TROMBOCITI ONTOGENEZA I STRUKTURA

Transcript

1 TROMBOCITI ONTOGENEZA I STRUKTURA Klinički zavod za kemiju KBC Sestre milosrdnice Biserka Getaldić Zagreb,

2 POVIJESNI PRAVAC P.G. Werlhof osobni liječnik Georga II identificirao Morbus maculosus haemoragicus opisom ITP J.J. Lister prvi upotrijebio akromatski mikroskop G. Bizzozero prvi identificirao trombocite kao krvne stanice i njihove hemostatske funkcije F. Brohm dijagnosticirao trombocitopeniju kao uzrok purpure P. Kaznelson student medicine u Pragu dokazao destrukciju trombocita u slezeni; započinje era splenektomije W.J.Harrington i P.S. Evans ITP je imunološki poremećaj; započinje era imunosupresiva Izoliran TPO Započinje era terapijske upotrebe TPO

3 LABORATORIJSKA DIJAGNOSTIKA Vrijeme krvarenja DUKE Bojenje razmaza po Wrightu indirekna metoda broja trombocita po Foni-u Direktne metode Riees Ecker 1980.Hematološki analizatori TROMBOCOUNTER S Plus Coulter David Bessman - inverzan odnos broja trombocita i MPV nomogram Technicon H*1- BROJ TROMBOCITA Coulter STKS Abbe Y. IPF na analizatorima

4 Naša povijest do direktna metoda Riess Ecker od automatsko brojenje

5 3 SPECIFIČNOSTI TROMBOCITA 1.MEGAKARIOPEZA 2.TROMBOPEZA 3. STANIČNA STRUKTURA

6 Klasični hijerarijski hematopoezni model - bifurkacija Produkcija u koštanoj srži iz iste progenitorske stanice kao za eritroidnu i mijeloidnu lozu CMP/CFU-GEMM Bipotencijal MEP (CFU-E/Mgk) konačno dovodi do prekursorskih stanica za razvoj Mgk Mgk prva morfološki moguća identificirana prekursorska stanica trombocita

7 MEGAKARIOPOEZA u adekvatnim uvjetima stanične kulture ovaj proces traje tjedan dana Mgk progenitorske stanice porast broja Mgk kao odgovor na hematopoetske citokine Hijerarhijski razvoj kroz stadije BFU-Mgk i CFU-Mgk (razlika u površinskim antigenima i karakteristikama rasta) Primitivnija progenitorska st. od BFU-Mgk megakariocitna st. s visokim proliferativnim potencijalom (HPPC-Mgk) Morfološki male neraspoznatljive st. nalik limfoidnima TPO kao glavni humoralni čimbenik regulacije razvoja trombocita

8 megakariocit trombopoeza trombocit CFU Meg je zrelija progenitorska stanica iz koje se razvija 3-50 zrelih megakariocita Megakariocit nema proliferacijskoi potencijal već u periodu od 4-10 sati može završiti transformaciju u protrombocite te njihovo sekvencioniranje u trombocite koje ulaze u cirkulaciju ( ) Megakariociti mogu migrirati u pluća megakariocita svakodnevno što rezultira sa novo formiranih trombocita za usporedbu -u jednom satu eritrocita ; 10⁹ granulocita Iz navedenog slijedi da je uski intraindividualni raspon od X10 9 /L u cirkulaciji Laboratorijski uzorak

9 MIKROOKOLIŠ HEMATOPEZNIH STANICA U KOŠANOJ SRŽI TROMBOCITI ERITOCITI NEZRELE STANICE MIJELOIDENE LOZE

10 Trombopoietin 1994.izoliran Sintetizira se u stromi koštane srži, jetri, slezeni i bubregu Referentni interval koncentracije Tpo u serumu je pg/L, dobiven metodom ELISA. U bolesnika s kroničnim zatajenjem funkcije jetre nalaze se vrijednosti ispod donje granice detekcije svih metoda od 20pg/L - usporedba eritropoietin -3,0-16,6 IU /L god. Upotreba rekombinantnog humanog Tpo (rhtpo) prije kemoterapije prema kliničkim studijama može smanjiti induciranost trombocitopenije te time i potrebu za transfuzijama trombocitnih pripravaka.

11 Mehanizam TPO

12

13 Protrombociti Otpuštanje trombocita s krajeva protrombocita slijedi niz nastanaka ruptura citoplazmatskih niti, nakon čega ostaje takozvana ogoljena jezgra megakariocita koja ulazi u proces apoptoze Trombociti ulaze u cirkulaciju pri čemu se odmah oko 30 % skladišti u slezeni Dijagnostika 1. Protrombocite nije moguće vidjeti svjetlosnim mikroskopijom 2. Formiranje protrombocita i ubrzavanje njihovog fragmentiranja od megakariocita i dalje je predmet istraživanja. Za sada je poznato da je povećanje / ubrzanje stvaranja protrombocita povezano sa povišenim tlakom smicanja

14 3.Laboratorijski dostupan pokazatelj ubrzane trombopoeze je udjel retikuliranih trombocita optička metoda uz fluorescenciju fluorokrom: oksazin dio fluorescentne analize trb. rezultat: %IPF (frakcija nezrelih trombocita) referentni intervali: 1,0-7,3%

15

16 Ultrastruktura trombocita pokazuje nekoliko zona ili regija s definiranom funkcionalnom aktivnosti : periferna i strukturna zona membranskog sustava citoplazmatska zona s organelama granule α i sive granule /dens /

17 Membranski sustav Površina trombocitne plazmatske membrane je glatka osim periodičnih invaginacija koje daju obrise kompleksnoj mreži intramembranskih cijevi koje su propusne do citoplazme i nazivaju se otvoreni kanikularni sustav Površina plazmatske membrane ili gilokaliks (često je nazivaju i pahuljasti omotač stanica) znatno je tanja od analognih površinskih slojeva Podražava više od 50 kategorija receptora koji sudjeluju u adheziji i inicijalizaciji agregacije vezujući specifične ligande ili agoniste Većina receptora poznata je po svojoj elektroforetskoj nomenklaturi

18 Shematski prikaz dijela glikoproteinskih receptora

19 Citoskeleton Membranski sustav trombocita predstavlja konglomerat lipidnih i proteinskih molekula i naziva se sol - zona ispod koje se nalazi mikrotubularni i filamentni skelet trombocita ili strukturna zona. Ova membrana trombocita je odvojena od intrastaničnog sadržaja mikroskopski nevidljivim slojem skeletom trombocita (na slici submembranski filamenti ). Ovaj citoskeleton je proteinska mreža koja pomaže plazmatskoj membrani da održi diskoidni oblik trombocita u mirovanju te omogućava ekstremno brze promjene oblika stanice tijekom aktivacije. Dva BITNA polimerna sustava postoje u megakariocitu: aktin i tubulin

20 citoskeleton

21 Strukturna zona osim otvorenog kanikularnog sustava trombociti imaju i gusti tubularni sustav (eng. DTS-dense tubular system) za koji se pretpostavlja da je analogija endoplazmatskom retikulumu i predominantni je sustav skladištenja kalcija i regulacije koncentracije kalcijevih iona, mjesto sinteze prostaglandina i tromboksana kao i enzima ciklooksigenaze ( samim tim ovaj je sustav izuzetno interesantan u razumijevanju mehanizma djelovanja antiagregacijskih lijekova).

22 Mikrograf elektronskim mikroskopom a. Visoko rezolutni mikrograf trombocita smještenog između eritrocita (lijevo) i endotelne stanice (desno). Vidljive organele: mitohondrij, mikrotubuli, jedinstveni profil površine vezane na otvoreni kanikularni sustav, profil gustog tubularnog sustava, poneka α- granula, jedna gusta granula i čestice glikogena. b. Dijagram trombocita koji prikazuje 4 strukturne zone.

23 Ključni proteini u α-granulama Koagulacijski proteini Ne-kogulacijski proteini α granule EGF - Endotelni faktor rasta, GMP - Gvanidinmonofosfat. GP Glikoprotein, HMWH Visoko molekularni kininogen, Ig Imunoglobulin, PAI-1 Inhibitor aktivatora plazminogena, PDCI trombocitni inhibitorkolagenaze, PDGF trombocitni faktor rasta PECAM-1 trombocitna molekula adhezije na endotel, PF4 trombocitni faktor 4, TGF β transformirajuči faktor rasta β, VEGF/VPF vaskularni endotelni faktor rasta i faktor permeabilnosti, VWF von Willebrandov Faktor, cap1 protein asociran s adenilciklazom Proteini prisutni u citoplazmi trombocita i α- granulama Unos endocitozom Fibronektin Albumini Fibrinogen Imunoglobulini Sintetizirani u megakariocitu Faktor V - Proteini prisutni u α-granulama, ali ne i u citoplazmi (sintetizirani u megakariocitu) Trombospondin - VWF - Β-tromboglobulin HMWK PAI-1 Plazminogen EGF Multimerin PDC1 PDGF PF4 Inhibitor proteina C TGF-β VEGF/VPF Proteini vezani na membranu trombocita Samo na membrani α-granula P-selektin GMP33 - Osteokalcin Na plazmatskoj membrani i α-granulama GP IIb-IIIa cap1 GP IV GP Ib-IX-V CD9 PECAM-1

24 Guste granule ADP Adenozindifosfat, ATP Adenozintrifosfat, P2Y1 I P2Y12 članovi porodice receptora na koje se vežu purini Serotonin Molekula Komentar ADP Nije metabolički, podržava agregaciju trombocita vezanjem na P2Y1 I P2Y12 ADP receptore ATP Nepoznata funkcija, otpuštanje ATP-a detektirano prilikom aktivacije trombocita Serotonin Vazokonstriktor, veže se za endotelne stanice i membranu trombocita Ca 2+ i Mg 2+ Važni za aktivaciju trombocita i koagulaciju

25 In vitro promjene Trajni problem u laboratorijskoj dijagnostici

26 Prikaz EDTA induciranih promjena- TEM A) Aktivirani trombociti sa značajnim morfološkim promjenama u membrani uključujući elongaciju B) Veliki aktivirani trombocit - potencijalne morfološke promjene u α granulama -priprema za kondenzaciju i fuziju C) Produžene projekcije trombocita i inicijacija PMP (trombocitne mikročestice) vezikulacije D) Intaktni aktivirani trombocit s fuzijom stanične membrane i PMP formacijom E) Projekcija stanične membrane i kondenzacija α organela F) Trombociti u naprednom stadiju aktivacije stanična membrana oštećena, PMP-ovi i druge stanične organele su otpuštene

27 Prikaz citrat induciranih promjena - TEM A) Križni presjek normalnog trombocita glatka stanična membrana -prikaz otvorenog kanalikularnog sustava i α granula B) Presjek kroz longutidinalnu ravninu C) Normalan presjek trombocita Ovoreni kanikularni sustav, Mitohondrij, granule i inatkna membarana D) Normalan trombocit intaktna stanična membrana i neke stanične organele - α granule, denzova tjelešca i produljene filamente denzovih tjelešaca E) Normalan trombocit sa depozitom glikogena F) Trombocit u ranom stadiju aktivacije, promjene stanične membrane

28 PRIMARNA HEMOSTAZA- in vivo ADHEZIJA SEKRECIJA AGREGACIJA

29 Potencijalno: Trombogram?! 1. Broj trombocita 2. MPV 3. Trombokrit 4. PDW 5. Trombociti fluorescencija 6. IPF 7. LPLTF 8. MPC Mean Platelet Component Concentration