Encimi v tleh. k 1 E + S ES E + P. k 3. k 2

Transcript

1 Encimi v tleh k 1 E + S ES E + P k 2 k 3 1

2 Encimi in definicije encim (E) je protein, ki ga producira celica in deluje kot katalizator znižuje aktivacijsko energijo in na ta način pospeši hitrost reakcije substrat (S) je spojina, na katero deluje encim kompleks (ES) je intermediarna struktura encima in substrata produkt (P) je spojina, ki zapusti encim 2

3 Kinetika encimskih reakcij v i v max ½ v max K m [S] v i = začetna hitrost (mol/čas) [S] = koncentracija substrata (mol) v max = maksimalna hitrost K m = koncentracija substrata, ko je v1 = ½ v max (Michaelis Menten konstanta) 3

4 Recipročni diagram kinetike encimskih reakcij naklon = K m /v max 1/v i 1/v max -1/K m 1/S 4

5 Katalitični mehanizmi 1. Kislinsko-bazna kataliza 2. nukleofilan kataliza 3. Kataliza s kovinskimi ioni 5

6 Mehanizem delovanja encimov intramolekularne interakcije (orientacija substrata v optimalno lego) orientacija katalizatorja v optimalno lego regulacija lokalnega okolja (npr. hidrofilnost, hidrofobnost) kombinacija večih mehanizmov organske katalize (nukleofilna, kislinska bazna, kovinska kataliza) 6

7 Mehanizem delovanja encimov zniževanje aktivacijske energije pri obstoječih reakcijskih koordinatah zniževanje reakcijske energije s spremembo reakcijskih koordinat ravnotežne konstante vezava substrata na encim so v rangu od 10-2 do 10-8 M, kar je enako prosti energiji vezave v rangu od 12 do 50 kj/mol (to energijo lahko encim uporabi za reakcijo) 7

8 Mehanizem delovanja encimov K m predstavlja moč ES kompleksa in je enak (k 2 /k 1 ), večji K m pomeni šibko vezavo, majhen K m pomeni močno vezavo število kataliziranih molekul substrata (turnover number) je enako reakcijski konstanti za nastanek produkta k 3, predstavlja število molekul substrata, ki jih encim katalizira v eni sekundi, ko je encim popolnoma nasičen (v max /k 3 ), čas cikla je 1/(v max /k 3 ) kinetična učinkovitost encima (k 3 /K m ) kaže kakšno je razmerje med razpadom ES kompleksa med produkte in reaktante 8

9 Mehanizem delovanja encimov kinetična učinkovitost encima je odvisna od kemijskih reakcij na encimu in od hitrosti vezave substrata na encim vrednost k 1 je difuzijsko omejena na 10 8 do 10 9 M -1 s -1, veliko encimov ima učinkovitost, ki se približa difuzijskim omejitvam difuzijska omejitev je zmanjšana pri domenski organiziranosti encimskih kompleksov (npr. dihalna veriga) do 1000 X hitrejše reakcije s -1 encimi z velikim K m imajo nizek trurnover, vendar so izjemno učinkoviti pri nizkih koncentracijah substrata 9

10 Primer katalitičnega mesta encima 10

11 Primer katalitičnega mehanizma encima Ser napade C v karbonilni sk.substrata tvori se tetrahedralen intermediat vezava acilne sk.. na Ser; nastane1.produkt H 2 O napade acil-encim 11

12 Primer katalitičnega mehanizma encima tvori se tetrahedralen intermediat nastane produkt Končni efekt je regeneracija encim, ki je katalizator in v reakciji niti ne nastaja niti se ne porablja. 12

13 Inhibicija encimske aktivnosti Poleg difuzije lahko na k 1 delujejo tudi inhibitorji, ki blokirajo: aktivno mesto regulatorno mesto dostop substrata do aktivnega mesta ali izstop produkta inhibitorji lahko delujejo reverzibilno ali ireverzibilno reverzibilni encimski inhibitorji vstopajo v nekovalentne interakcije, ireverzibilni tvorijo kovalentne povezave s tarčnimi skupinami na encimu 13

14 Reverzibilni inhibitorji inhibicija je večja s povečanjem koncentracije inhibitorja hitra začetna stopnja inhibicije hitrost encimske aktivnosti je znižana, vendar konstantna nekovalentne interakcije z encimom delujejo kot analog substrata - tekmovanje za specifično vezavno mesto Tipi inhibicije: - kompetitivna (konkurenčna) inhibicija - nekompetitivna inhibicija - antikompetitivna inhibicija - inhibicija mešanega tipa 14

15 Tipi reverzibilne inhibicije KOMPETITIVNI INHIBITOR NEKOMPETITIVNI INHIBITOR ANTIKOMPETITIVNI INHIBITOR INHIBITOR MEŠANEGA TIPA 15

16 Ireverzibilni inhibitorji stopnja inhibicije narašča s časom enakomerno zniževanje hitrosti encimske aktivnosti kovalentne povezave s tarčnimi skupinami na encimu - vezava z aminokislinskimi radikali v aktivnem centru inaktivacija zmanjša koncentracijo aktivnega encima dajo informacijo o funkcionalnih skupinah ali kofaktorjih encima praktično so uporabni kadar je namen uničiti encimsko aktivnost 16

17 Vezava encimov na površino Za opis adsorpcije proteinov na površine je potrebno poznati fizikalno-kemijske lastnosti adsorbenta adsorpcijske izoterme adsorpcijsko kinetiko število adsorbiranih molekul na enoto dostopne površine adsorbenta konformacijo adsorbiranega proteina 17

18 Vezava encimov na površino Sile, ki vodijo v adsorpcijo encimov na površine (predvsem neg. nabite) g ads = H ads -T. S ads Entalpijski prispevek elektrostatske interakcije van der Waalsove interakcije Entropijski prispevek hidrofobne interakcije spremembe v konformaciji proteina ionska izmenjava povečanje entropije raztopine 18

19 Sprememba katalitske aktivnosti encima zaradi adsorpcije predpostavljeno je drugačno obnašanje kot prosto v raztopini odvisno je od lege proteina na površini; lateralno premikanje odvisno od tega ali je adsorbent inertna površina (podlaga) ali aktivno sodeluje v katalizi pogosto se optimalno ph-območje pomakne višje lahko se spremeni reakcijski mehanizem 19

20 Inaktivacija encimske aktivnosti 1. Avtoklaviranje sprostijo se: org. snovi(ak, OH), Mn, N, P, S, NH 4 -N ter NO 3 -N znižajo se koncentracije topnih elementov v sledovih večina talnih encimov se inaktivira(denaturira) pri T = o C avtoklaviranje inhibira hidrolizo 20

21 Inaktivacija encimske aktivnosti 2. Sterilizacija s suhim zrakom padec koncentracije organske snovi ter porast v Mn in NH 4 -N več encimske aktivnosti v tleh se ohrani pri daljšem času sterilizacije pri nizkih T, kot pri krajši izpostavi visokim T 21

22 Inaktivacija encimske aktivnosti 3. Sterilizacija z γ-sevanjem radioaktivnih elementov- 60Co/ 137Cs povečajo se količine Mn, org. N, NH 4 -N, P celice se ne morejo več deliti, vendar so še vedno opazili biokemično aktivnost ohranise večja aktivnost encimov kot pri sterilizaciji s suhim zrakom 22

23 Inaktivacija encimske aktivnosti 4. Mikrovalovno sevanje(2450 MHz) voda v tleh in organizmih absorbira infrardeče sevanje, zato se močno poviša temperatura, to ubije organizme postopek bolj učinkovit pri vlažnih kot pri suhih tleh močno se poveča vsebnostmn 23

24 Inaktivacija encimske aktivnosti 5. Sterilizacija z etilenoksidom, propilen oksidom, metilbromidom Adsorbcijaoksidanaorg.in anorg.koloidepovzroči povečano vsebnost organske snovi propilen oksid: Mn in Fe; inhibira hidrolizo etilen oksid napada proteine, NK in druge org. snovi, še posebno škodljiv je za sulfhidrilne skupine, ki jih alkilira 24

25 Inaktivacija encimske aktivnosti 7. Preplinjevanje s kloroformom(chcl 3 ), 24 ur poveča količino organske snovi v raztopini in amonijaka poveča aktivnost arilsulfataze zmanša aktivnost: β-glukozidaze, kislih in bazičnih fosfomonoesteraz, proteaz in ureaz 25

26 Inaktivacija encimske aktivnosti 8. Inhibicija mikrobne aktivnosti z azidom(kn 3, NaN 3 ), cianidom, toluenon ali živosrebrovim kloridom azid in cianid: 1-10 %, toksična toluen: 5-10% HgCl 2 : odvisno od vzorca-500mg/kg delujejo na sulfhidrilne skupine(katalitična mesta encimov) HgCl 2 povzroči najmanj sprememb v prsti v primerjavi z drugimi postopki, deluje na celične proteine, ki vsebujejo sulfidrilne skupine azid povzroči Mn ter porast v ph, zmanjšano aktivnosti invertaze in amilaze, na fosfataze nima večjega vpliva 26

27 Inaktivacija encimske aktivnosti 9. Težke kovine: Zn in Cu sulfat inhibirajo encimske reakcije : - s tvorbo kompleksov s substratom - z vezavo na aktivno mest proteina ali - z vezavo na kompleks encim substrat inhibirajo ureaze, fosfomonoesteraze, nitratne reduktaze, amidaze 27

28 Vpliv težkih kovin na encimsko aktivnostv tleh Primer: onesnaženost z bakrom 400 mg Cu/kg zemlje: - zmanjšanje dehidrogenazne aktivnosti za 82% - zmanjšanje ureazne aktivnosti za 47% - zmanjšanje kislo fosfatazne aktivnosti za 34% - zmanjšanje alkalno fosfatazne aktivnosti za 40% 1200 mg Cu/kg zemlje: - zmanjšanje dehidrogenazne aktivnosti za 98% - zmanjšanje ureazne aktivnosti za 62% - zmanjšanje kislo fosfatazne aktivnosti za 62% - zmanjšanje alkalno fosfatazne aktivnosti za 67% 28

29 Inaktivacija encimske aktivnosti Toluen se najpogosteje uporablja pri proučevanju ekstracelularnih encimov je plazmolitičen in antiseptik učinek je odvisen od koncentracije, časa inkubacije, vsebnosti vlage v tleh in predhodnega tretiranja v krajših inkubacijskih časih inhibira sintezo encimov in prepreči asimilacijo reakcijskih produktov za zaustavitev mikrobnega podvajanja je potrebna vsaj 20% konc. inhibira aktivnost katalaz in dehidrogenaz, arilamidaz njegova plazmolitična aktivnost prispeva k aktivnosti intracelularnih encimov v tleh 29

30 Merjenje aktivnosti encimov E + S + I ES + I E + P merimo nastanek produkta (P), po dodatku substrata (S), pri kontroliranih pogojih (temperatura, EI + S ESI ph in ionska moč) če je prisoten inhibitor (I), E = encim S = substrat I = inhibitor P= produkt nastajajo poleg ES tudi ES in ESI kompleksi 30

31 Metode za kvantitativno določanje encimske reakcij SPEKTROFOTOMETRIČNE FLUORIMETRIČNE RADIOAKTIVNE TITRIMETRIČNE MANOMETRIČNE (detekcija plinskih substratov ali produktov) ELEKTRODNE (detekcija ionskih substratov ali produktov) KROMATOGRAFSKE KAPILARNA ELEKTROFOREZA 31

32 Spektrofotometrične metode kolorimetrično določanje spremembe koncentracije substrata ali produkta (neposredno ali posredno, po pretvorbi v obarvano spojino) po ekstrakciji iz vzorca tal, inkubiranega določen čas s substratom pri specifičnih pogojih (npr. T, ph ) najpogostejših načinov merjenja aktivnosti različnih hidrolaz (npr. arilsulfataz, amidaz, fosfataz, celulaz, saharaz) arilsulfataza 0SO 3 K OH + KHSO 4 NO 2 p-nitrofenil sulfat NO 2 p-nitrofenol (rumen v alkalnem) 32

33 Uporaba fluorescence uporaba različnih fluorogenih substratov (substratov s konjugiranimi spojinami, ki ob encimatski cepitvi oddajajo fluorescenco) za ugotavljanje aktivnosti različnih hidrolitičnih encimov v tleh (npr. β- glukozidaz, arilsulfataz, β-celobiaz, β-galaktozaminidaz, kislih in alkalnih fosfataz, lipaz) lipaza ROC-O- O O OH O O H 2 O + + RCOOH CH 3 CH 3 7-Hydroxy-4-methylcoumarin 7-hidroxy-4-methylumbelliferone (nefluorescenten) (močno fluorescenten) 33

34 Radioizotopske metode temeljijo na sledenju radioizotopsko označenih substratov in produktov uporaba 14 C uree za merjenje ureazne aktivnosti preko sledenja sproščenega 14 CO 2. težavo lahko predstavlja ''izotopski efekt'' (spremenjena aktivnost encima pri hidrolizi substrata s težjim izotopom, glede na običajnega) 34

35 Kaj vpliva na izmerjeno encimsko aktivnost v talnih vzorcih in pomen kontrolnih meritev 1. VPLIV TAL NA ZADRŽEVANJE MERJENIH SPOJIN: različni tipi tal imajo različno kapaciteto za zadrževanje substratov oz. produktov encimskih reakcij potrebno narediti tudi test kapacitete tal za zadrževanje različnih koncentracij merjene spojine 2. VPLIV TAL NA INTENZITETO FLUORESCENTNEGA SIGNALA talne komponente lahko vplivajo na intenziteto fluorescentnega signala, uporaba tal z znanimi koncentracijami flourescentnih produktov (npr. quench standards) 3. VPLIV ABIOTSKIH DEJAVNIKOV na NASTAJANJE MERJENIH SPOJIN: v vsakem naravnem vzorcu kemijske reakcije ne potekajo le encimsko, temveč lahko tudi spontano kemijsko, uporablja abiotske kontrole (npr. avtoklavirana zemlja, pufer, substrat) 35

36 Interpretacija izmerjene encimske aktivnosti večina testov aktivnosti talnih encimov se izvaja pri stabilnih pogojih, ki zagotavljajo optimalne hitrosti katalize (prebitek substrata, optimalna T, ph in razredčitev, ki omogoča prosto difuzijo substrata ). pri optimalnih pogojih merimo POTENCIALNO in ne DEJANSKE encimske aktivnosti v tleh koristno je narediti primerjave izmerjenih potencialnih encimskih aktivnosti z dejanskimi (npr. hidrolizo naravnih substratov, dodanih vzorcem zemlje in inkubiranih pri realističnih in situ pogojih) z zdajšnjimi metodami ne moremo ločiti med encimi, ki se nahajajo na znotraj živih ali mrtvih celic ali izven njih-prosti ali adsorbirani na anorganske koloide oz. v kompleksih s huminskimi snovmi 36

37 Primerljivost rezultatov Ključna težava, ki ovira razvoj talne encimatike, je neprimerljivost rezultatov, oziroma pomanjkanje standardiziranih metod merjenja encimske aktivnosti. 37

38 Viri encimov v tleh rastline, talne živali, mikroorganizmi encimi, ki se akumulirajo v tleh so prisotni kot: - prosti encimi (eksoencimi) - endoencimi (citoplazma, periplazma) konstitutivni encimi (pogosto v uporabi, stalno prisotni) inducibilni encimi (producirani le tedaj, ko je to nujno potrebno) 38

39 Lokacija encimov v tleh intracelualrni encimi periplazmatski encimi encimi na zunanji strani membrane encimi sproščeni med rastjo encimi v sporah, cistah, semenih, endosporah encimi na celičnem debriju in mrtvih celicah encimi sproščeni iz intaktnih ali mrtvih celic encimi v ES kompleksih adsorbirani na glino adsorbirani na humus neaktivna celica (V) Resting structure Living cells živa celica Release Release Growth/Devision Growth/Devision (iv) (iv) živa celica Living cell (ii) Secretion (i) (vii) Extracellular enzymes ekstracelularni encimi Humic acids huminske kisline (I) Death Death (iii) Lysis Lysis Humus-enzyme Humus-encim complex kompleks mrtva intaktna celica (vii) Dead intact cell (viii) Entraped enzymes (x) (vi) Lysis Dead disintegrated cell (vii) (vi) Enzyme-substrate ES-kompleks complex Clay minerali minerals glin Adsorbed enzymes (ix) Clay-enzyme Glina-encim complex kompleks mrtva desintegrirana celica 39

40 Vpliv rastlinskega pokrova na aktivnost encimov v tleh na vzorcu tal so gojili češmina, grmičasto travo in borovnice po treh mesecih so se mikrobne združbe začele močno razlikovati npr. tla poraščena z grmičasto travo so imela višje aktivnosti endocelulaze, aminopeptidaze, alkalne fosfataze in fenolne oksidaze,, ter najnižje koncentracije nitrata v tleh (rastlina( rastlina je imela večji privzem nitrata in fosfatov) 40

41 Vpliv kmetijstva na aktivnost talnih encimov encimske aktivnosti so v splošnem višje v neobdelanih tleh (naravna vegetacija, trave ali pašniki) odsotnost oranja daljša prisotnost vegetacije in obsežen koreninski sistem trav večji rizosferni efekt in večja encimska aktivnost povišano aktivnost arilsulfataze ob dodajanju organskih gnojil, povišana aktivnost fosfataz ob dodajanju fosfatnih gnojil pri stročnicah in žitih povišana aktivnosti glukozidaz in galaktozidaz intenzivne obdelave zemlje, gojenja monokultur in obsežne uporabe anorganskih gnojil povzroči znižanje aktivnosti talnih encimov 41

42 Delitev encimov glede na tip reakcije, ki jo katalizirajo klasifikacija encima oksidoreduktaze transferaze hidrolaze liaze izomeraze ligaze tip katalizirane reakcije redoks reakcije prenos funkcionalne skupine rreakcija hidrolize eliminacija funkcionalne skupine izomerizacija formiranje vezi 42

43 Glikozidaze oziroma glikozid hidrolaze So skupina encimov, ki katalizirajo hidrolizo različnih glikozidov. GLIKOZID + H 2 O sladkor + aglikan Glikozidi pa so etrom podobne spojine sladkorje. Glikozidaze običajno poimenujemo po tipu vezi, ki jo hidrolizirajo. 43

44 Glikozidaze oziroma glikozid hidrolaze α GLUKOZIDAZA (maltaza), katalizira hidrolizo α-d-glukopiranozida β- GLUKOZIDAZA (gentobioza ali celobioza), katalizira hidrolizo β-dglukopiranozida α - GALAKTOZIDAZA (melibiaza) β- GALAKTOZIDAZA (laktaza( laktaza), katalizirata hidrolizo melibioze in laktoze 44

45 β-glukozidaza hidroliza terminalnih, ne-reducirajočih β-d-glukoznih ostankov, pri katerih se sprosti β-d-glukoza celobioza + H 2 O 2 beta-d-glukoza reakcija je enosmerna encim je široko specifičen za beta-d-glukozide, inaktivira se pri 70 C 45

46 Pomembni substrati β-glukozidaze Aryl glucosides p-nitrophenyl b-d-glucoside p-nitrophenyl b-d-glucopyranoside p-nitrophenyl b-d-xyloside o-nitrophenyl b-d-glucoside Disaccharides Cellobiose (b-1,4) Gentiobiose (b-1,6) Laminaribiose (b-1,3) Sophorose (b-1,2) Salicin Phenyl-b-glucoside Alkyl b-glucosides Methyl-glucoside Hexyl-glucoside Octyl-glucoside Dodecyl-glucoside 46

47 Glukozidaze in razgradnja celuloze

48 Glukozidaze in razgradnja celuloze mineralizacija ogljika β-glukozidaza katalizira končni omejujoč korak pri razgradnji celluloze HO HOH 2 C HO O OH O-R + H 2 O β-glukozidaza HO HOH 2 C HO O OH OH + OH NO 2 p-nitrofenil-β-d-glukozid β-glukozid + p-nitrofenol 48

49 β-galaktozidaza (laktaza) Je encim, ki hidrolizira disaharid laktozo v D-glukozo in D-galaktozo. β- GALAKTOZIDAZA LAKTOZA β-d-galactopiranozil-(1,4) 4)- β-d-glukopiranoza GALAKTOZA GLUKOZA 49

50 β-fruktofuranozidaza Druga imena: ivertaza saharaza β-fruktozidaza sukraza β-h-fruktozidaza invertin maxinvert L 1000 fruktozil invertaza alkalna invertaza kisla invertaza sistematično ime: β-d-fruktofuranozid fruktohidrolaza 50

51 Saharaze maltoza, laktoza in saharoza so najbolj pogosti vodotopni disaharidi sestavljeni iz dveh monosaharidov povezanih z glikozidno vezjo eden od najbolj pogostih sladkorjev v rastlinah, mikroorganizmih in živalih je saharoza 51

52 β-fruktofuranozidaza hidroliza terminalnih nereducirajočih β-d-fruktofuranozidnih ostankov v β-d-fruktofuranozidih katalizira tudi fruktotransferazne reakcije to reakcijo lahko katalizira tudi -D-glukozidaza, ki odceplja stran terminalno glukozno enoto 52

53 Ksilanaze Za hidrolizo glavne verige sta odgovorna 2 encima: endo-β-1,4-ksilanaza cepi hrbtenico do ksilooligosaharidov β-ksilozidaza hidrolizira ksilooligosaharide do ksiloze 53

54 Aktivnost ksilanaz v odvisnosti od substrata AKTIVNOST ena enota (U) encimske aktivnosti ustreza 1 mol ksiloznega ekvivalenta sproščenega v 1 min pri pogojih: 50 mm natrijev citratni pufer, ph 5.0, 50 C vir ksilana ksilanazna aktivnost (Uml -1 ) macesen 70 oves 36 pšenični otrobi 28 breza 10 koruzni storži 9 ksiloza 3 celuloza 2 Aktivnost ekstracelularne endoksilanaze v supernatantu kulture Streptomyces sp. AMT-3 po 10 dnevih rasti pri 30 C v medijih z različnimi substrati. 54

55 Hitinaze hitin je nerazvejan polisaharid iz N-acetil-D-glukozaminskih (GlcNAc) enot povezanih z β-1,4-vezjo hitinolitsko aktivnost ima več encimov: -endohitinaza-hidroliza hitinske verige v oligomere - eksohitinaza oz. Hitobiozidaza - hidrolizira na terminalnem koncu hitinske verige ali oligomerov, nastane dimer hitobioza -1,4-β- N-acetilglukozaminidaza hidroliza kratkih oligomerov in hitobioze, nastane N-acetil-glukozamin 55

56 Encimske reakcije pri mineralizaciji dušika aminizacija amonifikacija nitrifikacija peptid NH + 4 NO - 2 NO - amino kislina 3 56

57 Mineralizacija amino kislin v tleh amino kislina amonifikacija nitrifikacija arilamidaza amino kislina amidohidrolaze npr. L-glutaminaza L-asparaginaza L-aspartaza NH 4 + NO 2 - NO 3 - Sproščanje amino kislin iz organskega materiala 57

58 Arilamidazna aktivnost NH 2 O NHCCHCH 2 CH(CH 3 ) 2 NH 2 L-leucin b-naftilamid (testni substrat) + H 2 O arilamidaza β-naftilamin + HOOC CHCH 2 CH(CH 3 ) 2 NH 2 leucin 58

59 Amidazna aktivnost RCONH 2 + H 2 O amidaza NH 3 + RCOOH katalizira hidrolizo amidov C-N vezi pri čemer nastaja amonij in ustrezna karboksilna kislina je specifična za alifatske amide prisotna v mikroorganizmih (bakterije,kvasovke in glive), živalih in rastlinah specifičnost in kinetične lastnosti amidaze v tleh so pomembne, ker so substrati tega encima (amidi) potencialna dušikova gnojila 59

60 L-asparaginazna aktivnost COOH HC NH 2 CH 2 CO COOH + H 2 O L-asparaginaza HC NH 2 + NH 3. CH 2 COOH NH 2 velik del sproščenega NH 4+ pri mineralizaciji se sprosti s hidrolizo asparagina in glutamina v naravi široko zastopan encim (mikroorganizmi, rastline) aktivnost pada z naraščajočo globino tal in z nižanjem vsebnosti org. ogljika 60

61 L-aspartazna aktivnost COOH HC NH 2 + H 2 O L-aspartaza COOH C H + NH 3 CH 2 CH COOH COOH 61

62 L-glutaminazna aktivnost COOH COOH H C NH 2 CH 2 + H 2 O L-glutaminaza H C NH 2 CH 2 + NH 3. CH 2 CH 2 CO COOH NH 2 široko zastopan v naravi, zaznali so ga pri številnih živalih, rastlinah in mikroorganizmih L-glutaminaza najbolj občutljiva amidohidrolaza na spremembe ph v tleh aktivnost encima se znižuje z globino vzorca tal, aktivnost je močno povezana s količino organskega ogljika in dušika. Močno je tudi povezana s aktivnostjo amidaze in ureaze in L-asparaginaze. Inhibitorji L-glutaminaze Ag(I), Hg(II), Sn(II), Cr(III), Ti(IV) in W(VI) 62

63 Ureazna aktivnost O NH 2 C NH 2 ureaza H 2 O CO 2 + 2NH 3 v naravi široko zastopan encim: mikrobne, rastlinske in živalske celice katalizira razgradnjo uree, dihidroksiuree in semikarbazida optimalni ph :alkalen med ph ali pa nevtralen med ph 6-7 temperaturni optimum: 60ºC, vendar vzorce tal navadno inkubiramo na 30ºC 63

64 Encimska aktivnost in mineralizacija fosforja fosfomonesteraze fosfodiesteraze trifosfomonoesteraze hidrolaze fosfatnih anhidridov hidrolazep-n vezi Izvor: večinoma mikroorganizmi in rastline, lahko ostanki živali Lokacija: znotraj živih celic, zunaj celic- prosto v tleh(nestabilne), adsorbirane na anorganske komponente tal ali v kompleksih z organskimi koloidi 64

65 Fosfatazna aktivnost O HO P O O kisle ali alkalne O monofosfataze + H 2 O HO P O + ROH O OH O P OR 1 + H 2 O fosfodiesteraze OH O P OH + R 1 OH OR 2 OR 2 65

66 Fosfomonoesteraza (FME) R-O O P O- + H 2 O FME R-OH + OH O P O- O- O- najbolje raziskana od fosfataz nizka substratna specifičnost oz. spososobnost hidrolize mnogih spojin, med katerimi najpogostejše substrate predstavljajo: inozitol- P, polifosfati, mononukleotidi in fosforilirani sladkorji glede na ph optimum delovanja, jih delimo na: - kisle: : 4-6,54 - nevtralne: : 6,5-8 - alkalne: : razmerje med kislimi in alkalnimi fosfatazami je potencialni indikator ph statusa tal 66

67 Sulfatazna aktivnost ROSO 3 _ p-nitrofenil-sulfat (testni substrat) + H 2 O arilsulfataza ROH + H + + SO p-nitrofenol (barvni produkt) 67

68 Katalaza H 2 O 2 H 2 O + ½ O 2 katalazna aktivnost v zemlji je izredno stabilna kaže se povezava katalazne aktivnosti z vsebnostjo organskega ogljika aktivnost pada z globino 68

69 Peroksidaze donor elektronov + H 2 O 2 oksidiran donor + 2H 2 O najdemo ga v rastlinah, živalih aerobnih mikroorganizmih kot donor elektronov uporablja fenole, aminofenole, organske kisline kot kofaktor se pojavlja hem ali flavin, vanadij, selen, cistein ktivnost vezana predvsem na zgornjih 5 cm huminske kisline povečajo aktivnost peroksidaz, omogočajo nastanek bolj stabilnih organskih spojin 69

70 Monooksigenaze encimi, ki inkorporirajo 1 atom O 2 v substrat, drugega pa reducirajo do H 2 O ker katalizirajo nastanek hidroksilne skupine, jih pogosto imenujemo hidroksilaze elektronski donor pri večini predstavlja NADH ali NADPH, prenos elektrona na kisik pa poteka preko flavinskega kofaktorja omogočajo izrabo ogljikovodikov nekaterim mikroorganizmom (npr. Nocardia, Pseudomonas, Mycobacterium) 70

71 Metan monooksigenaza CH 4 + O 2 CH 3 OH + H 2 O metan monooksidaza lahko deluje tudi kot oksidaza amonijaka, pri tem oba substrata tekmujeta za razpoložljiv encim amonij je za metanotrofe strupen oksidacija metana(metanotrofne bakterije) poteka na meji med oksičnim in anoksičnim delom metanotrofne bakterije za svojo rast potrebujejo metan in kisik metanotrofi vsebujejo precej sterolov, ki se nahajajo na zapletenih membranskih sistemih, ki sodelujejo pri oksidaciji metana 71

72 Amonij monooksigenaza NH 3 + O 2 + 2H+ + 2e - NH 2 OH + H 2 O encim amonij monooksidaza katalizira proces dodajanja enega kisikovega atoma na molekulo amonija (nitritacijske bakterije) pri nizkih koncentracijah amonija v zemlji, pride do inhibicije metan monooksigenaze, saj se namesto metana porablja amonij vzrok temu so soli v zemlji: ki spremenijo osmotski potencial zemlje (kar lahko vpliva na oksigenacijo metana), vplivajo na izmenjavo ionov v zemlji (kar lahko poveča dostopnost amonija) direktno vplivajo na združbo oksidatorjev metana. 72

73 Esteraze R 1 C O OR 2 R 1 C O OH + HO R 2 esteraze se od lipaz razlikujejo, ker je njihovo delovanje omejeno na kratkoverižne maščobne kisline karboksilna esteraza katalizira hidrolizo mnogih alifatskih in aromatskih estrov esteraze in druge hidrolitične encime so izolirali iz mnogih mikroorganizmov v tleh 73

74 Lipaze lipaze hidrolizirajo estre glicerola z dolgimi maščobnimi kislinami delujejo kot vmesnik med hidrofobnim substratom in hidrofilnim topilom aktivnost je visoka v emulzijah zaradi tega reakcija odstopa od Michaelis-Mentenovea modela 74

75 Dehidrogenaze XH 2 + A X + AH 2 XH 2 je pri tem organska molekula( donor vodika), A pa je pri tem akceptor vodika pomemben encim, ki ga merimo v tleh, kaže na celokupno oksidativno aktivnost celic uporabljamo tetrazolijeve soli (INT, CTC, TTC, XTT), ki so reducirane ob prisotnosti dehidrogenaz, pri tem pride do spremembe barve 75