DETERMINAREA CONCENTRAŢIILOR MINIME INHIBITORII PENTRU TULPINI DE NEISSERIA GONORRHOEAE PRIN E-TEST RAPORT ŞTIINŢIFIC

Transcript

1 DETERMINAREA CONCENTRAŢIILOR MINIME INHIBITORII PENTRU TULPINI DE NEISSERIA GONORRHOEAE PRIN E-TEST RAPORT ŞTIINŢIFIC Doctorand: dr. Silvia Filipiuc Îndrumător: Prof. Univ. Dr. Luminiţa Smaranda Iancu

2 OBIECTIV: stabilirea tipului de rezistenţă a tulpinilor de Neisseria gonorrhoeae, utilizând benzi E-test, la bolnavi cu gonoree din judeţul Suceava, în perioada

3 DESIGN: studiul prezentat este unul analitic (observaţional etiologic), de cohortă, prospectiv. LOC: investigarea, în laboratorul de Microbiologie al DSP Suceava şi Laboratorul de Microbiologie al Disciplinei de studiu Microbiologie din cadrul U.M.F. Iaşi. PARTICIPANŢI: pacienţii care se încadrează în definiţiile de caz şi care au fost de acord cu consimţământul informat, aprobat de către Comitetul de Etică al Universităţii.

4 PACIENŢI SI METODE: au fost testaţi 32 pacienţi (6 femei, 26 bărbaţi); perioada studiului: octombrie august 2010; s-au recoltat probe de secreţie uretrală / endocervicală.

5 PACIENŢI SI METODE: frotiu direct colorat Gram şi albastru de metilen, examinat la microscopul cu obiectivul cu imersie, izolare (însămânţare pe 2 plăci cu mediu selectiv şi neselectiv); identificare (microscopică, testul oxidazei, identificare biochimică, utilizând truse mini- API);

6 PACIENŢI SI METODE: S-a determinat CMI pentru tulpinile izolate, la: penicilină, tetraciclină, amoxicilină, augmentin, claritromicină, ciprofloxacină, ceftriaxonă, spectinomicină, utilizând benzi E test, tehnică recomandată de O.M.S, cu respectarea criteriilor de interpretare şi control CLSI Asigurarea calităţii prin utilizarea de tulpini de referinţă de N. gonorrhoeae ATCC pentru verificarea calităţii nutritive a mediilor de cultură şi a corectitudinii antibiogramei; prelucrarea datelor pentru cazurile de gonoree depistate şi confirmate (EpIData, EpiInfo).

7 Principiul E-test Pe suprafaţa unei plăci de mediu agarizat, însămânţată mai întâi cu tulpina testată în condiţii standardat, se aplică langhetele cu antibiotic care sunt depuse radiar, sau în paralel. După incubare, CMI este indicată de intersecţia dintre zona eliptică de inhibiţie a culturii şi scala de gradient a langhetei. Testul permite: - determinarea concomitentă, pe aceeaşi placă, a CMI pentru mai multe antibiotice, atât pentru bacterii aerobe cât şi anaerobe; - supravegherea pacienţilor pe parcursul terapiei antimicrobiene, pentru a surprinde selectarea de clone rezistente.

8 E-test CMI Sao Paulo Med. J. vol.112 no.4 São Paulo Oct./Dec. 1994

9 Avantajele E-test Poate determina CMI pentru bacterii fastidioase. Detectează/confirmă fenotipuri de rezistenţă deosebite (ESBL, MBL, AmpC, sau GISA/hGISA). Detectează rezistenţe de nivel scăzut. Util în testarea antibioticelor noi sau care nu sunt testate de rutină. Confirmă rezultatele echivoce obţinute prin antibiograma difuzimetrică.

10 Cultură primară de Neisseria gonorrhoeae pe agar GC bază + 1% hemoglobină + 1% supliment nutitiv IsoVtalex, VITOX + supliment selectiv (VCN).

11 Cultură pură de Neisseria gonorrhoeae pe agar GC bază + 1% hemoglobină + 1% supliment nutitiv IsoVtalex, VITOX + supliment selectiv (VCN).

12 Teste biochimice galerii API NH Biomerieux, tulpină β- lactamaza pozitivă.

13 Teste biochimice galerii API NH Biomerieux, tulpină β-lactamaza negativă.

14 Criteriile de interpretare conform CLSI 2008 Antibiotic Tulpină sensibilă CMI (µg/ml) Tulpină intermediar sensibilă CMI (µg/ml) Tulpină rezistentă CMI (µg/ml) Penicilină >2 Ceftriaxonă 0.25 Nu există limite CLSI Nu există limite CLSI Ciprofloxacin >1 Spectinomicină Tetraciclina

15 Rezultate E-test pe mediu GC agar bază, completat cu 1% IsoVitaleX, fară hemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 10 8 UFC/ml) pentru ceftriaxonă si ciprofloxacin.

16 E-test pe mediu GC agar bază completat, cu 1% IsoVitaleX, fară hemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 108 UFC/ml) pentru claritromicina si tetraciclina.

17 E-test pe mediu GC agar bază completat, cu 1% IsoVitaleX, fară hemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 10 8 UFC/ml) pentru penicilină şi tetraciclină.

18 E-test pe mediu GC agar bază completat, cu 1% IsoVitaleX, fară hemoglobină; suspensia standardizată (0.5 McFarland 10 8 UFC/ml) pentru penicilină si amoxicilină.

19 Rezultate Valorile CMI pentru antibioticele utilizate au fost transformate în rate de rezistenţă (%): sensibil, intermediar, şi tulpini rezistente (Tabelul1). Din totalul tulpinilor 53,1%, 43,75%, 40,6%, 34,4%, 59,4%, 34,4%,0% au fost rezistente la penicilină, respectiv la amoxicilină, augmentin, claritromicină, tetraciclină, ciprofloxacin, ceftriaxonă si spectinomicina; 7 tulpini (21,8%) au fost ß-lactamază pozitive; 49% tulpini au fost multirezistente. În timp ce pentru penicilină, tetraciclină, ceftriaxonă şi ciprofloxacin sunt criterii clare în ghidul pentru interpretare al sensibilităţii (CLSI 2008), pentru amoxicilină, augmentin, si claritromicină nu sunt bine definite.

20 TABEL 1. Rezultatele testării prin E-test pentru tulpini de Neisseria gonorrhoeae izolate in perioada Antibiotic Rezistent % (pozitiv/total) Intermediar % (pozitiv/total) Sensibil % (pozitiv/total) Ceftriaxona 0 (0/32) 3,1 (1/32) 96.9 (31/32) (CMI =0,25μg/ml) Penicilina 53,1 (17/32) (CMI >2 μg/ml) 15,6 (5/32) (CMI =0,12-1μg/ml) 31.2 (10/32) (CMI =0,06μg/ml) Tetraciclina 59,4 (19/32) (CMI >2 μg/ml) 9,4 (3/32) (CMI =0,5-1μg/ml) 31.2 (10/32) (CMI =0,25μg/ml) Amoxicilina 43.7 (14/32) 21,9 (7/32) 34,4 (11/32) Augmentin 40,6 (13/32) 18,8 (6/32) 40,6 (13/32) ClaritroCMIina 34,4 (11/32) 40,6 (13/32) 25 (8/32) Ciprofloxacina 34,4 (11/32) (CMI >1 μg/ml) 28,1 (9/32) (CMI =0,12-0.5μg/ml) 37,5 (12/32) (CMI =0,06μg/ml) Spectinomicină 0 (0/32) (CMI =128 μg/ml) 3,1 (1/32) (CMI =64μg/ml) 96.7 (31/32) (CMI =32μg/ml)

21 Criterii de interpretare (CLSI) Am folosit definiţiile, conform CLSI 2008: sunt definite ca tulpini de Neisseriei gonorrhoeae rezistente la penicilină (PPNG), tulpinile β-lactamază pozitive; în cazul rezistenţei mediate cromosomal, se consideră, pentru Neisseria gonorrhoeae ( CMRNG), tulpinile care au CMI >2 µg/ml şi sunt β-lactamază negative; (mecanism principal de rezistenţă: modificări ale PLP1 şi PLP2 (Roop, 2002); tulpini de Neisseriei gonorrhoeae rezistente la tetracicline (TRNG): sunt tulpinile care au CMI la tetraciclină >16 µg/ml (rezistenţă înaltă legată de prezenţa genelor teta-e, cu localizare plasmidică, care codifică sistemul de pompă-eflux- (Roberts,1997); - Neisseria gonorrhoeae cu rezistenţa cromosomală la tetraciclină (tetr): CMI la tetraciclină 2-8 µg/ml şi CMI la penicilină <1 µg/ml.

22 Quinolone rezistance Neisseria gonorrhoeae (QRNG): sunt tulpinile care au CMI la ciprofloxacin > 1µg/Ml, rezistenţa fiind mediată de mutaţiiale genelor gyr A sau par C; Ceftriaxone -resistance Neisseria gonorrhoeae (CRNG): sunt tulpinile care au CMI > 0.125µg/mL; sunt descrise variante de b-lactamaze TEM şi SHV care conferă rezistenţa la noile cefalosporine (Philippon 1989; Jacoby si Medeiros 1991); Spectinomycine-resistance Neisseria gonorrhoeae (SRNG): tulpini cu CMI > 128µg/mL; Multirezistenţa a fost definită pentru: QRNG şi PPNG; QRNG şi TRNG; QRNG, PPNG şi TRNG; sistemul de gene MtrC-MtrD-MtrE a fost primul sistem eflux descris la Neisseria gonorrhoeae care determină rezistenţa la penicilină, tetraciclină, macrolide si fluoroquinolone (Hagman 1995).

23 Rezultate Pentru penicilină: 7 tulpini (21,8%) au avut rezistenţă înaltă, corelată cu rezistenţa plasmidică PPNG, iar 8 tulpini (25%), CMRNG, au avut rezistenţă mediată cromosomal ( CMI >2 µg/ml) (tabelul 1). Pentru tetraciclină: 19 tulpini au fost rezistente (tabelul 1); 11 tulpini(37.5%) au avut rezistenţă mediată cromosomal tetr (CMI >8 µg/ml), iar 4 tulpini (12.5%) au fost TRNG (CMI.>16 µg/ml), având rezistenţă înaltă, mediată plasmidic (tabelul 1).

24 Rezultate Pentru ciprofloxacină: 11 tulpini (34.4%) au avut rezistenţă înaltă (tabelul 1), fiind QRNG (CMI>1 µg/ml), 9 tulpini (28,1%) au prezentat o reducere a sensibilităţii la ciprofloxacin (tabelul 1). Pentru ceftriaxonă: 1 tulpină (3,1%) a prezentat o reducere a sensibilităţii (tabelul 1). - Concentraţia care defineşte reducerea sensibilităţii (CMI >0.125 µg/ml) (tabelul 1), 0 tulpini au prezentat rezistenţă la ceftriaxonă. Pentru spectinomicină:1tulpină (3,1%) a prezentat o reducere a sensibilităţii (tabelul 1). - Concentraţia care defineşte reducerea sensibilităţii (CMI>128 µg/ml), 0 tulpini au prezentat rezistenţă la spectinomicină.

25 TABEL 1. Rezultatele testării prin E-test pentru tulpini de Neisseria gonorrhoeae izolate in perioada Antibiotic Rezistent % (pozitiv/total) Intermediar % (pozitiv/total) Sensibil % (pozitiv/total) Ceftriaxona 0 (0/32) 3,1 (1/32) 96.9 (31/32) (CMI =0,25μg/ml) Penicilina 53,1 (17/32) (CMI >2 μg/ml) 15,6 (5/32) (CMI =0,12-1μg/ml) 31.2 (10/32) (CMI =0,06μg/ml) Tetraciclina 59,4 (19/32) (CMI >2 μg/ml) 9,4 (3/32) (CMI =0,5-1μg/ml) 31.2 (10/32) (CMI =0,25μg/ml) Amoxicilina 43.7 (14/32) 21,9 (7/32) 34,4 (11/32) Augmentin 40,6 (13/32) 18,8 (6/32) 40,6 (13/32) ClaritroCMIina 34,4 (11/32) 40,6 (13/32) 25 (8/32) Ciprofloxacina 34,4 (11/32) (CMI >1 μg/ml) 28,1 (9/32) (CMI =0,12-0.5μg/ml) 37,5 (12/32) (CMI =0,06μg/ml) Spectinomicină 0 (0/32) (CMI =128 μg/ml) 3,1 (1/32) (CMI =64μg/ml) 96.7 (31/32) (CMI =32μg/ml)

26 TABEL 2. CMI 50 şi CMI 90 si limitele de sensibilitate ale CMI, pentru antibioticele testate prin E-test pentru 32 izolate de Neisseria gonorrhoeae Antibiotic CMI (µg/ml) CMI (µg/ml) CMI (µg/ml) Limite 50% 90% Ceftriaxona Penicilina Tetraciclina Amoxicilina Augmentin ClaritrOMICINAina Ciprofloxacina Spectinomicină

27 Analiza datelor Acest studiu a urmărit optimizarea diagnosticului microbiologic al gonoreei cu implementarea controlului de calitate al testării sensibilităţii la antibiotice prin E-test, într-un laborator de microbiologie, judeţean. Rezistenţa prin producere de penicinilaze la Neisseriei gonorrhoeae este variabilă în funcţie de zona geografică, ajungând la 80% în numeroase ţări din sudul şi sud-estul Asiei şi în Vestul Pacificului (Way 2005).

28 Analiza datelor Procente ridicate sunt semnalate în diferite ţări din Africa (ex 98%, în Nigeria, Tadese 2002). Valori mai reduse, se înregistrează, în Franţa, în zona Parisului 15% sau în Germania 21,5% (Enders 2006) În perioada s-a inregistrat un declin semnificativ al tulpinilor Neisseriei gonorrhoeae producătoare de penicinilaze, dar a crescut procentul tulpinilor cu rezistenţa mediată cromosomal la penicilină şi tetraciclina (Shigemura 2005)

29 Analiza datelor Un număr mare de tulpini (62.5%) au fost rezistente la ciprofloxacin, respectiv, 34.4%, cu rezistenţa de nivel înalt (QRNG) şi 28.1% cu o scădere a sensibilităţii; Din aceste motive, ciprofloxacina nu mai este recomandă ca tratament util în gonoree în regiunea noastră, utilizarea sa fiind indicată numai după efectuarea antibiogramei şi demonstrarea sensibilităţii izolatelor. PENTRU URMATOARELE TREBUIE GRAFIC Alte zone care au raportat rezistenţă cu nivele inalte: Asia 63%; Europa de Vest ( Austria 53.1%, Belgia 46.9%, Suedia 48%(Martin I.M.C. 2006); Rusia 50% (Kubanova A.2006); Iaşi 59.2% (Badescu A. 2007); India 86.6% (Manju B. 2007);Australia 50%(Tapsall JW.1998); Japonia 81.6%(Ito M. 2005);

30 Tabel 3. Rata de rezistenţă la antibiotice şi gradele de comparaţie cu alte state Europene, Japonia si Australia pentru tulpini de Neisseria gonorrhoeae testate prin metoda E-testª ( Martin I.M.C.2006) Ţara Ceftriaxonă QRNG % CMRNG % PPNG % TRNH % TetR % Austria Belgia Danemarca Anglia Franţa Grecia Italia Neterland Portugalia Scoţia Spania Suedia Japonia 30, Australia Ro/Suceava

31 TABEL 4. CMI 50 şi CMI 90 si limitele CMI de sensibilitate pentru antibioticele testate pentru Neisseria gonorrhoeae in Europa devest MartinI.M.C. 2006) Antibiotic CMI (µg/ml) Limite CMI (µg/ml) 50% CMI (µg/ml) 90% Ceftrixonă Penicilină Tetraciclină Ciprofloxacină Spectinomicină

32 Discuţii Pană în prezent tulpinile de Neisseria gonorrhoeae au dezvoltat o rezistenţă crescută la penicilină, tetraciclină, quinolone în diferite ţări (India, China, Japonia) punând o serioasă problemă de management în gonoree (Manju B. 2008). La ceftriaxonă nu am izolat nicio tulpină rezistentă, însă o tulpină a fost moderat sensibilă, în timp ce în alte regiuni au fost raportate tulpini ca rezistente în Italia 4.8%, America (semnalate sporadic), Africa 13%; Rusia 3% (Kubanova A.2006), Iasi 0% (Badescu A); India 5.5% (Manju.B2007); Japonia 30.3% (Ito M2005); Italia 4.8%; Suedia 1% (Martin I.M.C.2006). Fa grafic cu aceste date!!!! Este greu de urmarit in acest format Din pacate informaticina mea nu este acasa si nu te pot ajuta cu grafice Daca nu le poti face spuen ca sa caut pe cineva sa le faca sau le fac eu

33 Discuţii Nu am izolat nicio tulpină rezistentă la spectinomicină. Datorită păstrării sensibilităţii la acest antibiotic, o singură doză, de 2 g este considerată utilă, tratamentul de primă linie în zona noastră. Au fost raportate tulpini rezistente în ţările Pacificului de Vest ( Martin I.M.C.2006).

34 Concluzii In zona noastră, penicilina, tetraciclina, ciprofloxacina, claritromicina, amoxicilina şi augmentinul nu mai pot fi folosite în tratamentul de primă intenţie a gonoreei, testarea lor fiind obligatorie. In ţara noastră se impune optimizarea, standardizarea şi introducerea controlului de calitate al testării sensibilităţii la antibiotice pentru tulpinile de N. gonorrhoeae izolate, în toate labortoarele. Continuarea la nivel regional şi naţional a supravegherii sensibilităţii la antibiotice este crucială în detectatea emergenţei noilor rezistenţe; monitorizarea variaţiei pattern-urilor de sensibilitate va face posibilă adaptarea schemelor terapeutice.

35 Concluzii Evoluţia sensibilităţii la cefalosporine trebuie monitorizată obligatoriu, (fiind singura clasă de antibiotice disponibilă în momentul de faţă pentru terapia sindromică în uretrita gonococică), pentru surprinderea apariţiei tulpinilor rezistente. Pentru stabilirea mecanismelor de rezistenţa şi a modului lor de transmitere sunt necesare studii microbiologice extinse, inclusiv prin utilizarea markerilor de epidemiologie moleculară.

36 Vă mulţumesc!