבסיס נכון שמגיע נקשר, ובסיס לא נכון לא נקשר. צריך שיתקיימו 3 תנאים כדי שיתרחש הקשר- תחילה שהבסיס יהיה נכון, שנית שעל הקצה ה-' 3 של השרשרת תהיה קבוצת הידרוקסיד, ושלישית שעל הנוקלאוטיד הבודד שנכנס יהיה 3 קבוצות פוספט. סנגר ניצל את העובדה הזו כדי לרצף. הוא ידע כי אם נכניס נוקלאוטידים חופשיים בלי קבוצת ההידרוקסיד על הריבוז,)di-deoxynucleotide( הפלמור של השרשרת יעצר. בשיטת הריצוף על שם סנגר, לוקחים את ה- DNA שרוצים לרצף ושמים אותו עם פריימר )חייבים לדעת את הרצף של הפריימר( ו- DNA פולימרז, ושני סוגים של נוקלאוטידים- נוקלאוטידים רגילים )דה-אוקסי( ונוקלאוטידים "פגומים" )די-דה-אוקסי(. מריצים ארבע ריאקציות שונות, בכולם יש את כל ארבעת הנוקלאוטידים התקינים, ובנוסף, בכל אחת מהן יש גם את אחד מהנוקלאוטידים ה"פגומים" )באחוז נמוך יחסית( שעוצרים את הריאקציה. בכל מבחנה יש המון עותקים של הגן אותו מעוניינים לרצף. כאשר מתחיל הפלמור, הסתברותית, בכל עותק הפלמור נעצר במקום אחר- יש עותקים בהם הוא נעצר מוקדם, ויש עותקים בהם הוא נעצר מאוחר. לכן, בכל מבחנה מתקבלות שרשראות שונות באורכן. לאחר מכן מריצים את התוצרים מארבעת המבחנות בג'ל, והם עוצרים לפי האורך- שנקבע על פי כמות הבסיסים בשרשרת. ניתן לדעת את רצף הגן לפי הסדר של הבנדים. למשל בדוגמא של הג'ל שפה, הגן מתחיל ב- TTAG )צריך לזכור להפוך את הבנדים לרצף המשלים(..

25 25 Second -נקרא generation sequencing גם הסנגר האוטומטי. עם המצאת הבסיסים הפלורנסטים, החלו לבצע את הריאקציה עם נוקלאוטידים שמסומנים בצבעים פלורסנטים. כל אחד מארבעת הנוקלאוטידים הדי-דה-אוקסי סומן בצבע פלורסנטי אחר, מה שאפשר לעשות רק ריאקציה אחת במקום ארבע, וכך חסך את העבודה עם החומרים הרדיואקטיבים )בהם השתמשו קודם כדי לסמן את הנוקלאוטידים הפגומים(. ספריות גנים- כאשר רוצים לרצף גנום או כרומוזום חייבים לשבור אותו לחלקים. שוברים אותו על ידי אנזימי רסטריקציה, ואז משבטים אותם לתוך פלסמיד שהרצף שלו ידוע, ומחדירים אותם לחיידק כדי שישכפל את ה- DNA בהרבה עותקים. מפיקים את החיידקים, שכל אחד מהם מכיל חלק קטן מהגנום ההומני ומרצפים אותם. השבירה של ה- DNA צריכה להיות באופן כזה שיאפשר כפילויות וחפיפות כדי שנוכל לחבר אותם לכדי רצף ארוך. בספרייה, כל הגנום של היצור נמצא בתוך פלסימידים. בעזרת השיטה הזו ניתן לתכנן פריימרים לריצוף של גנים אנושיים. בפרויקט הגנום האנושי עסקו בריצוף של גנום שלם של אדם. לקח 15 שנה להשלים את הפרויקט. אזורים של טלומרים ואזורי הטרוכרומטין )אזורים מאוד דחוסים( לא רוצפו כי קשה לפתוח אותם. -Next generation sequencing (NGS) ב- sequencing next generation שוברים את ה- DNA למקטעים קצרים )סביב 400 בסיסים(. את אותם המקטעים מקבעים על משטח ומגבירים אותם. בעת ההגברה, כל בסיס שהוסף נקרא בשיטות של פלורסנציה. הטכניקה היא כזו שמיד לאחר ההוספה של בסיס יש השהייה קצרה, בה המכונה קוראת את הפלורסנציה של הבסיס שהוסף ומזהה אותו. בעזרת תוכנות מחשב מחברים את המקטעים לכדי גנום. -Ilumina סוג של.NGS חותכים את ה- DNA למקטעים קצרים. למקטעים האלו מוסיפים אדפטורים, רצפים בשתי הקצוות- ה-' 5 וה-' 3, )1 באיור( שמאפשרים להם התאמה למשטח )צ'יפ( שעליו יש מקטע קצר משלים. הקישור תחילה הוא רק לאדפטור אחד, בקצה ה-' 5, ואז הגדיל מתקפל ונקשר לאדפטור השני בצד ה-' 3 ונוצר גדיל בצורת גשר )U הפוך( שקשור לצ'יפ )2 באיור(. על אותו גדיל עושים שכפול באמצעות פריימר ו- DNA פולימרז, כך שנוצר גשר דו-גדילי )3-4 באיור(. אז עבור כל אחד מהגדילים, אדפטור אחד יתנתק כך שנקבל מקטע אנכי וחד גדילי )5 באיור(, שיכול לעשות את אותו הסבב מחדש, וכך נעשית ההגברה של המקטע. לאחר מכן

26 26 מסלקים את כל העותקים של הגדיל המשלים, כדי שישאר רק הגדיל,forward וכך נוצרים איים של DNA אחיד- המון עותקים של אותו המקטע, ללא הגדיל המשלים )6 באיור(. לאחר ההגברה אפשר לרצף את המקטע )אי אפשר לרצף מולקולה בודדת, חייבים שתהיה הגברה(. חוסמים את הקצה ה-' 3, כדי לא לקבל ריצוף של המקטע ההפוך ועושים ריצוף עם נוקלאוטידים פלורסנטים. זה נעשה על כל העותקים במקביל. לאחר מכן בתוכנת מחשב צריך לחבר את המקטעים כדי לבנות את הרצף המלא. היכולת של הצ'יפ היא עצומה ומאפשרת לבחון מיליונים של מקטעים בבת אחת. לפריימרים ניתן להוסיף כל מיני רצפים, למשל רצפים שיעזרו לנו לזהות מאיפה הגיעה הדגימה )קובעים שדגימות מסוימות יקבלו פריימר עם תוספת אחת, ודגימות אחרות יקבלו פריימר עם תוספת אחרת. זה מקל אח"כ על האנליזה(. היום בטיפול לסרטן מנסים להכווין טיפול שיהיה יעודי לתאים הסרטניים על ידי ריצוף של ה- DNA הסרטני. -Exome sequencing רק אחוז אחד מהגנום הוא מקודד לחלבונים, ויש גישות בהם מרצפים רק את האזורים האלו- מרצפים רק אקסונים. ידוע כי בגנום אנושי יש אקסונים, והפריימרים אליהם ידועים. לוקחים את הגנום ומגבירים את האקסון בלבד בעזרת הפריימרים, ואז מבודדים את המקטעים שעברו הגברה ואותם מרצפים. אלטרנטיבה אחרת היא להוציא את מקטעי האקסונים מתוך הספריות הגנומיות הקיימות כבר. מסנתזים פרובים שמתאימים לחלקים של אקסונים בלבד, ויכולים לעבור איתם היברידיזציה. אל הפרובים מחברים בידים קטנים וכך אפשר למשוך אותם בעזרת מגנט. אפשר גם למשוך גן ספציפי מתוך הספרייה שמעניין אותנו לחקור ע"י תכנון פרוב שמותאם אליו. ברקוד מולטיפלקסינג- אפשר לרצף גם mrna ע"י reverse transcription ל- cdna שאותו מרצפים. זה ישמש אותנו כאשר נרצה לדעת על הפעילות של התא- כמה RNA הוא מבטא מכל גן, פחות כדי לדעת את הרצפים עצמם )רלוונטי לזיהוי תא סרטני נניח(. לכן מספיק לרצף מקטע מאוד קצר של -mrna כי מספיק כמה בסיסים בודדים לקבל זיהוי מתוך השוואה לספרייה )זה בעצם הברקוד של הגן(. תיקון DNA ה- DNA פולימרז יודע לחוש כשיש בסיס לא נכון, ועל ידי פעולת אקסונולאזה להחליף בסיס. אבל גם היכולת הזו של ההגהה היא מוגבלת, וצריך מנגנונים משלימים בשכפול ובשעתוק שיעשו תיקונים. מנגנונים אלו חשובים גם למקרים בהם יש מוטציות עקב פגעים סביבתיים או תהליכי הזדקנות. נזק ל- DNA יכול לנבוע מרעלנים )כמו סיגריות, קרינה( או משינויים פנימיים )כמו טעויות של הפולימרז(. חשוב להבחין בין נזק לתאים מתחלקים ולתאים שאינם מתחלקים. אם הנזק הוא בתאים מתחלקים, המוטציות שיכולות לגרור מחלה יעברו לתאים הבאים, ויגרמו להתפשטות של המחלה )זה הליך סרטני(. אם הנזק הוא בתאים לא מתחלקים, המוטציות ישפיעו על שעתוק הגנים בו. אותו תא יפעל פחות טוב, ובסוף הוא ימות. זה חלק מתהליך ההזדקנות. מתי יתרחשו יותר טעויות בשכפול? ברגעי עקה, הפעילות של הפולימרז היא פחות טובה ויש יותר סיכוי למוטציות. ואצל וירוסים, המשמרים את המידע הגנטי שלהם במולקולות חד גדיליות )או DNA או.)RNA הם יותר חשופים לטעויות של מוטציות, כי אין להם את האפשרות לבקר את הטעות אל מול הגדיל המשלים, התקין.

27 27 מנגנונים לתיקון טעויות שנעשו השכפול (MMR) MisMatch -אם repair ישנה טעות זה יכול לגרור לכך שהגדילים לא יקשרו, ותהיה בליטה ב- DNA. בפרוקריוטים, יש חלבונים שתפקידם הוא לסרוק את ה- DNA )חלבוניMutH,)MutS, MutL, וכאשר הם מבחינים בבליטה כזו עקב זוג לא מתאים, הם יובילו לפתיחה של הגדילים. הבסיס הלא נכון יוסר יחד עם כמה בסיסים לפניו ואחריו, ותהיה השלמה חדשה של הגדיל ע"י פולימרז, בתקווה שהפעם יוכנס הגדיל הנכון. חיידקים יודעים להבחין מי הגדיל היותר חדש כי עליו עוד אין מתילציות )בחיידקים יש מתילציות על אדנוזין(. ה- MutH הוא החלבון שעושה את הניק, והוא יכול לחתוך רק DNA לא ממותל. MMR באאוקריוטים- יש חלבונים דומים לאלו שעושים MMR בפרוקריוטים. לאאוקריוטים אין מתילציות על אדנוזין. לא ברור מה בדיוק המנגנון לפיו הם מזהים את הגדיל החדש, עם הטעות. מניחים שהם רגישים לאזורים של ניק, שיהיו על ה-.lagging strand יתכן גם שהוא עושה את התיקון אקראית, ולכן יש הסתברות של 50% שהוא מתקן את הגדיל הלא נכון. תיקון למוטציות ספונטיות )לא מהשכפול( יש מוטציות ספונטניות, שנגרמות עקב תהליכים בסביבה- חמצון, חום, קרינה, טעויות מטבוליות. בין השינויים יכולה להיות הוספה של קבוצות מתיליות לבסיסים, התקפות של הידרוליזה שתוביל להסרה של כל הבסיס )זה ישאיר נוקלאוטיד בלי בסיס- תהליך דה פוריניציה או דה פירמידינציה(, הוצאה של קבוצת אמין ועוד. שכיחות המוטציות האלו היא די גדולה. למשל הוצאה של פורין בהידרוליזה מתרחשת בתא פעמים ביום. הוצאה של פירמידין מתרחשת בתא 600 פעמים ביום. התא משקיע המון אנרגיה לתקן את הטעויות האלו. מספר סוגי מוטציות שגורמות ל- mispairing : דה אמינציה- מוטציה של הוצאה קבוצת אמין מהבסיסים. מים מתקיפים את ה- DNA וזה מוביל לשחרור קבוצת האמין, ולשינוי של הבסיס. אדנוזין למשל יהפוך להיפוקנסטין. אדנוזין ללא קבוצת אמינית מתחברת ל- C במקום ל- T, וכך נקבל מוטציה. גואונין שעובר דה-אמינציה הופך לקסנטין. ציטוזין הופך אחרי דה-אמינציה ל- U. לכן בעת שכפול ישימו מולו A ולא G. טימין לא עובר דה-אמינציה. בעצם אם אין תיקון לאותם טעויות, בחצי מתאי הבת תהיה מוטציה נקודתית. יש אזורים בגנום שנקראים,CpG islands בהם ה- C עובר מתילציה וזה משתיק את הגן. אם יש דה-אמינציה של ציטוזין באיי -CpG הדה אמינציה הופכת C ל- T. בין האנזימים המתקנים מוטציות של דה-אמינציה )גליקוזילזות- יוזכרו בהמשך(, יש כאלו מיוחדות שמזהות קשר,C-T והן מורידות את ה- T. המנגנונים האלו לא מספיק יעילים ולכן יש הפחתה של איי CpG באבולוציה.

28 28 דה-פורינציה/דה פירמינציה- כאמור הידרוליזה של מים יכולה לגרום להסרה של הבסיס. גם במוטציה כזו, בחצי מתאי הבת לא יהיה שינוי, אבל בחצי מתאי הבת יהיה deletion ומתוך כך.frameshift הפולימרז יראה שחסר בסיס ופשוט ידלג עליו, ובתא הבת האלו נקבל בסיס אחד פחות. -Base oxidation חמצון של קשרים כפולים שמוביל לשינוי של הבסיס )יש לו קשר בודד במקום כפול( או יצירה של טאוטומרים- בהם יש שינוי במיקום של הקשר הכפול. זה יוביל למוטציות ברצף, כי אז הבסיס המחומצן יקשר לבסיס לא נכון בשכפול. למשל טאוטומר של T יקשר ל- C במקום ל- A. יתכן כי עקב שינויים סביבתיים, אנלוגים של בסיסים, שהם חומצות גרעין שדומות לאחד מארבעת הבסיסים אבל עם שינוי של קבוצה פונקציונלית אחת, יכנסו במקום הבסיס התקין. למשל 5 -ברומואורציל דומה לטימין, אבל הוא יקשור אליו G בשכפול במקום A. מנגנון התיקון הקיים למוטציות אלו נקרא -Base excision repair זו מערכת חלבונים שעוברת על ה- DNA ומחפשת שינויים שהובילו לבסיסים אבנורמלים. חלבונים אלו נקראים גליקוזילזות. ברגע שהם מזהים בסיס לא תקין, הם נעצרים ומסירים את הבסיס הפגום )למשל כזה שעבר דה-אמינציה(. ברגע זה יש "שן חסרה" בגדיל. עדין יש את הסוכר והפוספט אבל אין בסיס. יש אנדונוקלאזות שמזהות קשרים פוספו-דיאסטרים חסרי בסיס. הן חותכות את ה- DNA ויוצרות ניק היכן שיש בסיס חסר, ואז מגיע פולימרז ומכניס נוקלאוטיד חדש במקומו, וליגז שסוגר את הניק. חומרים שעושים מתילציה )נקראים )alkylating agents הם אלקטרופילים, והם יובילו לאובדן של ה- DNA או שיצרו ל- A. במקום עם מתיל יתחבר ל- G T ; G במקום A בתא הבת הבא נקבל ואז עם מתיל יתחבר ל- T, G למשל.mispairing יש חומרים אלקילים בעשן סיגריות, מוצרים קוסמטים מסוימים ומזון שעבר טיפול בניטריט )יתכן בדגים וגבינה(.

29 29 חומרים רבים שנמצאים בשימוש בכימותרפיה עושים מתילציה ל- DNA, מתוך ניסיון לערער את ה- DNA בתאים הסרטניים. לתאים סרטניים יש מערכות תיקון DNA יותר חלשות, והתקווה היא שהם יפגעו יותר מתאים בריאים. חומרים שנמצאים בעשן )מהגריל ומסיגריות( יכולים לגרום למודיפיקציות מזיקות ב- DNA. החומרים המסרטנים קשורים באופן קוולנטי לבסיס adducts( )DNA והם מונעים שעתוק ומקדמים מודיפיקציות מזיקות. מנגנון התיקון: מתיל טרנספרזות. הן עוברות על גבי ה- DNA וכאשר הן מזהות קבוצת מתיל על בסיס לא נכון, הן נקשרות באופן קוולנטי למתיל )דרך קבוצת צד ציסטאינית( ומנקות את ה- DNA מהמתיל. תיקון תוך כדי שכפול המנגנונים שהוזכרו עד כה פעילים במהלך חיי התא. המנגנון הבא הוא בעת שלב S. כאשר מזלג ההכפלה נתקל ב- DNA פגוע, שלא תוקן ע"י המנגנונים הקודמים )נניח עקב מתילציה לא נכונה, טאוטומר, בסיס ללא קשר כפול- כל אלו גורמים לכך שהמבנה הוא לא מדויק(, הפולימרז נעצר ומגייס פולימרזות מיוחדות polymerase( )translesion שמאפשרות מעבר על גבי המכשול. אותן פולימרזות הן ספציפיות- כל אחת מזהה מכשול מסוג אחר. יהיו פולימרזות שיחליפו באופן מדויק )ישימו את הבסיס הנכון(, ויהיו כאלו שינחשו- הן לא ידעו מה הבסיס הנכון שצריך להיכנס ויכניסו אקראית איזשהוא בסיס. אומנם זה הכנסה של מוטציה, אבל לפחות זה מאפשר את ההמשך של השכפול. יתכן כמובן שזו מוטציה שתתן יתרון. ברוב המקרים אבל לא. הפולימרזות האלו תחת בקרה מאוד חזקה, הן יגוייסו רק כאשר יש תקלה ב- DNA. אם הן לא מבוקרות נכון, הן יעשו מוטציות בעצמן. *לא צריך לזכור את שמות הפולימרזות. אצל חיידקים, ברגע שיש DNA פגוע, נכנס לפעולה מנגנון, SOS שמגייס אנזימים שמתקנים.DNA באופן רגיל, ללא עקה, פקטור שעתוק בשם LexA משמש כרפרסור לגנים של ה- SOS. פקטור זה עובד כדימר. כאשר יש קריאה של התא שיש DNA פגום, מולקולה בשם RecA משועתקת, והיא חותכת את הרפרסור הדימר לשני מונומרים- מה שהופך אותם למאקטבי שעתוק. כתוצאה מכך הגנים של ה- SOS משועתקים.

30 30 תיקונים תוך כדי שעתוק כאשר מערכת השעתוק מזהה DNA פגוע, היא גם תפעל לתקן אותו. באאוקריוטים, ה- RNA פולימרז נשאר על ה- DNA הפגום ולא מתקדם. מערכת התיקון מזהה זאת ובאה לתקן. בחיידקים, כאשר ה- RNA פולימרז יזהה DNA פגוע, הוא יתנתק מה- DNA ורק אחרי שיופעלו מנגנוני תיקון הוא ישוב לשעתק. יש כמה מחלות syndrome( )cokayne בהם ה- RNA פולימרז נתקע במקום של ה- DNA הפגום, ולא מצליח לאותת למנגנוני התיקון להגיע. לכן הוא אינו מתקדם ואין שעתוק. יכול להוביל לפיגור גדילתי, פיגור שכלי, אבנורמליות של השלד. Ames test ש- יטה ישנה לבחון האם חומרים הם מוטגנים- יכולים לשנות.DNA לוקחים חיידקים בהם המסלול הביוסינתטי לאחת מהחומצות אמינו פגוע. למשל גורמים לו לאבד את היכולת לסנתז היסטדין, ואז הוא חייב היסטדין במצע. אם החומר שבודקים הוא מוטגן, היא יכולה באופן אקראי לעשות מוטציה באותו מסלול שתאפשר לו לייצר היסטדין ואז נראה שגדלות מושבות במצע בלי היסטדין- משמע החומר הוא מוטגן. כמובן שיתכן שהיו מוטציות רבות שלא נזהה בשיטה הזו, היא לא מושלמת. הטלידומיד. היא ניתנה כתרופה לבחילות בוקר לנשים בהיריון. גרמה למומים מולדים, כי פגעה בהתחלקות של התאים. טלידומיד הוא מוטגן שעבר את מבחן איימס. הוא לא נבחן על בע"ח לפני שניתן לשימוש. היום משתמשים בו לטיפול בסרטן. כאמור לתאי סרטן יש מנגנוני תיקון פחות טובים, ולכן הם יותר פגיעים לחומרים שפוגעים ב- DNA. פגיעות מקרינה קרינה )רנטגן או )UV יכולה ליצור כמה סוגים של פגיעות ב- DNA - דימרים של פירמידנים, שבירות דו-גדיליות, ניקים שידרדרו לשבר דו גדילי. בדימרים של פירמידינים, שני פירמידנים עוקבים נקשרים זה לזה. בסיסים בצורה של דימר לא מוכרים על ידי הפולימרז. *דימרים של פירמידין יכולים גם להיווצר ע"י חומרים מסרטנים בעשן סיגריות ופליטת דיזל. בצמחים ואצל חלק מהחיידקים יש אנזימים שמאוקטבים על ידי אור,)photolyase( והם יודעים לתקן את הדימרים הללו. אצל אאוקריוטים יש מערכת שנקראת,nucleotides excision repair שמטפלת באותם דימרים. האנזימים מזהים את הדימר ויוצרים ניק משני צידי הדימר. הליקאס פורם את המקטע עם הדימר החוצה )לרוב מדובר על מקטע של 30 בסיסים בבני אדם(, ואז פולימרז מוסיף את הבסיסים החסרים. המנגנון דומה לזה שב- mismatch, המערכת מזהה שיש הפרעה נפחית בדו-גדיל ושם היא מתקנת. המערכת ב- E.coli :.Urv system פחות או יותר אותו מנגנון כמו באאוקריוטים, רק שההסרה היא של 11 בסיסים ולא 30. יש קומפלקס של 3 חלבונים שמעורבים בזיהוי ובפתיחה של ה- DNA והם.UrvA,,B C ההשלמה היא על ידי DNA פולימרז 1, וההליקס נקרא.UrvD תיקונים לשבירה של ה- DNA : כאשר יש זיהוי של שבירה של ה- DNA )בין אם זה ניק או שבירה,)double strand חלבוני סנסור חשים בה, והם מזעיקים למקום השבר מנגנוני תיקון. במידה והמנגנונים יעבדו טוב, ה- DNA יתוקן והתא ממשיך בפעולתו.

31 31 אם זה קורה במהלך חלוקת התא, במידה והתא חש שזו שבירה שעלולה לסכן את תא הבת, תהליך החלוקה נעצר. אם התיקון לא צלח, התא יעבור אפופטוזיס. מצב ה- DNA נבחן במספר נקודות קריטיות במהלך מעגל חיי התא. ישנם מעצורים מיוחדים על מנת למנוע מהתא להיכנס למחזור התא במידה ויש DNA לא תקין. מעצור אחד הוא בין שלבי.G1-S זה שלב בו התא מחליט אם לשכפל את ה- DNA. אם ה- DNA פגוע לא יהיה שכפול. המעצור השני הוא בשלב ה- G2-M. זה אחרי השכפול ולפני המיטוזה. חלבון ATM הוא חלבון שמזהה שבירות דו גדיליות ב- DNA. חלבון הומולוגי אליו- ATR מזהה שבירות חד גדיליות. הם יכולים להביא לעצירת מעגל התא. אם הם מזהים שבר ב- DNA, הם מפעילים חלבון p53, דרך הפעלת קינזות בשם,chk1+2 שמזרחנות את p53, וגורמות לייצובו )מה שמונע ממנו לעבור דגרגציה בפרוטואוזום(. הייצוב של p53 גורם לו לפעול כגורם שעתוק. הוא נקשר לרצפי בקרה בפרומוטורים של כל מיני גנים )הוא.)trans regulatory element בעקבות כך, חלבון p21 עובר שעתוק ותרגום, והוא יוצא לדכא את חלבוני.CDK1+2 ה- CDKs הם אנזימי מפתח במעגל התא, שאחראים על המעבר מ- G1 ל- S, ומ- G2 ל- M. החלטה זו תלויה בגורמים פנימיים וגורמי סביבה. למשל אם אין אוכל מספק בסביבה, לא תהיה חלוקה. ואם מצב ה- DNA אינו תקין, לא יהיה שכפול/חלוקה. התמודדות עם שבירה חד גדילית בעת שכפול: באיור רואים שהגדיל העליון נשבר. זה גדיל ה- leading. כשמזלג ההכפלה פוגש בניק, הפולימרז נופל, כי הוא חושב שסיים את ה- template. כך השכפול לא יהיה מלא. בעקבות כך מוזעק מנגנון תיקון. המנגנון תיקון מגייס אקסונוקלאזות, שמעכלות את הגדיל ה- leading השבור, על מנת ליצור קצה '3 בולט בגדיל התחתון המשלים אותו. קצה זה יכול לעבור צימוד ל- DNA הדו גדילי מהצד השני )של ה- strand,)lagging על מנת להתארך במקצת. זה ההוספה של החלק הירוק. החלק הירוק יכול להוות פריימר כדי לתקן את החלק החסר בגדיל העליון שנשבר. לאחר ההארכה, הגדילים חוזרים לסידורם המקורי, והפולימרז משלים את החלק החסר בגדיל העליון, וממשיך את הסינתזה רגיל במזלג ההכפלה. האקסונוקלאזות שמשתתפות במהלך התיקון הזה מבוקרות באופן חזק ומבוטאות רק בשלבי מנת שלא ייצרו ניקים ב- DNA. על ו- G2, S

32 32 תיקון ניק ב- DNA לא בעת שכפול: יש מערכת תיקון שמזהה את השבירה ומנסה לתקן אותו. החלבון שמעורב בזה נקרא.PARP הוא מזהה את האתר השבור ונקשר אליו. אז הוא עושה פוליריבוזילציה על עצמו )מוסיף לעצמו שרשראות פוליריבוז ע"י שימוש בקו-פקטור.NAD+ אותן שרשראות נקראות.)PAR זה מהווה סימון לחלבונים נוספים שמגויסים לאזור. אלו הם DNA ליגז ו- DNA פולימרז ביתא. הם משלימים את הבסיסים החסרים. אח"כ אנזים PARG מוריד את היחידות הסוכריות ומשחרר את הקומפלקס. מנגנון ה- PARP יודע גם לטפל בשברים דו גדילים. מנגנוני התיקון דורשים שה- DNA לא יהיה דחוס מאוד. לשם כך יש גיוס של היסטונים מיוחדים, שמסמנים את האזור כשבור )היסטון.)H2AX הם מחליפים את ההיסטונים הרגילים כדי ליצור DNA פחות דחוס, מה שמקל על התיקון. שבירה חד גדילית יכולה להוביל לשבירה דו-גדילית. שבירה דו-גדילית היא חמורה יותר משבירה חד-גדילית, כי מקטע שלם של כרומוזום יכול ללכת לאיבוד, ולא יהיה תבנית להשלים לפיה. היא יכולה להוביל לכך שכל הכרומוזום יתפרק. תיקון שבר דו-גדילי: שברים דו גדילים יכולים להיגרם מקרינה, טעויות בשכפול או חומרים מחמצנים. -Non-homologous end joining חלבוני Ku מזהים את השבירה, ומתיישבים עליה. הם מטפלים בקצוות- מיישרים אותם לקצה חלק וקצת מעכלים אותם ומדביקים את שתי קצוות ה- DNA. מנגנון זה הוא מהיר אבל "מלוכלך" כי הוא יוצר מוטציות מקומיות או.frameshift סטטיסטית, בגיל 70, לאדם יש כ הלחמות של כרומוזומים. זה הרבה פעמים לא קריטי כי רוב ה- DNA אינו מקודד לחלבון. המנגנון מאוד לא ספציפי ויכול לאחות 2 קצוות של כרומוזומים שונים. -Homologous recombination מנגנון שמאפשר שחלוף בין כרומוזומים הומולוגים/כרומטידות אחיות לצורך השלמת המקטע החסר. תחילה נוקלאזות מעכלות את הקצוות השבורים, ויוצרות קצוות בולטים של '3. אותם הקצוות יכולים להשתרבב לכרומוזום ההומולוגי/כרומטידה אחות, שם הם יתארכו על ידי גדילים משלימים, ואז יחזרו לכרומוזומים המקורי שלהם לצורך השלמת המקטע החסר. *אין צורך לדעת בדיוק את האופן של השחלוף, רק את העקרון של שחלוף עם הכרומוזום ההומולוגי והשלמת המקטעים

33 33 החסרים על פי ה- template שלו. כתוצאה מהמנגנון הזה, אם התיקון היה בין כרומוזומים הומולוגים, ועל גן שאדם היה הטרוזיגוט עבורו, זה יהפוך אותו להומוזיגוט. במנגנון זה, שני ההומולוגים צריכים להיות קרובים אחד לשני. לכן זה יכול להתרחש רק לקראת שלב ה- S. החלבונים המתקנים הם מאוד מבוקרים. הם נוצרים בתא במצב לא פעיל וצריכים לעבור אקטיבציה ע"י סיגנלים שמאותתים כי יש נזק ל- DNA. אם תהיה פעילות יתר או חסר שלהם, יתפתחו גידולים סרטניים. החלבונים שמזהים את הרצף שצריך תיקון ועושים את השחלוף בין ההומולוגים הם RecA בבקטריה ו- Rad51 באאוקריוטים. שלב השחלוף הוא האיטי ביותר במנגנון התיקון. ה- RecA מתלפף סביב ה- DNA החד גדילי ומותח אותו )תוך ניצול.)ATP אז הקומפלקס של ה- RecA וה- DNA החד גדילי מתחברים אל ה- DNA הדו גדילי בכרומוזום ההומולוגי. ה- Rec פותח את הדו-גדיל בכרומוזום ההומולוג, והחד גדיל נדחף ביניהם, כך שנוצר הטרודופלקס )דו גדיל, המורכב מגדיל אחד של הכרומוזום השבור וגדיל משלים מהכרומוזום ההומולוגי שלו(. במידה ויש התאמה הומולוגית בבסיסים )כלומר אכן מדובר במקטעים הומולוגים בין הכרומוזומים(, ה- RecA יתנתק )ע"י הידרוליזה של,)ATP והחד גדיל יושלם על פי ה- template של הכרומוזום ההומולוגי. במידה ואין התאמה בין הבסיסים, ה- Rec יחפש אזור אחר בכרומוזום להיקשר אליו. בבני אדם, חלבוני BRCA הם חלק מקומפלקס חלבונים שמגייסים את Rad51 הנחוץ לרקומבינציה הומולוגית. ה- BRAC1+2 אלו נחשבים סופרסורים לגידול. אם יש בהם מוטציה והם לא פעילים, מנגנון התיקון של רקומבינציה הומולוגית נפגע, והתא נהיה סרטני. מוטציות בגנים אלו מופיעות ב- 3-8% מסרטני השד. ה- BRCA2 תופס את ה- Rad51 ושומר אותו לא פעיל. כאשר יש נזק ל- DNA, הוא מוביל את ה- Rad51 לאזור הנזק, ומשחרר אותו כך שהוא נהפך לפעיל. BRCA1 כנראה קשור בעיכול הקצוות הראשוני שחשוב לרקומבינציה הומולוגית. אם הוא לא פועל כמו שצריך, יתרחש מנגנון התיקון הלא הומולוגי, שמעלה את הסבירות למוטציות. כאשר ה- BRCA לא מצליחים להשרות תיקון הומולוגי, יש תיקון על ידי מנגנון ה- PARP. כפי שראינו, יש כמה מסלולים בהם מתוקן.DNA במידה ומסלול אחד פגוע יש סכנה מוגברת להתפתחות של סרטן. אבל גם לתא סרטני עדיין נותרו מנגנוני תיקון שעובדים, אחרת הוא לא היה יכול להמשיך להתחלק. למעשה, התא הסרטני ממש תלוי במערכות התיקון האחרונות לצורך התרבותו. מכאן בא רעיון לטיפול חדש בסרטן- הבינו שיש אופציה לחסום את מנגנון הטיפול התקין שנותר, וכך להרוג את התא הסרטני. בתאים רגילים, אם חוסמים מערכת תיקון אחת זה לא אידיאלי, אבל הם כן ימשיכו לתפקד ולתקן שברים. אבל בתא סרטני, אם חוסמים את המערכת היחידה שעוד נותרה פעילה )ה- PARP ( התאים ימותו. תרופה זו רלוונטית לתאים סרטניים שהם הומוזיגוטים למוטציה ב- BRCA ולא לתאים להטרוזיגוטים למוטציה, שכן בתאים ההטרוזיגוטים המנגנון ההומולוגי עוד יפעל במידת מה.

34 34 שימוש במערכות תיקון DNA במחקר צריך להבדיל בין כמה גישות מחקריות. גישה אחת היא.forward genetics בה לוקחים פנוטיפ כלשהו )בדר"כ מחלה( ומנסים לגלות מה הגן שאחראי לפנוטיפ הזה. דרך אחת לגלות זאת היא באמצעות.screening עושים מוטגנזה אקראית בתאים, ובודקים מה הפנוטיפ של המוטציה )זה ה- screen (. את המוטגנזה הזו אפשר לעשות באמצעות,PCR שיעשה שכפול של ה- DNA, אבל עם פולימרז גרוע, שיש לו הרבה טעויות. דרך אלטרנטיבית היא לחשוף את התא למוטגנים, שיעשו מוטציות באופן אקראי, ואז נחקור את הפנוטיפ. גישה אחרת היא.reverse genetics פה בוחרים גן מסוים, פוגעים בו ע"י מוטציות מכוונות וידועות, ובוחנים מה ההשפעה על הפנוטיפ. כדי לעשות את המוטציות האלו מתכננים פריימר שיש לו מוטציה מכוונת, ובעזרת PCR מסנתזים את הגדילים. יש אפשרות לזהות את הגדיל החדש על פני הישן בזכות המתילציה )רק בישן יש מתילציה(. ככה עושים שינויים ברמה של הגן. חוקרים את הפעילויות האלו.in vitro אבל במקרים רבים רוצים לעשות את השינוי ברמה של כל הגנום- ליצור צמח טרנסגי או חיה טרנסגנית. התקווה היא שבעתיד יהיה ניתן לעשות את זה באדם כטיפול למחלות. הכלים שעמדנו לרשותו בעבר היו רקומבינציה הומולוגית. אם יש מקטע של DNA שאותו רוצים להחליף, היו שמים את המקטע שרוצים להכניס )מקטע שהונדס גנטית( על פני וקטור, ונותנים למערכת של הרקומבינציה להחליף ביניהם. זו לא שיטה יעילה אבל היא עובדת. בקצרה על התהליך- לוקחים תאים עובריים, שנלקחו מבלסטוציט )ביצית מוקפאת שעברה מספר קטן של חלוקות(. הם נלקחים מעכבר שיש לו תכונה מובחנת )נגיד פרווה שחורה(. עושים מניפולציה שגורמת לוקטור לחדור אל תאי הבלסטוציט )לא יעיל אבל עובד(. בעזרת אנטיביוטיקה אפשר לעשות סלקציה רק לתאים שעברו את השינוי, ואותם להחדיר לתאים עובריים שנקצרו מעכבר אחר, עם תכונה מובחנת אחרת )נגיד פרווה לבנה(. העוברים ההיברידים מוחדרים לאם, ונולדים צאצאים כימרים-להם תהיה להם פרווה לבנה עם אחוז מסוים של הפרווה השחורה והמוטציה של הנוק- אאוט. אם המוטציה חדרה לאזור של הגמטות, הצאצאים של אותם עכברים כימרים בגמטות כבר יהיו הומוזיגוטים למוטציה. זה תהליך מאוד ארוך והוא לוקח כשנה. בטכניקות החדשות, עובדים על לעשות מוטציה נקודתית על ידי שבירה דו גדילית של ה- DNA. את השבירה צריך לעשות באופן מדויק מאוד- בדיוק בנוקלאוטיד שאנחנו רוצים שיוחלף. אחת ממערכת התיקון שהזכרנו היא המערכת הלא- הומולוגית,)NHEJ( שעושה מוטציות. אם יהיה לנו מזל היא תעשה את המוטציה כמו שרצינו והשגנו נוק-אאוט של גן. אופציה אחרת היא להשתמש במערכת התיקון ההומולוגית repair(.)hdr-mediated במקרה זה, לאחר השבירה מכניסים לתאים בעודף את המקטע שנרצה שיוחלף. מערכת התיקון תזהה אותו ותכניס אותו לתוך הגנום. בדרך זו עושים נוק-אין. אפשר לעשות את זה לגן שלם או )ואז צריך להחדיר מקטע דו גדילי( או למוטציה נקודתית של נוקלאוטיד אחד )ואז צריך

35 35 להחדיר מקטע חד גדילי עם השינוי בנוקלאוטיד(. כדי לכוון למערכת תיקון אחת ולא אחרת, צריך להוסיף חלבונים שיעכבו את המערכת השנייה. בשביל השיטות האלו משתמשים בנוקלאזות ספציפיות, שיודעות לחתוך את ה- DNA במקום הנחוץ. מגה-נוקלאז הוא נוקלאז מאוד ספציפי, שיכול לזהות רק רצף מסוים )של בסיסים( מתוך כל הגנום. הספציפיות מושגת על ידי כל מיני מודיפיקציות לנוקלאז, שבזכותן הוא מכיר רצף מאוד ספציפי של בסיסים. זה לא פשוט לעשות את המודיפיקציות האלו על הנוקלאז, ולכן יש רק מספר מוגבל של רצפים שניתן לתכנן נוקלאז מיוחד אליהם. שיטה אחרת היא שימוש ב-.zinc-finger nuclease לוקחים נוקלאז כללי בשם,Fox שנקשר ל- DNA על ידי 'אצבע אבץ'. האצבע אבץ מזהה רצפים ספציפיים על ה- DNA, ולכן אפשר לכוון את הנוקלאז להיקשר לרצף המבוקש. הנוקלאז עובד כדימר-עליו להיקשר לגדיל העליון והתחתון, והחיתוך יתבצע איפה ששני המונומרים נפגשים. גם עם שיטה זו יש בעיות, קשה לפתח אצבעות ספציפיות. היום בשיטות עובדים עם נוקלאזות בשם.TALENs זה די דומה לנוקלאז עם אצבעות אבץ, רק שהפעם החלק שנקשר ל- DNA הוא רצף חומצות אמינו, שהינדסו אותו להיות רצף בתחילת חלבון הנוקלאזה. ניתן היום לבחור רצף חומצות אמינו כזה שמתאים רק לאזור אחר בגנום. גם הנוקלאזות האלו עובדות כדימר )החלק החותך הוא גם נוקלאזה.)Fox שיטה אחרת היא שיטת קריספר, שעובדת עם אנזים.Cas9 אנזים זה נלקח מבקטריות. הוא אנדונוקלאז שמשמש את הבקטריה להגנה מפני בקטריופאג'ים. האנזים שובר את ה- DNA של הבקטריופאג' לאחר רצף קצר ומסוים שנקרא.PAM ההפעלה של האנזים היא על ידי מקטע של.RNA בחיידקים, הם מייצרים אותו, והוא נקשר אל ה- DNA של הפאג', ומגייס את ה- Cas9 שיחתוך באותו האזור-מיד אחרי ה- PAM. כאשר רוצים לשבור את הגנום בנקודה מאוד ספציפית, מסנתזים מולקולת,RNA שתדע להיקשר למקום ב- DNA אותו רוצים לשבור, ומחדירים אותו לתא עם.Cas9 זה מן הסתם יעבוד רק איפה שיש רצפי PAM )אבל זה דבר שהוא יחסית שכיח בגנום(. לאחר השבירה, ניתן לעשות מוטציה עם רקומבינציה הומולוגית ולא הומולוגית.

36 36 אורגניזמים שהם מודלים גנטיים מערכת השמר כמודל מחקרי שמרים הם אאוקריוטים חד תאיים. הם מודל מחקרי מאוד נוח כי הם גדלים מאוד מהר וניתן לעשות להם מניפולציות גנטיות יחסית בפשטות. הגנום שלהם מאוד קטן ועבר ריצוף מלא עוד בשנות ה- 90. יש לו המון מרקרים שניתן להשתמש בהם. אלו מרקרים ביוסינטטים של חומצות אמינו, אנטיביוטיקות, בסיסים. ה- DNA של השמר מורכב מ- 16 כרומוזומים, ויש לו רק בסיסים ו- 650 גנים. ה- DNA כמעט חסר אינטרונים. זמן החלוקה הוא מאוד קצר. שמר האפייה נקרא גם שמר הנצה, כי בתהליך המיטוזה יש הנצה של התא החדש מהתא הישן. השמר הוא האפלואידי, ויש לו הומולוג לשמר זכרי ונקבי. אפשר בעזרת מניפולציה ליצור שמר דיפלואידי, שיתחלק ל- 2 שמרים האפלאידים )במיוזה( שיהיו בצורה של נבגים )כמו תאי זרע(. לשמרים שימוש נרחב בתעשייה הפרמצוטית. הם משמשים ליצור אלכוהול, אפייה, מקור ויטמינים, מקור פרוביוטי. הוא נחשב בטוח לאורגניזמים בניגוד לחיידקים. השימוש בשמר כמודל הוא רלוונטי כי המסלולים המטבולים שלו דומים לשאר התאים האאוקריוטים. ניתן לעשות רה- קונסטיטוציה- לקחת מסלול מטבולי בשמר שהוא מוכר, ולעשות לו מוטציה שתהרוס אותו, תוך כדי screening במצע שמכיל את החומר שהשמר הפגוע לא יודע לסנתז. בנוסף אפשר להחדיר לשמר גן מיונק ולחקור את הפעילות שלו בתא השמרי. החסרונות עם העבודה בשמר היא שלא ניתן לחקור מנגנונים של התפתחות. ניתן להכניס פלסמידים לשמרים, שיוכפלו בתוך השמר ויתבטאו בכמויות גדולות. יש גם פלסמידים שמתחלקים יחד עם הגנום של השמר )להם יש.)centromeric sequence ניתן להכניס מסלול ביוסינטטי שלם לתוך שמר בפלסמיד, כי יש הרבה מרקרים ידועים. וניתן לעשות מניפולציות גנטיות בשמר על ידי הפלסמידים. השמר מסייע לנו לחקור קשרי חלבון-חלבון. קשרי חלבון-חלבון הם חשובים מאוד בכל המסלולים הביולוגים. כל החלבונים בתא עוברים אינטראקציה עם חלבונים אחרים במהלך החיים, ואחת המטרות היא להבין את הקשרים החלבוניים האלו- האם חלבון אחד הוא מעכב/זרז לאחר, אינטראקציה בין ליגנד לרצפטור וכן הלאה. יש אינטראקציות חלבוניות שהן יציבות, כמו בנוגדנים, פולימרזות. ויש אינטראקציות זמניות, שהן מבוקרות, כמו בחלבונים אלוסטרים, מודיפיקציות אחרי תרגום ועוד. ישנה מערכת מיוחדת שפותחה בשמרים לחקור אינטראקציות חלבון-חלבון. היא נקראת hybridsystem).y2h (yeast 2 לגורמי שעתוק יש שני אזורים- האחד שמאפשר את הקשירה ל- DNA )נקרא,)DNA binding domain-bd והשני שמאפשר את הקשירה ל- RNA פולימרז domain-ad(.)transcription activation בין הדומיינים האלו יש אינטראקציה- ללא קשירה לא יתרחש שעתוק. כאשר חקרו את הפקטור שעתוק Gal4 גילו את שני הדומיינים האלו )בניסוי שנדבר עליו יותר בהרחבה בחלק של מוטי(.

37 37 שיטת ה- hybrid :two כאשר יש חלבון שמעניין אותנו לחקור, מחברים אותו אל ה- BD של פקטור שעתוק לגן מדווח. החלבון הנחקר נקרא חלבון פיתיון. גן מדווח מאפשר לנו לעקוב אחרי הביטוי של הגן )נגיד כי הוא משנה את הצבע של התרבית או שהוא מאפשר גדילה על מצע סלקטיבי בלי נויטריינט כלשהו, או שניהם(. הקומפלקס חלבון פיתיון- BD ידע היכן להיקשר, אבל הוא לא ידע לאקטב את השעתוק. בנוסף עושים עוד היבריד- לוקחים את ה- AD ומאחים אותו עם cdna לחלבון טרף- חלבון שאנחנו חושדים שהוא עובר אינטראקציה עם החלבון השני שלנו )הפיתיון(. הקומפלקס הזה יודע לשעתק אבל הוא לא יודע היכן. הציפייה היא שתהיה אינטראקציה בין חלבוני הטרף והפיתיון, שתוביל ליצירה של פקטור שעתוק )יהיה חיבור בין ה- AD וה-,)BD ואז נראה ביטוי של הגנים המדווחים. אם אלו חלבונים שלא עוברים אינטראקציה, לא נראה את הגן המדווח. אפשר לעשות את ההיבדריד של ה- AD -טרף עם הרבה חלבונים שונים, ולבחון את האינטראקציה שלהם עם חלבון הפיתיון. הרעיון הוא ליצור.expression library זו ספרייה של מכלול כל ה- DNA שמתבטא באותה רקמה. לשם כך עושים שימוש ב- reverse transcriptase שמתחבר אליו, ואז בעזרת T עושים פריימר של פולי לכן זנב של פולי- A. יש בקצה ה- RNA.RNA מסנתזים cdna שאותו אפשר להכניס לתוך פלסמיד. המטרה היא לאסוף את כל הגנים שמתבטאים באורגניזם, ולהכניס כל גן לתוך פלסמיד אחר, כאשר כל גן מחובר ל- AD,Gal4 ואז נוכל בקלות לבדוק את האינטראקציה שלהם עם חלבונים אחרים. מאחר וכל רקמה מבטאת גנים אחרים, תהיה ספריה שונה לכל רקמה )ספרית כבד, ספרית לב וכו'(. הרברס טרנסקריפטאז עוצר באופן אקראי, אם הוא יעצור באמצע של קודון )שלשת נוקלאוטידים(, יהיה.frameshift לכן רק 1/3 מהספרייה יבטאו חלבונים אמיתיים, 2/3 יכנסו במסגרת קריאה לא נכונה. כמו כן, חייבים לשמור על ספרייה בה ל- RNA יש כיווניות נכונה של 3'5, אחרת רק 1/6 יבטאו חלבונים אמיתיים. )לא צריך לדעת איך שומרים על אלו(. דבר נוסף שלוקחים בחשבון הוא שהפריימר יתפס באופן לא ספציפי לכל mrna שיראה, ועל כן, ה- cdna שנקבל יהיו פרופורציונליים לגנים שמתבטאים ברקמה. אם יש גנים שמתבטאים פחות )שה- mrna נדיר יותר(, יהיה יותר קשה לתפוס אותם, ונצטרך יותר פלסמידים. מכל השיקולים האלו נגזר כמה עלינו לסרוק כדי ליצור ספרייה טובה. עבור 20,000 גנים, צריך ספרייה של כמיליון פלסמידים. אחד הניסויים שנעשו בשמר היה למפות את כל האינטראקציות הקיימות בין חלבונים של השמר. ביטאו את כל הגנים המתבטאים בפלסמידים- פעם אחד שהם קשורים ל- AD ופעם אחת שהם קשורים ל- BD. ואז היה ניתן לבדוק את האינטראקציות בין כולם בשיטת.Y2H מגבלות השיטה: האינטראקציות החלבוניות ב- Y2H צריכות להיות בגרעין. זה לא יכול להיות על חלבונים ממברנלים או מה-.ER השיטה לא מתאימה לחלבוני טרף שיש להם פעילות שיעתוקית בעצמם, כי הם יובילו לביטוי של הגן המדווח בכל מקרה. לשיטה יהיו הרבה false negative ו- positive,false היא אינה מאוד מדויקת. מודל זבוב הדרוזופילה דרוזופילה נבחרה כמודל מחקר לפני כ- 100 שנה. לכך כמה סיבות: 1. זו חייה קטנה ופשוטה, שזול לעבוד איתה.

38 38 אין צורך באישור אתיקה לעבוד איתם. זמן מחצית החיים של זבוב הוא קצר. זבובים יכולים להאריך ימים עד 3 חודשים. אבל הזבוב הבוגר מופיע אחרי שבוע. כל פרט מעמיד המון צאצאים. בשילוב עם מחזור חיים קצר, זה מאפשר לגדל אוכלוסיות מאוד גדולות- של מיליונים. זה מקל עלינו לזהות מוטציות גנטיות נדירות. ניתן לסקור כמויות עצומות של אורגניזמים בזמן קצר. קל מאוד להחדיר שינויים גנטיים, לפי רצוננו. קל לנתח את המערכות. קל לעבוד.in vivo בהשוואה ל- C.elegance והשמר, יש להם אורך חיים שלם-מצעיר עד בוגר. יש להם דיפרנציאציה של רקמות. מאפשר לחקור תהליכי התפתחות. כ- 85% מהגנים שמעורבים במחלות בבני אדם שמורים ברמה מקסימלית לזבוב. מבנה הגנום שמור מאוד לגנום האנושי, אבל הוא מצומצם- יש להם רק ארבעה כרומוזומים. אבל עם זאת, כל התהליכים הבסיסיים זהים- שעתוק וכן הלאה. זבובים מסוגלים למגוון של התנהגויות מורכבות. מערכת העצבים שלו יודעת לעשות אינטגרציה של הקלטים מהסביבה ולהבין כי הוא בסכנה, והיא תורה לו לשנות את כיוון התעופה שלו. יש להם התנהגויות חיזור, מושפעים מאלכוהול, יכולים להתמכר לסמים ועוד מעגל החיים של הדרוזופילה: יש זבוב זכרי ונקבי. הם מזדווגים ואחרי 24 בוקעת רימה )זו התולעת(, שנקראת לארבה. לתולעת כבר יש את כל המערכות- הולכת דם, אויר. הלארבה עוברת שלושה שלבים של התפתחות והופכת לגולם. לגולם יש שני שלבים התפתחותיים ואז הוא הופך לזבוב. כל התהליך הזה לוקח כעשרה ימים בממוצע. במעבדה הם מאוחסנים בבקבוקים, וכל מסלול ההתפתחות מתקיים באותו בקבוק. בתוכו יש את המזון שהם צורכים. לא ניתן להקפיא זבובים elegance(.c כן אפשר(. אפשר להזרים להם פד"ח לתקופה מוגבלת- זה חומר שמרדים אותם, ואז ניתן לעבוד איתם- להפריד אותם, לנתח אותם. יש לנו יכולת לזהות באופן ויזואלי פנוטיפים שונים על פני הדרוזופילה, להבין איך נראים הומוזיגוטים והטרוזיגוטים, ולקשר אותם למיקומים על כרומוזומים. זה מאוד מקל על הניתוח המולקולרי. למשל בעין של הזבוב. העין היא מורכבת- יש אלפי תת יחידות שמרכיבות את העין. יש מחקר נרחב על ההתפתחות של העין. היא אדומה משום שיש לזבוב פיגמנט ההופך אותה לאדומה. יש מוטנט עם עיניים לבנות )נקרא - W( ומוטנט אחר עם עיניים שנראות כעדשה/בוטן. ויש עוד מוטציות שקשורות עם כל מיני פנוטיפים שונים של העין. בדומה לכך, יש המון מוטציות שנותנות ביטוי פנוטיפי בכנפיים. לפני כ- 100 שנה, מורגן חיפש מוטציות בזבובים שנחשפו למוטגנים. הוא גילה אזור בגנום שכאשר יש בו מוטציה, הזכרים מתים, והנקבות הן בעלות כנפיים אכולות. הוא קרא לגן הזה.notch בהמשך מתברר כי ה- notch הוא רצפטור, שהוא חלק ממנגנון תקשורת בין תאית. כאשר הוא פוגש רצפטור אחר, יש אירועי חיתוך, שבעקבותיהם פקטורי שעתוק נכנסים לגרעין ומפעילים תוכניות גנים שחשובות להתמיינות של תאים. יש מספר רב של מחלות שקשורות במוטציות שונות באותו הרצפטור- ביניהם סוגים שונים של סרטן. אלו מוטציות שקשורות בהפעלת יתר של הרצפטור, ולא בחוסר ביטוי שלו.

39 39 מה ניתן ללמוד מזבובים? ניתן ללמוד מזבובים בעיקר על גנטיקה התפתחותית- בכל האספקטים- תאיים, מולקולרים, ביוכימיים. היום משתמשים בזבובים כמערכת להבנה של פיסיולוגיה ומחלות. למשל, הגנים הראשונים שנתגלו באוטיזם נתגלו בזבובים. קצת על ההתפתחות: העובר כעבור 24 שעות פוקע כלארבה. כעבור כמה ימים יש את היצור הבוגר. כבר ברמת העובר מוצאים אזורים מובחנים זה מזה מבחינה תאית, שכל אחד מהם יתפתח לאזור אחר של הפרט הבוגר. בדרוזופילה, האזורים המובחנים מתחילים כבר בביצית. ניתן לעקוב אחר ההתפתחות העוברית על ידי סימון אחד ההיסטונים בסמן פלורסנטי, שמאפשר לעקוב אחרי הגרעינים. כך ניתן לעקוב אחרי נדידה של תאים לאורך ההתפתחות. אלו פרוצדורות שניתן בקלות לעשות בזבוב אבל לא ניתן לעשות ביונקים, שם ההיריון הוא רחמי. בעשורים האחרונים הבינו כיצד מביצית מופרית נוצרת כל תבנית הגוף של הבוגר, בזכות מודל הדרוזופילה. שם ראו את הסגמנטציה. יש קסקדת אירועים של פקטורי שעתוק, שפועלים בצורה היררכית ורוחבית, כדי לייצר אזורים ששונים זה מזה מבחינת זהות התאים, והם יתמיינו לאיברים ומערכות שונות, כתלות במיקום הפיסי שלהם על פני העובר )המיקום הפיסי מכתיב את סוג וריכוז הפקטורי שעתוק אליהם יחשפו(. פה רואים את הלארבה. בצבעים השונים סימנו פקטורי שעתוק שונים, שכל אחד משרה התמיינות לסוג אחר של תאים. יש ביניהם אינטראקציות שמגדילות את מגוון אופציות ההתמיינות- למשל פקטור כחול ישרה תוכנית שונה מפקטור כחול ששולב עם פקטור אדום. תהליכים התפתחותיים בדרוזופילה מופיעים גם ביצורים יותר מתקדמים אבולציונית. Hox genes הם גנים שקשורים בהתמיינות של אזורים אחוריים וקדמיים בדרוזופילה, והם נמצאים גם בעכברים, ובבני אדם. מעניין שגם הפולריות של הגנים נשמרת בין היצורים. למשל גנים שקשורים בהתמיינות לאזורים קדמיים של הדרוזופילה קשורים גם להתפתחות של אזורים מוחיים בעכבר ובאדם. זבוב עם מוטציה ב- genes hox )נוק אאוט של הגן( הוא בעל בית חזה כפול, ו- 4 זוגות כנפיים במקום 2. ביטוי יתר של אותם גנים יגרום להתפתחות של זבוב ללא בית חזה שלם, ובלי כנפיים כלל. בעכברים, ביטוי יתר של ה- genes hox גורר אובדן של צלעות. נוק אאוט של הגנים האלו מובילים לצלעות נוספות. בבני אדם, מוטציות של חסר ב- hox קשורות במלפורמציות שונות של הגפיים והפנים. ביטוי יתר קשור בלוקמיה.

40 40 הגן wingless חשוב גם לסגמנטציה של הזבוב. בזבובים פגיעה בו מובילה לבקיעה של זבובים בלי כנפיים. בבני אדם יש אנלוג שלו שנקרא.witt הוא מקודד לליגנד שהוא חלק מ- pathway שחשוב מאוד בתהליך סרטני. מוטציה בו תוביל לסרטן השד. מרמה שהסתכלנו על גן בודד, אפשר להסתכל באופן מערכתי על פקטורי השעתוק. מאחר והגנום של הדרוזופילה הוא קטן, ניתן לבחון את הזיקה של פקטורי השעתוק לאזורים שונים בגנום. למשל שני פקטורים ספציפיים- הפקטורים A ו- B הם הופכיים בזיקה שלהם לאזורים בגנום. אזורים בגנום שנקשרים טוב ל- A לא נקשרים טוב ל- B ולהיפך. זה תואם את התיאוריה של הסגמנטציה לפי -hox genes אזורים שונים יבטאו גנים שונים כי הם יקשרו באופן דיפרנציאלי לאותם פקטורים, וכך הם יתמיינו לאיברים שונים. המשותף בין הגנום של זבובים ובעלי חוליות הוא כ %. רק 24% מהגנום של בעלי חוליות הוא ייחודי להם. לכן יש חשיבות רבה להבנת הגנום של היצורים האלו. מה ניתן ללמוד מזבובים על ביולוגיה של התא? לארבות עם מוטציות בגן myc לא מתפתחות מספיק ונותרות קטנות. עכברים עם נוק אאוט ל- myc לא חיים. נמצא כי myc הוא אחד האקטיבטורים של גדילת תאים )בכל היצורים(, והוא גם אחד האונקוגנים החשובים ביותר, הוא מעורב בכמעט כל סוגי הסרטן. זה גן שקשור בגדילה, וכאשר הוא יוצא משליטה יהיה גידול. בזבוב, הגדילה של רקמות קשורה במסלול העברת אותות של אינסולין. קינזות PI3 אחראיות על משק הסוכר והאינסולין בתאים. הן מעורבות בהעברת אותות של אינסולין. כשעשו ביטוי יתר של אותן קינזות רק ברקמת שומן של הזבוב )רקמה שמקבילה לכבד של האדם(, הרקמה גדלה בהרבה ממה שהיא אמורה להיות. ברמת האורגניזם, זבובים עם מוטציה ברצפטור לאינסולין נולדים קטנים יותר, וזבובים עם פעילות יתר של המסלול נולדים גדולים יותר. ביונקים, מסלול האינסולין גם קשור בגדילה. ההבדל בגודל של כלב נקבע לפי הרצפטור ל- IGF-1 )אחד הרצפטורים ב- pathway של אינסולין(. בבני אדם, תינוקות לאימהות סכרתיות נולדים גדולים יותר. מסלולי אינסולין רלוונטים גם התפתחות סרטן. המחיר שאנו משלמים על הפעלת מסלול האינסולין הוא שהחיים של היצור הם קצרים יותר. מוטנטים ללא מערכת האינסולין הם יותר קטנים בגודל, אבל מאריכים חיים יותר. זה נראה גם בזבובים וגם בעכברים. המנגנונים ששולטים על גודל איבר: מסלול בשם. hypo pathway כשהכנף מתפתחת ברימה, היא מתפתחת מקבוצת תאים קטנה שנקראת דיסק. כעשו מוטציות ברצפטור,FAT אחד הרצפטורים של המסלול, גודל הדיסק היה מאוד גדול, והסיקו שהגן הזה חשוב לשמירה על גודל נכון של האיבר. בעכברים, עיכוב של המסלול הזה גורר הגדלה רצינית של הכבד. תחום מחקר אחר שמאוד התפתח מהדרוזופילה הוא התפתחות מערכת העצבים. ניתן להבין על מחלות שונות של מערכת העצבים בזכות הדרוזופילה- ממחלות נוירודגנרטיביות, התמכרויות ומחלות נוירופסיכיאטריות. בדרוזופילה גילו גנים שונים שקשורים באוטיזם.

41 41 שעתוק ופוסט שעתוק הדוגמה המרכזית בביולוגיה מדברת על כך שהמידע הגנטי נמצא ב- DNA, הוא משועתק אל ה- RNA, אשר זמין לצאת החוצה מהגרעין. הוא עובר תרגום בריבוזום אל חלבון. הפונקציה היחידה של ה- DNA בתא הוא לאכסן את המידע הדרוש ליצירת חלבון. לא מעט תצפיות לא מסתדרות עם הדוגמה המרכזית. למשל, רק 1% מה- DNA מקודד לחלבון. בעבר חשבו כי כל ה- DNA הלא מקודד הוא "זבל" שלא נעלם באבולוציה. היום ברור כי יש לאזורים הללו תפקודים. כמו כן, מרבית ה- RNA אינו מתורגם לחלבון. יש למולקולות RNA תפקידים רבים, ביניהם תפקידים אנזימתיים. בנוסף, ישנם וירוסים שהגנום שלהם הוא RNA ולא.DNA היום מניחים כי התאים הפרימורדלים כלל לא הכילו,DNA אלא המידע הגנטי היה רק ב- RNA. ההסתכלות על חלבונים כעל גולת הכותרת בדוגמה המרכזית התרסקה עקב ראיות אלו. דוגמה נוספת שקורסת היום היא זו שטוענת כי בכל תאי גופנו יש בדיוק את אותו הגנום. כאשר החלו ללמוד מערכות אימונולוגיות, מצאו כי בתאים מסוימים של מערכת החיסון, חלקים בגנום שלהם עוברים רקומבינציה כדי ליצור את הנוגדנים. לכן כל תא של מערכת החיסון לא זהה לתא הראשוני של הזיגוטה בגוף. היום יש שיטות לריצוף גנום של תאים בודדים, וכך יודעים כי לא כל התאים שלנו זהים, ויש שינויים שנוצרים עקב מוטציות,,deletion טרנסלוקציות ועוד. ככל הנראה אותה הטרוגניות בין התאים חשובה לתפקוד של הרקמות. על אף כל זאת, אם ניקח כל תא בגופנו ונרצף אותו, במאקרו נקבל את אותו הגנום. למרות שהגנום הוא בגדול אותו הגנום בין התאים, לכל תא בגופנו יש פונקציה אחרת, צורה אחרת ותכונות אחרות. ההסבר לכך הוא בקרה על הביטוי הגנטי. העובדה כי לתא יש את האינפורמציה, לא אומרת כי הוא יבטא אותה. כל תא מבטא RNA שונה וחלבונים אחרים. אפשר לשאול מהם האתגרים שעומדים בפני אותו המנגנון שאמור לברור אילו גנים יבוטאו. אתגר ראשון הוא מתי לבטא גנים מסוימים. השאלה של 'מתי' לא מתייחסת לזמן אלא לסיטואציה. למשל יצור פשוט כמו חיידק,E-coli יבטא גנים של רצפטורים לנויטריינטים בהתאם לסוג הנויטריינים שיש בסביבה. לא כדאי לו לבטא את כל הרצפטורים כל הזמן, כי יש לזה עלות אנרגטית גבוהה. הוא צריך לווסת את הביטוי בהתאם לסביבה. בדוגמא יותר מורכבת של יונק, בזמן ההיריון, תאים צריכים לעבור התמיינות לסוגים שונים של רקמות. ההתמיינות נעשית על ידי סיגנלים מהסביבה, וסיגנלים אלו מופרשים על ידי תאים אחרים, שעברו התמיינות. לכן, ההתמיינות מדומה למשחק פינג-פונג- אירוע התמיינות אחד קורה עקב אירוע התמיינות אחר בסביבה. על מערכת זו להית מערכת יחסית "לא יקרה", שלא תעלה על המקורות האנרגטים שיש לגוף להשקיע. במקרים רבים, נוצרות מול' RNA רבות שלא משועתקות, אלא עוברות מיד דגרגציה. לכאורה זו בזבוז של אנרגיה, אבל בחינה יותר מעמיקה מגלה שלא, כי לאותו RNA יש תפקיד בבקרה, ולכן בסך הכללי יש חסכון באנרגיה.

42 42 דוגמה נוספת שנשברה היא לגבי בקרת הביטוי הגנטי. היא גורסת שיש שלבים שונים של בקרה על תהליך הביטוי- בקרה על ה- RNA primary )זה שמיוצר בגרעין מה- template של ה- DNA (, בקרה על ה- mrna )זה שעבר עיבוד, כמו,)splicing בקרה על היציאה של ה- RNA הבשל מהגרעין לציטופלסמה, בקרה על הפירוק של ה- RNA שעבר את התרגום. הבקרה על כל אחד מהשלבים הללו היא קריטית. בדוגמה הזו יש שני דברים לא נכונים. תחילה, הדוגמה היא ליניארית- מתחילה בנקודה מסוימת ומסתיימת בנקודה מסוימת. עבודות חדשות הראו כי יש פקטורי בקרה שמשתתפים בשלבים שונים של התהליך- ובעצם יש מולקולות שעושות פירוק של RNA וגם את ההרכבה שלו בגרעין. בעצם ההסתכלות החדשה על התהליך היא הסתכלות מעגלית, ולא כזו ליניארית עם התחלה וסוף. שנית, החלוקה לשלבים היא מלאכותית. בפועל הכל הוא מנגנון אחד רציף, כי פקטורים שמשתתפים בשלבים מוקדמים משתתפים גם בשלבים אחרונים, ויש גם פקטורים שמשתתפים בבקרה בכל שלבי התהליך. -Machinery מכונות מולקולריות בתא שמבצעות "עבודה". RNA polymerase הוא machinery כזה, וגם הפרוטאוזום. ברוב המקרים אלו machinery אוטומטים. אין להם את היכולת הערכית להבין אם צריך לעבוד על התהליך הזה או לא. למשל ה- RNA פולימרז, אם יראה DNA הוא יסנתז,RNA גם אם התא לא צריך אותו כרגע. מי שמווסת את ה- machinery ומורה לו איפה והיכן לעבוד הם הפקטורי שעתוק והפקטורי תרגום. -Transcription factor הם הפקטורים שמכוונים את השעתוק. מורים ל- RNA פולימרז איזה חלק ב- DNA לשעתק. -Translation factor פועלים על הריבוזום, קובעים לו איזה מולקולות RNA הוא יזהה ויתרגם. - Decay factors פקטורי פירוק- קובעים אילו מולקולות יפורקו. יש פקטורים שמשמשים גם כפקטורי שעתוק, גם כפקטורי תרגום וגם כפקטורי פירוק. הקונטקסט הוא זה שמשפיע על התפקוד של הפקטור. ההסבר הוא אבולציוני- כאשר פקטור רכש עוד תפקיד והיה לזה יתרון, התפקיד נשמר. ביטוי גנטי אנחנו נלמד את תהליך השעתוק כפי שהוא מתבצע בחיידקים פרוקריוטים. יש חשיבות רבה להכרת התהליכים הללו אצל חיידקים, כי הם מהווים חלק אינטגרלי בגוף האדם, וגם כי המערכות שם יותר פשוטות כדי להתחיל ולחקור אותם, והן הבסיס למערכות המורכבות יותר ביונקים. השעתוק נעשה על ידי RNA פולימרז. ה- RNA polymerase משולה למכונית, שדורשת נהג )פקטורים( כדי שיכווין אותה.

43 43 כמה מוסכמויות: ב- DNA,double stranded הגדיל העליון הוא המקודד- כלומר הרצף שלו יהיה כמעט זהה לחלוטין לרצף ה- RNA שנוצר ממנו )לפחות בתהליך השעתוק הראשוני(. הבסיס הראשון ב- RNA נקרא בסיס +1. מה הולך שמאלה ממנו, )לכיוון ה-' 5 והפרומוטור(, נחשב,upstream וכל.1.2 מה שהולך ימינה ממנו, )לכיוון ה-' 3 (, נחשב.downstream הרצף ATG הוא.start codon הוא מקודד למתיונין. עם ההתקדמות בריצוף, גילו שזה נכון ברוב המקרים, אבל לא ב- 100%. נשאלת השאלה האם זו טעות שלא תוקנה או שזה מכווון, כחלק מתהליך אבולציוני? ככל הנראה זה דבר שמקנה יתרון, כשם שכל וריאביליות מקנה יתרון. ה- polymerase RNA מזהה גדיל אחד, שהוא הגדיל ה- template והוא מרצף לפי התבנית שלו. בעבר חשבו ששני הגדילים נפתחים, והפולימרז נכנס ומשעתק את אחד מהם. אבל לאחר הגיבוש של ה- RNA פולימרז עם ה- DNA, התברר כי התמונה היא שונה: הגדיל המלופף נפתח באזור מסוים. באזור הפתוח יש מתכת, והיא מהווה את האתר הפעיל לפעילות האנזימטית. הגדיל של ה- RNA נבנה היכן שהמתכת נמצאת. ברגע שהגדיל מתחיל להתארך, השייר שלו שנוצר זז החוצה, והפולימרז והמתכת נשארים במקום. הפולימרז מביא את ה- DNA אל אזור המתכת הפעיל, ובסביבה הזו יש נוקלאוטידים בודדים. אם הנוקלאוטיד שהגיע הוא נכון מבחינת ההתאמה, המתכת תבצע פעולה קטליטית ויווצר קשר קוולנטי בין הבסיס הנ"ל לבסיס שלפניו. ביצורים פרוקריוטים )כגון ה- E.coli ( יש רק RNA פולימרז אחד. זאת להבדיל מיצורים אאוקטריוטים שיש להם שלושה סוגים של RNA פולימרז. 50% ממולקולות ה- RNA פולימרז בתא עסוקות בשעתוק. היתר לא מחוברות כדי שיוכלו להחליף פולימרז שמתנתק. בפרוקריוטים, האנזים בנוי מ- 5 תת יחידות. בשמרים )שהם אאוקריוטים( יש לאנזים 12 תת יחידות. באופן מפתיע אין דימיון רב בין תתי היחידות של האנזים בין הפרוקריוטי והאאוקריוטי )מבחינת הרצף(. אבל המבנה המרחבי שלהם הוא דווקא כן דומה.

44 44 פה ניתן לראות את מבנה ה- RNA פולימרז: האתר הפעיל הוא באזור המגנזיום. כאמור יש לו 5 תת יחידות, אחת מהן היא יחידה סיגמא. עם סיום השעתוק, כשה- RNA משתחרר, יחידת הסיגמא מתנתקת מהאנזים. יש לה תפקיד חשוב ב- כי זו התת יחידה שיוצרת את המגע הפיסי עם ה- DNA. initiation המודל לשעתוק )כפי שהוא היום( בפרוקריוטים התחלת שעתוק transcription( )initiation of היא קריטית כי היא קובעת מה יהיה קצה ה-' 5 של ה- RNA. זה קובע את מסגרת הקריאה, ואת גורל ה- RNA, ובכלל מה ה- RNA שייוצר. זה אירוע סטטיסטי- כלומר מה שמוצג במודל קורה ברוב המקרים אבל לא בכולם. האירוע הראשוני הוא אינטראקציה של ה- RNA פולימרז בעל יחידת הסיגמא עם ה- DNA )בציור הסיגמא בכתום(. המפגש הזה יקבע איפה הפולימרז יתחיל לעבוד. לסיגמא יש כמה דומיינים. כל דומיין הוא אזור פונקציונלי של החלבון )הוא בעל צורה מרחבית מסוימת, מופרדת משאר הדומיניים(. מחוץ לאזורי הסיגמא יש Closed promotor complex בו ה- DNA סגור, ואינו קשור באופן חזק לפולימרז. ה- DNA אינו כל הזמן במצב דו גדילי, יש מידי פעם פתיחה של הגדילים )של הקשרים המימניים המחברים אותם(, וזה נקרא נשימה. אירועים אלו הם סטוכסטים. תת יחידה הסיגמא מחליטה איפה הקומפלקס החלבוני יקשר. יש לה דומיין אחד שמזהה אזורים עשירים ב- T-A. אלו אזורים בהם יש פחות קשרי מימן מאשר אזורים של.C-G אזורים של A-T הם אזורים שנושמים יותר בקלות, ולכן יש להם רגעים בהם ה- DNA שם הוא.single stranded לסיגמא יש את היכולת לזהות אזורים של single.stranded עם הקשירה שלו ל- DNA החד גדילי, הוא מונע מה- DNA לחזור למצב של double.stranded הזיהוי של הסיגמא את האזור החד גדילי בנשימה הוא סטטיסטי ולא אקראי. זאת מפני שלסיגמא יש העדפה לרצף מסוים ב- stranded double )שזה בעצם אזור התחלת השעתוק( ויש לה העדפה לרצף נוסף שנמצא 35 בסיסים אחרי אזור תחילת השעתוק. אלו שני האזורים שנתפסים מצידי אזור הסיגמא. מאחר וסטטיסטית יש באזור הזה יותר קשרי,A-T אז יש גם יותר סיכוי שיהיה שם single strand ואז יתרחש האירוע של האינטראקציה בין ה- DNA לפולימרז.

45 45 אזורים חד גדיליים הם הרבה יותר גמישים. לאחר שהסיגמא נקשר אליהם, ה- DNA החד גדילי נע לעבר תעלה בתוך הפולימרז שמרוצפת בחומצות אמינו חיובית. הם עוברות אינטראקציה חזקה עם ה- DNA )שהוא שלילי(, והוא נתקע בתעלה, ויכול להגיע לאתר הפעיל, היכן שהמגנזיום. לאחר מכן, מתחילה הסינתזה. יש בסביבה תעלה נוספת המוליכה נוקלאוטידים חופשיים המסתובבים באזור. מניחים כי הם נכנסים באופן אקראי, ואם הם מוצאים "שידוך הולם" הם נשארים שם מספיק זמן ומתרחשת איניציאציה, אחרת הם יוצאים. מאחר וזה אירוע סטטיסטי, יתכנו טעויות. וזה חוזר חלילה- בסיס אחרי בסיס. הקצב הוא בערך של 50 בסיסים בשנייה. יש מנגנונים שנועדו לנטר את הטעויות הללו ולתקן אותן. הרעיון של מנגנון מייצר ומנגנון מבקר הוא נפוץ מאוד בביולוגיה. ככל הנראה לתא יותר יעיל ליצר שני מנגנונים- אחד שמייצר והשני מתקן, מאשר לייצר מנגנון אחד שאין בו טעויות. סביב הנוקלאוטיד ה- 9 בשרשרת, נוצר קונפליקט. הגדיל שמתארך נתקע בתוך לשונית בחלל )מסומן בצהוב בציור(, והוא דוחף את הלשונית ויוצא החוצה. זה גורם לשרשרת פעילויות ושינויי קונפורמציה, שגורמת לשחרור יחידת הסיגמא מה- RNA פולימרז. בעצם היחידה הזו נמצאת רק בתחילת השעתוק, בעת שעתוק ה בסיסים הראשונים. הפולימרז ממשיך לשעתק בסיס אחרי בסיס, עד אירוע טרמינציה. בהתחלה תפקיד הלשונית היה תמוה. היא הרי מפריעה ל- RNA כי שניהם תופסים את אותו המקום. אבל דברים לא נשארים סתם באבולוציה, ואכן התברר כי יש לה תפקיד בבקרה על איכות ה- RNA, היא עוזרת לוודא שה- RNA הוא "כשר". כאשר מתווסף בסיס לא נכון, הוא לא יתקע בלשונית, והוא לא ידחוף אותה. כך ה- RNA יישאר תקוע בחלל לזמן מה )כי לא יתרחש שינוי הקונפורמציה וכו'(, ואז הוא יתנתק באופן ספונטני ויצא החוצה לפירוק )אירוע זה נקרא "הפלה" של.)RNA המחקרים הראשונים בהם ניסו להבין את בקרת השעתוק ב- E.coli, ניסו לקבוע את הקצה ה-' 5 של RNA שמשועתקים מהרבה מאוד גנים-בעצם לזהות פרומוטור. החוקרים השוו את הגנים שרוצפו וחיפשו אזורים משותפים לכולם. בעיקר אזורים upstream לשעתוק, כי הניחו שאירועי הבקרה מתרחשים רק upstream לאזור השעתוק.

46 46 החיפושים הללו לא הניבו פרי, לא היה נוקלאוטיד שהופיע יותר בצורה סטטיסטית מאחרים. אבל כן מצאו אזור, שנמצא 10 בסיסים upstream לשעתוק, שמכיל את הרצף TATTAT )נקרא טאטא בוקס(. זה למעשה רצף שמור. עוד 25 בסיסים אחורה )upstream( היה עוד רצף שמור. סקירה של הרבה מאוד גנים הראתה כי למרות שהאזורים הללו שמורים, יכולות להיות מספר מוטציות בטאטא בוקס והוא עדיין יהיה פונקציונלי. היום מבינים כי עמדות 10- ו- 35- בגן הן העמדות שיחידת הסיגמא נקשרת אליהם. ביניהם יש את האזורים שעשירים ב- A-T. בניסויים בהם החליפו את הבסיסים בעמדות הללו, היו שינויים רבים בביטוי של הגנים, אבל אם החליפו את הבסיסים שבין עמדות 10- ו- 35 -, לא היו הרבה שינויים בביטוי. לכן הם נכנסים להגדרה של פרומוטור. מצאו היום שיש כמה סוגים של יחידות סיגמא, כל אחת מעדיפה רצף אחד. אצל.E, coli יש אחת שנועדה לזהות את רוב הגנים )זו סיגמא 70 שמזהה את הטאטא בוקס(, אבל יש יחידות סיגמא אחרות, שמזהות גנים מיוחדים, כמו סיגמא 28 שמזהה גנים לתנועה וגנים לכימוטוקסינים, או סיגמא 38 שמזהה גנים שמבוטאים מצבים של אי תנועה וגנים שמבוטאים במצבי סטרס. חשוב להדגיש כי הסיגמא תזהה את אזור הפרומוטור גם אם יהיו שינויים בודדים ברצף הבסיסים. אבל זה יוריד את הסיכוי שזה יקרה. הסיבה לכך שלעיתים הרצף לזיהוי הסיגמא אינו מושלם, היא שתהיה יותר שליטה בביטוי של הגנים. אם תמיד הרצף היה מושלם, לא ניתן היה להגביל את התהליך. אבל ברגע שההתאמה היא לא מושלמת, צריך שיהיו עוד פקטורים שיאפשרו את הקשירה, ואת הפקטורים הללו אפשר לבקר בסיגנלים שונים. הגיוון ביחידות הסיגמא מאפשר תחילה לאותו RNA פולימרז לפעול בסיטואציות שונות. מטפורית, הרכב RNA פולימרז יכול לנהוג בכבישים שונים, תלוי בנהג. הוא לא ישעתק כ- default את כל הגנים, אלא את הגנים שהסיגמא )הנהג הנוכחי( תכתיב לו. למשל, במצבי רעב, פועלת סיגמא S, והיא מזהה יותר טוב גנים שקשורים בעקה סביבתית, וכך הפולימרז ישתעק גנים שנועדו להתמודד עם הרעב, ולא כל גן. המודולריות של ה- RNA פולימרז )העובדה כי הספצפיות שלו משתנה בהתאם לתנאי הסביבה והפרטנרים שמוצמדים לו( היא חסכון אדיר מבחינת מערכת ביולוגית. כי מאותם "חלקי בניין" ניתן לייצר קומפלקס שיהיו לו מגוון של תפקודים. בתאים אאוקריוטים המערכת היא יותר מתוכחמת, כי יש יותר פקטורים שמבקרים את אותו מנגנון, אבל ברמות הבסיסיות, הפרטים הם דומים. ה- E.coli הוא יצור עם 3000 גנים, ו- 6-7 סוגי סיגמא. לא יתכן כי זה מספיק כדי לבקר את הביטוי, כי יש הרבה יותר מצבי סביבה להתמודד איתם. ולכן ברור כי צריך להיות עוד מנגנון לבקרה על ביטוי, ופה נכנסים הפקטורי שעתוק.

47 47 פקטורי שעתוק מכוונים את ה- RNA פולימרז לאן להגיע, מתי ובאיזו כמות. הראשונים שעבדו על פקטורי שעתוק, ג'קו ומונו, הציעו את המערכת הפשוטה ביותר שנתנה לנו את ההבנה הראשונית כיצד פקטורים מבקרים שעתוק. הם עבדו בתאים פרוקריוטים וחקרו את מנגנון ה- operon.lac ה- operon lac מורכב מ- 3 גנים: lacz, lacy, laca שרלוונטים לניצול לקטוז מהסביבה. מסגרות הקריאה האלו מוכרות על ידי פרוטור משותף )הצהוב( והם מיוצרים כ- transcript אחד המכיל את שלושת מסגרות הקריאה. operon הוא מסגרת קריאה בה מאוגדות יחד כמה מסגרות קריאה, המבוטאות על ידי פרומוטור אחד ומשועתקות ל- RNA אחד. אם שלושת הגנים הללו משתתפים באותו מנגנון או קומפלקס חלבוני, יש יתרון לבטא אותם יחד, מנקודת מבט של בקרה- שכן ה- E.coli לא זקוק להם בסביבה ענייה בלקטוז וכן זקוק לשלושתם בסביבה שמכילה לקטוז. ארגון זה של כמה מסגרות קריאה תחת operon אחד מאפיין תאים פרוקריוטים. בניסוי של ג'קו ומונו, הם חקרו את הפקטורים שמבקרים את השעתוק של ה- operon.lac עניין אותם להבין מה האזור על פני הרצף של ה- operon lac אליהם הפקטורים והפולימרז נקשרים. בשלב הראשון, הם לקחו את מקטעי ה- DNA של ה- lac RNA והגיבו אותם עם,operon אחרי שסילקו אותו. האזורים של ה- DNA שהיו מחוברים ל- RNA פולימרז עם הסיגמא לא עוכלו על ידי ה- DNAase, הם היו מוגנים. האזור שנותר הוא RNA polymerase footprint -זה האזור שהפולימרז נקשר אליו, והוא הפרומוטור )35- עד.)-10 פולימרז יחד עם הסיגמא. אח"כ הם הוסיפו,DNAase1 אנזים שמעכל DNA ובחנו מה נשאר בשלב השני הם הגיבו את ה- DNA עם פקטור שעתוק,repressor וראו כי הוא מגן על אזור דומה לזה של ה- RNA פולימרז, בתחילת הגן וסוף הפרומוטור. בשלב השלישי עשו זאת עם הפקטור השני-,cAMP-CAP ראו כי הוא מגן על אזור מעט יותר upstream מזה של ה- RNA פולימרז. מכך לומדים שיש התנגשות בין הקישור של ה- RNA פולימרז לרפרסור. זה לא מקרי, התברר כי תפקידו של הרפרסור הוא לעצור את ה- RNA פולימרז. כאשר הוא מבוטא, הוא יושב על הרצף lac operon ומעכב את פעילות הפולימרז כי הוא לא נותן לו להמשיך להתקדם בשעתוק. הרפרסור יתנתק מה- DNA כאשר יהיה תוצר פירוק של לקטוז בסביבה, וכך בעצם הביטוי של הגנים הללו יתבצע רק הם נחוצים )שיש לקטוז בסביבה(.

48 48 כשמסתכלים על הרצף של המקטע שהרפרסור נקשר אליו, מתברר כי יש לו רצף מסוים שמיד אחריו מופיע הרצף המשלים לו. זה רצף פלינדרומי. זה העלה את המחשבה שיתכן כי כל אחד מהגדילים יכול לקשור את הרפרסור, מה שאומר כי הוא עובד כדימר. כל חלבון של רפרסור נקשר אל גדיל אחד. אפשר לראות כי הפלינדרום לא מושלם, וגם לזה יש יתרון אבולציוני. דימר נקשר יותר טוב ל- 2 אתרי קשירה ממונומר לאתר קשירה אחד, כי יש 3 אינטראקציות: בין מונומר אחד ל- DNA, המונומר השני ל- DNA ובין המונומרים עצמם. עקרון 'טובים השניים'- אחיזה של שני פקטורים כדימר טובה יותר מ- 2 פקטורים שנקשרים כמונומר. ואילו היה פקטור שלישי, זה אפילו היה יותר יציב. מתוך כך יוצא שהבקרה של הרפרסור העובד בדימר היא חזקה יותר מאשר אם היה רפרסור שעובד כמונומר. האופרטור )camp-cap( הוא כזה שנקשר לפרומוטור בנוסף לשני הפקטורים האחרים. נמצא כי ה- CAP יכול לעבור אינטראקציה עם הפולימרז. לאור עקרון 'טובים השניים' מבינים כי תפקידו של ה- CAP הוא לעשות אקטיבציה לפולימרז. ל- CAP יש נקודת עיגון ל- DNA, וכנ"ל לפולימרז. כל אחד מהם מייצב את השני, ולכן הקשירה שלהם גוררת הגדלה של הזמן שהפולימרז שוהה על הפרומוטור. זה עושה את האקטיבציה, כי סטטיסטית, זה מגביר את הסיכוי לשעתוק. ה- CAP הוא תלוי.cAMP זו מולקולת שליח בתוך התא. היא רגישה מאוד לרמת הגלוקוז בתא. כשרמת הגלוקוז נמוכה, כמות ה- camp עולה, ולהפך. לפיכך, הפקטור CAP יהיה גבוה במקרים בהם ריכוז הגלוקוז הוא נמוך, ואז יש צורך בניצול של לקטוז. סיכום המודל: כעקרון ה- E.coli יעדיף גלוקוז על לקטוז אם יש לו אפשרות. אם יש גלוקוז בסביבה )ללא לקטוז(, ריכוז ה- camp נמוך ולכן ה- CAP מעוכב, ובנוסף הרפרסור קשור. כתוצאה מכך אין ביטוי של ה- lac.operator כאשר יש לקטוז וגלוקוז בסביבה, הרפרסור יעוף, אבל ה- camp עדיין יהיה נמוך, וימנע המון ביטוי של ה- lac. לכן יהיה מעט מאוד ביטוי של ה- lac. כאשר הלקטוז נוכח והגלוקוז לא, יהיה הרבה camp וכך ה- CAP יאוקטב, וגם הרפרסור לא יהיה, ויהיה הרבה ביטוי של ה- lac. המודל מראה שיש סקאלה רחבה לביטוי ה- operator lac )מאפס ועד הרבה( כתלות בסביבה- מידת הלקטוז והגלוקוז. הוא מסביר תגובה של התא לאינסוף מצבים.

49 49 אירועי הבקרה הללו הם רק על האיניציאציה. כמובן שיש גם אירועי בקרה על טרמינציה ואלונגציה, ולכן המנגנון הוא הרבה יותר מסובך. דוגמא נוספת לפקטור תאי שנקשר לפרומוטור כפונקציה של תנאי הסביבה היא ה- DtxR. זה רפרסור לדיפטריה טוקסין )רעל שמפריש החיידק והורג את המאכסן(, והוא נקשר לפרומוטור רק בנוכחות ברזל. דהיינו, הגן ייוצר רק כשאין ברזל. יש עוד כמובן הרבה דוגמאות כאלו. עקרון טובים השניים מאפשר לשני פקטורים להיקשר יחד ל- DNA. הקישור הוא סמוך פיסית. אבל יש אפשרות ל- elements cis ב- DNA, שנמצאים הרחק מהפרומוטור, לשמש כתבנית לפקטורים וכך להשפיע על פעילות הפולימרז. דוגמא- ברמות נמוכות של חנקן משועתק גן שנקרא.glnA בגישות גנטיות, חוקרים זיהו אלמנטים שנמצאים 140 בסיסים upstream לפרומוטור, ושמשפיעים על השעתוק. לאותם אלמנטים נקשרים 2 חלבונים )טרנס אלמנט( כטטרמר, והם משפיעים על הפולימרז גם דרך עקרון טובים השניים )כלומר מגע פיסי שיוצר אינטראקציה עם הפולימרז(. אנחנו רגילים לחשוב על DNA כעל מולקולה ליניארית, אבל בפועל היא מולקולה גמישה שנמצאת במצב מקופל ומסובב. לכן יש אזורים שרחוקים מבחינת רצף הבסיסים, שיכולים למצוא את עצמם קרובים מבחינה מרחבית, בזכות לופ ב- DNA. חלבוני הטרנס אלמנט מייצרים קשר עם הפולימרז וגורמים לו לשהות יותר זמן על פני ה- DNA, וכך הם מקדמים שעתוק. הקשירה של החלבונים אל הפולימרז דורשת הידרוליזה של.ATP מוצאים כי לולא הפקטורי שעתוק, הפולימרז לא ישהה מספיק זמן על ה- DNA וסטטיסטית, לא יהיה שעתוק. על ידי רגולציה של הקיפול של ה- DNA, אפשר לעשות עוד בקרה על ביטוי הגן.glnA כך למשל אם יגיע חלבון שמונע את הלופ שנחוץ לאינטראקציה של האינהנסור עם הפולימרז, הוא יהווה רפרסור. רצף ה- DNA עצמו גם משחק תפקיד ביצירה של הלופ, כי רק רצף נכון יאפשר יצירה של לופ. קלסיפיקציה של פקטורי שעתוק בתאים פרוקריוטים: לבקרה יש לפחות שתי זרועות- אקטיבציה ועיכוב. שתי הזרועות הללו מתפקדות בו זמנית ברוב המקרים. לכאורה זה מוזר, שפרומוטור ירצה בו זמנית גם עיכוב וגם אקטיבציה. אבל זה מקנה בקרה יותר מפוכחת, כי על ידי שינוי קטן בקישור של כל אחד מהם, ניתן לקבל את מידת השעתוק הרצויה- לא מעט מדי ולא יותר מדי, בהתאם לתנאי הסביבה שמשתנים כל הזמן. הרבה קומפלקסים מכילים גם אקטיבטורים וגם רפרסורים מחוברים פיסית.

50 לA 50 ציינו קודם שלאחר התחלת השעתוק יש אירועי בקרה על אלונגציה וטרמינציה. כאשר הפולימרז מגיע לסוף מסגרת הקריאה יש אירוע טרמינציה. הבקרה על טרמינציה מורכבת לא פחות מזו שעל האיניציאציה, וחולקת עקרונות דומים לזו של האיניציאציה. בהרבה גנים, הטרמינציה מתרחשת באזורים מוגדרים שעשירים ב- A, שלפניהם יש רצף עשיר ב- C ו- G. רצף זה, ברגע שהוא משועתק יודע לעשות לופ. תחילת הלופ הוא בקשר בין A ל- U. הקישור בין ה- וזה גורם לשחרור של ה- transcript. -U אינו יציב, אתרי טרמינציה מצויים גם באזורים שלא היינו מצפים למצוא אותם על פני האופרון- באמצע האופרון ובתחילתו. הסיבה היא שכך ניתן לבקר טוב יותר את השעתוק, ולהפסיק באמצע שעתוק שאינו רצוי. יש פקטורים שמונעים טרמינציה, ובמידה והשעתוק הוא כן רצוי, הם יעצרו אירוע טרמינציה באמצע ה- transcript. סיכום בקרת שעתוק בפרוקריוטים: ישנו RNA פולימרז אחד. תת יחידות הסיגמא קובעות את מיקום התחלת השעתוק, ויש להן ספציפיות לגנים שונים. פקטורי שעתוק משמשים כאקטיבטורים ורפרסורים. במקרים רבים אקטיבטורים יכולים להפוך לרפרסורים, ולהיפך. השעתוק מצומד לתרגום, והרבה פעמים ה- transcript נקשר לריבוזום עוד במהלך השעתוק. בקרת שעתוק בתאים אאוקריוטים השעתוק באאוקריוטים הוא מורכב יותר מהשעתוק בפרוקריוטים, אבל השפה היא אותה השפה. מבנה סכמטי של פרומוטור אאוקריוטי: בצהוב יש את ה- RNA פולימרז. הוא מורכב יותר מהפולימרז הפרוקריוטי. יש לו 12 תת יחידות. יש רצף שמסמן את תחילת הפרומוטור, כמו TATA בוקס, רק שהרצף הוא מורכב יותר וכולל גם

51 51 רצף Inr ורצף DPE )בתכלת(. יש קומפלקס חלבוני- TAFs2D שנקשר ל- TATA box ולפולימרז. הוא מחליף את הסיגמא )מסומן בכחול כהה(. באדום למטה יש פקטור שעתוק שעושה אקטיבציה. הוא נקשר לאלמנט ציס. הוא יכול לעבור אינטראקציה עם ה- TAF2D. הוא משפיע על שעתוק על פי עקרון טובים השניים. אפשר לראות כי יש עוד אקטיבטור שנמצא רחוק מהפרומוטור )אדום למעלה(, והוא עושה את אותה העבודה של אקטיבציה, אבל באמצעות חלבון מתווך )החלבון הכחול הכהה שנקרא co-.)regulator complex כמו שצוין קודם, הפקטורי שעתוק מאריכים את הזמן של הפולימרז על ה- DNA ולכן מגדילים את הסיכוי שיתרחש שעתוק. שעתוק הוא אירוע סטטיסטי ולא דטרמיניסטי, ולכן הארכת הזמן של הפולימרז על ה- DNA מגדילה את הסיכוי שהשעתוק יצא לפועל. בנוסף, הפקטורי שעתוק עושים פעולות נוספות כמו מודיפיקציות ל- DNA, ל- RNA וגם לפולימרז. יש גם אלמנטים של נוקלאוזום וכרומטין )ירוק וכתום למעלה(. ה- DNA האאוקריוטי נמצא במבנה של כרומטין- כרוך סביב היסטונים, ולכן צריך להתמודד איתם בעת השעתוק. נרחיב על זה בהמשך. פה רואים פרומוטורים אאוקריוטים קלאסים- של יונקים ושל יצורים יותר פרימיטיבים )שמרים ופטריות(. בשמר הפרומוטור הוא יחסית פשוט. במיקום 90- בהשוואה לחיידק. יש רצף TATA )בצהוב(. כלומר הוא יכול להיות הרבה יותר upstream אצל יונקים, מוצאים אלמנטים שעושים הגברה לשעתוק )אינהנסורים( )זה בכתום(. האלמנטים יכולים להיות גם upstream וגם downstream לפרומוטור, ואפילו בתוך הגן עצמו. מצאו כי ניתן גם לקרוא את האלמנט הפוך )מ-' 3' 5 ( והוא עדיין יעבוד, אם כי פחות ביעילות )לקחו אקסונוקלאזות שיחתכו את הרצף של האינהנסור, הפכו אותו, וסגרו שוב את ה- DNA, ועדיין הם עשו הגברה לשעתוק(. כשעשו אנליזה לכל הגנום בשיטות של,deep sequencing מצאו כי תחילת השעתוק היא גם אירוע סטטיסטי. הרעיון ששעתוק תמיד מתחיל בפרומוטור הגיע מכך שבניסויים רבים שעשו מצאו כי השעתוק מתחיל באותו אזור של הפרומוטור. אבל בפועל זה אירוע סטטיסטי, ושעתוק יכול להתחיל גם upstream ו- downstream לאזור שאנו מכנים פרומוטור, אבל זה קורה בשכיחות הרבה יותר נמוכה )אפסית כמעט אל מול השכיחות בה השעתוק מתחיל בפרומוטור(.

52 52 מעגל השעתוק: החלוקה לשלבים היא מלאכותית. ההתחלה היא בהרכבה של -pre-initiation complex זה הפולימרז עם הקומפלקס המקביל לסיגמא והפקטורים הרלוונטים. בזמן זה, ה- DNA עוד סגור, ולכן הוא נקרא.closed promotor complex השלב הבא הוא הפתיחה של ה-.DNA שלב זה מאפשר את החדירה של ה- template אל תוך האתר הפעיל בפולימרז. כניסת הנוקלאוטיד הראשון של ה- RNA מהווה את שלב האיניציאציה. עם ההתווספות של בסיסים נוספים, יהיה פינוי של הפולימרז מהפרומוטור, והוא ילך down stream אל הגן. הפקטורים שהיו אחראים על ייצוב הפולימרז נשארים מאחור. לאחר מכן יש אלונגציה עד לשלב הטבעי של ה- RNA. שלב זה הוא מבוקר מאוד, אפילו יותר מהאיניציאציה. זאת כדי לוודא שה- RNA שנוצר יהיה תקין. אם הוא לא תקין הוא יעבור דגרגציה )משערים כי ב- 90% מהמקרים ה- RNA נופל(. השלב הבא הוא קביעת קצה ה-' 3 של ה- RNA )לא בסכמה(. זה לא נעשה על ידי הפולימרז אלא על ידי פקטורים שחותכים את ה- RNA במקום מוגדר ומוסיפים קטעים של פולי- A. לבסוף יש טרמינציה והמעגל מתחיל מחדש. בדומה לניסויים שראינו בפרוקריוטים, גם פה ניסו עשו ניסוים רבים בהם ריצפו את אזור הפרומוטור של הרבה מאוד גנים, כדי לחפש רצף שיכול להוות רצף הכרה ליחידות הסיגמא. כשבחנו את השכיחות של ארבעת הבסיסים במיקומים שונים בפרומוטור, מצאו שפה הרצף השכיח הוא.TATAAA חוקרים ניסו להבין מה החלק בפרומוטור שהוא הקריטי לבקרה על הביטוי. הם חיברו את הפרומוטור לגן מדווח- זה גן שמוציא תוצר שניתן לעקוב אחריו )כמו צבע(, ולכן לדעת מתי הגן מתבטא. אז הם עשו מוטציות קטנות באזורים שונים על פני הפרומוטור, ומצאו כי מוטציות באזורים מסוימים השפיעו הרבה על הביטוי, בעוד שמוטציות אחרות לא )איפה שיש +++ הביטוי היה כמו בקונטרול- ללא התערבות. איפה שיש פחות + או הייתה השפעה(. בסוף הגיעו למסקנה כי יש 3 אזורים קריטיים על הפרומוטור שמשפיעים על השעתוק, ואלו אזורים שקושרים את הפקטורי שעתוק. כיצד גילו את פקטורי השעתוק? היה שילוב של כמה שיטות. שיטה אחת היא DNase -protection assay חוקרים לקחו אקסטרקט של תאים והוציאו את כל החלבונים. הם הפרידו את החלבונים בשיטות שונות של כרומוטוגרפיה, וחיפשו את הפרקציה בה יש את הפקטור שעתוק. לקחו DNA ערום ועיכלו אותו עם DNase לזמן מאוד קצר כדי לשבור אותו לרצפים קצרים. הם הוסיפו את ה- DNA השבור לפרקציות, ושוב הוסיפו.DNAase הם הריצו את הפרקציות בג'ל )ג'ל של DNA ולא של חלבון(, וחיפשו היכן יש

53 53 מקטעים שלא נשברו על ידי ה- DNase, מתוך מחשבה שכאשר פקטור שעתוק יהיה נוכח, ה- DNase לא יוכל לחתוך את ה- DNA באותה הנקודה, כי הפקטור מגן עליו. בכל הפרקציות, הבנד העבה בהתחלה של הג'ל מייצג DNA שלא נשבר, והבנדים שרצו הם מקטעים של DNA שבור באורכים הולכים ויורדים, עד כמה נוקלאוטידים בודדים. הפקטורי שעתוק היו בפרקציות 9-12, שם יש בנדים חסרים. טכניקה אחרת היא.gel shift לוקחים את DNA השבור והערום, ומוסיפים לו את הפקטור שעתוק, ואז מריצים אותו בג'ל. DNA ללא כלום ירוץ ללא בעיה, אבל כאשר הוא קשור לפקטור שעתוק הוא ירוץ לאט יותר, וזה ה- shift.gel זה מוכיח כי יש.shift קשירה בין הפקטור שעתוק ל- DNA. כדי לוודא שהאכן הפקטור שעתוק הוא החלבון הקשור ל- DNA ולא חלבון אחר משתמשים בנוגדן. את נוגדן מוסיפים לג'ל, והוא יקשר אל החלבון ויאט עוד יותר את הריצה של הבנד- מה שיוביל ל- super יתרה מכך, ניתן לדעת בדיוק לאיזה אזור ב- DNA הפקטור נקשר. לשם כך עושים מספר מוטציות בודדות בגן. מוטציה של בסיס אחד באתר הקושר, צפויה לבטל את הקישור בין הפקטור שעתוק ל- DNA וה- gel shift יעלם. General transcription factors באאוקריוטים, יש רשימה של כמה פקטורי שעתוק כללים )לא חשוב השמות כל כך, למעט,)TF2D שהם מדמים את הסיגמא בפרוקריוטים. בקריסטלוגרפיה אפשר לראות שהם נקשרים אל הפולימרז ויוצרים קומפלקס על ה- DNA. אותם פקטורים כללים לא מספיקים כדי לייצב את הפולימרז במקומו ולייצר איניציאציה. לשם כך יש פקטורים ספציפיים שנקראים.transcription activators כמה עקרונות חשובים של פעילות פקטורי שעתוק התגלו בניסוי שבשמרים בו עבדו עם החלבון Gal4 )שהוא פקטור שעתוק(. לקחו גן מדווח )LacZ( שמאפשר לעקוב אחרי מידת השעתוק מבלי לבחון את ה- RNA או דברים אחרים. Upstream לגן המדווח שמו פרומוטור, שמכיל מעבר ל- box,tata רצף בסיסים שה- Gal4 נקשר אליהם כדי להפעיל את השעתוק GAL(.)UAS

54 54 החוקרים רצו לבדוק מהם הדומיינים בחלבון Gal4 שאחראים על שעתוק. הם עשו מוטציות באזורים שונים על פני הגן ל- Gal, ובדקו 2 דברים- את מידת השעתוק של הגן המדווח, וגם את הקישור לרצף UAS על הפרומוטור. הם ראו שמוטציות באזורים ספציפיים מנעה את הקישור, ואז גם לא נצפה שעתוק. מוטציות באזורים אחרים אפשרה את הקישור, אבל עדיין מנעה את השעתוק. המסקנה היא שהקישור ל- DNA הוא חיוני לאקטיבציה, אבל אינו מספיק- ה- Gal צריך אזור באמצעותו יקשר ( binding.)activating site( ואזור אחר באמצעותו יאקטב )site ב- two-hybrid עוברים על הפרדה בין שני הדומיינים האלו. חייב להיות ביניהם מגע פיסי כדי שהפקטור יפעל. הרעיון של חלוקה לשני הדומיינים האלו משותפת להרבה פקטורי שעתוק. יש גם שונות בכמות הדומיינים מפקטור אחד לשני- יכולים להיות למשל דומיין אחד מכל אחד, או BD אחד ו- 2,AD והסדר ביניהם על פני הרצף של הגן יכול להשתנות. איך יוצרים מגוון גדול באפשרויות הרגולציה על השעתוק, שיאפשר הגבה להמון מצבי סביבה? גישה אחת- מגוון גדול מאוד של פקטורי שעתוק על אותו גן. כשבוחנים את אזור הפרומוטור לגן,TTR רואים את הפולימרז 2 קשור עם הרבה מאוד פקטורי שעתוק. בפרומוטור המסוים הזה יש 6 אתרים קושרי פקטורי שעתוק שנמצאים בסמיכות לתחילת השעתוק, ועוד 4 אזורים קושרים פקטורי שעתוק במרחק של כ בסיסים מאזור האיניציאציה. מאחר וה- DNA הוא גמיש ויכול להתקפל, אותם 4 אזורים יכולים להיות פיסית קרובים לאזור הקשירה של הפולימרז )כל אחד עם BD ו- AD אחד(. כל החלבונים האלו יוצרים קומפלקס יציב מאוד, שמאפשר לפולימרז להתחיל שעתוק. היתרון של כל כך הרבה פקטורי שעתוק הוא שזה מאפשר לכייל את מידת השעתוק ברזולוציה די גבוהה )עד 5-10%(, וזה מאפשר לתאים להגיב להרבה מצבי סביבה משתנים. למשל אם פקטור אחד יעוכב כרגע בגלל תנאי סביבה, סטטיסטית זה יקטין ב- 5% את הסיכוי של הפולימרז לשהות מספיק זמן על ה- DNA לייצר שעתוק. ובממוצע נקבל שעתוק מופחת ב- 5%, ולעיתים זה יכול להיות משמעותי בתגובה. מודיפיקציות שיכולות למנוע את הקישור של פקטור שעתוק לפרומוטור הן למשל פוספורילציה של הפקטור )זה הופך אותו לשלילי ואז הוא נדחה על ידי ה- DNA ( או פוספורילציה של ה- DNA.

55 55 גישה נוספת- קומבינטוריקה של פקטורים. אפשר להגיע למגוון רחב יותר של רגולציות עם מספר מועט של פקטורי שעתוק )לא 10 כמו בדוגמא לעיל(. בדוגמא הבאה יש שלושה פקטורי שעתוק- הצהוב, כחול וירוק. כל אחד נקשר לרצף מוגדר וספציפי על פני ה- DNA, והקשירה היא בצורה של דימרים )בגלל עקרון טובים השניים(. כל אחד מהפקטורים יכול לייצר הומודימר )קשירה של שני מונומרים זהים( והטרודימר )קשירה של שני מונומרים שונים(, וזה מאפשר יצירה של 6 דימרים שונים. יש דימרים שמועדפים מבחינת יציבות על פני האחרים, ולכן כל קומבינצית דימר תתן מידת שעתוק מעט שונה. אם מוסיפים על זה את האפשרות לעשות מודיפיקציות על הפקטורים )כדימר או מונומר( זה מרחיב עוד יותר את מידת הגיוון. וככל שעולים במספר הפקטורים, ניתן לייצר עוד ועוד קומבינציות. דוגמא נוספת )ב- b (- ישנו את הפקטור האדום, שיכול להיקשר לפקטור הצהוב בלבד )האדום הוא פקטור שלא נקשר ל- DNA אלא לחלבון(. כאשר האדום נקשר לצהוב, הוא מונע ממנו להיקשר אל ה- DNA. לכן הפקטור האדום ישמש כמעכב, אבל העיכוב יהיה ב- tuning fine כי הוא לא ישפיע על 3 דימרים של אקטיבציה- הומודימר ירוק וכחול, והטרודימר כחול-ירוק. כמה סוגים של עיכוב: -עיכוב תחרותי: הירוק הוא אקטיבטור, האדום הוא רפרסור. לשניהם יש,BD ורק לירוק יש.AD שניהם מתחרים על הקישור אל אותו הרצף ב- DNA. אפשר בצורה מלאכותית להפוך את הרפרסור לאקטיבטור, אם מוסיפים לו AD כמו שיש באקטיבטור הירוק. -עיכוב ע"י אינטראקציה בין הפקטורים: ברגע שהאדום נקשר אל הירוק הוא חוסם לו ה- AD ומונע ממנו לשפעל שעתוק. -אינטראקציה עם פקטורי שעתוק כללים: הרפרסור עובד בדומה לאקטיבטור. אקטיבטור לרוב נקשר אל TF2D )שהוא פקטור שעתוק כללי( ומפעיל אותו. אם הרפרסור נקשר אל ה-,TF2D הוא מונע ממנו לתפקד. מה היתרון של הצימוד בין מעכב לאקטיבטור? זה חסכון בזמן. אם התא צריך עכשיו לייצר אקטיבטור בהינתן סינגל, זה יקח לו הרבה יותר זמן מאשר להסיר את המעכב על ידי מודיפיקציה פשוטה. השעתוק על פני DNA עטוף היסטונים עד כה עסקנו בשעתוק DNA ערום. אבל בתא, ב- DNA עטוף בהיסטונים בצורה של כרומטין. היחידה הבסיסית היא הנוקלאוזום, בה כמות קבועה של DNA מתלפפת סביב קומפלקס היסטון אחד, במרווחים יחסית קבועים. אחת התכונות הייחודיות של ההיסטונים היא שהם מאוד חיוביים )יש להם אחוזים גבוהים של ליזין וארגינין( והם מאוד מאוד שמורים.

56 56 ההיסטונים בנויים מ- 8 תת יחידות. יש להיסטון ליבה יותר קשיחה, ואזורי זנב אמיני שהם אלו שבאינטראקציה עם הסביבה החיצונית. הנוקלאוזומים מתארגנים בצורה מאוד ספציפית, גם מלופפת שנקראת 30nm כרומטין. על זה יש שני ליפופים נוספים ליצור את הכרומוזום. בעת שעתוק בתא, צריך לפרום את הנוקלאוזומים. התא מנצל את הקושי של הפולימרז להתגבר על המחסומים האלו לצורכי בקרה. הכרומטין מאורגן בצורה דחוסה יותר )הטרוכרומטין( או פחות )יו-כרומטין(. RNA פולימרז והחלבונים האחרים כלל לא יכולים לגשת אל האזורים של הטרוכרומטין. אחד התפקידים המרכזיים של פקטור שעתוק הוא לקחת כרומטין דחוס ולפתוח אותו כדי לאפשר גישה לפולימרז ושאר החלבונים. פקטורים אלו נקראים.chromatin remodelers הם יודעים לסלק לגמרי נוקלאוזומים מאזורי בקרה עיקריים, כמו בוקס, וכל אזור ה- assembly TATA של ה- RNA פולימרז בתחילת השעתוק, ולהותיר את ה- DNA ערום. יש גנים בהם אזור תחילת השעתוק באופן רגיל לא מצוי בנוקולאוזום, אלא הוא במרווחים בין נוקלאוזומים. ברגע שהפולימרז ממשיך את האלונגציה, הוא יתקל בנוקלאוזומים והוא יצטרך להסיר אותם או לשנות אותם. אחד הניסויים הראשונים שהצביעו על כך שהכרומטין של גנים משתנה בין תאים, כתלות באם הם מבטאים את הגנים האלו: החוקרים לקחו תאים בהם יש גן כלשהו שמתבטא ותאים אחרים בהם אותו הגן מושתק. הם הוסיפו לגרעינים של התאים DNase לפרקי זמן משתנים. ה- DNase מעדיף לחתוך DNA ללא חלבונים )כלומר DNA לא דחוס(. לאחר סילוק ה- DNase הוציאו את כל החלבונים מהתמיסה ולקחו את ה- DNA הערום, אותו חתכו עם אנזימי רסטריקציה כך שהתקבל פרגמנט באורך ידוע. אותו הריצו בג'ל. בסוג הראשון של התאים, בו הגן כן מתבטא, הזמן של האפס דקות DNase מייצג את הביקורת, בה הפרגמנט היה שלם ורץ לכל אורך ה בסיסים. ואז ככל שה- DNase היה יותר זמן, הפרגמנט הזה התקצר. בסוג השני של התאים, בהם הגן לא מתבטא, ה- DNase לא קיצר את הפרגמנט, וזאת כי הוא היה דחוס בכרומטין.

57 57 יש שני סוגים של פרומוטורים שאקטיבים בשעתוק- סוג אחד הוא כזה שאין בו נוקלאוזום באופן קבוע.)DPN( סוג אחר של פרומוטורים הם כאלו שכן יש בהם נוקלאוזומים )המיקום של הנוקלאוזום אינו קבוע בפרומוטור אלא אקראי(.)OPN( מצאו כי פרומוטורים ערומים מנוקלאוזומים באופן קבוע הם כאלו ששייכים לגנים שהתא מבטא באופן קבוע. ולעומת זאת, הפרומוטורים שכן עטופים בנוקלאוזומים הם כאלו שמתבטאים בתנאי סביבה מסוימים. ואז הביטוי שלהם מותנה בכך שסיגנל חיצוני יוביל לפתיחת הנוקלאוזום )ע"י פקטורי שעתוק(. הסילוק של הנוקלאוזומים: יש כמה מנגנונים שמעורבים בסילוק של נוקלאוזומים. מנגנון הוא לקשור שני חלבונים אל ה- DNA, במרחק קצר יחסית )כ- 130 בסיסים(. כדי ליצור נוקלאוזום צריך 145 בסיסים, ולכן באזור זה לא יוכל להיווצר נוקלאוזום. כשיש נוקלאוזום, עדיין יכול סטטיסטית יכול להתרחש שעתוק. בין שני נוקלאוזומים נמצא,linker שזה אזור יחסית חשוף. הנוקלאוזום יכול לנוע באופן דיפוזי ימינה ושמאלה, וכך לחשוף מקטעי BD שהיו מוסתרים בתוך הנוקלאוזום. מיקום אתר קשירה בתוך הנוקלאוזום הוא קריטי להסתברות שהשעתוק יתרחש. אם האתר קשירה נמצא בקצה הנוקלאוזום, תזוזה קטנה שלו תחשוף את האתר, אבל אם הוא במרכז הנוקלאוזום, יהיה צורך בתזוזה רצינית של הנוקלאוזום, וזה כבר הסתברותית פחות סביר. מעבר לכך שהנוקלאוזום יכול להתנייד באופן חופשי ללא צורך באנרגיה, יש גם אנזימים שיכולים באופן אקטיבי לשנות את מיקום הנוקלאוזום והמבנה שלו, והקשר של ההיסטונים ל- DNA )זה בהשקעת אנרגיה(. יש אנזימים שיכולים לקחת את כל ההיסטונים של הנוקלאוזום ולהעביר אותם מ- DNA אחד לאחד. הם נקראים.histone chaperons מנגנון שלישי מטפל במקרים בהם האתר קשירה נמצא באמצע הנוקלאוזום, מאוד לא חשוף. יש אנזימים ( chromatin )remodelers שמתערבים בקשר בין ה- DNA להיסטונים. קשר זה הוא לרוב הדוק וכך ה- DNA אינו גלוי לחלבונים שנמצאים בסביבה. אותם חלבונים מחלישים את הקשר הזה, כך שהאתר קשירה לא ממש צמוד אל ההיסטון, ואז הוא חשוף אל פקטורים בסביבה. זה מנגנון בו אין תזוזה של הנוקלאוזום )בניגוד למנגנונים האחרים(. לפקטורי שעתוק יש פעולת שרשרת, ולכן אם הם הצליחו להשתחל לאזור דחוס )עקב פעולת ה- remodelers )chromatin הם יוכלו לפתוח את האזורים בסביבתם לצורך השעתוק. כאמור, להיסטונים יש את החלק הליבתי שנמצא בחלק הפנימי, והזנב שפונה החוצה. זנבות ההיסטונים יכולים לעבור אינטראקציה בינם לבין עצמם וכך להשפיע על הארגון המרחבי של ההיסטונים. הם יכולים ליצור כרומטין דחוס או לא דחוס. לכן, דרך נוספת להשפיע על הפתיחה של ה- DNA היא להשפיע על זנבות ההיסטונים )באמצעות מודיפיקציות(, כך שהאינטראקציות ביניהם יחלשו. אלטרנטיבה אחרת ממודיפיקציות היא שימוש בחלבונים שיהוו תחרות לקשר בין הזנבות. אם יהיה חלבון שיקשר אל אחד הזנבות, הוא ימנע מאותו זנב ליצור אינטראקציה עם זנב אחר.

58 58 בין המודיפיקציות שעל זנבות ההיסטונים נמצא מתילציות, אצטילציות, יוביקוויטינציה )ועוד(. גם החלק הליבתי של ההיסטון יכול לעבור מודיפיקציות, אבל זה פחות שכיח. מאמינים כי גם ההשפעה של מודיפיקציה בחלק הליבתי היא פחות משמעותית מההשפעה של מודיפיקציה בזנב. שתי המודיפיקציות שכדאי לזכור הם מתילציה על ליזין ואצטילציה על ליזין. אצטילציה על ליזין מנטרלת את המטען החיובי שלו, וכך הזנב נקשר פחות חזק אל ה- DNA )לכן לאחר אצטילציה ה- DNA יותר חשוף לפקטורי שעתוק(. חלבון בשם ברומודומיין יודע לזהות היסטון שעבר מודיפיקציה של אצטילציה )הוא לא יזהה היסטון שעבר מתילציה(. אם חלבון זה נקשר אל ההיסטון לאחר אצטילציה הוא יסייע עוד בפתיחה של ה- DNA. מתילציה על ליזין גם מנטרלת את המטען אבל באופן פחות חזק. חלבון בשם כרומודומיין יודע לזהות היסטון שעבר מודיפיקציה של מתילציה )אבל לא יזהה אצטילציה על היסטון(, ולהגביר את פתיחת ה- DNA. מוטציות בגנים לחלבונים שמזהים את המודיפיקציות האלו יכולות לגרום לסרטן. חוקרים ניסו למצוא קשר בין סוגי המודיפיקציות על ההיסטונים וביטוי גנים. כאשר בחנו באופן ספציפי את הזנב של H3, מצאו כי באזורי כרומטין בהם אין מודיפיקציות על אותו הזנב, הגנים מושתקים ולא מתבטאים כלל. לעומת זאת כרומטין עם מודיפיקציה של אצטילציה בעמדה 14, הובילה לביטוי נרחב של הגן. לעומת זאת, מודיפיקציה של אצטילציה בעמדה 9 הובילה לתזוזה של היסטון. ועבור כל מודיפיקציה נמצאה תגובה שונה. דבר זה נעשה על פני כל ההיסטונים, והתגלה כי ישנו קוד של היסטונים, שהוא קוד נוסף על פני הקוד הגנטי וקודים אחרים בתא, והוא חשוב לביטוי גנים. הנוקלאוזום הראשון, וזנבות ההיסטונים בו, חשובים לבקרה של תחילת השעתוק. -TF2D הקומפלקס האנלוגי לסיגמא באאוקריוטים, שאחראי על מציאת אתר תחילת השעתוק ל- RNA פולימרז. הוא מורכב מכמה חלבונים, אחד מהם הוא TATA binding protein שנקשר אל ה- TATA. לאחר שה- TF2D מזהה את ה- TATA, הוא קושר את ה- RNA פולימרז, ואז עושה מודיפיקציה על היסטון שנמצא נוקלאוזום אחד downstream לאזור תחילת השעתוק. אחד מזנבות ההיסטונים שלו מכיל קומפוננטות שה- TF2D יודע לזהות. הקומפלקס TF2D עובד בשיטה של טובים השניים, וקושר אליו כמה חלבונים נוספים, מה שמייצב את הקומפלקס במקום ליותר זמן. מתברר כי פגיעה בזנב של ההיסטון בנוקלאוזום הראשון, תוביל לכך שהקומפלקס TF2D ישהה באתר התחלת השעתוק פחות זמן )ולכן גם הפולימרז ישהה שם פחות זמן(, והשעתוק יהיה פחות סביר סטטיסטית. למעשה הזנב של ההיסטון בנוקלאוזום הראשון משמש כפקטור שעתוק.

59 59 הכרומטין מעורב בהרבה בקרות נוספות מלבד שעתוק. לאחר תחילת השעתוק, ה- RNA פולימרז צריך לעבור דרך נוקלאוזומים לשם האלונגציה. הארגון הבסיסי של הכרומוזום מהווה מכשול בפני ה- RNA פולימרז, והוא צריך להתגבר עליו. אפשר לשאול למה נוצר המכשול הזה ומדוע לא סולק באבולוציה? התשובה היא בקרה על קצב האלונגציה )לא על התחלת שעתוק- שם יש את שאר המנגנונים שציינו(. מתברר ש- 90% מאירועי איניציאציה לא מסתיימים ב- transcript בוגר. באותם מקרים ה- RNA פולימרז פשוט נופל ולא ממשיך את השעתוק. בקרה זו חשובה לא פחות מבקרה על איניציאציה, והיא קשובה לסיגנלים של התא. העקרונות של בקרת האלונגציה דומים לעקרונות של בקרת האיניציאציה. אחד הקומפלקסים שמאפשרים את מעבר ה- RNA פולימרז דרך נוקלאוזומים נקרא.FACT הם יודעים להקשר לחלק מההיסטונים- בעיקר.H2A, H2B ה- FACT נמצא מעט לפני הפולימרז ומסלק את יחידות ההיסטון H2A, H2B ומשאיר את,H3. H4 שני אלו הם היסטונים שיכולים להיקשר ל- RNA פולימרז בקשר חלש, והוא יכול לעבור על פניהם ללא בעייה ולשעתק, מבלי לפגוע בהן. לאחר שה- RNA פולימרז עבר, ה- FACT מחזיר את ה- H2B H2A, למקום. הוא יחזיר ספציפית את היחידות שהוציא, ולא סתם FACT שימצא בסביבה, בגלל שהמודיפיקציות עליהן מאוד ספציפיות. עיכוב של H2A, H2B יוביל לכך שהפולימרז יתקע באזור שבו הוא אמור לעבור. זה לא אומר שלא תתרחש כלל אלונגציה, אבל הסבירות שלה תרד כי הפולימרז יתקע שם ליותר זמן, וגם את תתרחש, הקצב שלה יהיה איטי יותר. שחבור- splicing ה- RNA הסופי לא בהכרח מייצג את הרצף של ה- DNA המקודד אליו, וזאת בגלל שרצפים רבים של ה- RNA מוצאים בתהליך ה- splicing. החלקים שהוצאו הם האינטרונים. כל transcript יכול לעבור כמה אירועים שונים של splicing )זה נקרא,)alternative splicing ולכן מתוך מסגרת קריאה אחת ב- DNA יכולים לצאת כמה mrna שונים. למעשה אחד התפקידים של splicing הוא להגדיל את כמות האינפורמציה שיש ב- DNA. כמו כן, ה- splicing מאפשר ורסטיליות לאורך האבולוציה, כי אפשר להכניס מוטציות באינטרונים, מבלי להשפיע על החלבון. אפשר גם שרקמות שונות יבטאו גן באופן שונה ע"י -alternative splicing למשל שאותו גן יתבטא בפיברובלסט באופן מסוים, ובתא כבד באופן אחר. כל חלבון מורכב ממספר דומיינים, כאשר דומיין הוא אזור פונקציונלי מסוים של החלבון. לרוב כל אקסון מקודד ליחידה פונקציונלית אחת, אבל לעיתים יש דומיין שיקודד משני אקסונים. ככל הנראה, יש מספר יחסית נמוך בטבע של דומיינים, אבל האפשרויות הרבות לחבר אותם ע"י splicing מאפשרת מגוון עצום בחלבונים. ההיפותזה על האבולוציה אומרת כי רוב הזמן באבולוציה הוקדש ליצירה של הדומיינים הבסיסים, ושאר האבולוציה התפתחה באופן מאוד מהיר על ידי "משחק" עם אותם דומיינים ב- splicing.

60 ה, 60 אקסון ממוצע באאוקריוטים הוא 150 בסיסים )מספר דומה לכמות הבסיסים סביב נוקלאוזום(. האינטרונים הם הרבה יותר ארוכים- כ בסיסים. ספלייסינג דורש בסיסים בלבד, שבהם צריכים להיות ארבעה אלמנטים: האזור בין סוף אקסון א' לתחילת האינטרון. זה ה- site '5. splice יש רצפים upstream ו- downstream אליו שהם שמורים )יש נוקלאוטידים מסוימים שממש ממש שמורים- מופיעים ב- 100% מאזורי החיתוך, ויש כאלו שמופיעים בשכיחות גבוהה. אזורים downstream יותר שמורים(. מה שיש אח"כ באינטרון הוא לא משנה. אפשר שיהיה כל רצף וזה לא קריטי לספלייסינג. כמו כן מוטציות באזורים האלו לא קריטיות. האזור השני החשוב הוא האזור בין סוף האינטרון לתחילת אקסון ב'- '3. splice site שוב יש רצפים שמורים upstream ו-.)upstream אליו, וגם פה, הם יותר שמורים בצד של האינטרון )שפה זה downstream שני אזורים נוספים שחשובים הם בסוף האינטרון יחסית. לפני ה- site '3 splice צריך להיות רצף עשיר בפירמידנים )כ- 15 בסיסים(, וכ בסיסים upstream לחיתוך יהיה אדנוזין. אזור זה נקרא.branch point ה- splicing מתבצע בשני חיתוכים- טרנספריקציה ראשונה ושנייה. את התהליך של השחבור )מבחינה כימית( לא צריך לדעת. הספלייסינג יכול להתבצע על ידי RNA ולא חלבון. על פני ה- RNA יש רצף שיודע לזהות את ה- junction של האקסון-אינטרון. יש RNA אחד שיזהה את הרצף של תחילת הספלייסנג )זאת אומרת המעבר מאקסון לאינטרון( ו- RNA אחר שיזהה את הרצף של סוף הספלייסינג )מעבר מאינטרון לאקסון(. אלו הם U1/2. snrna הם עושים צימוד בסיסים עם הבסיסים של ה- באזור ה- branch.junction - A ישאר מחוץ לצימוד של הבסיסים, וכך יהיה נגיש לחיתוך של השרשרת. גם RNA פועל בשיטות של אינטראקציות )טובים השניים וכו'(, כמו חלבון. ל- RNA יש יתרון מסוים על פני חלבון והוא שהוא יודע לזהות רצפים ב- DNA וב- RNA באופן יותר מדויק מאשר חלבון. לכן הוא יותר מדויק ביכולת שלו לבקר תהליכים מסוימים.

61 61 בניסוי עשו מוטציה באחד הבסיסים שעל ה- snrna, שמנעה ממנו ליצור צימוד עם ה- mrna. ראו שה- splicing ירד במידה ניכרת. רצו לדעת האם המוטציה פגעה רק בצימוד של בסיסי ה- snrna עם ה- mrna, או שהיא גם חשובה לתהליך של החיתוך. לכן עשו מוטציה אחרת שלא פוגעת בצימוד )כלומר מוטציה לבסיס שעדיין יודע להיקשר ל- transcript ( וראו שאחוז ה- splicing חזר למה שהיה. יש אזורים על פני האקסון שמהווים אינהנסור או רפרסור של.)ESE, ESS( splicing הם מבקרים את פעילות ה- snrna. הרצפים האלו מזוהים על ידי proteins),sr proteins (serine argenine שנקשרים אליהם ומבקרים את פעילות הספלייסוזום. לאקסון יש את היכולת לבקר את ה- splicing של עצמו בזכות אותם רצפים. ספלייסוזום הוא מבנה גדול שמכסה את האזור של האינטרון, והוא אחראי ההוצאה של האינטרון. הוא מכיל את כל המרכיבים שנחוצים לספלייסינג. לכל אינטרון יש את הספלייסוזום שלו. הספלייסינג מתרחש תוך כדי השעתוק splicing(.)co-transcriptional זה מאפשר את השידוך של אקסון אחד לשני לאחר החיתוך. אילו החיתוך היה מתבצע אחרי השלמת השעתוק היה סכנה שאקסונים לא נכונים יתחברו זה לזה, ושאקסונים מסוימים ילכו לאיבוד. הזמן שניתן לקומפלקס הספלייסינג להיווצר תלוי לא רק ביעילות של אותו הקומפלקס, אלא גם בקצב של השעתוק. אם יהיו שני פולימרזים, כל אחד משעתק בקצב אחר, בשעתוק האיטי יהיה לספלייסוזום יותר זמן לזהות את האקסון. אבל אם השעתוק יהיה מהיר מאוד, יש סכנה שהספלייסוזום לא יעמוד בקצב ויעשה טעויות בזיהוי ה- junctions הנכונים. מהם המנגנונים שמאפשרים זיהוי טוב של אתרי הספלייסינג? הספלייסינג מתרחש בזמן השעתוק כך שהאקסונים והאינטרונים נחשפים ברצף מסוים, שעוזר לזיהוי של אותם.junctions אזורי האנהנסור על פני האקסון מושכים את הספלייסוזום לאזור החיתוך. יש לפחות שני snrna שמשתתפים בזיהוי רצפים. זה מוריד את הסיכוי לטעויות. Splicing לא חייב להתרחש בין שני אקסונים של אותו.RNA אפשר שיכנס אקסון בכלל מגן אחר. תעדו את התופעה בחיידקים, אבל כנראה זה קיים ביצורים נוספים. זה נקרא.trans-splicing במקרה זה, ה- RNA יהיה שונה לחלוטין מרצף ה- DNA. זה מעלה את אפשרויות הקומבינציה ליצירת חלבונים לכמעט מספר אינסופי.

62 62 דרכים אלטרנטיביות לספלייסינג של :RNA ה- RNA הראשוני הוא קומפלמנטרי ל- DNA. הוא מכיל את האקסונים והאינטרונים, כמו ה- DNA. מתוך הסכמה זה נראה שהספלייסינג הוא לאחר השעתוק, אבל כפי שציינו זה תוך כדי. ניתן לראות פה כמה דוגמאות ל- RNA בשל שנוצר מאותו transcript ראשוני. השמאלי הוא כביכול הנורמלי- בו כל האקסונים נותרו כפי שהם. האופציה השנייה היא איבוד של אקסון אחד. זה יכול להיווצר על ידי שימוש ב- RNA פולימרז מאוד מהיר, שלא מאפשר לספלייסוזום להדביק את הקצב, ומאבדים אקסון אחד. אופציה אחרת היא שה- snrna שהיו אמורים לזהות את האקסון השני עברו עיכוב, ולכן הוא נחתך. אפשרות נוספת היא exon extended בה יש הוספה של חלק מהאינטרון. יתכן גם שכל האינטרון ישאר- retained.intron כמובן שיתכן שכאשר הייתה החסרה של אקסון, כל פעם תהיה החסרה של אקסון אחר, ולכן יווצרו מולקולות RNA בוגרות השונות זו מזו למרות שנוצרו מאותו RNA ראשוני. כל האופציות האלו אכן נצפו בתאים אמיתיים. בדרוזופילה נמצא גן )DSCAM( שלו יש רפרטואר אדיר של אקסונים וספלייסינג אלטרנטיבי. החוקרים חישבו שמספר הקומבינציות האפשריות ליצור RNA מאותו הגן הוא כ- 38,000. זה כמובן לא אומר שכולם אכן נוצרים. אם לוקחים בחשבון את ה- trans-splicing אז תיאורטית כמות ה- RNA האפשרית היא אינסופית. כ- 15% מהמחלות שנגרמות ממוטציה בנוקלאוטיד בודד נובעות ממוטציות שמשפיעות על הספלייסינג. יש מוטציות שמשפיעות על הקישור של חלבוני ה- SR לאינהנסורים, ויש מוטציות שיוצרות אתרי ספלייסינג חדשים. חוקרים רצו למפות בתוך התא את האזורים בהם מתבצע הספלייסינג. הם סימנו את החלבונים שמשתתפים בתהליך במרקרים פלורסנטים. הם ציפו כי זה יתרחש בכל הגרעין, כי בכל מקום מתרחש שעתוק, אבל מצאו שיש מוקדים מסוימים בהם זה מתרחש. אותם אזורים הם בתי חרושת לשעתוק, וה- RNA המשועתק מגיע לשם לעבור חיתוך. פוליאדנילציה- יצירת קצה ה-' 3 של ה- RNA לכל RNA יש בקצה זנב של בסיסי אדנין. אלו בסיסים שלא מקודדים על ידי ה- DNA אלא הם מוספים ל- RNA לאחר השעתוק בתהליך פוליאדנילציה.

63 63 צריך לא לבלבל בין הטרמינציה של השעתוק )הירידה של הפולימרז מה- template ( וההוספה של זנב האדנין )שיוצרת את הקצה ה-' 3 של ה- RNA (. בתאים אאוקריוטים, אירוע הטרמינציה מתרחש הרבה אחרי שהפולימרז עובר את האזור בו יהיה הקצה ה-' 3 של ה- RNA. פוליאדנילציה מתרחשת במקום מאוד מוגדר ב- RNA, וכאמור קובעת את הקצה ה-' 3 של ה- RNA. ואם היא תתרחש באמצע אזור הקריאה זה יעצור את הגן. אם היא תיווצר אחרי מסגרת הקריאה, התכונות של ה- RNA יקבעו על פי כמה downstream למסגרת הקריאה זנב האדנין נוצר )תכונות כמו באיזה קלות יצא מהגרעין(. יש אזורים שמורים שאומרים איפה צריך להתווסף זנב פולי- A. סמוך אליהם יהיו גם אזורי רפרסורים ואינהנסורים שיבקרו את התהליך. הם יקשרו פקטורים שיעשו את החיתוך במקום הנכון ויוסיפו את זנב האדנין. חלק מאותם פקטורים ישארו על ה- RNA גם כשיסתיים התהליך וימשיכו איתו לתרגום. בדומה לספלייסינג, הפוליאדנילציה מתרחשת תוך כדי השעתוק. אירוע זה נתון לבקרות נרחבות. יש גם אירועים של.alternative polyadenylation יציאת mrna מהגרעין לציטופלסמה שלב זה מכריע את גורל הביטוי הגנטי כמו בקרת שעתוק ובקרת תרגום. התקשורת בין הגרעין לציטופלסמה היא קריטית לקיומו של התא. המנגנונים החשובים לתקשורת זו הן אלו המבקרים יציאת מולקולות מהגרעין לציטופלסמה וכניסת מולקולות לגרעין מהציטופלסמה. ממברנת הגרעין מורכבת משכבה ליפידית שבתוכה משובצים מעין אברונים בעלי 8 תת יחידות סימטריות. בצד הפונה לגרעין המבנים דומים בצורתם לסל, ולכן נקראים.basket מחקרים רבים הראו כי מדובר ב-( NPC ),nuclear pore complex דרכם עוברים חלבונים, RNA מהגרעין לציטופלסמה ולהיפך. השער הוא דו כיווני. פה ניתן לראות חתך בדופן הגרעין, ואת ה- NPC. ה- NPC מסודרות בצפיפות גדולה על פני הממברנה, כך שקומפלקס אחד נושק לשני. בתוך החלל של הפורות יש הרבה סיבים חלבוניים ארוכים. אותם סיבים נקראים nuclear.porins הם מאופיינים ברצפים חוזרים של פניל-אלנין וגליצין repeats(.)fg הרצפים החוזרים הללו יכולים לעבור אינטראקציות בינם לבין עצמם. משום כך, החלל של הפורות הוא סבוך- דמוי ספגטי. ה- NPC אינו השער היחיד בו עוברות מול' בין שני המדורים, לא נרחיב על שאר השערים. דרך ה- NCP יכולות לעבור כ- 28 מולקולות בשנייה, זה קצב מאוד מהיר. כשלוקחים בחשבון את כמות הפורות בממברנה, מדובר על תנועה מאוד מסיבית של מולקולות בין המדורים. גודל ה- NPC הוא כ- 125 מיליון דלתון )פי 30 מריבוזום(. חלבוני ה- NPC נקראים.nucleoporines לשמר יש כ- 30 חלבונים כאלו, וליונק כ- 60. יש דימיון בין החלבונים השמריים והאנושיים. חוק האצבע אומר כי חלבונים עד 60 קילו-דלתון עוברים בחופשיות בפורות. מולקולות יותר גדולות נלכדות ברשת הספגטי ולא יכולות לחצות. המעבר בפורות הוא פסיבי- ללא צורך באנרגיה, וללא צורך בחלבונים מוטורים.

64 64 מולקולות שלא עוברות בפורות בזכות עצמן )חומצות גרעין או מולקולות גדולות( צריכות טרנספורטרים בשם karyopherins כדי לחצות. למשל תת יחידה של הריבוזום נכנסת בדרך זו. הקריופרין עובר אינטראקציות לא חזקות עם ה- repeats.fg משום כך, ה- repeats FG לא נקשרים בינם לבין עצמן, והמעבר מתאפשר דרך סבך הספגטי )הקריופרין מתחרה עם ה- FG הסובבים על הקישור לרצף FG מסוים(. בגלל שהאינטראקציות לא חזקות, הקריופרין יכול לדלג בין רצף FG אחד לבא )הוא נקשר לרצף אחד, הקשר מתנתק, ואז נוצר קשר עם הרצף הבא(. אילו האינטראקציה הייתה חזקה, הקריופרין היה נתקע בתחילת הסבך. הקריופרין משיג את האנרגיה לנוע בתוך הסבך ממולקולות מים שנמצאות באזור ופולטות אנרגית חום. האינטראקציה בין הקריופרין למטען שלו )cargo( חזקה יותר מהאינטראקציה בין הקריופרין ל- FG, וזאת כדי שהוא לא ישחרר את המטען באמצע הסבך. ומה לגבי הכיווניות של התנועה בתוך הסבך? מדוע שהקריופרין ינוע קדימה בתוך הסבך ולא יחזור אחורה? זה אירוע אקראי, לעיתים הוא ישוב ולעיתים יתקדם. אז איך בכל זאת חלבונים מגיעים לצד שהם צריכים להיות בו? בזכות שני דברים: )א( מפל ריכוזים. אם מפל הריכוזים תומך בתנועה לכיוון אחד, אז גם אם שני התהליכים יתרחשו במקביל, בכיוון אחד הקצב יהיה יותר מהיר. אבל בקרה זו היא די מינורית, כי קשה לשלוט בריכוזים במהירות בתנאים של התא. )ב( אפיניות משתנה בין הקריופרין וה- repeats,fg וכן בין הקריופרין ל- cargo שלו. בצד אחד של הממברנה, הוא יהיה באפיניות יותר גבוהה להיקשר ל- FG ולמטען )זה במדור ההתחלה(, ובצד אחר של הממברנה הוא יהיה באפיניות יותר גבוהה להשתחרר מה- FG ומהמטען )זה במדור היעד(. כך מולקולה שהוא העביר לא תוכל לחזור )הוא לא יקשור אותה בצד של היעד(. כל סובסטרט נישא על ידי קריופרין מסוים. יתכן קריופרין שמזהה יותר מסובסטרט אחד. איך קריופרין מזהה את הסובסטרט שלו? חוקר עכב אחרי חלבוני הציטופלסמה בתא מסוים. הוא סינתז אותם בכמויות גבוהות על ידי שימוש בוירוס, ואז בחן את מיקומם בתוך תא אאוקריוטי. הוא בחן מיהם החלבונים שנכנסים לגרעין מהציטופלסמה והבחין שלכל החלבונים שנכנסים יש רצף שמור של כניסה. מדובר ברצף חיובי ששובר אלפא הליקס. רצפים אלו נקראים nuclear localization sequence.(nls) אם לוקחים חלבון שבאופן טבעי לא אמור להימצא בגרעין, ומכניסים לו את הרצף הזה בהנדסה גנטית, הוא יכנס אל הגרעין. מצד שני, אם עושים מוטציה ומשבשים את הרצף הזה, חלבון שאמור להיות בגרעין לא יכנס. לא לכל החלבונים הגרעיניים יש רצף כניסה לגרעין. יש חלבונים שתופסים טרמפ על חלבונים אחרים שיש להם רצף כניסה. באופן דומה יש גם (NES),nuclear export sequence כדי לצאת מהגרעין. יש חלבונים בעלי שני הרצפים, לכן הם יכנסו ויצאו )תנועה דו כיוונית זו נקראת.)shuttling אחוז גבוה מחלבוני הגרעין עושים,shuttling וביניהם רבים הם ללא שני הרצפים )הם תופסי טרמפים(. כדי לקשור את המטען במדור אחד ולשחרר אותו במדור אחר, הקריופרין עושה שימוש ב-.ran בשם GTPase הכניסה לגרעין: את זה עושים קריופרנים מסוג אימפורטין. מחוץ לגרעין האימפורטין קשור ל-.ran-GDP רק במצב זה הוא יודע לקשור את המטען. האימפורטין+המטען+ ה- ran-gdp נכנסים פנימה, ואז GEF משחלף את ה- GDP ב- GTP והמטען משתחרר. המטען לא יכול לחזור, כי הקריופרין קושר אותו רק כשהוא קשור ל-.GDP

65 65 היציאה מהגרעין: קריופרנים בשם אקספורטין עושים את זה. הם קושרים את המטען בתוך הגרעין, בסיוע של ה- ran-gtp. כאשר הם יוצאים אל הציטופלסמה, GAP עושה הידרוליזה ל- GDP ואז המטען משתחרר בחוץ, ולא יכול להיקשר מחדש. כדי שמולקולות RNA יחצו את הפורות, יש טרנספורטרים ייעודים ל- RNA, שלא תלויים ב- GTPase. הם לא ממשפחת הקריופרנים אבל הם מאוד דומים להם, ומתפקדים אותו הדבר. הכיווניות של תנועת ה- RNA מבוקרת על ידי חלבונים שיודעים לנתק את הקריופרין מה- RNA, אבל נמצאים רק בצד הציטופלסמטי. כך ה- RNA נשאר תקוע בציטופלסמה ולא חוזר. הבקרה על היציאה של מולקולות ה- RNA מהגרעין היא מאוד רצינית, והיא תותאם לתנאי הסביבה. כך למשל בעת צורך לחלוקת תא, תתאפשר יציאה של מולקולות RNA רלוונטיות לחלוקת תא. ואילו בתנאים של סטרס, תתאפשר יציאה של RNAs רלוונטיים להתמודדות עם סטרס. תרגום ה- mrna הערוך יוצא מהגרעין ומטרתו היא לעבור תרגום. התרגום לחלבון הוא באמצעות הקוד הגנטי- כל שלשת נוקלאוטידים מקודדת לחומצה אמינית אחת. בזכותו מועבר מידע המקודד בארבע אותיות למידע המקודד ב- 20 חומצות אמינו + סטופ קודון. יש חומצות אמינו שמקודדות על ידי יותר מקודון אחד, ויש כאלו שמקודדות רק מקודון אחר. יש שלושה סטופ קודונים. מסגרת הקריאה: ה- mrna הוא מולקולה ליניארית לרוב. מולקולה ליניארית יכולה להיות מחולקת לשלשות ב- 3 אופנים )3 מסגרות(. שלושת המסגרות האלו יכולות ליצור חלבונים שונים לחלוטין אחד מהשני. בדוגמא הבאה, המסגרת הראשונה מתחילה ב- AUG המקודדת למתיונין )כל חלבון מתחיל במתיונין(. במסגרת השנייה, המסגרת מתחילה בסה"כ נוקלאוטיד אחד אח"כ, וה- transcript שנוצר הוא עם הרבה סטופ קודון. בדוגמא האחרונה, עבור אותו הרצף מתחיל מחלוקה של 2 נוקלאוטידים קדימה, לא יהיו שום סטופ קודון. trna מלאכת הקידוד נעשית על ידי ה- trna. הן עושות את החיבור בין שלשה של נוקלאוטידים לחומצה אמינית. המבנה של ה- trna הוא בצורה של 3 זרועות וקצה, שיוצר מעין תלתן. יש לה מבנה שניוני ושלישוני מאוד מיוחד. בקצה ה-' 3 שלה קשורה החומצה אמינית. היא קשורה לרצף של CCA באופן קוולנטי. בקצה הלולאה שמול החומצה אמינית, יש את האנטיקודון. האנטיקודון הוא שלשה של בסיסים שקומפלמנטרים לקודון אותו היא אמורה לתרגם. Wobble -בשלישית האנטיקודון, במיקום השלישי יש אפשרות לגמישות מסוימת. העמדה הראשונה והשנייה באנטיקודון חייבת להיות תואמת ב- 100% לקודון, אבל בשלישית יש גמישות והיא לא חייבת להתאים

66 66 תמיד לנוקלאוטיד בקודון. הוובל בעמדה הזו מגשר על הפער בין 20 חומצות אמינו ו- 61 קודונים )בלי הסטופ קודון יש 61 קודונים(. ה- trna משועתק על ידי RNA פולימרז- 3. לאחר השעתוק נחתכים הקצה ה-' 5 וה-' 3 )ולפעמים גם חלקים מהאמצע של ה-,)transcript ואז מוספת קבוצת ה- CCA. בנוסף, על פני ה- trna בגרעין נעשות מודיפיקציות שונות. לאחר מכן, המולקולה תעבור אמינו-אצילציה- שזה ההוספה של החומצה האמינית בקצה ה-' 3. זה יכול להיות בגרעין, בציטופלסמה או במיטוכונדריה. תהליך האמינו-אצילציה מתבצעת ע"י trna סינטתזות בתהליך שמצריך.ATP הצימוד הזה נקרא,high energy bond כי אגורה שם הרבה אנרגיה. אותה אנרגיה שאצורה בו תשמש ליצירת הקשר הפפטידי בעת יצירת החלבון. יש 20 אנזימי trna סינטתזות, אחד עבור כל חומצה אמינית. הריבוזום עיוור לחומצה האמינית שהגיעה- הוא לא יכול לדעת אם ה- trna שהגיע נושא את החומצה האמינית הנכונה או לא. מעניין אותו רק אם יש צימוד נכון בין הקודון לאנטי-קודון. לכן האמינות )fidelity( של הסינתטזות מאוד מאוד חשובה. מנגנוני הדיוק של האמינואצילציה: האמינות מתבצעת ב- 2 רמות: בהכרה של חומצת האמינו הספציפית ע"י האנזים. הכרות זו היא עם כמה מנגנוני בקרת איכות. היא נעשית בשני שלבים: תחילה החומצה אמינית צריכה להתאים לאתר הפעיל של האנזים, שהוא בצורה של כיס מרחבי. הכיס של האתר הפעיל אמור להתאים אך ורק לחומצה אמינית אחת. בגלל שיש חומצות אמינו שמאוד דומות, לעיתים תדחף חומצה אמינית לא מתאימה לכיס, ולכן יש כיס נוסף-,editing site שם מתבצעת בדיקה נוספת שהחומצה האמינית אכן מתאימה לסינתטז הזה. אם החומצה האמינית לא תתאים לכיס השני היא תוסר. בהכרה של ה- trna הספציפי עבור האנזים. כל trna שונה מעט במבנה המרחבי שלו. יש הרבה נקודות מגע בין ה-.1.2 trna לסינתטז, וצריכה להיות התאמה גבוהה ביניהם כדי שיקשרו. הקשר הפפטידי הקשר בין ה- trna לחומצה האמינית שלו אוגר בתוכו המון אנרגיה, והיא זו שמשמשת ליצירה של הקשר הפפטידי. החומצה האמינית קשורה אל ה- trna דרך הצד הקרבוקסילי, וביצירת הקשר הפפטידי, נעשה חיבור בין הצד האמיני החשוף שלה לקצה ה- C טרמינלי של פפטיד המתגבש. הפפטיד עדיין קשור בחומצה האמינית האחרונה שלו ל- trna )שקרוי peptidyl- trna בגלל שהוא קשור לפפטיד(, וה- trna החדש שמגיע )שנקרא )aminoacyl trna ידחוף אותו החוצה, ויהפך בעצמו להיות הפפטידיל- trna. יצירת הקשר הפפטידי היא תהליך ספונטני, לא מושקעת בו אנרגיה חיצונית )אנרגיה הושקעה כבר ביצירת האמינו-אציל.)tRNA

67 67 אז למה צריך את הריבוזום? מי שעושה את הקישור בין החומצות אמינו הוא ה- trna, ולכאורה הריבוזום מיותר. מתברר שהתפקיד של הריבוזום הוא לשמור על מסגרת הקריאה. לולא הריבוזום, ה- trna היו נפגשים אקראית, לחלבון לא הייתה כיווניות, לא התחלה ולא סוף. בנוסף, הריבוזום מעמיד את שני ה- trna אחד בסמוך לשני, בקונפורמציה מאוד מסוימת, ומאפשר את היצירה של הקשר הפפטידי. הריבוזום הריבוזום הוא מאוד יעיל, הוא עושה טעות 1 ל חומצות אמינו. יש כ- 3.5 מיליון ריבוזומים בתא הומני. קצב האלונגציה הוא יחסית מהיר- 20 ח. אמינו לשנייה בחיידק, ו- 2 חומצות אמינו לשנייה באאוקריוטי. הריבוזום הוא בעצם.ribozyme הכוונה היא שהריבוזום בנוי בחלקו מ- RNA ובחלקו מחלבונים. יש לו תת יחידה גדולה וקטנה, ובשניהם, החלק האפור הוא RNA והחלקים הצבעוניים הם חלבונים. למעשה הוא 2/3 רנ"א )הוא נקרא )rrna ו- 1/3 חלבונים. כל ה- site active של הריבוזום הם.rRNA מבנה הריבוזום: פה מופיעים הריבוזום הבקטריאלי והריבוזום האאוקריוטי. שניהם מורכבים מתת יחידה גדולה וקטנה. הריבוזום הבקטריאלי נקרא 70S. ה- S מסמנת שיקוע, וזה קשור לצפיפות של המול' לא למשקל. התת יחידה הקטנה היא 30S והגדולה היא 50S. הריבוזום האאוקריוטי הוא 80S, התת יחידה הקטנה שלו הוא 40S והגדולה היא 60S.

68 68 כל תת יחידה כאמור בנויה מ- rrna ומחלבונים. הגודל של התת יחידות, מספר החלבונים בהן ושרשראות ה- RNA מפורטים באיור. ההבדל באאוקריוטים(. העיקרי בין הפרוקריוט לאאוקריוט הוא במספר שרשראות ה- RNA בתת יחידה הגדולה )2 בפרוקריוטים, 3 ה- rrna משועתקים על ידי DNA פולימרז 1, חוץ מה- 5S )שרשרת אחת של התת יחידה הגדולה- גם בפרוקריוטים וגם באאוקריוטים( שמשועתק על ידי פולימרז 3. כל ה- rrna משועתקים מאותו הלוקוס בגנום, הקרוי.RDNA יש כ- 400 עותקים של הרצף הזה בגנום. השעתוק והעיבוד של ה- rrna מתבצע בנוקלאולוס. שם גם מתרחשות כל מיני מודיפיקציות על ה- RNA וקיפולים, ו- assembly עם כל מיני חלבונים ליצירה של הריבוזום השלם. תהליך זה מערב הרבה חלבונים. לאחר מכן הוא נשלח לציטופלסמה. תהליך התרגום יש כמה שלבים, חלק משותפים לאאוקריוטים ופרוקריוטים. יש חלק ייחודי לאאוקריוטים, והוא שלב הסריקה. השלבים הם איניציאציה-אלונגציה-טרמינציה. בסיום התרגום הריבוזום עובר מחזור. בריבוזום יש שני active site עיקריים: אחד הוא ה- center,decoding שם נעשה הצימוד בין הקודון לאנטי קודון. הוא נמצא בחיבור בין תת היחידה הגדולה exit והקטנה. השני הוא,PTC-peptidyl transfer center שם נוצר הקשר הפפטידי. הפפטיד הנוצר עובר במנהרה שנקראת.tunnel ה- decoding סנטר מחולק ל- 3 עמדות. כל אחת מהן מותאמת מרחבית להחזיק trna )ולכן הריבוזום יכול לאכלס trna 3 בכל רגע(. בכל רגע נתון למעט איניציאציה, יהיה בהן.tRNA העמדה הראשונה- A היא העמדה בה מתבצע ה- decoding, שם יושב אציל-.tRNA העמדה השנייה P- שם עומד ה- trna מהשלב הקודם שמחזיק את השרשרת הפפטידית )פפטידיל- trna (. העמדה השלישית- E, זו עמדת ה- exit, ממנה יוצא ה- trna החופשי שהשתחרר.

69 69 שלב האלונגציה: שלב מאוד שמור בין בקטריות ואאוקריוטים. כדי להתקדם שלשה, הריבוזום הוא שנע ולא ה- mrna. תחילה ה- trna אציל יקשר לעמדה A. צריך שזה יהיה ה- trna הנכון, ויש מנגנונים שמוודאים שזה ה- trna הנכון. אז נוצר הקשר הפפטידי. בשלב זה, ה- trna שהיה בעמדת P יתנתק מהפפטיד )שלב 2 באיור(. שלב 3- כל הריבוזום יעשה טרנסלוקציה של שלושה בסיסים. קודם תנוע תת היחידה הגדולה, ותת היחידה הקטנה תבוא בעקבותיה. כתוצאה מתנועת התת יחידה הגדולה, אותו trna שהיה ב- P יעבור לעמדה E, ועמדה A תתפנה ל- trna חדש. עם התנועה של היחידה הקטנה, ה- trna בעמדה E יפול. *בפועל לא כל שלושת העמדות של ה- center decoding מאוישות בו זמנית. יש פערי זמן קצרים. לתהליך זה מסייעים פקטורי אלונגציה. הם מבקרים את האמינות והדיוק. אכיפת הדיוק הוא תהליך שצורך אנרגיה. פקטור ראשון: פקטור בקטריאלי- EF-Tu והאנלוג האאוקריוטי.eEF1 הוא אחראי להביא את ה- trna לעמדה A. יש לו פונקציה של.proofreading הוא מסוגל לוודא שהייתה הכרה נכונה בין הקודון והאנטי-קודון. לשם כך הוא עושה הידרוליזה של.GTP ה- EF-Tu קשור ל- GTP, והוא נקשר ל- trna באופן שממסך את החומצה האמינית שעליה. הוא לא מאפשר לה להיות חשופה להיווצרות הקשר הפפטידי לפני שיעשה את ההגהה. רק כאשר יהיה codon-anti-codon recognition מלא, ה- GTP יעבור הידרוליזה, ואז הפקטור ישתחרר מה- trna. ה- trna שבעמדה A הוא בקונפורמציה מושלמת עם ה- trna בעמדה P, וכך נוצר הקשר הפפטידי. נוסף. פקטור EF-Ts בבקטריות eef1b( באאוקריוטים( עושה שחלוף של ה- GDP חזרה ל- GTP כדי למחזר את הפקטור לשימוש פקטור שני: EF-G בבקטריות. )אנלוג באאוקריוטים.)eEF-2 הוא מאפשר את הטרנסלוקציה של הריבוזום בדיוק בשלושה בסיסים. גם תהליך זה תלוי אנרגיה. הטרנסלוקציה מתרחשת תוך הידרוליזה של.GTP אם כך, חיבור של חומצה אמינית אחת דורש ATP אחד ושני.GTP )ה- ATP הוא לטעינה של ה- trna בחומצה האמינית, וה- GTP הם לפעילות הפקטורים(.

70 70 תהליך האלונגציה זהה בין אאוקריוטים ופרוקריוטים. כיצד מתבצע ה- proofreading? זה על ידי ההכרה בין הקודון והאנטיקודון, והתת יחידה הקטנה של הריבוזום. רק אם יש צימוד נכון בין קודון לאנטי-קודון, ה- trna נמצא בפוזיציה מרחבית מסוימת שבה הוא יכול ליצור קשרים עם התת יחידה הקטנה של ה- rrna 16s (.)rrna ה- 16S יעשה קשרי מימן עם ה- trna וה- mrna. הצימוד בין התת יחידה של הריבוזום לשתי מולקולות ה- RNA היא שמאפשרת את ההידרוליזה של ה- GTP על פני הפקטור שעתוק. אם אין צימוד נכון, ה- EF-Tu לא יוכל להיכנס לאתר שאליו הוא צריך להגיע ולא יוכל לעשות הידרוליזה, וה- trna יצא החוצה. האתר הפעיל השני,,peptidyl transfer center הוא שנותן את הכיווניות בתרגום: המבנה המרחבי של הריבוזום מאפשר טרנסלוקציה רק בכיוון אחד- לכיוון ה-' 3 של ה- mrna. התזוזה של ה- trna מעמדה A לעמדה P יכולה להתבצע רק בכיוון אחד ואינה יכולה לחזור אחורה, ולכן הריבוזום אוכף כיווניות מ- 5' 3. ה- tunnel exit הוא תעלה בריבוזום בה עובר הפפטיד. זו מנהרה צרה, שבה יכולים להיות בו זמנית כ- 30 חומצות אמינו. התעלה בנויה ברובה מ- rrna )23S( ושני חלבונים ריבוזומלים )L22,L4(, שמשתתפים ביצירת התעלה )הם יושבים בקצה שלה ומצביעים עליה(. הדעה הרווחת היא שהתעלה מונעת קיפול של החלבון. האיניציאציה: ה- mrna הפרוקריוטי והאאוקריוטי מאוד שונים. בחיידקים ה- mrna הוא פוליציסטרוני- כלומר הוא מקודד ליותר מחלבון אחד. יהיו לו כמה מסגרות קריאה- כמה start קודון וכמה stop קודון. לרוב אין אינטרונים. יש לו מוטיב מסוים ברצף שנמצא 5 בסיסים upstream ל- start קודון, ואליו יודע להיקשר הריבוזום. הוא נקרא site) RBS (ribosome binding או.shine-delgrano-sequence הריבוזום נצמד אל ה- mrna בזכות צימוד בסיסים )בין התת יחידה הקטנה וה- RBS של ה- mrna (. באאוקריוטים אין את הרצף שמסמן לריבוזום איפה להיקשר. ה- recognition נעשה ישירות על ה- codon.start ה- mrna הוא לא פוליציסטרוני )לפחות בגדול. mrna יקודד לחלבון אחד לרוב(. בצד ה-' 3 יש את זנב הפוליA )זה קיים רק באאוקריוטים(. בצד ה-' 5 יש אזור של cap )כל מיני מודיפיקציות שיש על הקצה של ה- mrna (, ובינו לבין ה- start codon יש אזור שלא יעבור תרגום region) '5). UTR-untranslated זה קיים גם באזור ה-' 3, בין הפולי- A לחלק מסוים על ה- mrna '3(. UTR( UTR* קיימים גם בפרוקריוטים.

71 ה. 71 בפרוקריוטים ה- trna הראשון מקודד לפורמיל-מתיונין )מתיונין עם מודיפיקציה(. הוא נכנס ישירות לעמדה P של הריבוזום. לפרוקריוטים אין גרעין. תהליך השעתוק ותהליך התרגום הם מצומדים ויתרחשו במקביל. לכן, mrna שעוד לא סיים את השעתוק שלו כבר יתחיל תרגום. באאוקריוטים, לאחר השעתוק יש עיבוד נרחב של ה- mrna )הוספת ה- cap, זנב הפוליA, ספלייסינג( ואז הוא יוצא לציטופלסמה לתרגום. איניציאציה בפרוקריוטים דורשת בנוסף ל- trna האיניציאצור )של פורמיל מתיונין( שלושה פקטורים:.IF1, IF2, IF3 בשלב הראשון, ה- RBS מייצב את התת יחידה הקטנה של הריבוזום על ה- IF1, מגיע ביחד עם ה- 2 trna המתיונין-פורמיל בעזרת ה- IF3. mrna ונכנס ישירות לעמדה P. תפקיד ה- IF2 הוא להביא את ה- trna האיניציאצור, והוא גם אחראי על ה- fidelity. הוא מגיע עם ה- GTP, וברגע שיש הכרה בין הקודון לאנטי-קודון יש הידרוליזה של ה-,GTP ושלושת הפקטורים משתחררים. זה מאפשר לתת היחידה הגדולה להצטרף לתת היחידה הקטנה ולהתחיל את האלונגציה. כל הקומפלקס הזה נקרא pre-initiation complex כי יש בו את כל המרכיבים הדרושים לאיניציאציה. באאוקריוטים, הסיפור יותר מורכב. יש 27 פקטורי איניציאציה, נזכיר את החשובים ביניהם. האיניציאציה מתחילה ב- Cap '5. זה מבנה קריטי בשביל האיניציאציה של התרגום בציטופלסמה. כל שלבי האיניציאציה, למעט יוצאי דופן שנזכיר בהמשך, מתחילים ב- שנקשר אל ה- Cap,cap binding complex ה. mrna- לא מסתובבים ערומים בתא, הם קשורים לכל מיני חלבונים, שמגינים עליהם מפני דגרגציה. בעת התרגום, החלבונים האלו מוסרים. כדי שה- mrna לא יעבור דגרגציה הוא מתקפל, כך שהקצה הפולי A )ב- '3( גם נקשר אל ה- complex,cap binding ואז המולקולה היא מעגלית ומוגנת מדגרגציה. ב- complex cap binding יש כל מיני חלבונים. אחת המשפחות היא,eiF ויש לה כמה חלבונים: -הוא קושר את ה- cap. 4E 4G -הוא חלבון פיגום. 4A -הליקז שמאפשר את ה- scanning - תהליך ייחודי לאאוקריוטים. ההליקאז יכול לפרק ATP כדי לפתוח מבנים שניוניים. ה- complex cap binding מגייס את ה- complex.scanning בתהליך זה נעשית סריקה על פני ה- mrna במטרה למצוא את ה- codon.start ה- complex scanning )קרוי גם )pre-initiation complex מורכב מה- trna הראשון )עם המתיונין(, היחידה הקטנה )40S( וכל מיני פקטורי איניציאציה, בהם גם eif2a complex- scanning ינוע על פני ה- mrna, עד אשר

72 72 ימצא את ה- codon.start מי שנותן לו את הכוח לנוח הוא ה- 4A שתורם לו.ATP כשהקומפלקס ימצא ה- codon start )כלומר יהיה צימוד בסיסים בין התת יחידה הקטנה וה- mrna (, תהיה הידרוליזה של GTP מה- eif2, הוא יעזוב את ה- mrna ובמקומו תגיע התת יחידה הגדולה, ויתחיל תרגום. ה- codon start הוא קבוע.AUG קודוני AUG נמצאים באיזשהיא סביבה בה יש קונטקסט מועדף. לרוב שלושה בסיסים לפני ה- AUG יש A, בסבירות יותר נמוכה יהיה G. בעמדה מינוס 1, בסבירות גבוהה יהיה C. גם downstream אליו יש בסיסים מועדפים. רצף הקונטקסט נקרא.kosak sequence ה- UTR, גם בצד ה-' 5 וגם בצד ה-' 3 יכולים להיות מאוד ארוכים- מאוד ואלפי בסיסים. יש להם תפקיד חשוב בבקרה של התרגום. הם יכולים להכיל מידע ספציפי על שלבי בקרה פוסט תרגומיים, ועל מתי וכמה ה- mrna יתורגם. הטרמינציה: יש שלושה קודוני טרמינציה:.UUA, UAG, UGA טרמינציה בפרוקריוטים מורכבת משני שלבים-טרמינציה ומחזור. בשלב הטרמינציה, יפול הפוליפפטיד מהריבוזום. הוא מצריך פקטור factor) RF1 (release או RF2 )כל אחד מכיר סטופ קודונים אחרים(. הפקטורים הם חלבונים שיודעים להיכנס לעמדה A של הריבוזום )אף על פי שהם לא.)tRNA אז מתבצעת הידרוליזה של הקשר האסתרי בין הפפטיד לפפטידיל P. ריק בעמדה trna הפפטיד משתחרר ומקבלים,tRNA לאחר שהפפטיד שוחרר, תת היחידות של הריבוזום עוד קשורות זה לזו, וצריך למחזר אותן ואת ה- trna לשימוש נוסף. זה שלב המחזור. לשם כך מגיע.RF3 הוא משחרר את ה- RF1/2 )תלוי מי היה שם(, תוך הידרוליזה של.GTP אז יכנס פקטור נוסף,RRF הוא מביא את EF-G )עוד פקטור( ושניהם יחד מאפשרים את הדיסוציאציה של תת היחידה הגדולה, גם תוך הידרוליזה של.GTP אז מגיע פקטור נוסף,,IF3 שמשחרר את ה- trna החופשי. כך נותרת התת היחידה הקטנה בלבד, עדיין קשורה ל- mrna. מאחר וה- mrna הוא פוליציסטרוני, הריבוזום צריך להמשיך למסגרת הקריאה הבאה, ולכן התת יחידה הקטנה נשארת. )סה"כ, נוצלו שני GTP בשחרור IF1/2 ובשחרור התת יחידה הגדולה של הריבוזום(.

73 73 באאוקריוטים, הטרמינציה תכלול גם את השחרור של תת היחידה הקטנה. התהליך מורכב משלושה שלבים. )א( שלב ה- termination, בו משתחרר הפפטיד. שלב שנעזר בפקטור erf1 ו- erf3. הם גם דומים ל- trna, מכירים את הסטופ קודון, ונכנסים לעמדה A. ה- erf3 קשור ל- GTP, ועם ההכרה של הסטופ קודון יש הידרוליזה של ה- GTP. זה מקדם את שחרור השרשרת הפוליפפטידית מהפפטידיל.tRNA הקומפלקס שנותר כולל את ה- trna הריק, הריבוזום וה- erf3. )ב( שלב המחזור של התת יחידה הגדולה. תחילה יעזוב ה- erf3, ויגיע פקטור נוסף בשם,ABCE1 שיסייע במחזור תת היחידה הגדולה. לשם כך הוא יעשה הידרוליזה של.ATP אז שני הפקטורים יעזבו. נותרנו עם התת יחידה הקטנה, הקשורה ל- mrna וה- trna הריק )כמו בפרוקריוטים(. )ג( שלב מחזור התת יחידה הקטנה. אירוע של Re-initiation באאוקריוטים יכול להתרחש, אבל הוא נדיר. לרוב יהיה מחזור של התת יחידה הקטנה. יש שני מנגנונים בהם זה קורה בעזרת פקטורים או בעזרת חלבון ליאגטין. לא פורט יותר מזה. mrna ארוך יכול להיות מתורגם על ידי הרבה ריבוזומים בו זמנית. מבנה זה נקרא פוליזום. מאחר והריבוזום מתקדם לאורך השרשרת, לאחר ההכרה עם ה- codon start הוא יתקדם, ויוכל להגיע ריבוזום נוסף, ולהתחיל איניציאציה. כל ריבוזום יהיה בשלב אחר של התרגום )השרשרת המוקדמות יהיו קצרות, והשרשראות המאוחרות יהיו ארוכות(. בסוף יווצרו המון עותקים של החלבון מאותו transcript mrna אחד. יש שיטות לראות את זה בתנאי מעבדה. בונים גרדיאנט של סוכרוז )מ- 10% עד 50%( במבחנה, ומוסיפים לתוכה את כל ה- mrna הקיימים בתא. בצנטריפוגה מסרכזים את התמיסה במהירויות מאוד גבוהות. זה מאפשר ל- mrna השונים לשקוע בגרדיאנט, כפונקציה של המשקל שלהם והצפיפות שלהם.

74 74 מתורגם לא שוקע. כך ניתן להפריד בין כל ה- mrna שלא שמתורגם על ידי הרבה ריבוזומים שוקע יותר, ו- mrna mrna בתא על פי כמות הריבוזומים שמתרגמים אותם. לאחר השיקוע מעבירים את התמיסה בקורא.UV כל פעם עוברת דרך הקורא טיפה אחת של הנוזל. ה- UV אומר כמה RNA יש באותה הטיפה, וכאמור כל טיפה מייצגת תרגום על ידי מספר שונה של ריבוזומים. הפלט שיוצא מתאר כמה RNA עברו תרגום על ידי ריבוזום 1, כמה על ידי 2 וכן הלאה. דוגמא לפלט של ניסוי. היו שלוש קבוצות- קונטרול ו- 2 קבוצות ניסוי באדום וירוק שעברו סטרס של heat.shock הפיק הכי משאלי מייצג mrna שלא עברו תרגום )אלו הכי פחות שקעו בסוכרוז(. בשלושת הקבוצות, כמות ה- mrna שנוצרה ולא תורגמה דומה. הפיק השני הוא mrna שמתורגמים על ידי ריבוזום אחד. ניתן לראות שבקבוצות הסטרס הכמות של mrna שמתורגמים על ידי ריבוזום אחד עלתה משמעותית בהשוואה לקונטרול. אבל כמות ה- mrna שמתורגמים על ידי הרבה ריבוזומים קטנה מאוד )הפיקים הימניים(. המסקנה היא שהחום פוגע בתרגום. ההבדלים המבנים בין הריבוזום הפרוקריוטי והאאוקריוטי שניהם מבצעים את אותה הפונקציה, וראינו מעט הבדלים בשלבי האיניציאציה והטרמינציה. מאחר ויש הבדלים בין ה- mrna הפרוקריוטי והאאוקריוטי, יש הבדלים מבניים בין הריבוזומים הללו, וניתן לנצל את ההבדלים האלו ליצור ושימוש באנטיביוטיקה. אנטיביוטיקות רבות היום יודעות לתקוף את הריבוזום הפרוקריוטי ולא את האאוקריוטי. אריתרומיצין וטטרהציקלין הן אנטיביוטיקות ייחודיות לריבוזום הפרוקריוטי. הטטרהציקלין חוסמת את העמדה ה- A ולא מאפשרת ל- trna להיכנס. אריתרומיצין חוסמת את ה- tunnel exit ממנה יוצא הפוליפפטיד. יש אנטיביוטיקה אחרת שנכנסת לאתר ה- PBC וחוסמת את הטרנסלוקציה. באבולוציה של הריבוזום, השתנה מספר מולקולות ה- rrna בתת יחידה הגדולה, אורך השרשראות, ומספר וסוג החלבונים שמרכיבים כל תת יחידה. בין ריבוזום של שמר וריבוזום כאשר משווים פרוקריוטי מוצאים שיש הרבה משותף core(,)common וההבדל העיקרי הוא שנוספה עוד שרשרת rrna וחלבונים. כאשר משווים את הריבוזום השמרי לריבוזום ההומני, השוני העיקרי הוא כמות ה- rrna. השרשראות התארכו משמעותית. כמות החלבונים לא השתנתה כמעט מהשמר. הריבוזום של השמר דומה יותר לריבוזום החיידקי מאשר ההומני.

75 75 בקרת תרגום פרוקריוטים מנצלים את ה- delgarno shine לבקרה של התרגום. הוא עובר צימוד עם התת יחידה הקטנה, ומסמן לה שעוד כמה בסיסים מתחיל תרגום. יש שוני במידת החשיפה של הרצף בתנאים שונים. בתנאים מסוימים הוא מוסתר, והתרגום נמנע, ובתנאים אחרים הוא חשוף והתרגום יתבצע. יש כמה מנגנונים מוכרים לכך: יש פקטורים רפרסורים )חלבונים( שיודעים להיקשר אל ה- RBS, ומתחרים עם התת יחידה הקטנה על אתר הקשירה. קשירתם תמנע את התרגום..1.2 ה- RBS יכול להיות בכמה מבנים שניוניים, כתלות בטמפ', שחלקם יהיו אופטימלים לצימוד עם התת יחידה הקטנה וחלקם לא. זו תהיה בקרה נפוצה בחלבונים שמסייעים לחיידק להתמודד עם סביבות חמות proteins(.)heat shock שינוי במבנה השניוני של ה- RBS, אבל בעזרת מולקולות קטנות- כמו חומצות אמינו. קשירת המולקולה הקטנה תשנה את המבנה השניוני באופן שימנע את התרגום. זו בקרה שנפוצה בגנים שקשורים בתהליכי ביוסינתזה מסוימים. בדר"כ אחד מתוצרי השרשרת הוא שמונע את התרגום. דוגמא- גנים לייצור חומצת אמינו ליזין. כאשר ליזין נמצאת בסביבה, החיידק לא צריך לייצר אותה ולכן היא מעכבות את הביטוי. *זו דוגמא בה המול' הקטנה מנעה תרגום. זה יכול להיות גם להפך בקרה על ידי.small RNA יש מולקולות RNA לא מקודדות, בהן מולקולות קטנות שיודעות לעשות צימוד אל ה- RBS ולמנוע מהתת יחידה הקטנה להיקשר ומהתרגום להתחיל. ה- RNA הרגולטורי יתבטא בהתאם לתנאי סביבה, שמגדירים אם כעת צריך או לא צריך לתרגם את הגן שאותו מבקר ה- RNA הרגולטורי.

76 76 באאוקריוטים, הסיפור הרבה יותר מורכב. נתחיל בדוגמא של בקרה תחת תנאי סטרס. תא חשוף לסוגים שונים של סטרס- סטרס של רעב, סטרס אוקסיטטיבי, טמפ' קיצוניות ועוד. התגובה הראשונה של התא אל סטרס היא לעצור את כל התהליכים הלא נחוצים- גדילה, תרגום חלבונים ייעודיים של התא. מטרת התא היא להפעיל מנגנוני הצלה ואדפטציה שיאפשרו לו להתמודד עם לתנאי הסביבה החדשים. ה- hallmark של התגובה התאית לסטרס היא רפרסיה גלובלית של סינתזת חלבונים, והגברה סלקטיבית של תת קבוצה של mrna שרלוונטים להתמודדות עם הסטרס. עוד בשנות ה- 60 ראו את התופעה הזו במגוון אורגניזמים. למשל בדוגמא הבאה רואים שעם העלייה בטמפ', הזבוב מבטא פחות ופחות חלבונים. במקביל, מטמפ' מסוימת הייתה עלייה בביטוי של חלבונים ספציפיים )בהמשך גילו שאלו.)heat shock proteins זה חזר על עצמו בעכבר, תרנגול ואדם. תהליך עצירת התרגום הוא מהיר יותר מתהליך עצירת השעתוק, וגם יותר מהיר מדגרגציה של ה- mrna הקיימים. בתגובה לסטרס התא צריך להגיב באופן מיידי, ולכן נראה עצירה של התרגום. זה יתרחש במקביל להגברה של mrna ספציפיים שמיועדים להתגבר עם הסטרס הנוכחי. בקרות על שלב האיניציאציה: שלב איניציאציה יכול להיות מבוקר בצורה גלובלית דרך שני pathways עיקריים. הבקרה צריכה להתלבש על מנגנונים המשותפים לכל ה- mrna. תת יחידה של,eIF2 )הוא אחד קשור ל- eif2alpha. Pathway- זה הפקטור שמביא את ה- trna הראשוני ל- scanning.)complex מסלול זה מבוקר על ידי פוספורילציה. הבקרה היא על ידי עיכוב המחזור של.scanning complexes הפעילות של eif2aplha תלויה בהידרוליזה של.GTP רק לאחר קישורו ל- GTP הוא יכול להתחיל את ה- scanning. לאחר שהוא סיים את פעילותו צריך למחזר את ה- GDP כדי להיות זמין למסלול נוסף. eif2b הוא הפקטור שעושה לו את המחזור )עושה שחלוף ל- GTP (. ה- eif2alhpa יכול לעבור פוספורילציה באתר מסוים, וזה ימנע מה- eif2b למחזר אותו. במצבי סטרס, מהר מאוד יגמר ה- poll של ה- eif2alhpa שנמצאים קשורים ל-,GTP ואז לא תהיה אפשרות להתחיל איניציאציה. יתכן גם עיכוב על ה- eif2b כדי למנוע מחזור. eif2alhpa עובר פוספורילציה על ידי אחד מארבע קינזות, כל אחת משופעלת על ידי גורם סטרס אחר. PERK למשל מופעלת על ידי היפוקסיה וסטרס הקשור ל- ER. האחרים הם.HRI, PKR, GCN2

77 77 איך mrna מסוימים מצליחים "להימלט" מההשתקה כזו ולהגביר תרגום? זה מתווך על ידי אלמנטי ציס שנמצאים על ה- UTR '5. המנגנון נקרא frame).uorf (upstream open reading uorf הם מסגרות קריאה קצרות המקודדות לפפטידים קצרים )יש להם start וסטופ קודונים(, ונמצאות ב- 5'UTR של גנים. לעיתים הם קצרים ברמה של מספר חומצות אמינו בודדות. ה- uorf הם בעלי רצפים מקודדים, אבל קיומם של החלבונים שהם מייצרים מוטל בספק. ככל הנראה כן מסונתז מהם פפטיד קצר, אבל לא ברור אם יש לו פונקציה ואם אורך החיים שלו מספיק ארוך כדי לתפקד בתא. היום רק יודעים שהפפטידים האלו קיימים, ושהם מצלחים לגייס ריבוזומים שעושים תרגום. הגילוי של המנגנון החל מגן GCN4 בשמר. זה גן שמתבטא רק בתנאים של מחסור בחומצות אמינו בסביבה. לגן הזה יש 4 מקטעי uorf ברצף ה- 5'UTR. בתנאים רגילים, ה- initiation של ה- uorf start נעצר על ארבעת ה- codons complex הראשונים ומתרגם את אותם לפפטידים קצרים, וזה בזכות היכולת לעשות רה-איניציאציה. אולם כאשר הוא מגיע ל- start codon של הגן,GCN4 כבר אין מספיק פקטור איניציאציה eif2alpha שקשור ל- GTP פנוי, כדי להתחיל שם גם איניציאציה. זאת כי מנגנון המחזור של הקומפלקס איניציאציה לא מספיק מהיר כדי לאפשר את זה. בתנאים של מחסור בחומצות אמינו, מתחילה איניציאציה על ה- uorf הראשון )יש מספיק eif2 פעיל לעשות זאת(, והתת יחידה של הריבוזום ממשיכה לרה-איניציאציה. אבל אחוזי ה- eif2alpha הפעיל מאוד נמוכים, בגלל שהוא עבר פוספורילציה, ולכן הוא לא מספיק להתגייס כדי להגיע לרה-איניציאציה של ה- uorfs הבאים. עם ההתקדמות של קומפלקס האיניציאציה, ה- eif2alpha מספיק לעבור מחזור בדיוק בזמן להגיע לתחילת מסגרת קריאה של הגן CNG4 ולהתחיל רה- איניציאציה בגן. בעצם המרחק בין ה- uorf הראשון וה- codon start המדויק הזה של הפעלת מנגנון המחזור. הראשון הוא מאוד מדויק, כך שיאפשר את התזמון גן אנלוגי ביונקים הוא.ATF4 המנגנון פה הוא די דומה. לגן הזה יש שני uorf ב- 5'UTR. אחד הוא מאוד קצר ונמצא בתחילת ה- 5'UTR. השני הוא קצת יותר ארוך והוא חופף את ה- start קודון של החלבון. כאשר יתחיל תרגום על פני ה- uorf השני, זה יפריע לתרגום של הגן. בתנאים נורמליים, כשיש מספיק ממנו פפטיד קצר מאוד. התת יחידה הקטנה של הריבוזום תמשיך לרה- איניציאציה ותקשור eif2alpha חדש, באזור ה- uorf eif2alpha אקטיבי וזמין, הוא יתחיל ב- uorf הראשון ויתרגם השני. זה לא יאפשר את האיניציאציה של הגן,ATF4 והוא לא יתורגם. בעצם בגלל שמנגנון האיניציאציה כל כך יעיל, התרגום של הגן לא מתרחש. בסטרס, מתרחש דבר דומה למה שראינו בשמר. eif2alpha עובר פוספורילציה. בתנאים אלו, יש מספיק eif2alpha פעיל כדי להתחיל איניציאציה ב- uorf הראשון, אבל לא מספיק לרה-איניציאציה של ה- uorf השני. אבל המרחק בין ה- uorf הראשון ומסגרת קריאה של הגן ATF4 כן מספיק גדול כדי לאפשר למנגנון המחזור של eif2alpha לפעול.

78 78 כשחיפשו היכן בגנום יש uorf בתוך ה- 5'UTR מצאו שזה מאוד נפוץ. הגילוי שלהם הוא יחסית חדש, והתאפשר על ידי השיטות של ה- sequencing,next generation שמאפשר לרצף גם.RNA לפני מספר שנים יצאה שיטה חדשה המאפשרת לדעת איזה RNA מתורגמים בתא, ואיפה יושב ריבוזום ומתרגם בכל רגע נתון. באאוקריוטים יש המון בקרת תרגום. העובדה ש- mrna מסתובב בתא לא אומרת כי הוא יתורגם. אותה השיטה תאפשר לנו לדעת ברזולוציה יותר גבוהה מי מה- mrna יתורגם, ולעזור לנו לגלות כל מיני בקרות על התרגום. השיטה נקראת.ribosome footprint profiling היא נסמכת על ה- NGS, ועל כך שכאשר ריבוזום מתרגם, הוא מגן על אזור הקריאה מכל הפרעה חיצונית, כמו למשל טיפול ב- RNAase. RNAase מעכל כל RNA חופשי שיש בתא, שאינו מוגן על ידי חלבונים. הריבוזום מגן על כ- 30 בסיסים, שבמרכז שלהם נמצא הקודון שכעת מתורגם. לכן הוספה של RNAase לתוך תמצית של תא, תשאיר רק את האזורים ב- RNA שעברו תרגום באותה נקודת זמן. מפ תחי השיטה ניצלו את העובדה הזו כדי לגלות מהי אותו footprint שכעת מוגן על ידי הריבוזום, וכך לדעת מה התא מתרגם כרגע, באותו סוג תא, במצב של steady state ובעקבות חשיפה לכל מיני גורמים סביבתיים שונים. ניתן ליצור ספרייה על ה- footprints האלו, ולדעת כמה ריבוזומים תרגמו כל קודון בחלבון. יש פה מידע על כמות התרגום )מספר ממוצע של ריבוזום על כל )mrna ומיקום התרגום על פני ה-.mRNA בזכות הטכנולוגיות האלו אפשר לשאול שאלות חדשות על בקרות של תרגום, ולדעת אם ה- uorf מתורגמים על ידי ריבוזומים. לקחו תאי גזע של עכברים והסתכלו על הריבוזום באזור של.ATF4 ראו כי יש הרבה ריבוזומים שמתרגמים את ה- uorf הראשון ואחוז נמוך של ריבוזומים המתרגמים את ה- uorf השני, וכמעט שום ריבוזומים המתרגמים את ה- ATF4. סיווגו את ה- uorf שמתורגמים, ומצאו שיש המון מהם. עוד לא ברור לגמרי מה הבקרה שהם עושים כפוליפפטידים. Pathway- שני נקרא.MTOR הוא שולט על ה- complex,cap binding וישירות על ה- 4E שנקשר אל ה- cap עצמו. המנגנון הזה נסמך על רגולטור ישיר של eif4e שנקרא.4E-BP כאשר אותו חלבון נקשר אל ה- 4E, הוא מונע ממנו לקשור את ה- יעבור פוספורילציה הוא לא יקשר אל ה- 4E ואין איניציאציה. אם ה- 4E-BP cap ותוגבר האיניציאציה. במצבים של עקה- חוסר בגלוקוז או חוסר חומצות אמינו, ה- 4E-BP יהיה לא מזורחן, ותהיה רמה נמוכה של איניציאציה. מי שעושה את הפוספורילציה של ה- E4-BP הוא קינז.MTOR הוא יושתק במצבי סטרס.

79 79 מנגנון עוקף למסלול הזה:.IRES-internal ribosome entry site מדובר במבניים שניוניים מורכבים, שנמצאים upstream ל- start קודון, ויכולים לעקוף את ה- MTOR כי הם יודעים להביא לגיוס של ה- scanning קומפלקס, מבלי צורך ב- complex.cap binding הם יכולים לגייס את ה- complex scanning באופן ישיר, או לגייס פקטורים אחרים,ITAF שיגייסו את הקומפלקס סריקה. ה- IRES התגלו לראשונה בוירוסים. לוירוס יש מטרה לחדור לתא המאכסן ולהתרבות. המידע הגנטי שלו הוא.RNA ל- RNA אין cap והוא לא מסוגל לגייס את ה- complex,cap binding ועם זאת הוא מסוגל להיות מתורגם בתא המאכסן. זאת כי הוא מצליח לגייס את ה- IRES כדי לעבור איניציאציה. בהמשך ראו את המנגנונים האלו גם בגנים אנדוגנים באאוקריוטים. היעילות והתחכום של אותם המנגנונים האנדוגנים לא מגיעה לזו של ה- RNA הויראלי, אבל כן מצאו שהם מסוגלים לעבור איניציאציה בתנאים בהם יש רפרסיה לתרגום שזקוק ל- cap. בקרה על אלונגציה: אחד הנקודות בהם יכולה להיות בקרה היא על ידי פוספורילציה של פקטור האלונגציה.eEF2 קינז שמזרחן אותו גורם לו להיקשר ביעילות פחותה לריבוזום. ה- eef2 עובר אקטיבציה ורפרסיה על ידי מגוון רחב של מצבים פיסיולוגים. הקינז מאוקטב במצבים של סטרס, ועובר דיכוי כאשר יש מספיק נוטריינטים בסביבה )ואז רוצים הרבה אלונגציה( ובנוכחות של פקטורי גדילה. בקרה נוספת ברמת האלונגציה היא שינוי הזמינות של trna לקודונים מסוימים. כאשר יש חלבון שמקודד רק על ידי trna מסוימים )הכחולים(, הוא יתורגם בקצב גבוה בתאים שבהם יש הרבה trna כחולים. לעומת זאת, חלבון שמקודד רק על ידי trna אדומים, יתורגם בקצב איטי באותו התא. כך בקרה על כמות ה- trna הזמינים מסוג מסוים יכולה להאט אלונגציה של גנים. כך למשל בתנאים שהתא ירצה פרוליפרציה, הוא ידאג לזמינות גבוהה של trna שנחוצים לתרגום גנים של פרוליפרציה, ומצד שני זמינות נמוכה של trna הנחוצים לתרגום גנים של דיפרנציאציה. ולהפך בתנאים בהם התא ירצה דיפרנציאציה ולא פרוליפרציה. ראינו את הניסוי שהראה כי יש רפרסיה של mrna עקב,heatshock למעט mrna ספציפיים שעוזרים להתמודד עם המצב. כדי לדעת מיהם ה- mrna שעולים ומיהם ה- mrna שיורדים, השתמשו ב- profiling.ribosome footprint בפלט עשו alignment לפי ה- start קודון לכל ה- mrna שכן תורגמו, ובדקו את ריכוז הריבוזומים לאורך ה-.transcript בתנאי קונטרול יש יותר ריבוזומים בהתחלה, ואז יש התפלגות שווה של הריבוזום על פני ה- mrna. בעקבות heat shock חמור ראו הצטברות של ריבוזומים בתחילת מסגרת הקריאה, ואחרי כ- 60 חומצות אמינו יש ירידה ומיעוט יחסי של ריבוזומים. זה מעיד על עצירה של האלונגציה. מדוע האלונגציה נעצרת אחרי 60 ח.אמינו? בדר"כ יש צ'פרון שנמצא על הריבוזום ומחזיק את הפפטיד שיוצא

80 ש, 80 החוצה מה- tunnel.exit בתנאים של,heat shock הצ'פרון לא קיים ולכן הריבוזום נתקע. כנראה זה מנגנון בקרה רחב בזמן סטרס, כי הוא קיים בתגובה לעוד סוגים של סטרס. מנגנוני בקרה ב- UTR '3: microrna הם מולקולות RNA מאוד קטנות, בעלות תפקיד רגולטורי. יש להם תפקיד מרכזי בהשתקת גנים. המיקרו RNA מקודדים על ידי גנים עצמאיים )יש כמה מאות או אלפים של גנים כאלו בגנום הומני(, שיכולים להימצא באזורים אינטרגנים או באינטרונים של גנים אחרים. המולקולה משועתקת תחילה כמולקולה ארוכה של כ- 70 בסיסים,)pri-miRNA( אבל אז היא עוברת עיבוד בגרעין. העיבוד יוצר מבני שניוני מיוחד של stem loop באורך של כ בסיסים, שמחובר עדיין למולק' ארוכה. יש machinery של עיבוד שנקרא drosha מזהה את אותו מבנה שניוני וגוזר את ה- pri-mirna ל-- pre,mirna שכולל רק את המבנה של הloop,stem כלומר הוציאו את שאר הרצפים שלא שייכים ללופ. אותו מבנה הוא עדיין דו גדילי. הוא יוצא אל הציטופלסמה. שם אנזים DICERI גוזר את הלופ, מפריד את הגדילים ויוצר את ה- mirna,mature שהוא חד גדילי. ה- mirna mature הוא שעושה את ההשתקה של הגנים. זו מולקולה חד גדילית, באורך בסיסים. בציטופלסמה היא קשורה על ידי complex) RISC (RNA induced silencing קומפלקס, כדי שלא תעוכל. ככל הנראה, המיקרו RNA מחפשת mrna שאיתם תוכל לעשות צימוד בסיסים, ומי שעושה את ההשתקה זה ה- RISC שקשור אליה. ביונקים, מצאו כי המיקרו RNA נוטה להיקשר לבסיסים ב- 3'UTR, והצימוד גורם להשתקה של הגן. צימוד הבסיסים בין המיקרו RNA ל- mrna יכול להיות מלא או חלקי. אם הצימוד הוא חלקי, התרגום יעצר. אם ההתאמה היא מלאה, תהיה דגרגציה של ה- mrna על ידי חיתוך שלו. ההתאמה המלאה קיימת רק בצמחים ולא ביונקים. בהתאמה חלקית, מצאו כמה מנגנוני השתקה שכנראה נעשים על ידי מיקרו RNA והקומפלקס :RISC גיוס של הפקטור AGO שחותך את ה- mrna. גיוס של דה-אדנילזות, שמורידות את זנב הפולי- A וכך ה-.1.2 mrna יותר נגיש לפירוק. 3. עיכוב איניציאציה-העובדה שה- RNA יכול להתקפל, מאפשרת לאזורים מה-' 3 להיות קרובים פיסית לאזורים של האיניציאציה, והמיקרו RNA מונעים איניציאציה. יצירה של pre-mature termination של ה- mrna. גיוס של,P-bodies שמונע מהריבוזום לגשת ל- mrna..4.5 לא ידוע מיהו המנגנון העיקרי שמשחק תפקיד בהשתקה של תרגום.

81 81 שינויים פוסט תרגומיים הגנום האנושי מכיל בין גנים שמקודדים לחלבונים. אם לוקחים בחשבון את מנגנון ה- splicing זה מגדיל את מגוון החלבונים הקיימים מאותם גנים. ניתן להגיע בעזרת ספלייסינג עד 100,000 מולקולות mrna שונות. ברמת הפרוטאום, יש גם שינויים לאחר התרגום, שמגדיל עוד יותר את מגוון החלבונים. דוגמא נפוצה היא פוספורילציה של חלבון, שמשנה את הפונקציה שלו, או את מיקומו בתוך התא. מבחינה מספרית, מדובר על יותר ממיליון חלבונים שונים בתא. כל החלבונים מתחילים בחומצה אמינית מתיונין, בקצה ה- N טרמינלי. בשיטות המסתמכות על סימונים של חלבון באופן רדיואקטיבי, נהוג לבחור במתיונין, כי יודעים בוודאות שהיא תופיע בכל חלבון. קבוצות הצד של חומצות האמינו, הקצה ה- N טרמינלי וקצה ה- C טרמינלי של החלבון, הם אתרי המטרה למודיפיקציות פוסט תרגום. דוגמאות למודיפיקציות פוסט תרגומיות: אצטילציה, מתילציה, יוביקוויטינציה, פוספורילציה, הוספת סוכר, הוספת ליפיד, ביקוע פרוטאוליטי. מודיפיקציות אלו מתרחשות בכל מקום- במיטוכונדריה, ב- ER, בגולג'י, במרווח הבין תאי. לכל אברון יהיו אנזימים שיהיו רלוונטים למודיפיקציות שצריכות להתרחש בו. כל חלבון יכול לעבור הרבה מאוד מודיפיקציות שונות. קיים קוד קומבינטורי של מגוון המודיפיקציות, שיכול להשיג תגובה מאוד ספציפית ומורכבת. בסוף ההשפעה העיקרית של מודיפיקציות היא שינוי מטען החלבון, וזה משפיע על האינטראקציות שלו עם מולקולות אחרות. שינוי האינטראקציה של חלבון עם מולקולות אחרות, יכולה לגרור שינויים במיקום חלבון, בקשירה של חלבון לחלבון אחר )שינוי האפיניות ביניהם(, בפעילות שלו, בזיהוי שלו על ידי מערכות דגרגציה. דוגמא היא חלבון p53. הוא חלבון שעובר המון שינויים פוסט תרגומים, שמשפיעים על התפקוד שלו בתוך התא. הוא רגולטור של שעתוק. פוספורילציה חלבון יכול להתקיים במצב פעיל ולא פעיל בתא. בהרבה מקרים, ההפעלה של החלבון נעשית על ידי פוספורילציה בעזרת קינזה. קינז מפרק ATP ל- ADP, ואת הפוספט הזה הוא מעמיס על החלבון. זרחון לרוב לא מתרחש באופן ספונטני, צריך שיהיה סיגנל תאי כדי שהוא יתרחש. דה- פוספורילציה לעומת זאת, לא דורשת אנרגיה. היא תתרחש כאשר הסיגנל שהורה על פוספורילציה יעלם. קבוצת הפוספריל טעונה שלילית באופן חזק. במולקולות,ATP יש שלוש קבוצות פוספוריל. הקשר בין כל קבוצת פוספריל גבוה באנרגיה. קינזה שוברת את הקשר עם הפוספריל הכי קיצוני- פוספט גמא, ומדביקה אותו על החלבון שעובר זרחון. המולקולה שנותרה- ADP היא עם שתי קבוצות פוספריל, והיא יכולה לתרום אחד מהם ולהפוך ל- AMP. זרחון יכול לגרום לאקטיבציה של חלבון או לדה-אקטיבציה שלו. כ- 30% מהחלבונים עוברים מודיפיקציה של פוספורילציה. בגנום יש לפחות 518 חלבונים שפועלים כקינזות. קרוב למחצית מהם קשורים במחלות אנושיות. לפחות 100 מהן אונקוגנים.

82 82 בשנות ה- 50 התגלה מנגנון הפוספורילציה. ברנט וקנדי זיהו שאם לוקחים תאים סרטניים ושמים אותם במצע עשיר פוספט, יש turnover מהיר של הפוספט- הוא נכנס ויוצא במהירות מהתאים. הם זיהו שיש אנזים קינז שיודע לקחת ATP ולהדביק את הפוספט על מולקולה אחרת. המערכת הראשונה בה התגלה תפקיד הזרחון היא הגליקוגן בכבד. אנזים בשם גליקוגן פוספורילז מקטלז קשר 1-4 במולקולת גליקוגן ומשחרר גלוקוז מתוך הגליקוגן. קרבס ופישר גילו שכאשר אותו אנזים מזורחן, הוא פעיל, וכאשר הוא לא מזורחן הוא לא פעיל. הזרחון והדה-זרחון שלו מתבצע בקסקדה של תהליכים. תחת תנאים של סטרס מופרש אדרנלין, הוא מעלה בתא את רמות ה- camp. הוא נקשר ליחידה רגולטורית של קינז בשם camp-dependent,protein kinase )ידוע גם כ- PKA ( ומפעיל אותו. הוא מזרחן קינז אחר בשם פוספורילז קינז, אשר מזרחן בתורו את הגליקוגן פוספורילז. והתוצאה היא עלייה ברמת הגלוקוז. ידועים קרוב למיליון אתרים על חלבונים שמסוגלים לעבור זרחון. בפועל זרחון נצפה על כ- 170,000 חלבונים. מתוך כל הפוספורילציות שנצפו בפועל, כ- 50% היו על סרין, כ- 23% על טריאונין, וכ- 20% על טירוזין. מבין מודיפיקציות הזרחון שחקרו, הרוב עושים אקטיבציה )בערך פי 4 מאשר דה-אקטיבציה(. מה שמיוחד בפוספורילציה על פני מודיפיקציות אחרות הוא שזו המודיפיקציה היחידה שדורשת אנרגיה. ברמה ההוליסטית, התא צריך שזה ישתלם לו לבצע את המודיפיקציה הזו, ולכן זה יקרה בתהליכים שהתא מאוד זקוק להם. זה גם עוד סיבה מדוע פוספורילציה היא תהליך כל כך מבוקר- כדי שאנרגיה לא תבזבז סתם. סוגים של קינזות: חלוקה אחת היא על פי חומצת האמינו שעוברת זרחון. -סרין-טריאונין קינזות. מרביתם הם אנזימים שנמצאים בתא. מיעוט הם קולטנים, שבחלק התוך תאי יש להם פעילות של קינז. דוגמאות:.PCK, Rho -טירוזין קינזות, שמרביתם הם רצפטורים. נקראים גם.RTK *פסואודו-קינזות. במבנה שלהם הם נראים כקינזות, אבל הם לא פעילים כקינזות. הפונקציה שלהם עוד לא ידועה. מבחינה אבולוציונית ניתן לחלק אותם לקבוצות נוספות, כפי שנראה באיור.

83 83 לכל הקינזות, ללא יוצא מן הכלל, יש דומיין שעושה את הפעילות הקטליטית. דומיינים אחרים משתנים בין קינזות, אפילו בתוך אותה משפחה. כיצד מתבצע זרחון? זו דוגמה מהקינז ERK )קרוי גם MAP קינז(. היא רלוונטית כמעט לכל הקינזות..ADP לקינז יש אתר שקושר את ה- ATP ואתר הקושר את הסובסטרט- ה- domain.docking כאשר חלבון הסובסטרט מעוגן באתר הקשירה, נוצר שינוי קונפורמציה בקינז, וכעת האתר הקטליטי מאוד מותאם לאזור שצריך לעבור זרחון בסובסטרט. הזרחון יתבצע על ידי ההידרוליזה של ה- ATP, והקינז שוב ישנה את הקונפורמציה שלו- מה שישחרר את הסובסטרט וה- מבחינה מולקולרית: על פני הקינז יש שני חלקים: N-lobe ו- C-lobe. בין שתי היחידות האלו יושב ה- ATP. הם מחוברים על ידי.p-loop הצורה של ה- loop p יכולה לשנות את המפתח בין שני החלקים של הקינז. על פני ה- lobe C נמצא ה- activation.segment זה אזור רגולטורי של הקינז, שיכול לעבור פוספורילציה על ידי קינזות אחרות )כתוצאה מהימצאות של סיגנל(. כמו כן יש אזור שיודע לקשור את הסובסטרט-.substrate binding domain אם יתרחשו שני דברים- גם יקשר סובסטרט, וגם הקינז יהיה מזורחן באתר הרגולטורי, הקינז יעבור שינוי קונפורמציה: שרשרת הליקס בשם αc helix שנמצאת על ה- N lobe תזוז, ה- loop p יתקפל, ושתי תתי היחידות יתקרבו זו לזו )ה- N וה- C (. זה יצור אתר קטליטי שיכול לעשות בצורה מיטבית את ההידרוליזה של ה- ATP ולהדביק את הפוספט על הסובסטרט. לאחר ההידרוליזה, יש שינוי קונפורמציה של הקינז, הסובסטרט וה- ADP משתחררים, והקינז שוב פתוח. אל ה- helix Cα שזז עם שינוי הקונפורמציה של הקינז קשור קו פקטור מגנזיום. הוא נחוץ לפעילות הקטליטית, ובעת התנועה של ההליקס הוא מתקרב בדיוק למקום שהוא צריך להיות באתר הקטליטי.

84 84 לכל קינז יש העדפה לפפטידים מסוימים. הפפטידים שהוא יזרחן הם כאלו שנושאים מוטיב קונצנזוס- חומצות אמיניות ברצף מסוים. הקינז יוכל לזרחן יותר מסובסטרט אחד, בתנאי שיש לו את המוטיב קונצנזוס. כך למשל, קינז ERK יזרחן רק סירין או טריאונין ששתי חומצות אמינו לפניהם יש פרולין, וגם מיד אחריהם יש פרולין. זה יהיה רצף שיתאים באופן הטוב ביותר לאתר הקטליטי. יש קינזות שונות שיש להם העדפה לאותו סובסטרט. כלומר אותו חלבון יזורחן יותר מפעם אחת, על ידי יותר מקינזה אחת. בעזרת התכונות האלו אפשר להשיג בקרה על קינזות. דוגמא: יש לקינז הזה שני סובסטרטים- A ו- B. כאשר בוחנים את כמות הפוספורילציה שלו על כל אחד מהם בנפרד )במבחנות נפרדות(, רואים ש- A הוא הסובסטרט המועדף על פני אותה קינזה. כאשר שמים את שני הסובסטרטים יחד, הם מתחרים זה בזה, ואז הפער ביניהם גדל עוד יותר. דוגמא נוספת- אותו הסובסטרט מזורחן על ידי שני קינזות, אבל הזרחון השני תלוי בכך שיתרחש הזרחון הראשון. דוגמא נוספת- משוב חיובי- קינז שעובר פוספורילציה על ידי קינז אחר )וזה שפעל אותו(, מזרז זרחון של עוד קינזות מסוגו. שיטות לזיהוי פוספורילציה: -שיטות ביוכימיות: חלבון שעובר פוספורילציה לרוב יותר כבד )משקל מולקולרי משתנה(, ולכן בהרצה בג'ל המפריד על פי משקל, הוא ירוץ קצת פחות. -כדי לזהות בדיוק מיהי החומצה האמינית שעברה זרחון, אפשר לעשות מוטציה נקודתית ולהחליף את החומצה האמינית שיכולה לעבור זרחון בחומצה אמינית שלא יכולה לעבור חמצון, ולראות אם עקב המוטציה, הפוספורילציה של החלבון בוטלה. אם כן, אז זו החומצה שעוברת זרחון. אם לא, אז זו חומצה אחרת, וצריך להמשיך לסקור עם עוד מוטציות. -אפשר גם לעשות מוטציה נקודתית שתחקה את הפוספורילציה )הוספת מטען שלילי(.

85 85 -שיטות אימונולוגיות: אפשר להשתמש בשיטות של נוגדנים, שיהיו ספציפיים רק לחלבונים שעברו זרחון. השיטה הראשונה שפותחה השתמשה ב-.anti-phosphotyrosine antibodies זה נוגדן שמכיר רק טירוזין שעבר זרחון, והוא יהיה רלוונטי להרבה חלבונים )כל חלבון בו יש טירוזין שעובר זרחון(. בהמשך ניסו לסנתז נוגדנים שיהיו יותר ספציפיים- שידעו לזהות זרחון על חלבון ספציפי, ולא כל חלבון שעובר זרחון על טירוזין. היום יש נוגדנים שיודעים לעשות את זה, למשל עבור החלבון p53 הכינו נוגדן שמזהה רק סירין בעמדה 15 שעבר זרחון. זה מרקר מאוד חשוב. איך מייצרים את הנוגדן הזה? מכינים את חלבון הסובסטרט במעבדה באופן מזורחן, ומחדירים אותו לתוך עכבר בעזרת וירוס. מערכת החיסון של העכבר תייצר נוגדנים עבור אותו הפפטיד המזורחן, וניתן למצות אותם מהסרום. כאשר מוציאים את הסרום, הוא מכיל כל מיני נוגדנים שהעכבר ייצר, ולכן צריך לנקות אותו ולהישאר רק עם הנוגדן שמעניין אותנו. לשם כך משתמשים בקולונה שעליה נמצא הפפטיד המזורחן. מעבירים את הסרום בקולונה, ורק הנוגדן שאנחנו מעוניינים בו יקשר לקולונה, כל השאר ישטפו. בהמשך נפריד את הפפטיד מהנוגדן. את הטכניקה הזו אפשר לעשות לכל חלבון שעולה על דעתנו. ב- array antibody אפשר לשים על פני סלייד המון נוגדנים בבת אחת, שכל אחת מזהה זרחון אחר )או באותו החלבון, או בחלבונים שונים(. אפשר להדגיר את התמצית על אותו הסלייד, וכך לבדוק בבת אחת המון חלבונים והמון פוספורילציות. פה נתונות שתי דוגמאות, האחת עברה טיפול והשנייה לא. יש להם דפוס פוספורילציה שונה. -הרצת ג'ל דו מימדי, בהפרדה על פי גודל ומטען, שתאפשר הפרדה טובה בין כל חומצות האמינו, ואז שימוש בנוגדנים ספציפיים שיגידו איפה היו חומצות אמינו שעברו זרחון. spectrometry- -mass זרחון של חומצה אמינית אחת משנה את המשקל המולקולרי של החלבון, וה- MS מאוד רגיש לשינויים האלו. בפלט הבא, הפיק הראשון הוא ללא זרחון, הפיק השני הוא זרחון 1, הפיק השלישי הוא 3 זרחונים. ב- MS אפשר לבדוק בבת אחת המון חלבונים ולקבל מפות שנותנות תמונה כללית של כלל הזרחונים בתא.

86 86 מסלולים חשובים בהם מעורבות קינזות: העברת אותות- למשל בנדידה של תא: ישנו גירוי בסביבה שמסמן שכדאי שהתא ינדוד. לתא יש קולטנים על פני הממברנה שקולטים את הסיגנל הזה, ועקב הקשירה של הליגנד אל הקולטן, יש שרשרת של תהליכים שבסופם יהיה שינוי בפעילות של חלבונים קיימים )נניח תנועה של המיקרוטובולין(, ושינוי בביטוי גנים שנחוץ לנדידה. השליחים השניוניים מתרגמים את הסיגנל החיצוני לפעילות בתא. רבים מהשליחים השניוניים עובדים על פוספורילציה. נתאר סכמה אחת כללית )יש גם סכמות אחרות(: הרצפטור עומד בתא במצב חופשי, בלי חלבונים שקשורים עליו. עם הקשירה של הליגנד, הרצפטור עובר זרחון )לרוב על ידי רצפטור חבר בשם טירוזין קינז או על ידי עצמו באוטופוספורילציה(. לאחר הזרחון הוא מזוהה על ידי כל מיני חלבונים שניוניים שמזהים אותו רק במצב המזורחן proteins(.)docking על פני אותם חלבונים נקשרים כל מיני חלבונים אחרים: חלבוני פיגום, חלבוני adaptors )חלבון שנחוץ כדי להחזיק חלבונים אחרים(. הרבה מהקישורים בין החלבונים אלו מתאפשר על ידי פוספורילציות-גם פוספורילציות של חלבונים וגם פוספורילציות של שומנים )נניח החלבון הירוק SOS נקשר לממברנה בעזרת פוספטידיל- אינוזיטול מזורחן- PI3 (. טירוזין קינז רצפטור- :RTK ה- RTK הם משפחה מאוד גדולה של רצפטורים, שבכולם החלק התוך תאי די דומה )אך לא זהה(, וההבדלים הם בעיקר בחלק האקסטראצלולרי, כי כל אחד מזהה ליגנד אחר. לכולם יש באזור התוך תאי,tyrosine kinase domain שעושה את הפוספורילציה. זו יכולה להיות פוספורילציה על פני רצפטור אחר סמוך או אוטופוספורילציה. דוגמאות לרצפטורים מהמשפחה )ציין שצריך לדעת את הפרטים של הטבלה(:

87 87 דוגמא לגבי האינסולין רצפטור: הוא עובר כדימר. במידה והליגנד מפעיל את שני הקולטנים, הם עוברים דימריזציה, ואז עושים פוספורילציה זה על זה ואחד על השני.trans-auto-phosphorylation כתוצאה מהפוספורילציה, הרצפטורים יקשרו אליהם אדפטורים, שמזהים אותם רק במצבם המזורחן. ההכרה על ידי אדפטורים מתאפשרת על ידי דומיינים שיש להם, המזהים מודיפיקציות שונות. למשל דומיין SH2 מזהה פוספוטירוזין. אדפטור עם SH2 ידע להיקשר לכל חלבון בו יש טירוזין מזורחן. אותם אדפטורים יעבירו את הסיגנל הלאה בתא. דוגמא לגבי factor) :EGF (epidermal growth הורמון מאוד חשוב לפרוליפרציה של תאים. הקולטן אליו הוא בעל חלק אקסטרצלולרי מקופל. גם הוא עובר דימריזציה עם הקשירה של הליגנד לרצפטור. זה מוביל לשינוי בחלק הפנימי של הקולטנים- וכתוצאה מהם אחד )האקטיבטור( דוחף את השני )ה- receiver (, ושניהם מזורחנים בקצה ב- C טרמינלי ויכולים לקשור חלבוני אדפטור. דוגמא לגבי הורמון גדילה: גם אקטיבציה בצורה של דימר. עם הקשירה של הליגנד ברצפטור, הרצפטור יעבור זרחון ויוכל לקשור אדפטור GRB בעל SH2 דומיין. הוא יקשור אדפטור SOS שיקשור.RAS ה- RAS הוא חלבון GTPase קטן. ההפעלה שלו תתחיל שרשרת שבה יופעלו 3 קינזות, האחרון תזרחן את השנייה-,)ERK>--MEK>--raf-1( והקינזה האחרונה גם תשנה פעילות של חלבונים רלוונטים לסיגנל, וגם תזרחן אתרים בגרעין ותוביל לשינוי בביטוי גנים. קסקדה זו נקראת.map kinase cascade הקינזה האחרונה,,ERK נקראת גם map -קינז. הקינזה שמזרחנת אותה,,MEK תקרא map -קינז-קינז. והקינזה שמזרחנת אותה,,raf1 תקרא map -קינז-קינז-קינז. כל שם מציין מה הקינזה הולכת לזרחן, ולכן ככל שהולכים אחורה מוסיפים עוד קינז לשם.

88 88 פוספורילציה יכולה לשפעל חלבון באופן ישיר, והיא יכולה לעשות זאת בדרכים עקיפות. ב- A - מזורחן המעכב של החלבון, מה שגורר ניתוק שלו מהפקטור אותו הוא מעכב --<גנים משועתקים. ב- B, יש קסקדה של פוספורילציות. מזרחנים מעכב ובכך מבטלים את העיכוב, והחלבון פעיל/גנים משועתקים. זרחון חלבונים בגרעין יכול לשמש כזיכרון מולקולרי לאחר סיגנל. למשל כאשר הופעל סיגנל שגרם לתאים התמיינות, לא נרצה שהם יחזרו אחורה. לשם כך, אחד מהתהליכים שיקרו בשרשרת העברת האותות הוא זרחון של חלבונים בגרעין, שישמרו את ההשפעה של הסיגנל גם לאחר שהוא הסתלק מהמערכת. דוגמא מהעובר של הדרוזופילה: גני המטרה שה- EGF מפעיל הם גנים שקשורים בהתמיינות. בתחילת ההתפתחות הם מושתקים על ידי פקטור בשם.groucho כאשר מתחילה ההפרשה של,EGF מופעל הטירוזין קינז. כתוצאה מכך יש הפעלה של מערכת ה- map קינז, בסופה מופעל אנזים.ERK אנזים זה נכנס לגרעין ומזרחן את,groucho מה שהופך אותו ללא פעיל, ואז הגנים האלו יכולים להתבטא. הזרחון על ה- groucho נמשך זמן רב לאחר שה- EGF יתפנה מסביבת התא, וכך זה משמש זכרון מולקולרי. RTK הם רק סוג אחד של טירוזין קינזות. יש קבוצת אנזימים ציטופלסמטים של טירוזין קינז שגם יכולים להיות מעורבים בהעברת אותות. גם הם יכולים להכיל דומיין של SH2 ו- SH3. דרך אותם הדומיינים הם עוברים אקטיבציה. נניח בדוגמא הזו, הטירוזין קינז הוא הכתום. הוא מזורחן בזנב שלו, ולכן מעוכב על ידי התת יחידה הכחולה )לה יש דומיין,SH2 וכך היא קשורה לטירוזין קינז המזורחן(. הוא גם מעוכב על ידי היחידה הירוקה )שלה יש דומיין SH3 ולכן היא קשורה לקינז במקום אחר, אבל מעכבת אותו גם(. כאשר הטירוזין קינז יעבור דה-פוספורילציה, המעכב הכחול יתנתק, ויחפש מישהו אחר עם פוספורילציה להיקשר אליו דרך ה- SH2. אם יבוא ה- ligand activating )הירקרק הבהיר(, הוא יקשור את התת יחידה הכחולה והירוקה, והעיכוב מהטירוזין קינז יוסר, ואז הוא יזרחן את עמו ויהפוך להיות פעיל.

89 89 בקרה על קינזות: נזכיר 4 דרכי בקרה שונות של קינזות: -PKA- עובר כדימר. יש לו שתי יחידות רגולטוריות שמונעות את הקישור שלו לסובסטרט כאשר הם נמצאות. מולקולה של camp יכולה להיקשר לתת יחידה הרגולטורית וכך להסיר אותה ולשפעל את ה- PKA. אם תמנע יצירת ה- camp, הקינז הזה יעוכב. -PKC- כדי שהוא יופעל, צריך שדיאציל-גליצרול )מהממברנה( וקלציום יסירו את התת יחידה הרגולטורית שלו, ואז הוא יעבור שינוי מבני שיהפוך אותו לפעיל. DAG וקלציום מופיעים בתא עקב סיגנל של העברת אותות. map- קינז -)ERK2( צריך לעבור פוספורילציה על האזור הקליטי כדי שיהיה פעיל. הפוספורילציה גורמת לשינוי קונפורמציה, שמאפשרת את יצירת האתר הקטליטי של הקינז. -cdc2- קינז קריטי להעביר תאים מ- G1 ל- S. הוא יהפוך לפעיל רק לאחר שתצטרף אליו תת יחידה בקרתית של ציקלין A. לעיתים זה דורש פוספורילציות נוספות להפעלה. השוני בדוגמא הזו משאר הדוגמאות, הוא בכך שפה היה צריך תוספת של יחידה רגולטורית ולא הסרה שלה. הזכרנו שבקרה יכולה להשפיע גם על מיקום החלבון ולא רק על הפעלתו. למשל, חלבון ERK נמצא בציטופלסמה. כאשר חלבון MEK מזרחן את ה- ERK במספר אתרים, וזה מאפשר לו להתנתק מחלבון מעכב, שתקע אותו בתוך הציטופלסמה. אם תהיה פוספורילציה נוספת, ה- ERK יתחבר ל- IMP7 )חלבון אימפורטין( ויכנס לגרעין, שם יקדם שעתוק על ידי פוספורילציות בגרעין. בעצם הבקרה של הקינז לא רק הפעילה אותו אלא גם שינתה את מיקומו התוך תאי. בקרת קינז כטיפול ללוקמיה: זו רק דוגמא אחת לתהליך מולקולרי בו קינזות משפיעות על תהליכים פתולוגים, יש עוד דוגמאות רבות. -Chronic myelogenic leukemia תאי הדם הלבנים הם פולי-נוקלארים, כי יש להם כמה אונות בגרעין. הציטופלסמה היא מאוד מצומצמת בתאים האלו. בהיסטולוגיה של מח העצם, רוב התאים שנראה הם תאי דם אדומים. בסוג הלוקמיה הזה, יש הבשלה לא תקינה של חלק מתאי הגזע של תאי הדם הלבנים, ובהיסטולוגיה נמצא עלייה בתאים מסוג מיאולוציטים, על חשבון תאי הדם האדומים. זו מחלה ששכיחותה היא כ- 1:100,000. זו אחת מהלוקמיות הנפוצות. היא פורצת לרוב סביב גיל % מהחולים הם א- סימפטומטים בעת הדיאגנוזה, ועם הזמן יש החמרה. גורם הסיכון הגדול ביותר ל- CML הוא קרינה מייננת.

90 90 הבסיס הגנטי למחלה הוא טרנסלוקציה בין כרומוזום 9 ו- 22. על כרומוזום 9 יש גן בשם abl ועל כרומוזום 22 גן בשם.bcr עקב טרנסלוקציה, הגנים האלו מתחברים על פני כרומוזום 22. הכרומוזום המאוחה נקרא כרומוזום פילדלפיה, והגן פיוז'ן.bcr-abl האיחוי של הגנים האלו מייצר קינזה שהיא פעילה ביתר. ה- abl היא קינזה שקשורה לממברנה ומופעלת על ידי טירוזין קינז רצפטור. עקב הטרנסלוקציה, הבקרה על הקינזה הזו מתבטלת, והיא מאוד פעילה בתאים המיאלואידים. כתוצאה מכך, הם מתחילים להתחלק ללא קשר לשום סיגנל חיצוני. מלבד הפרוליפרציה הבלתי נשלטת, התאים האלו מקבלים חסינות מפני אפופטוזיס. אם כך יש פה בעייה כפולה- הם מתחלקים ללא שליטה, ולא מתים. לכן קו הטיפול היה לנסות ולעשות targeting ל- bcr-abl ולעכב אותו. לקינזה יש אתר שעושה הידרוליזה ל- ATP, ואתר שקושר את הסובסטרט ועושה לו זרחון. מצאו מעכב שמונע את הקשירה של ה- ATP לקינזה. התרופה נקראת גליבק. לפני הגליבק, הטיפול בלוקמיה הזו היה בעייתי. האופציה הייתה השתלת מח עצם. זו פרוצדורה מסוכנת עם 25% תמותה. אופציה אחרת הייתה כימותרפיה, ורק כ- 50% מהחולים היו מגיבים אליה. לעומת זאת, כ- 96% מהחולים שטופלו בגליבק הגיעו לריפוי המטולוגי תוך שנה )זה השיפור הסימפטומטי(. אפשר גם לעקוב אחרי הרמסיה המולקולרית של התאים )לראות כמה ה- mrna הכימרי מתבטא שם(, ומצאו שאצל 83% מהחולים היה רמסיה ציטוגנטית גם כן. זה מלמד כי התאים הסרטניים מתו. המסקנה היא שהשרידות של התאים האלו, ולא רק ההתחלקות שלהם, תלויה בקינזה. יש היום כמה דורות נוספים של הגליבק, כי חלק מהחולים פיתחו עמידות. יש עוד מחלות רבות שקשורות בקינזות שיצאו משליטה, ויש המון תרופות חדשות שעושות targeting לאותן הקינזות )טבלה במצגת(. לא צריך לזכור את השמות. אם עושים עיכוב של הקינזות רק באמצעות מעכב אחד, יש סיכוי שהתא יעשה מוטציה שתאפשר לו לעקוף את העיכוב הזה. לכן, בפיתוח תרופות, הרעיון הוא לבוא עם קוקטיל שמורכב מכמה תרופות, שפוגעות בכמה קינזות של אותו המסלול )שהרי אם אחת במסלול פועלת ביתר, כנראה גם השאר יפעלו ביתר(, ובכמה קינזות במסלולים שונים, וכך לתת "מכת מוות" לתא. יוביקוויטינציה מודיפיקציה פוסט תרגומית מאוד מיוחדת, היא לא מבוססת על מולקולה קטנה אלא על חלבון שלם. יוביקוויטין הוא חלבון של 78 ח. אמינו, שנקשר לשיירי ליזין או לקצה ה- N טרמינלי של חלבון המטרה. זה נחשב קשר איזופפטידי. הוא בזווית של 90 מעלות לשרשרת החלבון. היוביקוויטין נקשר מהקצה ה- C טרמינלי שלו, שבו יש גליצין. כמות היוביקוויטינציות על חלבון היא מגוונת. מונו-יוביקוויטינציה נפוצה על היסטונים. ניתן גם להדביק הרבה יוביקוויטין על חלבון אחד. זה חשוב לאנדוציטוזה )מבקר את ה- targeting של המולקולה(. ההדבקה יכולה להיות באתרים שונים על פני החלבון )מולטי-יוביקוויטינציה(, או אחת על השנייה בשרשרת )פולי-יוביקוויטינציה(, על פני אותו האתר. כל סימון גורר תגובה אחרת, למשל פירוק של חלבון, תיקון.DNA

91 91 פירוק תוך תאי של חלבונים מתבצע בעיקר בליזוזום. הליזוזום מפרק אברונים וחלבונים שנכנסו פנימה באנדוציטוזה, כי הייתה להם מודיפיקציה של מולטי-יוביקוויטינציה. מדובר על חלבונים ממברנלים, ולא ממש חלבונים חוץ תאיים. מוטציות במערכות שקשורות בליזוזום מובילות למחלות שונות וקשות, ביניהן הטיי-זקס. קבוצת מחלות אלו נקראות אגירה או גלוקוזידאזות. מודיפיקציה של יוביקוויטין שגוררת פירוק חלבונים שונה ממודיפיקציות אחרות. פוספורילציה, אציטלציה וכו' ניתן להסיר, והחלבון יחזור להיות מה שהיה לפני המודיפיקציה. יוביקוויטינציה שולחת חלבון לדגרגציה, ולאחר פירוק החלבון לא ניתן לאחות אותו. צריך רק לסנתז אותו מחדש. *היוביקוויטינציה עצמה היא מודיפיקציה כן הפיכה, אבל התוצאה שלה לא. מערכת היוביקוויטינציה לא קיימת בחיידקים. התא. גולדברג חקר פירוק של חלבונים ומצא שזמן מחצית החיים של חלבונים בתא מאוד מגוון. יש חלבונים עם זמן מחצית חיים של מספר דקות, וכאלו שזמן מחצית החיים שלהם מגיע לשעות, וכאלו שהם מאוד יציבים, ולא מתפרקים במהלך חייו של נשאלה השאלה מה גורם להבדל האלו. בריאן פול ערך ניסוי שהיווה את הבסיס לגילוי מערכת היוביקוויטין. הוא לקח מאקרופאג'ים, תאים בולעניים עשירים בליזוזומים. חצי מהתאים סומנו במימן רדיואקטיבי, ולכן כל החלבונים הפנימיים שלהם היו מסומנים גם במימן רדיואקטיבי. החצי השני של התאים סומנו בחנקן רדיואקטיבי. את התאים שסומנו בחנקן הוא כתש לתמצית. את התמצית הוא הוסיף לתרבית התאים המסומנים במימן. הוא מדד את קצב התחלופה של החלבונים, וראה כי הקבוצה של החלבונים שסומנו במימן היו בעלי פירוק נמוך- של 4%, ואילו הפירוק של החלבונים שסומנו בחנקן )דהיינו חלבונים חיצוניים לתא( היה גבוה- 37%. אז הוא הוסיף חומר שמעכב את הכניסה לליזוזום. זה כמעט ולא שינה את קצב הכניסה של חלבונים אנדוגנים לליזוזום, אבל זה שינה דרמטית את קצב הפירוק של החלבונים האקסוגנים )הוריד אותו משמעותית(. היום יודעים שזה משום שהליזוזום לא מפרק חלבונים אנדוגנים. זה הפרוטאוזום שמפרק אותם. הרשקו וצחנוב'ר גילו את מערכת היוביקוויטין בשיטת הסלמי. זו שיטה בה מפרקים מערכת לכל המרכיבים שלה, ואז מחברים אותם מחדש, ובוחנים כל חלק בנפרד, כדי לראות אם הוא זה שעושה את הפונקציה. הם לקחו תרבית תאי גזע שאמורים להתמיין לתאי דם אדומים, ופירקו אותה לפרקציות. הם ידעו שבתאים האלו יש מערכת שמפרקת חלבון שסומן ביוביקוויטין, ושהפירוק הזה הוא תלוי.ATP הם שמו לב כי אם הפרקציות מופרדות, אין פעילות של פירוק, בין אם יש ATP ובין אם אין.ATP אבל כשחיברו את שתי הפרקציות, כן היה פירוק של החלבונים. היוביקוויטין יציב בחום, הוא לא מתפרק. יש לו מבנה גלובולרי מוגדר. הוא מאוד שמור באבולוציה- מהשמר עד האדם יש דימיון של 96%. היוביקוויטין מעורב בהרבה תהליכים. מודיפיקציה של יוביקוויטינציה לחלבון היא כאמור דרך שיירי ליזין של חלבון המטרה. על פני חלבון היוביקוויטין יש 7 חומצות אמינו של ליזין, ודרכם אפשר לבצע פולי-יוביקוויטינציה. צורת השרשרת יכולה להשתנות, כתלות במיקום הליזין שעליו נעשה החיבור. כל החיבורים יכולים להעשות באותו אופן polyubiquitination( )homotypic או בשילוב של כל מיני קשרים polyubiquitination(.)mixed linkage אופן הקישור של השרשרת יכתיב את גורל החלבון. למשל, אם הקישור של השרשרת הוא דרך ליזין 48, החלבון ילך לפירוק בפרוטאוזום. אם החיבור הוא דרך ליזין 63, החלבון ילך לתיקון.DNA

92 92 יש מולקולות דמויות יוביקוויטינציה, כמו ה- SUMO, שהן יכולות להשתלב בשרשראות יוביקווטין או להיות מודיפיקציות בפני עצמן. אפשר לדעת את כמות היוביקוויטין שהתווספו בזכות הרצה בג'ל על סמך משקל. איך נוצרת שרשרת יוביקוויטין? יוביקוויטין היא מולקולה שצריכה לעבור שפעול. אנזים E1 עושה הידרוליזה של ATP ל-,AMP ונקשר אל היוביקוויטין )זה השפעול(. הוא בא במגע עם חלבון E2, ובהשקעת של עוד אנרגיה )לא מופיעה באיור(, היוביקוויטין המשופעל נקשר ל- E2, וה- E1 משתחרר. היוביקוויטין יעבור לאנזים שלישי- E3 )נקרא גם יוביקוויטין ליגז(. זה אנזים פיגום, שעליו מתלבש חלבון המטרה שעובר את היוביקוויטינציה, וה- E2 שמכיל את היוביקוויטין. הקרבה ביניהם תאפשר את יצירת הקשר האיזופטטידי. כדי ה- E3 יזהה את הסובסטרט, הרבה פעמים הוא צריך להיות מזורחן.

93 93 אם התהליך הזה יקרה כמה פעמים, יבנה עץ יוביקוויטין. יש כמה סוגים של E2, שהזהות שלהם תקבע על איזה ליזין תהיה היוביקוויטינציה. יש אפילו יותר סוגים של E3, שהזהות שלהם תקבע את הסובסטרט שעובר יוביקוויטינציה. דה-יוביקוויטינציה: נעשות על ידי אנזימי protease).dub/usp (ubiquitin-specific מוטציות באנזימים האלו גורמות לסרטן. האנזים שמסיר את היוביקוויטין יכול להיות ספציפי לקשר הפנימי בשרשרת. כלומר יהיו DUB ספציפיים לקישור בליזין 63, ואחרים לקישור בליזין 48.. יש DUB שיודעים לחתוך רק את היוביקוויטין האחרון שהוסף, ויש כאלו שיודעים לחתוך רק כשזה לא היוביקוויטין האחרון, אלא זה באמצע. יש כאלו שיודעים לקצוץ רק את היוביקוויטין הראשון )מונו-דה-יוביקוויטינציה(. יש DUB שספציפיים לסובסטרטים מסוימים. יש אנזימים שיודעים לעכב את ה- DUBs, וחומרים פרמקולוגים שיודעים לעכב אותם. הפרוטאוזום: הפירוק של חלבון שסומן ביוביקוויטין נעשה על ידי הפרוטאוזום. זה קומפלקס חלבוני ענק. הוא נקשר לחלבון המטרה דרך שרשרת היוביקוויטין. בנוסף יש לו חלק שעושה unfolding לחלבון, ואז מפרק אותו. הפרוטאוזום בנוי מארבע טבעות מרכזיות, ה- core )זה ה- 20S (. חלק זה מכיל 7 שרשראות אלפא ומעליהן 7 שרשראות ביתא. במרכז הטבעות נמצא החלק הקטליטי. ארבע הטבעות האלו מוקפות באזור רגולטורי, שנקשר אל חלבון המטרה ושרשרת היוביקוויטין ועושה את ה- unfolding.

94 94 פעולת ה- unfolding דורשת פירוק של ATP ל- ADP. אפשר למצוא מעכבים ספציפיים שמונעים פירוק של ATP ל- ADP, וכך לעכב את הפרוטאוזום מבלי לעכב חלבונים אחרים שעושים הידרוליזה של ה- ATP ל- AMP. לאדם שסבל משבר ונמצא בגבס, או לאדם שסובל ממחלה כרונית, יש פירוק של השריר, שנעשה על ידי הפרוטאוזום. אפשר לעכב את הפרוטאוזום כדי למנוע את הפירוק של השריר. יש הרבה פרוטאוזומים בכל תא- הם מהווים כ- 1% מכל חלבוני התא. בניגוד לליזוזום, הפרוטאוזום עובד ב- ph=7. כיצד מזהים פירוק חלבונים? יש כמה שיטות. אחת היא בריצה בג'ל לפי משקל. אפשר להריץ את הרקמה תחת תנאים שונים, ובזמנים שונים, ולראות את איך המניפולציה השפיעה על פירוק החלבונים. למשל לוקחים רקמה סרטנית ובודקים את הריצה של,myc ללא נוכחות של ATP בתמצית, ואז בנוכחות ATP )מצפים כי המיק יתפרק כשיש,ATP כי אז הפרוטאוזום יכול לעבוד(. דוגמא נוספת היא לקחת תרופה שמעכבת את הפרוטאוזום, ולראות שהרמה של חלבון מסוים נותרת קבועה כשמטפלים בה. מודיפיקציות של יוביקוויטינציה קיימות בשרשרת של העברת אותות. דוגמא- בתאים של מערכת החיסון מסוג,NK יש פקטורי שעתוק )p65 ו- NK-kB ( שבאופן רגיל לא יכולים להיכנס לגרעין כדי לקדם תגובה חיסונית, כי הם חסומים על ידי אי-קבבין.)Ikb-α( כאשר תאים מסוג NK נחשפים לציטוקינים שונים, זה מהווה עבורם סיגנל לעשות זרחון של אי-קבבין בשני אתרים ספציפיים, מה שמאפשר את היוביקוויטינציה שלהם )היוביקוויטין ליגז מזהה את האי-קבבין המזורחן בלבד(. כתוצאה מכך האי-קבבין מפורקים על ידי הפרוטאוזום. זה מאפשר לפקטורי השעתוק להיכנס אל הגרעין ולהתחיל שעתוק של גנים שקשורים בתגובה חיסונית. תאי סרטן תלויים בבקרת חלבונים באופן הדוק, במיוחד בפרוטאוזום. יש תרופה בשם,velcade שמעכבת את הפרוטאוזום ונועלת אותו. גידול המטולוגי )של מערכת הדם( בשם מיאלומה מטופל בתרופה הזו. לפני מציאת התרופה הזו זה היה סרטן קטלני, שאי אפשר היה לרפא ממנו. בסרטן הזה, יש השתלטות של הסרטן על מח העצם, על ידי שרשראות של אימונוגלובולינים שמפרישים תאי הסרטן. התרופה מעכבת את הפרוטואוזום, מה שגורם לכך שהתא הסרטני מפסיק לייצר את השרשראות )כנראה ששיווי המשקל בין הפירוק של השרשרת ליצירתה הוא קריטי(. לאחר טיפול במעכב הפרוטואוזום, יש ירידה משמעותית ברמות האימונוגלובלינים ובגודל של הסרטן.