Analýza nukleových kyselín

Transcript

1 Analýza nukleových kyselín elektroforetická analýza ( agaróza, PAGE) Southern, Northern- analýza, dot blot, Western - blotting Elfo analýza

2 Elektroforetická analýza nukleových kyselín (Agaróza a PAGE) - Elektroforéza (agarózová alebo PAGE) patrí medzi jednoduché, pomerne rýchle metódy na izoláciu, identifikáciu a prečistenie fragmentov DNA, RNA alebo proteínov. Pri charakterizácii DNA a RNA patrí medzi jej výhody aj priama detekcia fragmentov v ultrafialovom svetle, pomocou farbenia s fluórescenčným interkalačným činidlom, etídiumbromidom, ktorého prítomnosť umožňuje vizualizovať napr. v agarózovom géli už 10 ng DNA alebo RNA. Záporne nabitá molekula DNA sa pohybuje v agarózovom géli k anóde (- fi +) + Pohyblivosť molekúl DNA v elektrickom poli závisí od: - molekulovej hmotnosti: lineárne dvojvláknové molekuly DNA sa pohybujú v agarózovom géli rýchlosťou, ktorá je nepriamo úmerná logaritmu ich relatívnych molekulových hmotností (počtu bázových párov), väčšie molekuly DNA migrujú pomalšie, lebo nemajú možnosť prechádzať cez póry v géli, tak ako malé molekuly. - koncentrácie agarózy: lineárne molekuly rovnakej veľkosti sa pohybujú v géli s rôznou koncentráciou agarózy rozličnou rýchlosťou - konformácie DNA: superhelikálna, nickovana a lineárna forma molekuly DNA sa pohybujú rôznou rýchlosťou v závislosti od koncentrácie EtBr - smeru elektrického poľa: pulzná elektroforéza - delenie veľkých molekúl DNA do kb - použitého napätia: 5V/cm - zloženia báz a teploty: delenie nezávisí od zloženia báz a v rozmedzí 4 až 30 C je stále (room temperature), nízko topiacu agarózu a < 0,5 % agarózový gél je lepšie deliť v chladničke pri 4 C. - prítomnosti etídium bromidu v géli: znižuje pohyblivosť lineárnych molekúl DNA. - zloženia elektroforetického tlmivého roztoku

3 Agaróza Agaróza je polymer extrahovaný z morských chalúh. V súčasnosti sú dostupné agarózy s rôznym stupňom čistoty a špeciálnymi vlastnosťami Závislosť delenia fragmentov DNA od koncentrácie agarózového gélu Obsah agarózy (%, w/v) Rozsah delenia DNA (kb) 0,3 60 až 5 0,6 20 až 1 0,7 10 až 0,8 0,9 7 až 0,5 2,0 3 až 0,1

4 Postup prípravy 0,8% - ného agarózového gélu na separáciu 0,5-20 kb fragmentov DNA: navážime 0,8 g agarózy do 100 ml 1x koncentrovaného elektroforetického tlmivého roztoku TAE alebo TBE agarózu rozpustíme vo vriacej vode, v tlakovej nádobe alebo v mikrovlnnej rúre roztok agarózy ochladíme na 50 C a pridáme etídiumbromid (zásobný roztok 10 mg/ml vo vode, skladovať pri 4 C v výslednej koncentrácie 0,5 mg/ml tmavej nádobe) do tesniacou páskou zalepíme okraje podnosu na prípravu gélu na podnos umiestnime hrebeň na vytvorenie jamiek pre nanášanie vzoriek (hrebeň je konštruovaný tak, že jeho krajné zuby dosahujú až na dno podnosu, ostatné zuby sú kratšie, čím je po stuhnutí agarózy zabezpečené vytvorenie jamiek s dnom z agarózového gélu) vylejeme primeraný objem roztoku agarózy (od šírky zubov použitého hrebeňa a hrúbky gélu bude závisieť objem nanášanej vzorky DNA) do pripraveného podnosu a necháme vychladnúť pri laboratórnej teplote (asi minút) zo stuhnutého gélu vyberieme hrebeň, odstránime tesniacu pásku, podnos s gélom vložíme do elektroforetickej aparatúry a zalejeme

5 s identickým 1x koncentrovaným elektroforetickým tlmivým roztokom, obsahujúcim 0,5 mg/ml etídiumbromidu tak, aby roztok presahoval gél do výšky asi 1 mm (agarózový gél možeme farbiť etídiumbromidom až po skončení delenia vo farbiacom roztoku takže ho nemusíme vždy pridávať do pripravovaného gélu a elektroforetického roztoku, výhodou priameho farbenia gélu etídiumbromidom je však možnosť pozorovania pohyblivosti fragmentov DNA pod UV svetlom v ktorejkoľvek fáze elektroforetického delenia). do jamiek v agarózovom géli, zaliatych s elektroforetickým roztokom, nanesieme pomocou mikropipety vzorky DNA zmiešané s nanášacím tlmivým roztokom. Roztoky pre nanášanie vzoriek DNA sa obyčajne pripravujú 6-10x koncentrované a obsahujú glycerín alebo sacharózu, ktorá svojou hustotou umožní klesnutie vzorky DNA do nanášacej jamky a farbivo brómfenolovú modrú, ktoré zabezpečuje viditeľnosť pohybu štartovacej zóny (bróm fenolová modrá má nízku molekulovú hmotnosť a v géli sa pohybuje ako DNA fragment o veľkosti 500 bp). Pri bežnej analýze sa na jednu dráhu nanáša približne 0,2 až 0,5 mg DNA ale množstvo DNA môžeme zvýšiť až na 5-10 mg v závislosti od hrúbky gélu a šírky jednotlivých elektroforetických dráh). aparatúru pripojíme na zdroj napätia (odporúčaná intenzita napätia 5 V na 1 cm vzdialenosti medzi elektródami), elektroforetické delenie necháme prebiehať pri laboratórnej teplote pokiaľ modrá štartovacia zóna nedosiahne koniec gélu. Ak sme pripravili gél s nízkou koncentráciou agarózy (0,3%) na izoláciu väčších molekúl DNA (5-60 kb), ktorý je krehký, odporúča sa umiestniť elektroforetickú aparatúru do chladničky.

6 Príprava elektroforézy v agarózovom géli Technika prípravy jamiek na aplikáciu vzoriek pri agarózovej elektroforéze

7 Elektroforetické delenie DNA v agarózovom géli Dráha č. 1 štandard molekulovej hmotnosti bp ladder (veľkosti fragmentov 500 bp až bp s odstupňovaním po 500 bp, zvýraznený je fragment o veľkosti 5000 bp); dráha č. 2 - neštiepená chromozómová DNA kmeňa S. bovis; dráha č. 3 - chromozómová DNA S. bovis štiepená restrikčnou endonukleázou HindIII; dráha č. 4 neštiepená DNA plazmidu pkil18; dráha č. 5 - DNA plazmidu pkil18 štiepená restrikčnou endonukleázou HindIII; dráha č. 6 - štandard molekulovej hmotnosti - l- DNA štiepená restrikčnou endonukleázou BstEII (veľkosti fragmentov 702 bp, 1264 bp, 1371 bp, 1929 bp, 2323 bp, 3675bp, 4324 bp, 4822 bp, 5687 bp, 6369 bp, 7242 bp a 8453 bp).

8 Stanovenie koncentrácie DNA Na určenie koncentrácie nukleových kyselín (DNA, RNA) v roztokoch sa používa spektrofotometrická alebo fluórescenčná metóda, ktorá využíva farbenie DNA pomocou etídiumbromidu (malé množstvo nukleových kyselín alebo vzorka DNA je kontaminovaná látkami, ktoré interferujú s absorbanciou v UV svetle, interkaláciou etídiumbromidu do molekúl nukleových kyselín sa v UV svetle emituje fluorescencia, ktorá je priamo úmerná koncentrácii nukleových kyselín. Množstvo DNA v skúmanej vzorke stanovíme porovnávaním jej fluorescencie s intenzitou fluorescencie riedenej sady štandardnej DNA o známej koncentrácii, buď priamo v agarózom géli alebo na parafínovej fólii pod UV svetlom). Molekuly DNA obsahujú purínové a pyrimidinové bázy, ktoré majú aromatický charakter a absorbujú charakteristickým spôsobom ultrafialové žiarenie o vlnovej dĺžke l v rozsahu nm. Pri spektrofotometrickej metóde meriame absorbanciu vzorky nukleových kyselín pri vlnovej dĺžke 260 nm a 280 nm. Hodnoty A namerané pri 260 nm nám umožňujú stanoviť koncentráciu nukleových kyselín nasledovne: 1 A 260 odpovedá 50 mg/ml pre dvojvláknovú DNA, 40 mg/ml pre jednovláknovú DNA a RNA a 20 mg/ml pre oligonukleotidy. Pretože prítomnosť RNA, proteínov, detergentov a organických rozpúšťadiel ovplyvňuje priebeh absorbčného spektra, môže byť spektrofotometricky vyhodnocovaná i čistota vzorky. Vzhľadom k tomu, že najbežnejšie znečisťujúcimi látkami bývajú proteíny, ktoré majú absorbčné maximum pri vlnovej dĺžke 280 nm, používa sa často ako kritérium čistoty pomer A 260 /A 280. Pri spektrofotometrickej metóde pomer A 260 /A 280 poskytuje informácie o čistote preparátov nukleových kyselín; ak uvedený pomer dosahuje hodnoty 1,8-2, môžeme hovoriť o čistých preparátoch nukleových kyselín. Znečistenie preparátov nukleových kyselín (fenolom, bielkovinami) znižuje uvedené pomerné hodnoty, čo zároveň znižuje presnosť spektrofotometrického stanovenia koncentrácie DNA alebo RNA.

9 Identifikácia plazmidových foriem DNA v prírodnych izolátoch baktérií Dvojrozmerná agarózová elektroforéza B Plazmidový profil DNA po zafarbení s EtBr v agarózovom géli. A, l DNA-Hind III (0,5mg); B, zmes rovnakých množstiev l DNA, PM2 DNA, ColE1 DNA a pbr322 (2 mg celkove); 1, lambda DNA(0,5mg) ; 2, PM2 DNA (0,5mg); 3, ColE1 DNA (0,5mg); 4, pbr322 (0,5mg); C, CCC DNA; O, OC DNA; L, lineárna DNA; CR, chromozomálna DNA; CD, CCC diméry; OD, OC diméry; Profil DNA fragmentov zmesy B po ožiarení pod UV svetlom a pustení ELFO druhym smerom. Označenie a skratky sú tie isté ako na predchádzajúcom obrázku len O * značia novovzniknuté OC formy po ožiarení UV svetlom. E. coli V517 štandard na určovanie molekulovej hmotnosti ccc foriem plazmidovej DNA v prírodných izolátoch baktérií (1,36; 1,79; 2,03; 2,63; 3,39; 3,67; 4,82; 35,84 x 10 6 Daltonov)

10 Stanovenie molekulovej hmotnosti fragmentov DNA (1) Molekuly plazmidovej DNA sa môžu vyskytovať v rôznych formách: superšpiralizovanú (superhelical alebo covalent closed circular, ccc), kruhovú otvorenú (relaxed alebo open circular, oc) a lineárnu (l), prípadne ich diméry, ktorých pohyblivosť v agarózovom géli je rôzna Všeobecne oc formy DNA sa pohybujú v agarózom géli najpomalšie, potom nasledujú l formy a ccc formy, ktoré sa pohybujú najrýchlejšie, čo súvisí s ich priestorovou konformáciou a zníženou schopnosťou interkalácie etídiumbromidu (dvojrozmerná ELFO). Pri stanovovaní molekulovej hmotnosti neznámej kruhovej plazmidovej DNA z prírodných bakteriálnych izolátov, sa po určení prítomnosti počtu plazmidov (ccc foriem), používa zmes ccc foriem plazmidových molekúl izolovaných z kmeňa E. coli V517, ktorý obsahuje osem ccc molekúl DNA v rozsahu molekulovej hmotnosti 1,36 až 35,84 x 10 6 D. Molekulovú hmotnosť ccc foriem nemôžeme stanovovať oproti štandardom, ktoré obsahujú lineárne fragmenty, vzhľadom na ich rozdielnu pohyblivosť v agarózovom géli! Ak bakteriálny kmeň obsahuje len jeden plazmid, ktorý má unikátne štiepne miesto pre restrikčnú endonukleázu, možeme izolovanú zmes foriem plazmidu linearizovať a stanoviť molekulovú hmotnosť l formy plazmidovej DNA (podobne pri analýze rekombinantnej DNA alebo pri analýze PCR produktov) Podstata stanovenia molekulovej hmotnosti lineárnej molekuly DNA spočíva v porovnaní pohyblivosti fragmentu DNA nášho záujmu s pohyblivosťou štandardných fragmentov DNA so známou molekulovou hmotnosťou (ako štandardy na stanovenie molekulovej hmotnosti fragmentov DNA sa často používa zmes dvojvláknových lineárnych fragmentov DNA so známou molekulovou hmotnosťou).

11 Stanovenie molekulovej hmotnosti fragmentov DNA (2) Keď použijeme štandardy DNA, ktoré obsahujú fragmenty s lineárne stúpajúcou molekulovou hmotnosťou (100 bp rebrík - ladder, 1kb ladder), molekulovú hmotnosť skúmaného fragmentu DNA môžeme odhadnúť aj priamo v agarózom géli, porovnaním jeho pohyblivosti s pohyblivosťou štandardných fragmentov DNA. alebo Po ukončení elektroforézy sa zmeria vzdialenosť fragmentu DNA od štartu a porovná sa s pohyblivosťou štandardnej DNA. Po grafickom znázornení pohyblivosti jednotlivých fragmentov štandardnej DNA v závislosti od logaritmu ich molekulovej hmotnosti, odčítame z grafu na základe pohyblivosti hodnotu logaritmu molekulovej hmotnosti skúmaného fragmentu DNA. Pre presný výpočet veľkosti fragmentov DNA existujú viaceré počítačové programy. veľkosť fragmentov dvojvláknovej DNA sa uvádza v počte bázových párov, 1 kilobáza = 1kb = 1000 bázových párov, 1kb dvojvláknovej DNA odpovedá molekulovej hmotnosti 660 kd

12 Schématické znázornenie určenia molekulovej hmotnosti lineárnych fragmentov dvojvláknovej DNA pomocou odhadu, priamo z pohyblivosti fragmentov štandardnej DNA (l-dna~hindiii) v agarózovom géli a pomocou výpočtu z grafického znázornenia pohyblivosti fragmentov DNA v závislosti od molekulovej hmotnosti fragmentov DNA.

13 Polyakrylamidová gélová elektroforéza (PAGE) Akrylamid je monomér, ktorý v prítomnosti voľných radikálov (persulfát amonný) a stabilizačného činidla TEMEDu (N,N,N,N tetrametyletylén diamín) polymerizuje do dlhých reťazcov. V prítomnosti N,N -metylénbisakrylamidu nastáva počas polymerizácie sieťovanie, pričom vzniká gél, ktorého pórovitosť je určená dĺžkou reťazcov a stupňom priečneho sieťovania. Rôznymi koncentráciami akrylamidu môžeme dosiahnuť rozličný stupeň sieťovana a rôzny stupeň separácie molekúl. Častejšie sa používa na analýzu proteínov ale využíva sa aj pri analýze NK. PAGE aparatúra je konštruovaná vo vertikálnom prevedení, systém prípravy gélov je o niečo zložitejší ako pri príprave agarózových gélov. Pri analýze exprimovaných proteínov pri klonovaní tvorí PAGE nevyhnutný základ pre Western blot. Závislosť delenia fragmentov DNA od koncentrácie akrylamidového gélu Množstvo akrylamidu (%, w/v) Separácia (počet nukleotidov) 3,5 100 až ,0 80 až 500 8,0 60 až ,0 40 až ,0 6 až 100

14 Hybridizácia (1) Pri analýze rekombinantných klonov často používame techniku hybridizácie rekombinantnej DNA s označenou sondou (probe), ktorej sekvencia je komplementárna k hľadanému-klonovanému úseku DNA. Hybridizácia využíva špecifické párovanie báz (GC a AT), ktoré umožňuje vytvárať in vitro závitnicu nukleovej kyseliny z jednotlivých vlákien s komplementárnou sekvenciou. Nie je pritom rozhodujúce, či ide o vlákna DNA alebo RNA. Môžu sa tak vytvárať molekuly dvojzávitnicovej DNA, RNA alebo hybridné molekuly zložené z jedného vlákna DNA a z jedného vlákna RNA. Jedno vlákno pritom reprezentuje templát a druhé vlákno vhodne označená sonda (rádioaktívne alebo nerádioatívne), ktorá umužňuje hybridnú molekulu NK vizualizovať. Po izolácii plazmidovej DNA z rekombinantných klonov sa táto štiepi s restrikčnými enzýmami a vzniknuté fragmenty DNA sa rozdelia agarózovou elektroforézou. Potom sa DNA prenesie z agarózy na nitrocelulózovú, alebo nylonovú membránu (Southern transfer, Southern blotting), kde sa po alkalickej denaturácii a vysušení nechá hybridizovať so sondou. Ireverzibilné naviazanie DNA na membránu sa dosahuje vysušením filtra pri teplote 80 o C alebo pôsobením UV žiarenia. Ak dôjde k hybridizácii sondy k niektorému fragmentu plazmidovej DNA, znamená to, že tento fragment obsahuje hľadaný-klonovaný úsek DNA. Technika hybridizácie sa používa aj pri vyhľadávaní určitého klonu v génovej knižnici, pričom počet rekombinantných klonov knižnice (bakteriálne kolónie v prípade plazmidovej knižnice, alebo plaky v prípade fágovej knižnice) môže dosahovať hodnoty rádovo Táto technika sa nazýva hybridizácia v kolónii, resp. v plaku (colony hybridization, plaque hybridization). Northernov prenos-hybridizácia (RNA blotting): delenie fragmentov špecifickej mrna z totálnej alebo polya RNA pomocou denaturačnej agarózovej elekroforézy, prenos na aktivovanú celulózu, nitrocelulózu alebo nylónovú membránu, fixácia, hybridizácia s rádioaktívne značenou DNA alebo RNA, autorádiografia.

15 Hybridizácia in situ

16 Hybridizácia (2) Dot hybridizácia: rádioaktívne značená sonda (DNA alebo RNA) je hybridizovaná so vzorkou, ktorá obsahuje RNA alebo RNA imobilizovanou na pevnom nosiči. Jednotlivé vzorky biologického materiálu (body, dots) sú po autorádiografii denzitometricky vyhodnotené, pričom môžeme kvantitatívne aj kvalitatívne porovnať prítomnosť cielenej sekvencie v jednotlivých vzorkách (analýza bez ELFO stanovenia veľkosti hubridizovaných fragmentov DNA). Hybridizačné sondy sú rádioaktívne alebo v poslednom čase veľmi často i nerádioaktívne značené. Rádioaktívne značenie spočíva v substitúcii fosforu za rádioaktívny izotop 32 P alebo 33 P, prípadne kyslíka za 35 S v nukleotidoch použitých na prípravu sondy. Detekcia pozitívneho signálu sa potom uskutočňuje pomocou autorádiografie, ktorá spočíva v tom, že po ukončení hybridizácie a odstránení nenaviazanej sondy z membrány sa na túto položí fotografický film, na ktorom rádioaktívne žiarenie vytvorí čierne škvrny na miestach, kde došlo k hybridizácii. Nerádioaktívne značenie možno dosiahnuť naviazaním určitých látok ( značiek ) na nukleotidy použité pri príprave sondy. Tieto značky môžu byť fluoreskujúce látky, ktoré možno detegovať na základe fluorescenie, alebo majú vlastnosti antigénnych determinantov (digoxigenín), prípadne sa vyznačujú afinitou k iným látkam (napr. biotín k streptavidínu). Detekcia sa potom uskutoční pomocou príslušnej protilátky (v prípade biotínu pomocou streptavidínu) konjugovanej s určitým enzýmom (alkalická fosfatáza, peroxidáza), ktorý po pridaní špecifického substrátu vytvorí farebný produkt alebo produkt vyznačujúci sa chemiluminiscenciou.

17 Hybridizácia (3) Použitie hybridizačných techník je podmienené dostupnosťou sondy Jedným zo spôsobov ako získať sondu je využiť už naklonovaný príbuzný gén. Iná možnosť je použiť sondu syntetizovanú podľa známej bielkovinovej sekvencie. Nakoľko jedna aminokyselina môže byť kódovaná viacerými kodónmi, je potrebné syntetizovať niekoľko alternatívnych sônd so zohľadnením degenerácie genetického kódu. Pri výbere syntetického oligonukleotidu ako sondy, sa vyberajú také úseky sekvencie, ktoré prevažne obsahujú také aminokyseliny, ktoré sú kódované len jedným prípadne dvoma kodónmi (metionín, tryptofán, fenylalanín, tyrozín, histidín). Ďalšou možnosťou je použitie cdna ako sondy. Špecifická cdna sa môže získať po selektívnej izolácii požadovanej mrna, ktorá zvlášť v niektorých špecializovaných orgánoch eukaryontov môže tvoriť podstatnú časť. Pri rádioaktívnom značení fragmentov NK používame izotopy [ 32 P], [ 35 S], [ 125 I] prípadne [ 3 H], ich používanie má však aj nevýhody majú krátky polčas rozpadu, čo súvisí s potrebou opakovanej prípravy sond. práca s rádioaktívnym materiálom vyžaduje špeciálne postupy (bezpečnosť pri práci, spracovanie rádioaktívneho odpadu, samotná cena izotopov je dosť vysoká).

18 Hybridizácia DNA- Southern blot Príprava rádioaktívne značených sond DNA a RNA v fosforyláciou ktorej alebo RNA pomocou bakteriofág T4 polynukleotid kinázy, pri g-fosfát ATP je prenášaný na 5 hydroxylový koniec DNA v nick transláciou, pri ktorej E. coli DNA polymeraza I vymieňa neznačené nukleotidy v dvojvláknovej DNA za a- 32 P značené nukleotidy v syntézou a značením jednovláknových sodn komplementárnych k DNA sekvenciám klonovaných v M13 vektore v prípravou značených jednovláknových RNA transkriptov z DNA in vitro, ktoré môžu byť použité pri tvorbe hybridov DNA:RNA a RNA:RNA

19 Priama fosforylácia T4 polynukleotid kináza prenáša g-fosfát ATP na 5 koniec defosforylovanej DNA DNA OH 5 / RNA OH 5 bakteriofág T4 polynukleotid kináza RNA+ADP [g- 32 P]ATP, dithiothreitol, Mg +2 5 [ 32 P]DNA / 5 [ 32 P] 5 HO C p G p C.. 3 [g- 32 P]ATP dithiothreitol Mg +2 bakteriofág T4 polynukleotid kináza 5 * p C p G p C 3 + ADP Výmenná reakcia T4 polynukleotid kináza prenáša v nadbytku ADP koncový 5 fosfát z fosforylovanej DNA na ADP. DNA je potom refosforylovaná prenosom rádioaktívne značeného g-fosfátu z [g- 32 P]ATP 5 p C p G p C nadbytok ADP [g- 32 P]ATP dithiothreitol Mg +2 bakteriofág T4 polynukleotid kináza 5 * p C p G p C 3 + ADP +ATP

20 Značenie 5 koncov dvojvláknovej DNA a RNA Značenie 5 koncov priamou fosforyláciou Značenie 5 koncov výmenou 5 fosfátovej skupiny

21 Nick translácia pri ktorej E. coli DNA polymeraza I vymieňa neznačené nukleotidy v dvojvláknovej DNA za a- 32 P značené nukleotidy. Dvojvláknová DNA (sonda) je na začiatku opracovaná s určitým množstvom DNA-ázy I v prítomností horčíka, vzniknuté zlomy-medzery (nicks) vo vláknach DNA slúžia potom ako priméry pre syntézu DNA pomocou E. coli DNA polymerázy I. Počas syntézy sa rádioaktívne značené nukleotidy inkorporujú do narastajúceho reťazca DNA (v mieste 3 -OH ) a medzera sa posúva v smere 5 fi3 (nick translation) podĺž reťazca DNA pôsobením exonukleázovej aktivity (odstraňuje nukleotidy z 5 konca medzery), ktorá je súčasťou aktivity E. coli DNA polymerázy I. Časť nukleotidov je radioaktívne značená [a- 32 P] dntp

22 Nick translácia DNA polymeráza I značí obe vlákna DNA na viacerých miestach náhodne, čo môže spôsobiť pri hybridizácii kompetitíciu značených a neznačených častí sondy s cieľovým vláknom DNA.

23 Značenie DNA predlžovaním náhodne vzniknutých hexanukleotidových primérov zo zmesou dntp (rádioatívne alebo nerádioaktívne značených) a Klenowho fragmentu DNA polymerázy I Zmes náhodných primérov môžeme získať trávením DNA teľacieho týmusu alebo spermií lososa s DNA-ázou I, pričom získame rôznorodú zmes jednovláknovej DNA v rozmedzí 6-12 nukleotidov kúpou hotovej zmesi random oligonucleotides (väčšinou hexanukleotidy) syntetizovaním populácie oktamérov na automatickom syntetizátore, ktoré obsahujú všetky bázy v každej pozícii.

24 Nerádioaktívne značenie nukleových kyselín Digoxigenín-UTP/dUTP/ddUTP DIG-UTP (R1= OH, R2=OH DIG-dUTP (R1=OH, R2-H) DIG-ddUTP (R1=H, R2=H) Digitalis purpurea Biotin-dUTP Fluorescín-dUTP

25 Značenie RNA s DIG-UTP počas prepisu in vitro

26 Značenie DNA predlžovaním náhodne vzniknutých hexanukleotidových primérov so zmesou dntp a Dig-dUTP Detekcia hybridných molekúl DNA značených pomocou DIG-dUTP

27 Citlivosť detekcie DNA pri značení pomocou digoxigenínu v kontrolnom Southern prenose Citlivosť detekcie DNA pri značení pomocou digoxigenínu pri dot blote Nerádioaktívny digoxigenínový systém značenia a detekcie nukleových kyselín umožňuje detegovať 0,1pg homologickej DNA a 0,3 pg homologickej RNA a je porovnateľný s citlivosťou rádioaktívneho značenia

28 Génovú knižnicu možno pripraviť aj s použitím tzv. expresívneho vektora, ktorý umožňuje expresiu klonovaného génu (t.j. tvorbu príslušného proteínu) v hostiteľskej bakteriálnej bunke. Príslušný klon možno potom v génovej knižnici nájsť pomocou protilátky k tomuto proteínu, alebo využitím funkčných vlastností proteínov, ktoré vznikli expresiou hľadaných génov, napr. sledovaním enzýmovej aktivity, kde je detekcia možná pomocou špeciálnych detekčných pôd. Takýmto spôsobom boli úspešne vyhľadávané klony, ktoré niesli rekombinantnú DNA s génmi pre amylázu, celulázu, proteázu, nukleázu, agarázu a mnohé iné. Detekcia je jednoduchá vtedy, keď je syntetizovaná bielkovina produkovaná z bunky von, v opačnom prípade musíme steny buniek najprv rozrušiť, napríklad v parách chloroformu alebo indukciou teplotne temperovaných fágov. Western blot Western blotting je pre charakterizáciu proteínov to isté ako pre nukleové kyseliny Southern blotting. Pri technike Wb sú proteíny elektroforeticky rozdelené (PAGE) prenesené z gélu na pevný nosič (nitrocelulózový filter, nylónová membrána) a značené reagenciami, ktoré sú špecifické pre určitú sekvenciu aminokyselín. Ako sondy sa používajú protilátky, ktoré reagujú špecificky s antigénnymi epitopmi cieľových proteínov naviazaných na pevnom nosiči. Western blotting je preto veľmi užitočný pri identifikácii a kvantifikácii špecifických proteínov v komplexnej zmesy proteínov, ktoré nie sú rádioaktívne značené. Na vizualizáciu väzby proteín:protilátka sa používa obyčajne ešte sekundárna protilátka (napr. proteín A), ktorá je zviazaná s alkalickou fosfatázou (chrenovou peroxidázou) zabezpečujúcou farebnú reakciu so špecifickým substrátom (napr. 5-brómo-4-chlóro-3-indolyl fosfát/nitro tetrazólium modrá, BCIP/NBT, citlivosť 1-5 ng proteínu). Výber protilátok na detekciu cieľových proteínov podlieha iným špecifickým pravidlám ako výber sondy na hybridizáciu NK.

29 Použitie fingerprintingu DNA pri určení rodičovstva analýzou krvi matka, 2-3 jednovaječné dvojčatá, 4- otec, 5-6 neznámy muži 5 mg DNA vyizolovanej z bielych krviniek bolo štiepené s enzýmom HinfI a hybridizované s rádioaktívne značenou sondou 33,15 (AGAGGTGGGCAGGTGG) 29, ktorá v rozsahu 4-20 kb štandardne deteguje 6 typických fragmentov DNA (fi). Individuálne fragmenty v profile DNA detí sa musia prekrývať s fragmentami DNA matky a otca, ktoré sa dedia približne na polovicu (pravdepodobnosť, že 6 typických fragmentov DNA skutočného otca sa prekryje s typickými fragmentami DNA neznámeho muža je ~ 5x10-5 ). Jeffreys et al.: Nature, 316, 1985,

30 cdna microarray - DNA chip - technology Používa sa hlavne na identifikácii génovej expresie jednotlivých génov v rôznych funkčných stavoch buniek, často kritických (napr. porovnanie expresie génov normálnych a karcinogénnych buniek), môže sa tiež použiť pri analýze mechanizmu a regulácie vývoja jednotlivých špecializovaných buniek, prípadne aj pri analýze genetických dedičných chorôb...a iné (identifikáciu patogénnych baktérií).