مقدمه ميميرند. هزينههاي بيمارستاني سپتي سمي بالغ بر 17 چكيده ميباشد. Downloaded from payavard.tums.ac.ir at 19:46 IRST on Tuesday October 30th 2018

Transcript

1 مجله دانشكده پيراپزشكي دانشگاه علوم پزشكي تهران (پياورد سلامت) دوره 3 شماره ) و 3 4) پاييز و زمستان خون محيطي سطح سرمي اندازه گيري آپوپتوز سلول هاي تك هستهاي فاكتور نكروز دهنده تومورآلفا و پذيرنده نوع يك آن در بيماران ايراني آن با افراد سالم مبتلا به سپتي سمي و مقايسه 3 2 1* محمد مهدي اميري دكتر زهره جدلي دكتر سيد عباس ميرشفيعي دكتر عبدالفتاح صراف نژاد دكتر مهرناز رسولي نژاد مسعود روانبخش مهدي روحاني محمد علي بوير چكيده 9 عليرضا صالحي نوده زمينه و هدف: گزارشات متعددي مبني بر اهميت نقش آپوپتوز در سندروم سپتي سمي وجود دارد. هدف از مطالعه حاضر بررسي ميزان آپوپتوز در PBMC سطح TNF و پذيرنده نوع يك آن در افراد مبتلا به سپتي سمي و مقايسه آن با افراد سالم ميباشد. روش بررسي: اين تحقيق بر روي 22 فرد بيمار مبتلا به سپتي سمي انجام گرفت. پس از اخذ 6 سيسي خون در شرايط استريل با استفاده از كيت اليزا ميزان TNF و TNFRI سرم بيماران بررسي گرديد. بلافاصله پس از جداسازي PBMC ميزان آپوپتوز اين سلولها بررسي گرديد(آپوپتوز در زمان صفر) در ادامه با كشت اين سلولها ميزان آپوپتوز خود به خودي و تاثير TNF نوتركيب بر ميزان آپوپتوز نيز بررسي گرديد. يافتهها: ميزان آپوپتوز در زمان صفر و ميزان آپوپتوز خود به خودي PBMC بيماران در مقايسه با افراد نرمال افزايش معنيداري داشته و نشان دهنده اين است كه سلولهاي ايمني در شرايط in vivo براي مرگ سلولي برنامهريزي شدهاند. ميزان آپوپتوز PBMC بيماران تحت تاثير TNF نسبت به آپوپتوز خود به خودي آنها افزايش معنيداري نداشت. بحث و نتيجه گيري: نتايج نشان دهنده اين است كه مسيرهاي مرگ ديگري غير از پذيرندههاي مرگ در امر آپوپتوز دخيلند. همچنين ميزان سرمي هر دو پروتي ين TNF و TNFRI در اين بيماران بطور معنيداري در مقايسه با افراد نرمال افزايش يافته و اين افزايش متناسب بيماري است. r=0.908 * نويسنده مسي ول : محمد مهدي اميري كارشناس ارشد ايمونولوژي گروه پاتوبيولوژي دانشكده بهداشت و انستيتو تحقيقات بهداشتي دانشگاه علوم پزشكي تهران gmail.com با يكديگر است و نشان دهنده نقش پروتكتيو TNFRI در مراحل ابتدايي واژههاي كليدي: سپتي سمي آپوپتوز فاكتور نكروزدهنده تومور آلفا گيرنده محلول نوع يك فاكتور نكروزدهنده تومور آلفا سلولهاي تك هستهاي خون محيطي مرگ سلولي - دريافت مقاله : تير 88 - پذيرش مقاله : اسفند 88 1 كارشناس ارشد ايمونولوژي گروه پاتوبيولوژي دانشكده بهداشت و انستيتو تحقيقات بهداشتي دانشگاه علوم پزشكي تهران 2 دكتراي تخصصي ايمونولوژي گروه پاتوبيولوژي دانشكده بهداشت و انستيتو تحقيقات بهداشتي دانشگاه علوم پزشكي تهران 3 دانشيار گروه پاتوبيولوژي دانشكده بهداشت و انستيتو تحقيقات بهداشتي دانشگاه علوم پزشكي تهران 4 استاد گروه پاتوبيولوژي دانشكده بهداشت و انستيتو تحقيقات بهداشتي دانشگاه علوم پزشكي تهران 5 استاد بيمارستان امام خميني(ره) دانشگاه علوم پزشكي تهران 6 كارشناس ارشد ايمونولوژي گروه پاتوبيولوژي دانشكده بهداشت و انستيتو تحقيقات بهداشتي دانشگاه علوم پزشكي تهران 7 كارشناس ارشد ميكروب شناسي دانشكده پزشكي دانشگاه علوم پزشكي كاشان 8 رزيدنت عفوني بيمارستان امام خميني(ره) دانشگاه علوم پزشكي تهران 9 كارشناس ارشد ايمونولوژي گروه پاتوبيولوژي دانشكده بهداشت و انستيتو تحقيقات بهداشتي دانشگاه علوم پزشكي تهران مقدمه سپتي سمي يكي از مشكلات با اهميت كلينيكي است كه هرساله بيش از نفر را تنها در امريكا درگير ميكند كه 20 تا 30 درصد از آنها در نهايت ميميرند. هزينههاي بيمارستاني سپتي سمي بالغ بر 17 بيليون دلار در سال است. بي شك سپتي سمي يكي از

2 و 9 اندازه گيري آپوپتوز سلولهاي تك هسته اي... مهمترين مشكلات بهداشتي است كه استراتژيهاي درماني جديدي را ميطلبد( 1 ). سپتي سمي با حضور علاي م زير و به عنوان يك فرآيند عفوني تعريف ميشود. 1) درجه حرارت بدن بيشتر از 38 C يا كمتر از 36. C 2) ضربان قلب بيشتر از 90 ضربان/دقيقه. 3) سرعت تنفس بيشتر از 20 تنفس/ دقيقه يا هايپرونتيلاسيون با فشار Co2 كمتر از 32 ميليمتر جيوه. 4) ميزان گلبولهاي سفيد خون بيشتر از 12/000 در هر ميليمترمكعب يا كمتر از 4/000 در هر ميلي- مترمكعب يا تعداد نوتروفيلهاي نابالغ بيشتر از %10. آپوپتوز لنفوسيتها بعنوان يكي از مراحل مهم در پاتوژنز سپتي سمي شناخته شده است بطوريكه سبب القاء حالتي از فلج ايمني شده كه منجر به آسيب پذيري ميزبان در برابر پاتوژنهاي مهاجم ميگردد( 2-4 ). لنفوسيتها سلولهاي حياتي در پاسخ به سپتي سمي هستند. اولين مطالعه در اين زمينه توسط «هاچكيس» و همكاران( 2001 ) صورت گرفت و نشان داد كه لنفوسيتهاي بيماران مبتلا به سپتي سمي دچار آپوپتوز ميشوند( 5 ). آپوپتوز لنفوسيتها كه در تمام اندامهاي لنفاوي مثل طحال تيموس و بافتهاي لنفاوي مرتبط با دستگاه گوارش مشاهده ميشود ممكن است مسبب اصلي كاهش عملكرد لنفوسيتها در بيماران مبتلا به سپتي سمي باشد( 6 ). بررسيها نشان ميدهند كه سپتي سمي سبب القاء آپوپتوز در انواع سلولهاي تك هستهاي ميشود. براي مثال نتايج حاصل از مطالعه مدلهاي حيواني نشان ميدهد كه سپتي سمي موجب القاء آپوپتوز در سلولهاي CD4+ و+ CD8 T و همچنين سلولهاي B ميشود. بعلاوه سلولهاي NK در پاسخ به طيفي از شرايط استرسي مانند عفونت دچار آپوپتوز ميشوند. فقدان اين لنفوسيتها ممكن است از دلايل اصلي مهار ايمني باشد( 7 ). آپوپتوز ميتواند از سه مسير مجزا رخ دهد: مسير با واسطه گيرنده مسير ميتوكندريايي و مسير با واسطه شبكه اندوپلاسمي. مسير با واسطه گيرنده (به عنوان مسير خارجي نيز شناخته ميشود) با اتصال ليگاند و اوليگومريزه شدن گيرنده در سطح غشاء پلاسمايي آغاز ميشود. اين ليگاندها شامل پروتي ينهاي مختلفي منجمله Fas و TNF-α هستند. شناخته شده ترين گيرندههاي مرگ TNFRI و (Fas, Apol) CD95 CD120a),p55) ميباشند. سيگنال انتقال يافته توسط برخي از گيرندههاي مرگ (مانند (TNFRI بسته به نوع سلول ژنتيك و عوامل محيطي ميتواند منجر به فعاليت بيولوژيكي غير از آپوپتوز (مانند التهاب) شود. اوليگومريزه شدن TNFRI در ابتدا سبب فراخواني RIP1 وTRADD و TRAF2 وcIAP1 و تشكيل كمپلكسI ميشود كه سبب انتقال فاكتور نسخه برداري NF-κB به هسته مي گردد. در ادامهRIP1 TRADDوTRAF2 فراخواني و جدا شده و TNFRI سبب و كاسپاز 8 و تشكيل كمپلكسII FADD ميشود كه اين كمپلكس در نهايت باعث مرگ سلولي ميشود( 7 ). در حال حاضر مكانيسمهاي القاء آپوپتوز در جريان سپتي سمي به خوبي شناخته نشده و عليرغم تلاشهاي فراواني كه به منظور شناسايي مسيرهاي منتهي شونده به مرگ سلولي در جريان سپتي سمي به عمل آمده است امكان پيش بيني نقش دقيق آنها ميسر نمي باشد. لذا هرگونه تلاشي كه در جهت درك مكانيسم مرگ سلولي به عمل آيد ميتواند كمك فراواني به درك بهتر روند پاتوژنز بيماري و نيز اراي ه پروتوكلهاي درماني مناسب شود( 8 و 1 ). بيشتر مطالعات پيشين بر روي آپوپتوز لنفوسيتهاي بافتي متمركز شدهاند و يافتههاي اندكي در مورد تاثير 97

3 ) محمد مهدي اميري و همكاران آپوپتوز بر لنفوسيتهاي گردشي در دسترس ميباشد و لذا تحقيق حاضر به بررسي ميزان آپوپتوز در سلولهاي تك هستهاي خون بيماران مبتلا به سپتي سمي اختصاص داده شده است. در سالهاي اخير مطالعات گستردهاي در رابطه با مكانيسمهاي مولكولي مرتبط با آپوپتوز انجام شده است و با توجه به گزارشات متعددي كه در مورد تغيير سطح سيتوكين بيماران مبتلا به سپتي سمي در دسترس ميباشد بخشي از اين مطالعات بر روي سيتوكينهاي مختلف و پذيرندههاي مربوط به آن و نيز بررسي نقش احتمالي آنها در پيشبرد و يا مهار آپوپتوز متمركز بوده است. فاكتور نكروز دهنده تومور از جمله سيتوكينهايي است كه افزايش آن در بيماران مبتلا به سپتي سمي گزارش شده است( 10 ). TNF كه توسط ماكروفاژها و سلولهاي T در پاسخ به عفونت توليد ميشود در التهاب و آپوپتوز سلولي نقش داشته و به صورت پيش ساز 26 كيلودالتني متصل به غشاء ساخته ميشود و توسط آنزيم مبدل (TACE) TNF به شكل 17 كيلودالتني محلول در مي آيد. پاسخ بيولوژيك به TNF از طريق دو گيرنده غشايي p55 و p75 ايجاد ميشود( 11 ). TNF-α به دو گيرندة TNFRIوTNFRII متصل ميشود. TNFRI مسي ول اصلي القاء پاسخهاي پيش التهابي از طريق فاكتور نسخهبرداري NF-κB ميباشد اما در عين حال ميتواند سبب آپوپتوز نيز بشود و از اين طريق ممكن است در بروز مشكلات مربوط به سپتي سمي دخالت داشته باشد( 12 و 6 ). به عبارت ديگر TNF همانند يك شمشير دولبه عمل ميكند كه هم در پاتوژنز و هم در دفاع ميزبان نقش دارد و بررسي تغييرات و چگونگي عملكرد آن در بيماران مبتلا به سپتي سمي از اهميت بسياري برخوردار است. لذا بخش ديگري از تحقيق داده شده است. هدف از مطالعه حاضر بررسي ميزان آپوپتوز در PBMC سطح TNF و پذيرنده نوع يك آن در افراد مبتلا به سپتي سمي و مقايسه آن با افراد نرمال است. روش بررسي در اين پژوهش تعداد 22 فرد مبتلا به سپتي سمي با تشخيص متخصص عفوني وارد مطالعه شدند. ابتدا با استفاده از سيستم خونگيري در خلاء و در شرايط بسته و كاملا استريل از 22 فرد بيمار و 20 فرد نرمال (با رضايت كامل) مقدار 6 ميلي ليتر خون كامل هپارينه گرفته و 5 دقيقه با سرعت 2000 دور در دقيقه سانتريفوژ شد. پلاسماي نمونهها جدا شده و جهت بررسي ميزان TNF و stnfri در فريزر 20- ºc نگهداري شد و سلولهاي تك هستهاي خون محيطي به وسيله گراديان فايكول-هايپك جدا گرديد. بخشي از سلولها جهت تعيين ميزان آپوپتوز با استفاده از كيت V(Roche) annexin رنگ آميزي شد و توسط دستگاه فلوسايتومتر بررسي قرار گرفت. PAS(Germany) Partec مورد بخش ديگري از PBMC در محيط كشت سلول Sigma) (RPMI1640, كشت داده شد. تعداد 8 ميليون سلول براي سنجش ميزان آپوپتوز و كشت سلول مورد نياز بود بصورت triplicate ميزان آپوپتوز در زمان صفر (در هر مرحله كشت 2 ميليون سلول براي سنجش (يعني به محض جداسازي سلولهاي تك هستهاي خون محيطي) بكار رفت كه يك ميليون از آنها به عنوان كنترل مورد استفاده قرار گرفت. براي تعيين ميزان آپوپتوز اين سلولها را با كيت تجاري حاوي Annexin V و PI رنگ آميزي شد و با دستگاه فلوسايتومتري مورد آناليز قرار گرفت. 2 ميليون سلول ديگر در پليتهاي كشت سلول به مدت 24 ساعت در انكوباتور 37 درجه با حاضر به اندازهگيري سطح پلاسمايي TNF و stnfri و بررسي ارتباط آن با آپوپتوز اختصاص 98

4 اندازه گيري آپوپتوز سلولهاي تك هسته اي... ميزان %5 Co 2 كشت داده شد (در هر خانه يك ميليون سلول) به يكي از اين خانهها تنها محيط كشت اضافه گرديد (براي بررسي آپوپتوز خودبخودي) و به خانهي ديگر علاوه بر محيط كشت به ميزان 50pg TNF (Abcam) تعيين غلظت نوتركيب اضافه گرديد. TNF و stnfri محلول براي به ترتيب از كيتهاي Syste) BMS223/4 (Bender Med و كيت (Hycultbiotechnology) Hbt HK301 استفاده شد. دادهها به صورت ميانگين ± انحراف معيار گزارش شده و از آزمون آماري Mann-Whitney U test براي آناليز دادهها استفاده گرديد. يافته ها در اين مطالعه ميزان آپوپتوز PBMC كنترل در زمان صفر به ترتيب افراد بيمار و 0.29±0.18) 24 (1.6±0.41 ساعت پس از كشت 1.04±0.4) و و (1.08±0.45 TNF و 2.54±0.53 ) بدست آمد كه اختلاف معنيداري (0.001>P) در هر سه مورد مشاهده ميشود. ميزان آپوپتوز PBMC در گروه بيمار در زمان صفر و پس از گذشت 24 ساعت به ترتيب 1.63±0.41 و 2.5±0.58 بوده كه اختلاف معنيداري (0.001>P) را نشان ميدهد. همچنين ميزان آپوپتوز PBMC در گروه بيمار پس از گذشت 24 ساعت در محيط كشت و در محيط كشت همراه با TNF به ترتيب 2.47±0.58 و 2.56±0.53 بوده و اختلاف معنيداري (0.657>P) را نشان نميدهد (شكل 1 ). غلظت TNF و stnfri افراد بيمار و كنترل نيز اختلاف معنيداري (براي هر دو مورد 0.001>P) با يكديگر دارند (شكل 2 ). افزايش غلظت TNF و stnfri در گروه بيمار نيز متناسب با يكديگر و بطور معنيداري (0.001>P r) =,0.908 ارتباط نشان ميدهد (شكل 3 ). 2.47±0.58) و 24 ساعت پس از كشت در مجاورت آپوپتوز در زمان صفر آپوپتوز پس از 24 ساعت آپوپتوز بر حسب درصد آپوپتوز در مجاورت TNF پس از 24 ساعت گروه كنترل گروه بيمار شكل : 1 مقايسه ميانگين آپوپتوز گروه بيمار و كنترل در زمان صفر پس از گذشت 24 ساعت در محيط RPMI 1640 و پس از مجاورت با TNF- α در محيط كشت 99

5 محمد مهدي اميري و همكاران بحث شكل : 2 طي دهه گذشته مطالعه بر روي مدلهاي حيواني و انساني سپتي سپتي ميكند سمي سمي مقايسه ميانگين غلظت TNF-α و stnfri در گروه بيمار و كنترل شكل : 3 ارتباط ميان TNF-α و stnfri در گروه بيمار پيشنهاد نمود كه پاسخ ايمني در 1 از يك الگوي دو مرحلهاي پيروي يك مرحله ابتدايي (Hyperinflammator) كه مشخصه آن حضور مقادير فراواني از سايتوكاينهاي التهابي ميباشد و مرحله دوم كه با كاهش پاسخ دهي سلولهاي ايمني به محركهاي التهابي شناخته ميشود( Iimmunoparalysis ). مرحله فلج ايمني مرحلهاي با آسيب پذيري بالاست كه در اين زمان بيمار به شدت از جانب باكتري مهاجم تهديد ميشود( ). بنظر ميرسد مكانيسم اين فلج ايمني در ارتباط با آپوپتوز سلولهاي ايمني باشد. نتايج اين بررسي نشان ميدهد كه ميزان آپوپتوز PBMC بيماران مبتلا به سپتي سمي (بلافاصله پس از اخذ نمونه و جداسازي بطور معنيداري در زمان صفر (PBMC (P<0.001) غلظت بر حسب pg/ml غلظت TNF-α غلظت stnfri غلظت TNF-α غلظت stnfri گروه كنترل گروه بيمار كنترل تفاوت نشان ميدهد كه با نتايج با ميزان آپوپتوز گروه حاصل از برخي بررسيهاي مشابه همخواني دارد. براي مثال در مطالعات اوليه وانگ و همكاران (1994) دريافتند كه 1.Biphasic 100

6 اندازه گيري آپوپتوز سلولهاي تك هسته اي... تزريق داخل صفاقي باكتريهاي گرم منفي به موش منجر به ايجاد آپوپتوز لنفوسيتهاي CD4+CD8+ در تيموس ميشود( 15 ). «هاچكيس» و همكاران ( 1997 و 2001 ) از يك مدل موشي puncture) (cecal ligation and استفاده نمودند تا نشان دهند كه آپوپتوز لنفوسيتها در طحال و ساير اندامهاي حياتي نيز ديده ميشود آنها سپس نشان دادند كه آپوپتوز وسيع لنفوسيتي در بيماران مبتلا به سپتي سمي نيز ديده ميشود( ). در مطالعهاي با استفاده از روش annexin V ميزان آپوپتوز لنفوسيتهاي گردشي افراد مبتلا به سپتي سمي را بررسي نمودند. نتايج مطالعات آنها نشان داد كه ميزان آپوپتوز لنفوسيتهاي بيماران مبتلا به شوك سپتيك در حدود ± 3/5 16/5 است در حاليكه ميزان آپوپتوز در بيماران سپتي سمي بدون شوك در حدود است. 7/5±1/5 در تحقيقي ديگر نيز ميزان آپوپتوز سلولهاي تك هستهاي در بيماران مبتلا به سپتي سمي و شوك سپتيك به ترتيب معادل ±0/1 9/4 براي 10/6 گزارش ±0/1 گرديد( 18 ). در بخش ديگري از اين تحقيق ميزان آپوپتوز سلولهاي PBMC خون افراد مبتلا به سپتي سمي پس از مدت 24 ساعت در محيط كشت بررسي شد. ميزان 1 آپوپتوز خود به خودي PBMC افراد بيمار تفاوت معنيداري (p<0.001) با گروه كنترل داشت. اين آپوپتوز ميتواند به دليل عدم حضور سايتوكاينهاي in vivo آپوپتوزي) IL-2 (مانند در محيط و ساير مولكولهاي ضد ex vivo باشد( 19 ). همچنين برخي مطالعات نشان ميدهند كه سلولهاي فعال شده سريعتر از سلولهاي در حال استراحت تحت آپوپتوز قرار ميگيرند( ). ولي با توجه به بررسيهاي اخير اين افزايش مرگ سلولي ممكن است بدليل 2 برنامهريزي قبلي باشد كه براي مرگ سلولها در نظر گرفته شده زيرا با حذف سايتوكاينها و عوامل دخيل در آپوپتوز پس از گذشت 24 ساعت هنوز هم درصد معنيداري از سلولها دچار آپوپتوز ميشوند. بر طبق نتايج بدست آمده ميزان آپوپتوز بيماران كه در مجاورت PBMC TNF قرار گرفته بودند با ميزان آپوپتوز خود به خودي آنها تفاوت معنيداري نداد. نشان 0.068>p كه احتمال دخالت ساير مسيرهاي القاء آپوپتوز را در جريان سپتي سمي مطرح ميكند. اين احتمال با مشاهداتي نظير اهميت نقش مسير ميتوكندريايي در آپوپتوز القاء شده در اثر سپتي سمي سمي و عدم كاهش آپوپتوز القاء شده توسط سپتي در لنفوسيتهاي موشهاي مقاوم به اندوتوكسين و موشهايي كه ژن p55 و p75 در آنها تخريب شده است تقويت ميشود( 22 و 17 ). از طرف ديگر در محيط in vitro لوكوسيتها به سرعت توانايي خود جهت اتصال به TNF و IL-1 را از دست ميدهند اين پديده احتمالا در اثر ريزش و بدرون كشي TNFR و كاهش ظرفيت اتصال لوكوسيتها به TNF صورت ميگيرد كه به نوبه خود ممكن است در كاهش اثر TNF تاثير گذار باشد( 23 ). نظر به اينكه گزارشات متعددي در مورد تغيير سطح سيتوكينهاي مختلف در بيماران مبتلا به سپتي سمي در دسترس ميباشد و در بين آنها جايگاه از TNF ويژهاي برخوردار است لذا بخشي از تحقيق حاضر به اندازهگيري سطح پلاسمايي TNF و stnfri اختصاص داده شده است( 9 ). طبق نتايج بدست آمده stnfri و TNF ميزان بطور معنيداري p<0.001 نسبت به گروه كنترل بالا و با برخي گزارشات ديگر در اين زمينه مطابقت دارد( ). ارتباط معنيداري بين غلظت TNF در اين مطالعه stnfri و (0.001>p و 0.908= r) نيز مشاهده گرديد كه نشان 2.Preprogram 1.Spontaneous 101

7 محمد مهدي اميري و همكاران ميدهد غلظت TNF و stnfri متناسب با يكديگر افزايش مييابد. يافتههاي فوق با نتايج بدست آمده از برخي تحقيقات ديگر همخواني دارد( ). آنجايي كه دومين خارج سلولي پذيرنده از stnfri داراي خاصيت بازدارنده عليه TNF-α ميباشد به نظر ميرسد كه در تعديل فعاليت بيولوژيك از TNF-α اهميت بسيار زيادي برخوردار باشد. براي مثال لسلور و همكارانش نشان دادند كه قطعات نوتركيب پذيرنده TNF انسان در مدل موشي حساس شده با D -گالاكتوز آمين كه تحت تزريق اندوتوكسين قرار گرفته نقش پروتكتيو دارند( 31 ). نشان ميدهد كه تناسب و يا عدم تناسب نتايج بدست آمده TNF stnfri و نقش مهمي در تعيين فعاليت بيولوژيك TNF-α و نيز عواقب كلينيكي پسين بازي ميكند. نتيجهگيري منابع در مجموع به نظر ميرسد آپوپتوز يك رخداد اوليه در جريان سپتي سمي مي باشد كه نه تنها در لنفوسيت بافتهاي بيمار بلكه در سلولهاي خون محيطي نيز بوقوع ميپيوندد. بعلاوه يافتههاي اين مقاله نشان مي دهد كه سطح پلاسمايي TNF و stnfri بيماران در مقايسه با افراد كنترل از افزايش معنيداري برخوردار است. معذالك از آنجايي كه سپتي يك سمي ناهنجاري بسيار پيچيده ميباشد كه شامل فعال شدن شمار بسياري از آبشارها از جمله سيستمهاي پيش التهابي ضد التهابي انعقادي و كمپلمان است بنابراين دور از ذهن نيست كه در پاتوژنز بيماري مسيرهاي متعدد مرگ سلولي نيز دخيل باشند( 32 ). تشكر و قدرداني نويسندگان مقاله مراتب تقدير و تشكر خود را از سركار خانم دكتر مهرناز رسولينژاد (متخصص عفوني بيمارستان امام خميني تهران) جهت تشخيص بيماران مبتلا به سپتي سمي اعلام ميدارند. 1. Lang JD, Matute-Bello G. Lymphocytes, apoptosis and sepsis: making the jump from mice to humans. Crit Care 2009; 13(1): Opal SM, Fisher CJ, Dhainaut JF, Vincent JL, Brase R, Lowry SF, et al. Confirmatory interleukin-1 receptor antagonist trial in severe sepsis: a phase III, randomized, double-blind, placebo-controlled, multicenter trial. Crit Care Med 1997; 25(7): Angus DC, Birmingham MC, Balk RA, Scannon PJ, Collins D, Kruse JA, et al. E5 Murine monoclonal antiendotoxin antibody in gram-negative sepsis: a randomized controlled trial. JAMA 2000; 283(13): Abraham E, Laterre PF, Garbino J, Pingleton S, Butler T, Dugernier T, et al. Lenercept (p55 tumor necrosis factor receptor fusion protein) in severe sepsis and early septic shock: a randomized, doubleblind, placebo-controlled, multicenter phase III trial with 1,342 patients. Crit Care Med 2001; 29(3): Hotchkiss RS, Swanson PE, Cobb JP, Jacobson A, Buchman TG, Karl IE. Apoptosis in lymphoid and parenchymal cells during sepsis: findings in normal and T- and B-cell-deficient mice. Crit Care Med 1997; 25(8): Remick DG. Pathophysiology of Sepsis. Am J Pathol 2007; 170(5):

8 اندازه گيري آپوپتوز سلولهاي تك هسته اي Pinheiro DA, Silva F, Nizet V. Cell death during sepsis: integration of disintegration in the inflammatory response to overwhelming infection. Apoptosis 2009; 14(4): Hsieh YC, Athar M, Chaudry IH. When apoptosis meets Autophagy: deciding cell fate after trauma and sepsis. Trends Mol Med 2009; 15(3): Ward PA. Sepsis, apoptosis and complement. Biochem Pharmacol 2008; 76(11): Kurt AN, Aygun AD, Godekmerdan A, Kurt A, Dogan Y, Yilmaz E. Serum IL-1beta, IL-6, IL-8, and TNF-alpha levels in early diagnosis and management of neonatal sepsis. Mediators Inflamm 2007; 31: Oberholzer C, Oberholzer A, Clare-Salzler M, Moldawer LL. Apoptosis in sepsis: a new target for therapeutic exploration. FASEB J 2001; 15(6): Chen G, Goeddel DV. TNF-R1 signaling: a beautiful pathway. Science 2002; 296(5573): Docke WD, Randow F, Syrbe U, Krausch D, Asadullah K, Reinke P, et al. Monocyte deactivation in septic patients: restoration by IFN-gamma treatment. Nat Med 1997; 3: Volk HD, Reinke P, Krausch D, Zuckermann H, Asadullah K, Muller JM, et al. Monocyte deactivation-rationale for a new therapeutic strategy in sepsis. Intensive Care Med 1996; 22(4): Wang SD, Huang KJ, Lin YS, Lei HY. Sepsis-induced apoptosis of the thymocytes in mice. J Immunol 1994; 152: Hotchkiss RS, Swanson PE, Freeman BD, Tinsley KW, Cobb JP, Matuschak GM, et al. Apoptotic cell death in patients with sepsis, shock, and multiple organ dysfunction. Crit Care Med 1997; 27(7): Hotchkiss RS, Tinsley KW, Swanson PE, Schmieg RE. Sepsis-induced apoptosis causes progressive profound depletion of B and CD4+ T lymphocytes in humans. J Immunol 2001; 166: Hotchkiss RS, Osmon SB, Chang KC, Wagner TH, Coopersmith CM, Karl IE. Accelerated lymphocyte death in sepsis occurs by both the death receptor and mitochondrial pathways. J Immunol 2005; 174: Marrack P, Kappler J, Mitchell T. Type I interferons keep activated T cells alive. J Exp Med 1999; 189(3): Kabelitz D, Pohl T, Pechhold K. Activation-induced cell death (apoptosis) of mature peripheral T lymphocytes. Immunol Today 1993; 14(7): Shi YF, Szalay MG, Pasksr L, Sahai BM, Boyer M, Singh B, et al. Activation-induced cell death in T cell hybridomas is due to apoptosis. J Immunol 1990; 144(9): Hiramatsu M, Hotchkiss RS, Karl IE, Buchman TG. Cecal ligation and puncture (CLP) induces apoptosis in thymus, spleen, lung, and gut by an endotoxin and TNF-independent pathway. Shock 1997; 7: VanDer Poll T, Coyle SM, Kumar A, Barbosa K, Agosti JM, Lowry SF. Down-regulation of surface receptors for TNF and IL-1 on circulating monocytes and granulocytes during human endotoxemia: effect of neutralization of endotoxin-induced TNF activity by infusion of a recombinant dimeric TNF receptor. J Immunol 1997; 158: Oriordain MG, Oriordan DS, Molloy RG, Mannick JA, Rodrick ML. Dosage and timing of anti-tnfalpha antibody treatment determine its effect of resistance to sepsis after injury. J Surg Res 1998; 64:

9 محمد مهدي اميري و همكاران 25. Sriskandan S, Moyes D, Lemm G, Cohen J. Lymphotoxin-alpha (TNF-beta) during sepsis. Cytokine 1996; 8: Neilson D, Kavanagh JP, Rao PN. Kinetics of circulating TNF-alpha and TNF soluble receptors following surgery in a clinical model of sepsis. Cytokine 1996; 8: Timokhov VS, Iakovleva II, Kalashnikova EA, Ipateva EI. Plasma contents of cytokines (TNF-alpha, IL-1 beta, IL-6) and their clearance during continuous hemofiltration in patients with sepsis and multiple organ failure. Anesteziol Reanimatol 1997; 3: Rigato O, Ujvari S, Castelo A, Salomao R. Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and sepsis: evidence for a role in host defense. Infection 1996; 24: Girardin E, Roux-Lombard P, Grau GE, Suter P, Gallati H, Dayer JM. Imbalance between tumour necrosis factor-alpha and soluble TNF receptor concentrations in severe meningococcaemia. Immunology 1992; 76: Aderka D, Sorkine P, Abu-Abid S, Lev D, Setton A, Cope AP, et al. Shedding kinetics of soluble tumor necrosis factor (TNF) receptors after systemic TNF leaking during isolated limb perfusion. J Clin Invest 1998; 101: Lesslauer W, Tabuchi H, Gentz R, Brockhaus M, Schlaeger EJ, Grau G, et al. Recombinant soluble tumor necrosis factor receptor proteins protect mice from lipopolysaccharide-induced lethality. Eur J Immunol 1991; 21: Hotchkiss RS, Karl IE. The Pathophysiology and treatment of sepsis. N Engl J Med 2003; 348:

10 اندازه گيري آپوپتوز سلولهاي تك هسته اي... Received : Jul 2009 Accepted : Mar 2010 * Corresponding author : Amiri mm ; e -mail : gmail. com Comparison of apoptosis, circulating levels of tumor necrosis factor-α and tumor necrosis factor type-i receptor in Iranian patients with sepsis and normal controls Amiri MM 1 *(MSc.) - Jadali Z 1 (Ph.D.) - Rasoolinejad M 2 (M.D.) - Salehi Nodeh AR 1 (MSc.) Mirshafie SA 1 (Ph.D.) - Sarrafnezhad A 1 (Ph.D.) - Ravanbakhsh M 1 (MSc.) - Rohani M 3 (MSc.) - Boyer MA 2 (M.D.) 1Department of Pathobiology, School of Public Health, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran 2 Infection Department, Imam Khomeini Hospital, Tehran University of Medical Sciences, Tehran, Iran 3 Department of Microbiology and Immunology, Kashan University of Medical Science, Kashan, Iran Abstract Background and Aim: The present study was designed to compare the cell death, circulating levels of tumor necrosis factor-α and tumor necrosis factor type-i receptor in Iranian patients with sepsis and normal controls. Materials and methods: Twenty-two patients with sepsis were included in this study. After blood collection, the serum circulating levels of TNF-α and TNFRI measured with ELISA kits. The PBMCs isolated from blood samples and proportion of apoptotic cells measured by flowcytometry at the time of blood draws (0 time) and after 24-h incubation. PBMCs incubated at 37 C in culture (spontaneous apoptosis) and in the presence of rtnf that is capable of inducing apoptosis in activated T cells expressing the TNF family of receptors. Results: PBMCs obtained from the patients showed significantly higher (P<0.001) proportion of apoptotic cells than PBMCs of controls at 0 time, indicated that a higher fraction of PBMCs were undergoing apoptosis in vivo in patients but not in controls. After 24-h incubation, spontaneous ex vivo apoptosis of PBMCs was nearly as high as that of TNF-α induced apoptosis, indicating that activated T cells had been preprogrammed in vivo to die. Discussion and Conclusion: The circulating levels of both TNF-α and TNFRI showed significantly higher in patients (P<0.001) than controls and this increase is proportional (r=0.908) in both indicating that TNFRI may have a protective effect in the early stage of sepsis. Key words: Sepsis, Apoptosis, TNF, stnfr1, PBMC, Cell Death