Downloaded from feyz.kaums.ac.ir at 11: on Tuesday September 4th 2018 ٢ چكيده و E توصيه ميشود.

Transcript

1 محمدحسين اعرابى و دکتر محمود جلالى / 1 اندازه گيري همزمان ويتامين A و E به روشHPLC Reversed Phase ٢ ١ محمدحسين اعرابي دكتر محمود جلالي چكيده سابقه و هدف: با توجه به نقش ا نتي اكسيداني و خواص حفاظتي Aا ويتامينهي و E در مقابل سرطان ارزيابي ا نها از اهميت بالايي برخوردار است. اندازهگيري اين ويتامينها نياز به روشهاي دقيق و قابل اعتمادي دارد لذا به منظور اندازهگيري دقيق همزمان ويتامين A و E با دستگاه HPLC اين تحقيق انجام گرفت. مواد و روشها: تحقيق به روش Exploratory survey انجام گرفت. پس از استخراج و ا ماده سازي نمونه سرمي ٥٠ ميكروليتر از اين نمونه به دستگاه HPLC تزريق شد. روش اندازهگيري به روش كروماتوگرافي فاز معكوس با ا شكار ساز (دتكتور) UV و ستون Super Pacpep-S با سرعت جريان rate) (Flow ١/٥ ميلي ليتر در دقيقه و فاز متحرك متانول ٩٥ درصد و مدت زمان ا زمايش ١٥ دقيقه بود. زمان بازداري درصد تغييرپذيري تكرارپذيري تاثير زمان و نيز ميزان بازيافت ويتامين ها اندازه گيري شد. يافتهها: ويتامين A رتينيل استات (استاندارد داخلي) و ويتامين E به ترتيب در محدوده زماني ٤/٧ ٣/٤ و ١١/٥ دقيقه از ستون خارج شدند. حد تشخيص دستگاه براي ويتامين A حدود ٢٥ng/ml و براي ويتامين E حدود ١µg/ml بود. بازيافت ويتامين A و E به ترتيب ٧٨/٢ و ٩٠/٨ درصد بود. نتيجهگيري: اندازهگيري ويتامين A و E به روش HPLC همراه با تغييراتي در روشهاي قبلي روشي عملي در بالا بردن كيفيت اندازهگيري ا نها به ويژه قسمت بازيافت ويتامينها است. انجام پژوهشهاي ديگر براي بالا بردن كيفيت اندازهگيري ويتامينه ي Aا و E توصيه ميشود. واژگان كليدي: اندازه گيري ويتامين A ويتامين HPLC E ١- گروه بيوشيمي و تغذيه دانشگاه علوم پزشكي كاشان ٢- دانشگاه علوم پزشكي تهران دانشكده بهداشت

2 اندازه گيرى همزمان ويتامين A و... E / 2 فصلنامه علمى پژوهشى فيض مقدمه Aا ويتامينهي و E اثرات بيولوژيك متعددي دارند و اهميت ا نها روز به روز ا شكارتر ميگردد (١). از جمله نقشهاي اين دو ويتامين كه در سلامت بدن حياتي است عمل حفاظتي در مقابل راديكالهاي ا زاد يا به عبارت ديگر نقش ا نتياكسيداني اين دو ويتامين است (٣ و ٢) به طوري كه كمبود اين ويتامينها احتمال بروز اختلالاتي مثل سرطان بيماريهاي قلب و عروق و عفونتها را بيشتر ميكند و ميزان اين ويتامينها در بيماريهاي متعدد دستخوش تغيير ميگردد (٦ و ٥ و ٤ و ٢) لذا اندازه گيري همزمان اين دو ويتامين بيش از پيش اهميت پيدا كرده است. در اين راستا روشهاي مختلفي براي اندازهگيري غلظت ويتامين A و E در سرم و ساير مايعات بيولوژيك ابداع شده است كه از ا ن جمله ميتوان روش رنگ سنجي و فلوريمتري نام برد (٨ و ٧). اين روشها معمولا وقتگير هستند و از حساسيت و دقت كمي برخوردار هستند. با ابداع روشهاي كروماتوگرافي مايع با كاركرد عالي HPLC اندازهگيري اين ويتامينها دقيقتر و حساستر شده است (١٠ و ٩). با توجه به اينكه اين ويتامين مورد توجه خاص پژوهشگران و متخصصان باليني است اهميت راهاندازي روشي ا سان و دقيق در اندازهگيري ا نها دو چندان ميشود لذا به منظور راهاندازي روش اندازهگيري دقيق و همزمان ويتامين A و E با تغييرات در روشهاي قبلي روش جديدي مورد بررسي قرار گرفت. مواد و روشها تحقيق به روش Exploratory survey انجام گرفت. پژوهش حاضر به روش تجربي بر روي نمونه خون افراد مراجعه كننده به پايگاه انتقال خون تهران انجام شد. چون ويتامين هاي A و E در مايعات بيولوژيك به ويژه در تماس با نور و هوا ناپايدار هستند (١١) بنابراين تمام نمونههاي سرم در لولههاي سرپوشيده و با پوشش تيره نگهداري شد. فضاي خالي لوله به وسيله جريان گاز نيتروژن پر شد و نمونهها تا درجه سانتيگراد ٢٠- هنگام ا زمايش در دماي نگهداري شد. ٢٠٠ ميكروليتر سرم به يك لوله پلي پروپيليني ٢ ميليليتري دربدار ريخته شد و ٥٠ ميكروليتر استاندارد داخلي (رتينيل استات) ٢٠٠ ميكروليتر اتانول و ٢٠٠ ميكروليتر متانول به سرم اضافه شد. پس از ١٠ ثانيه ورتكس ٥٠٠ ميكروليتر هگزان به ا ن اضافه شد و مجددا به مدت ٦٠ ثانيه ورتكس شد. سپس مخلوط در زمان ٥ دقيقه با دور ١٥٠٠ سانتريفوژ شد. در مرحله بعد فاز رويي كنار گذاشته شد. مجددا ٥٠٠ ميكروليتر هگزان به مخلوط اضافه شد و به مدت ٦٠ ثانيه ورتكس شد و مشابه مرحله قبل فاز رويي جدا شد ا نگاه مجموع فازهاي رويي در دماي ٤٥ تا ٥٠ درجه سانتيگراد تحت گاز نيتروژن تبخير شد تا فاز هگزني كاملا خشك شود. به قسمت خشك شده ٢٠٠ ميكروليتر متانول اضافه و حل شد و ٥٠ ميكروليتر از ا ن به دستگاه HPLC تزريق شد. متد HPLC اين روش بر اساس كروماتوگرافي با فاز معكوس است. مواد مورد نياز شامل α Retinol all trans توكوفرول ترانس رتينيل استات متانول اتانول و HPLC بود. سيستم HPLC هگزان مخصوص n مورد استفاده از نوع Pharmacia, LKB با ا شكار ساز مدل ٢٢٤١ از نوع multi wave length, UV

3 محمدحسين اعرابى و دکتر محمود جلالى / 3 جذب تكرارپذيري( Reliability ) در يك روز و ٤ روز متوالي و تا ثير زمان روي تغيير غلظت ويتامينها تعيين گرديد. يافتهها پس از تزريق استانداردهاي ويتامن A رتينيل استات و α توكوفرول به طور جداگانه زمان بازداري time) (Retention هركدام در كروماتوگرام شماره ١ اراي ه گرديده است و نشان ميدهد كه به ترتيب در محدوده ١١/٥ ٤/٧ ٣/٤ دقيقه است. و ستون به كار رفته از نوع Super pac pep-s با سرعت زمان ا زمايش (RUN) ١٥ دقيقه و ميزان تزريق ٥٠ ميكروليتر بود. طول موج انتخابي از شروع ا زمايش تا ٧ دقيقه ٣٢٥ نانومتر و از ٧ تا ١٥٠ دقيقه ٢٩٢ نانومتر بود. پس از پايان جداسازي ويتامينها و ترسيم كروماتوگرام توسط نرمافزارهاي HPLC manager و Nelson به محاسبات و تفسير منحني اقدام گرديد. زمان بازداري ) Retention (time درصد تغييرپذيري [ضريب تغييرات Variation) (Coeffieient of با ١٠ تكرار] ميزان درصد تغييرپذيري پس از تزريق مكرر هركدام از ويتامين ها در جدول ١ ارايه گرديده است و نشان مي دهد كه تكرارپذيري رتينول و ترينيل استات بيشتر از α توكوفرول است نمونه ها جدول ١- تكرارپذيري زمان بازداري ويتامين A رتينيل استات ويتامين E زمان بازداري زمان (± انحراف معيار) (دقيقه) دامنه تغييرات (دقيقه) درصد* CV ١ ٣/٤٣ ٣/ ٥٢ ٣/٤٧ ± % ٣٥ ويتامين A ١/١ ٤/٨٢-٤/ ٩٩ ٤/٨٦ ± % ٥٣ رتينيل استات ٢/٢٦ ١١/٦٥-١٢/ ٧ ١١ /٩٥ ± % ٢٧ ويتامين E * ضريب تغييرات variation) (coefficient of

4 اندازه گيرى همزمان ويتامين A و... E / 4 فصلنامه علمى پژوهشى فيض (RT) پس از تزريق سرم ا مادهسازي شده به دستگاه بازداري استانداردها ايجاد ميشود مشاهده شد كه منحنيهايي در محدوده زمان (كروماتوگرام شماره ٢). براي اطمينان از اين تناسب استاندارد ويتامين A و E به نمونه سرم اضافه شد و منحني ا ن با حالت قبل مقايسه شد كه در كروماتوگرام شماره ٣ اراي ه گرديده است و نشان ميدهد كه ميزان جذب افزايش چشمگيري داشته E A و ويتامين است.

5 محمدحسين اعرابى و دکتر محمود جلالى / 5 در تعيين حداقل حساسيت دستگاه براي ويتامين (Limit-Detection) A و E ا خرين حد ا شكارسازي براي ويتامين مشخص شد كه حدود A ٢٥ng/ml و براي ويتامين E حدود ١ug/ml است. پس از بررسي تمام شرايط عمل كاليبراسيون براي هر كدام در غلظت هاي مختلف استاندارد در محيط سرمي انجام شد. تكرارپذيري غلظت ويتامين A و E در سرم طي يك روز و ٤ روز متوالي در جدول ٢ شماره غلظت ويتامينها اراي ه گرديده است و نشان ميدهد كه در طي زمانها و تكرارها قابل قبول بوده است و اختلاف ا نها به لحاظ ا ماري معنيدار نيست. جدول ٢- دقت و تكرارپذيري غلظت ويتامين هاي A و E به تفكيك يك روز و چهار رو ميزان دامنه تغييرات ضريب تغييرات (درصد) ١ /٣ ٦٨ /٢٥-٧١/٠٧ (µg/dl) ٦٩ /٧٦ ±٠/٩٤(µg/dl) يك روز (٥=N) ١ /٩ ٦٨ /٧-٧١/٨٢ (µg/dl) ٦٩ /٨±١/٣١(µg/dl) چهار روز (٤=N) A ٦ /٩ ٩ /٣٥-١١/٣ (µg/dl) ١٠ /٢±٠/٧١(µg/dl) يك روز (٥=N) E ٩ /٤ ٨ /٦٥-١١/١(µg/dl) ٩ /٧١±٠/٩٢(µg/dl) چهار روز (٤=N) تا ثير مدت زمان روي تغييرات غلظت ويتامين در ندارد اما ويتامين E در اين مدت كاهش قابل جدول شماره ٣ اراي ه گرديده است و نشان ميدهد ملاحظهاي دارد. كه غلظت ويتامين A تا ٦٠ دقيقه تغيير محسوسي

6 اندازه گيرى همزمان ويتامين A و... E / 6 فصلنامه علمى پژوهشى فيض جدول ٣ تغييرات غلظت ويتامينهاي زمان (دقيقه) غلظت ويتامين A A و E در طي زمان غلظت ويتامين E (µg/dl) (µg/dl) ٧/١٥ ٠/ ٤٥٠ ٠ ٦/٢١ ٠/ ٤٤٧ ٢٠ ٥/٦٩ ٠/ ٤٤١ ٦٠ *٦/٣٥±٠/٧٤ =١١/٦ درصد CV *٠/٤٤٦±٠/٠٠٤٦ =١ درصد ** CV * ميانگين ± انحراف معيار تزريق شماره مقدار مشاهده شده ** ضريب تغييرات ميزان بازيافت به سرمي كه غلظت ويتامين A و E ا ن دقيقا مشخص شده بود مقداري معين ويتامين A و رتينيل استات و ويتامين اضافه شد. E پس از مراحل استخراج و ا مادهسازي نمونه به دستگاه تزريق شد. اين عمل چندين بار تكرار شد. نتايج در جدول شماره ٤ ميزان بازيافت ويتامين A برابر اراي ه گرديد و نشان ميدهد كه ± ٧/٨ ٧٨/٢ و ميزان بازيافت ويتامين E برابر ± ١١/٣ ٩٠/٧٧ بود. جدول ٤ ميزان بازيافت و درصد خطاهاي ويتامين هاي A و E ويتامين ( ug/dl) A ويتامين (ug/ml) E درصد خطا درصد بازيافت مقدار مشاهده شده درصد خطا درصد بازيافت ٧٩/٢٢ ٢٠/ ٨ ٢٦/ ٣ ١٠٠/ ٢-٠/ ٢ ٨/ ٠١ ١ ٨٥/٥١ ١٤/ ٤٩ ٢٨/ ٢٢ ٩٤/ ٤ ٥/ ٦ ٦/ ٢٣ ٢ ٦٩/٩ ٣٠/ ١ ٢٣/ ١ ٧٧/ ٧ ٢٢/ ٣ ٥/ ١٣ ٣ ٧٨/٢١ ±٧/٨ ٩٠/٧٧±١١/ جمع (ميانگين ± انحراف معيار) ٣ بحث تحقيق نشان داد كه راهاندازي و اندازهگيري همزمان ويتامين A و E به روش Reverse phase HPLC مقدور است. تاكنون انواع روشهاي مختلف HPLC براي اندازهگيري ويتامين A و E به صورت منفرد و يا همزمان ابداع شده است (١٥ و ١٤ و ١٣ و ١٢ و ٩) در بررسي و مطالعه روشهاي مختلف روش (٩) Cuesta Sanz به دليل سادگي و كارا يي نسبتا مناسب به عنوان اساس روش اندازهگيري انتخاب شد. اما تغييراتي در ا ن روش نيز انجام شد كه شامل: الف) ستون: ستون مورد استفاده داراي ماتريكس C2/C18 بود كه براي اولين بار از اين ستون جهت اندازه گيري ويتامين A و E استفاده شد. از مزاياي اين ستون جداسازي بسيار عالي و عدم تداخل مواد با يكديگر و همچنين تكرارپذيري عالي ا ن است. ب) تغيير طول موج: رتينول و رتينيل استات توكوفرول طول موج انتخابي براي ٣٤٠ نانومتر و براي α ٢٨٠ λmax نانومتر بود. در طول موجهاي مختلف اما پس از بررسي در سيستم دتكتور ما مشخص شد كه رتينول در طول موج ٣٢٥ نانومتر و α توكوفرول در ٢٩٢ نانومتر بيشترين جذب را دارد. ج) تغيير در روش استخراج : در روش قبلي (٩) عمل استخراج يك بار و با افزودن ميلي ليتر ١ هگزان انجام شد اما با توجه به اينكه هرچه مرحله استخراج بيشتر شود مقدار بازيافت ويتامين ها بيشتر است (١٦) ما در دو مرحله استخراج ١ ميلي ليتر هگزان اضافه نموديم كه مقدار بازيافت به طور قابل توجهي افزايش يافت. همچنين دور سانتريفوژ ١٠٠٠ دور در دقيقه پيشنهاد شده بود كه بنا به تجربه مشاهده شد كه در دور

7 محمدحسين اعرابى و دکتر محمود جلالى / 7 ١٥٠٠ جدا شدن فازها از همه بهتر و ا سانتر است. درصد بازيافت ما در مقايسه با روش cuesta sanz كمي اختلاف دارد به طوري كه درصد بازيافت ويتامين A كمتر از روش فوق (٧٢/٢٨ درصد در E مقابل ١٠٣/١ درصد) ولي در مورد ويتامين درصد بازيافت كمي بيشتر (٩٠/٨ درصد در مقابل ٩٠/٢ درصد) بود. تكرارپذيري ما نيز با روش ا نها تفاوت اندكي داشت به طوري كه درصد تغييرپذيري ويتامين A در يك روز در روش ما بهتر بود (١/٣٤ در مقابل ولي در مورد ويتامين E تكرارپذيري ما كمتر از روش قبل بود (٢/٨٤ در مقابل پپ ٦/٩ ) كه شايد مهمترين دليل ا ن طولاني بودن زمان جداسازي ويتامين E باشد. در يك جمع بندي به نظر مي رسد كه سنجش E هم زمان ويتامين A و عملي است و از نظر كيفيت اندازه گيري به ويژه در زمينه بازيافت نسبت به روش هاي متعارف قابل قبول انجام ميباشد. پژوهشهاي ديگر براي استخراج و اندازه گيري ويتامين A و E در مايعات بيولوژيك ديگر و هم چنين ارتقاء كيفيت ا زمايش ميشود. توصيه (١/٨٥ References: 1- Eitenmiller R-R. Vitamins in human health and Disease. Trends in food science & technology 1997; 8 (6): Meagher Emma A. Antioxidant vitamin and atherosclerotic vascular Disease. ACC Current Journal. 1999; 8 (5): Fang YZ, Yang SWu G. Free radicals, antioxidant and nutrition 2002, 18(10): Dutta A, Dutta S K. Vitamin E and its role in the prevention of atherosclerosisand Carcinogensis: 2003; 22(4): Kimminck GG, Bell Ra, Bosick RM. Vitamin E and breast cancer. Nutr Cancer 1997; 27(2): Stephensen CB. Vitamin A infection and immune function. Annu Rev Nutr. 2001; 21: Henry JR, In clinical chemistry principles and techniques. Harper and Row publisher McCromick DB, Wright Lemvel D. Vitamin and Coenzyme: methods in enzymology Vol 67 part F. 9- Cuesta Sanz D, Santa Gruz M.C: Simultaneous measurement of retinonl and α tocopherol in human serum by high performance liquid chromatography with ultraviolet Detection, J. chromatog 1986: 380, 140-4, 10- Calias S. Ruberto Bonia F: Determination of vitamin A vitamin E and their esters. J Pharm Sci Apr1995; 84(4). 11- Packer L. Retinoids molecular and metabolic aspects. methods in enzymology Vol 98 part A 12- Browne RW, Armstrong D. Simultaneous determination of serum retinol, tocopherols, and carotenoids by HPLC. Methods Mol Biol. 1998; 108: Abahusain MA, Wright J, Dickerson JW, de Vol EB. Retinol, alpha-tocopherol and carotenoids in diabetes. Eur J Clin Nutr Aug ; 53(8): Lee BL, New AL, Ong CN. Simultaneous determination of tocotrienols, tocopherols, retinal, and major carotenoids in human plasma. Clin Chem (12): Weinmann AR, Oliveira MS, Jorge SM, Martins AR. Simultaneous high- performance liquid chromatographic determination of retinol by fluorometry and of tocopherol by ultraviolet absorbance in the serum of newborns. J Chromatogr B Biomed Sci Appl. Jun 1999; 729 (1-2): Zamman Z, Filden P & Frost P.G. Simultaneous determination of vitamin A and E and carotenoids in plasma by Reversed-phase HPLC in elderly and younger subjects, Clin Chem, 1993; 39,10,