Molekulárna biológia a jej využitie v laboratórnej diagnostike na OKM FNsP Skalica a.s. Kos S., Kóňová L., Vašková M.,

Transcript

1 Molekulárna biológia a jej využitie v laboratórnej diagnostike na OKM FNsP Skalica a.s. Kos S., Kóňová L., Vašková M.,

2 Štruktúra OKM FNsP Skalica, a.s Bakteriológia Priama diagnostika -kultivácia, mikroskopia, detekcia bakt. Ag Klinika Hemokultúty Infekcie dýchacích ciest Infekcie urogenitálneho traktu Črevné infekcie 2006 Serológia Nepriama diagnostika -detekcia prítomnosti protilátok Baktérie Vírusy Parazity 2011 Molekulárno biolog. metódy (PCR) Priama diagnostika -detekcia nukleovej kyseliny Baktérie (chlamýdie trachomatis) Vírusy (HPV) Parazity

3 Štruktúra DNA 2 polynukleotidové reťazce tvorené nukleotidmi 5C monosacharid pentóza (deoxy ribóza) Kys. trihydrogénfosforečná H 3 PO 4 Báza -Purínová (A,G) alebo Pyrimidínová (C,T)

4 Neamplifikačné Hybridizácia Dôkaz nukleových kys. DNA/RNA Metódy: Amplifikačné Kvalitatívne: PCR, microarray sys. Kvantitatívne: RealTime PCR

5 NEAMPLIFIKAČNÉ Hybridizácia Dôkaz DNA/RNA vo vzorke bez predchádzajúcej amplifikácie cieľovej /target/ nukleovej kys. Využíva značené hybridizačné sondy (DNA/RNA) SONDA = oligonukleotid, komplementárny k špecifickej (hľadanej) sekvencii NK väzba cez H mostíky

6 AMPLIFIKAČNÉ I. Kvalitatívne (PCR) II. Kvantitatívne (Real-time PCR) I. Kvalitatívne PCR polymerázová reťazová reakcia - amplifikácia špecifickej sekvencie DNA (druhovo špecifický úsek) - vyžaduje predchádzajúcu izoláciu cieľovej DNA zo vzorky 1. Izolácia DNA 2. PCR -Denaturácia - Anelácia primerov - Elongácia 3. Analýza produktu

7 Izolácia DNA zo vzorky biolog. materiálu Zdrojom templátovej DNA: Krv EDTA, BAL, iné telové tekutiny, tkanivo NEVYHNUTNOSŤ odstrániť porfyrínové zlúč. (hemoglob., hematín) inhibujú PCR Pozor na výtery obsahujúce krv! Cieľ: získať dostatočné množstvo DNA vo vyhovujúcej kvalite Množstvo: od ng po μg

8 Reakčná zmes Master mix Primery- krátke oligonukleotidy, komplementárne k cieľovej sekvencii ssdna - Špecifita reakcie: nukleotidov Nukleotidy- vo forme trifosf. (datp, dttp, dctp, dgtp) Polymeráza- Taq Pufor - obsahujúci Mg 2+ ióny, pre optim.aktivitu Taq poly Optimálna konc. Mg mmol/l

9 Princíp PCR 1. Denaturácia teplota o C /94 o C 1 min., príp. 95 o C 30s/ uvoľnenie H mostíkov ( teplota pri počte G-C párov) oddelenie vlákien templátovej DNA 2 ssdna 2. Anelácia primerov teplota o C /~60 o C/ naviazanie primerov ku komplementárnej sekvencii templátovej ssdna 3. Elongácia teplota o C /72 o C/ syntéza nového komplementárneho vlákna od 3 OH konca primera pomocou Taq polymerázy podľa templátovej ssdna vznikne dsdna amplikón

10 1. Denaturácia

11 2. Anelácia primerov

12 3. Elongácia

13 1 východisková ds DNA 35 cyklov 2 36 kópií PCR prebieha v termocykleri umožňuje automaticky naprogramovať teplotný režim a počet cyklov Optimálny počet cyklov závisí od konc. jednotlivých zložiek reakcie, v rozsahu cyklov (1-4 hod)

14 Analýza produktu amplifikácie Detekcia ELFO (ds amplikóny): Separácia fragmentov v jednosmernom elekt. poli od k + podľa ich molekulovej hmotnosti Agarózový gél ( Et-Br, UV) Polyakrylamidový gél (PAGE) jemná separácia, umožňuje detekovať rozdiel dĺžky 1 bp, na separáciu malých fragmentov Fluorescencia Využitie v Real-time PCR

15 Kontaminácie PCR Separovať priestory pre izoláciu DNA, prípravu PCR a analýzu produktu! Každý úsek má mať sadu pipiet, ktoré sa neprenášajú Priestory dekontaminovať UV žiarením Používať jednorázový spotreb. materiál (rukavice, špičky, mikroskúmavky) Reagencie deliť na alikvóty, na jedno použite

16 Real-Time PCR II. Kvantitatívne amplifikačné metódy -umožňuje sledovať nárast počtu amplikónov v reálnom čase - využíva fluorogénne farbivá - bez potreby postamplifikačnej analýzy - je možné využiť aj na kvalitatívnu analýzu

17 OKM FNsP Skalica a.s. - od novembra 2011 zriadenie PCR laboratória Vyšetrujeme: od Ch. trachomatis kvalitatívna detekcia metódou Real-time PCR Ch. trachomatis je intracelulárna baktéria, ktorá vyvoláva infekcie urogenitálneho a reprodukčného systému. Najčastejšie pohlavne prenášané ochorenie vo vyspelých krajinách. Ak sa nelieči môže spôsobiť u žien neplodnosť. Odber výterov suchý dakrónový tampón Z materiálu: - urogenitálne a rektálne výtery - výter hrdla - výtok z oka - moč 1. porcia - sekrét z prostaty

18 Vyšetrujeme: od HPV vysokorizikové genotypy 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 Ľudský papilomavírus (HPV), jeho niektoré genotypy zvyšujú riziko rakoviny krčka maternice. 1. Z materiálu - cervikálne a uretrálne zoškraby 2. Do transportnej pôdy - dodá laboratórium 3. Simultánna kvalitatívna detekcia metódou Real-time PCR 4. Detekcia produktov reakcie - fluorescenčné farbivá

19 Princíp: Amplifikácia špecifického úseku DNA s použitím špecifických primerov. Detekcia produktov reakcie fluorescenčné farbivá, ktoré sa naviažu na amplifikovaný produkt. Monitorovanie intenzity fluorescencie počas Real-time PCR umožňuje detekciu akumulovaného produktu bez nutnosti otvárania reakčnej skúmavky, čo výrazne znižuje možnosť kontaminácie.

20 Diagnostika pôvodcov infekčných ochorení:! Vírusy (HPV, HBV, HCV, CMV, HIV, HSV1/2, a.i.)! Baktérie (Ch. trachomatis, B. burgdorferi, T. pallidum, M. tuberculosis a.i.) Huby (P. jiroveci), Parazity Taxonómia Archeológia: určovanie pohlavia, príbuzenských vzťahov a.i. Aplikácie PCR Dôkaz mikroorganizmov v potravinách Genetika hospodárskych zvierat a rastlín Diagnostika geneticky podmienených ochorení (fenylketonúria, cystická fibróza, kosáčikovitá anémia a.i.) Kriminalistika a súdne lekárstvo(genetické odtlačky, dôkaz paternity)

21 Výhody: Rýchlosť (cca 3 hodiny) Detekcia ťažko kultivovateľných patogénov (Ch. trachomatis, vírusy...) Rýchla detekcia patogénov s dlhou kultivačnou dobou (M. tubeculosis...) Detekcia patogénov, ktorých vitalita a rastové schopnosti sú obmedzené napr. prebiehajúcou ATB liečbou Detekcia patogénov prítomných vo veľmi malom množstve citlivosť, špecificita, spoľahlivosť, využitá ako konfirmačná metóda

22 Ďakujeme za pozornosť Tešíme sa na spoluprácu