ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ IDO ΣΤΟΝ ΚΑΡΚΙΝΟ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ο καρκίνος του πνεύμονα... 8

Transcript

1 ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΩΝ ΣΠΟΥΔΩΝ «ΕΦΑΡΜΟΣΜΕΝΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΚΑΙ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ» ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΗΣ 2,3 ΔΙΟΞΥΓΟΝΑΣΗΣ ΤΗΣ ΙΝΔΟΛΕΑΜΙΝΗΣ ΣΤΟ ΑΔΕΝΟΚΑΡΚΙΝΩΜΑ ΤΟΥ ΠΝΕΥΜΟΝΑ ΜΑΡΙΑ ΖΑΜΑΝΑΚΟΥ Διπλωματική Εργασία ΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΓΙΑΓΚΟΥ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΜΗΝΑΣ Αναπληρωτής ΜΗΝΑΣ καθηγητής ΓΙΑΓΚΟΥ του Τμήματος Βιολογίας Αναπληρωτής Καθηγητής Τομέας Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας Τμήμα Βιολογίας Τομέας Γενετικής, Ανάπτυξης και Μοριακής Βιολογίας Αριστοτέλειο Πανεπιστήμιο Θεσσαλονίκης ΣΥΝΕΠΙΒΛΕΠΩΝ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΓΕΡΜΕΝΗΣ Αναπληρωτής Καθηγητής - Διευθυντής Εργαστήριο Ανοσολογίας- Ιστοσυμβατότητας Τμήμα Ιατρικής Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας ΛΑΡΙΣΑ 2006

2 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ο καρκίνος του πνεύμονα Ανοσιακή απάντηση και διαφυγή του καρκίνου ,3- ΔΙΟΞΥΓΟΝΑΣΗ ΤΗΣ ΙΝΔΟΛΕΑΜΙΝΗΣ Δομή IDO και φλεγμονή IDO και ανοχή στον καρκίνο Κύτταρα που εκφράζουν IDO IDO και ανοσιακή διαφυγή του καρκίνου Αναστολή της δράσης της IDO Εφαρμογές στη θεραπεία του καρκίνου ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΥΠΟΘΕΣΗ - ΣΚΟΠΟΣ ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Πειραματικός σχεδιασμός / Δείγματα Ιστός ασθενών Κύτταρα περιφερικού αίματος υγιών δοτών Καρκινικές σειρές Δείγματα ιστών υγιών ατόμων Κυτταρικές τεχνικές Συλλογή και μεταχείριση ιστού ασθενών Καλλιέργεια καρκινικών σειρών Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος Πάγωμα κυττάρων Πάγωμα κυττάρων ως ίζημα Καλλιέργεια PBMC υγιών ατόμων διεγερμένων με PHA Μοριακές τεχνικές Εκχύλιση RNA Ποσοτική και ποιοτική ανάλυση Σύνθεση μορίων cdna Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Βελτιστοποίηση κύκλων PCR Ημιποσοτική PCR (Semi-quantitative PCR) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Quantitative Real Time PCR)

3 4. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Έκφραση της IDO σε καρκινικές σειρές Έκφραση της IDO σε δείγματα υγιών ατόμων Έκφραση της IDO σε φυσιολογικό ιστό Έκφραση της IDO σε καρκινικό και μη προσβεβλημένο ιστό ασθενών Σύγκριση της έκφρασης σε όλα τα δείγματα Σχέση της έκφρασης της IDO με το στάδιο της ασθένειας ΣΥΖΗΤΗΣΗ Αξιολόγηση των μεθόδων PCR Έκφραση της IDO σε καρκινικές σειρές, δείγματα υγιών ατόμων και φυσιολογικών ιστών Έκφραση της IDO σε δείγματα χειρουργείου Έκφραση της IDO και ανοσοθεραπεία ΕΠΙΛΟΓΟΣ ΠΕΡIΛΗΨΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ

4 ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η σχέση του ανοσιακού συστήματος με τον καρκίνο έχει αποτελέσει, εδώ και έναν αιώνα περίπου, αντικείμενο εντονότατου ενδιαφέροντος και μελέτης. Η κακοήθης εξαλλαγή (malignant transformation) των κυττάρων αποτελεί ένα συχνό γεγονός που, στις περισσότερες περιπτώσεις, δεν ο- δηγεί στην ανάπτυξη όγκων. Αυτό, ως ένα βαθμό, φαίνεται ότι οφείλεται στη λειτουργία του ανοσιακού συστήματος που είναι ικανό να εντοπίζει και να καταστρέφει, τα εξαλλασσόμενα και ενδεχομένως επικίνδυνα κύτταρα. Η άποψη αυτή που φέρεται ως θεωρία της ανοσοεπιτήρησης του καρκίνου (cancer immunosurveillance), προτάθηκε αρχικά από τον Ehrlich το 1909, και 50 χρόνια αργότερα παρουσιάστηκε από τους Burnett και Thomas, έχει επανέλθει πρόσφατα στο προσκήνιο. Σύμφωνα με αυτήν, τα καρκινικά κύτταρα που προκύπτουν με μεγάλη συχνότητα στον οργανισμό αναγνωρίζονται ως ξένα και εξαλείφονται από τη δράση του ανοσιακού συστήματος [1]. Κατόπιν αυτού, οι όγκοι δημιουργούνται όταν τα καρκινικά κύτταρα κατορθώσουν να διαφύγουν από την επιτήρηση του ανοσιακού συστήματος. Διάφοροι μηχανισμοί έχουν διαπιστωθεί, οι οποίοι φαίνεται να οδηγούν στην διαφυγή του καρκίνου από την επιτήρηση του ανοσιακού συστήματος. Οι μηχανισμοί αυτοί μπορούν να διακριθούν σε δύο ομάδες: σε μηχανισμούς που μειώνουν ενεργά την ανοσιακή απάντηση κατά του όγκου και σε μηχανισμούς, με τους οποίους τα κύτταρα των όγκων αποφεύγουν την αναγνώριση και καταστροφή που μεσολαβείται από τα Τ- κύτταρα [2]. Υποστηρίζεται ότι τα κύτταρα του όγκου και τα Τ- κύτταρα που διηθούν τον όγκο μπορούν να αλλάξουν το μεταβολισμό κάποιων αμινοξέων με σημαντικές επιπτώσεις στην ανοσιακή απάντηση έναντι του καρκίνου [3]. Η ενεργοποίηση του ενζύμου 2,3- διοξυγονάση της ινδολεαμίνης (IDO), που αποικοδομεί την τρυπτοφάνη, συνδέθηκε αρχικά με την περιφερική ανοχή και την ανοχή της μητέρας προς το έμβρυο, πρόσφατα όμως αποδείχθηκε ότι ε- μπλέκεται και στη διαφυγή του καρκίνου από το ανοσιακό σύστημα [4, 5]. Καθώς φαίνεται, η IDO αποικοδομώντας την τρυπτοφάνη στερεί από τα Τ- κύτταρα ένα από τα πιο βασικά αμινοξέα εμποδίζοντας τον πολλαπλασιασμό τους. Σκοπός της εργασίας ήταν να μελετηθεί η παραγωγή IDO από κύτταρα αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, γεγονός που θα μπορούσε, ως ένα βαθμό τουλάχιστον, να ερμηνεύσει την αδυναμία των λεμφοκυττάρων που διηθούν αυτούς τους όγκους, να λύσουν τα καρκινικά κύτταρα

5 Η εργασία αυτή έγινε στη Μονάδα Ανοσολογίας Καρκίνου του Εργαστηρίου Ανοσολογίας- Ιστοσυμβατότητας του Τμήματος Ιατρικής του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας (Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Λάρισας), στο πλαίσιο του χρηματοδοτούμενου από την Ευρωπαϊκή Ένωση ερευνητικού προγράμματος IRTALUNG. Το ανθρώπινο βιολογικό υλικό (όγκοι), που χρησιμοποιήθηκε στην εργασία, συλλεγόταν από το προσωπικό και αποτελεί ιδιοκτησία του Προγράμματος, σύμφωνα με τις διαδικασίες που έχουν εγκριθεί από την Ευρωπαϊκή Ένωση και την Επιτροπή Ηθικής και Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Θεσσαλίας και, ειδικότερα, μετά από ενυπόγραφη συγκατάθεση των ασθενών. Τα αποτελέσματα της εργασίας αποτελούν πνευματική ιδιοκτησία του Εργαστηρίου Ανοσολογίας- Ιστοσυμβατότητας και, σύμφωνα με τον Εσωτερικό Κανονισμό του, δεν μπορούν να δημοσιευθούν χωρίς την έγκριση του Διευθυντή του. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα καθηγητή μου Αν. Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας ΑΠΘ κ. Μηνά Γιάγκου για την ευκαιρία που μου έδωσε και το συνεπιβλέποντα Αν. Καθηγητή κ. Αναστάσιο Γερμενή που με δέχθηκε στο υπό τη διεύθυνσή του Εργαστήριο Ανοσολογίας- Ιστοσυμβατότητας και μου προσέφερε όλα τα μέσα και την υποστήριξη για την ολοκλήρωση της διπλωματικής μου εργασίας. Στον Καθηγητή κ. Βάιο Καρανίκα (EU Marie Curie Fellow στο Εργαστήριο Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας) εκφράζω την ευγνωμοσύνη μου για τη βοήθεια, τη στήριξη και την ανεκτίμητη καθοδήγησή του όλο αυτό το διάστημα. Ευχαριστώ, επίσης, τη Φαίη Σούκου για τις ατελείωτες ώρες της συνεργασίας μας, το Στέφανο Τσόχα για όλη τη βοήθεια του, την Εύα Γραμουστιάνου, τον Κώστα Μπούκα, καθώς και την υπόλοιπη ομάδα της Μονάδας Ανοσολογίας Καρκίνου, ελπίζοντας στη συνέχιση της καλής συνεργασίας μας και στο μέλλον

6 Συντομογραφίες 1MT 1-methyl-tryptophan 1-μεθυλο- τρυπτοφάνη APC Antigen presenting cell Αντιγονοπαρουσιαστικό κύτταρο CTL Cytotoxic T- lymphocyte Κυτταρολυτικό Τ- κύτταρο CTLA4-Ig Cytotoxic T lymphocyte antigen 4 CTL αντιγόνο 4 DC Dendritic cell Δενδριτικό κύτταρο HLA Human leukocyte antigen Αντιγόνο ιστοσυμβατότητας του ανθρώπου IDO Indoleamine 2,3- dioxygenase 2,3 διοξυγονάση της ινδολεαμίνης IFN-γ Interferon gamma Ιντερφερόνη γ LPS Lipopolysaccharide Λιποπολυσακχαρίτης MHC Major histocompatibility complex Κύριο σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας MSC Myeloid suppressor cells Μυελικά κατασταλτικά κύτταρα NK cell Natural killer lymphocyte Φυσικά κυτταροκτόνα κύτταρα NSCLC Non small cell lung carcinoma Μη μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα PBMC Peripheral blood mononuclear cell Μονοπύρηνο περιφερικού αίματος SCLC Small cell lung cancer Μικροκυτταρικό καρκίνωμα TAA Tumor-associated antigens Συνδεόμενα με τον όγκο αντιγόνα TDO Tryptophan dioxygenase Διοξυγονάση της τρυπτοφάνης TGF- b Transforming growth factor β Αυξητικός παράγοντας της βλαστικής μεταμόρφωσης β TILs Tumor infiltrating lymphocytes Διηθητικά λεμφοκύτταρα του όγκου Treg T regulatory lymphocyte Τ ρυθμιστικό λεμφοκύτταρο - 6 -

7 1. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ - 7 -

8 1.1. Ο καρκίνος του πνεύμονα Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η συχνότερη αιτία θανάτου που σχετίζεται με τον καρκίνο, αποτελώντας το 17,8% της συνολικής θνησιμότητας του καρκίνου. Στις μέρες μας, περισσότεροι από 1,2 εκατομμύρια άνθρωποι προσβάλλονται κάθε χρόνο. Επιπλέον, έχει δυσμενή πρόγνωση, αφού λιγότερο από το 15% των ασθενών επιβιώνουν πάνω από 5 χρόνια. Οι κακοήθεις τύποι καρκίνου του πνεύμονα ταξινομούνται σε δύο ομάδες βάσει των χαρακτηριστικών ιστολογικών γνωρισμάτων τους: στο SCLC (<20% των περιπτώσεων) και στο NSCLC (75-80% των περιπτώσεων). Ο NSCLC τύπος διαχωρίζεται περαιτέρω σε πλακώδες καρκίνωμα, αδενοκαρκίνωμα και μεγαλοκυτταρικό καρκίνωμα [6]. Σε ασιατικούς πληθυσμούς το αδενοκαρκίνωμα εμφανίζεται ως η πιο κοινή μορφή καρκίνου των πνευμόνων, ενώ στη δύση έχει αναγνωριστεί ως η συχνότερη μορφή καρκίνου των πνευμόνων στους μη - καπνιστές [7]. Στην Ελλάδα, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου, με 6416 περιπτώσεις καταγεγραμμένες μόνο το 2002 (Βάση δεδομένων GLOBOCAN Σύμφωνα με μελέτες, το αδενοκαρκίνωμα εμφανίζεται συχνότερα στις γυναίκες και τους μη-καπνιστές. Ο Παγκόσμιος Οργανισμός Υγείας κατατάσσει το αδενοκαρκίνωμα σε διάφορες υποκατηγορίες, συμπεριλαμβανομένων των: κυψελοειδούς (acinar), θηλώδους (papillary), βρογχιολο-κυψελοειδούς (bronchiolo-alveolar), στερεού αδενοκαρκινώματος με βλέννη, αδενοκαρκινώματος μεικτού τύπου (Εικ.1) και αδενοκαρκινώματος με διάφορες παραλλαγές. Το χαρακτηριστικό αυτού του τύπου είναι ότι οι αλλοιώσεις εμφανίζονται σε πλευρικές επιφάνειες, προκαλούν την δημιουργία πτυχώσεων στην πλευρική επιφάνεια πάνω από την περιοχή του όγκου και έχουν μαύρη χρώση και στιλπνή όψη παρουσία βλέννης [7]. Το πλακώδες καρκίνωμα του πνεύμονα αποτελεί περίπου το 30% των περιπτώσεων μημικροκυτταρικού καρκίνου. Ξεκινά από τις κεντρικότερες περιοχές του πνεύμονα και μπορεί εύκολα να δώσει μεταστάσεις μέσω του αίματος και της λέμφου των πνευμόνων. Ο πενταετής δείκτης επιβίωσης των ασθενών με πλακώδες καρκίνωμα κυμαίνεται από 47%, στην περίπτωση της έγκαιρης διάγνωσης και αντιμετώπισής του, μέχρι και 8%

9 Α Β Εικόνα 1: Α) Μεικτό αδενοκαρκίνωμα. Στα δεξιά της εικόνας τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν λεπιδικό πρότυπο ανάπτυξης. Στα αριστερά του πεδίου εμφανίζεται κυψελοειδής ανάπτυξη πάνω σε ένα στρώμα κολλαγόνου [7]. Β) Αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα 1.2. Ανοσιακή απάντηση και διαφυγή του καρκίνου Η φύση της ανοσιακής απάντησης που αναπτύσσεται ενάντια σε έναν δεδομένο τύπο καρκίνου μπορεί να ποικίλει ανάλογα με τον τύπο του κυττάρου από το οποίο προέρχεται ο όγκος, με το μηχανισμό του κυτταρικού μετασχηματισμού, με τον ανατομικό εντοπισμό του όγκου και από την ανοσολογική αναγνώριση [1]. Η καταστροφή των μετασχηματισμένων κυττάρων έγκειται στην ενεργοποίηση και κλωνική επέκταση συγκεκριμένων Τ πρόδρομων κυττάρων στους δευτερογενείς λεμφοειδείς ιστούς και στον επανεντοπισμό των κύριων Τ δραστικών κυττάρων στην περιοχή ανάπτυξης του όγκου. Διάφορα αντιγόνα των όγκων μπορούν να αποτελέσουν στόχο της χυμικής ή/και της κυτταρικής, επίκτητης ανοσοαπάντησης [8]. Επίσης, κατά τη διάρκεια των περισσότερων Τ διαμεσολαβούμενων απαντήσεων κατά του όγκου, παράγονται ειδικά αντισώματα ενάντια σε TAA, αλλά η σημασία της παρουσίας τους στον έλεγχο όγκων in vivo αμφισβητείται [9]. Ιστολογικές μελέτες ανθρώπινων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του αδενοκαρκινώματος των πνευμόνων [10], έχουν δείξει ότι η πλειοψηφία τους περιλαμβάνει ένα αξιοσημείωτο αριθμό λεμφοκυττάρων που διηθούν τα καρκινικά κύτταρα (Εικ. 2). Ειδικά Τ κύτταρα έναντι σε αντιγόνα του ό- γκου έχουν ανιχνευθεί σε μικρούς ή μεγάλους αριθμούς [11] και το γεγονός αυτό δημιουργεί ερωτήματα σχετικά με τα μόρια και τους μηχανισμούς που συμμετέχουν στη διαφυγή του καρκίνου [12,13]

10 Εικόνα 2: Διηθητικά λεμφοκύτταρα σε αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα A. Τα επιθηλιακά κύτταρα του όγκου έχουν καταστραφεί από διηθητικά λεμφοκύτταρα- οι αποκαλούμενες λεμφο-επιθηλιακές αλλοιώσεις εμφανής ήταν η συσσώρευση των λεμφοκυττάρων στις κοιλότητες των αδενίων (βέλος). B. Τα περισσότερα διηθητικά κύτταρα χρωματίζονται θετικά για το CD3 ( 400) [14]. Έχουν αναφερθεί διάφοροι μηχανισμοί που ευνοούν την ανάπτυξη του όγκου ενάντια στην ανοσιακή απάντηση (Πίν.1). Ένας από τους γνωστότερους μηχανισμούς διαφυγής που χρησιμοποιείται από τα κύτταρα των όγκων, είναι η μειωμένη έκφραση ή ακόμη και η ολική απώλεια των μορίων HLA από την επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, ένα φαινόμενο που είναι καλά τεκμηριωμένο τόσο in vitro και in vivo [15]. Άλλος ένας μηχανισμός είναι η γονιδιωματική αστάθεια των όγκων, που επιτυγχάνεται με τη μειωμένη έκφραση των μορίων TAA ή/και HLA, ή ακόμη και επεμβαίνοντας στην επεξεργασία των TAA ή των μηχανισμών παρουσίασής τους (π.χ. πρωτεασώματα, ΤΑΡ-1). Επιπλέον, η παραγωγή ανοσοκατασταλτικών κυτοκινών (π.χ. TGF-β, interleukin-10) και η έκφραση λεμφοκυτταροτοξικών μορίων (όπως FAS-L) από τα κακοήθη κύτταρα υποδηλώνουν ότι ο καρκίνος μπορεί να αντιδρά με ενεργό τρόπο ενάντια στην αναγνώριση και δράση του ανοσιακού συστήματος. Κατά αυτόν τον τρόπο, παρόλο που τα διηθητικά Τ- κύτταρα αναγνωρίζουν το καρκινικό κύτταρο, η δράση τους μπορεί να ανασταλεί. Ακόμη, τα καρκινικά κύτταρα (όπως και τα περισσότερα φυσιολογικά κύτταρα) στερούνται συνδιεγερτικών μορίων όπως τα B7-1/CD80 και B7-2/CD86, τα οποία εκφράζονται φυσιολογικά στα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα. Στην έλλειψη συνδιέγερσης, τα Τ- κύτταρα έχουν τη τάση να μετατρέπονται σε ανενεργά και να επιτρέπουν έτσι την ανάπτυξη του όγκου. Τέλος, το ανοσοποιητικό σύστημα μπορεί να αποτύχει να απορρίψει τον καρκίνο λόγω ανοσοκατασταλτικών επιδράσεων που προκύπτουν από τη μεσολάβηση άλλων ανοσιακών κυττάρων, όπως τα Τ ρυθμιστικά κύτταρα, τα μυελοειδή κατασταλτικά κύτταρα, τα Τ κυτταροτοξικά NKT και τα ανώριμα ανοσοκατασταλτικά DC (ανασκόπηση από [9])

11 Πίνακας 1: Μηχανισμοί ανοσοδιαφυγής Μηχανισμοί που εμπλέκονται στη διατήρηση της περιφερικής ανοχής Μηχανισμοί όπου εμπλέκονται ενεργά οι όγκοι Μετατροπή του καρκινικού φαινότυπου CD4+ CD25+ T cells CD4+NKT cells Απώλεια HLA ή μειωμένη έκφραση Απώλεια έκφρασης MICA-B Παραγωγή παραγόντων που επηρεάζουν τα κύτταρα Τ Αναστολή της ωρίμανσης των Τ κυττάρων Μείωση έκφρασης συνυποδοχέων Απελευθέρωση προαποπτωτικών μορίων Συνεχή έκφραση ενζύμων που περιορίζουν τη δράση των κυττάρων Τ Απελευθέρωση παραγόντων που επηρεάζουν τη πρόκληση απάντησης από τα κύτταρα Τ Αναστολή της ωρίμανσης των DC Συντμήσεις: DC, δενδριτικά κύτταρα; HLA, human leukocyte antigens; MIC, MHC class I related chain; NKT, natural killer T cells. [2] Ο μεταβολισμός βασικών αμινοξέων είναι μια ακόμη στρατηγική που εφαρμόζουν οι όγκοι για να επηρεάσουν την αποτελεσματικότητα των Τ κυττάρων. Τα ίδια τα καρκινικά κύτταρα, αλλά και άλλα κύτταρα του ανοσιακού συστήματος που στρατολογούνται από τους όγκους, χρησιμοποιούν το μεταβολισμό των αμινοξέων για να ρυθμίσουν τη δραστικότητα κοντινών σε αυτά κυττάρων και να προκαλέσουν μερικές από τις δυσλειτουργίες του ανοσιακού συστήματος που οδηγούν στην ανοσοκαταστολή [5]. Δύο είναι τα βασικότερα αμινοξέα που εμπλέκονται στην ανοσοδιαφυγή: η αργινίνη (L-Arg), που καταβολίζεται από τα ένζυμα ARG1, ARG2 και NOS [16] και η τρυπτοφάνη (L-Trp) που διασπάται από τα ένζυμα IDO και TDO. Η ενεργοποίηση της IDO, συνδέθηκε αρχικά με την περιφερική ανοχή και τη μητρική ανοχή προς το αλλογενές έμβρυο. Πρόσφατα, όμως, αποδείχθηκε ότι συμμετέχει και στην ανοσιακή διαφυγή των όγκων [4, 5]. Το ένζυμο αυτό εκφράζεται στους πρωτογενείς όγκους και τις καρκινικές κυτταρικές σειρές, καθώς και από πλασματοκυτταρικά DC σε λεμφαδένες που διηθούν τους όγκους. Σε διαφορετικά καρκινικά μοντέλα, συστηματική χορήγηση συγκεκριμένου αναστολέα της IDO οδήγησε στη μερική αναστροφή της ανοσοκαταστολής που προκαλείται από τον όγκο [17]. Ο ρόλος της IDO στην ανοσιακή διαφυγή του όγκου θα αναλυθεί εκτενώς στη συνέχεια ,3- ΔΙΟΞΥΓΟΝΑΣΗ ΤΗΣ ΙΝΔΟΛΕΑΜΙΝΗΣ Στους μονοκύτταρους οργανισμούς, η έλλειψη των απαραίτητων θρεπτικών ουσιών αποτελεί μια κοινή βιολογική στρατηγική για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού ανταγωνιστικών κυττάρων [3]. Για πολλά χρόνια ήταν αποδεκτό ότι η IDO λειτουργεί ως αντιμικροβιακός αμυντικός μηχανισμός επιτρέποντας στα κύτταρα να απαλείφουν την τρυπτοφάνη από ενδοκυτταρικές δεξαμενές ή τοπικά

12 μικροπεριβάλλοντα. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι τα κύτταρα που εκφράζουν IDO καταστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των Τ- κυττάρων in vitro με τη μείωση της συγκέντρωσης της τρυπτοφάνης στο θρεπτικό μέσο [18, 19]. Παρακάτω, θα συζητηθεί η δομή του γονιδίου (INDO), η λειτουργία της πρωτεΐνης (IDO) και ο ρόλος της στην ανοσιακή διαφυγή Δομή Η 2,3-διοξυγονάση της ινδολεαμίνης είναι μία κυτοσολική μονομερής αιμοπρωτεΐνη μεγέθους 430 αμινοξέων (Μοριακό Βάρος 45,324KD) που καταλύει το πρώτο βήμα του καταβολισμού της τρυπτοφάνης μέσω του μονοπατιού της κυνουρενίνης [20]. Στους ανθρώπους, το μονοπάτι αυτό καταβολίζει πάνω από το 90% της τρυπτοφάνης, με πρώτο βήμα την οξειδωτική διάσπαση του 2-3 διπλού δεσμού της τρυπτοφάνης, με συνέπεια την παραγωγή Ν-φορμυλ- κυνουρενίνης [21]. Οι Littlejohn et al. (2003) [21] ανακάλυψαν ότι για την πρόσδεση της αίμης είναι απαραίτητη μόνο η His346, υποδεικνύοντας αυτό το αμινοξύ ως τον κεντρικό συνδέτη. Επιπλέον, η κατευθυνόμενη μεταλλαξιγένεση της Asp274 ελάττωσε τη δυνατότητα της IDO να δεσμεύσει την αίμη. Κατά συνέπεια, τόσο η His346 όσο και η Asp274 είναι απαραίτητες για τη πρόσδεση της αίμης και συνεπώς για την ενζυματική δραστηριότητα της IDO. Πρόσφατα, έγινε γνωστή και η κρυσταλλική δομή της IDO [22], που έδειξε πως περιλαμβάνει δύο περιοχές με έλικες που σχηματίζουν μία δομή τσέπης, όπου βρίσκεται ο δακτύλιος της αίμης (Εικ.3). Μικρή περιοχή Δακτύλιος αίμης Μεγάλη περιοχή Εικόνα 3: Τρισδιάστατη δομή της 2,3 διοξυγονάσης της ινδολεαμίνης [22]

13 Το ανθρώπινο γονίδιο (INDO) έχει έκταση 15 kb και περιλαμβάνει 10 εξόνια (Εικ. 5). Το 5-άκρο του INDO mrna βρίσκεται 33 νουκλεοτίδια πριν το κωδικόνιο έναρξης (ATG) της μετάφρασης. Ανάλυση Southern blot έδειξε ότι το γονίδιο INDO βρίσκεται σε ένα μόνο αντίγραφο. Οι Burkin et al. (1993) αναλύοντας με PCR και Southern blot μια σειρά από υβρίδια κυττάρων για την παρουσία του ανθρώπινου γονιδίου της IDO, καθόρισαν ότι το γονίδιο βρίσκεται στη περικεντρομερική περιοχή του χρωμοσώματος 8, πιθανώς στη 8p11-q11 [23]. Με φθορίζον in situ υβριδισμό, οι Najfeld et al. (1993) περιόρισαν τον εντοπισμό στη θέση 8p12-q11 [24]. Στη περιοχή του υποκινητή των γονιδίων της IDO ανθρώπου και ποντικού εντοπίζονται ρυθμιστικά μοτίβα που αποκρίνονται σε κυτοκίνες της φλεγμονής. Παρόντα σε κάθε προαγωγέα είναι δύο στοιχεία που αποκρίνονται σε ενεργοποίηση από ιντερφερόνη (ISRE), μία περιοχή δράσης IFN-γ (GAS) και μοτίβα δομής κουτιού Χ,Υ του κύριου συμπλέγματος ιστοσυμβατότητας τάξης ΙΙ [3]. Αυτά τα ευρήματα προτείνουν ότι το γονίδιο INDO αρχικώς χρησιμοποιήθηκε ως παράγοντας φλεγμονής, για τον περιορισμό των μικροβιακών λοιμώξεων, και μόνο αργότερα στην εξέλιξη απέκτησε έναν ανοσορυθμιστικό ρόλο τόσο στη μητρική ανοχή καθώς και στην ανοσιακή διαφυγή του καρκίνου. Εικόνα 4: Αναδρομή της βιοχημείας της τρυπτοφάνης. Τα σπονδυλωτά αποκτούν την τρυπτοφάνη με την τροφή. Η διοξυγονάση της τρυπτοφάνης (TDO), που εκφράζεται συνεχώς στο ήπαρ, και η IDO, είναι τα δύο ένζυμα που καταβολίζουν την τρυπτοφάνη σπάζοντας το δακτύλιο της ινδολεαμίνης με μία οξειδωτική αντίδραση που καταναλώνει ρίζες οξυγόνου. Ένα άλλο ένζυμο, η υδρολάση της τρυπτοφάνης (TPH),που εκφράζεται από ορισμένα κύτταρα του CNS, αποτελεί το πρώτο βήμα στο μονοπάτι σύνθεσης της σεροτονίνης, ενός ισχυρού νευροδιαβιβαστή και των παραγώγων της. Κάποιοι μεταβολίτες του καταβολισμού της τρυπτοφάνης είναι νευροτοξίνες (π.χ. quinolinate). Η 1-μεθυλοτρυπτοφάνη (1mW)είναι ανταγωνιστικός αναστολέας της IDO [3]

14 1 AATTTCTCACTGCCCCTGTGATAAACTGTGGTCACTGGCTGTGGCAGCAACTATTATAAG ATGCTCTGAAAACTCTTCAGACACTGAGGGGCACCAGAGGAGCAGACTACAAGAATGGCA...-M--A- 121 CACGCTATGGAAAACTCCTGGACAATCAGTAAAGAGTACCATATTGATGAAGAAGTGGGC 3 -H--A--M--E--N--S--W--T--I--S--K--E--Y--H--I--D--E--E--V--G- 181 TTTGCTCTGCCAAATCCACAGGAAAATCTACCTGATTTTTATAATGACTGGATGTTCATT 23 -F--A--L--P--N--P--Q--E--N--L--P--D--F--Y--N--D--W--M--F--I- Εικόνα 5: Indoleamine 2,3- dioxygenase Ακολουθία μεταγράφου cdna 241 GCTAAACATCTGCCTGATCTCATAGAGTCTGGCCAGCTTCGAGAAAGAGTTGAGAAGTTA 43 -A--K--H--L--P--D--L--I--E--S--G--Q--L--R--E--R--V--E--K--L- 301 AACATGCTCAGCATTGATCATCTCACAGACCACAAGTCACAGCGCCTTGCACGTCTAGTT 63 -N--M--L--S--I--D--H--L--T--D--H--K--S--Q--R--L--A--R--L--V- Δομή μεταγράφου 361 CTGGGATGCATCACCATGGCATATGTGTGGGGCAAAGGTCATGGAGATGTCCGTAAGGTC 83 -L--G--C--I--T--M--A--Y--V--W--G--K--G--H--G--D--V--R--K--V- 421 TTGCCAAGAAATATTGCTGTTCCTTACTGCCAACTCTCCAAGAAACTGGAACTGCCTCCT 103 -L--P--R--N--I--A--V--P--Y--C--Q--L--S--K--K--L--E--L--P--P- 481 ATTTTGGTTTATGCAGACTGTGTCTTGGCAAACTGGAAGAAAAAGGATCCTAATAAGTAT 123 -I--L--V--Y--A--D--C--V--L--A--N--W--K--K--K--D--P--N--K--Y- 541 GTAAACACTGGGAACATGGACGTTTTGTTCTCATTTCGTGATGGAGACTGCAGTAAAGGA 143 -V--N--T--G--N--M--D--V--L--F--S--F--R--D--G--D--C--S--K--G- 601 TTCTTCCTGGTCTCTCTATTGGTGGAAATAGCAGCTGCTTCTGCAATCAAAGTAATTCCT 163 -F--F--L--V--S--L--L--V--E--I--A--A--A--S--A--I--K--V--I--P- 661 ACTGTATTCAAGGCAATGCAAATGCAAGAACGGGACACTTTGCTAAAGGCGCTGTTGGAA 183 -T--V--F--K--A--M--Q--M--Q--E--R--D--T--L--L--K--A--L--L--E- 721 ATAGCTTCTTGCTTGGAGAAAGCCCTTCAAGTGTTTCACCAAATCCACGGCAAGTATCAT 203 -I--A--S--C--L--E--K--A--L--Q--V--F--H--Q--I--H--G--K--Y--H- 781 GTGAACCCAAAAGCATTTTTCAGTGTTCTTCGCATATATTTGTCTGGCTGGAAAGGCAAC 223 -V--N--P--K--A--F--F--S--V--L--R--I--Y--L--S--G--W--K--G--N- 841 CCCCAGCTATCAGACGGTCTGGTGTATGAAGGGTTCTGGGAAGACCCAAAGGAGTTTGCA 243 -P--Q--L--S--D--G--L--V--Y--E--G--F--W--E--D--P--K--E--F--A- 901 GGGGGCAGTGCAGGCCAAAGCAGCGTCTTTCAGTGCTTTGACGTCCTGCTGGGCATCCAG 263 -G--G--S--A--G--Q--S--S--V--F--Q--C--F--D--V--L--L--G--I--Q- 961 CAGACTGCTGGTGGAGGACATGCTGCTCAGTTCCTCCAGGACATGAGAAGATATATGCCA 283 -Q--T--A--G--G--G--H--A--A--Q--F--L--Q--D--M--R--R--Y--M--P CCAGCTCACAGGAACTTCCTGTGCTCATTAGAGTCAAATCCCTCAGTCCGTGAGTTTGTC 303 -P--A--H--R--N--F--L--C--S--L--E--S--N--P--S--V--R--E--F--V CTTTCAAAAGGTGATGCTGGCCTGCGGGAAGCTTATGACGCCTGTGTGAAAGCTCTGGTC 323 -L--S--K--G--D--A--G--L--R--E--A--Y--D--A--C--V--K--A--L--V TCCCTGAGGAGCTACCATCTGCAAATCGTGACTAAGTACATCCTGATTCCTGCAAGCCAG 343 -S--L--R--S--Y--H--L--Q--I--V--T--K--Y--I--L--I--P--A--S--Q CAGCCAAAGGAGAATAAGACCTCTGAAGACCCTTCAAAACTGGAAGCCAAAGGAACTGGA 363 -Q--P--K--E--N--K--T--S--E--D--P--S--K--L--E--A--K--G--T--G GGCACTGATTTAATGAATTTCCTGAAGACTGTAAGAAGTACAACTGAGAAATCCCTTTTG 383 -G--T--D--L--M--N--F--L--K--T--V--R--S--T--T--E--K--S--L--L AAGGAAGGTTAATGTAACCCAACAAGAGCACATTTTATCATAGCAGAGACATCTGTATGC 403 -K--E--G--* ATTCCTGTCATTACCCATTGTAACAGAGCCACAAACTAATACTATGCAATGTTTTACCAA TAATGCAATACAAAAGACCTCAAAATACCTGTGCATTTCTTGTAGGAAAACAACAAAAGG TAATTATGTGTAATTATACTAGAAGTTTTGTAATCTGTATCTTATCATTGGAATAAAATG ACATTC

15 IDO και φλεγμονή Υπάρχει ισχυρή συσχέτιση μεταξύ της IDO και της φλεγμονής. Η παραγωγή της IDO επάγεται από διάφορους μεσολαβητές της φλεγμονής συμπεριλαμβανομένων των ιντερφερονών, από τις ο- ποίες ως πιο ισχυρή εμφανίζεται η IFN-γ. Η IFN-γ έχει αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση σε πολλά καρκινικά κύτταρα και εμποδίζει ενδοκυτταρικά παθογόνα, όπως το Τοξόπλασμα και τα Χλαμύδια, τουλάχιστον εν μέρει εξαιτίας της επαγωγής της IDO. Η δραστηριότητα της IDO, όταν αξιολογείται αδρά σε ολόκληρα ομογενοποιήματα ιστού, είναι ανιχνεύσιμη σε χαμηλά επίπεδα σε πολλούς ιστούς υγιών (χωρίς μικρόβια ζώων) και είναι εμφανώς υψηλότερη σε ιστούς που αφαιρούνται από ζώα που εκτίθενται σε παθογόνα ή σε παράγοντες φλεγμονής, όπως το LPS. Υγιείς ιστοί που υπόκεινται σε συνεχή ερεθίσματα φλεγμονής, όπως βλεννώδεις επιφάνειες του πνεύμονα, του εντέρου και της μήτρας κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης, εκφράζουν IDO στη φυσιολογική τους λειτουργία [25]. Ω- στόσο, τα σχετικά επίπεδα αποικοδόμησης της τρυπτοφάνης ποικίλλουν αρκετά μεταξύ των ιστών. Δραστηριότητα της IDO υπάρχει συνεχώς σε υψηλά επίπεδα στο έντερο και στην επιδιδυμίδα, και σε χαμηλότερα επίπεδα στη σπλήνα, τους λεμφαδένες και το θύμο αδένα. Αυτό το μοτίβο της συνεχούς, βασικής δραστηριότητας της IDO δεν είναι σύμφωνο με την υπόθεση ότι ο μόνος ρόλος της είναι να αποκρίνεται σε μικροβιακές μολύνσεις. Επιπλέον, η αξιολόγηση της δραστηριότητάς της σε ομογενοποιήματα ιστού είναι ενδεχομένως παραπλανητική επειδή σε συγκεκριμένο ιστό μόνο μια μειονότητα κυττάρων μπορεί να παράγει IDO [3] IDO και ανοχή στον καρκίνο Όπως έχει αναφερθεί, η IDO in vivo εμπλέκεται στη διατήρηση της μητρικής ανοχής προς το α- ντιγονικά "ξένο" έμβρυο κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης - ένα εντυπωσιακό παράδειγμα επίκτητης, ειδικής ανοχής σε αντιγόνο. Η IDO συμμετέχει επίσης στην καταστολή των Τ- κυτταρικών αποκρίσεων σε MHC αλλομοσχεύματα και σε αυτοαντιγόνα σε ζωικά μοντέλα ασθενειών, όπως τα επιρρεπή σε διαβήτη, μη παχύσαρκα διαβητικά ποντίκια [5]. Είναι εμφανές, λοιπόν, ότι η IDO έχει ανοσοκατασταλτικό ρόλο παρεμποδίζοντας τον πολλαπλασιασμό των Τ- κυττάρων με ένα μηχανισμό που μπορεί επίσης να χρησιμοποιείται από τα κύτταρα των όγκων προκειμένου να διαφύγουν από την επιτήρηση του ανοσιακού συστήματος. Έχει αποδειχθεί ότι η έκφραση της IDO οδηγεί στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των Τ- κυττάρων in vitro [5, 18]. Ιn vivo φαρμακολογική παρεμπόδιση της δραστηριότητας της IDO κατά τη διάρκεια της κύησης σε ποντίκια οδηγεί στην απόρριψη των εμβρυϊκών αλλομοσχευμάτων και

16 εμποδίζει τη δυνατότητα των CD8+ DCs να καταστείλουν καθυστερημένου τύπου αντιδράσεις υπερευαισθησίας σε ΤΑΑ [18]. Οι Mellor et al. (2002) χρησιμοποίησαν δύο μοριακές γενετικές στρατηγικές για να ενισχύσουν τη δραστηριότητα της IDO σε διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές και σε νέα στελέχη διαγενετικών ποντικών, ώστε να διασταυρώσουν τα αποτελέσματα των φαρμακολογικών μελετών και να εξετάσουν περαιτέρω τη σχέση ανάμεσα στη δραστηριότητα της IDO και την παρεμπόδιση της απόκρισης των κυττάρων Τ [19]. Στα αποτελέσματά τους αναφέρουν ότι η ικανότητα απόκρισης των αλλογενών Τ- κυττάρων μετά από τη μεταφορά τους ήταν λιγότερο ισχυρή στα διαγενετικά ποντίκια, όπου η IDO υπερεκφράζεται στο μικροπεριβάλλον του ιστού. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η γενετικά ενισχυμένη δραστηριότητα της IDO εμπόδισε τον πολλαπλασιασμό των Τ- κυττάρων in vitro και in vivo. Πρόσφατα, οι Uyttenhove et al. (2003) κατέδειξαν ότι οι περισσότεροι ανθρώπινοι όγκοι εκφράζουν συνεχώς IDO (Πίν.2) [4]. Στα καρκινικά κύτταρα διαπιστώθηκε έκφραση της IDO σε όλες τις περιπτώσεις καρκίνου του προστάτη, παγκρέατος και τραχήλου, καθώς επίσης και σε πολλά δείγματα άλλων καρκινικών τύπων, συμπεριλαμβανομένου του NSCLC. Πίνακας 2: Έκφραση της IDO σε ανθρώπινους όγκους Καρκινικός τύπος IDO+ καρκινικά δείγματα (θετικά προς εξεταζόμενα) Ποσοστό IDO θετικών καρκινικών κυττάρων >50% 10-50% <10% Καρκίνος προστάτη 11/ Καρκίνος ορθού/εντέρου 10/ Καρκίνος παγκρέατος 10/ Καρκίνος αυχένα 10/ Καρκίνος ενδομητρίου 5/ Καρκίνος στομάχου 9/ Γλιοβλάστωμα 9/ Μη μικροκυτταρικός καρκίνος πνέυμονα 9/ Καρκίνος ουροδόχου κύστης 8/ Καρκίνος ωοθηκών 8/ Καρκινώματα κεφαλής και λαιμού 7/ Καρκίνος οισοφάγου 7/ Μεσοθηλίωμα 6/ Καρκίνος νεφρικών κυττάρων 5/ Μελάνωμα 11/ Καρκίνος μαστού 3/ Καρκίνος θυρεοειδούς 2/ Λυμφώματα 4/ Μικροκυτταρικός καρκίνος πνεύμονα 2/ Σαρκώματα 2/ Ηπατοκαρκινώματα 2/ Καρκίνος επινεφριδίων 2/ Χοριοκαρκινώματα 1/ Δερματικά βασεοκυτταρικά καρκινώματα 1/ Ορχικό σπερμογονίωμα 0/

17 Σε όλες τις περιπτώσεις τα περισσότερα φυσιολογικά κύτταρα του στρώματος ήταν αρνητικά, γεγονός που προτείνει ότι η έκφραση της IDO στα κύτταρα των όγκων δεν προέκυψε από την in vivo έκθεση στην IFN-γ. Επίσης παρατηρήθηκε ότι η έκφραση της IDO από ανοσιακά κύτταρα των όγκων ποντικών αποτρέπει την απόρριψή τους σε προ-ανοσοποιημένα ποντίκια. Αυτή η επίδραση συνοδεύεται από έλλειψη συσσώρευσης ειδικών Τ- κυττάρων στο σημείο του όγκου και μπορεί να αντιστραφεί εν μέρει με τη συστηματική χορήγηση αναστολέα της IDO, χωρίς αξιοσημείωτη τοξικότητα [4] Κύτταρα που εκφράζουν IDO Η IDO εκφράζεται από τα ίδια τα καρκινικά κύτταρα [4, 5] και από κύτταρα όπως τα μακρόφαγα ή/και τα δενδριτικά κύτταρα [5, 18] στη ζώνη διήθησης του όγκου και στους λεμφαδένες όπου διηθείται ο όγκος [26, 27]. Ωστόσο, σε μια πρόσφατη μελέτη, οι Astigiano et al. (2005) υποστήριξαν ότι στο ανθρώπινο NSCLC η IDO δεν εκφράζεται από τα κύτταρα του όγκου, αλλά από φυσιολογικά κύτταρα που διηθούν το στρώμα γύρω από τον όγκο και προσδιορίστηκαν ως ηωσινόφιλα κοκκιοκύτταρα [28]. Είναι δυνατόν σε τύπους καρκίνου όπως προστάτη, παγκρέατος, ή ορθοκολικά καρκινώματα, η IDO να εκφράζεται κυρίως από τα κύτταρα των όγκων, ενώ σε άλλους τύπους όπως το NSCLC ή τα ηπατοκαρκινώματα, η IDO να εκφράζεται κυρίως από τα διηθητικά κύτταρα των όγκων [28]. Γενικότερα, διαφορετικοί μηχανισμοί και σε διάφορα επίπεδα συμβάλλουν στην έκφραση της IDO στους όγκους: η IDO μπορεί να εκφραστεί, ακόμα και ταυτόχρονα, στον όγκο και τους λεμφαδένες που τον διηθούν, από τα κύτταρα όγκων, τα σχετικά με τον όγκο ηωσινόφιλα, τα DCs και τα μακροφάγα. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι η έκφραση της IDO μπορεί να δώσει ένα αυξητικό πλεονέκτημα στους όγκους, τουλάχιστον σε εκείνους τους όγκους όπου μια ανοσολογική απόρριψη μπορεί να λάβει χώρα, όπως το NSCLC. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η ανοσιακή καταστολή που προκαλεί η IDO θα μπορούσε να υποθάλψει την αύξηση των όγκων. Αφού τα ηωσινόφιλα διηθητικά κύτταρα του όγκου είναι υπεύθυνα για την ανοσοκαταστολή στο NSCLC, η ανάπτυξη του όγκου επιταχύνεται σε εκείνες τις περιπτώσεις που επιδεικνύουν ένα μεγάλο αριθμό των κυττάρων αυτών στα TILs. Με βάση αυτή την υπόθεση, οι Astigiano et al. (2005) εξέτασαν εάν υπάρχει σχέση μεταξύ IDO θετικών διηθητικών κυττάρων και έκβαση της ασθένειας σε περιπτώσεις NSCLC [28]. Ο αριθμός των IDO- θετικών διηθητικών κυττάρων συγκρίθηκε με την επιβίωση σε 17 ασθενείς και προέκυψε

18 ότι εμφανίζουν αντίστροφη σχέση. Όμως δεν έγινε δυνατόν να εξαχθεί κάποιο συμπέρασμα για το εάν ο μεγάλος αριθμός IDO-θετικών διηθητικών κυττάρων είναι η αιτία ή το αποτέλεσμα της δυσμενούς πρόγνωσης IDO και ανοσιακή διαφυγή του καρκίνου Ακόμα κι αν η IDO εκφράζεται από τα καρκινικά κύτταρα ή από τα APCs του ξενιστή (ή, όπως είναι αρκετά πιθανό, και από τα δύο), δεν εξηγείται ο επακόλουθος μηχανισμός με τον οποίο η IDO προστατεύει τον όγκο από το ανοσιακό σύστημα. Το απλούστερο μοντέλο προτείνει ότι παρουσία της IDO, τα Τ κύτταρα είναι ανίκανα να πολλαπλασιαστούν και να υποβληθούν σε κλωνική επέκταση, εξ αιτίας ενός σημείου ελέγχου στον κυτταρικό τους κύκλο (στο μέσο της G1 φάσης) που είναι ευαίσθητο στην έλλειψη τρυπτοφάνης. Η IDO είναι ένα κυτοσολικό ένζυμο, έτσι, ο καταβολισμός της τρυπτοφάνης λαμβάνει χώρα μέσα στο κύτταρο και εφόσον η τρυπτοφάνη διασχίζει εύκολα τη πλασματική μεμβράνη διαμέσου συγκεκριμένων μεταφορέων, δημιουργείται ένα μικροπεριβάλλον με έλλειψη τρυπτοφάνης. Επειδή το Κ m της συνθετάσης του τρυπτοφανυλ-rna είναι χαμηλότερο από αυτό της IDO, η πρωτεϊνοσύνθεση προχωρά παρά τα μειωμένα επίπεδα τρυπτοφάνης και αυτό επιτρέπει στα περισσότερα κύτταρα να αναπτύσσονται. Παραδείγματος χάριν, αν και τα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν μειωμένη αύξηση in vitro, δεν αναστέλλεται ο πολλαπλασιασμός τους παρουσία της IDO. Αντίθετα, τα Τ- κύτταρα, σταματούν να πολλαπλασιάζονται υπό τέτοιες συνθήκες επειδή έχουν ένα ευαίσθητο σημείο ελέγχου στην τρυπτοφάνη, το οποίο σταματά τον κυτταρικό τους κύκλο στην G1 φάση όταν η συγκέντρωση της τρυπτοφάνης είναι κάτω από 0.5-1μM. Επιπλέον, τα Τ- κύτταρα που έχουν σταματήσει να αναπτύσσονται καθίστανται ευαίσθητα σε απόπτωση και είναι πιθανό, έτσι, να εξαλειφθούν [4]. Μία πρόσφατη αναφορά κατέδειξε πως η αντίδραση στο στρες που εξαρτάται από την κινάση GCN2 επάγεται ειδικά στα ενεργοποιημένα Τ- κύτταρα παρουσία κυττάρων που εκφράζουν IDO, οδηγώντας τα Τ κύτταρα σε ανεργία [29]. Αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν τη θεωρία της απαλοιφής της τρυπτοφάνης καθώς η ενεργοποίηση της κινάσης GCN2 αποτελεί ειδική αντίδραση στην αύξηση των επιπέδων των χωρίς φορτίο μορίων trna στο κυτταρόπλασμα. Η IDO παράγει διάφορους μεταβολίτες, μερικοί από τους οποίους είναι τοξικοί για τα Τ- κύτταρα in vitro [30, 31], επομένως, είναι δυνατόν τα καρκινικά και τα φυσιολογικά κύτταρα να μην είναι το ίδιο ευαίσθητα στις τοξικές επιδράσεις της IDO, όπως δεν είναι και στη χαμηλή συγκέντρωση της τρυπτοφάνης. Όμως, η διακοπή του κυτταρικού κύκλου ή η τοξικότητα που προκαλείται από τους μεταβολίτες θα μπορούσαν να περιορίσουν σημαντικά την ανοσιακή απάντηση μόνον εάν όλα τα

19 πιθανά αποκρινόμενα Τ- κύτταρα θα μπορούσαν να έρθουν σε άμεση επαφή με ένα κύτταρο που εκφράζει IDO. Επειδή αυτή η υπόθεση δεν είναι ιδιαίτερα πιθανή, το παραπάνω μοντέλο ανταποκρίνεται περισσότερο σε ένα μοντέλο τοπικής καταστολής της ανοσιακής απάντησης, παρά σε πραγματική κατάσταση σωματικής ανοχής [5]. Οι όγκοι δημιουργούν γενικευμένη ανοχή στα αντιγόνα τους, ταυτόχρονα με την τοπική ανοσοκαταστολή (Εικ.6). Εάν η IDO συμβάλλει σε αυτήν την ευρύτερη σωματική ανοχή, θα πρέπει να το κάνει διαμέσου ενός μηχανισμού μεγαλύτερης εμβέλειας από τις τοπικές μόνο επιδράσεις του ίδιου του ενζύμου. Μέχρι στιγμής, κανένας τέτοιος μηχανισμός δεν έχει διευκρινιστεί, ακόμα κι αν είναι πλέον σαφές ότι η IDO είναι σε θέση να προκαλέσει πραγματική ρύθμιση και καταστολή του ανοσιακού συστήματος, που συνεπάγεται ότι κάποιος τέτοιος μηχανισμός θα πρέπει να λειτουργεί [32]. Μία πιθανή εξήγηση, διατυπώθηκε πρόσφατα από τους Mellor και Munn (2003) [33]. Σύμφωνα με αυτήν την υπόθεση θα μπορούσε να υπάρχει ένα μονοπάτι μέσω του οποίου μερικά από τα κύτταρα Τ, που έχουν σταματήσει τον πολλαπλασιασμό τους εξαιτίας της IDO, θα μπορούσαν να υιοθετήσουν ένα ρυθμιστικό φαινότυπο. Η θεωρία αυτή παραμένει υποθετική, επειδή η παραγωγή Treg από APCs που εκφράζουν IDO δεν έχει καταδειχθεί πειραματικά. Ωστόσο, αυξάνεται ο αριθμός των αναφορών στη βιβλιογραφία που αναφέρουν την επαγωγή Τ ρυθμιστικών κυττάρων από δενδριτικά κύτταρα (ανασκόπηση [34]) και αρχίζει να διαφαίνεται μια σχέση ανάμεσα στα Tregs και την IDO [35, 36]. Επίσης, πρόσφατα διατυπώθηκε πως οποιοσδήποτε καθορισμένος πληθυσμός DC μπορεί να δημιουργήσει de novo Tregs ενάντια σε ένα συγκεκριμένο αντιγόνο [5]. Επειδή οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους τα APCs προκαλούν τη μετατροπή των παρθένων Τ- κυττάρων σε Tregs είναι μέχρι σήμερα ασαφείς, η πιθανή συμβολή της IDO σε αυτήν τη διαδικασία παραμένει άγνωστη. Ε- ντούτοις, σε διηθητικά λεμφοκύτταρα καρκίνου NSCLC [37] και σχετικά με τον όγκο λεμφοκύτταρα καρκίνου των ωοθηκών [38] παρατηρήθηκαν αυξημένα ποσοστά κυττάρων CD4 + CD25 +, που υποδεικνύουν σύνδεση των κυττάρων αυτών με την ανοσοκαταστολή στους συγκεκριμένους τύπους καρκίνου. Η πρόκληση παραγωγής των Τreg παραμένει αντικείμενο έρευνας. Δεν είναι γνωστό εάν στη διαδικασία αυτή συμβάλλει η διακοπή του κυτταρικού κύκλου από την IDO στα αποκρινόμενα Τ- κύτταρα, ή εάν προς την κατεύθυνση αυτή οδηγούν μονοπάτια απόκρισης στο στρες που προκαλείται από την έλλειψη τρυπτοφάνης ή τους τοξικούς μεταβολίτες της (ανασκόπηση από [5]). Πρόσφατα, καταδείχθηκε μια μηχανιστική σύνδεση μεταξύ της IDO και της δραστηριότητας ανοχής που παρουσιάζει το ανασυνδυασμένο αντιγόνο CTLA4-Ig [39, 40]. Πρόσδεση του CTLA4-Ig σε υποδοχείς Β7 ή Β7-2 στην επιφάνεια των DC αποδείχθηκε ότι ενεργοποιεί ένα σηματοδοτικό μονο

20 πάτι που οδηγεί στην επαγωγή της IDO in vitro (Εικ. 7). Αντιθέτως, αναστολή της IDO με τη χρήση 1MT αναίρεσε τη πρόκληση ανοχής του CTLA4-Ig σε μοντέλο μεταμόσχευσης κυττάρων νησιδίων (islets). Κατά συνέπεια, φαίνεται ότι η IDO αποτελεί έναν ενδογενή μεσολαβητή μιας μορφής αυτοανοχής και επίσης ένα πιθανό μηχανισμό πρόκλησης ανοχής de novo σε νέα αντιγόνα. Υπό αυτή την έννοια, η IDO θα μπορούσε να αντιπροσωπεύει έναν αποτελεσματικό μηχανισμό διαφυγής των ό- γκων από την ανοσιακή επιτήρηση. Εικόνα 6: Μοντέλο δράσης της IDO. Η IDO (κόκκινα βέλη) εκφράζεται από τα καρκινικά κύτταρα και δημιουργεί ένα τοπικό ανοσοκατασταλτικό περιβάλλον γύρω από τον όγκο (δεξιά), είτε με την καταστολή της δράσης και του πολλαπλασιασμού των Τ- κυττάρων, ή με απευθείας καταστροφή των διηθητικών κυττάρων χρησιμοποιώντας τοξικούς μεταβολίτες της τρυπτοφάνης. Εναλακτικά, δενδριτικά κύτταρα που εκφράζουν IDO μπορούν να προσλάβουν αντιγόνα του όγκου (πράσινες σφαίρες) και να μεταναστεύσουν σε λεμφαδένες που διηθούν τον όγκο, όπου θα παρουσιάσουν τα αντιγόνα σε παρθένα Τ- κύτταρα (αριστερά). Αυτό μπορεί να οδηγήσει σε απαλοιφή αυτών των κλώνων, αποτυχία κλωνικής επέκτασης ή ακόμα και τη μετατροπη κάποιων κυττάρων σε κύτταρα με ρυθμιστικό φαινότυπο. Με τον τρόπο αυτό η IDO θα μπορούσε να οδηγήσει τόσο σε τοπική αλλά και γενικευμένη ανοχή σε αντιγόνα των όγκων [32]

21 Εικόνα 7: Ο πιθανός ρόλος του CTLA-4 στη ρύθμιση της ομοιόστασης των Τ βοηθητικών κυττάρων. Ο CTLA-4 λειτουργεί σαν μόριο σύνδεσης για τους υποδοχείς B7 στα DCs, και επάγει την ελευθέρωση IFN-γ από αυτά. Η IFN-γ μπορεί με τη σειρά της να επάγει στα T κύτταρα τον παράγοντα δέσμευσης σε Th1 (T-bet) που αλληλορυθμίζει το GATA-3. Αυτοκρινής IFN-γ επίσης επάγει την έκφραση της IDO στα DC. Μια σειρά επιδράσεων που εξαρτώνται από την IDO και την κυνουρενίνη, συμπεριλαμβανομένων της εξάλειψης της τρυπτοφάνης, της διακοπής του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης, μπορεί να συμβάλλουν στη ρύθμιση της ομοιόστασης των T- κυττάρων από το CTLA-4 [41]. Σε άλλη μελέτη, η έκφραση της IDO συνδέθηκε με τη μειωμένη έκφραση των αντιγόνων MHC τάξης Ι [42], ενός ακόμη μηχανισμού που χρησιμοποιούν οι όγκοι για να προάγουν την ανοσιακή διαφυγή. Για να εξεταστεί η υπόθεση αυτή, κατασκευάστηκε ένας αδενοϊικός φορέας της IDO και αξιολογήθηκε η επίδραση της στην έκφραση των αντιγόνων MHC τάξης Ι στα ανασυνδυασμένα κερατινοκύτταρα. Τα πειράματα αποκάλυψαν μια σημαντική μείωση της έκφρασης των μεμβρανικών αντιγόνων MHC Ι στα γενετικά τροποποιημένα κερατινοκύτταρα σε σχέση με τα μη ανασυνδυασμένα ή τα ανασυνδυασμένα με κενό φορέα κύτταρα. Περαιτέρω πειράματα κατέδειξαν ότι προσθήκη τρυπτοφάνης ή ανασταλτικού παράγοντα της IDO απεκατέστησε σε μεγάλο βαθμό την έκφραση των MHC τάξης Ι στα IDO επιμολυσμένα κερατινοκύτταρα. Τα ευρήματα της μελέτης αυτής προτείνουν τη μειωμένη έκφραση των MHC Ι ως ένα ακόμη μηχανισμό μέσω του οποίου η IDO μεσολαβεί στην τοπική διαφυγή από το ανοσοποιητικό σύστημα

22 Αναστολή της δράσης της IDO Εφαρμογές στη θεραπεία του καρκίνου Η ανακάλυψη και ο μοριακός καθορισμός των αντιγόνων των όγκων που αναγνωρίζονται από τα Τ- κύτταρα επέτρεψαν το σχεδιασμό πρωτοκόλλων ανοσοθεραπείας του καρκίνου, που βασίζονται κυρίως στον εμβολιασμό με διάφορους συνδυασμούς αντιγόνων. Αν και αυτές οι κλινικές δοκιμές βρίσκονται ακόμη σε πρώιμα στάδια, έχει παρατηρηθεί ήδη σε μερικές περιπτώσεις υποχώρηση των όγκων [43, 44]. Ωστόσο, αυτές οι θετικές αποκρίσεις εμφανίζονται μόνο σε ένα μικρό ποσοστό των ασθενών [45]. Υπάρχουν πολλοί πιθανοί λόγοι για τους οποίους οι όγκοι δεν υποχωρούν στους υπόλοιπους ασθενείς, συμπεριλαμβανομένης της πιθανότητας ότι το εμβόλιο μπορεί να είναι ανεπαρκές για να προκαλέσει μια ανοσιακή απάντηση σε αυτούς τους ασθενείς. Ο μηχανισμός της αντίστασης των όγκων που περιλαμβάνει την έκφραση της IDO μπορεί να έχει ιδιαίτερη σημασία στην ανοσοθεραπεία για τουλάχιστον δύο λόγους. Κατ' αρχήν, είναι πολύ συχνός: όπως φαίνεται στον πίνακα 2, η πλειοψηφία των ανθρώπινων όγκων έχει σταθερή έκφραση της IDO. Επιπλέον, αφού η IDO επάγεται από την IFN-γ, τα IDO-αρνητικά κύτταρα των όγκων μπορεί να εκφράσουν IDO μετά από έκθεση σε περιβάλλον φλεγμονής, όπως αυτό που προκύπτει από την ανοσιακή απάντηση και έτσι το φάσμα των καρκινικών τύπων που χρησιμοποιούν ενδεχομένως αυτόν τον μηχανισμό αντίστασης μπορεί να είναι ακόμα ευρύτερο. Δεύτερον, αυτός ο μηχανισμός διαφυγής μπορεί να υποσκελιστεί με την αναστολή της IDO χρησιμοποιώντας ένα ανάλογο της τρυπτοφάνης όπως την 1ΜΤ, η οποία θα μπορούσε να χορηγηθεί στους ασθενείς με καρκίνο που υποβάλλονται σε ανοσοθεραπεία. Ο Muller et al. (2005) πρόσφατα πρότειναν ότι ανασταλτικοί παράγοντες του INDO μπορούν να βελτιώσουν την απόκριση στη χημειοθεραπεία, οδηγούμενοι από το γεγονός ότι σε μοντέλο καρκίνου του μαστού ποντικών, η συνδυαστική χορήγηση μικρομοριακών αναστολέων της IDO και κυτταροτοξικών παραγόνων οδήγησαν στην υποχώρηση όγκων που ήταν απρόσβλητοι σε μονοπαραγοντική θεραπεία [17]. Ο ανασταλτικός παράγοντας 1MT παρουσιάζει ορισμένα πλεονεκτήματα καθώς είναι ενεργός σε ανθρώπινα λεμφοκύτταρα, και έχει διαπιστωθεί ότι κάποιοι CTL κλώνοι ανθρώπου αναπτύσσονται καλύτερα in vitro παρουσία του αναστολέα [4]. Επιπλέον, δεν εμποδίζει τη διοξυγονάση της τρυπτοφάνης, το ηπατικό ένζυμο που ρυθμίζει τα σωματικά επίπεδα τρυπτοφάνης, που σημαίνει ότι σημαντικές παρενέργειες, τουλάχιστον όσον αφορά το μεταβολισμό της τρυπτοφάνης, μπορούν να α- ποφευχθούν στους ανθρώπους. Ωστόσο, αν και δεν έχει αναφερθεί σοβαρή τοξικότητα σε ποντίκια, η ασφάλεια της θεραπείας αυτής θα πρέπει να αξιολογηθεί προσεκτικά σε περισσότερα προκλινικά μοντέλα προτού χρησιμοποιηθεί σε πρωτόκολλα ανοσοθεραπείας

23 2. ΕΡΕΥΝΗΤΙΚΗ ΥΠΟΘΕΣΗ - ΣΚΟΠΟΣ

24 Η υπόθεση που διατυπώνεται είναι πως η IDO έχει αυξημένη έκφραση στον καρκινικό ιστό των ασθενών με NSCLC σε σχέση με τον αυτόλογο μη προσβεβλημένο ιστό. Επίσης αναμένεται να παρατηρηθεί έκφραση σε κάποιες καρκινικές σειρές και συγκεκριμένους ιστούς, ενώ θα γίνει και μία προσπάθεια συσχέτισης της πρόγνωσης της ασθένειας με τα επίπεδα έκφρασης του ενζύμου. Σκοπός της μελέτης είναι να διαπιστωθεί εάν τα επίπεδα έκφρασης της IDO διαφέρουν στα καρκινικά δείγματα ασθενών με μη μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα σε σχέση με αυτόλογα δείγματα παρακείμενου μη προσβεβλημένου ιστού. Παράλληλα, χρησιμοποιήθηκαν δείγματα διαφορετικής προέλευσης, ώστε να αποκτηθεί μια γενικότερη εικόνα της έκφρασης της συγκεκριμένης πρωτεΐνης στο επίπεδο του mrna. Η μελέτη του ενζύμου αυτού είναι ιδιαίτερα σημαντική σε έναν καρκινικό τύπο όπως το μη μικροκυτταρικό καρκίνωμα του πνεύμονα, όπου η ανοσοθεραπεία προβάλλει ως εναλλακτική επιλογή θεραπείας. Εμφανίζεται λοιπόν κρίσιμο το ερώτημα εάν η πρωτεΐνη αυτή, που συνδέεται με την ανοσιακή καταστολή έχει αυξημένη έκφραση στην περιοχή του όγκου και το αποτέλεσμα θα πρέπει να ληφθεί υπόψη στην επιλογή της θεραπευτικής προσέγγισης. Είναι σημαντικό να διατυπωθεί πως μέχρι στιγμής ελάχιστες μελέτες υπάρχουν στην βιβλιογραφία όπου να συμπεριλαμβάνεται παρακείμενος μη προσβεβλημένος ιστός από τους ίδιους ασθενείς. Επίσης, για πρώτη φορά γίνεται έλεγχος της έκφρασης της IDO ταυτόχρονα σε τόσο μεγάλο αριθμό φυσιολογικών ιστών και καρκινικών σειρών. Έτσι, εκτός από την έκφραση αυτής της τόσο ενδιαφέρουσας πρωτεΐνης στον όγκο, θα μπορέσουμε να αποκτήσουμε και μία εικόνα της κατανομής της στους φυσιολογικούς ιστούς, ώστε να αξιολογήσουμε καλύτερα τα αποτελέσματά μας

25 3. ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ

26 3.1. Πειραματικός σχεδιασμός / Δείγματα Τα πειράματα σχεδιάστηκαν έτσι ώστε να αναλυθεί η έκφραση της IDO σε κύτταρα διαφόρων τύπων (Εικ.8). Η μελέτη της έκφρασης πραγματοποιήθηκε σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων που περιλαμβάνει: α) ιστό που προέρχεται από χειρουργείο (καρκινικό και φυσιολογικό) β) εγκαθιδρυμένες καρκινικές σειρές γ) λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος από υγιείς δότες δ) καλλιέργειες κυττάρων φυσιολογικών ατόμων διεγερμένες με μιτογόνο (PHA blasts) και ε) RNA διαφόρων οργάνων φυσιολογικών ατόμων. Σε όλα τα παραπάνω δείγματα, εκτός των εμπορικά διαθέσιμων RNA, πραγματοποιήθηκε εκχύλιση RNA και στη συνέχεια σύνθεση cdna, PCR για τα γονίδια της β-ακτίνης και IDO και Real Time PCR για το γονίδιο της IDO με γονίδιο αναφοράς το ABL. καρκινικός ιστός α) φυσιολογικός ιστός β) Καρκινικές κυτταρικές σειρές δ) PHA blasts ε) RNA ιστών και οργάνων γ) PBMC υγιών ατόμων απομόνωση RNA σύνθεση cdna i) PCR για β-actin και IDO ii) Real Time PCR για IDO και ABL Εικόνα 8: Πειραματικός σχεδιασμός

27 Ιστός ασθενών Τα δείγματα ιστού προέρχονται από 17 ασθενείς οι οποίοι νοσηλεύθηκαν στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Λάρισας και υποβλήθηκαν σε ολική ή μερική λοβεκτομή του ενός πνεύμονα το διάστημα Νοέμβριος Αύγουστος Οι ασθενείς, 4 γυναίκες και 13 άντρες, ηλικίας ετών (Μ.Ο έτη), είναι ενήμεροι σχετικά με την παρούσα μελέτη και έχουν συναινέσει σε αυτή εγγράφως. Τα δείγματα, αμέσως μετά τη λήψη τους, απέκτησαν έναν μοναδικό κωδικό, ο οποίος χρησιμοποιείται στο παρόν κείμενο. Τα στοιχεία των ασθενών αναγράφονται στον πίνακα που ακολουθεί (Πίν.3). Κωδικός Ασθενή Γενικά χαρακτηριστικά Ηλικία Φύλο Ασθένεια a Προ χειρ Πίνακας 3: Στοιχεία Ασθενών Θεραπευτικό πρόγραμμα b Μετά χειρ Αρχική Σταδιοποίηση Νόσου Τ Ν Μ Στάδιο Σημερινή κατάσταση της νόσου c Απόσταση (cm) d PGEGE 56 ΑΔΠ - Χ/Θ IIA Κ.Ε.Ν. 3.5 Τ Ν PNAGE 61 ΠΚΠ - Χ/Θ IV Υ.Ν. 8 Τ Ν PPANI 65 ΑΔΠ Χ/Θ Α/Θ IIB Σ.Ν. 8 Τ Ν PATHA 65 ΑΔΠ - Χ/Θ IIA Κ.Ε.Ν. 5 Τ Ν PPOVA 67 ΠΚΠ IA Κ.Ε.Ν. 10 Τ Ν PELGA 48 ΑΔΠ IA Κ.Ε.Ν. 7 Τ Ν PGERO 55 ΠΚΠ - Χ/Θ IIB Κ.Ε.Ν. - Τ - PAZOI 59 ΑΔΠ - Χ/Θ + Α/Θ IIIA Κ.Ε.Ν. 8 Τ Ν PEVEV 79 ΠΚΠ IB Κ.Ε.Ν. 9 Τ Ν PINTZ 73 ΑΔΠ - Χ/Θ IB Κ.Ε.Ν. 5 Τ Ν PAPAN 70 ΠΚΠ IA Κ.Ε.Ν. - - Ν PALAD 63 ΠΚΠ IIIA Κ.Ε.Ν. - Τ Ν PASTE 55 ΑΔΠ - Χ/Θ + Α/Θ IIIB Κ.Ε.Ν. 9 Τ Ν PGEBA 66 ΜΑΠ - Χ/Θ ΙV Κ.Ε.Ν. 6 Τ Ν PIOZI 79 ΠΚΠ IB Κ.Ε.Ν. 2.5 Τ Ν POKOK 59 ΠΚΠ ΙIB Κ.Ε.Ν. - - Ν PKAKI 60 ΑΔΠ IΙΒ Κ.Ε.Ν. 11 Τ Ν a: ΑΔΠ: Αδενοκαρκίνωμα Πνεύμονα, ΠΚΠ: Πλακώδες Καρκίνωμα Πνεύμονα, ΜΚΠ: Μικτό Καρκίνωμα Πνεύμονα b: Χ/Θ: Χημειοθεραπεία, Α/Θ: Ακτινοθεραπεία c: Κ.Ε.Ν.: Καμία Ένδειξη Νόσου, Σ.Ν.: Σταθερή Νόσος, Υ.Ν.: Υποτροπή Νόσου d: Απόσταση μεταξύ νεοπλασματικού και φυσιολογικού ιστού που λάβαμε από τον κάθε ασθενή Ιστός Οκτώ ασθενείς πάσχουν από αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα, 8 από πλακώδες καρκίνωμα του πνεύμονα και ένας ασθενής PGEBA διαγνώστηκε με μικτό καρκίνωμα ποικίλης διαφοροποίησης. Μετεγχειρητικά οι ασθενείς δεν έχουν παρουσιάσει καμία ένδειξη νόσου, με εξαίρεση τον ασθενή PPANI, ο οποίος παρουσιάζει σταθερή νόσο, και τον PNAGE, ο οποίος εμφάνισε μετάσταση στο βραχιόνιο οστό (υποτροπή νόσου). Από τον ασθενή PGERO, τέλος, δεν κατέστη δυνατό να ληφθεί υγιής ιστός, ενώ για τους ασθενείς PAPAN και POKOK δεν ελήφθη καρκινικός ιστός

28 Κύτταρα περιφερικού αίματος υγιών δοτών Εξετάστηκαν 8 δείγματα PBMCs που προήλθαν από υγιή άτομα (Πίν.4). Από αυτά, 2 δείγματα PBMCs καλλιεργήθηκαν στο εργαστήριο και διεγέρθηκαν με μιτογόνο (PHA-L, Sigma Cat L-4144), έτσι ώστε να παρουσιάζουν εντονότερο πολλαπλασιασμό και πρότυπα έκφρασης καρκινικών κυττάρων. Τα δείγματα περιφερικού αίματος προήλθαν από εθελοντές δότες του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Λάρισας. Πίνακας 4: Δείγματα Υγιών Ατόμων Κυτταρική Σειρά Προέλευση Φύλο Ηλικία NANGE PHA-blasts Υγιής δότης (διεγερμένη σειρά) 54 NKOMP PHA-blasts Υγιής δότης (διεγερμένη σειρά) 22 NAFKA Υγιής δότης 29 B08082 Υγιής δότης 27 B12105 Υγιής δότης 54 B11856 Υγιής δότης 59 B00466 Υγιής δότης 23 B1393 Υγιής δότης Καρκινικές σειρές Η έκφραση της IDO ελέγχθηκε σε 12 εγκαθιδρυμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές που αναγράφονται στον ακόλουθο πίνακα (Πιν.5). Κυτταρική Σειρά Πίνακας 5: Καρκινικές Κυτταρικές Σειρές Προέλευση Κυτταρική Σειρά Προέλευση CALU-1 Αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα DAJU 2.7 Μελάνωμα CALU-6 Αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα GERL Μελάνωμα GILI Αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα MEL272 Μελάνωμα ONET Αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα K562 Χρόνια μυελογενής λευχαιμία HCA 2.6 Αδενοκαρκίνωμα παχέως εντέρου JURKAT Τ-λεμφοκυτταρική λευχαιμία HCA 3.2 Αδενοκαρκίνωμα παχέως εντέρου MCF7 Καρκίνος μαστού Συγκεκριμένα εξετάστηκαν τέσσερις καρκινικές σειρές που προέρχονται από αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα, δύο από αδενοκαρκίνωμα παχέως εντέρου, τρεις από μελάνωμα, και από μία κυτταρική σειρά που απομονώθηκε από χρόνια μυελογενή λευχαιμία, Τ-λεμφοκυτταρική λευχαιμία και καρκίνο του μαστού

29 Δείγματα ιστών υγιών ατόμων Για να έχουμε ευρύτερη εικόνα για το πρότυπο έκφρασης της IDO στους διάφορους ιστούς χρησιμοποιήσαμε RNA από υγιείς ιστούς ανθρώπου. Οι ιστοί που εξετάστηκαν περιγράφονται στον πίνακα (Πιν.6): Πίνακας 6: Δείγματα ιστών υγιών ατόμων Κυτταρική Σειρά Κωδικός προϊόντος Κυτταρική Σειρά Κωδικός προϊόντος Κυτταρική Σειρά Κωδικός προϊόντος Πνεύμονας S2424 Εμβρυικό Ήπαρ S2438 Ωοθήκες Όρχεις S2435 Καρδιά S2421 Πάγκρεας Πλακούντας S2440 Νεφρoί S2422 Ήπαρ Προστάτης S2433 Σιελογ. Αδένες S2443 Μαζικός Αδέν Σκελετικοί Μύες S2434 Επινεφρίδια S2441 Θύμος S2431 Νωτιαίος Μυελός S2439 Μυελός Οστών S2427 Θυρεοειδής S2969 Ήπαρ 2423 Παρεγκεφαλίδα S2968 Τραχεία S2425 Εμβρ. Εγκέφαλος S2437 Εγκέφαλος S2420 Μήτρα S2436 * Όλα τα δείγματα αγοράστηκαν από την Clontech, με τον κωδικό που αναγράφεται στο πίνακα 3.2. Κυτταρικές τεχνικές Συλλογή και μεταχείριση ιστού ασθενών Μετά την αφαίρεση του λοβού/πνεύμονα ειδικός παθολογοανατόμος συνέλλεγε τομές πάχους 10μm από το νεοπλασματικό κομμάτι του ιστού και από τμήμα ιστού που δεν έφερε ένδειξη νόσου. Εναλλακτικά, λαμβάνονταν τμήματα ιστού διαμέτρου 3x3mm, όπως και έγινε για τους 5 τελευταίους ασθενείς (PALAD- PKAKI). Εν συνεχεία, τα τμήματα του ιστού τοποθετούνταν σε διάλυμα (RLSR, RNA Later Stabilization Reagent, Qiagen Cat 74126), και διατηρούνταν για 24h σε θερμοκρασία 4 ο C. Έπειτα, μεταφερόταν σε νέο καθαρό σωληνάριο και αποθηκεύονταν στους -80 ο C, μέχρι να χρησιμοποιηθούν για εκχύλιση RNA. Σε κάθε βήμα της διαδικασίας, όλα τα αντικείμενα που έρχονταν σε επαφή με το δείγμα καθαριζόταν με διάλυμα RNAseZap (Ambion Cat 9782) που προστατεύει από τη δράση RNασών Καλλιέργεια καρκινικών σειρών Οι διαθέσιμες καρκινικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε φλάσκες 75cm 2 (Corning, Cat ), ώ- στε να αποκτηθεί ένας ικανοποιητικός αριθμός κυττάρων. Τις πρώτες μέρες καλλιέργειας οι καρκινικές σειρές αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό μέσο 10%FBS-RPMIc, που αποτελείται από 10% εμβρυικό ορό βοδιού (FBS, Gibco, ) και πλήρες θρεπτικό μέσο SF-RPMI (RPMI, Gibco, Cat

30 με 1%PSG 10,000U/ml Gibco Cat , 1%MEM aminoacids Gibco Cat και 0.1% 2ME (50mM) Gibco, Cat ) σε συνθήκες 37 ο C, 5%CO 2 και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε θρεπτικό μέσο 10%FBS-IDc (IMDM, Gibco Cat αντί RPMI) σε συνθήκες 37 ο C, 8%CO Απομόνωση μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος Για τη μελέτη της έκφρασης της IDO σε κύτταρα περιφερικού αίματος προβήκαμε σε απομόνωση PBMCs από ολικό αίμα. Για την αιμοληψία χρησιμοποιήθηκε ηπαρινισμένη σύριγγα (Heparin, Leo Cat 4246) και η απομόνωση των κυττάρων έγινε με φυγοκέντρηση διαβαθμισμένης πυκνότητας με φυκόλη (Ficoll Histopaque, Sigma, Cat ), όπως περιγράφεται στην εικόνα 9. Η στιβάδα των PBMCs καθαριζόταν περαιτέρω με 3 διαδοχικές φυγοκεντρήσεις, χρησιμοποιώντας διάλυμα 1xPBS (10xPBS, Gibco Cat ) με 1mM EDTA (UltraPure EDTA 0.5M, Gibco Cat ) και στη συνέχεια μετρούνταν ο αριθμός των κυττάρων (ζωντανών και νεκρών) που απομονώθηκαν με τη χρήση αντικειμενοφόρου πλάκας Neubauer (Counting chamber Neubauer, Fisher Cat ) και χρωστικής Trypan Blue (Gibco, ) ml ολικού αίματος 400g 30min 20 C πλάσμα στιβάδα λευκών αιμοσφαιρίων 20ml φικόλης φικόλη ερυθρά αιμοσφαίρια Εικόνα 9: Απομόνωση PBMCs. Το ολικό αίμα φυγοκεντρείται και συλλέγεται η στιβάδα των λευκών αιμοσφαιρίων. Με την ολοκλήρωση της φυγοκέντρησης, 4 στιβάδες είναι ορατές: μία διαυγής κίτρινη στιβάδα του πλάσματος, μία υποκίτρινη θολή στιβάδα των λευκών αιμοσφαιρίων (buffy cοat), μία αρκετά διαυγής υπόλευκη στιβάδα της φικόλης και ένα σκούρο κόκκινο ίζημα, των ερυθρών αιμοσφαιρίων

31 Πάγωμα κυττάρων Το πάγωμα των κυττάρων έγινε σε υλικό που αποτελείται από 80% πλήρες θρεπτικό μέσο (SF- IDc), 10% ανθρώπινο ορό θερμικά αδρανοποιημένο και 10% D.M.S.O. (Dimethyl soulphoxide, Sigma Cat D-5879). Στη συνέχεια τα κύτταρα τοποθετούνταν σε ειδικό δοχείο με ισοπροπανόλη και μεταφέρονταν στους -80 ο C, όπου και παρέμεναν για τουλάχιστον 24h. Μετά αποθηκεύονταν για μεγάλα χρονικά διαστήματα σε βαθειά κατάψυξη σε δοχείο υγρού αζώτου Πάγωμα κυττάρων ως ίζημα Εναλλακτικά, τα κύτταρα μπορούν να καθαριστούν με 1xPBS και να καταψυχθούν σαν ίζημα με άμεση ψύξη σε υγρό άζωτο ή σε διάλυμα RLT (Lysis reagent, Quiagen, Cat ) με 1% 2- mercaptethanol 14.3M (2ME, Sigma, M-6250) ώστε να χρησιμοποιηθούν για εκχύλιση RNA Καλλιέργεια PBMC υγιών ατόμων διεγερμένων με PHA Η καλλιέργεια των κυττάρων αυτών έγινε όπως έχει περιγραφεί από τους Echchakir et al. (2001) [46]. Τα κύτταρα τα οποία είχαν προηγουμένως καταψυχθεί στο υγρό άζωτο, αποψυχόταν σε υδατόλουτρο 37 ο C και εν συνεχεία φυγοκεντρούνταν προκειμένου να απομακρυνθεί το υπερκείμενο, τοξικό για αυτά, D.M.S.O. Τα κύτταρα διαλύονταν σε πλήρες θρεπτικό μέσο 10%HS-IDc που περιέχει επιπλέον 100U/ml ιντερλευκίνης-2 (IL-2, RND Systems, Cat 202-IL) και 1μg/ml PHA-L (PHA-L, Sigma Cat L-4144) και καλλιεργούνταν σε δισκία 24-οπών και 96-οπών (24-W Cell Culture Cluster Round Bottom, Corning Cat 3524 και 96-W Cell Culture Cluster Round Bottom, Corning Cat 3799) σε συνθήκες 37 ο C, 8%CO Μοριακές τεχνικές Εκχύλιση RNA Στο στάδιο της εκχύλισης RNA χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία RNeasy της Qiagen (Cat 74126). Όλα τα δείγματα τοποθετήθηκαν σε RLT (Lysis reagent) και έγινε ομογενοποίηση του δείγματος με ισχυρή ανακίνηση του σωληναρίου για 30 και εισαγωγή του 5 φορές μέσα από σύριγγα 21G (BD, Cat ). Ακολουθεί προσθήκη διαλύματος αιθανόλης 70% (Ethanol, Scharlau Cat ET0016) και μεταφορά όλης της ποσότητας σε μικροκολώνες RNeasy. Για περαιτέρω καθαρισμό του δείγματος

32 από επιμόλυνση γονιδιωματικού DNA, χρησιμοποιήθηκε το RNAse-free DNAse Set της Qiagen (Cat 79254). Ακολούθησαν διαδοχικές φυγοκεντρήσεις καθαρισμού με τη χρήση των διαλυμάτων του πακέτου RNeasy, RW1 και RPE, όπως περιγράφεται στο πρωτόκολλο της Qiagen. Μετά την ολοκλήρωση της διαδικασίας, ακολούθησε ποσοτικοποίηση κάθε δείγματος με φωτομέτρηση, ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και προσαρμογή της συγκέντρωσης στα 100ng/μl, όπως περιγράφεται στην εικόνα 10. Τα δείγματα αποθηκεύθηκαν στους -80 o C Ποσοτική και ποιοτική ανάλυση Η φωτομέτρηση έγινε σε φωτόμετρο (BioPhotometer, Eppendorf) με RNase- DNase free κυψελίδες (Eppendorf, UVette) και αραίωση δείγματος 1:20. Στην ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιήθηκε 1,5% αγαρόζη (Agarose, Invitrogen Cat ) με 5 μl βρωμιούχο αιθίδιο (Ethidium Bromide 10mg/ml, Biorad Cat ). Τα δείγματα ελέγχθηκαν για την παρουσία γονιδιωματικού DNA και η ποσοτικοποίηση επαληθεύθηκε με τη χρήση πρότυπου RNA (control template RNA Ambion, 500ng/μl), όπως περιγράφεται στην εικόνα (Εικ.11) Σύνθεση μορίων cdna Προκειμένου να μετατραπούν τα μόρια mrna σε συμπληρωματικά μόρια DNA (complementary DNA, cdna), απαιτείται η αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής. Στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε το πακέτο της Qiagen (Omniscript RT kit, Cat ) που περιλάμβανε: 10xRT buffer, διάλυμα dntps, Omniscript RT και Η 2 O ελεύθερο DNAσών και RNAσών. Επιπλέον χρησιμοποιήθηκαν ολιγονουκλεοτίδια θυμίνης ως τυχαίοι εκκινητές (OligodT 15 Primer 20μg0.5μg/μl, Promega Cat C1101) και αναστολέας των RNAσών (RNAsin 2,500U, 40U/μl, Promega Cat N2111). Ο όγκος του κάθε αντιδραστηρίου ανά δείγμα φαίνεται στον πίνακα 7. Πίνακας 7: Ποσότητες αντιδραστηρίων για σύνθεση cdna Αντιδραστήριο Όγκος ανά δείγμα (μl) oligodt hexamers 10xRT buffer dntp mix (500μΜ) Stock oligodt 15 (10μΜ) RNAsin (10 Units) Omniscript RT (4 Units) RNase-free Η 2 Ο όγκος MasterMix Random hexamers - 4 RNase-free Η 2 Ο δείγμα RNA Συνολικός όγκος

33 Εκχύλιση RNA με DNase 65μl 5μl για ηλεκτροφόρηση 50μl 10μl για φωτομέτρηση Προσαρμογή της συγκέντρωσης RNA στα 100ng/μl 6.5μl σύνθεση cdna b-actin και IDO PCR Ανάλυση δεδομένων Εικόνα 10: Πορεία της επεξεργασίας των δειγμάτων. Την εκχύλιση RNA ακολούθησε ποσοτικοποίηση του δείγματος και προσαρμογή της συγκέντρωσης στα 100ng/μl. Από αυτό, 650ng χρησιμοποιήθηκαν για σύνθεση cdna και έγινε έ- λεγχος της έκφρασης για τα γονίδια της β-ακτίνης και IDO. πρότυπο RNA άγνωστο δείγμα 28sRNA 18sRNA 625ng 312.5ng 156ng 78.1ng 2,5μl 1,25μl 0,6μl 0,3μl Εικόνα 11: Ηλεκτροφόρηση RNA σε πηκτή αγαρόζης. Έγιναν 4 διαδοχικές α- ραιώσεις του RNA γνωστής ποσότητας και διαδοχικές αραιώσεις του αγνώστου δείγματος. Με βάση την ένταση των ζωνών του 18sRNA υπολογίστηκε η συγκέντρωση ως εξής: τα 0,6μl δείγματος αντιστοιχούν σε 312.5ng RNA, άρα η συγκέντρωση του δείγματος είναι 312.5/0,6=520ng/μl. Στο συγκεκριμένο δείγμα η φωτομέτρηση έδειξε 545.8ng/μl

34 Στην αντίδραση χρησιμοποιήθηκαν 650ng RNA, ενώ σε ορισμένες περιπτώσεις η ποσότητα αυτή ήταν πολύ μικρότερη (Πίν.8), λόγω της μειωμένης συγκέντρωσης ορισμένων δειγμάτων. Προκειμένου να λάβει χώρα η αντίδραση, το διάλυμα τοποθετήθηκε στους 37 ο C για 60. Έπειτα, τα δείγματα μεταφέρθηκαν αμέσως σε πάγο και προστέθηκαν 80 μl H 2 O ελεύθερου DNAσών και RNAσών (UltraPure Water, Gibco Cat ). Tα δείγματα cdna αποθηκεύθηκαν στους -20 ο C. Πίνακας 8: Ποσότητα RNA κατά τη σύνθεση μορίων cdna Δείγμα Ποσότητα RNA (ng) Δείγμα Ποσότητα RNA (ng) K Ήπαρ 625 GERL 625 Μαζικός Αδένας 625 MCF7 625 Θύμος 625 JURKAT 625 Θυρεοειδής 625 DAJU Τραχεία 625 HCA Μήτρα 625 MEL Σιελογόνοι Αδένες 625 HCA PATHA T 144 CALU PATHA N 79 CALU PAZOI T 122 ONET 625 PAZOI N 36 GILI 625 PELGA T 60 NANGE 625 PELGA N <25 NKOMP 625 PEVEV T 54 B PEVEV N 0 NAFKA 260 PGEGE T 85 B PGEGE N <25 B PGERO T 112 B PINTZ T 21 B PINTZ N 0 Πνεύμονας 625 PNAGE T 203 Όρχεις 625 PNAGE N <25 Πλακούντας 625 PPANI T 237 Προστάτης 625 PPANI N <25 Σκελετικοί Μύες 625 PAPAN N 98 Νωτιαίος Μυελός 625 PPOVA T 57 Ήπαρ 625 PPOVA N 10 Εμβρυικός Εγκέφαλος 625 PALAD T 625 Εμβρυικό Ήπαρ 625 PALAD N 625 Καρδιά 625 PASTE T 625 Νεφρός 625 PASTE N 345 Επινεφρίδια 625 PGEBA T 625 Μυελός Οστών 625 PGEBA N 625 Παρεγκεφαλίδα 625 PIOZI T 625 Εγκέφαλος 625 PIOZI N 508 Ωοθήκες 625 POKOK N 519 Πάγκρεας 625 Για να αυξηθεί η αποτελεσματικότητα της μεθόδου, ώστε να γίνει δυνατή η ανάλυση σε Real Time PCR, χρησιμοποιήθηκε και ένα δεύτερο πρωτόκολλο σύνθεσης μορίων cdna με τη χρήση τυχαίων εξαμερών. Σε αυτό το πρωτόκολλο χρησιμοποιήθηκαν σωληνάρια PCR στα οποία προστέθηκαν αρχικά 3.5 μl νερό με 4 μl τυχαία εξαμερή (Primer random, Roche, Cat ) και 6.5 μl RNA. Τα σωληνάρια τοποθετήθηκαν στους 72 o C για 2 λεπτά και στη συνέχεια προστέθηκαν 11 μl μείγματος αντιδραστηρίων, όπως φαίνεται στον πίνακα 7. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 42 ο C για 60 λεπτά και στη συνέχεια για 10 λεπτά στους 65 ο C, ώστε να επέλθει αδρανοποίηση των ενζύμων, και αποθηκεύθηκαν σε θερμοκρασία -20 ο C

35 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) Για την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης χρησιμοποιήθηκε το προϊόν της Qiagen Taq Mastermix (Cat ), που περιέχει το ένζυμο Taq DNA πολυμεράση, PCR buffer, dntps και Η 2 Ο ε- λεύθερο DNAσών και RNAσών. Οι αντιδράσεις έγιναν σε σωληνάρια της Corning (0.2ml thin-wall PCR tubes,corning Cat 6571) και σε θερμοκυκλοποιητές MJ Research PTC-200. Ως γονίδιο αναφοράς για την ποιότητα αλλά και την ποσότητα του γενετικού υλικού χρησιμοποιήθηκε το γονίδιο της β-ακτίνης, το οποίο εκφράζεται σε όλα τα κύτταρα σε συγκρίσιμα επίπεδα. Οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν είναι: Αρχική αποδιάταξη: 94 ο C για 4 Αποδιάταξη: 94 ο C για 1 Αναδιάταξη: 68 ο C για 1 21 κύκλοι Επιμήκυνση: 72 ο C για 1 Τελική επιμήκυνση: 72 ο C για 15 Για το γονίδιο της β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές: 5 ggcatcgtgatggactccg 3 (Thermo, ID# OR ) (20μM) 5 gctggaaggtggacagcga 3 (Thermo, ID# OR ) (20μM) Για το γονίδιο της IDO χρησιμοποιήθηκαν οι εκκινητές: 5 CCTgACTTATgAgAACATggACgT 3 (Thermo, D# OR ) (20μM) 5 ATACACCAgACCgTCTgATAgCTg 3 (Thermo, ID# OR ) (20μM) Οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν είναι: Αρχική αποδιάταξη: 94 ο C για 4 Αποδιάταξη: 94 ο C για 1 Αναδιάταξη: 55 ο C για 1 35 κύκλοι Επιμήκυνση: 72 ο C για 1 Τελική επιμήκυνση: 72 ο C για Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης Προκειμένου να απεικονίσουμε τα αποτελέσματα της αντίδρασης PCR, τα δείγματά μας φορτώθηκαν σε πηκτή αγαρόζης με πυκνότητα 2% (Agarose, Invitrogen Cat , 10xTBE BioRad, Cat ) που περιείχε 5μl βρωμιούχο αιθίδιο (Ethidium Bromide 10mg/ml, Biorad Cat ). Η ηλεκτροφόρηση έγινε σε συσκευή Wide Mini Subcell GT system και PowerPac Basic power supply (BioRad, Cat ) και χρησιμοποιήθηκε χρωστική 5x Nuclei acid sample buffer

36 (BioRad, Cat ) ή εναλλακτικά 10x Blue Juice Gel Loading Buffer (Invitrogen, Cat ) και ποσοτικός μάρτυρας DNA (Invitrogen, Cat ) Βελτιστοποίηση κύκλων PCR Για να βεβαιωθούμε ότι η έκφραση δεν μελετάται στη φάση κορεσμού δημιουργήθηκε, μέσω ημι-ποσοτικής PCR, μία καμπύλη κύκλων-αριθμού εικονοστοιχείων. Ο αριθμός των εικονοστοιχείων μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως μία αδρή εκτίμηση της συγκέντρωσης του προϊόντος της PCR. Οι κύκλοι ξεκινούν από τους 9 και καταλήγουν στους 45. Υπολογίζοντας το μέσο μεταξύ του πρώτου κύκλου που ανιχνεύεται προϊόν PCR και του κύκλου που αρχίζει η φάση κορεσμού της αντίδρασης, πήραμε την τιμή που αντιστοιχεί στους κύκλους με τη μέση συγκέντρωση προϊόντος PCR (Εικ.12), με βάση τον τύπο: (α+β)/2, όπου α= ο αριθμός κύκλων που για πρώτη φορά ανιχνεύουμε προϊόν PCR και β= ο αριθμός κύκλων όπου αρχίζει η φάση κορεσμού της αντίδρασης. Ο αριθμός των κύκλων που προέκυψε από την ημιποσοτική PCR χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των προϊόντων σε όλα τα δείγματα b-actin IDO pixels % εκθετικής φάσης pixels PCR cycles PCR cycles Εικόνα 12: Semi quantitative PCR για τα γονίδια της β-ακτίνης και IDO. Ο α- ριθμός των κύκλων που αντιστοιχεί στο 50% της συγκέντρωσης προϊόντος βρίσκεται περίπου στο κέντρο της εκθετικής φάσης αύξησης του προϊόντος. Για τη β-actin υπολογίστηκε στους 21κύκλους και για την IDO στους 35κύκλους

37 Ημιποσοτική PCR (Semi-quantitative PCR) Για την ποσοτικοποίηση των προϊόντων της αντίδρασης PCR, έτσι όπως αυτά απεικονίζονταν στις πηκτές αγαρόζης, μετρήθηκε η ένταση της κάθε ζώνης με τη χρήση του προγράμματος UviDocMw της Uvitech, το οποίο μας δίνει τον αριθμό των εικονοστοιχείων κάθε ζώνης. Για τη μελέτη της έκφρασης της IDO στα δείγματα διαφορετικής ποσότητας RNA δημιουργήθηκε ο λόγος R, όπου: R 1 = εικονοστοιχεία _ αντιγόνου εικονοστοιχεία _ β ακτίνης Επιπλέον, λόγω του γεγονότος ότι οι υπολογισμοί βασίστηκαν σε φωτογραφίες των πηκτών α- γαρόζης και μέτρηση της φωτεινότητας των ζωνών των προϊόντων PCR, θελήσαμε να εξαλείψουμε το σφάλμα της διαφοράς φωτεινότητας και αντίθεσης μεταξύ των διαφορετικών φωτογραφιών, εισάγοντας στους υπολογισμούς μας ένα λόγο που να αντιπροσωπεύει τις πηκτές και τις διαφορές τους (κατασκευαστικές ή φωτογραφικές). Ως σταθερά στη συγκεκριμένη περίπτωση αποφασίσαμε να λάβουμε μία ζώνη του μάρτυρα (Ladder) και να τη συγκρίνουμε μεταξύ των διαφορετικών πηκτών αγαρόζης. Δηλαδή: R 2 = εικονοστοιχεία _ μάρτυρα _ αντιγόνου εικονοστοιχεία _ μάρτυρα _ β ακτίνης Και τελικά ο τύπος που μας δίνει τη σύγκριση μεταξύ της έκφρασης της IDO και της β-ακτίνης είναι ο εξής: R = R 1 / R 2 Τα δεδομένα καταχωρήθηκαν και επεξεργάστηκαν με το πρόγραμμα Excel της Microsoft Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (Quantitative Real Time PCR) Για την Real Time PCR χρησιμοποιήθηκε το προϊόν της Invitrogen Platinum SYBR Green qpcr Supermix- UDG (Cat ). Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε σωληνάρια 0.1ml (Corbett Reasearch, Cat ) και σε κυκλοποιητή Rotor Gene RG-3000 (Corbett Reasearch). Για το γονίδιο της IDO χρησιμοποιήθηκαν εκκινητές: 5 ggtcatggagatgtccgtaa 3 (Thermo, D# OR ) (20μM) 5 ACCAATAgAgAgACCAggAAgAA 3 (Thermo, ID# OR ) (20μM)

38 Οι συνθήκες της PCR ήταν 50 ο C για 2, 95 o C για 2, και 45 κύκλοι στους 60 o C για 30 και 72 ο C για 30 και 95 o C για 15, με τη μέτρηση του φθορισμού να γίνεται στους 72 ο C. Για το γονίδιο του ABL χρησιμοποιήθηκε το προϊόν της Ipsogen Fusion Quant Kit BCR-ABL (Cat FQpp-10-CE). Οι συνθήκες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν 50 ο C για 2, 95 o C για 2, και 45 κύκλοι με 95 o C για 15 και 60 o C για 1, με τη μέτρηση του φθορισμού να γίνεται στους 60 ο C. Απόλυτη ποσοτικοποίηση Για να υπολογίσουμε τον αριθμό αντιγράφων της IDO στα δείγματά μας χρειάστηκε να κατασκευάσουμε πρότυπα δείγματα DNA με γνωστό αριθμό αντιγράφων ανά μl. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε συνδυασμός PCR προϊόντων του ιδίου δείγματος με έντονη έκφραση IDO. Το προϊόν καθαρίστηκε με το QUIquick PCR Purification Kit της Qiagen (Cat 28104) και ακολούθησε φωτομέτρηση με αραίωση 1:20 που έδωσε μια τιμή 16.3ng/μl. Με 227 ζεύγη βάσεων και 660 gr/mole για κάθε ζεύγος το μοριακό βάρος υπολογίστηκε ότι είναι gr/mole. Έχουμε Ν (6,023 *10 23 ) μόρια για κάθε mole οπότε στο αρχικό απόθεμα του προϊόντος υπάρχουν περίπου 65.5*10 9 μόρια/μl. Στη συνέχεια, 10μl δείγματος αραιώθηκαν σε 655μl τελικό όγκο με τελική συγκέντρωση 10 9 αντίγραφα/μl. Από το υλικό αυτό δημιουργήθηκαν αραιώσεις, ώστε να χρησιμοποιούνται κάθε φορά αντίγραφα IDO σαν πρότυπο σε κάθε αντίδραση Real Time PCR. Αντίστοιχα, για τον υπολογισμό των αντιγράφων ΑBL χρησιμοποιήθηκαν πλασμίδια που περιλαμβάνονται στο πακέτο της Ipsogen (Cat FQpp-10-CE). Με βάση τις καμπύλες φθορισμού των πλασμιδίων/ πρότυπων δειγμάτων (Εικ.13Α) κατασκευάζονταν από το πρόγραμμα η πρότυπη καμπύλη (Εικ.13C) από την οποία υπολογιζόταν κάθε φορά η συγκέντρωση των άγνωστων δειγμάτων. Ο έλεγχος της αποτελεσματικότητας της αντίδρασης ελέγχθηκε με βάση την κλίση (slope, Μ) της πρότυπης καμπύλης που πρέπει να βρίσκεται μεταξύ -3 και -3,6, και της αποδοτικότητας (efficiency, Ε) της αντίδρασης που πρέπει να είναι μεταξύ 0,9 και 1,1. Επίσης, οι αντιδράσεις για το γονίδιο της IDO ελέγχθηκαν για την παρουσία παραπροϊόντων με την επιλογή της καμπύλης τήξης (melting-curve) (Εικ.13Β). Η εμφάνιση μίας καμπύλης υποδηλώνει την παρουσία ειδικού μόνο προϊόντος, ενώ τυχόν παραπροϊόντα εμφανίζονται ως διαφορετικές κορυφές με μικρότερη ή μεγαλύτερη θερμοκρασία τήξης ανάλογα με το μέγεθος του ενισχυόμενου παραπροϊόντος (μεγαλύτερο ή μικρότερο αντίστοιχα). Για κάθε γονίδιο χρησιμοποιήθηκαν διπλά δείγματα και υπολογίστηκε η μέση τιμή των δύο μετρήσεων. Η έκφραση της IDO αποδόθηκε ως αντίγραφα IDO ανά 100 αντίγραφα ABL

39 A B C D No. Χρώμα Δείγμα Τύπος Ct Πραγματική Συγκέντρωση Υπολ. Συγκ. (Αντίγραφα) A1 10^6 IDO copies Standard 13, A2 10^5 IDO copies Standard 17, A3 10^4 IDO copies Standard 21, Α4 10^3 IDO copies Standard 24, Α5 10^2 IDO copies Standard 27, Α6 DNA sample Unknown 21, Α7 Blank Εικόνα 13: PCR πραγματικού χρόνου Α. Καμπύλες φθορισμού για τα πρότυπα δείγματα. Β. Καμπύλες τήξης C. Με βάση τα πρότυπα δείγματα δημιουργείται η πρότυπη καμπύλη από την οποία υπολογίζεται η συγκέντρωση των άγνωστων δειγμάτων (D)