Seyyed Mohsen Mahdiyoun 1, Mohammad Ahanjan 2, Mehdi Goudarzi 3, Razieh Rezaee 4

Transcript

1 Prevalence of Antibiotic Resistance in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Determining Aminoglycoside Resistance Gene by PCR in Sari and Tehran Hospitals Seyyed Mohsen Mahdiyoun 1, Mohammad Ahanjan 2, Mehdi Goudarzi 3, Razieh Rezaee 4 1 MSc Student in Microbiology, Faculty Medicine, Student Research Committee, Mazandaran University of Medical Science, Sari, Iran 2 Mazandaran Pediatric Infectious Diseases Research Center, Faculty of Medicine, Mazandaran University of Medical Sciences, Sari, Iran 3 Assistant Professor, Department of Medical Microbiology, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran 4 MSc in Microbiology, School of Medicine, Shahid Beheshti University of Medical Sciences, Tehran, Iran Abstract (Received February 24, 2015 ; Accepted August 23, 2015) Background and purpose: Staphylococcus aureus is one of the major causes of community and hospital-acquired infections. Aminoglycosides are potent bactericidal agents that are often used in combination with beta-lactam or glycopeptide in treatment of staphylococcal infections. The aim of this study was to investigate the prevalence of the aminoglycoside modifying enzyme aac(6 )-Ie/aph(2 ) genes and meca. Materials and methods: In current study, 174 clinical isolates of MRSA from different clinical specimens were tested for antibiotic susceptibility using the Kirby Bauer method. MRSA isolates were detected by disc diffusion method using 1 ug oxacillin and 30 ug cefoxitin discs. Then, MRSA strains were further analyzed for detection of meca and aminoglycoside resistant aac (6 )-Ie/aph (2 ) genes by PCR. Results: All strains were resistant to oxacillin and cefoxitin. The highest and lowest resistances were found against erythromycin (85.1%) and trimethoprim/sulfamethoxazole (24.7%), respectively. In PCR, meca gene was detected in 100% of the strains and 77% of the strains were found to harbor aac(6 )/aph(2//)-ia gene. Conclusion: According to this study, the prevalence of aminoglycosides resistant genes is increasing in MRSA isolates. Keywords: meca gene, aac(6 )-Ie/aph(2 ) gene, aminoglycoside modifying enzyme, Staphylococcus J Mazandaran Univ Med Sci 2015; 25(128): (Persian). 97

2 دوره بيست و پنجم شماره 821 شهریور سال )11-801( 8314 چكیده سابقه شیوع مقاومت آنتی بیوتیکی استافیلوکوک اورئوس مقاوم به متی سیلین و تعیین ژن مقاومت به آمینوگلیکوزید به روش PCR در بیمارستان های ساری و تهران 1 سید محسن مهدیون 2 محمد آهنجان 3 مهدی گودرزی 4 راضیه رضایی و هدف: استافیلوکوک اورئوس یکی از مهمترین عوامل عفونت جامعه و بیمارستان است. آمینوگلیکوزیدها عوامل باکتری کش قدرتمندی هستند که اغلب به صورت ترکیبی همراه با بتاالکتامها یا گلیکوپپتیدها در درمان عفونتهای استافیلوکوکی مصرف میشوند. هدف اصلی تحقیق حاضر تعیین فراوانی ژن یکی از مهمترین آنزیمهای تغییردهنده آمینوگلیکوزیدها به همراه ژن meca است. مواد و روشها: در این مطالعه, 471 MRSA جدا شده aac(6 )-Ie/aph(2 ) کدکننده از نمونههای مختلف بالینی برای تعیین مقاومت دارویی به آنتیبیوتیکها با روش کربی بوئر انجام شد. وجود MRSA با گذاشتن دیسکهای آنتیبیوتیکی اگزاسیلین و سفوکسیتین مورد بررسی قرار گرفت. سپس DNA جدا شده از MRSA برای یافتن ژنهای meca و ژن مقاومت به آمینوگلیکوزیدها aac(6 )-Ie/aph(2 ) به روش PCR مورد بررسی قرار گرفت. یافتهها: نتایج نشان داد تمامی جدایهها به اگزاسیلین و سفوکسیتین مقاوم بودند و پس از آن بیشترین وکمترین مقاومت به ترتیب به اریترومایسین با 58/4 درصد و کوتریموکسازول با 41/7 درصد مشاهده شد. در 411 PCR درصد سویهها از نظر ژن meca و 77 درصد جدایهها نیز از نظر حضور ژن aac(6 )-Ie/aph(2 ) مثبت بودند. استنتاج: بررسیها نشان داد که در ایزوله MRSA درصد شیوع ژنهای مقاومت به آمینوگلیکوزیدها روبه افزایش است. واژههای کلیدی: ژن meca آنزیم مقاومت به آمینوگلیکوزیدها استافیلوکوک مقدمه استافیلوکوک اورئووس یکوی از مهومتورین عوامول عفونتهای منشاء گرفته از جامعه و بیمارستان اسوت) 4 (. این باکتری میتواند منجر به بروز عفونتهوای مختلفوی در بیماران شود. از جمله آنها میتوان به: سوپتی سومی پنومونی سپسیس زخم اندوکاردیت عفونتهوای وابسوته به کاتتر و عفونت مجرای ادراری اشاره نمود) 4 (. مقاومت این مقاله حاصل طرح تحقیقاتی شماره 141 است که توسط معاونت تحقیقات و فناوری دانشگاه علوم پزشکی مازندران تامین شده است. مولف مسئول: محمد آهنجان- کیلومتر 45 جاده خزرآباد دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی مازندران 4. دانشجوی کارشناسی ارشد میکروبشناسی کمیته تحقیقات دانشجویی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی مازندران ساری ایران 4. مرکز تحقیقات بیماری های عفونی اطفال مازندران دانشگاه علوم پزشکی مازندران دانشکده پزشکی ساری ایران 3. استادیار گروه میکروبشناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی تهران ایران 1. کارشناسی ارشد میکروبشناسی دانشکده پزشکی دانشگاه علوم پزشکی شهید بهشتی تهران ایران ahanjan2007@gmail.com تاریخ دریافت : 4333/44/8 تاریخ ارجاع جهت اصالحات : 4333/44/8 تاریخ تصویب : 4331/6/4 11

3 سید محسن مهدیون و همکاران به متیسیلین در سوشهای استافیلوکوک اورئوس مقواوم به متی سیلین (Methicillin resistant Staphylococcus aureus: MRSA) برای اولوین بوار در سوال 4364 یعنوی تنهوا دنود سوال پوس از شوروع تجوویز متوی سویلین در انگلستان مشاهده شد و هم به اکنون به عنوان یوک عامول عفونت بیمارستانی رایج مطرح میباشود) 3 (. از آن زموان فراوانی ایزوله های مقاوم بوه متوی سویلین دائمواز افوزایش یافت به طوریکه عفونتهوای بیمارسوتانی گسوتردهای در نقاط مختلف دنیا در دهه 4371 گزارش شد) 1 (. MRSA سویهای از استافیلوکوک اورئوس میباشد کوه بوه یوک گوروه بوزرت آنتوی بیوتیوک هوا بوه نوام بتاالکتامها که شوامل پنویسویلینهوا و سفالوسوپورینهوا میباشند مقاوم است. مقاومت به متیسیلین نشان دهنوده مقاومت به تمامی پنیسیلینهای مقاوم بوه پنویسویلیناز و سفالوسپورینها میباشد) 3 (. تقریبواز بوه تموام ایزولوههوای استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متیسیلین یوک پوروتنین متصل بوه پنویسویلین PBP) (Penicillin binding protein: اضافه شده است. که PBP 2 a نامیده میشود. PBP 2 a نسوبت PBP 2 میل ترکیبی بسیار کمتری به آنتیبیوتیکهوای بتاالکتوووامی دارد کوووه هووودف اصووولی فیزیولووووژیکی متوویسوویلین موویباشوود. PBP 2 a توسووط ژن meca کوود گذاری میشود) 8 (. با گذشت زمان هموراه بوا گسوترش بیشتر ایزولههای MRSA این باکتریها به مورور نسوبت به برخی از آنتیبیوتیکهای دیگر مثل تتراسوایکلینهوا آمینوگلیکوزیدها لینکوزامیدها و سایر آنتی بیوتیکهوا مقاوم شده و درموان عفونوتهوا را مشوکلتور از گذشوته کردهاند) 6 1 (. آنتیبیوتیکهای آمینوگلیکوزیودی یکوی از عوامل مهم آنتی باکتریال میباشوند کوه بورای درموان بسیاری از عفونتهای باکتریایی به خصوو عفونوتهوای اسووتافیلوکوکی مووورد اسووتفاده قوورار موویگیرنوود) 7 ( آمینوگلیکوزیدها اغلب به صورت ترکیب با بتاالکتام ها و گلیکوپپتیووودها در درموووان عفونوووتهوووایی ماننووود انوودوکاردیت باکتریووایی کووه توسووط انتروکوووکهووا و اسووتافیلوکوکهووا ایجوواد موویشووود کوواربرد دارنوود) 5 (. آمینوگلیکوزیدها این مولکولهای کاتیونی با اتصال به زیر واحد s31 ریبوزومی سبب قطع ترجمه باکتری شوده و اثرات آنتی باکتریال خوود را اعموال مویکننود) 3 (. سوه مکانیسوم مقاوموت بوه آمینوو گلیکوزیودها شوامل: تغییور در جایگوووواه ریبوووووزومی اتصووووال دارو کوووواهش در نفوذپذیری دارو و غیرفعالسازی آنزیمی دارو میباشود. در این میوان غیور فعالسوازی آنزیموی آمینوگلیکوزیودها توسوووط آنوووزیمهوووای تغییردهنوووده آمینوگلیکوزیووودها )Aminoglycoside Modifyng Enzymes: AME( اصلیترین مکانیسم مقاومت در گونههای استافیلوکوکی است. این آنزیمهوا براسواس فعالیوت تغییور دهندگیشوان بوووه سوووه رده مختلوووف طبقوووه بنووودی مووویشووووند و شوووووامل: آمینوگلیکوزیووووود اسوووووتیل ترانسوووووفرازها )Aminoglycoside-acetyltransferase: AACs( آمینوگلیکوزیووووووووود فسوووووووووفریل ترانسوووووووووفرازها APHs) (Aminoglycoside-phosphotransferase: و آمینوگلیکوزیووووووود نوکلنوتیووووووودیل ترانسوووووووفرازها )Aminoglycoside-nucleotidyltransferase: ANTs( هستند. سوه آنوزیم APH(3 )-III AAC(6 )/APH(2 ) و ANT(4 ) کووووه بووووه ترتیووووب توسووووط ژنهووووای aac(6 )-Ie/aph(2 ) aph(3 )-IIIa و ant(4 )-Ia رموووز مویشووند جوزء شوایعتورین آنوزیمهوای تغییردهنوده در گونههای مختلف استافیلوکوکهوا هسوتند و از اهمیوت درمانی و بالینی برخوردارند) 41 (. با توجه به اهمیت بیماریزایی شیوع باالی مقاومت بوه متوی سویلین حضوور موداوم و گسوترش سوویه هوای استافیلوکوک اورئوس مقاوم به متیسویلین و بواال بوودن مقاومت به آمینوگلیکوزیدها در این سویهها و بوا تاکیود بر نقش آمینوگلیکوزیدها در درمان ترکیبی عفونتهای استافیلوکوکی مطالعه دورهای بورای شناسوایی و جلووگیری از انتشوار سوویههوای مقواوم ضورورت دارد. هودف ایون تحقیق بررسی شیوع مقاومت آنتویبیووتیکی اسوتافیلوکوک اورئووس مقواوم بوه متوی سویلین )MRSA( و تعیوین ژن مقاوموت بوه آمینوگلیکوزیود aac(6 )-Ie/aph(2 ) جودا 11

4 شده از بیماران بسوتری در بیمارسوتانهوای زارع سواری لقمان حکیم و پارس تهران به روش PCR است. مواد و روش ها 4-4- جمع آوری و تشخیص باکتری ها در ایووون مطالعوووه مقطعوووی 471 سوووویه بوووالینی اسووتافیلوکوکوس اورئوووس مقوواوم بووه متووی سوویلین از نمونههای بالینی مختلف نظیر زخم خون خلط تراشوه برونش پلوور کواتتر و سوواری ادرار از سوه بیمارسوتان زارع در لقمووان و پووارس در تهووران طووی سووال هووای 4334 تا 4333 به روش تصادفی جموعآوری شود. تموامی سویه ها ابتدا روی محیط مانیتول نمک آگار تهیوه شوده از شورکت Merck آلموان کشوت داده شودند و سوپس بورای تعیوین هویوت سوویههوا از ر گنو آمیوزی گورم و آزمونهای بیوشیمیایی معموول نظیور آزموایش کاتواالز کوآگوالز و DNase بورای تشوخیص اسوتافیلوکوکوس اورئوس استفاده شد) 44 (. در نهایت از تمامی سویههوا در محیط تریپتیک سوی براث تهیه شده از شرکت Merck آلموان حواوی 48 درصود گلیسورول اسوت و ککشوت ذخیره تهیه و در دمای 71- درجه سانتیگراد نگهوداری شد )جدول شماره 4(. جدول شماره 1: تعداد کل ایزوله ها و تفکیک محل نمونه گیری در بیمارستان های مورد مطالعه محل نمونه بیمارستان خون خلط تراشه برونش پلور ادرار زخم کتتر لقمان تهران پارس تهران زارع ساری کل تعیین استافیلوکوک اورئوس مقاوم به متی سویلین )MRSA( برای تعیین استافیلوکوک های مقاوم به متی سویلین ابتودا از روش انتشوار دیسوک روی آگوار اسوتفاده شود. جهووت تشووخیص فنوووتیپی ایزولووه هووای اسووتافیلوکوک اورئوس مقواوم بوه متویسویلین از دیسوک 4 میلوی گورم اگزاسیلین) OX ( و 31 میلی گرم سفوکسیتین )FOX( بور روی محویط موولر هینتوون آگوار دارای 1 درصود NaCl طبوق توصویه )NCCLS( National Committee for Clinical Laboratory Standards اسوتفاده گردیود. در صورتی که قطر هاله ایجاد شده نسبت به دیسک اگزاسیلین کمتر از 44 میلیمتر و نسبت به دیسک سفوکسیتین کمتر از 43 میلیمتر بود نمونه استافیلوکوک اورئوس مقواوم بوه متیسیلین در نظر گرفته شد) 44 8 ( تعیین حساسیت آنتی بیوتیکی سویه ها برای تعیین الگوی مقاومتی سویهها حساسیت آنها نسبت به آنتیبیوتیکهای ریفامپین μg) 5) ونکومایسین )31μg) جنتامایسین توووری متوپریمفسولفامتوکسوووازوت )31μg) )48μg) اریترومایسین )48μg) سیپروفلوکسوازین )31μg) سوووووفازولین )4μg) کلیندامایسوووووین )8μg) دوکسی سیکلین )31μg) و سفوکسیتین.)31μg) مطوابق روش انتشار از دیسک کربی بائر با استفاده از دیسکهای آنتویبیوتیوک UK) (Mast, و بوا رعایوت اسوتانداردهای Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) بررسی شد) 44 8 (. برای کنترل کیفی دیسکها و پودرهای آنتویبیوتیوک از سووویههووای اسووتاندارد اسووتافیلوکوکوس اورئوووس ATCC25923 استافیلوکوکووووووووس اپیدرمیوووووودیس ATCC ATCC استافیلوکوک اورئوس و و انتوووروکووکووووووس فکوالوووویس اسووتفاده شوود. هوومدنووین از سووویه MRSA 400 )تهیه شده از بانک میکروبی بیمارستان بوعلی تهوران( مقواوم بوه اگزاسویلین برای کنترل مقاومت به اگزاسیلین استفاده گردید) 43 ( استخراج ژنوم بوووووورای اسووووووتخراج DNA از سووووووویههووووووای اسوتافیلوکوک اورئووس از کیوتهوای اسوتخراج DNA 51304( Cat.No: )QiaAmp DNA Mini Kit اسوتفاده شد. مقداری از کلنی ایزولهها به محیط کشت LB براث 11285( Number: )Merck, Germany, Cat تلقوی و پس از 41 ساعت گرماگذاری در 41 درجه سوانتیگوراد 800

5 سید محسن مهدیون و همکاران و پوس از آن سوانتریفیوژ در دور انجوام گرفوت. طبق پروتکل کیوت بور روی رسووا حاصوله 411μL از بوافر لیزکننوده )بورای تخلویص بهتور و بویشتور DNA از آنووزیم لیزواسووتافین USA( )Sigma, St Louis, نیووز استفاده شد( اضافه شد و به مدت 4 ساعت در 37 درجوه سانتیگراد گرماگذاری شد. سوپس پوروتنین کینواز K و دیگر محلولهای ذکر شده در پروتکل الصاقی اضوافه و به مدت 31 دقیقه در 86 درجه سانتیگوراد گرماگوذاری شد. سپس با افزودن اتانول مطلق سرد و سوانتریفوژ آن و اضافه نمودن اتانول 71 درصد و بیرون ریختن مواد رویی DNA استخراج شده رسوا کرد. سپس بافر حل کننوده بوووه رسووووا DNA اضوووافه و در دموووای 41 - درجوووه سوانتیگوراد نگهوداری شود. )تموام مراحول در پروتکول الصاقی بهطور کامل توضی داده شده( تایید ژنتیکی ایزوله ها برای تایید استافیلوکوک مقاوم به متیسیلین بررسی تموام ایزلوههوا از نظور وجوود ژن meca و بوا اسوتفاده از PCR که در سوال 2009 توسوط S.Suhaili و همکواران مورد استفاده قرار گرفته بود) 8 ( بوه روش PCR صوورت گرفت )جدول شماره 4(. برای اطمینان از درست بوودن کووار در آزمووایشهووای PCR و الکتروفووورز از نمونووه اسوتاندارد ATCC25923 بوهعنووان کنتورل مثبوت بورای سووویه اسووتافیلوکوک اورئوووس و هوومدنووین از نمونووه استاندارد ATCC سویه های MRSA استفاده شد) 41 (. به عنوان کنتورل مثبوت بورای در سال 4331 توسط Vanhoof و همکاران معرفی شد و توووالی آن در جوودول شووماره 4 آورده شووده اسووتفاده گردیده است. واکنش PCR بورای 471 ایزولوه MRSA صورت گرفت. نمونه استاندارد ATCC43300 به عنوان کنترل مثبت برای ژن های مقاومت آمینوکلیکوزیدی از انستیتو پاستور ایران تهیه شد) 48 (. جدول شماره 2: توالی آغازگر های مورد استفاده به همراه اندازه محصوالت قطعات PCR Perimer Sequencimg 5 GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA3 5 CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA3 5 CCAAGAGCAATAAGGGCATACC3 5 CACACTATCATAACCACTACCG3 Gene meca سایز منابع )8( )45( aac(6 )- Ie/aph(2 ) مخلوووط نهووایی واکوونش در حجووم 48 میکرولیتوور شووامل: 4 میکروموووول از هوور جفوووت آغوووازگر 44/8 میکرولیتر مسوترمیکس 3 میکرولیتور DNA Amplicon الگوو کوه بوا 7/8 میکرولیتور آا دیوونیزه بوه حجوم 48 میکرولیتر رسید. سپس ویالهوا در دسوتگاه ترموسوایکلر Canada( )Pio Intellectica قرار گرفت. برنامه دسوتگاه ترموسایکلر در جدول شماره 3 آمده است. جدول شماره 3: مراحل واکنش PCR برای شناسایی ژنهای مقاوموت آمینوگلیکوزیدی و meca فاکتور دما (ºC) زمان ژن مرحله aac(6 )-Ie/aph(2 ) meca aac(6 )-Ie/aph(2 ) meca واسرشتگی اولیه 5 min 5 min 94 C 94 C واسرشتگی 1min 1min 94 C 94 C اتصال 1 min 1 min 45 C 57 C تکثیر 30 s 30 s 72 C 72 C تکثیر نهایی 8min 8min 72 C 72 C تعداد سیکل واکنش مولکولی PCR بوووورای تکثیوووور ژن aac(6 )-Ie/aph(2 ) کووووه از شایعترین آنزیمهای تغییر دهنده در گونوههوای مختلوف اسووتافیلوکوکهووا هسووتند و سووبب غیوور فعووال سووازی آنتیبیوتیکهای آمینوگلیکوزیدی میشوند و از اهمیت بووالینی و درمووانی برخوردارنوود از یووک جفووت پرایموور اختصاصی )سنتز پرایمر توسط ژن فن آوران ایوران( کوه یافته ها در این بررسی که از بهمون 4334 توا مهور مواه سوال 4333 انجووام شوود 471 ایزولووه اسووتافیلوکوک اورئوووس مقاوم به متیسویلین از نمونوههوای مختلوف بوالینی نظیور: خون )3/4 درصد( خلط )6/4 درصد( اگوزدای تراشوه )34/3 درصد( برونش) 48/8 درصد( پلور) 7/7 درصود( کاتتر )5 درصد( ادرار )44 درصد( و زخم )45/4 درصد( 808

6 جودا شوده از بیمارسوتانهوای زارع شوهر سواری )41/7 درصود( لقموان حکویم )81/8 درصود( و پوارس )45/5 درصد( تهران مورد بررسی قرار گرفتند )جدول شماره 1( نتایج آنتیبیوگرام به روش انتشار از دیسک کربی- بوائر که 411 درصد به سفوکسیتین و اگزاسیلین مقاوم بودند نشان داد باالترین میزان مقاومت در برابر اریترومایسوین )58/4 درصد( و پس از آن بیشترین میزان مقاوموت بوه ترتیب در مقابل کلیندامایسین )77/6 درصد( سوفازولین 77( 87/8( درصد( سیپروفلوکساسین )78/3 درصد( ریفامپین درصد( داکسی سیکلین )88/4 درصد(و کمتورین میزان مقاومت در مقابل کوتریموکسازول )41/7 درصد( بود. و نیز تمام سویههوا بوه ونکومایسوین حسواس بودنود. همدنین میزان مقاومت به جنتامایسین به عنووان شواخص مقاومت آمینوگلیکوزیدی )71/4 درصد( مشاهده شد. در این مطالعه میزان مقاومت دند دارویی بواال بوود. بهطوری که میزان مقاومت به 3 آنتی بیوتیک 8/4 درصد و میزان مقاومت به 7 دارو 37/3 درصد را نشوان داد )جودول شماره 8 و 6 (. در این مطالعه با اسوتفاده از تکنیوک مولکوولی 471 PCR جدول شماره 4: ایزولوووه بووورای وجوووود ژنهوووای meca و aac(6 )-Ie/aph(2 ) مورد بررسی قورار گرفتنود. تموامی ایزولوووههوووا دارای ژن meca و 431 سوووویه دارای ژن aac(6 )-Ie/aph(2 ) )77 درصد( بودند. تصویر شمماره 1: الکتروفوورز ژل آگواروز 4 درصود بورای محصوول تکثیر یافته ژن meca )قطعه 341 جفت بازی( به وسیله PCR ردیف 4: کنترل منفی ردیف 4: کنترل مثبت ATCC ردیف 5-3: نمونه بالینی ردیف :6 لدر 411 bp فراوانی نمونه های جدا شده و تفکیک محل نمونه گیری در 3 بیمارستان مورد مطالعه محل نمونه بیمارستان و فراوانی نمونه ها خون 3/4( ) خلط 6/4( ) تراشه 34/3( ) برونش 48/8( ) پلور 7/7( ) ادرار 44( ) زخم 45/4( ) کتتر 5( ) لقمان تهران 81/8( درصد( پارس تهران 45/5( درصد( زارع ساری 41/7( درصد( کل جدول شماره 5: میزان مقاومت دند دارویی تعداد آنتی بیوتیک 7 آنتی بیوتیک 6 آنتی بیوتیک 8 آنتی بیوتیک 1 آنتی بیوتیک 3 آنتی بیوتیک )8/4( 3 )1/8( 5 )41/3( 43 )47( 17 )37/3( 66 تعداد ایزوله های مقاوم جدول شماره 6: میزان مقاومت دند گانه دارویی در ایزوله های جدا شده از بیمارستان های مختلف مقاومت دندگانه دارویی درصدکل مقاومت دند گانه لقمان پارس زارع )44/4( 4 )37/8( 3 )46/3( 8 )44/4( 4 )44/8( 4 )36/5( 7 )88/8( 8 )81( 1 )36/5( 7 ) 8/4( 3 ) 1/8( 5 )41/3( 43 3 آنتی بیوتیک 1 آنتی بیوتیک 8 آنتی بیوتیک )43/1( 44 )44/7( 48 )31( 46 )36/3( 41 )14/8( 41 )14( 47 )47( 17 )37/3( 66 6 آنتی بیوتیک 7 آنتی بیوتیک 802

7 سید محسن مهدیون و همکاران تصویر شماره 2: الکتروفورز ژل آگاروز 4 درصد برای محصول تکثیر یافته ژن aac(6 )-Ie/aph(2 ) )قطعه 444 جفت بازی( به وسیله PCR 411 bp لدر :M کنترل مثبت ATCC43300 P: N: کنترل منفی ردیف 4 تا 1: نمونه بالینی بحث استافیلوکوک اورئوس مقاوم به متیسیلین بوه طوور فزاینودهای در سرتاسور جهوان شویوع پیودا کورده اسوت. شناسایی سریع و دقیق MRSA برای کمک به پزشوکان و انتخاا درمان آنتوی بیووتیکی مناسوب و جلووگیری از گسترش این گونه موورد نیواز اسوت) 47 (. اسوتافیلوکوک اورئوس در طی دند دهوه گذشوته مبودل بوه شوایعتورین عامل عفونتهای بیمارستانی شده است) 45 43(. یکی از عوامل موفقیت این باکتری کسب فاکتورهای مقاوموت میباشد. بودین صوورت کوه بوا ورود هور آنتویبیوتیوک جدید سویههای مقاوم باکتری به سرعت ظهور یافتهانود و درمان عفونتهای حاصل از این باکتری را با دشواری مواجه کردهاند. به عنوان مثال با ورود پنیسیلین به بوازار و استفاده از این دارو در درمان بیماران بستری به سرعت سووویههووای مقوواوم بووه پنوویسوویلین ظوواهر گشووتند) 41 (. مکانیسم اصلی مقاومت به متیسویلین به دلیل کسوب ژن ترانسپپتیووداز جدیود بوه نوام PBP 2 در اسووتافیلوکوک اورئوس است کووه تمایو لو بسیار کمی بووورای اتوووصال بوووه آنتووویبیوتیوووک بتاالکتوووام دارد. ژن کدکننوووده مقاومو تو به متیسیلین meca است که ایون ژن بورروی کروموزم حمل میشود و باعث تبودیل PBP بوه PBP 2 a میشود. ژن meca قسومتی ازیک عنصر ژنتیکی متحوورک بووه نووام کاسوووت کروموزومی استافیلوکوکی SCCmec اسووت) 8 (. ایوون عنصوور ژنووی در گونووههووای حسوواس بووه متیسیلین وجود ندارد. در ضمن دون منطقه ژنوی ذکور شده قدرت جذا دیگور ژنهوای مقاوموت را نیوز دارد بنابراین این اعضواء توانوایی الزم بورای بقواء و کلوونیزه شدن در بیمارستانها را مییابند) 44 (. مطالعووه حوواظر نشووان داد کووه میووزان مقاومووت در بیمارستانهای مورد تحقیق به 13/8 درصد رسیده اسوت. عواملی که میتواند روی شویوع MRSA در کشوورهای مختلف موثر باشد شامل سیاستهای مختلف در اجورای برنامه کنترل عفونت میزان و دگونگی تجویز آنتیبیوتیک جمعیت نوع یا تایپ سویه غالب و درنهایت به روش مورد اسوتفاده در آزمایشوگاه جهوت تشوخیص اسوتافیلوکوک مقاوم به متیسیلین بستگی دارد. عسگری و همکاران در سووال 4144 مقالووهای منتشوور کردنوود کووه در آن شوویوع استافیلوکوک مقواوم بوه متویسویلین را در کول مقواالت منتشر شده در ایران بررسی نمودند. برطبق یافتههای ایون تحقیق تاکنون 4631 مقاله و یا خالصه مقاله در ارتباط با MRSA در ایوران منتشور شوده اسوت کوه در ایون مقالوه 7161 نمونه استافیلوکوک اورئوس مورد بررسی ژنتیکی )meca( قرار گرفته است. بر طبق تحقیوق انجوام گرفتوه شیوع MRSA از 41 توا 31 درصود متفواوت بووده اسوت ولی میانگین شیوع آن در تهران 84 درصد بود) 44 (. بنابر این با توجه به اهمیوت بیمواریزایوی و بواال رفوتن شویوع مقاومت به متیسیلین در سالهای اخیور مطالعوه دورهای برای شناسایی و جلووگیری از انتشوار سوویههوای مقواوم ضرورت دارد. در مطالعه ایمان عینوی و همکوارانش کوه در سال 4143 روی 484 ایزوله استافیلوکوک اورئوس جدا شده از بیماران سوختگی در تهران انجام شود 63/6 درصود از ایزولهها دارای ژن meca تشخیص داده شدند) 43 (. در کشورهای مختلف مقاومت به آمینوگلیکوزیدها در بین سویههای استافیلوکوک اورئوس رایج مویباشود. مقاومت بوه جنتامایسوین دارای اهمیوت کلینیکوی بواالیی 803

8 و% میباشد. زیرا میتواند با اثرات درمانی ایون عوامول ضود میکروبی سازش نماید و اغلب در ترکیب با یوک بتاالکتوام و یا یک گلیکوپپتید بهویژه در درمان اندوکاردیتهوای استافیلوکوکی مورد استفاده قرار میگیرد) 31 (. حساسیت ایزولههای استافیلوکوک اورئوس نسبت بوه جنتامایسوین به عنوان شاخص مقاوموت آمینوگلیکوزیودی مویباشود. گونووههووایی کووه ژن aac(6 )-Ia/aph(2 ) را نگهووداری میکردند کدکننده آنزیم AAC(6 )-APH(2 ) و حتوی همه آنزیمهای تغییردهنوده آمینوگلیکوزیودها بوه خواطر مقاومت به جنتامایسین مورد توجوه قورار گرفتنود) (. در ایون مطالعوه بوا روش دیسوک دیفیووژن مقاوموت بوه جنتامایسین 71/4 درصد براورد شد و میزان مقاوموت بوه ژن aac(6 )/aph(2 )-Ia با استفاده از ردیابی ژن توسوط روش 77 PCR درصد بود. نتوایج مطالعوات مختلوف در سایر کشور ها نشان داد که ژن aac(6 )/aph(2 ) فرآوان تورین ژن کود کننوده آنوزیمهوای AME در ایزولوههوای بالینی MRSA در کشورهای اروپایی است) 46 (. همدنین طی مطالعهای که توسط Choi و همکاران در سال 4113 در کره جنوبی انجام شد نتوایج مشوابهی بوهدسوت آمود بودین صوورت کوه ژن aac(6 )/aph(2 ) بوا فراوانوی 68 درصد شایع ترین ژن در میان ایزوله هوای موورد مطالعوه بووود و بعوود از آن ژن هووای aph(3 )-IIIa و ant(4 )-Ia بترتیب با فراوانی 14 و 3 درصد شناسوایی شودند) 34 ( در مطالعهای که در سال 4116 توسوط Nurittin و همکوارانش صورت گرفت درصد حضوور ژن aac(6 )/Aph(2 ) در 66 درصوود از اسووتافیلوکوک ارئوووسهووای مقوواوم بووه متویسویلین مشواهده شود بوه دنبوال آن ژن Ant(4)-Ia و Aph(IIIa) به ترتیب با 41 که مشابه نتیجه بهدست آمده در مطالعه و 5 درصد مشواهده شود) 36 (. Choi بوود. و در مقابل تحقیقی که Ida و همکارانش در سال 4114 روی 354 ایزولووه بووالینی در ژاپوون انجووام دادنوود شوویوع ژن 51/8 Ant(4)-Ia دو ژن دیگر درصد گزارش شد که خیلی بیشتر از 513 Aph(IIIa) 6417 aac(6 )/Aph(2 ) درصد بود) 35 (. مطالعهای که عباس یادگار و همکارانش در سال 4355 بر روی 411 ایزوله بهدست آموده در بیمارسوتان شریعتی و بقیه اهلل تهران داشتند 85 درصد سویهها نیوز از نظر حضور ژن ژن ant(4 )-Ia ant(4 )-Ia مثبت بودند. در تحقیوق فوو بیشترین فراوانی را داشت) 43 (. در حالی که در تحقیق حاضر نتایج مشوابهی بوا آندوه ارائوه شود بهدست آمد بهطوری که ژن aac(6 )/aph(2 ) با 77 درصد بیشترین فراوانی را داشت. پس میتوان نتیجوهگیوری کورد ژنهای مختلف ایجاد کننده مقاومت آمینوگلیکوزیودی مویتواننود در کلووونهوای مختلوف MRSA در منوواطق مختلف جغرافیایی متفاوت باشند) 37 (. در پایوان مویتووان نتیجوهگیوری کورد کوه افوزایش دشمگیری در شیوع استافیلوکوک مقاوم به متویسویلین در سط جهان مشواهده شوده اسوت. پیشورفت مقاوموت دند گانه به آمینوگلیکوزیدها و دیگر آنتیبیوتیکها در سویههایی کهMRSA هستند دیده شوده. در ایون مطالعوه اهمیوت واژه مقاوموت بوه آمینوگلیکوزیودازها و ظهوور مقاومت به متیسیلین نشان داده شده. و اما سورعت و شویوع پیشرفت مقاومت وابسته به نحوه مصرف آنتویبیوتیوک در بیمارستانهای منواطق مختلوف اسوت. و شواید بتووان نتیجه گرفوت کوه ژن aac(6 )/aph(2 ) میوزان مقاوموت آمینوگلیکوزیدی بیشتری را کد میکنود. هومدنوین در منوواطق جغرافیوایی مثول ایوران در اسووتانهوای مختلوف ژنهای متفاوتی ممکن اسوت علوت بوروز ایون مقاوموت باشند که میتواند بیوانگر ایون مسواله باشود کوه مصورف آنتویبیوتیوکهوای مختلوف از خوانواده آمینوگلیکوزیود و همدنین مدت زمان استفاده در بیماران مختلف شاید بوه نووعی در بیوان مقاوموت مووثر باشود. در نتیجوه سورعت تشخیص عفونت وابسته به MRSA و دیگور ایزولوههوای مشکل سواز بیمارسوتانی و تشوخیص و درموان صوحی و بهموقع مهمتورین امور در اپیودمیولوژی هسوتند. بنوابراین زمانی که درمان عفونت MRSA در بیمارستانهایی کوه امکان انجام مطالعات مولکوولی در آن وجوود نودارد در حال برنامه ریزی میباشد نبایود نورب بواالی مقاوموت بوه آمینوگلیکوزیدها را نادیده گرفت. 804

9 سید محسن مهدیون و همکاران References 1. Al-Khulaifi Manal M, Amin Aref Nagwa M, Al Salamah AA. Phage typing, PCR amplification for meca gene, and antibiotic resistance patterns as epidemiologic markers in nosocomial outbreaks of methicillin resistant Staphylococcus aureus. Saudi J Biol Sci 2009; 16(1): Hu Y, Liu A, Vaudrey J, Vaiciunaite B, Moigboi C, McTavish SM, Kearns A, Coates A. Combinations of β-lactam or aminoglycoside antibiotics with plectasin are synergistic against methicillin-sensitive and methicillin-resistant Staphylococcus aureus. PLoS One 2015; 10(2): e Pillai MM, Latha R, Sarkar G. Detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus by polymerase chain reaction and conventional methods: a comparative study. J Lab Physicians 2012; 4(2): Moon JS, Lee AR, Kang HM, Lee ES, Kim MN, Paik YH, et al. Phenotypic and genetic antibiogram of methicillin-resistant staphylococci isolated from bovine mastitis in Korea. J Dairy Sci 2007; 90(3): Suhaili Z, Azmi Johari S, Mohtar M, Rushdi Tan Abdullah A, Ahmad A, Manaf AliJi Y A. Detection of Malaysian methicillinresistant Staphylococcus aureus (MRSA) clinical isolates using simplex and duplex real-time PCR. World J Microbiol Biotechnol 2009; 25: Ji Y. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) protocols. Preface. Methods Mol Biol 2007; 391: v. 7. Gade Neeta D. Qazi Mohiuddin Recent trend of aminoglycoside resistance among Staphylococcus aureus isolates in tertiary care hospital. Journal of Laboratory Physicians Materials and Mthods 2014; 6(6): Edson R, Terrell C. The aminoglycosides. Mayo.C/in. Proc 1991; 66(1): Schmitz F, Fluit C, Gondolf M, Beyrau R, Lindenlauf E, Verhoef J. The prevalence of aminoglycoside resistance and corresponding resistance genes in clinical isolates of staphylococci from 19 European hospitals. Journal of Antimicrobial Chemotherapy 1999; 43: Oyebode A, Terry A, Olusoga D, Bamigboye K, Animasaun D, Oluremi A. Distribution of genes encoding aminoglycoside modifying enzymes amongst methicillin resistant and methicillin sensitive Staphylococcus aureus isolates from Nigerian hospitals. African Journal of Microbiology Research 2015; 9(5): Hadadi A, Moradi-Tabriz H, Mehdipour B, Moslehi B, Esmaielzadeh P. Determining the prevalence of methicillin- and vancomycinresistant Staphylococcus aureus by MIC and E-Test. Tehran Univ Med J 2011; 69(6): (Persian). 12. Clinical Laboratory Standards Institute; Performance standards for antimicrobial susceptibility testing, twenty first informational supplement CLSI 2011; Vol.31 No Yadegar A, Satri M, Mozafari N, Gudarzi Gh. Pervalence ant(4 )-Ia gene among nosocomial methicillin resistant Staphylococcus aureus by Multiplex-PCR. Jornal of medicin science Modares 2010; 1: Martineau F, Picard FJ, Roy PH, Ouellette M, Bergeron MG. Species-specific and ubiquitous- DNA-based assays for rapid 801

10 identification of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 1998; 36(3): Ardic N, Sareyyupoglu B, Ozyurt M, Haznedaroglu T, Ilga U. Investigation of aminoglycoside modifying enzyme genes in methicillin resistant staphylococci. Microbiol Res 2006; 161(1): Vanhoof R, Godard C, Content J, Nyssen H, Eleonora H. Detection by polymerase chain reaction of genes encoding aminoglycosidemodifying enzymes in methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates of epidemic phage types. J Med Microbio1 1994; 41: Dibah S, Arzanlou M, Jannati E, Shapouri R. Prevalence and antimicrobial resistance pattern of methicillin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) strains isolated from clinical specimens in Ardabil, Iran. Iran J Microbiol 2014; Havaei SA, Azimian A, Fazeli H, Naderi M, Ghazvini K, Mirab Samiee S, et al. Isolation of Asian endemic and livestock associated clones of methicillin resistant Staphylococcus aureus from ocular samples in Northeastern Iran. Iran J Microbiol 2013; 5: Hasani A, Sheikhalizadeh V, Naghili B, Valizadeh V, Nikoonijad AR. Methicillin resistant and susceptible Staphylococcus aureus: Appraising therapeutic approaches in the Northwest of Iran. Iran J Microbiol 2013; 5: Kikuchi K. Overview and strategy for methicillin resistant bacteria. Jpn J Med Assoc 2002; 127: Fateh Manesh P. taeene ekhtesasi Staphylo cuccose ureuse haye moghavem be methicillin az tarighe PCR gene meca hamgam ba pagohesh haye daneshgahi. Newspaper Resalat 2006; 5960: Askari E, Soleymani F, Arianpoor A, Tabatabai SM, Amini A, Naderinasab M. Epidemiology of meca-methicillin Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) in Iran: A Systematic Review and Meta-analysis. Iran J Basic Med Sci 2012; 15(5): Emaneini M, Bigverdi R, Kalantar D, Soroush S, Jabalameli F, Noorazar Khoshgnab B, et al. distribution of genes encoding tetracyclin resistante and aminoglycoside modifying enzymes in Staphylococcus aureuse strains isolated from a burn center. Annals of Burns and Fire Disasters 2013; vol. XXVI n Sabath LD. Mechanisms of resistance to betalactam antibiotics in strains of Staphylococcus aureus. Ann Intern Med 1982; 97(3): Zembower TR, Noskin GA, Postelnick MJ, Nguyen C, Peterson LR. The utility of aminoglycosides in an era of emerging drug resistance. Int J Antimicrob Agents 1998; 10(2): Maurin M, Raoult D. Use of aminoglycosides in treatment of infections due to intracellular bacteria. Antimicrob Agents Chemother 2001; 45(11): Mulazimoglu L, Drenning SD, Muder RR. Vancomycingentamicin synergism revisited: effect of gentamicin susceptibility of methicillinresistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother 1996; 40(6): Chandrakanth RK, Raju S, Patil SA. Aminoglycosideresistance mechanisms in multidrugresistant Staphylococcus aureus clinical isolates. Curr Microbiol 2008; 56(6): Wright GD. Aminoglycoside modifying enzymes. Curr Opin Microbiol 1999; 2(5):

11 سید محسن مهدیون و همکاران 30. Brown NM, Reeves DS. Mechanisms and epidemiology of aminoglycoside resistance. J Med Microbiol 1992, 36: Stewart PR, Dubin DT, Chikramane SG, Inglis B, Matthews PR, Poston SM. IS257 and small plasmid insertions in the mec region of the chromosome of Staphylococcus aureus. Plasmid 1994; 31(1): Choi SM, Kim SH, Kim HJ, Lee DG, Choi JH, Yoo JH, et al. Multiplex PCR for the Detection of genes encoding aminoglycoside modifying enzymes and methicillin resistance among Staphylococcus species. J Korean Med Sci 2003; 18(5): Shaw KJ, Rather PN, Hare RS, Miller GH. Molecular genetics of aminoglycoside resistance genes and familial relationships of the aminoglycoside-modifying enzymes. Microbiol Rev 1993; 57(1): Ounissi H, Derlot E, Carlier C, Courvalin P. Gene homogeneity for aminoglycosidemodifying enzymes in gram-positive cocci. Antimicrob Agent Chemother 1990; 34: Udo EE, Dashti AA. Detection of genes encoding aminoglycoside- modifying enzymes in staphylococci by polymerase chain reaction and dot blot hybridization. Int J Antimicrob Agent 2000; 13: Nurittin A, Baris S, Ozyurt M, Haznedaroglu T, Ilga U. Investigation of aminoglycoside modifying enzyme genes in methicillinresistant staphylococci. Microbiological Research 2006; 161(1): Ida T, Okamoto R, Shimauchi C, Okubo T, Kuga A, Inoue M. Identification of aminoglycosidemodifying enzymes by susceptibility testing: epidemiology of methicillin resistant Staphylococcus aureus in Japan. J Clin Microbiol 2001; 39(9):