PLATELIA TM TOXO IgG TMB 96 ΟΚΙΜΕΣ 72741

Transcript

1 PLATELIA TM TOXO IgG TMB 96 ΟΚΙΜΕΣ ΚΙΤ ΓΙΑ ΤΗΝ ΠΟΙΟΤΙΚΗ/ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ, ΣΤΟΝ ΑΝΘΡΩΠΙΝΟ ΟΡΟ Ή ΠΛΑΣΜΑ, ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ IgG TOY ΤΟΞΟΠΛΑΣΜΑΤΟΣ GONDII ΜΕΣΩ ΕΝΖΥΜΙΚΟΥ ΑΝΟΣΟΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ Για διαγνωστική χρήση In Vitro Όλα τα παρασκευασµένα αντιδραστήρια που διατίθενται στο εµπόριο υπόκεινται στις διαδικασίες συστήµατος πλήρους ελέγχου ποιότητας, από την παραλαβή των πρώτων υλών έως την τελική εµπορευµατοποίηση του προϊόντος. Κάθε παρτίδα υπόκειται σε έλεγχο ποιότητας και διατίθεται στην αγορά µόνο εφόσον ικανοποιεί τα κριτήρια αποδοχής. Τα αρχεία που σχετίζονται µε την παραγωγή και τον έλεγχο κάθε παρτίδας τηρούνται εντός της εταιρίας µας.

2 ΠΙΝΑΚΑΣ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΩΝ 1-ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ 3 2-ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ 3 3-ΒΑΣΙΚΗ ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΟΚΙΜΗΣ 3 4-ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΟΥ ΚΙΤ 4 5-ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ 6 6-ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΟ ΥΛΙΚΟ 8 7-ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ 8 8- ΕΙΓΜΑΤΑ * 9 9- ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ 9 10-ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ ΕΠΙ ΟΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΙΑ ΤΗΣ ΟΚΙΜΗΣ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 18

3 1-ΠΡΟΒΛΕΠΟΜΕΝΗ ΧΡΗΣΗ Το Platelia TM Toxo IgG TMB είναι ένα κιτ δοκιµών προοριζόµενο για διαγνωστική χρήση in-vitro, το οποίο επιτρέπει την ποιοτική και ποσοτική ανίχνευση, στον ανθρώπινο ορό ή πλάσµα, αντισωµάτων IgG του τοξοπλάσµατος gondii. 2-ΚΛΙΝΙΚΗ ΑΞΙΑ Το T. gondii είναι ένα πρωτόζωο το οποίο προκαλεί λοιµώξεις σε πολυάριθµα είδη θηλαστικών και πτηνών. Η τοξοπλάσµωση, η οποία απαντά συχνά σε ανθρώπους και ζώα, είναι συνήθως ασυµπτωµατική. Ο επιπολασµός της λοίµωξης αυτής στον πληθυσµό καταδεικνύεται µέσω ορρολογικών δοκιµών και ποικίλλει ανάλογα µε τη χώρα προέλευσης και την ηλικία. Η τοξοπλάσµωση κατά τη διάρκεια της κύησης θεωρείται υπεύθυνη για την πρόκληση σοβαρών συγγενών ανωµαλιών (κυρίως διαταραχές των εγκεφαλικών λειτουργιών), ενώ οδηγεί, ενίοτε, σε θνησιγένεια. Η ανίχνευση, στις γυναίκες προ της σύλληψης, του αντιτοξοπλασµατικού αντισώµατος IgG διασφαλίζει την προστασία του εµβρύου από πιθανή τοξοπλάσµωση κατά τη διάρκεια της κύησης. Η προδιαθεσιακή λοίµωξη από οξεία τοξοπλάσµωση είναι συνήθης σε άτοµα µε διαγνωσµένο Σύνδροµο Επίκτητης Ανοσοανεπάρκειας (AIDS) ή σε άτοµα µε άλλες µορφές ανοσοκαταστολής. Οι λοιµώξεις αυτές οφείλονται κυρίως στην επανενεργοποίηση των κύστεων T. gondii, οι οποίες προϋπήρχαν της µόλυνσης από τον ιό HIV. Η συγκεκριµένη διάγνωση της λοίµωξης από Τ. gondii µπορεί να αποβεί αρκετά περίπλοκη, ενώ η αποµόνωση του παρασίτου είναι σπάνια. Η ορρολογική επιβεβαίωση της παρουσίας του αντισώµατος του T. gondii είναι ενδεικτική της έκθεσης στο παράσιτο και έχει γίνει ευρέως αποδεκτή ως µέσο προσδιορισµού της ανοσολογικής κατάστασης και της επιδεκτικότητας στη µόλυνση. Η ανίχνευση διαφόρων ισοτύπων επιτρέπει είτε τον προσδιορισµό της χρονικής φάσης της µόλυνσης µε T. gondii και, στην περίπτωση που αυτή είναι πρόσφατη, την εφαρµογή κατάλληλης θεραπείας ή την υπόδειξη προφυλακτικών µέτρων: υγιεινοδιαιτητικές οδηγίες προς τις έγκυες γυναίκες, χηµειοπροφύλαξη για τον πληθυσµό µε ανοσοκαταστολή. 3.ΒΑΣΙΚΗ ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΟΚΙΜΗΣ Ο προσδιορισµός βασίζεται στην αρχή της τεχνικής ενζυµικού ανοσοπροσδιορισµού στερεάς φάσης, γνωστής ως έµµεσης ELISA. Το χρησιµοποιούµενο για την επίχριση της µικροπλακέτας αντιγόνο T. gondii προέρχεται από ταχυζωΐτη κατεργασµένο µε υπερήχους και εµπλουτισµένο µε πρωτεΐνες µεµβράνης. Το συζυγές αποτελείται από σηµασµένο µε υπεροξειδάση µονοκλωνικό αντίσωµα το οποίο είναι ειδικό των ανθρώπινων αλυσίδων γάµµα. Πρώτο Στάδιο Τα αραιωµένα δείγµατα εισάγονται στις επιχρισµένες µε αντιγόνο T. gondii κοιλότητες της µικροπλακέτας. Κατά την επώαση διάρκειας µίας ώρας στους 37 C, τα αντισώµατα T. gondii που υπάρχουν στο δείγµα δεσµεύονται στις επιχρισµένες µε αντιγόνο T. gondii κοιλότητες των µικροπλακετών. Μετά την επώαση, τα αντισώµατα που παραµένουν αδέσµευτα, καθώς και άλλες πρωτεΐνες του ορού αποµακρύνονται µέσω πλύσεων. εύτερο Στάδιο Το συζυγές (µονοκλωνικό αντίσωµα σηµασµένο µε υπεροξειδάση, το οποίο είναι ειδικό των ανθρώπινων αλυσίδων γάµµα) προστίθεται στις κοιλότητες των µικροπλακετών. Κατά τη διάρκεια µιας δεύτερης επώασης διάρκειας µίας ώρας σε θερµοκρασία 37 C, το σηµασµένο µονοκλωνικό αντίσωµα δεσµεύεται από τα σύµπλοκα αντισωµάτων IgG-αντιγόνων T. gondii που έχουν προσκολληθεί στις κοιλότητες των µικροπλακετών. Το συζυγές που παραµένει αδέσµευτο αποµακρύνεται µέσω πλύσεων. Τρίτο Στάδιο Η παρουσία του ανοσοσυµπλέγµατος (συζυγές T. gondii Ag, anti-t. gondii IgG, anti IgG) καταδεικνύεται µέσω της προσθήκης διαλύµατος το οποίο περιέχει υπόστρωµα υπεροξειδάσης και χρωµογόνο το οποίο προκαλεί αντίδραση χρωµατικής ανάπτυξης. Τέταρτο Στάδιο Μετά από επώαση διάρκειας µισής ώρας σε θερµοκρασία δωµατίου, η ενζυµική αντίδραση

4 διακόπτεται µέσω της προσθήκης οξέος, όπως το H 2 SO 4 1N. Οι τιµές οπτικής πυκνότητας, οι οποίες λαµβάνονται µε τη βοήθεια φασµατοφωτοµέτρου στα 450/620 nm, είναι ανάλογες προς την ποσότητα αντισωµάτων T. gondii IgG που υπάρχουν στο δείγµα. Οι τιµές οπτικής πυκνότητας µετατρέπονται σε IU/mL µε τη βοήθεια πρότυπης καµπύλης. Οι οροί-βαθµονοµητές (R4a, R4b, R4c) διακριβώνονται βάσει του προτύπου του Π.Ο.Υ (TOXM 185). 4-ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΟΥ ΚΙΤ Όλα τα αντιδραστήρια προορίζονται αποκλειστικά για διαγνωστική χρήση in vitro. σήµανση Φύση των αντιδραστηρίων Παρουσίαση R1 Microplate Μικροπλακέτα 12 ταινίες των 8 αποσπώµενων 1 πλακέτα κοιλοτήτων έκαστη, επιχρισµένες µε αντιγόνα T.gondii (στέλεχος RH). R2 Concentrated Συµπυκνωµένο ιάλυµα Πλύσης (10x) Ρυθµιστικό 1 φιαλίδιο των 100 ml Washing Solution ιάλυµα TRIS NaCl ph 7,4, µε 1 % Tween 20, Συντηρητικό: 0,01% thimerosal (άλατα υδραργύρου). R3 Calibrator 0 Βαθµονοµητής 0: Ανθρώπινος ορός µη αντιδρών στα 1 φιαλίδιο του 1 ml αντισώµατα anti-t. gondii, το επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας Β, τα αντισώµατα των ιών ανθρώπινης ανοσολογικής ανεπάρκειας (HIV1-HIV2) και τα αντισώµατα του ιού της ηπατίτιδας C. < 0,01 % Thimerosal R4a Calibrator 6 Βαθµονοµητής 6 IU/ml: Ρυθµιστικό διάλυµα TRIS- 1 φιαλίδιο του 1 ml NaCl (ph 8 ± 0,2), ανθρώπινος ορός αντιδρών στα αντισώµατα anti-t. gondii και µη αντιδρών στο επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας Β (HBs Ag), τα αντισώµατα των ιών ανθρώπινης ανοσολογικής ανεπάρκειας (HIV1-HIV2), και στα αντισώµατα του ιού της ηπατίτιδας C (HCV), αλµπουµίνη βόειου ορού, γλυκερόλη, E 102 και E 122, συντηρητικό: < 0,01% Thimerosal και < 0,5 % Proclin 300. R4b Calibrator 60 Βαθµονοµητής 60 IU/ml: Ρυθµιστικό διάλυµα TRIS- 1 φιαλίδιο του 1 ml NaCl (ph 8 ± 0,2), ανθρώπινος ορός αντιδρών στα αντισώµατα anti-t. gondii και µη αντιδρών στο επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας Β (HBs Ag), στα αντισώµατα των ιών ανθρώπινης ανοσολογικής ανεπάρκειας (HIV1-HIV2), καθώς και στα αντισώµατα του ιού της ηπατίτιδας C (HCV), αλµπουµίνη βόειου ορού, γλυκερόλη, E 102 και E 122, συντηρητικό: < 0,01% Thimerosal και < 0,5 % Proclin 300. R4c Calibrator 240 Βαθµονοµητής 240 IU/ml: ρυθµιστικό διάλυµα TRIS- 1 φιαλίδιο του 1 ml NaCl (ph 8 ± 0,2), ανθρώπινος ορός αντιδρών στα αντισώµατα anti-t. gondii και µη αντιδρών στο επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδας Β (HBs Ag), στα αντισώµατα των ιών ανθρώπινης ανοσολογικής ανεπάρκειας (HIV1-HIV2), και στα αντισώµατα του ιού της ηπατίτιδας C (HCV), αλµπουµίνη βόειου ορού, γλυκερόλη, E 102 και E 122, συντηρητικό: < 0,01% Thimerosal και < 0,5% Proclin 300. R6 Conjugate (50x) Συζυγές: Μονοκλωνικό αντίσωµα µυϊκής προέλευσης 1 φιαλίδιο των 0,6 ml στις ανθρώπινες αλυσίδες γάµµα, συζευγµένο µε υπεροξειδάση από ραφανίδα, συµπυκνωµένο (50x). R7 Diluent Αραιωτικό δείγµατος ή συζυγούς: Ρυθµιστικό διάλυµα TRIS-NaCl (ph 7,7 ± 0,15), αλµπουµίνη βόειου ορού, 0,1% Tween 20 και ερυθρούν φαινόλης, συντηρητικό: < 0,01% thimerosal. 2 φιαλίδια των 80 ml

5 R8 TMB Substrate Buffer Ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος: ιάλυµα κιτρικού οξέος και οξικού νατρίου µε ph 4,0, το οποίο περιέχει 0,015% H2O2 και 4% DMSO Χρωµογόνο: ιάλυµα το οποίο περιέχει τετραµεθυλβενζινδίνη (TMB). 1 φιαλίδιο των 60 ml R9 Chromogen: TMB Solution 1 φιαλίδιο των 5 ml R10 Stopping Solution ιάλυµα διακοπής της αντίδρασης: ιάλυµα θειικού 1 φιαλίδιο των 28 ml οξέος 1N Κολλητικές ταινίες 4 5-ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ Προφυλάξεις Η αξιοπιστία των αποτελεσµάτων εξαρτάται από τη σωστή εφαρµογή των ακόλουθων Ορθών Εργαστηριακών Πρακτικών: Μην χρησιµοποιείτε αντιδραστήρια των οποίων η ηµεροµηνία λήξης έχει παρέλθει. Μην αναµιγνύετε αντιδραστήρια από διαφορετικές παρτίδες κατά τη διάρκεια µιας συγκεκριµένης δοκιµής. Σηµείωση: Η χρησιµοποίηση παρτίδων διαφορετικών από εκείνες που περιλαµβάνονται στο κιτ είναι εφικτή, υπό την προϋπόθεση ότι χρησιµοποιείται η ίδια παρτίδα κατά τη διάρκεια µιας συγκεκριµένης δοκιµής: διάλυµα πλύσης (R2, αναγνωριστικό σήµανσης : 10 x µε µπλε χρώµα), ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος (R8, αναγνωριστικό σήµανσης : ρυθµιστικό διάλυµα TMB µε µπλε χρώµα), χρωµογόνο (R9, αναγνωριστικό σήµανσης: διάλυµα TMB µε πράσινο χρώµα) και διάλυµα διακοπής της αντίδρασης (R10, αναγνωριστικό σήµανσης: 1N µε κόκκινο χρώµα). Τα αντιδραστήρια αυτά µπορούν να χρησιµοποιούνται µε ορισµένα εκ των άλλων προϊόντων µας. Για περισσότερες πληροφορίες, επικοινωνήστε µε την υπηρεσία τεχνικής υποστήριξης της εταιρίας µας. Πριν από τη χρήση, είναι απαραίτητο να αναµένετε 30 λεπτά µέχρι να σταθεροποιηθούν τα αντιδραστήρια στη θερµοκρασία δωµατίου. Προβείτε σε προσεκτική ανασύσταση των αντιδραστηρίων, αποφεύγοντας οποιαδήποτε µόλυνση. Μην διεξάγετε τη δοκιµή παρουσία σκόνης ή δραστικών ατµών (όξινων, αλκαλικών ατµών και ατµών αλδεΰδης) οι οποίοι θα µπορούσαν να αλλοιώσουν την ενζυµική δράση του συζυγούς. Χρησιµοποιείτε υαλικά καλά πλυµένα και ξεπλυµένα µε απιονισµένο νερό ή, κατά προτίµηση, υλικά µίας χρήσης. Μην αφήνετε τη µικροπλακέτα να στεγνώσει κατά το διάστηµα που µεσολαβεί µεταξύ του τερµατισµού της διαδικασίας πλύσης και της κατανοµής του αντιδραστηρίου. Η ενζυµική αντίδραση είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη σε µεταλλικά ιόντα. Για τον λόγο αυτό, δεν πρέπει να επιτρέπεται η επαφή κανενός µεταλλικού στοιχείου µε τα διάφορα διαλύµατα συζυγούς ή υποστρώµατος. Το διάλυµα ανάπτυξης (ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος + χρωµογόνο) πρέπει να είναι άχρωµο. Η εµφάνιση µπλε χρώµατος λίγα λεπτά µετά την ανασύσταση υποδεικνύει ότι το αντιδραστήριο δεν µπορεί να χρησιµοποιηθεί και ότι πρέπει να αντικατασταθεί. Η προετοιµασία του διαλύµατος αυτού µπορεί να διεξάγεται σε καθαρούς πλαστικούς δίσκους µιας χρήσης ή σε γυάλινα δοχεία τα οποία έχουν προπλυθεί µε HCl 1N, έχουν εκπλυθεί καλά µε απεσταγµένο νερό και έχουν στεγνωθεί. Αποθηκεύετε το διάλυµα σε σκοτεινό χώρο. Χρησιµοποιείτε νέο επιστόµιο πιπέτας για κάθε δείγµα. Η πλύση της µικροπλακέτας αποτελεί κρίσιµο στάδιο της διαδικασίας : τηρείτε τον συνιστώµενο αριθµό κύκλων πλύσης και βεβαιωθείτε ότι όλες οι κοιλότητες γεµίζονται πλήρως και, εν συνεχεία, εκκενώνονται πλήρως. Τυχόν ακατάλληλη πλύση µπορεί να οδηγήσει σε ανακριβή αποτελέσµατα. Ποτέ µην χρησιµοποιείτε το ίδιο δοχείο για να κατανείµετε το διάλυµα συζυγούς και το διάλυµα ανάπτυξης. Ελέγχετε τις πιπέτες και τον λοιπό εξοπλισµό για την ακρίβεια και τη σωστή λειτουργία τους. Μην αλλάζετε την διαδικασία του προσδιορισµού. Οδηγίες για την υγιεινή και την ασφάλεια Όλα τα αντιδραστήρια προορίζονται για διαγνωστική χρήση in vitro. Κατά τον χειρισµό των αντιδραστηρίων, φοράτε γάντια µιας χρήσης. Μην αναρροφάτε µε το στόµα.

6 Το υλικό ανθρώπινης προελεύσεως που χρησιµοποιείται για την προετοιµασία των αντιδραστηρίων έχει υποστεί έλεγχο και αποδείχτηκε µη αντιδρών στο επιφανειακό αντιγόνο της ηπατίτιδαςβ (HBS Ag), στα αντισώµατα του ιού της ηπατίτιδας C (HCV) και στους ιούς ανθρώπινης ανοσολογικής ανεπάρκειας (anti-hiv1 και anti-hiv2). εδοµένου ότι καµία µέθοδος δεν µπορεί να εγγυηθεί µε απόλυτη βεβαιότητα την απουσία µολυσµατικών παραγόντων, συνιστάται ο χειρισµός των αντιδραστηρίων ανθρώπινης προέλευσης ως ικανών να µεταδώσουν µολυσµατικές ασθένειες Οποιοδήποτε υλικό έρχεται σε απευθείας επαφή µε δείγµατα ή αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης, καθώς και µε διαλύµατα πλύσης, πρέπει να θεωρείται ως µολυσµατικό υλικό. Αποφεύγετε το πιτσίλισµα των δειγµάτων ή των διαλυµάτων που περιέχουν δείγµατα. Τυχόν λεκέδες από πιτσίλισµα πρέπει να ξεπλένονται µε λευκαντικό αραιωµένο κατά 10%. Εάν το µολυσµατικό ρευστό είναι οξύ, οι λεκέδες πρέπει αρχικά να αδρανοποιούνται µε διτανθρακικό νάτριο και στη συνέχεια να καθαρίζονται µε λευκαντικό και να στεγνώνονται µε απορροφητικό χαρτί. Το υλικό που χρησιµοποιείται για τον καθαρισµό πρέπει να απορρίπτεται σε δοχείο για µολυσµένα υπολείµµατα. Τα δείγµατα, τα αντιδραστήρια ανθρώπινης προέλευσης, καθώς και το µολυσµένο υλικό και τα µολυσµένα προϊόντα πρέπει να απορρίπτονται µετά από απολύµανση. - είτε µέσω εµβάπτισης σε λευκαντικό µε τελική συγκέντρωση υποχλωριώδους νατρίου 5% επί 30 λεπτά, - ή µέσω αποστείρωσης σε κλίβανο στους 121 C επί τουλάχιστον 2 ώρες. Η αποστείρωση σε κλίβανο στους 121 C επί τουλάχιστον µία ώρα αποτελεί την καλύτερη µέθοδο αδρανοποίησης του ιού HIV και του ιού της ηπατίτιδας Β. ΠΡΟΣΟΧΗ : ΜΗΝ ΕΙΣΑΓΕΤΕ ΣΤΟΝ ΚΛΙΒΑΝΟ ΑΠΟΣΤΕΙΡΩΣΗΣ ΙΑΛΥΜΑΤΑ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΥΠΟΧΛΩΡΙΩ ΕΣ ΝΑΤΡΙΟ ΠΡΟΣΟΧΗ : Ορισµένα αντιδραστήρια περιέχουν: * Proclin 300 < 0,5%: ΠΡΟΪΟΝ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΕΙ ΕΡΕΘΙΣΜΟ R43: Ενδέχεται να προκαλεί ευαισθητοποίηση δια της επαφής µε το δέρµα S28-37 : Μετά την επαφή µε το δέρµα, ξεπλύνετε αµέσως µε άφθονο νερό και σαπούνι. Φοράτε κατάλληλα γάντια. Τα χηµικά προϊόντα πρέπει να χρησιµοποιούνται και να απορρίπτονται σύµφωνα µε τις Ορθές Εργαστηριακές Πρακτικές. Αποφεύγετε οποιαδήποτε επαφή του ρυθµιστικού διαλύµατος υποστρώµατος, του χρωµογόνου και του διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης µε το δέρµα ή τον βλεννογόνο (κίνδυνος τοξικότητας, ερεθισµού και εγκαυµάτων) Το έντυπο σχετικά µε την ασφάλεια διατίθεται κατόπιν παραγγελίας. 6-ΑΠΑΙΤΟΥΜΕΝΟ ΑΛΛΑ ΜΗ ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΟ ΥΛΙΚΟ Περιστρεφόµενος αναδευτήρας. Συσκευή ανάγνωσης µικροπλακετών εξοπλισµένη µε φίλτρα 450 nm και 620 nm (*). Υδατόλουτρο ή ισοδύναµος επωαστήρας µικροπλακετών, θερµοστατικά ρυθµισµένος στους 37±1 C (*). οχείο απορριµµάτων για προϊόντα που ενέχουν βιολογικό κίνδυνο. Υποχλωριώδες νάτριο (λευκαντικό) και διτανθρακικό νάτριο Απεσταγµένο ή απιονισµένο νερό. Βαθµονοµηµένοι κύλινδροι χωρητικότητας 25, 50, 100 και 1000 ml. Γάντια µίας χρήσης από λάτεξ. Προστατευτικά γυαλιά. Απορροφητικό χαρτί. Αυτόµατες ή ηµιαυτόµατες, πιπέτες ή πολυπιπέτες µεταβλητού ή σταθερού όγκου για τη µέτρηση και την κατανοµή 10 έως 1000 µl και 1, 2 και 10 ml. Χειροκίνητη, ηµιαυτόµατη ή αυτόµατη συσκευή πλύσης µικροπλακετών (*).

7 οκιµαστικοί σωλήνες µιας χρήσης. (*) Για περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε τον εξοπλισµό που συνιστάται από το τεχνικό µας τµήµα, επικοινωνήστε µε την εταιρία µας. 7-ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΤΩΝ ΑΝΤΙ ΡΑΣΤΗΡΙΩΝ Το κιτ θα πρέπει να φυλάσσεται στους 2 έως 8 C έως την ηµεροµηνία λήξεως που αναγράφεται στη συσκευασία. Σηµείωση: πριν από τη χρήση, αφήνετε τα αντιδραστήρια να σταθεροποιούνται σε θερµοκρασία δωµατίου ( C). 1) Αντιδραστήρια έτοιµα προς χρήση Αντιδραστήριο 1 (R1): µικροπλακέτα Κάθε δίσκος, ο οποίος περιέχει 12 ταινίες των 8 αποσπώµενων κοιλοτήτων έκαστη, είναι τυλιγµένος σε σακούλα σφραγισµένη µε ταινία αλουµινίου. Κόψτε τη σακούλα µε ψαλίδι ή νυστέρι 0,5-1 cm επάνω από την ταινία. Επανατοποθετείστε αµέσως τις αχρησιµοποίητες ταινίες εντός της σακούλας. Σφραγίστε εκ νέου τη σακούλα µε προσοχή και αποθηκεύστε την εκ νέου σε θερµοκρασία 2 έως 8 C. Κατ αυτόν τον τρόπο οι ταινίες παραµένουν σταθερές για έναν µήνα. Αντιδραστήριο 3 (R3), Αντιδραστήριο 4a (R4a), Αντιδραστήριο 4b (R4b), Αντιδραστήριο 4c (R4c), Αντιδραστήριο 10 (R10): Τα αντιδραστήρια που φυλάσσονται στους 2 έως 8 C παραµένουν σταθερά µέχρι την ηµεροµηνία λήξης που αναγράφεται στην ετικέτα (ακόµη και αν έχουν ανοιχτεί). 2) Αντιδραστήρια προς ανασύσταση Αντιδραστήριο 2 (R2): διάλυµα πλύσης συµπυκνωµένο 10x Αραιώστε σε αναλογία 1:10 µε απεσταγµένο νερό προκειµένου να επιτύχετε διάλυµα έτοιµο προς χρήση (R2d). Στην περίπτωση πλύσης µε το χέρι, προετοιµάστε 350 ml για µία πλακέτα των 12 ταινιών. Μετά την αραίωση, µπορείτε να αποθηκεύετε στους 2 έως 8 C για διάστηµα 2 εβδοµάδων. Το συµπυκνωµένο διάλυµα µπορεί να φυλάσσεται στους 2 έως 25 C. ιάλυµα συζυγούς: αντιδραστήριο 6 (R6) + αντιδραστήριο 7 (R7) Για την παρασκευή του διαλύµατος συζυγούς (R6d) για µία µικροπλακέτα, διαλύστε 0,5 ml Συµπυκνώµατος Συζυγούς 50x σε 25 ml Αραιωτικού (R7). Αναµίξτε καλά. ιαιρέστε τους όγκους αυτούς δια 10 προκειµένου να επιτύχετε τον όγκο που απαιτείται για µία ταινία των 8 κοιλοτήτων. Χρησιµοποιείτε το διάλυµα συζυγούς (R6d) εντός 60 λεπτών από την παρασκευή του. ιάλυµα ενζυµικής ανάπτυξης: αντιδραστήριο 8 (R8) + αντιδραστήριο 9 (R9) Αραιώστε σε αναλογία 1:11 το χρωµογόνο (R9) στο ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος (R8) (π.χ.: 1 ml αντιδραστηρίου R ml αντιδραστηρίου R8). Μετά την αραίωση, αποθηκεύετε τα αντιδραστήρια σε σκοτεινό χώρο για 6 ώρες σε θερµοκρασία δωµατίου (18 έως 30 C). 8-ΣΥΛΛΟΓΗ, ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΚΑΙ ΑΠΟΘΗΚΕΥΣΗ ΕΙΓΜΑΤΩΝ 1. Συνιστώµενους τύπους δειγµάτων αποτελούν ο ορός ή το πλάσµα (EDTA, κιτρικό οξύ, ηπαρίνη). 2. Για τον χειρισµό, την επεξεργασία και την αποθήκευση των δειγµάτων αίµατος, τηρείτε τις ακόλουθες συστάσεις: Συλλέγετε όλα τα δείγµατα αίµατος λαµβάνοντας τις συνήθεις προφυλάξεις φλεβοπαρακέντησης. Όσον αφορά τον ορό, αφήνετε τα δείγµατα να πήξουν πλήρως προ της φυγοκέντρησης. ιατηρείτε πάντα τους σωλήνες κλεισµένους µε πώµα. Μετά τη φυγοκέντρηση, διαχωρίστε τον ορό ή το πλάσµα από το πήγµα ή τα ερυθροκύτταρα σε σωλήνα αποθήκευσης ο οποίος είναι καλά κλεισµένος µε πώµα. Η αποθήκευση των δειγµάτων στους 2 έως 8 C είναι εφικτή, εφόσον ο προσδιορισµός διεξάγεται εντός 7 ηµερών. Σε περίπτωση που ο προσδιορισµός δεν έχει ολοκληρωθεί εντός 7 ηµερών, ή για την αποστολή των δειγµάτων, καταψύξτε στους 20 C ή σε χαµηλότερη θερµοκρασία. Αποψύξτε τα δείγµατα µόνο τρεις φορέs. Τα δείγµατα που είναι κατεψυγµένα πρέπει να αναµειγνύονται καλά µετά την απόψυξη που προηγείται της δοκιµής. 3. είγµατα τα οποία περιέχουν έως 90 g/l αλµπουµίνης, 100 mg/l χολυρεθρίνης, λιπαιµικά δείγµατα τα οποία περιέχουν έως και 36 g/l τριελαΐνης (τριγλυκερίδια), και δείγµατα τα οποία έχουν υποστεί αιµόλυση

8 και τα οποία περιέχουν έως και 10 g/l αιµοσφαιρίνης δεν επηρεάζουν τα αποτελέσµατα. 4. Μην θερµαίνετε τα δείγµατα. 9- ΙΑ ΙΚΑΣΙΑ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ Ακολουθείστε πιστά την προτεινόµενη διαδικασία. Για την επικύρωση των αποτελεσµάτων της δοκιµής, χρησιµοποιείτε βαθµονοµητές σε κάθε σειρά προσδιορισµών. Τηρείτε τις Ορθές Εργαστηριακές Πρακτικές. 1. Καθορίστε προσεκτικά το σχέδιο κατανοµής των δειγµάτων και της διαδικασίας ταυτοποίησης. 2. Προετοιµάστε το αραιωµένο διάλυµα πλύσης (R2d) (Βλ. ενότητα 7) 3. Αφαιρέστε τη θήκη των δίσκων και τις ταινίες (R1) από το προστατευτικό σακουλάκι. 4. Πλύνετε τις ταινίες των µικροπλακετών µία φορά χρησιµοποιώντας το διάλυµα πλύσης (R2d). Αναποδογυρίστε την µικροπλακέτα και χτυπήστε την ελαφρά επάνω σε απορροφητικό χαρτί προκειµένου να αποµακρύνετε το εναποµείναν υγρό. 5. Αραιώστε τους δοκιµαστικούς ορούς προσθέτοντας 10 µl δείγµατος σε 1 ml Αραιωτικού (R7). Οι βαθµονοµητές 0, 6, 60 και 240 IU/ml (R3, R4a, R4b, και R4c) αραιώνονται κατά τρόπο ώστε να προκύπτει αραίωση 1/101. Για την αραίωση των δειγµάτων χρησιµοποιείτε περιστρεφόµενο αναδευτήρα. 6. Για χειροκίνητη διεξαγωγή της δοκιµής, προσθέστε στις κοιλότητες 200 µl αραιωµένων βαθµονοµητών και δειγµάτων δοκιµής κατά τον ακόλουθο τρόπο: Κοιλότητα 1Α : 200 µl Βαθµονοµητή 0 IU/ml (R3) αραιωµένου σε αναλογία 1/101. Κοιλότητα 1Β : 200 µl Βαθµονοµητή 6 IU/ml (R4a) αραιωµένου σε αναλογία 1/101. Κοιλότητα 1C : 200 µl Βαθµονοµητή 60 IU/ml (R4b) αραιωµένου σε αναλογία 1/101. Κοιλότητα 1D : 200 µl Βαθµονοµητή 240 IU/ml (R4c) αραιωµένου σε αναλογία 1/101. Κοιλότητες 1E, 1F, 1G, κ.λπ. 200 µl δείγµατος αραιωµένου σε αναλογία 1/ Καλύψτε, ει δυνατόν, τη µικροπλακέτα µε κολλητική ταινία, πιέζοντάς την καλά σε ολόκληρη την επιφάνεια της µικροπλακέτας προκειµένου να διασφαλίσετε στεγανή επικάλυψη. Επωάστε, εν συνεχεία, τη µικροπλακέτα σε υδατόλουτρο ελεγχόµενο µε θερµοστάτη ή σε επωαστήρα µικροπλακετών στους 37±1 C για 1 ώρα ± 5 λεπτά. 8. Προετοιµάστε διάλυµα εργασίας συζυγούς (R6d) 15 λεπτά προ του τερµατισµού της πρώτης περιόδου επώασης. Για µία µικροπλακέτα, αραιώστε 0,5 ml Συµπυκνώµατος Συζυγούς 50x (R6) σε 25 ml Αραιωτικού (R7). Αναµίξτε καλά. (βλ. ενότητα 7) 9. Αφαιρέστε την κολλητική ταινία. Αναρροφήστε τα περιεχόµενα όλων των κοιλοτήτων σε δοχείο απορριµµάτων που προβλέπεται για προϊόντα που ενέχουν βιολογικό κίνδυνο (περιέχουν υποχλωριώδες νάτριο). Πλύνετε τις µικροπλακέτες 3 φορές χρησιµοποιώντας διάλυµα πλύσης (R2d). Αναποδογυρίστε την µικροπλακέτα και χτυπήστε την ελαφρά επάνω σε απορροφητικό χαρτί προκειµένου να αποµακρύνετε το εναποµείναν υγρό (βλ. ενότητα 10). 10. Κατανείµετε αµέσως 200 µl διαλύµατος συζυγούς (R6d) σε όλες τις κοιλότητες. Το διάλυµα πρέπει να ανακινείται ελαφρώς πριν από τη χρήση. 11. Καλύψτε, ει δυνατόν, τη µικροπλακέτα µε κολλητική ταινία, πιέζοντάς την καλά σε ολόκληρη την επιφάνεια της µικροπλακέτας προκειµένου να διασφαλίσετε στεγανή επικάλυψη. Επωάστε, εν συνεχεία, τη µικροπλακέτα σε υδατόλουτρο ελεγχόµενο µε θερµοστάτη ή σε επωαστήρα µικροπλακετών στους 37±1 C για 1 ώρα ± 5 λεπτά. 12. Αφαιρέστε την κολλητική ταινία, εκκενώστε όλες τις κοιλότητες µέσω αναρρόφησης και πλύνετε 4 φορές όπως περιγράφεται παραπάνω. Αναποδογυρίστε την µικροπλακέτα και χτυπήστε την ελαφρά επάνω σε απορροφητικό χαρτί προκειµένου να αποµακρύνετε το εναποµείναν υγρό Κατανείµετε γρήγορα και αµέσως σε κάθε κοιλότητα 200 µl οµογενοποιηµένου διαλύµατος ενζυµικής ανάπτυξης (R8 + R9). Αφήστε την αντίδραση να εξελιχθεί στο σκοτάδι για 30 λεπτά, σε θερµοκρασία δωµατίου (18 έως 30 C). Μην χρησιµοποιείτε κολλητική ταινία κατά τη διάρκεια αυτής της επώασης. 14. Προσθέστε 100 µl διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης (R10) τηρώντας την ακολουθία και τον ρυθµό κατανοµής που εφαρµόστηκαν για το διάλυµα ανάπτυξης. 15. Σκουπίστε προσεκτικά τη βάση της µικροπλακέτας. Προβείτε σε ανάγνωση της οπτικής πυκνότητας στα 450/620 nm, χρησιµοποιώντας συσκευή ανάγνωσης πλακέτας, εντός 30 λεπτών από τη διακοπή

9 της αντίδρασης (οι ταινίες πρέπει πάντα να διατηρούνται µακριά από το φως προ της ανάγνωσης). 16. Ελέγξατε εάν σε όλα τα αποτελέσµατα, οι τιµές ανάγνωσης είναι σύµφωνες προς το σχέδιο της κατανοµής πλακετών και δειγµάτων και το σχέδιο ταυτοποίησης. 10-ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ 1) Αναλυτικά στοιχεία βαθµονόµησης Η ύπαρξη και η ποσότητα, στο δείγµα δοκιµής, αντισωµάτων IgG για το T.gondii προσδιορίζεται µέσω σύγκρισης της οπτικής πυκνότητας (OD) του δείγµατος µε ένα πρότυπο εύρος τιµών. Οι βαθµονοµητές 6, 60, 240 UI/ml που περιέχονται στο κιτ διακριβώνονται βάσει του πρότυπου ορού (TOX M 185) του Π.Ο.Υ. Ενδέχεται, ωστόσο, να παρατηρηθούν αποκλίσεις µεταξύ των τίτλων για τον ίδιο ορό, όταν αυτός υποβάλλεται σε δοκιµή µέσω διαφορετικών ορρολογικών τεχνικών. Οι αποκλίσεις αυτές οφείλονται στο γεγονός ότι τα T. gondii που χρησιµοποιούνται στις διάφορες αυτές τεχνικές περιέχουν το διαλυτό αντιγόνο της µεµβράνης σε ποικίλες ποσότητες. 2) Έλεγχος Ποιότητας Για κάθε δοκιµή, συµπεριλάβετε όλους τους βαθµονοµητές. Για την επικύρωση του προσδιορισµού πρέπει να πληρούνται τα ακόλουθα κριτήρια. Τιµές οπτικής πυκνότητας: - OD R3 0,200 - OD R4c 1,000 Λόγος: OD R4a / OD R3 2 Εάν δεν πληρούνται οι προδιαγραφές, η δοκιµή πρέπει να επαναλαµβάνεται. 3) Χάραξη της πρότυπης καµπύλης α) Σχεδιασµός της πρότυπης καµπύλης Για αναγωγή των δεδοµένων µε το χέρι, χρησιµοποιήστε χιλιοστοµετρικό χαρτί και αναπαραστήσετε τις τιµές ανάγνωσης της οπτικής πυκνότητας των βαθµονοµητών (R3, R4a, R4b, R4c) στον κατακόρυφο άξονα (y). Αναπαραστήστε την αντίστοιχη συγκέντρωση σε IU/ml στον οριζόντιο άξονα (x). Ενώστε τα τέσσερα σηµεία για να χαράξετε την καµπύλη. Όσον αφορά την αυτόµατη αναγωγή των δεδοµένων, για τη σχεδίαση καµπύλης βάσει των τιµών ανάγνωσης οπτικής πυκνότητας που προέκυψαν για τους βαθµονοµητές χρησιµοποιείται συνάρτηση εξοµάλυνσης spline. β) Υπολογισµός της συγκέντρωσης σε IU/ml Εάν η τιµή της οπτικής πυκνότητας του δείγµατος δοκιµής περιλαµβάνεται στο εύρος τιµών µεταξύ OD R4a and OD R4c, βρείτε την τιµή που αντιστοιχεί στη οπτική πυκνότητα του δείγµατος στον άξονα των y και χαράξτε µια γραµµή οριζόντια ως προς την πρότυπη καµπύλη. Στο σηµείο τοµής µε την πρότυπη καµπύλη, χαράξτε µια γραµµή κάθετη ως προς τον άξονα των x. Προβείτε σε ανάγνωση της συγκέντρωσης IU/ml στο σηµείο τοµής µε τον άξονα των x. Σηµείωση: Εάν η οπτική πυκνότητα ενός δείγµατος αραιωµένου σε αναλογία 1/101 είναι > OD R4c, τότε το συγκεκριµένο δείγµα πρέπει να αραιωθεί σε αναλογία 1/1010 σε αραιωτικό R7 και να

10 επαναληφθεί η δοκιµή. Εν συνεχεία, οι σχετικές τιµές IU/ml πρέπει να πολλαπλασιάζονται µε το 10. 4) Ερµηνεία των αποτελεσµάτων Η ανίχνευση των αντισωµάτων IgG anti-t.gondii µε το Platelia Toxo IgG TMB παρέχει στους ασθενείς την εικόνα της ανοσολογικής τους κατάστασης. Τίτλος < 6 IU/mL Μη σηµαντικά επίπεδα αντισωµάτων µε την τεχνική αυτή = απουσία ανοσίας. 6 IU/mL Τίτλος 9 IU/mL Μη σηµαντικά επίπεδα αντισωµάτων µε την τεχνική αυτή = Τα αποτελέσµατα ενός µεµονωµένου δείγµατος ορού δεν παρέχουν επαρκή στοιχεία για τον προσδιορισµό της ανοσολογικής κατάστασης του ασθενή έναντι του T. gondii. Σύµφωνα µε τις συστάσεις που ισχύουν για τη Γαλλία, ένα δεύτερο δείγµα πρέπει να υποβάλλεται σε νέες δοκιµές οι οποίες θα χρησιµοποιούν δύο διαφορετικές τεχνικές. 9 IU/mL < Τίτλος 240 IU/mL Σηµαντικά επίπεδα αντισωµάτων = µακροχρόνια ανοσία ή πρώιµο στάδιο ορροµετατροπής. Τίτλος < 240 IU/mL Υψηλά επίπεδα αντισωµάτων = πρόσφατη ορροµετατροπή ή παρατεταµένης διάρκειας υψηλού επιπέδου ανοσίας, σε ορισµένα υποκείµενα. Περιορισµοί της διαδικασίας Η διάγνωση της πρόσφατης µόλυνσης από το παράσιτο δεν θεωρείται στοιχειοθετηµένη παρά µόνο εφόσον βασίζεται σε έναν συνδυασµό κλινικών και ορρολογικών δεδοµένων. Τα αποτελέσµατα ενός µεµονωµένου δείγµατος ορού δεν στοιχειοθετούν επαρκώς τη διάγνωση πρόσφατης µόλυνσης. Μόνο η σηµαντική αύξηση του τίτλου των αντισωµάτων anti-t. gondii IgG σε δύο δείγµατα ορού, η οποία προέκυψε κατά το ελάχιστο χρονικό διάστηµα τριών εβδοµάδων στο πλαίσιο της ίδιας δοκιµής, επιτρέπει τη διάγνωση πρόσφατης µόλυνσης, εκλαµβανόµενη, ωστόσο, ως ένδειξη πρόσφατης µόλυνσης από το παράσιτο. Επίσης, η παρουσία του αντισώµατος IgM για το T. gondii πρέπει να εκλαµβάνεται ως τµήµα της ορρολογικής παρακολούθησης των ατόµων για τα οποία εικάζεται ότι έχουν προσβληθεί από το T. gondii, δεδοµένου ότι η παρουσία του αντισώµατος anti-t. gondii IgG ενδέχεται να έπεται ελαφρώς της παρουσίας του αντισώµατος anti-t. gondii IgM. 5) Οδηγός αντιµετώπισης προβληµάτων Η µη επικύρωση ή η µη επαναληψιµότητα των αντιδράσεων οφείλεται συχνά σε: Ανεπαρκή πλύση της µικροπλακέτας, Μόλυνση των αρνητικών δειγµάτων µε ορό ή πλάσµα µε υψηλό τίτλο αντισωµάτων, Μόλυνση του διαλύµατος ανάπτυξης µε οξειδωτικούς παράγοντες (λευκαντικό, µεταλλικά ιόντα ), Μόλυνση του διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης. 6) Παράδειγµα υπολογισµού Σηµείωση: Τα ακόλουθα δεδοµένα παρατίθενται ενδεικτικά και δεν θα πρέπει να χρησιµοποιούνται αντί των αποτελεσµάτων που έλαβε ο χρήστης. Αποτελέσµατα Περιεχόµενα Οπτική Πυκνότητα Συγκέντρωση (IU/ml) κοιλοτήτων (450/620 nm) R3 (αρνητικό) 0,121 0 R4a 0,615 6 R4b 1, R4c 2, Ορός 1 (αραίωση 1/101) 0,108 Αρνητικό Ορός 2 (αραίωση 1/101) 0,675 7 IU/ml Ορός 3 (αραίωση 1/101) 0, IU/ml Ορός 4 (αραίωση 1/101) 2, IU/ml Ορός 5 (αραίωση 1/101) 1, IU/ml *Για αραίωση σε αναλογία 1/1010, τελική συγκέντρωση = IU/ml x 10

11 Επικύρωση της δοκιµής - Τιµές οπτικής πυκνότητας - Λόγος. - OD R3 0,200 - OD R4a / OD R3 2 - OD R4c 1, ΕΠΙ ΟΣΕΙΣ ΚΑΙ ΟΡΙΑ ΤΗΣ ΟΚΙΜΗΣ ιεξήχθησαν µελέτες επί δειγµάτων τα οποία συλλέχθηκαν σε στεγνούς σωλήνες, σε σωλήνες µε διαχωριστή ορού, σε σωλήνες µε επιταχυντή πήξης ή σε σωλήνες µε διαφορετικά αντιπηκτικά (EDTA, Ηπαρίνη και κιτρικό οξύ). 1.Επιδόσεις Τα χαρακτηριστικά των επιδόσεων του PlateliaToxo IgG TMB, τα οποία παρατίθενται συνοπτικά στη συνέχεια, καθορίστηκαν χρησιµοποιώντας πρόσφατα δείγµατα ορού που ελήφθησαν από έγκυες γυναίκες, ανοσοκατεσταλµένους ασθενείς ή φυσιολογικούς µη κλινήρεις αιµοδότες και κατεψυγµένα δείγµατα ορού τα οποία είναι γνωστά ως θετικά ή αρνητικά. Συγκριτικές µελέτες Σύνολο 787 τυχαίων δειγµάτων από έγκυες γυναίκες υπεβλήθη σε προσδιορισµό µε το Platelia TM Toxo IgG TMB καθώς και µία ακόµη δοκιµή ενζυµικού ανοσοπροσδιορισµού (ΕΙΑ) η οποία διατίθεται στο εµπόριο. Για τη διευθέτηση των αποκλινόντων αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε δοκιµή άµεσης συγκόλλησης. Τα αµφισβητούµενα αποτελέσµατα από 23 δείγµατα δεν συµπεριλήφθηκαν στους παρακάτω υπολογισµούς σχετικής ειδικότητας, σχετικής ευαισθησίας και σχετικής συµφωνίας. Platelia TM Toxo IgG TMB Αποτέλεσµα Αρνητικό Θετικό Σύνολο Άλλη δοκιµή ενζυµικού Αρνητικό ανοσοπροσδιορισµού Θετικό Σύνολο Αποτελέσµατα της προοπτικής µελέτης (κέντρο δοκιµών 1) Σχετική ειδικότητα Σχετική ευαισθησία Σχετική συµφωνία 488/ % (99,0 100,0) 271/276 98,2% (95,6 99,3) 759/764 99,3% (98,8 99,9) Μελέτες ειδικότητας Η ειδικότητα του προσδιορισµού µε το Platelia TM Toxo IgG TMB αξιολογήθηκε σε 2 ανεξάρτητα κέντρα δοκιµών. Για τον χαρακτηρισµό του ορού χρησιµοποιήθηκαν τεχνικές ανοσοενζυµικού προσδιορισµού οι οποίες διατίθενται στο εµπόριο. Η ειδικότητα του προσδιορισµού προσδιορίστηκε βάσει αυτού του χαρακτηρισµού. Για τη διευθέτηση των αποκλινόντων αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε δοκιµή άµεσης συγκόλλησης. Τα αµφισβητούµενα αποτελέσµατα δεν συµπεριλήφθηκαν στους παρακάτω υπολογισµούς ειδικότητας: - κέντρο δοκιµών 1 : 99,8% (403/404) - κέντρο δοκιµών 2 : 100% (488/488) Σύνολο: 99,9% (891/892) Μελέτες ευαισθησίας : Η ευαισθησία του προσδιορισµού µε το Platelia TM Toxo IgG TMB αξιολογήθηκε σε 2 ανεξάρτητα κέντρα δοκιµών. Για τον χαρακτηρισµό του ορού χρησιµοποιήθηκαν τεχνικές ανοσοενζυµικού προσδιορισµού οι

12 οποίες διατίθενται στο εµπόριο. Η ευαισθησία του προσδιορισµού προσδιορίστηκε βάσει αυτού του χαρακτηρισµού. Για τη διευθέτηση των αποκλινόντων αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε δοκιµή άµεσης συγκόλλησης. Τα αµφισβητούµενα αποτελέσµατα δεν συµπεριλήφθηκαν στους παρακάτω υπολογισµούς ευαισθησία: - Κέντρο δοκιµών 1 : 100 % (196/196) - Κέντρο δοκιµών 2 : 98,2% (271/276) Σύνολο: 98,9% (467/472) Πάνελ ορροµετατροπής (κέντρα δοκιµών 1 και 2) ή µεταµόλυνσης (κέντρο δοκιµών 1) µε: 84 δείγµατα ορού από 33 έγκυες γυναίκες (κέντρο δοκιµών 1), 48 δείγµατα ορού από 14 έγκυες γυναίκες (κέντρο δοκιµών 2), υπεβλήθησαν σε δοκιµή µε το Platelia TM Toxo IgG TMB. Για τον χαρακτηρισµό του ορού χρησιµοποιήθηκαν τεχνικές ανοσοενζυµικού προσδιορισµού οι οποίες διατίθενται στο εµπόριο. Για τη διευθέτηση των αποκλινόντων αποτελεσµάτων χρησιµοποιήθηκε δοκιµή άµεσης συγκόλλησης. Στο κέντρο δοκιµών 1, ο προσδιορισµός µε το Platelia TM Toxo IgG TMB έδωσε, σε 5 περιπτώσεις, θετικό αποτέλεσµα νωρίτερα απ ό,τι η άλλη δοκιµή ενζυµικού ανοσοπροσδιορισµού. Στο κέντρο δοκιµών 2, η άλλη δοκιµή ενζυµικού ανοσοπροσδιορισµού, η οποία ήταν διαφορετική από την προηγούµενη, έδωσε σε 6 περιπτώσεις, θετικό αποτέλεσµα νωρίτερα απ ό,τι το Platelia TM Toxo IgG TMB. Επιπολασµός Ο επιπολασµός της θετικότητας του πληθυσµού στα αντισώµατα anti-t.gondii IgG ποικίλλει από χώρα σε χώρα. Στην περιοχή του Παρισιού (Γαλλία), το ποσοστό επιπολασµού της θετικότητας ενός πληθυσµού αιµοδοτών ο οποίος θεωρείται υγιής ανέρχεται σε 67,6%. 2.Ακρίβεια Ιστόγραµµα Κατανοµής ειγµάτων Τεχνική ΕΙΑ Συχνότητα Τίτλος IU/ml Επαναληψιµότητα στο πλαίσιο του ίδιου προσδιορισµού: 3 θετικά και 1 αρνητικό δείγµα προσδιορίστηκαν 30 φορές υπό την ίδια δοκιµή. είγµα Αρνητικό Θετικό 1 Θετικό 2 Θετικό 3 Λόγος Τίτλος IU/ml Μέση τιµή 0, Τυπική Απόκλιση 0,02 0,83 1,35 9,53 Συντελεστής µεταβολής 6,29 7,57 3,55 8,64

13 Αναπαραγωγιµότητα µεταξύ προσδιορισµών: 3 θετικά και 1 αρνητικό δείγµα υποβλήθηκαν από 2 τεχνικούς σε προσδιορισµό εις τριπλούν, κατά τη διάρκεια 5 διαφορετικών ηµερών. είγµα Αρνητικό Θετικό 1 Θετικό 2 Θετικό 3 Λόγος Τίτλος IU/ml Μέση τιµή 0,22 11,8 39,2 127,5 Τυπική Απόκλιση 0,08 1,65 5,14 14,13 Συντελεστής µεταβολής 34,11 13,9 13,10 11,08 3.Σχετικές παρεµβολές ιεξήχθησαν µελέτες επί 141 δειγµάτων µε χαρακτηριστικά τα οποία θα µπορούσαν να προκαλέσουν δυνητικά µη ειδικές αντιδράσεις. Ειδικότητα=99,29% (140/141) είγµα Αντιδρών Παρατήρηση Θετικό για IgG του CMV (Κυτταροµεγαλοϊός) 5 1 Αρνητική δεύτερη δοκιµή IgΜ του CMV 5 0 IgM του VZV (ιός της ανεµοβλογιάς-έρπητα ζωστήρα) 10 0 IgG του VZV 9 0 IgG του ιού της παρωτίτιδας 7 0 IgΜ του ιού της παρωτίτιδας 3 0 IgG του ιού της ιλαράς (Rubeola) 7 0 IgΜ του ιού της ιλαράς 7 0 IgG του ιού EBV 8 0 IgΜ του ιού EBV 9 0 IgG του ιού της ερυθράς (Rubella) 5 0 IgΜ του ιού της ερυθράς 5 0 IgG του HSV (ιός του απλού έρπητα) 5 0 IgΜ του HSV 5 0 ιός HIV 15 0 Μυέλωµα 8 0 RF (ρευµατοειδής παράγοντας) 15 0 ANA (αντιπυρηνικό αντίσωµα) 10 0 HAMA 3 0 Σύνολο ΠΑΡΑΠΟΜΠΕΣ 1. ANDERSON S.E. and REMINGTON J.S. : The diagnosis of toxoplasmosis. Southern Med. J. 1975; 68, BELANGER F., DEROUIN F., GRANGEOT-KEROS L., MEYER L. and the HEMOCO and SEROCO Study Groups : Incidence and risk factors of toxoplasmosis in a cohort of Human immunodeficiency virus-infected patients ( ). Clinical Infectious Diseases 1999; 28, BULLOCK S.L., and WALLS, K.W. : Evaluation of some of the parameters of the enzyme-linked immunospecific assay. J. Inf. Dis. (Suppl.) 136: 2, S279-S DAFFOS, FORESTIER F., CAPELLA-PAVLOVSKY M., THULLIEZ P., AUFRANT C., VALENTI D. and COX L. : Prenatal management of 746 pregnancies at risk for congenital toxoplasmosis. New Eng. J. Med. 1988; 318, DECOSTER A., DARCY F., CARON A., VINATIER D., HOUZE DE L AULNOIS D., VITTU G., NIEL G., HEYER F., LECOLIER B., DELCROIX M., MONNIER J.C., DUHAMEL M. and CAPRON A. : Anti- P30 IgA antibodies as prenatal markers of congenital Toxoplasma infection. 1992; 87,

14 6. DEROUIN F., LEPORT C., PUEYO S., MORLAT P., LETRILLART B., CHENE G., ECOBICHON J.L., LUFT B., AUBERTIN J., HAFNER R., VILDE J.L., SALAMON R. and ANRS 005/ACTG 154 Trial Group Predictive value of Toxoplasma gondii antibody titres on the occurrence of toxoplasmic encephalitis in HIV-infected patients. AIDS 1996; 10, DESMONTS G., COUVREUR J., THULLIEZ Ph., SAINT JOIGNY G. and COLIN J. : Sérodiagnostic de la Toxoplasmose, des mιthodes simples, pour des questions prιcises. Le concours mdical 1985; , DUBEY J.P. and BEATTIE C.P. : Toxoplasmosis of animal and man. CRC Press (1988) 9. JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B., MELBY K.K., KAPPERUD G., WHITELAW A., ESKILD A. and ENG J. : Incidence of Toxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A. and STRAY-PEDERSEN B. : Development of specific immunoglobulins G, M, and A followingtoxoplasma gondii infection in pregnant women in Norway and pregnancy outcome for infected women. J. Clin. Microbiol. 1998; 36, JENUM P.A., STRAY-PEDERSEN B. and GUNDERSEN A.G. : Improved Diagnosis of primary Toxoplasma gondii infection in early pregnancy by determination of anti-toxoplasma immunoglobulin G avidity. J. Clin. Microbiol ; 35, LAPPALAINEN M., KOSKELA P., KOSKINIEMI M., AMMALA P., HILESMAA V., TERAMO K., RAIVIO K.O., REMINGTON J.S., HEDMAN K.: Toxoplasmosis acquired during pregnancy: improved serodiagnosis based on avidity of IgG. J. Infect. Dis. 1993; 41, LECOLIER B. and PUCHEU : Usefulness of IgG avidity analysis for the diagnosis of toxoplasmosis. Path. Biol. 1993; 42, LEBECH M., JOYNSON D.H.M., SEITZ H.M. THULLIEZ P., GILBERT R.E., DUTTON G.N., OVLISEN B. and PETERSEN E., : Classification system and case definition of Toxoplasma gondii infection in immunocompetent pregnant women and their congenitally infected offspring. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, LUFT B.J. and REMINGTON J.S. : Toxoplasmic encephalitis. Clinical Infectious Diseases 1992; 15, NAESSENS A., HEUNINCKX W., FOULON W. and LAUWERS S. : Evaluation of seven commercially available enzyme immunoassays for immunoglobulin G and M antibody detection of Toxoplasma gondii. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, PETITHORY J.C., REITER-OWONA I., BERTHELOT F., MILGRAM M., DE LOYE J. and PETERSEN E. : Performance of European laboratories testing serum samples for Toxoplasma gondii. Eur. J. Microbiol. Infect. Dis. 1996; 15, REMINGTON J.S. and DESMONTS G. : Toxoplasmosis in infectious disease of the fetus and newborn infant. JS Remington and JO Klein, eds. WB Saunders Co., Philadelphia 1976; SABIN A.B., and FELDMAN H.A. : Dyes as microchemical indicators of a new immunity phenomenon affecting a protozoan parasite (Toxoplasma), Science 1948; 108: SANTORO F., AFCHAIN D., PIERCE J.R., CESBRON J.Y., OVLAQUE G. and CAPRON A. : Serodiagnosis of Toxoplasma infection using a purified parasite protein P30. Clin. Exp. Immunol. 1885; 62, SHARMA S.D., MULLENAX J., ARAUJO F.G., ERLICH H.A. and REMINGTON J.S. : Western Blot analysis of the antigens of Toxoplasma gondii recognized by human IgM and IgG antibodies. J. Immunol. 1983; 131: SULHANIAN A., NUGUES C., GARIN J.F., PELLOUX H., LONGUET P., SLIZEWICZ B. and DEROUIN F. : Serodiagnosis of toxoplasmosis in patients with acquired or reactivating toxoplasmosis and analysis of the specific IgA antibody response by ELISA, agglutination and immunoblotting. Immunol. Infect. Dis. 1993; 3, SULZER A.J. and HALL EC. : Indirect fluorescent antibody tests for parasitic diseases : IV Statistical study of variation in the indirect fluorescent antibody (IFA) test for toxoplasmosis. Amer. J. Epidemiol. 1967; 86: WILSON M., REMINGTON J.S., CLAVET C., VARNEY G., PRESS C., WARE D. and the FDA TOXOPLASMOSIS AD HOC WORKING group : Evaluation of six commercial kits for detection of human immunoglobulin M. antibodies to Toxoplasma gondii. J. Clin. Microbiol. 1997; 35, WONG S.Y. and REMINGTON J.S. : Biology of Toxoplasma gondii. AIDS 1993; 7,

15 ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΤΗΣ ΙΑ ΙΚΑΣΙΑΣ ΠΡΟΣ ΙΟΡΙΣΜΟΥ 1. Ρυθµίστε τον θερµοστάτη του επωαστήρα στους 37±1 C. 2. Αραιώστε σε αναλογία 1:11 το χρωµογόνο R9 στο ρυθµιστικό διάλυµα υποστρώµατος R8 (διάλυµα ενζυµικής ανάπτυξης). 3. Αραιώστε σε απεσταγµένο νερό, µε αναλογία 1:10, το συµπυκνωµένο 10x διάλυµα πλύσης R2 4. Πλύνετε 1 φορά όλες τις κοιλότητες µε αραιωµένο διάλυµα πλύσης (R2d). 5. Αραιώστε, σε αναλογία 1:101, τους βαθµονοµητές και τα δείγµατα στο R7. 6. Κατανείµετε στις κοιλότητες 200 µl αραιωµένων βαθµονοµητών και δειγµάτων κατά τον ακόλουθο τρόπο A R3 S5 B R4a S6 C R4b S7 D R4c S8 E S1 S9 F S2 S10 G S3 S11 H S4 S12 7. Επωάστε για 1 ώρα στους 37 C. 8. Προετοιµάστε το ιάλυµα Συζυγούς (R6 +R7) 9. Αναρροφήστε και εν συνεχεία πλύνετε 3 φορές µε αραιωµένο διάλυµα πλύσης (R2d). 10.Κατανείµετε 200 µl ιαλύµατος Συζυγούς σε όλες τις κοιλότητες. 11.Επωάστε για 1 ώρα στους 37 C. 12.Αναρροφήστε και εν συνεχεία πλύνετε 4 φορές µε αραιωµένο διάλυµα πλύσης (R2d). 13.Κατανείµετε 200 µl διαλύµατος ενζυµικής ανάπτυξης (R8+R9) σε όλες τις κοιλότητες. 14.Επωάστε επί 30 λεπτά σε θερµοκρασία δωµατίου (18 έως 30 C), σε σκοτεινό χώρο. 15.Κατανείµετε 100 µl διαλύµατος διακοπής της αντίδρασης (R10) σε όλες τις κοιλότητες. 16.Αναγνώσατε την οπτική πυκνότητα µε τη βοήθεια φασµατοφωτοµέτρου στα 450/620 nm.

16

17

18 0459 Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel. : +33 (0) /2006 Fax.: +33 (0) code: