Teorie şi Practica. Dr. Vasile OSTAFE

Transcript

1

2 Aplicaţii ale Cromatografiei de Lichide de Înaltă Performanţă în Biochimie Teorie şi Practica Dr. Vasile OSTAFE 2011

3 OSTAFE, Vasile Aplicaţii ale Cromatografiei de Lichide de Înaltă Performanţă în Biochimie. Teorie şi Practică: Curs / Vasile Ostafe Timişoara, Editia a doua (revizuta, 2011 Biochimie Analitică Modernă 300 p: il., fig., tab. 22 cm

4 În amintirea D-lui Dr. Horst D. Schell, Cel ce mi-a îndrumat primii paşi în arta cromatografiei de lichide Şi D-lui Prof. Dr. B. Jarstorff, Cel ce m-a iniţiat în cromatografia de lichide de înaltă performanţă.

5 Multumiri, Autorul mulţumeşte tuturor celor ce au contribuit la apariţia acestei cărţi, în mod deosebit Prof. Dr. Adrian Chiriac pentru sprijinul şi permanentele încurajări, colaboratorilor de la Institutul de Sănătate Publică Dr. Leonida Georgescu din Timişoara Dr. Ioana Lupşa, Farm. Gabriela Papoe şi Ing. Chim drd. Claudiu Brumaru pentru discuţiile utile şi constructive asupra manuscrisului.

6 C U P R II N S PARTEA I NOTIUNI TEORETICE Prefaţa... 7 Noţiuni Introductive... 9 Teoria HPLC Mecanismele Separării Pregătirea Probelor Tehnici de Injectare a Probelor în Sistemul HPLC Pompele de Faze Mobile şi Degazoarele Detectoarele HPLC Derivatizarea Colectarea Datelor şi Evaluarea Metodelor... 77

7 C UPRINS PARTEA A II-A EXEMPLE PRACTICE DE SEPARARE HPLC Proteine, Peptide şi Aminoacizi Proteine Peptide Aminoacizi Glucide Separarea zaharidelor simple Separarea oligozaharidelor Analiza părţii glucidice Nucleotide Baze azotate Nucleozide Nucleotide Lipide Acizi graşi Acilgliceroli Fosfolipide Sfingolipide Steroizi Steroli Hormoni steroidici Vitamine Vitamine hidrosolubile Vitamine liposolubile

8 P r e f a ţ ă Prezentul curs de "Aplicaţii ale Cromatografiei de Lichide de Înaltă Performanţă în Biochimie" se adresează în primul rând studenţilor secţiilor de chimie şi biologie, pentru care cromatografia de lichide este o tehnică absolut necesară pentru desăvârşirea pregătirii lor generale şi biochimice. În egală măsură cursul se adresează analiştilor şi cercetătorilor chimişti, biologi, biochimişti, farmacişti, etc., ce lucrează în cele mai diverse domenii ale activităţii umane, pornind de la producţia şi controlul alimentelor, băuturilor alcoolice şi nealcoolice, produselor agricole în general, medicamentelor, cosmeticelor şi detergenţilor, pesticidelor, explozibililor, uleiurilor, benzinelor, materialelor plastice şi nu în ultimul rând în activităţi de protecţia mediului, a consumatorului şi a calităţii vieţii. Cursul este structurat pe două părţi: prima teoretică şi cea de-a doua cu un bogat conţinut practic. Partea întâi este o tratare teoretică, destul de succintă dar complexă, a principalelor noţiunilor necesare pentru punerea la punct a metodelor de separare a amestecurilor de analiţi şi pentru justa interpretare a rezultatelor obţinute. Sunt prezentate şi cele mai importante procedee de pregătire a probelor. Se face apoi o

9 trecere în revistă a celor mai comune aparate ce constituie un sistem HPLC. Dintre acestea, detectoarele HPLC sunt prezentate mai pe larg, cu accentul pus pe cele mai folosite detectoare la ora actuală - detectoarele UV, DAD şi MS. Partea a doua are un puternic caracter practic, nelipsind noţiunile teoretice esenţiale. În capitole separate, sunt tratate principalele grupe de biomolecule. După scurte informaţii biochimice referitoare la clasa de compuşi analizată se descriu cele mai comune metode de pregătire a probelor şi se prezintă câteva exemple concrete de separare a acestor substanţe. Unde este cazul, se descriu metode de derivatizare pre- sau post-coloană în ideea folosirii detectoarelor UV şi DAD, larg răspândite la ora actuală. Cursul are o bogată bibliografie, prezentată de fiecare dată la subsolul paginii, pentru a înlesni corelarea informaţiilor din carte cu sursa bibliografică primară utilizată pentru culegerea informaţiilor. Se prezintă atât articolele în care a fost semnalată pentru prima dată metoda respectivă de separare, cât şi articole publicate în ultimii 3 ani, ce tratează acelaşi subiect. Se preconizează înnoirea periodică a informaţiilor cât şi adăugarea de noi clase de biomolecule de interes biochimic în ediţiile viitoare. Vasile Ostafe 8

10 N OŢ II U N II I N T R O D U C T II V E DEFINIŢIE Fig. 1. Ilustrare a separării cromatografice: (a) soluţii A şi B sunt adăugaţi la capătul superior al coloanei cromatografice; (b) după ce faza mobilă a percolat coloana pentru câtva timp, soluţii A şi B sunt separaţi în coloană; (c) A eluează din coloană; (d) B eluează din coloană, separarea fiind încheiată cu succes. Cromatografia este un proces de separare în cascadă în care un amestec este separat în componentele individuale, urmat de detecţia acestora printr-un procedeu convenabil. Cromatografia, în principiu, necesită două faze, una staţionară şi alta mobilă. În cromatografia de lichide faza mobilă este lichidă, iar cea staţionară, este, cel mai adesea, legată de un solid, ce umple o coloană (de sticlă sau metal) 1. 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., and Glajch, J.L. Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, 1997

11 I NTRODUCERE SCURT ISTORIC În ultimii 50 de ani cromatografia ca ştiinţă s-a dezvoltat foarte mult din toate punctele de vedere: numărul sistemelor cromatografice şi al utilizatorilor, cantitatea de material publicat, varietatea şi complexitatea probelor supuse separărilor cromatografice, viteza de separare, uşurinţa separărilor, etc. Totuşi această dezvoltare nu a fost continuă şi nici lină. Dezvoltarea cromatografiei, la fel cu cea a altor ştiinţe a cunoscut perioade de progres şi perioade de stagnare. Printre evenimentele cruciale, care au contribuit cel mai mult la dezvoltarea acestei ştiinţe putem aminti: Introducerea cromatografiei de partiţie şi a cromatografiei pe hârtie din anii 40 1,2 ; Gaz cromatografia şi cromatografia în strat subţire introdusă prin anii 50 3,4 ; Diferite tipuri de gel-cromatografie sau excludere moleculară din anii Toate acestea au pus bazele cromatografiei de lichide moderne. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE = LC Cromatografia de lichide (LC) se referă la orice proces cromatografic în care faza mobilă este lichidă, în contrast cu faza mobilă gazoasă din cromatografia de gaze. Cromatografia tradiţională pe coloană (fie ea de orice tip - de adsorbţie, partiţie, schimb ionic, etc.), în strat subţire sau 1 Martin, A.J.P., Synge, R.L.M., Biochem. J., 35 (1941) Martin, A.J.P. in: Nobel Lectures: Chemistry , Amsterdam, Elsevier, 1964, p James, A.T., Martin, A.J.P., Biochem.J., 48(1) (1951) 7 4 James, A.T., Martin, A.J.P., Analyst (London) 77 (1952) Porath, J., Flodin, P. A., Nature 183 (1959)

12 ... V ASILE O STAFE..... pe hârtie, şi cromatografia de lichide modernă sunt toate forme ale cromatografiei de lichide. Diferenţele dintre toate aceste procedee se referă la detalii de echipament, material cromatografic, tehnica de lucru, dar cromatografia de lichide modernă are câteva avantaje majore faţă de celelalte tehnici menţionate: viteză sporită de separare, posibilitatea de a separa amestecuri complexe, uşurinţă în executare, etc. Pentru a aprecia mai bine avantajele cromatografiei de lichide moderne să facem două comparaţii: între cromatografia de lichide şi cea de gaze şi între cromatografia de lichide modernă şi cea tradiţională 1. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE COMPARATĂ CU CROMATOGRAFIA DE GAZE Dezavantaje ale GC: Probele trebuie să fie volatile stabile termic Capacitatea excepţională a cromatografiei de gaze (GC) de a separa şi analiza amestecuri foarte complexe este astăzi unanim recunoscută. Comparată cu metodele cromatografice anterioare, GC realizează separări mult mai rapide şi eficiente. Există sisteme cromatografice pentru GC total automatizate, la preţuri acceptabile, cu performanţe excelente. Totuşi multe amestecuri nu pot fi rezolvate de GC, fie din cauză că substanţele respective nu sunt volatile, fie că sunt instabile termic şi se descompun în timpul cromatografierii. S-a estimat că numai 20% din compuşii organici pot fi separaţi corespunzător cu ajutorul GC, fără modificări chimice prealabile 1. Cromatografia de lichide, pe de altă parte nu cunoaşte limitări datorită volatilităţii sau instabilităţii termice a probelor. Astfel, LC este ideală pentru separări de 1 Fallon, A., Booth, R.F.G., Bell, L.D., Applications of HPLC in Biochemistry, Amsterdam, Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division),

13 I NTRODUCERE macromolecule şi specii ionice (de interes biomedical), pentru produşi naturali sensibili şi pentru o mare varietate de alte substanţe cu masă moleculară mare, mai puţin stabili, cum ar fi: proteinele, aminoacizii, acizii nucleici, polizaharidele, pigmenţii vegetali, lipidele polare, substanţele de interes farmaceutic (hormoni, vitamine, antibiotice, etc.), coloranţii, surfactanţii, medicamentele, pesticidele, etc. 2 Avantaje ale HPLC faţă de GC: Există 2 faze a căror parametri pot fi modificaţi cu uşurinţă Cromatografia de lichide are unele avantaje faţă de GC şi poate rezolva (de cele mai multe ori) separări mai complexe deoarece: În LC sunt utilizate două faze (una staţionară şi alta mobilă) cu selectivităţi diferite faţă de moleculele supuse separării, faţă de doar una în GC. Separarea cromatografică este rezultatul unor interacţii specifice între moleculele probei cu fazele staţionară şi mobilă. Aceste interacţiuni sunt absente în ce priveşte faza gazoasă mobilă a GC, dar sunt prezente în cazul LC, furnizând astfel o variabilă în plus în ce priveşte controlul şi îmbunătăţirea separării 3. 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Introduction to Modern Liquid Chromatography, New York, Wiley- Interscience, Snyder, L.R., Glajch, J.L., Kirkland, J.J., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, 1988, p Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Introduction to Modern Liquid Chromatography, New York, Wiley- Interscience,

14 ... V ASILE O STAFE..... Există o mare varietate de detectoare Ridicarea la scală se face uşor Detecţie nedistructivă În LC există (cel puţin până acum) o mai mare varietate de suporturi cromatografice 1 ; În LC se utilizează temperaturi scăzute (cel mai adesea temperatura ambiantă). În LC se poate utiliza o mare varietate de detectoare: colorimetre (eventual combinate cu reactoare unde se desfăşoară reacţii de formare a compuşilor coloraţi), spectrofotometre în UV, fluorimetre, detectoare de conductivitate, de refracţie, detectoare polarografice, detectoare radiometrice, spectrometre de masă, etc., În anumite cazuri de separări cromatografice în LC utilizarea unui detector corespunzător elimină necesitatea unei separări complete 2. Un mare avantaj al LC faţă de GC este faptul că după separarea cromatografică substanţele pot fi uşor recuperate în eprubete separate, cu ajutorul colectoarelor de fracţiuni. Trecerea de la LC analitică la cea preparativă se face relativ uşor, recuperarea componentelor separate fiind cantitativă. Există posibilitatea de recuperare a componentelor şi în GC, dar procedeul este mult mai complicat şi cel mai adesea necantitativ 3. În ciuda avantajelor menţionate ale LC faţă de GC, aceasta 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, Snyder, L.R., Liquid Chromatography Detectors, New York, Marcel Dekker, Inc Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons,

15 I NTRODUCERE din urmă este aplicată cu prioritate dacă nu sunt de aşteptat probleme speciale în ce priveşte separarea componentelor amestecului de analizat. Separările prin GC sunt în general mai rapide şi mai sensibile şi, cel mai adesea, mai puţin costisitoare 1,2. Substanţe hidrofile HPLC Acizi carboxilici volatili Sulfoamide Aldehide Cetone Paraquat Diquat Glifosat Glicoli Fenoxiacizi Coloranţi alimentari sintetici Aminoacizi Enzime Glucide Alcooli Ioni anorganici Surfactanţi Polaritate HS, 2 SO, 2 mercapto Hidrazine Epoxizi Nitrozamine Nitriţi Halogenuri alifataice Uleiuri esenţiale Pesticide organofosforice Benzeni Benzidine Fenoli nitraţi şi cloruraţi DDT Alcooli Dioxine PG, OG, DG fenoli PCB BHT, BHA, THBQ Antioxidanţi Triazine Acizi graşi Monomeri pentru mase plastice Ftalaţi Carbamaţi Ierbicide fenil-ureice PAH-uri Antibiotice Trigliceride Aflatoxine Coloranţi alimentari naturali Anilide Nitroanilide Flavonoide Vitamine liposolubile Fosfolipide Substanţe hidrofobe GC Co 2, CO, Hidrocarburi Metan alifatice C2 - C6 GC Esteri metilici ai acizilor graşi Esteri aromatici Hidrocarburi alifatice >C8 HPLC Substanţe volatile Volatilitate Substanţe nevolatile Fig. 2. Domenii de aplicabilitate ale GC şi HPLC. COMPARAŢIE ÎNTRE LC Să considerăm acum diferenţele dintre sistemul 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, Snyder, L.R., Glajch, J.L., Kirkland, J.J., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, p

16 ... V ASILE O STAFE..... CLASICĂ ŞI HPLC Dezavantaje ale LC clasice: Coloanele se pot refolosi de un număr foarte mic de ori Timp de analiză lung Reproductibilitate redusă cromatografic tradiţional şi cel modern: În LC clasică, o coloană este, în general, utilizată o dată (în cel mai bun caz de câteva zeci de ori) după care este golită şi reumplută (eventual materialul de umplere este regenerat). Aceasta reprezintă o mare cheltuială atât de manoperă cât şi de material. Aplicarea probei, pentru a se face corect, necesită o mare pricepere din partea operatorului. Curgerea solventului (eluentului) prin coloană se realizează prin cădere liberă (pe baza acceleraţiei gravitaţionale), sau cu ajutorul unor pompe peristaltice. Separările cromatografice durează, în varianta clasică, câteva ore (uneori câteva zile), fiind prin urmare procedee mari consumatoare de timp şi de efort uman 1. Variantele LC pe hârtie (Paper chromatography - PC) apărută prin ani 40 şi a cromatografiei în strat subţire (Thin Layer Chromatography TLC) din anii 50 a simplificat într-o oarecare măsură multe din operaţiile necesare separării cromatografice. Hârtia cromatografică sau plăcile gata turnate pentru TLC pot fi astăzi cumpărate la preţuri acceptabile. Aplicarea probelor în aceste tehnici este mai puţin pretenţioasă, existând, de altfel, şi dispozitive care permit aplicarea semiautomată sau automată a probelor. Curgerea solventului se realizează, cel mai adesea, prin capilaritate, hârtia sau placa cromatografică fiind introdusă într-un tanc cromatografic închis, ce conţine o cantitate mică din solventul eluant. În acest fel, singura intervenţie a operatorului constă în urmărirea frontului de solvent pentru a opri procesul cromatografic la timpul dorit. Detectarea şi cuantificarea substanţelor separate se realizează prin stropirea hârtiei sau plăcii uscate cu reactivi cromogenici corespunzători, pentru a se crea spoturi colo- 1 Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983)

17 I NTRODUCERE AVANTAJE ALE HPLC FAŢĂ DE LC CLASICĂ: Coloanele pot fi refolosite de sute de ori Injectarea probelor se face (semi)automat 16 rate pentru fiecare component separat. Tehnica PC şi TLC a simplificat mult procesul cromatografic şi a redus timpul de separare, care, în special în cazul TLC este de ordinul minutelor (30-60 min.). Totuşi, anumite limitări, caracteristice metodelor cromatografice "pat-deschis" (open-bed) s-au păstrat şi la aceste tehnici: reproductibilitate redusă; dificultate în realizarea determinărilor cantitative; timpi de separare mai lungi şi rezoluţii mai scăzute decât în cazul GC; capacitate limitată de realizare a separărilor preparative (de ordinul miligramelor); automatizare dificilă. Cromatografia de lichide modernă utilizează coloane închise, care pot fi refolosite de sute sau chiar de mii de ori, fără a periclita performanţele separărilor. Cu toate că aceste coloane sunt foarte scumpe (de la 300 $ în sus), ţinând cont de faptul că perioada de viaţă este foarte lungă, practic utilizarea lor este mai economică decât cea a coloanelor deschise. Cu toate că şi coloanele HPLC se pot încărca individual de fiecare operator, cel mai adesea, acestea se cumpără gata umplute, astfel că se poate elimina această operaţie mare consumatoare de timp şi care necesită multă îndemânare din partea operatorului. Injectarea probelor se realizează cu ajutorul unor dispozitive speciale - valve de injecţie, bucle de injecţie - care fac ca operaţia să fie rapidă şi foarte uşor de executat. Curgerea solventului prin coloană se realizează cu ajutorul unor pompe de mare presiune, motiv pentru care tehnica se mai numeşte cromatografie de mare presiune. În funcţie de presiunea cu care este împinsă faza mobilă în coloană, metodele cromatografice pot fi clasificate în cromatografie la presiune redusă (sub 5 bari), la presiune moderată sau medie (5-50 bari) şi la presiune înaltă (peste 50 bari). Curgerea solventului sub presiune are o serie de avantaje: viteza de curgere este rapidă şi (aproape) perfect controlată, ceea ce duce la reducerea dispersiei moleculare şi la o (aproape)

18 ... V ASILE O STAFE..... detectarea şi cuantificarea analiţilor eluaţi se face continuu şi automat timpuri multiple de detectoare automatizarea întregului proces cromatografic se face cu uşurinţă timp de analiză redus, tipic sub 20 minute Preţ ridicat al aparaturii, chimicalelor şi deci a analizelor perfectă reproductibilitate a separărilor cromatografice 1. Detectarea şi cuantificarea substanţelor separate se realizează în mod continuu cu ajutorul detectoarelor de diferite tipuri şi a integratoarelor-înregistratoare ce fac parte componentă din sistemele cromatografice HPLC. Aceste sisteme sunt complet automatizate: probele pot fi injectate automat cu ajutorul injectoarelor automate, operaţiile executate de sistemul de pompe, detectoare şi integratoare pot fi, de asemenea, controlate de către un calculator, iar regăsirea substanţelor separate se poate realiza cantitativ cu ajutorul colectoarelor de fracţiuni. Intervenţia manuală a operatorului este minimă, în cel mai rău caz, reducându-se la efectuarea injectării probei în coloană, el putând face alte operaţii în timp ce sistemul cromatografic lucrează. Operaţiile fiind automatizate, performanţele cromatografice sunt excepţional de ridicate, dacă le comparăm cu metodele de LC clasice, motiv pentru care metodele cromatografice moderne se numesc de înaltă performanţă. În plus, ridicarea la scară, adică trecerea de la cromatografia analitică la cea semi-preparativă şi preparativă se realizează foarte uşor. Datorită curgerii solventului sub presiune prin stratul cromatografic, timpul de cromatografiere a fost redus, majoritatea a separărilor realizându-se în mai puţin de 20 minute. Pentru realizarea diferitelor separări cromatografice există o multitudine de suporturi cromatografice care fac posibile separări de mare fineţe - cum ar fi izomerii optici. Marele "dezavantaj" al LC moderne (pe care de acum încolo o vom numi simplu HPLC) constă în preţurile foarte ridicate al aparaturii, care trebuie să fie de cea mai mare precizie, al materialului cromatografic, care trebuie să fie de cea mai bună calitate, al solvenţilor de eluţie, care trebuie să fie ce cea mai mare puritate, motiv pentru care iniţialele HPLC pot să însemne şi High Price Liquid Chromatography. 1 Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983)

19 T E O R II A HPLC FORŢE IMPLICATE ÎN RETENŢIA SOLUŢILOR PARAMETRI CROMATOGRAFICI Retenţia unui amestec de soluţi pe o fază staţionară are loc ca urmare a conlucrării mai multor forţe, printre care amintim 1 : Forţe Van der Waals ; Interacţii dipol-dipol; Legături de hidrogen; Interacţii ionice. Principalii parametri cromatografici rezultaţi în urma analizei cromatografice sunt prezentaţi în Figura 3a 1,2 : t o timpul scurs de la injectarea probei în sistem până ce frontul de solvent sau orice solut total nereţinut de coloană a ajuns în celula de detecţie; V 0 volumul mort (void volume)(fig. 3a) reprezintă suma volumelor interstiţiale dintre particulele fazei staţionare şi a volumelor accesibile fazei mobile din porii particulelor fazei staţionare (în cromatografia de cernere moleculară 3 V 0 reprezintă doar volumul de solvent din afara perlelor de gel - Fig. 3b); t R timpul de retenţie al solutului de interes; 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) Fischer, L.,"Gel Filtration Ghromatography", Amsterdam, Elsevier, 1980

20 ... V ASILE O STAFE..... V R volumul de retenţie al solutului de interes (volumul de fază mobilă colectat de la momentul injectării probei până în momentul în care solutul de interes iese din celula de detecţie); V R şi t R pot fi interconvertiţi prin relaţia: V R = t R F, Fig. 3a. Un profil cromatografic tipic, prezentând diferiţi parametri cromatografici. unde F este viteza volumetrică a fazei mobile, exprimată în ml min 1 (V R este mai mare decât Vx cu excepţia cromatografiei de excludere moleculară, unde volumul de retenţie este egal cu volumul la care are acces solutul de interes - Fig. 3b). K este coeficientul de partiţie sau de distribuţie a solutului între faza staţionară şi faza mobilă şi este legat de volumul de retenţie prin relaţia: Fig. 3b. Variabile folosite pentru a caracteriza patul cromatografic: Vo - volumul de solvent din afara perlelor de gel; Vx - volumul fazei staţionare (atunci se mai notează cu Vs) sau volumul la care are acces analitul; Vt - volumul total al coloanei. V R = V 0 +KV S (unde V S este volumul fazei staţionare. În cromatografia de cernere moleculară, sau gel-cromatografie, se folosesc adesea 2 coeficienţi de partiţie, diferenţa provenind din modul de definiţie a fazei staţionare: daca întreg gelul este considerat fază staţionară atunci Kaw = (V R -V 0 )/V X ; dacă faza staţionară este doar porţiunea de fază mobilă din interiorul perlelor de gel, dar fără volumul ocupat de pereţii perlelor de gel, atunci K d = (V R - V 0 )/V S, deşi în al doilea caz măsurarea lui V S este dificilă) 19

21 C T EORIA H P L Factorul de capacitate (sau factorul de retenţie) k Ec. 1 ts t R t0 VR V0 k' t t V 0 Ec. 2. K V m k' şi Vs Factorul de separare k (Ec. 3) k ' B ' A 0 0 C K C CARACTERIZAREA DISPERSIEI BENZILOR CROMATOGRAFICE Fig. 4. O bandă cromatografică Gaussiană şi câteva mărimi corelate. s m În procesul de trecere prin coloană moleculele de solut fluctuează continuu între faza mobilă şi cea staţionară. Prin urmare, t R va cuprinde timpul pe care moleculele de solut îl petrec în faza mobilă (t 0 ) şi cel petrecut în faza staţionară (t s ): t R = t 0 + t s. Factorul de capacitate (sau de retenţie) k, care reprezintă o modalitate mult utilizată în HPLC de a exprima gradul de retenţie al solutului de interes în faza staţionară, este dat de ecuaţia 1. Factorul de capacitate este corelat cu coeficientul de distribuţie prin ecuaţia 2, unde C s şi C m sunt concentraţiile solutului în fazele staţionară şi respectiv mobilă. Raportul factorilor de capacitate a doi soluţi A şi B se numeşte factor de separare α (denumit şi selectivitate), conform ecuaţiei 3, unde k B > k A În urma migrării prin coloană, zonele individuale ale soluţilor suferă dispersii sau lărgiri ale benzilor, aşa cum se prezintă în figura 4, care reprezintă un pisc cromatografic tipic, de formă Gaussiană. 20

22 ... V ASILE O STAFE..... NUMĂRUL DE TALERE TEORETICE t R Ec. 4. N Deviaţia standard σ a benzii Gaussiene (W b = 4σ) poate fi calculată cu ecuaţia 4., unde N reprezintă numărul de talere teoretice. W b este lărgimea benzii la baza ei, iar W h este lărgimea benzii la jumătatea înălţimii piscului cromatografic: 2 t R N Ec t R N Ec. 6. Wb t R N 5,54 Ec. 7. Wh t R h N 2 Ec. 8. A Noţiunile de talere teoretice şi teoria talerelor au fost introduse de Martin şi Synge [2]. Teoria lor vedea coloana cromatografică ca fiind divizată într-un număr mare de segmente, numite talere teoretice similare cu treptele individuale dintro separarea în contracurent. În fiecare din aceste W b = 2 W h = 4σ Eficienţa coloanei cromatografice depinde de N. Să considerăm coloana împărţită în multe talere teoretice În fiecare taler teoretic moleculele de solut vor atinge un echilibru de distribuţie între faza mobilă şi cea staţionară. N este atât o măsură a eficienţei coloanei cât şi a lărgimii (dispersiei) benzilor cromatografice 1, conform cu ecuaţiile 5, 6 şi 7. Determinarea valorilor dispersiei la baza sau la jumătatea înălţimii piscurilor cromatografice poate fi o sarcină destul de dificilă. Majoritatea integratoarelor sau a softurilor dedicate nu calculează automat aceste valori. În schimb integratoarele şi softurile cromatografice calculează aria şi înălţimea piscurilor cromatografice, motiv pentru care numărul de talere teoretice poate fi calculat cu mai mare uşurinţă cu ecuaţia 8, în care h este înălţimea piscului cromatografic iar A este aria sa (ambele exprimate în unităţile integratorului sau softului respectiv). 1 Syed, S.E.H. High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J.Oxford New York Tokyo:Oxford University Press, 1991,p

23 C T EORIA H P L talere ipotetice se presupunea a avea loc o echilibrare completă a partiţiei solutului între faza staţionară şi cea mobilă. Aceste echilibrări se presupuneau a avea loc secvenţial de la primul la ultimul taler teoretic al coloanei. Cu cât numărul de talere teoretice este mai mare cu atât separarea este mai eficientă. Din acest motiv N este o abreviere pentru eficienţa separării. ÎNĂLŢIMEA ECHIVALENTĂ A UNUI TALER TEORETIC L H Ec. 9. N Cu cât valoarea lui N este mai mare cu atât separarea va fi mai bună. N creşte: cu cât particulele cromatografice ale fazei staţionare sunt mai mici cu cât viteza fazei mobile prin coloană este mai mică; cu cât temperatura fazei mobile este mai ridicată: cu cât viscozitatea fazei mobile este mai scăzută; cu cât împachetarea fazei mobile este mai bună; cu cât moleculele de solut au mase moleculare mai mici. N este direct proporţional cu lungimea coloanei (L). O altă exprimare a eficienţei unei coloane este înălţimea echivalentă a unui taler teoretic H, determinată conform ecuaţiei 9. Este evident că H trebuie să aibă valori cât mai mici pentru ca o coloană să fie eficientă. Cei mai importanţi factori de care depinde H sunt: dispersia benzilor cromatografice, difuzia Eddy, difuzia longitudinală, variaţiile în transferul de masă volumul mort (void) excesiv al sistemului cromatografic. (factori ce nu vor fi discutaţi în prezentul capitol, dar ce pot fi studiaţi în lucrările prezentate ca bibliografie). CUM SE DETERMINĂ EXPERIMENTAL N? Calitatea coloanei ca o măsură a numărului de talere teoretice N se determină experimental astfel: 22

24 ... V ASILE O STAFE..... proba constă dintr-o substanţă cu masă moleculară mică (de exemplu toluen sau naftalină) viteza volumetrică 1 ml min 1 pentru coloane cu diametrul de 0,4 0,5 cm (pentru coloane cu diametrul mai mic sau mai mare se va folosi o viteză volumetrică proporţională cu pătratul diametrului coloanei) viscozitatea fazei mobile (η)v să fie mai mică de 1 cp (de exemplu faza mobilă poate fi amestec acetonitril apă, pentru temperaturi >20ºC. temperatura de lucru <40ºC echipament cromatografic cu volum mort minim. 23

25 C T EORIA H P L Valori reprezentative pentru N sunt prezentate în tabelul 1. Dacă o coloană nouă are valori N mai mici de două treimi din aceste valori ideale, ea trebuie înlocuită cu o coloană mai bună. Tabelul 1. Numărul de talere teoretice N pentru o coloană HPLC bine împachetată, în condiţii cromatografice ideale 1 Diametrul Lungimea Numărul de particulei coloanei talere teoretice μm) (cm) N REZOLUŢIA Ec.10. Optimizarea procesului cromatografic implică realizarea unui compromis între obţinerea unei separări maxime între doi soluţi ce eluează consecutiv (fie ei A şi B) şi obţinerea unei dispersii minime a benzilor lor cromatografices 2. Raportul celor două efecte este exprimat prin rezoluţie Rs, conform ecuaţiei Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons,

26 ... V ASILE O STAFE ( Rs W A t R A b t W B R ) B b Ec k' Rs N 4 1 k' Rezoluţia poate fi exprimată şi în termenii cromatografici fundamentali: selectivitatea (α =k A /k B ), numărul de talere teoretice N şi factorul de capacitate k, conform ecuaţiei 11. Pentru a obţine cea mai bună rezoluţie, aceşti trei factori pot fi optimizaţi separat. Factorul de selectivitate pare a fi cel mai important factor al rezoluţiei şi el poate fi modificat prin schimbarea 1 : temperaturii, a compoziţiei fazei mobile, a fazei staţionare. Schimbarea compoziţiei fazei staţionare este opţiunea cea mai des folosită pentru a îmbunătăţi rezoluţia. 1 Snyder, L.R., Liquid Chromatography Detectors, New York, Marcel Dekker, Inc

27 M E C A N II S M E L E S E PA RĂR II II TIPURI DE FAZE STAŢIONARE AVANTAJE ALE MATERIALELOR PENTRU FAZA INVERSATĂ MATERIALE PENTRU FA- ZELE SCHIMBĂTOARE DE Fazele staţionare pot fi clasificate în funcţie de mecanismele prin care ele separă moleculele 1,2 : faze de partiţie faze de adsorbţie faze schimbătoare de ioni faze de excludere moleculară Cele mai populare materiale cromatografice actuale sunt fazele inversate, unde separarea este realizată prin mecanisme de partiţie (şi eventual adsorbţii pe grupările silanol neprotejate). In cromatografia în fază inversată, faza staţionară este nepolară (sau mai puţin polară decât faza mobilă) şi soluţii sunt reţinuţi până ce eluează cu un volum suficient de fază mobilă 3. Materialele pentru faza inversată pot fi folosite la majoritatea separărilor, au un timp de viaţă lung, reproductibilităţi foarte bune, timpi de echilibrare reduşi, stabilitate mecanică mare şi ordinea şi timpul de eluţie al soluţilor pot fi predictibile. Materialele schimbătoare de ioni comparate cu cele utilizate în cromatografia în fază inversată au timp de viaţă 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) Fallon, A., Booth, R.F.G., Bell, L.D., Applications of HPLC in Biochemistry, Amsterdam, Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division), 1990

28 .... M ECANISMELE S EPARARII IONI GELURI DE EXCLUDERE MOLECULARĂ MATERIALE PENTRU CROMATOGRAFIA DE ABSORBŢIE AVANTAJELE COLOANELOR CU DIA- METRU INTERN MIC (NARROW-BORE) economie de solvent (de până la 60%) sensibilitate mărită (de 4-6 or i) mai scurt, stabilitate mecanică mai mică şi necesită timpi de echilibrare mai lungi. Aceste coloane au aplicabilităţi reduse 1. Cromatografia de excludere moleculară este folosită pentru curăţarea probelor şi pentru fracţionare 2. Cromatografia de absorbţie este folosită destul de des pentru pregătirea şi curăţarea probelor. De exemplu, hidrocarburile aromatice policiclice din aer sunt colectate pe adsorbanţi din cărbune activ., flavonoidele din plante pot fi curăţate de contaminanţi, fracţionate şi îmbogăţite pe geluri de alumină, etc. 3 Discuţiile referitoare la materialele cromatografice folosite în HPLC trebuie să atingă şi problema diametrului intern al coloanei. Coloanele standard HPLC din zilele noastre au un diametru intern de 4 5 mm, în timp ce coloanele cu diametru intern mic (aşa numitele coloane narrow-bore) au un diametru intern de aproximativ 2 mm. Când sunt împachetate cu aceleaşi materiale cromatografice ca şi coloanele standard, coloanele narrow-bore pot obţine aceeaşi putere de separare cu mai puţin solvent, deoarece solutul de interes poate fi eluat cu o viteză volumetrică mai redusă (<0,5 ml min 1 ) decât cea utilizată în cazul coloanelor standard (1 3 ml min 1 ). În plus, coloanele narrow-bore sunt de 4 6 ori mai sensibile, folosind acelaşi volum de injecţie utilizat la coloanele standard 3. 1 Smith, F.C.J. Chang, R.C., The Practice of Ion Chromatography, New York:Wiley, Yau, W.W., Kirkland, J.J., Bly, D.D., Modern Size-exclusion Liquid Chromatography, New York:Wiley-Interscience, Steiner, F., Applications of Narrow-bore Columns in HPLC, Waldbronn Analytical Devision, HP, Germany:Hewlett Packard ( E),

29 P R E GĂT II R E A P R O B E LO R ETAPELE PREGĂTIRII PROBELOR 1) Omogenizări 2) Centrifugări 3) Precipitări 4) Hidrolizări 5) Extracţii lichid / lichid Separarea analiţilor de constituenţii matricei probei este sarcină importantă de care depinde în cea mai mare măsură succesul separării. Prepararea probelor pentru HPLC implică următoarele etape 1 : Colectarea şi stocarea probelor Curăţarea şi îmbogăţirea probelor (curăţarea se referă la eliminarea cât mai multor contaminanţi) presupune folosirea următoarelor operaţii 6) Extracţii în fază solidă 7) Extracţii în băi ultrasonice 8) Extracţii cu fluide supercritice 9) Concentrări Fracţionarea (şi îmbogăţirea) probelor presupune utilizarea de Coloane de protecţie, Cromatografie multidimensională, Cromatografie de gel-permeaţie, Cuplarea HPLC cu GC 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, 1997

30 .... P REGÃTIREA P ROBELOR Derivatizarea chimică a probelor presupune derivatizarea probelor pre-coloană (înainte de injectare), operaţie ce se poate realiza şi automat (după injectare). Este posibilă şi derivatizarea post-coloană. AUTOMATIZAREA PROCESULUI DE PREPARARE A PROBELOR Extracţia manuală, curăţirea şi concentrarea probelor înainte de injectare sunt operaţii consumatoare de timp şi necesită operatori specializaţi. Din această cauză operaţiile legate de pregătirea probelor trebuie automatizate cât de mult posibil. Actualmente există sisteme HPLC ce realizează integral operaţiile legate de prepararea probelor. Extracţia cu lichide supercritice (SFE) şi extracţia cu faze solde (SPE) au fost interfaţate cu sistemele HPLC. Echipamentele automate pentru pregătirea probelor pentru HPLC cuprind 1 : Valvele sunt folosite pentru a schimba coloanele între ele, pentru a permite cuplarea directă a sistemului SPE cu HPLC Interfeţe directe cu SFE şi SPE Derivatizare pre-coloană PROBE SOLIDE Probele solide, cum ar fi solurile, ciocolata, produsele de carne, trebuie mai întâi omogenizate, după care sunt supuse operaţiilor de extracţie 2,3. 1 Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard,

31 ... V ASILE O STAFE..... EXTRACŢIE CU SOXHLET operaţia se execută înainte de injectare (offline) timp lung de extracţie consum mare de solvenţi există metode puse la punct pentru o mare varietate de clase de compuşi Cu un lichid de extracţie bine ales, echipamentul Soxhlet poate extrage componentele nevolatile cât şi unele componente mai puţin polare 2. Extracţiile cu aparatul Soxhlet sunt lente (12 24 h), dar procesul nu necesită prezenţa operatorului. Pentru a reduce timpul de extracţie probele trebuie foarte fin mărunţite. Deoarece în vasul cu solventul la fierbere se acumulează analitul extras, acesta trebuie să fie stabil la punctul de fierbere al solventului folosit la extracţie. Dezvoltarea metodei implică găsirea unui solvent volatil (cu punct de fierbere sub 100 ºC) în care analitul să aibă o mare solubilitate, iar contaminanţii o foarte mină solubilitate. Fiind cea mai veche formă de extracţie eficientă, extracţia cu Soxhlet este considerată ca extracţie de referinţă pentru metodele mai noi. Există variante micro şi parţial automatizate cât şi variante mixte în care extracţia cu aparatul Soxhlet este combinată cu alte metode. EXTRACŢIA CU LICHIDE ÎN BĂI ULTRASONICE consum redus de solvenţi Extracţia cu lichide în băi ultrasonice este o metodă foarte simplă de extracţie pentru probele solide 1. Selectivitatea este asigurată de folosirea unor solvenţi adecvaţi. De exemplu, metoda a fost folosită pentru extragerea antioxidanţilor şi conservanţilor alimentari din matrice cu conţinut redus de grăsimi. DISTILAREA CU VAPORI Distilarea cu vapori este folosită doar pentru extracţia 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons,

32 .... P REGÃTIREA P ROBELOR extracţii selective timp lung de extracţie compuşilor volatili din matrice solide. De exemplu, pesticidele bifenilice şi 2-fenilfenilfenolice pot fi extrase din sucuri de fructe prin această tehnică 1 EXTRACŢIE CU LICHIDE SUPERCRITICE (SFE - supercritical fluid extraction) capacitatea redusă de solvatare limitează aria de aplicabilitate consum redus de solvenţi timp redus de extracţie procesul poate fi automatizat Starea fizică a unei substanţe poate fi descrisă de o diagramă de faze care defineşte regiunile corespunzătoare stărilor solidă, lichidă şi gazoasă 2. Punctele de pe curbele diagramei definesc situaţiile în care există un echilibru între două dintre faze, În diagrama fazelor dioxidului de carbon, linia dintre faza lichidă şi cea gazoasă are o zonă terminală, numită punctul critic, spre deosebire de linia dintre fazele solidă şi lichidă. Punctul critic este definit de temperatura critică şi presiunea critică. Deasupra punctului critic regiunea supercritică gazul nu poate fi convertit in stare lichidă prin modificarea presiunii. Un lichid supercritic se manifestă ca un gaz în ce priveşte transferul de masă şi ca un lichid în ce priveşte proprietăţile de solubilitate. Astăzi SFE este larg utilizată pentru extracţia analiţilor nepolari sau puţin polari din matrice solide. PROBE LICHIDE Pentru pregătirea probelor lichide există o mare varietate de metode, dar numai unele mai sunt astăzi utilizate larg în HPLC. De exemplu, distilarea este limitată la compuşii volatili, liofilizarea este limitată la purificarea probelor biologice, etc. EXTRACŢIA LICHID LICHID Extracţia lichid lichid (ELL) este cea mai comună metodă de extracţie folosită pentru probele lichide. Cuprinde 1 Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard,

33 ... V ASILE O STAFE..... necesită mari cantităţi de solvenţi organici toxici dificil de automatizat simplă modificatori selectivi (ph, săruri, perechi ionice) variante simple, cum ar fi utilizarea unui solvent convenabil şi a unei pâlnii de separare, cât şi variante sofisticate de extracţie continuă sau de distribuţie în contracurent. ELL este utilă pentru separarea analiţilor de contaminanţi prin partiţionarea probei între 2 faze lichide nemiscibile. Una dintre faze este apoasă, iar cealaltă un solvent organic. Compuşii mai hidrofili vor prefera faza apoasă, în timp ce compuşii mai hidrofobi vor prefera faza organică. Analiţii extraşi în faza organică pot fi recuperaţi prin evaporarea solventului, pe când cei extraşi în faza apoasă pot fi injectaţi direct în coloana HPLC 1. Tabelul 2. Solvenţi pentru ELL Solvenţi apoşi Solvenţi organici nemiscibili cu apa Apa pură Soluţii acide Soluţii bazice Săruri (salting-out) Agenţi de complexare (chelare, chirali, perechi-ionice, etc.) Combinaţii ale celor de mai sus Hidrocarburi alifatice (hexan, izooctan, eter de petrol, etc) Eteri Clorură de metilen Cloroform Acetat de etil sau alţi esteri Cetone alifatice superioare (>C6) Alcooli superiori Toluen, xileni Solvenţi organici miscibili cu apa (neutilizabili pt. ELL) Alcooli inferiori Cetone inferioare Acizi carboxilici inferiori Acetonitril Dimetil sulfoxid Dioxan EXTRACŢIA ÎN FAZĂ SOLIDĂ Avantaje SPE vs ELL extracţia analitului mai completă consum redus de Extracţia în fază solidă (Solid Phase Extraction - SPE) este foarte potrivită pentru analiza probelor de apă sau a diferitelor tipuri de băuturi 1. Proba este sucţionată peste un cartuş pre-condiţionat sau un disc umplut cu adsorbanţi corespunzători. Materialul adsorbant reţine analiţii ce pot fi 1 Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard,

34 .... P REGÃTIREA P ROBELOR solvenţi recuperarea uşoară a analitului automatizare uşoară eluaţi cu solvenţi organici. Există o mare varietate de materiale adsorbante ceea ce permite utilizarea tehnicii la aproape toate tipurile de probe. SPE poate fi utilizată şi ca tehnică de separare, deoarece proba iniţială poate fi divizată şi trecută pe mai multe tipuri de adsorbanţi. Sistemele HPLC noi permit executarea operaţiilor SPE automat, online. Aplicaţiile SPE în pregătirea probelor include: îndepărtarea contaminanţilor şi a substanţelor de distrug coloanele analitice (substanţe ce se adsorb prea puternic) concentrarea analitului (solutului de interes) eliminarea sărurilor din probă schimbarea solventului (sau a tamponului) derivatizare in situ păstrarea şi transportul probelor. Aplicarea SPE implică următoarele etape 2 : condiţionarea adsorbantului (implică o spălare cu un solvent tare (cu mare putere de eluare), de obicei cu metanol sau acetonitril şi are rolul de a îndepărta impurităţile şi de a permite solvatarea adsorbantului) aplicarea probei (proba este dizolvată într-un solvent slab (cu putere de eluare mică), cel mai adesea apa, eventual cu mici concentraţii de solvent organic) spălarea adsorbantului de contaminanţi (se face cu un solvent de tărie intermediară, deci apă cu ceva mai 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, Snyder, L.R., Glajch, J.L., Kirkland, J.J., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons,

35 ... V ASILE O STAFE..... mult solvent organic şi are rolul de a elimina contaminanţii din probă dar de a păstra adsorbit analitul) recuperarea analitului (se face prin eluarea cu un mic volum de solvent tare, de obicei metanol sau acetonitril) CROMATOGRAFIA DE GEL-PERMEAŢIE necesită mari cantităţi de solvenţi foarte reproductibilă posibilităţi bune de automatizare Cromatografia de gel-permeaţie (GPC), cunoscută şi sub numele de cromatografie de excludere moleculară, a devenit o metodă larg utilizată pentru izolarea compuşilor cu masă moleculară mică (cum ar fi pesticidele) din probele ce conţin compuşi cu mase moleculare mari, cum ar fi uleiurile şi grăsimile. Separarea se bazează pe diferenţele de dimensiuni, compuşii cu mase moleculare mai mari sunt reţinuţi mai puţin decât cei cu mase moleculare mai mici 1,2. CROMATOGRAFIA DE LICHIDE MULTIDIMENSIONALĂ TEHNICI HPLC CG CUPLATE Cromatografia de lichide multidimensională (MDC) incorporează cel puţin 2 coloane analitice de separare, interconectate printr-o valvă, care prin modificarea poziţiei permite transferarea fracţiunilor eluate dintr-o coloană în cealaltă. Tehnica poate fi utilizată pentru curăţirea probelor de contaminanţi, dar şi pentru îmbogăţirea în analit 3. Utilizarea tehnicilor HPLC GC cuplate pare a fi opţiunea ideală, ce ar trebui să rezolve toate tipurile de analize. Sistemul HPLC fracţionează proba, o curăţă de 1 Snyder, L.R., Glajch, J.L., Kirkland, J.J., Practical HPLC Method Development, New York:John Wiley and Sons, Yau, W.W., Kirkland, J.J., Bly, D.D., Modern Size-exclusion Liquid Chromatography, New York:Wiley-Interscience, Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R. HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard,

36 .... P REGÃTIREA P ROBELOR contaminanţi şi o îmbogăţeşte în analit, în timp de GC separă eficient soluţii de interes iar un detector spectrometru de masă îi identifică cu mare acurateţe. Dificultăţile constau în posibilităţile de interfaţare a celor 2 sisteme cromatografice, deoarece din sistemul HPLC iese în mod continuu faza mobilă cu o viteză de 1-2 ml min 1, iar în GC se injectează doar 10 μl 1. PROBE GAZOASE Compuşii organici din aer pot fi împărţiţi în trei grupe 2 : Gazele (în stare naturală), sunt, de obicei, analizate prin GC. Substanţele organice ce au o presiune de vapori suficientă pentru a sublima sau a se volatiliza, sunt colectate prin sucţionarea unui volum bine determinat de aer într-un tub umplut cu un material adsorbant potrivit. Compuşii adsorbiţi pot fi eluaţi cu solvenţi organici, concentraţi şi injectaţi în sistemul HPLC. Substanţele organice ce sunt ataşate la particule din aer, cum ar fi praful, sunt colectate prin filtrare, precipitare electrostatică sau alte procedee, după care sunt izolate (extrase în solvenţi potriviţi) şi concentrate. 1 Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard,

37 T E H N II C II D E I N JJ E C TA R E A P R O B E LO R ÎÎ N S II S T E M U L HPLC PRINCIPIILE ŞI CARACTERISTICILE UNUI BUN DISPOZITIV DE INTRODUCERE A PROBELOR După pregătirea probelor acestea pot fi injectate în coloana HPLC. Determinarea cantitativă a analiţilor impune un control riguros al volumului probei injectate. Principalele cerinţe pentru un dispozitiv de introducere a probelor în coloana HPLC sunt 1,2,3. O bună precizie; Efecte de memorare reduse (contaminarea cu material de la injectarea anterioară); Posibilitatea de a injecta probe vâscoase; Posibilitatea de a injecta volume variabile. Automatizarea injectării, eventual cu posibilitatea de derivatizare pre-coloană, încălzire, răcire, amestecare soluţii, etc. sunt opţiuni dar şi cerinţe ale sistemelor HPLC actuale. 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, 1994

38 .... I NJECTAREA P ROBELOR Fig. 5. Valva tip Rheodyne, cu 6 porturi. În poziţia din stânga (notată load) are loc încărcarea probei în bucla (spirala) calibrată. Excesul de probă este eliminat. Prim modificarea poziţiei pe injectare (notată inject), faza mobilă intră în bucla calibrată şi împinge proba conţinută în ea în coloana analitică. Sistemele de injecţie sunt, cel mai adesea, bazate pe valve cu şase porturi 1, aşa cum se prezintă în figura 5. INJECTOARE MANUALE Injectoarele manuale sunt încă suficient de mult folosite deoarece sunt ieftine şi nu necesită experienţă din partea operatorului. Atenţie deosebită trebuie acordată spălării exhaustive a seringii înainte de a se efectua injectarea unei noi probe. INJECTOARE AUTOMATE reproductibilitate foarte bună Principial injectoarele automate utilizează acelaşi principiu al valvei cu 6 porturi. Sisteme pneumatice sau electrice permit schimbarea poziţiei valvei de pe load pe inject cât şi injectarea de volume foarte mici (0,1 1,5 μl). Există sisteme sofisticate de injectoare automate, care pot controla aspirarea probei din stratul inferior sau superior al unei probe formate din 2 faze nemiscibile, sau care realizează 1 Syed, S.E.H., High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J.Oxford New York Tokyo, Oxford University Press, 1991,p

39 ... V ASILE O STAFE..... retragerea acului cu o anumită viteză, mereu aceeaşi şi fac injecţia atunci când pistoanele pompei sunt în aceeaşi poziţie, mereu aceeaşi, pentru îmbunătăţirea reproductibilităţi 1,2,3. AUTOSAMPLERE (INJECTOARE AUTOMATE DE PROBE) Autosamplerele permit, pe lângă injectarea automată a probelor, realizarea de derivatizări pre-coloană, diluarea volumelor mici de probe, adăugarea de standarde interne la probe, realizarea automată de curbe de etalonare, etc. 4,5. 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983) Syed, S.E.H., High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J.Oxford New York Tokyo:Oxford University Press, 1991, p Kraak, J.C. Sample Introduction Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, ed. Huber, J.F.K., Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard,

40 P O M P E L E D E FA Z E M O B II L E Ş II D E G A Z O A R E L E CARACTERISTICILE UNEI POMPE HPLC Pompa este piesa critică a echipamentului HPLC. Reproductibilitatea rezultatelor, posibilitatea identificării piscurilor cromatografice şi a cuantificării acestora depinde în cea mai mare măsură de performanţele pompei 1. O pompă HPLC modernă trebuie: Să nu aibă pulsuri de presiune Să aibă o viteză volumetrică foarte constantă, indiferent de compoziţia fazei mobile Posibilitatea de a pompa volume variabile Să aibă un volum mort foarte mic Să aibă limitator de presiune maximă Să permită pomparea şi amestecare cu mare precizie a cel puţin 2 lichide, pentru formarea de gradienţi. 1 Huber, J.F.K., The Chromatographic Apparatus from the Viewpoint of System Theory. In: Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, ed. Huber, J.F.K., Elsevier Scientific Publishing Company, Amsterdam, 1978, p. 1-9

41 ... V ASILE O STAFE..... POMPAREA DE VOLUME VARIABILE De obicei, pompele ce realizează gradienţi de joasă presiune pot pompa lichidele cu o viteză volumetrică de 0,2 10 ml min 1, pe când pompele ce realizează gradiente la presiune ridicată pompează lichidele cu o viteză volumetrică de 0,05 5 ml min -1, utilizate şi pentru coloanele narrow-bore 1,2. ELUAREA CU GRADIENŢI creşte rezoluţia scade timpul total de analiză FORMAREA DE GRADIENŢI LA PRESIUNE RIDICATĂ creează gradienţi cu pantă mare Unele probe complexe conţin mai mulţi soluţi de interes, care trebuie separaţi într-o singură cromatografiere. Dacă eluarea se face fără modificarea compoziţiei fazei mobile spunem că eluarea este izocratică. Schimbarea compoziţiei fazei mobile pe parcursul eluării (eluarea cu gradienţi) este o tehnică larg folosită în HPLC în scopul îmbunătăţirii separării acestor probe complexe. Tehnica este absolut obligatorie în cromatografia de schimb ionic şi foarte mult utilizată în cromatografie în fază inversată. În acest din urmă caz, tăria solventului creşte pe parcursul eluării. Aceasta duce la creşterea rezoluţiei, fără a se mări timpii de retenţie (şi deci fără a creşte dispersia benzilor cromatografice). Timpul total de analiză scade în urma utilizării eluării cu gradienţi. Dacă amestecarea solvenţilor are loc la presiune ridicată, deci după ieşirea solvenţilor din pompe, înseamnă că sistemul HPLC trebuie să conţină cel puţin 2 pompe, fiecare funcţionând izocratic, cu unul din cei 2 solvenţi. Sistemul are avantajul că poate forma gradienţi foarte 1 Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, Martin, M., Guiochon, G., Pump Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, ed. Huber, J.F.K., Elsevier, Amsterdam, 1978, p

42 P OMPE H P L C preţ ridicat exacţi, cu pantă mare şi permite schimbarea rapidă a solvenţilor (de la 100% A la 100% B) fără ca degazarea solvenţilor să fie absolut necesară. Dezavantajul principal constă în preţul de cost (trebuie cumpărate 2 pompe), dar şi în faptul că sistemul ocupă mai mult spaţiu în laborator 1. FORMAREA DE GRADIENŢI LA PRESIUNE REDUSĂ ieftin, poate amesteca mai mult de 2 solvenţi necesită degazare Cu o singură pompă, dar cu ajutorul unor valve comandate de un microprocesor, se pot crea gradienţi la presiune redusă. Pompa va trage un timp definit de microprocesor din diferitele lichide în funcţie de valva care este deschisă. Prin urmare acest sistem, deşi mai ieftin, creează un gradient în trepte, acurateţea lui depinzând în mare măsură de programul de control al valvelor şi de design-ul sistemului de amestecare a solvenţilor. În plus, degazarea solvenţilor este absolut necesară. Marele avantaj al acestui sistem este faptul că, în funcţie de numărul de valve, poate amesteca mai mult de 2 solvenţi 2. DESIGN-UL POMPELOR Toate tipurile de analize HPLC depind în primul rând de performanţele pompelor. Deşi există multe tipuri de pompe, unele nu s-au impus în decursul timpului (pompele pneumatice), iar altele, deşi cu excelente caracteristici, fiind prea scumpe, au o răspândire limitată 3. Cele mai des întâlnite tipuri de pompe sunt cele cu 2 1 Huber, J.F.K., ed. Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, Elsevier Amsterdam, Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons,

43 ... V ASILE O STAFE..... POMPE CU 2 PISTOANE, CU FORMARE DE GRADIENŢI LA JOASĂ PRESIUNE Fig. 6. Design-ul unei pompe cu 2 pistoane în serie, cu cursă în contratimp. PERFORMANŢE Precizie realizare viteză volumetrică: <0,3% Domeniu 0,2 9,9 L min-1 Volum întârziere în formare gradient: 0,8-1,1 ml Puls de presiune <2% Precizie în realizarea compoziţiei gradientului 0,2% pistoane în serie, cu cursă în contratimp (figura 6.). Faza mobilă intră în prima cameră a pompei prin intermediul unei valve de intrare comandată electric. Utilizarea acestui tip de valve elimină problemele de contaminare sau blocare întâlnite la valvele cu bile. Faza mobilă este împinsă într-un damper (ce are rolul de a reduce pulsurile de presiune, create în momentele când pistoanele îşi schimbă sensul) cu volum mic, ce are montat şi un traductor de presiune, după care pătrunde în cea de-a doua cameră a pompei. Cele două pistoane acţionează în contratimp, astfel că atunci când o cameră se umple cu fază mobilă, cealaltă se goleşte. Volumul de lichid împins la fiecare cursă a pistoanelor poate fi redus pentru a optimiza viteza volumetrică şi precizia în realizarea debitului, cerinţe necesare pentru a asigura o bună reproductibilitate a timpilor de retenţie. Faza mobilă este împinsă din ce-a de-a doua cameră în sistemul de injecţie. Acest sistem poate crea gradiente de joasă presiune, cu ajutorul valvelor de proporţionare ce fac legătura între rezervoarele de fază mobilă şi prima valvă de intrare în pompă. Majoritatea sistemelor conţin 3 sau 4 astfel de valve (ajungându-se până la 8 la modele mai pretenţioase). Valvele sunt sincronizate cu mişcarea pistoanelor şi amestecă solvenţii pe parcursul cursei de umplere a primei camere a pompei. În acest fel nu este necesară montarea unui mixer, păstrând volumul de întârziere al pompei la valori mai mici de 0,9 ml. Comparate cu pompele convenţionale multi-solvent cu volum fix al camerei de pompare, pompele cu volum variabil 41

44 P OMPE H P L C POMPE CU DISPOZITIVE VOLUMETRICE PERFORMANŢE Precizie realizare viteză volumetrică: <0,2% Reproductibilitate <2% Domeniu Var. (a) 0,5 2,5 L min-1 Var. (b) 0,05 2,5 L min-1 Volum întârziere în formare gradient: 1,8-2,9 ml Puls de presiune <2% Precizie în realizarea compoziţiei gradientului Varianta (a) 0,25% al camerei de pompare generează gradienţi foarte precişi. Modelele mai noi au posibilitate de degazare on-line a solvenţilor 1,2 [17, 20]. Mai multe firme specializate în aparatura HPLC comercializează pompe ce formează gradienţi la joasă presiune cu dispozitive volumetrice de măsurare urmate de pompe de mare presiune. Aceste pompe sunt atât mecanic cât şi funcţional mai complicate decât pompele cu 2 pistoane în serie (fig. 7.). Fiecare solvent are un element de măsurare propriu, o micropompă cu 2 pistoane în serie acţionate prin intermediul unui motor electric. Fiecare piston se mişcă în trepte de 0,7 μm pompând volume de 7 nl, sistemul fiind ideal pentru coloanele narrow-bore. Solventul este pompat într-un dispozitiv volumetric unde este stocat momentan până ce pompa de mare presiune ajunge în poziţia de aspiraţie. În dispozitivul volumetric presiunea este mai mică de 6 atm. Precizia realizării vitezei volumetrice a fazei mobile prin coloană este asigurată de furnizarea constantă a solvenţilor din dispozitivele volumetrice în pompa de mare presiune. Când pompa de mare presiune ajunge în poziţia de aspiraţie, solvenţii din dispozitivele volumetrice sunt aspiraţi în capul pompei, presând diafragma acesteia. Când pompa trece pe poziţia de pompare, forţează diafragma, pompând solventul înspre coloană. Un dispozitiv de atenuare a şocurilor de presiune 1 Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, Martin, M., Guiochon, G., Pump Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, edited by Huber, J.F.K., Amsterdam - Oxford - New York, Elsevier Scientific Publishing Company, 1978, p

45 ... V ASILE O STAFE..... Varianta (b) 0,15% previne apariţia variaţiilor vitezei volumetrice. Sistemul poate forma gradienţi în două maniere: (a) Solvenţii din rezervoare diferite sunt aspiraţi într-un singur dispozitiv volumetric prin intermediul unor valve de proporţionare. (b) Fiecare solvent este conectat separat la câte un dispozitiv volumetric, care sunt la rândul lor conectate prin intermediul unor valve de proporţionare la un dispozitiv de mixare. Deşi primul sistem este mai economic, cel de-al doilea este mai exact, permiţând realizarea de gradienţi precişi la concentraţii limită ale unuia dintre solvenţi (de exemplu, crearea unui gradient de la 1 la 99% B la viteza volumetrică F = 0,1 ml min -1, pe un interval de 3 minute, situaţie întâlnită destul de des în cazul coloanelor narrow-bore). Filtre speciale pot fi montate în compartimentul de joasă presiune pentru a preveni contaminarea pompei şi a coloanei cu alge, care se ştie că pot creşte pe tampoanele fosfat, dacă aceste soluţii sunt păstrate o perioadă mai lungă de timp. 43

46 P OMPE H P L C Fig. 7. Pompa cu dispozitive volumetrice de formare a gradienţilor la presiune redusă. Pompa se compune din (a) dispozitive volumetrice de măsurare a solvenţilor, (b) dispozitiv de pompare la presiune redusă, (c) pompă de mare presiune, (d) atenuator de pulsuri de presiune cu dispozitiv de măsurare a presiunii. POMPE CE FORMEAZĂ GRADIENŢI LA PRESIUNE MARE Majoritatea pompelor ce formează gradienţi la presiuni ridicate sunt formate din 2 pompe conectate în serie într-un singur corp. Figura 8. Schema unei pompe ce formează gradienţi la mare presiune. PERFORMANŢE Precizie realizare viteză volumetrică: <0,3% Domeniu 0,05 5,0 L min-1 Volum întârziere în formare gradient: 0,2-0,5 ml Puls de presiune <2% Precizie în realizarea compoziţiei gradientului 0,2% 44 Acest sistem asigură realizarea de conexiuni capilare interne şi externe foarte mici, reducând astfel volumul mort extracoloană la mai puţin de μl şi volumul de întârziere a formării gradientului la mai puţin de 500 μl. Ambele

47 ... V ASILE O STAFE..... DEGAZOARE pistoane ale ambelor pompe sunt controlate de servomotoare comandate de microprocesoare 1,2. Degazarea este un proces de îndepărtare a gazelor dizolvate în faza mobilă, înainte de a fi pompată în coloană. Acest proces previne formarea bulelor de gaz în faza mobilă şi înlătură inconvenientele legate de modificările de volum şi de amestecare a gradienţilor. Viteze volumetrice instabile duc la modificări ai timpilor de retenţie şi la degradarea performanţelor detecţiei. Principalele inconveniente legate de dizolvarea gazelor (în special a oxigenului) în solvenţi sunt 1,2 : Apariţia de piscuri fantomă, Creşterea zgomotului, Linii de bază instabile şi la absorbanţe ridicate în detectoarele UV, Linii de bază ridicate la detectoarele electrochimice, Modificarea fluorescenţei la detectoarele de fluorescenţă. Degazarea se poate face off-line (înainte de pompare, cu dispozitive adecvate) şi on-line (direct în sistemul HPLC). Cele mai comune metode sunt: Purjarea solvenţilor cu heliu (sau azot): se poate face 1 Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, Martin, M., Guiochon, G., Pump Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, edited by Huber, J.F.K., Amsterdam - Oxford - New York, Elsevier Scientific Publishing Company, 1978, p

48 P OMPE H P L C relativ uşor şi are rolul de a satura solvenţii cu acest gaz şi de a îndepărta oxigenul în spaţiul înconjurător. Metoda este destul de scumpă şi poate duce la evaporarea solvenţilor volatili. În plus, oxigenul este mai bine purjat prin procedeele cu vacuum. Degazarea ultrasonică este o metodă off-line în care toate tipurile de gaze sunt scoase din solvenţii respectivi prin supunerea solvenţilor unui tratament într-o baie ultrasonică. Principalul dezavantaj constă în faptul că pe măsură ce solvenţii stau în rezervoare, redizolvă gazele din atmosferă. Degazarea cu microunde este tot o metodă off-line, similară cu degazarea ultrasonică, doar că solvenţii sunt supuşi unui tratament cu microunde (atenţie trebuie acordată vaselor ce conţin solvenţii şi temperaturii la care are loc tratamentul, pentru a se evita fierberea şi eventual aprinderea solvenţilor) Degazarea prin vacuum este o metodă on-line, foarte eficientă, ce foloseşte membrane speciale ce permit doar trecerea gazelor în compartimente aflate în vid în raport cu fluxul de solvent. Metoda este ieftină, permite degazarea continuă şi elimină oxigenul foarte eficient. 1 Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard, Martin, M., Guiochon, G., Pump Systems. In: Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, edited by Huber, J.F.K., Amsterdam - Oxford - New York, Elsevier Scientific Publishing Company, 1978, p

49 D ET E C T O A R E L E H P L C PARAMETRI ANALITICI Metoda de detecţie depinde de caracteristicile fizicochimice ale substanţelor ce trebuie analizate. Cea mai des utilizată metodă de detecţie este detecţia în UV la lungime de undă prestabilită. Posibilitatea de a determina spectrele UV ale analiţilor ajută la confirmarea prezenţei în proba analizată a soluţilor de interes. Pentru probleme analitice speciale, ce necesită sensibilitate ridicată se recomandă utilizarea detectoarelor de fluorescenţă. Deşi detectoarele electrochimice sunt suficient de sensibile şi selective, ele sunt utilizate mult mai rar, la fel ca si detectoarele de conductivitate. Detectoarele indice de refracţie deşi virtual pot detecta orice substanţă, au o mică sensibilitate şi sunt folosite în special când celelalte tipuri de detectoare nu pot fi utilizate 1,2. Cei mai importanţi parametri analitici ai detectoarelor sunt: Sensibilitatea (limita de detecţie şi limita de cuantificare). Selectivitatea Linearitatea Informaţiile cantitative 1 Snyder, L.R., Liquid Chromatography Detectors, New York, Marcel Dekker, Inc Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego:Academic Press, Inc. 1993

50 ..... D ETECTOARELE H P L C LIMITA DE DETECŢIE ŞI LIMITA DE CUANTIFICARE Limita de detecţie: Nivelul zgomotului multiplicat cu 3 Limita de cuantificare: Nivelul zgomotului multiplicat cu 10 Sensibilitatea unui sistem analitic depinde de zgomotul şi de abaterea echipamentului de detecţie. Sensibilitatea absolută a detectorului poate fi determinată prin injectarea unei probe direct în detector. Ea este adesea exprimată ca nivelul minim detectabil sau limita de detecţie (definită adesea ca valoarea zgomotului multiplicată cu 3). Un parametru mai practic este sensibilitatea relativă a probei, măsurată cu detectorul cuplat la echipamentul HPLC. În acest fel limita de detecţie este influenţată nu numai de detector dar şi de conţinutul de oxigen al fazei mobile, de sistemul de injecţie, de dispersia benzilor cromatografice de către coloană, de variaţiile de temperatură ale diferitelor componente ale sistemului, etc. Limita de cuantificare este definită ca valoarea zgomotului multiplicată de de ori 1. Un detector UV este capabil să măsoare cantităţi de ordinul a 500 pg per injecţie. În cazul unor substanţe cu coeficienţi mari de absorbţie limita de detecţie poate scădea la 100 pg per injecţie (antioxidanţi alimentari) sau chiar la 50 pg per injecţie (hidrocarburi aromatice policiclice) 2. Detectoarele de fluorescenţă şi cele electrochimice au limita de detecţie în jurul picogramelor 3. Limita de detecţie a detectoarelor spectrometre de masă (MS) cuplate la HPLC depinde de tipul de interfaţă. Instrumentele cu interfaţă tip electrospray pot detecta analiţi în domeniul picogramelor. 1 Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego:Academic Press, Inc Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R. HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R. HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard,

51 ... V ASILE O STAFE..... Detectoarele indice de refracţie au limita de detecţie în jurul a 500 ng analit per injecţie 1. SELECTIVITATEA Definim selectivitatea unui sistem de detecţie ca fiind capacitatea acestuia de a selecta numai acei compuşi de interes dintr-o matrice complexă folosindu-se de proprietăţile specifice ale compuşilor de interes. Un detector este selectiv dacă nu răspunde la prezenţa compuşilor ce coeluează şi care ar putea interfera cu cuantificarea analiţilor de interes. Un detector UV poate fi făcut selectiv prin setarea acelei lungimi de undă la care analitul de interes are absorbanţă maximă, iar contaminanţii au absorbanţă minimă. Totuşi, această situaţie este destul de rar întâlnită în practică. Mult mai des sunt întâlnite cazurile în care analitul de interes prezintă o fluorescenţă caracteristică sau are proprietăţi oxido-reducătoare caracteristice, astfel încât folosirea detectoarelor de fluorescenţă, respectiv electrochimice fac ca analiza să fie foarte selectivă, chiar dacă analitul nu a fost total separat de contaminanţi în procesul cromatografic propriu-zis. Detectoarele indice de refracţie (RI) sunt prin definiţie universale. Detectoarele MS pot fi considerate atât ca instrumente selective cât şi universale (dacă operează în modul scanare). LINEARITATEA Răspunsul detectorului poate fi exprimat în două moduri: Domeniu dinamic Domeniu linear dinamic. 1 Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego:Academic Press, Inc

52 ..... D ETECTOARELE H P L C Domeniu de linearitate pentru diferite tipuri de detectoare: (m este concentraţia minimă a domeniului linear) UV Fl RX IR MS m - m m - m m - m m - m m - m Domeniul dinamic este raportul dintre concentraţia maximă şi concentraţia minimă ce pot fi atinse de proprietatea măsurată (absorbanţă, curent, etc.) 1. Domeniul linear dinamic este intervalul concentraţiei analitului pe care răspunsul detectorului este linear. Trasarea răspunsului detectorului în funcţie de diferite concentraţii ale analitului injectate trebuie să da o linie dreaptă pe o porţiune a domeniului concentraţiilor luate în lucru. Răspunsul este, de multe ori, linear doar pe o porţiune limitată (a zecea parte, sau chiar mai puţin) din întregul domeniu dinamic. Detectoarele UV sunt lineare de un domeniu de maxim cinci ordine de magnitudine, cele de fluorescenţă şi electrochimice pe un domeniu de două ordine de magnitudine, cele MS pe trei iar RI pe patru ordine de magnitudine 2. INFORMAŢII CANTITATIVE Identificarea analiţilor de interes se poate face cu un grad de siguranţă relativă cu următoarele detectoare: 1) MS 2) PDA 3) FL, RX În HPLC o identificare sigură a analitului de interes se poate doar cu detectorul MS. Din păcate aplicabilitatea sa este limitată de preţurile încă excesiv de mari ale acestor tipuri de detectoare. Dacă spectrele analiţilor de interes diferă semnificativ între ele şi faţă de cele ale contaminanţilor atunci cu ajutorul detectoarelor cu şir (sau arie) de fotodiode (PDA, adică photodiode array sau DAD, adică diode array detector) identificarea este, de asemenea, sigură. Dacă analiţii de interes au proprietăţi caracteristice de fluorescenţă sau redox, identificarea lor se poate face cu 1 Scrott, R.P.W., Techniques of Liquid Chromatography (Simpson, C.F., ed.) Wiley-Heden, Chichester, Snyder, L.R., Liquid Chromatography Detectors, New York, Marcel Dekker, Inc

53 ... V ASILE O STAFE..... destulă siguranţă şi cu detectoarele de fluorescenţă şi cele electrochimice. Identificarea compuşilor doar pe baza timpilor de retenţie nu constituie o metodă sigură 1. DETECTOARE UV Drumul optic al unui detector UV convenţional este prezentat în figura 9. Fig. 9. Detector UV cu lungime de undă variabilă Sensibilitate bună Măsurarea la o singură lungime de unde nu este, de cele mai multe ori, suficientă. Fără spectre identificarea analiţilor nu poate fi exactă. Lumina policromatică de la o lampă de deuteriu este focusată pe o fantă de către oglinzi plane şi sferice. Monocromatorul transmite selectiv o bandă îngustă de lumină pe fanta de ieşire. Lumina ce trece de această fantă trece prin celula de măsurare şi este parţial absorbită de soluţia ce este pompată prin celulă. Absorbanţa probei este determinată prin măsurarea intensităţii luminii ce ajunge pe fotodioda de măsurare (şi eventual comparată cu un fascicul de lumină care nu trece prin probă şi ajunge pe o 1 Ettre, L.S., LC Mag., 1 (1983)

54 ..... D ETECTOARELE H P L C fotodiodă de referinţă pentru a compensa fluctuaţiile de lumină ale lămpii). Detectoarele asistate de computere pot fi programate ca în timpul procesului cromatografic să-şi schimbe lungimea de undă la care se fac măsurătorile în funcţie de caracteristicile de absorbţie ale piscurilor cromatografice 1. În practică sunt destul de dese situaţiile în care doi soluţi nu pot fi separaţi cromatografic şi ar fi necesar ca măsurătorile să se facă la două lungimi de undă diferite în acelaşi timp. Acest lucru este posibil cu detectoare cu căi optice duble sau cu detectoare ce pot trasa spectrul UV. Acestea din urmă sunt de două feluri 2 : Detectoare care necesită oprirea circulaţiei fazei mobile prin sistem, pentru a permite detectorului să scaneze spectrul Detectoare şir (arie) de diode 3 DETECTOARE ŞIR (ARIE) DE DIODE (PDA, DAD) Figura 10 prezintă schema unui detector şir (arie) de diode, model Hewlett Packard (HP), una dintre cele mai bune şi cunoscute firme de aparatură HPLC din lume 4. 1 Wickam, D., in "A Practical Guide to HPLC Detection", Parriott, D., ed., Academic Press, San Diego, CA, Pole, C.F., Schuette, S.A., "Contemporary Practice of Chromatography", Elsevier, Amsterdam, Huber, L., Good Laboratory Practice and Current Good Manufacturing Practice, Waldbronn Analytical Division, HP, Germany, Hewlett Packard, Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego, Academic Press, Inc

55 ... V ASILE O STAFE..... Fig. 10. Schema drumului optic şi a principalele componente ale DAD, model HP Lentilele acromatice focalizează lumina policromatică de la lămpile de tungsten şi deuteriu în celula de măsurare. Lumina este apoi dispersată pe suprafaţa unei reţele de difracţie şi cade apoi pe suprafaţa unui cip format din şiruri de diode (traducerea termenului de diode array variază în funcţie de autor, cele mai uzitate forme fiind şir de diode, arie de diode sau reţea de diode). Domeniul de măsurare variază, în funcţie de model şi de firmă, de la (Perkin-Elmer LC-235 C), la nm (Merck L-7450, Waters PDA 996) şi (HP 1100). De asemenea, numărul de diode per cip variază în funcţie de model şi de firmă (512 la Merck L-7450 şi Waters PDA 996 şi 1024 la HP 1100). Acurateţea măsurării este, de obicei, de 1 1,2 nm. Prezenţa unui filtru special de oxid de holmiu permite o rapidă verificare a acurateţei lungimii de undă. 53

56 ..... D ETECTOARELE H P L C Majoritatea modelelor sunt dotate cu celule de măsurare ce rezistă la presiuni ridicate (peste 100 atm), astfel încât detectoarele pot fi folosite atât cu coloane narrow-bore cât şi în hyphenated chromatography (utilizarea mai multor tipuri de detectoare cuplate în cascadă, la care presiunea după ieşirea din coloană se menţine ridicată mai mult timp). Volumul celulelor de măsurare variază de la 13 μl şa 1,7 μl, cu un drum optic variind de la 10 mm la 6 mm, respectiv. Fig. 11. Model de DAD cu dublu fascicul Majoritatea DAD sunt mono-fascicul, dar există şi modele cu dublu-fascicul. Figura 11 prezintă schema unui astfel de model. În acest caz, eventualele fluctuaţii ale intensităţii luminii sunt compensate automat. Linia de bază este realizată prin soft, memorându-se caracteristicile spectrale la momentul injecţiei 1. Deoarece cantitatea de informaţie este foarte mare, DAD necesită ajutorul unui software specializat. De fapt, actualmente puterea acestor tipuri de detectoare nu mai constă în caracteristicile tehnice ala aparatului propriu-zis ci în facilităţile oferite de software. Rezoluţia digitală = domeniul lungimilor de undă acoperit de reţeaua de difracţie (lărgimea maximă a spectrului) supra numărul de diode din şirul de diode al cipului. Una din facilităţile oferite de acest tip de detectoare este posibilitatea de a face instantaneu măsurători la mai multe lungimi de undă. Măsurarea variaţiei intensităţii de lumină pe întreg domeniul de lungimi de undă duce la obţinerea unui spectru de absorpţie. Pentru analize de rutină, DAD 1 Huber, J.F.K., Instrumentation for High-Performance Liquid Chromatography, Amsterdam - Oxford - New York, Elsevier Scientific Publishing Company,

57 ... V ASILE O STAFE..... Rezoluţie optică = domeniul lungimilor de undă din spectrul maxim al reţelei de difracţie care se va constitui într-o singură valoare de absorbanţă optică. Valoarea rezoluţiei optice poate fi aleasă prin modificarea fantei programabile sau din soft. Fig. 12. Rezoluţia optică poate fi ridicată maxim până la nivelul celei digitale (1,2 nm), când fanta permite trecerea unui fascicul de lumină cu o fereastră optică egală cu dimensiunea unei diode din aria de diode, sau rezoluţia optică poate fi un multiplu al celei digitale. poate fi folosit cu aceleaşi performanţe ca un detector UV obişnuit, măsurându-se absorbanţa optică la o sigură lungime de undă (cu scopul de a salva spaţiu în memoria calculatorului).în mod normal DAD este folosit pentru a trasa spectrele de absorpţie pe un domeniu caracteristic de lungimi de undă pentru analitul de interes. Rezoluţia spectrală depinde de lărgimea benzii la care se fac măsurătorile. Aceasta poate fi programată cu ajutorul unei fante acţionate de un servomotor, de la 1 sau 1,2 nm (cât reprezintă valoarea maximă a rezoluţiei aparatului respectiv, aceasta fiind rezoluţia digitală) la valori relativ mari, cum ar fi 16, sau chiar mai mulţi nm (termen denumit rezoluţie optică, sau spectrală). Figura 12 explică grafic aceşti termeni 1,2. Dacă analiza în curs cere o sensibilitate mai mare rezoluţia optică poate fi scăzută, dacă însă este necesară o acuratele mai mare a spectrului atunci ea va fi crescută până la nivelul rezoluţiei digitale (figura 13). De notat că rezoluţia optică este maximă când fereastra fantei are valoarea 1 Parriott, D. (ed.), "A Practical Guide to HPLC Detection", San Diego, Academic Press, Inc Poole, C.F., Schuette, S.A., "Contemporary Practice of Chromatography", Elsevier, Amsterdam,

58 ..... D ETECTOARELE H P L C minimă, adică egală în rezoluţia digitală şi rezoluţia creşte când numeric valoarea fantei scade şi viceversa. Fig. 13. Adaptarea lărgimii benzii rezoluţiei optice duce la modificarea sensibilităţii semnalului detectorului. Datele de fineţe pot fi înregistrate când rezoluţia optică este maximă, deşi în acest caz şi raportul semnal / zgomot este mare. Fig. 14. Comparaţie între spectrele benzenului detectate la 1,2, respectiv 3,6 nm rezoluţie optică. 56 Capacitatea de a distinge între structuri spectrale fine creşte foarte mult pe măsură de rezoluţia optică creşte. De exemplu, la 1 sau 1,2 nm, spectrul benzenului ar trebui să aibă 5 maxime de absorpţie caracteristice (figurile 12 şi 14). La această rezoluţie, structura fină a benzenului poate fi detectată, chiar dacă concentraţia sa estre mică, semnalul fiind doar de 0,7 mau (figura 13). La o rezoluţie optică de 3,6 nm majoritatea detaliilor sunt pierdute, după cum se vede din figura 14. Pe de altă parte folosirea unei rezoluţii optice mai scăzute

59 ... V ASILE O STAFE..... Fig. 15. Influenţa lărgimii rezoluţiei optice asupra detectării soluţilor eluaţi (lărgimea benzii de 16 nm sau chiar mai mult) duce la obţinerea unui semnal mai puternic şi evidenţierea mai multor sau chiar a tuturor soluţilor eluaţi. Figura 15 prezintă un astfel de exemplu, când proba supusă analizei era formată dintr-un amestec de trei substanţe: propanolol, clometiazol şi fenitoină. În cromatograma (a) rezoluţia optică a fost doar de 4 nm, în jurul valorii de 280 nm şi aparent proba conţinea doar o singură substanţă. Dacă se modifică lungimea de undă, dar rezoluţia optică se menţine tot la 4 nm, se constată că pot fi detectate 2 substanţe, dar diferite de primul caz (cromatograma b). În cromatograma (c), unde rezoluţia optică a fost de 80 nm (în jurul valorii de 260 nm) se constată ce toate cele 3 substanţe pot fi detectate 1,2. Având în vedere că cele trei substanţe au maxime de absorbţie la lungimi de undă diferite, rezultă că dacă s-ar fi folosit un detector UV clasic ar fi fost nevoie de cel puţin 2 analize separate pentru a putea pune în evidenţă toate cele trei substanţe, şi de 3 analize diferite, realizate la maximele de absorbţie ale fiecăreia dintre substanţe pentru a realiza o cuantificare precisă. Cu DAD acest lucru se poate realiza într-o singură analiză 3. 1 Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, Syed, S.E.H. High Performance Liquid Chromatographic Assays. In: Enzyme Assay. A Practical Approach, edited by Eisenthal, R. and Danson, M.J., Oxford New York Tokyo:Oxford University Press, 1991, p Gratzfeld-Husgen, A., Schuster, R., HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard,

60 ..... D ETECTOARELE H P L C CROMATOGRAME TRIDIMENSIONALE Maximele de absorpţie ale analiţilor eluaţi pot fi identificate cu uşurinţă folosind prezentarea tridimensională a datelor 1. Fig. 16 (dreapta). Cromatograma tridimensională (spectru 3D). O dimensiune o reprezintă timpul de retenţie, o alta domeniul lungimilor de undă şi a treia densităţile optice la toate lungimile de undă şi timpii analizaţi. Fig. 17 (jos). Cromatograma bidimensională (spectru 2D), cu maximele de absorbţie Cromatograma tridimensională, obţinută într-o singură analiză, poate fi utilizată apoi în multiple scopuri 2 : Determinarea maximelor de absorbţie a analiţilor eluaţi (ca în exemplul din figura 17). Cuantificarea fiecărui analit în parte la lungimea de undă unde analitul respectiv are maximul de absorpţie (aşa numita metodă MaxPlot); Reprezentând grafic răspunsul detectorului în funcţie de concentraţia analitului de interes, se constată o foarte bună linearitate şi un domeniu dinamic ce cuprinde întreaga scală de extincţie (figura 18.). 1 Gratzfeld-Husgen, A. and Schuster, R. HPLC for Environmental Analysis, Hewlett Packard, Gratzfeld-Husgen, A. and Schuster, R. HPLC for Food Analysis, Hewlett Packard,

61 ... V ASILE O STAFE..... Fig. 18. Linearitatea curbelor de etalonare depăşeşte 2 unităţi de absorbanţă optică Detecţia contaminanţilor (impurităţilor) (tot prin folosirea facilităţii MaxPot, deoarece în acest fel detecţia impurităţii este maximă) Spectrele fiecărui analit în parte pot fi vizionate alături de cromatograma bidimensională extrasă la MaxPlot (figura 19). Fig. 19. (dreapta) Indexul de spectre asociat cu cromatograma extrasă MaxPlot. PURITATEA PISCURILOR CROMATOGRAFICE (1) folosind raţiogramele (raportul densităţii optice la lungimea de undă la care analitului are coeficientul de absorpţie maxim supra densitatea optică la o lungime de undă la care analitul are un coeficient de absorbţie foarte mic. Raţiograma este dreptunghiulară în cazul analitului pur. Verificarea purităţii piscurilor cromatografice se poate realiza în mai multe feluri: Fig. 20. Raportul semnalelor pentru un analit pur şi altul impur. 59

62 ..... D ETECTOARELE H P L C (3) Normalizând şi comparând spectrele la 2 sau mai multe porţiuni ale piscului cromatografic respectiv. De obicei se compară spectrul din vârful piscului (apex) cu cele din punctele de inflexiune (fig. 22). Există diferite algoritme de comparaţie. De exemplu, HP compară punctele din spectrele normalizate generând o dreaptă de regresie. Coeficientul de regresie este multiplicat cu 1000 şi denumit factorul de potrivire. (2) Normalizând şi comparând 2 sau mai multe cromatograme extrase la lungimi de undă diferite. Pentru a- naliţi impuri piscurile au timpi de retenţie diferiţi. Totuşi, dacă timpii de retenţie ai piscurilor sunt aceeaşi, aceasta nu este un indiciu sigur că analitul este pur (figura 21) Fig. 21. Cromatograme normalizate pentru testarea purităţii piscurilor cromatografice. Fig. 22. Cromatogramele extrase şi spectrele normalizate. La analiza după algoritmul HP cu cât factorul de potrivire este mai apropiat de 1000 cu atât probabilitatea ca piscul cromatografic respectiv să fie mai pur este mai mare, deoarece spectrele din apexul piscului şi cele din punctele de inflexiune sunt mai similare, indicând lipsa contaminanţilor. 60

63 ... V ASILE O STAFE..... IDENTIFICAREA ANALIŢI- LOR ELUAŢI PE BAZA BI- BLIOTECILOR DE SPEC- TRE Compararea spectrelor analiţilor eluaţi cu spectre ale diferitelor standarde aflate în baza de date proprie. Aceleaşi tipuri de algoritme folosite pentru stabilirea purităţii piscurilor sunt utilizate şi pentru compararea spectrelor analiţilor eluaţi cu spectre ale unor standarde aflate în bibliotecile de spectre. Crearea şi îmbogăţirea bazei de date proprii cu spectrele standardelor dorite. Acesta este un proces interactiv, deoarece oricând în bibliotecile de spectre pot fi introduse noi spectre ale unor standarde, împreună cu informaţiile referitoare la condiţiile cromatografice în care standardele respective au fost eluate. Depistarea tuturor soluţilor prezenţi în probă, ce au spectre şi maxime de absorbţie foarte diferite (cu facilitatea TotalPlot, care trasează cromatograma adunând densităţile optice la toate lungimile de undă în limitele spectrului stabilit pentru achiziţia de date; facilitate, de asemenea utilă în analiza în urme) AVANTAJE DAD În concluzie, principalele avantaje ale DAD sunt posibilitatea de a identifica analiţii eluaţi prin compararea spectrelor lor cu cele ale unor standarde din baza de date proprie şi verificarea purităţii piscurilor cromatografice, cât şi posibilitatea de a realiza cromatograme extrase la mai multe lungimi de undă. Deşi în ultimii ani s-au făcut multe progrese în acest sens, principalul dezavantaj al DAD este sensibilitatea relativ redusă, cel puţin atunci când se compară cu cea a detectoarelor electrochimice şi de fluorescenţă. 61

64 ..... D ETECTOARELE H P L C DETECTOARE DE FLUORESCENŢĂ Selectivitate foarte mare Sensibilitate foarte bună Fig. 23. Schema unui detector de fluorescenţă Fluorescenţa este un tip specific de luminiscenţă care este creată atunci când moleculele emit energie ce a fost anterior adsorbită în timpul unei perioade de iluminare. Detectoarele de luminiscenţă au o mai mare selectivitate decât, de exemplu, detectoarele UV deoarece nu toate moleculele care absorb lumină pot să şi emită lumină. Detectoarele de fluorescenţă sunt mult mai sensibile decât detectoarele de absorbanţă optică, permiţând scăderea semnatului de zgomot. Majoritate detectoarelor de fluorescenţă sunt configurate în aşa fel încât lumina este măsurată la un unghi drept faţă de lumina incidentă. Această geometrie reduce posibilitatea ca lumina incidentă să interfere cu lumina emisă de substanţele din celula de măsurare, reducând în acest fel raportul semnal / zgomot şi implicit mărind sensibilitatea acestor detectoare 1,2. Figura 23 prezintă schematic un detector de fluorescenţă. Lumina de la o lampă de xenon, tip blitz (ce funcţionează cu intermitenţă), este dispersată de o reţea de difracţie şi focusată pe celula de măsurare. Lumina emisă de probă este colectată la un unghi de 90º într-un fascicul incident şi măsurat cu un fotomultiplicator. Pentru selectarea lungimilor de undă, între reţeaua de excitare şi celula de măsurare, între aceasta din urmă şi reţeaua de emisie şi în faţa multiplicatorului sunt plasate fante. 1 Snyder, L.R., Liquid Chromatography Detectors, New York, Marcel Dekker, Inc Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego, Academic Press, Inc

65 ... V ASILE O STAFE..... Până acum câţiva ani, detectoarele de fluorescenţă aveau dezavantajul timpului lung de încălzire şi al deplasării liniei de bată datorită căldurii emanate de lampă în timpul funcţionării. Astăzi, prin folosirea lămpilor tip blitz, care se pot încălzi imediat şi care eliberează o foarte mică cantitate de energie termică dezavantajele amintite mai sus au fost eliminate. CELULA DE MĂSURARE Eficienţa transferului excitaţie emisie este proporţională cu volumul iluminat cu cât celula este mai mare cu atât este mai bun semnalul de răspuns. Pe de altă parte, cu cât volumul celulei de măsurare este mai mare cu atât dispersia benzilor cromatografice va fi mai mare. Celula de măsurare poate fi optimizată cu un volum de 5 μl, făcând-o astfel potrivită şi pentru utilizarea coloanelor narrow-bore. SCANAREA Spectrele de fluorescenţă nu sunt (încă) utilizate pentru confirmarea identităţii benzilor cromatografice Scanarea atât a spectrului de excitaţie cât şi a celui de emisie sunt facilităţi foarte utile, în special în perioada de punere la punct a metodei cromatografice. Acest lucru poate fi executat doar de detectoarele sofisticate (şi scumpe) care au servomotoare ce pot modifica poziţia reţelelor de difracţie. Odată stabilite lungimile de undă optime pentru excitaţie şi emisie, detectoarele pot fi programate să comute pe aceste poziţii în timpul procesului de separare cromatografică. 63

66 ..... D ETECTOARELE H P L C DETECTOARE ELECTROCHIMICE Fig. 24. Schema unui detector electrochimic cu 3 electrozi. Tehnica electrochimică de detecţie se bazează pe procesul de transfer al sarcinii electrice ce are loc când electronii sunt cedaţi de o moleculă când are loc oxidarea ei sau absorbiţi de o moleculă când se reduce [10, 21]. Această oxidare sau reducere are loc pe suprafaţa unui electrod de lucru. Diferenţa de potenţial dintre electrodul de lucru şi soluţia conţinând analiţii determină dacă un compus este redus sau oxidat şi cât de repede are loc această reacţie pe suprafaţa electrodului respectiv. Viteza de reacţie poate fi determinată din energiile de activare şi potenţialele redox exprimate de ecuaţia lui Nernst. Curentul rezultat este proporţional cu numărul reacţiilor ce au loc la electrod, care la rândul său este un indicator al concentraţiei compuşilor de interes la suprafaţa electrodului de lucru 1. Detecţia se bazează pe folosirea a 3 electrozi: electrodul de lucru, unde are loc reacţia; electrodul de numărare, care aplică diferenţa de potenţial dintre faza mobilă şi electrodul de lucru; electrodul de referinţă, care compensează eventualele schimbări în conductivitatea eluentului. Electrodul de referinţă preia valorile anterioare ale electrodului de numărare pentru a menţine diferenţa de potenţial constantă pe parcursul eluării piscului cromatografic, în timp ce curentul este măsurat de electrodul de lucru. Fluxul de electroni dintre electrozi este amplificat şi transformat în semnal. Detectoarele actuale pot amplifica semnale foarte slabe, provenite de la cantităţi de substanţă 1 Lavrich, C., Kissinger, P.T., in "Therapeutic Drug Monitoring and Toxicology by Liquid Chromatography", Wong, S.H.Y., ed., Marcel Dekker, New York,

67 ... V ASILE O STAFE..... din domeniul picogramelor şi chiar mai jos 1. Cu toate că detectoarele electrochimice detectează doar acele substanţe ce pot fi electrolizate, această limitare poate fi considerată şi un avantaj, atunci când se analizează probe complexe, deoarece, în acest fel, creşte selectivitatea. Fig. 25. Relaţia CV. Pentru a determina potenţial optim al electrodului de lucru, relaţia dintre răspunsul detectorului (curentul) şi potenţialul aplicat (voltajul) trebuie trasat grafic pentru fiecare analit de interes ca o curbă curenttensiune (CV), similară cu cea din figura 25. La un potenţial mai mic decât E 1, nu poate avea loc oxidarea deoarece cantitatea de energie furnizată nu este suficientă. Crescând potenţialul la E 1/2 pe suprafaţa electrodului vor fi electrolizate 50% din molecule. Răspunsul maxim necesită un potenţial doar cu puţin mai mic decât E 2. Acest potenţial este cunoscut sub denumirea de curentul limită deoarece creşterea ulterioară a tensiunii va limita detecţia prin creşterea zgomotului 2. ELECTROZII Deşi se folosesc mai multe tipuri de materiale pentru construcţia electrozilor, cel mai comun este electrodul de sticlă de carbon. Pentru diferite aplicaţii se preferă materiale specifice: aur pentru glucide şi alcooli; platină 1 Li, G., Szulc, M.E., Fischer, D.H., Krull, I.S., in "Electrochemical Detection in Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis", Kissinger, P.T., ed., Chromatographic Science Series, Marcel Dekker, New York, Kissinger, P.T., Heineman, W.R., eds., Laboratory Techniques in Electroanalytical Chemistry, Marcel Dekker, New York,

68 ..... D ETECTOARELE H P L C pentru cloruri, sulfiţi, hidrazine şi peroxizi de hidrogen; argint pentru halogenuri, cupru pentru aminoacizi, mercur pentru tiosulfat (varianta reductivă), combinaţie mercur-aur pentru compuşi organici azotaţi (varianta reductivă) 1,2. CELULELE DE MĂSURARE Fig. 26. Tipuri de celule de măsurare în detecţia electrochimică. Există multe modele de celule de măsurare. Majoritatea pot fi clasificate într-una din cele 3 categorii principale prezentate în figura 26: modelul în strat subţire, modelul jet la nivelul pereţilor şi modelul poros. Modelul poros diferă de celelalte tipuri prin aceea că detecţia coulometrică asigură un randament de 100% a reacţiei pe suprafaţa electrodului. Celelalte modele au o eficienţă de numai 1 10% folosind detecţie amperometrică. Totuşi detecţia amperometrică este cea uzuală fiind mai senzitivă. Majoritatea detectoarelor electrochimice folosesc celule de măsurare cu volumul intern de 1 μl, fiind deci potrivite pentru utilizarea coloanelor narrow-bore. 1 Li, G., Szulc, M.E., Fischer, D.H., Krull, I.S., in "Electrochemical Detection in Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis", Kissinger, P.T., ed., Chromatographic Science Series, Marcel Dekker, New York, Krull, I.S., Selavka, C.M., Lookabaugh, M., Childress, W.R., LC/GC, 7(9) (1989)

69 ... V ASILE O STAFE..... DETECTOARE INDICE DE REFRACŢIE nu sunt compatibile cu eluţia în gradienţi au sensibilitate redusă trebuie termostatate sunt universale, putând detecta orice modificare a fazei mobile. DETECTOARELE SPECTROMETRE DE MASĂ Detectoarele indice de refracţie (RI) sunt bazate pe diferenţa în indicele de refracţie dintre faza mobilă pură şi soluţia ce conţine analiţii eluaţi 1. Deoarece compoziţia fazei mobile, considerată ca indice de referinţă, nu trebuie să se schimbe, aceste detectoare nu pot fi utilizate când se eluează în gradient. Majoritatea tipurilor de detectoare RI fac parte dintr-un din cele 4 modele principale: Modele pe baza legii lui Snell (foloseşte celule duble şi este cel mai popular) Modele pe baza reflexiei lui Fresnel Modele pe bază de interferenţă Modele bazate pe efectul Christiansen. Deoarece detectoarele RI au o mică sensibilitate şi tendinţa de a devia de la linia de bază datorită modificărilor de temperatură, ele sunt utilizate în special în analiza glucidelor şi a aminoacizilor Probele complexe ridică probleme speciale pentru analiza HPLC. Detectoarele DAD permit identificarea compuşilor ce coeluează, dar în multe situaţii utilizarea lor este limitată de lipsa de detalii spectrale ale coeluanţilor. Detectoarele specifice, cum ar fi cele de fluorescenţă, pot oferi o mare specificitate şi sensibilitate, numai dacă analiţii au proprietatea de fluorescenţă. Spectrometrele de masă (MS) pot oferi o mai mare certitudine în identificarea analiţilor, în special în cazurile în care probele conţin compuşi din clase foarte diferite. Tehnica HPLC-MS este disponibilă doar de câţiva ani şi încă sistemele cu astfel de detectoare sunt prohibitiv de scumpe 2. 1 Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego, Academic Press, Inc Niessen, W.M.A.,van der Greef, J., Liquid Chromatography - Mass Spectrometry, Chromatographic Science Series 58, Marcel Dekker, New York,

70 ..... D ETECTOARELE H P L C * Când solvenţii tipici pentru HPLC sunt trecuţi în stare gazoasă are loc o creştere a volumului de aproximativ 1000 de ori. INTERFAŢA TERMOSPRAY Fig. 26. Procesul în interfaţa termospray. Crearea de interfeţe care să permită cuplarea sistemului HPLC la MS întâmpină o serie de dificultăţi, datorită condiţiilor operaţionale diferite: HPLC Operare în fază lichidă Temperatura 25 30ºC Nu există limitări de masă moleculară Foloseşte tampoane anorganice Produce mari cantităţi de solvent volatilizat: ml-min gaz * MS Operare cu gaz la presiune mică Temperatura ºC În funcţie de interfaţa folosită există limitări de masă moleculară Limitat la tampoane volatile Limitat la 10 ml/min gaz În decursul anilor au fost create multe tipuri de interfeţe, unele dintre ele apărând astăzi ca fanteziste sau chiar caraghioase. Actualmente pe piaţă s-au impus 3 tipuri de interfeţe 1 : Interfaţa termospray; Interfaţa fascicul de particule; Interfaţa electrospray. Figura 26 prezintă un tub capilar încălzit prin care circulă efluentul din HPLC în interfaţa termospray. Pe măsură ce tubul este încălzit, solventul se vaporizează şi produce ioni. Lentile electromagnetice focalizează aceşti ioni în MS. Ionizarea cu interfaţa termospray este blândă, producând o slabă fragmentare. Piscul mai mare din figura 27 constă din M + H (masa analitului şi a protonilor). Acest tip de detecţie este foarte util pentru determinarea masei moleculare. Fragmentarea şi sensibilitatea pot fi crescute prin creşterea temperaturii (filamentului de Fig. 27. Spectrul termospray al prometrynului. 1 Prokay, L., Field Desorption Mass Spectrometry, Marcel Dekker, New York,

71 ... V ASILE O STAFE..... Foloseşte aceleaşi viteze volumetrice ca HPLC Nu are părţi în mişcare încălzire) sau prin creşterea sarcinii pe un electrod. Interfaţa termospray este utilă pentru compuşii ionici nevolatili. Principalele dezavantaje constau în faptul că necesită tampoane volatile şi spectrele variază cu matricea probei. INTERFAŢA FASCICUL DE PARTICULE Fig. 28. (dreapta) Pompe pentru interfaţa fascicul de particule. Fig. 29. (jos) Spectru fascicul de particule al prometrynului Interfaţa fascicul de particule se bazează pe principiul separării momentane a solventului, ilustrat în fig. 28. Eluentul HPLC trece prin mai multe camere sub presiune. Pe măsură ce eluentul trece prin doze fine, solventul de evaporă şi este eliminat prin nişte supape sub presiune. Particulele mai grele continuă pe traiectoria lor originală şi intră în sursa de ioni. Instrumentele cu fascicul de particule folosesc o sursă standard (GC-MS) fie modelul impact cu electroni (EI) fie modelul ionizare-chimică (CI). Impactul cu electroni fragmentează proba mai mult decât ionizarea chimică sau termospray-ul, după cum se poate vedea comparând spectrul termospray (fig. 27) cu cel al impactului de electroni din interfaţa cu fascicul de particule (fig. 29) al aceleaşi substanţe. 69

72 ..... D ETECTOARELE H P L C avantaje dezavantaje INTERFEŢE PENTRU IONIZAREA LA PRESIUNEA ATMOSFERICĂ INTERFAŢA ELECTROSPRAY Spectrele obţinute cu interfaţa fascicul de particule cu EI sunt utilizate pentru crearea bibliotecilor spectrale (folosind o mare varietate de gaze). Interfaţa este uşor de folosit şi poate fi utilizată şi la sistemele GC. Rezultatele sunt destul de reproductibile 1. Interfaţa necesită tampoane volatile şi chiar şi analiţi trebuie să manifeste o anumită volatilitate. Nu este foarte sensibilă pentru compuşi hidrofili. Zaharurile complexe, coloranţii tip azo, ionii preformaţi şi compuşii sulfonaţi nu duc la obţinerea de spectre EI adecvate. Cuantificarea este nelineară la concentraţi mici 2. Deoarece interfeţele termospray şi fascicul de particule au o sensibilitate relativ redusă, un domeniu îngust al maselor analizate şi al domeniului polarităţii analiţilor, cât şi datorită fiabilităţii lor reduse, au fost înlocuite în aparatele create în ultimii ani cu două tipuri noi de interfeţe cu ionizare la presiunea atmosferică (API) 3 : Interfaţa electrospray Interfaţa cu ionizare chimică la presiune atmosferică (APCI) Fig. 30. Nebulizatorul interfeţei electrospray. 1 Parriott, D. (ed.), A Practical Guide to HPLC Detection, San Diego, Academic Press, Inc Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L. Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, Prokay, L., Field Desorption Mass Spectrometry, Marcel Dekker, New York,

73 ... V ASILE O STAFE..... Fig. 31. Interfaţa APIelectrospray HPLC- MS În această interfaţă efluentul este dirijat printr-un ac nebulizator într-un câmp de mare tensiune care favorizează formarea picăturilor şi ionizarea moleculelor 1. Proba intră apoi într-un capilar încărcat la un voltaj diferit de cel al restului ansamblului sursei. Pe măsură ce proba iese din capilar, intră într-o cameră de pompare, unde solventul este îndepărtat. Ionii sunt transportaţi spre analizorul de masă printr-o serie de camere cu vacuum şi lentile ce focalizează ionii 2. Ionizarea cu electrospray poate produce ioni cu sarcini multiple ale analiţilor macromoleculari, cum ar fi proteinele 3. Deoarece detectorii de masă separă ionii pe baza raportului masă / sarcină (m/z), pot fi folosite cu această interfaţă şi spectrometre de masă în domeniul câtorva sute de daltoni (respectiv m/z) pentru analiza unor molecule ce depăşesc chiar D. De aceea, utilizarea imediată a interfeţei electrospray a fost analiza compuşilor cu masă moleculară mare, deşi se poate aplica cu acelaşi succes şi la compuşii cu masă mică. 1 Niessen, W.M.A.,van der Greef, J., Liquid Chromatography - Mass Spectrometry, Chromatographic Science Series 58, Marcel Dekker, New York, Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, Technical literature on LCQ, Analytical Newsletter, Finnigan / MAT Instruments, San Jose, CA,

74 ..... D ETECTOARELE H P L C INTERFAŢA DE IONIZARE CHIMICĂ LA PRESIUNE ATMOSFERICĂ (APCI) Fig. 32. Interfaţa APCI HPLC-MS. avantaje dezavantaje APCI poate să analizeze soluţi cu polaritate moderată. Ca în electrospray, ionizarea are loc la presiune atmosferică, prin intermediul unui proces de ionizare chimică (fig. 32). Folosirea APCI se pretează la compuşii ce au o oarecare volatilitate şi este mai puţin potrivită pentru compuşii foarte labili termic 1. Principalele avantaje ale interfeţelor API sunt faptul că pot fi folosite pentru compuşi polari şi semipolari de până la D, sunt sensibile şi produc un spectru larg de ioni 2. Interfeţele API au dezavantajul că matricea poate interfera cu procesul de ionizare şi pentru sensibilitate foarte mare trebuie redusă viteza volumetrică, sau temporar oprită. CONCLUZII REFERITOARE LA DETECTOARE Tabelul de mai jos face o trecere în revistă a tehnicilor de detecţie discutate în acest capitol. Din păcate, decizia de a achiziţiona un detector trebuie să fie un compromis între rezultatele posibile sau dorite şi resursele financiare. 1 Niessen, W.M.A.,van der Greef, J., Liquid Chromatography - Mass Spectrometry, Chromatographic Science Series 58, Marcel Dekker, New York, Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons,

75 ... V ASILE O STAFE..... Tabelul 3. Comparaţii între caracteristicile detectoarelor HPLC Tip detector Sensibilitate Selectivitate Avantaje Aplicaţii UV + - cost redus universal DAD + + Confirmare puritate pisc Fl ++ + Foarte selectiv Acizi organici, acizi graşi, aldehide după derivatizare, ioni anorganici, Antioxidanţi, conservanţi, coloranţi, toxine, vitamine, pesticide, PAH, fenoli, anioni anorganici, etc. Micotoxine, îndulcitori, vitamine, carbamaţi, glifosaţi, PAH, etc. RX ++ + f. selectiv Fenoli, amine, vitamine, ioni RI - - Universal Virtual toate tipurile de substanţe MS Structura Virtual toate tipurile de substanţe 73

76 D E R II VAT II Z A R E A ADĂUGAREA DE CROMOFORI Tehnicile de derivatizare 1,2 s-au impus în situaţiile Când concentraţia analitului este foarte mică (sensibilitatea detecţiei poate fi îmbunătăţită prin derivatizare) Când analitul de interes nu prezintă cromofori sau nu are proprietatea de fluorescenţă (i se grefează o grupare cromoforă sau fluorescentă) Una dintre cele mai populare tehnici de derivatizare o constituie marcarea compuşilor cu reactivi ce prezintă absorbţia în UV 3. Reactivul trebuie astfel selecţionat încât nu numai să aibă un coeficient de absorpţie ridicat dar şi o selectivitate mare. Această combinaţie reduce efectele datorate matricei sau datorate produşilor secundari ai reacţiei de derivatizare. Tabelul următor cei mai comuni reactivi utilizaţi pentru introducerea de cromofori 4,5. 1 Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, John Wiley and Sons, New York, Techniques in Protein Chemistry, Vols. I VIII, Academic Press, San Diego, CA, Ahuja, S., Selectivity and Delectability Optimization, Wiley, New York, Gy, P.M., Sampling of Heterogeneous and Dynamic Material Systems, Elsevier, Amsterdam, Harris, D.C., Quantitative Chemical Analysis, 4th ed., W.H. Freeman, New York, 1994

77 ... V ASILE O STAFE..... Tabelul 4 Reactivi folosiţi pentru derivatizare prin introducerea de cromofori. Compusul ţintă Grupare reactivă Reactiv λ (nm) Alcooli -OH Fenilizocianat 250 Compuşi cu S 2- -SO 3 2,2 -ditio(5-nitro-piridina) 320 Acizi graşi -COOH bromura de p-bromofenacil bromura de 2-faftacil Aldehide şi -CO-COH 2,4-dinitrofenilhidrazina 365 cetone =C=O, -CHO Amine -NH 2 o-ftalaldehida (OPA) 340 primare Amine primare şi secundare -NHR 9-fluorenilmetil cloroformatul (FMOC) 256 ADĂUGAREA DE MARCHERI DE FLUORESCENŢĂ Ori de câte ori este necesar a se detecta un compus aflat în concentraţie foarte mică în probă, se recomandă derivatizarea sa cu un reactiv fluorescent 1. Tabelul 5 prezintă câţiva reactivi utilizaţi în acest scop 2. Datorită proprietăţilor speciale necesare pentru a avea un semnal de fluorescenţă puternic, reactivii de marcare fluorescentă sunt mai puţin numeroşi decât cei folosiţi pentru detecţia UV 3,4. 1 Wainer, I.W., Liquid Chromatography in Pharmaceutical Development, Aster Publishing, Springfield, OR, King, B., Graham, G.S., Handbook of Derivatives for Chromatography, Heyden, Philadelphia, Poole, C.F., Poole, S.K., Chromatography Today, Elsevier, Amsterdam, Ahuja, S., Selectivity and Delectability Optimization, Wiley, New York,

78 D ERIVATIZAREA Tabelul 4 Reactivi folosiţi pentru marcarea fluorescentă. Compusul ţintă Grupare reactivă Reactiv λex / λem (nm) Alcooli -OH Fenilizocianat 230 / 315 Amine -NH 2 o-ftalaldehida 330 / 455 primare (OPA) Amine primare şi secundare -NHR 9-fluorenilmetil cloroformatul (FMOC) 230 / 315 DERIVATIZARE PRE- SAU POST- COLOANĂ? Tehnica pre-coloană poate fi utilizată atât on-line cât şi offline, dar cea post-coloană trebuie executată on-line pentru acurateţe maximă. Dacă majoritatea autosampler-elor moderne au posibilitatea de a realiza operaţii simple de amestecare a probei cu reactivi prestabiliţi şi deci de a realiza reacţii de derivatizare pre-coloană on-line, pentru derivatizarea post-coloană este necesară aparatură specială, care cuprinde pompe de dozare a reactivilor, cuptoare de reacţie, etc. Prin urmare tehnica post-coloană este mai scumpă, implicând investiţii adiţionale în aparatură, cât şi consum mărit de reactivi, deoarece tot lichidul efluent din coloană trebuie supus reacţiei de derivatizare, nu numai proba, aşa cum se întâmplă în cazul tehnicii pre-coloană 1,2. 1 Wainer, I.W., Liquid Chromatography in Pharmaceutical Development, Aster Publishing, Springfield, OR, Ahuja, S., Selectivity and Delectability Optimization, Wiley, New York,

79 C O L E C TA R E A D AT E LO R Ş II E VA L U A R E A M ET O D E LO R Indiferent de metoda de detecţie folosită datele trebuie achiziţionate şi evaluate. Rezultatele analizei HPLC trebuie prezentate într-un format uşor lizibil şi sugestiv. Aparatura ce permite realizarea acestui lucru variază de la simple înregistratoare, la integratoare până la computere ce rulează software-uri dedicate, foarte sofisticate. Tendinţa actuală este de a se utiliza tot mai mult sisteme de management al informaţiilor de laborator (LIMS) 1. ÎNREGISTRATOARE LE CU HÂRTIE ieftine posibilităţi limitate Înregistratoarele cu hârtie sunt cele mai ieftine dispozitive folosite pentru achiziţionarea datelor de la detectoare. Au posibilităţi limitate de scalare a datelor (timpul şi amplitudinea semnalului), dar nu au posibilităţi de integrare a piscurilor cromatografice, sau alte tipuri de prelucrări, cum ar fi memorarea timpilor de retenţie, trasarea automată a liniei de bază, etc. 2 1 Huber, L. Good Laboratory Practice and Current Good Manufacturing Practice, Waldbronn Analytical Division, HP, Germany, Hewlett Packard, Snyder, L.R., Kirkland, J.J., Glajch, J.L., Practical HPLC Method Development, New York, John Wiley and Sons, 1997

80 .... C OLECTAREA D ATELOR INTEGRATOARELE ieftine posibilităţi limitate Integratoarele oferă o serie de avantaje, faţă de înregistratoare. Printre acestea amintim: Posibilitatea scalării cromatogramei Integrarea piscurilor cromatografice, după arie sau înălţime Calcularea ariei sau înălţimii procentuale Calcularea concentraţiilor analiţilor eluaţi pe baza standardelor externe şi interne Prezentarea sub formă tabelară a rezultatelor, incluzând timpii de retenţie, ariile, înălţimile şi concentraţiile piscurilor Trasarea liniei de bază Stocarea (temporară) a datelor şi recalcularea cromatogramelor după modificarea unor parametri (cum ar fi viteza hârtiei, extensia scalei semnalului, modul de integrare, etc.) Realizarea de calcule statistice, regresii multilineare şi nelineare. Există integratoare multicanal ce permit achiziţionarea şi prelucrarea datelor de la mai multe detectoare. CALCULATOARE PERSONALE avantaje, avantaje şi numai avantaje. Odată cu introducere calculatoarelor personale (PC) ca instrumente curente de lucru în HPLC posibilităţile de achiziţie, calculare, prelucrare şi raportare a datelor au devenit, virtual, nelimitate. De fapt, detectoarele DAD şi MS pot fi folosite la adevărata lor valoare doar împreună cu programe dedicate. Mai mult, PC-urile prezintă avantajul de a combina rezultatele cromatografice cu programe de editare de texte, calcul tabelar, grafică moleculară, etc. Prin 78

81 ... V ASILE O STAFE..... intermediul reţelelor de calculatoare, datele pot fi puse la dispoziţia altor utilizatori. Cu ajutorul PC-urilor toate modulele componente ale sistemului HPLC (pompe, autosamplere, detectoare, colectoare de fracţiuni, etc.) pot fi comandate şi se pot crea metode de lucru pentru fiecare modul în parte, care apoi pot fi integrate într-o metodă generală. Programele dedicate de cromatografie au facilităţi de diagnosticare a modulelor, calibrare a instrumentelor şi multe tipuri de metode preformate. Datele brute, cât şi cele prelucrate de metodele selecţionate, împreună cu parametri acestor metode pot fi salvate şi refolosite după dorinţă, în conformitate cu cerinţele unei practici bune de laborator (GLP). Folosirea bibliotecilor de spectre UV şi MS pentru identificarea compuşilor se poate realiza cu uşurinţă şi numai prin intermediul PC-urilor. Rezultatele şi rapoartele pot fi convertite în diferite formate pentru a putea fi utilizate de utilizatorii altor sisteme HPLC. Unul dintre formatele care s-a impus în ultima vreme este ANDI (Analytical Instrument Association - *.cdf) 1. SISTEME DE MANAGEMENT AL INFORMAŢIILOR DE LABORATOR LIMS defineşte o serie de proceduri pentru sarcini repetitive în laboratorul analitic. Aceste sarcini pot include mânuirea materialelor şi reactivilor, administrarea probelor ce intră în laborator, compilarea rezultatelor analitice pentru proba dată şi generarea unui raport validat şi 1 Berridge, J.C., Techniques for the Automated Optimization of HPLC Separation, Wiley, New York,

82 .... C OLECTAREA D ATELOR certificat de departamentele în drept. Astfel de sisteme sunt foarte utile deoarece ajută la creşterea productivităţii, a gestionării resurselor şi la scăderea cheltuielilor 1,2. 1 Schoenmakers, P.J., Optimization of Chromatographic Selectivity, Elsevier, Amsterdam, Glajch, J.L., Snyder, L.R. (eds.), Computer-Assisted Development for High - Performance Liquid 80 Chromatography, Elsevier, Amsterdam, 1989

83 P R OT E II N E,, P E P T II D E Ş II A M II N O A C II Z II HPLC a influenţat foarte mult dezvoltarea chimiei proteinelor în ultimii de ani, motiv pentru care anual se ţine o conferinţă internaţională dedicată acestui domeniu. În acelaşi timp, s-au dezvoltat faze staţionare capabile să separe prin schimb ionic sau fază inversată molecule mai mari de 30 kda 1,2,3. Încă din 1983 au apărut diverse cărţi dedicate domeniului separării proteinelor, peptidelor şi aminoacizilor prin HPLC 4,5 1 Regnier, F.E., Gooding, K.M:, Anal. Biochem., 103 (1980) Ghosh, R., Cui, Z.F., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 23 (2000) Zeng, X.F., Ruckenstein, E., Biotechnol. Prog., 15(1999) Horvath, C.(ed.) "High Performance Liquid Chromatography: Advances and Perspectives", Academic Press, New York, vol. 3, Henschen, A., Hupe, K.P., Lottspeich, F., Voelter, W. (eds.) "HPLC in Biochemistry", WCH, Weinheim, Germany, 1985

84 .. P ROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI Interesul în cromatografia proteinelor a fost stimulat de dezvoltarea tehnologiei ADN recombinant. Aceste dezvoltări au uşurat studiile detaliate ale structurii proteinelor (multe dintre ele cu potenţial terapeutic) şi au introdus posibilitatea design-ului structurii proteinelor pentru a modifica activitatea lor biologică. Pentru aceasta sunt necesare preparate proteice înalt purificate, deoarece probele trebuiau analizate prin cristalografie de raze X sau RMN bi-dimensional. În mod tradiţional, purificarea proteinelor este considerată o sarcină consumatoare de timp, laborioasă şi dificilă. Aceasta deoarece prin aceeaşi metodă nu se ajunge la acelaşi grad de purificare la două proteine diferite şi prin urmare procesul de purificare al proteinelor trebuie dezvoltat empiric pentru fiecare caz în parte. Prezentul capitol prezintă unele linii directoare generale utile în etapa de iniţiere a procedurii de purificare. Aspecte fizico-chimice. Strategiile de purificare se bazează, de obicei, pe o combinaţie a metodelor de separare care exploatează aspectele fizico-chimice particulare ale proteinei de interes, adică masa ei moleculară, sarcina globală sau hidrofobicitatea sa. Dacă este posibil, se recomandă o extracţie iniţială cu solvent organic sau cu un acid, dar trebuie avut grijă a se evita denaturarea sau modificarea proteinei de interes (cum ar fi, de exemplu, deminarea Gln sau Asn). Adesea, prima metodă de fracţionare este cromatografia de cernere moleculară. Aceasta are însă dezavantajul de a creşte volumul probei şi prin urmare, în cazul separărilor preparative nu se recomandă ca prima etapă. În acest caz, o strategie mai utilă este folosirea unei etape iniţiale de adsorpţie. Chiar în cazul separărilor analitice, metoda poate fi utilizată cu succes. Este, de asemenea, important de a se pune la punct o metodă de păstrare pentru perioade lungi a proteinei de interes în forma sa nativă. În acest fel se pot strânge cantităţi suficient de mari din proteina de interes, folosind metoda analitică de separare de mai multe ori. Tehnica cromatografiei de schimb ionic este larg utilizată pentru 82

85 ... V ASILE O STAFE..... purificarea proteinelor deoarece condiţiile cromatografice sunt compatibile cu stabilitatea majorităţii proteinelor. Mai mult, capacitatea de încărcare cu proba este ridicată şi selectivitatea este mai bună decât în oricare altă variantă cromatografică. Separările pot fi realizate atât la ph-uri ridicate (schimb de anioni) cât şi coborâte (schimb de cationi). Proba poate fi eluată fie prin modificarea ph-ului fazei mobile, fie, şi aceasta este metoda cel mai des folosită, prin creşterea tăriei ionice. Comportamentul proteinei în cromatografia de schimb ionic poate fi uneori predictibilă folosind tehnica izoelectrofocusării bidimensionale. Tehnica dă rezultate bune în cazul proteinelor hidrofile, dar comportarea proteinelor hidrofobe în cromatografia de schimb ionic poate fi destul de diferită de cea observată în cazul izoelectrofocusării. Adesea se foloseşte includerea unei concentraţii mici de solvent organic (10-20%) în faza mobilă şi/sau concentraţii mari de uree (3-6 M), mai ales în cazul proteinelor puţin solubile în medii apoase. Trebuie avut în vedere însă că folosirea ureei poate duce la modificarea resturilor de Lys şi Cys din structura proteinelor. Tehnica este larg aplicată atât în domeniul analitic cât şi preparativ graţie existenţei unor schimbători de ioni foarte eficienţi bazaţi fie pe materiale polimerice (TSK-PW Toyo Soda, FPLC Pharmacia) sau pe bază de silicagel (Synchrom, Brownlee, etc.). După cromatografia de schimb ionic, proteina de interes se găseşte, în mod normal, într-o soluţie cu o concentraţie ridicată de sare. Aceasta poate fi îndepărtată prin precipitare cu sulfat de amoniu urmată de dializă, sau şi mai bine, proba poate fi aplicată pe o fază staţionară hidrofobă (silicagel cu braţe hidrofobe lungi şi cu pori largi, sau polimerice de tipul TSK-PW, cu grupări fenil). Cromatografia de excludere moleculară poate fi utilizată atât pentru schimbarea fazei mobile într-una volatilă şi prin urmare potrivită pentru liofilizare, cât şi pentru a îndepărta contaminanţii cu masă moleculară mică. Pentru a se obţine randamente mari ale purificării, cel mai adesea se impune o strategie ce presupune o combinaţie a metodelor de purificare amintite: schimb ionic, fază inversată şi gel filtrare. 83

86 .. P ROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI Cromatografia de afinitate a constituit un avantaj enorm în purificarea proteinelor. În contrast cu alte metode care exploatează diferenţele fizico-chimice dintre diferitele proteine, această tehnică exploatează anumite diferenţe structurale şi funcţionale. Singurul dezavantaj al tehnicii este capacitatea de încărcare cu probă, în special în cazul folosirii ca ligand imobilizat a unei molecule cu masă moleculară mare. Ingineria genetică a creat posibilitatea de modificare a structurii proteinelor şi astfel purificarea lor poate deveni mai uşoară. Prin manipularea genelor ce codifică a proteină specifică, peptidele de fuziune pot fi modificate la capetele lor N- sau C-terminale, pentru a uşura purificarea. Ulterior, extensiile peptidice sunt îndepărtate şi proteina de interes este purificată prin metode convenţionale 1. De exemplu, se pot lega la capătul C-terminal mai multe resturi de Arg şi astfel se modifică semnificativ ph i al proteinei. Faţă de alte metode de modificare, aceasta permite proteinei să ia o conformaţie normală. După o purificare iniţială prin schimb ionic, resturile de Arg sunt îndepărtate cu carboxipeptidaza B după care urmează o a doua cromatografiere prin schimb ionic 2. Cromatografia de schimb ionic este tehnica cea mai des folosită pentru separarea proteinelor deoarece condiţiile cromatografice sunt compatibile cu menţinerea structurilor terţiare ale proteinelor 3. Retenţia solutului poate fi controlată prin tăria ionică, ph-ul şi temperatura fazei mobile. Tot aceşti parametri influenţează şi gradul de recuperare al proteinei. Totuşi, găsirea condiţiilor optime de separare se face empiric. Deoarece sunt necesare faze staţionare cu pori largi (30-50 nm), perlele matricei au dimensiuni relativ mari (10-50 μm). Aceasta face ca stabilitatea mecanică să fie redusă şi presiunea aplicată pe coloană să fie limitată sub 400 psi la 1 ml min 1. Cele mai folosite tipuri de faze staţionare pentru cromatografia de 1 Shine, J., Fettes, I., Lan, N.C.Y., Roberts, J.L., Baxter, J.D., Nature, 285 (1980) Sassenfeld, H.M., Brewer, S.J., Biotechnology, 2 (1984) Krull, I.S., Sebag, A., Stevenson, R., J. Chromatogr. A., 887(2000)

87 ... V ASILE O STAFE..... schimb ionic a proteinelor sunt cele polimerice de la Toyo Soda (TSK-PW) 1, Pharmacia (FPLC Mono Beads) sau pe bază de silicagel de la Synchrom Inc. Fazele polimerice sunt stabile pe domeniul de ph 2 10 neavând loc dizolvarea loc la phuri mai mari de 8, cum se întâmplă în cazul matricelor de silicagel 2,3. Separări preparative cu TSK-5PW-SP 4 au dat rezultate complet compatibile cu cele obţinute la nivel analitic 5. Purificarea proteinelor prin cromatografie de schimb anionic Coloana ProtEx-SP, 50 x 4.6mm PEEK Faza mobilă A: 20 mm Bis-Tris HCl, ph 6,0 B: "A" + 0,5M NaCl Gradient 7 40% B timp de 20 min. Viteza 0,5 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@415 nm Proba 1. GHb A 1c 2. GHb A 1c 3. Hb A 0 1 Kamberi, M., Kamberi, P., Nakano, S., J. Chromatogr. B., 741 (2000) Ren, Q., de Roo, G., Kessler, B., Witholt, B., Biochem. J. 349 (2000) Engel, S., Barak, Z., Chipman, D.M., Merchuk, J.C., J. Chromatogr. B., 743 (2000) Kit, YY., Kuligina, E.V., Onishchenko, A.M., Yurchenko, L.V., Romannikova, I.V., Richter, V.A., Vlassov, V.V., Biochem.-Moscow., 64 (1999) Brewer, S.J., Dickerson, C:D., Ewbank, J.J., Fallon, A., J. Chromatogr., 362 (1985)

88 .. P ROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI Purificarea proteinelor prin cromatografie de schimb cationic Coloana ProtEx-DEAE, 50 x 4.6 mm PEEK Faza mobilă A: 20 mm Tris HCl, ph 8,0 B: "A" + 0,5M NaCl Gradient 5 70% B timp de 30 min. Viteza 0,5 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@415 nm (scala timpului 30 minute) Proba 1. hgh, 10µg 2. hgh desamido derivative 3. hgh desamido derivative C ROMATOGRAFIA ÎN FAZA INVERSATA Succesele obţinute în urma introducerii suporturilor cu pori largi pentru cromatografia în fază inversată pentru proteine cu mase moleculare mai mari de 30 kda a încurajat folosirea tot mai largă a acestui mod de cromatografie 1. În teorie, fazele staţionare cu pori largi sunt necesare numai când moleculele de interes sunt mai mari decât porii fazelor staţionare "normale". În general este mai bine să se folosească faze staţionare cu pori mici deoarece acestea au o suprafaţă mai mari şi deci şi o eficienţă mai mare 2. Prin urmare, pentru o proteină mică se va obţine un număr al talerelor teoretice (N) mai mare pe o fază staţionară cu pori mici. Cu toate că în condiţiile de ph scăzut şi în mediu de solvenţi organici, condiţii cerute de cromatografia în fază inversată, majoritatea proteinelor sunt denaturate există şi proteine are sunt stabile sau care au capacitatea de a-şi recăpăta conformaţia nativă 1 Yu, X., Zhao, R., Liu, G.Q., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 23 (2000) Szpunar, J., Analyst., 125 (2000)

89 ... V ASILE O STAFE..... dacă sunt repuse în mediu propice 1. În anumite circumstanţe menţinerea activităţii biologice nu este necesară, cum ar fi în cazul în care proteina se purifică pentru a i se determina secvenţa primară 2. Purificarea proteinelor prin cromatografie în fază inversată Coloana C18 Bakerbond wide-pore (250 x 4.6mm) Faza mobilă A:0,05 M bicarbonat de amoniu ajutat la ph 3,2 cu acid trifluoracetic; B: tetrahidrofuran Gradient 20% B pentru 10 min., 20-30% B în 30 min. şi 30% B pentru 15 min. Viteza 1 ml min 1 volumetrică Temperatura 21ºC Detecţie UV@220 nm Proba 1. artefact, 2. Colagen tip III, 3. Colagen tip I. În figura de mai sus se prezintă separarea prin cromatografie în fază inversată a formelor mature de colagen tip I şi III din pielea bovină. Denaturarea la 56ºC pentru 30 minute înainte de cromatografiere a permis separarea subunităţilor individuale 3. Încă din anii '80 lista proteinelor separate prin cromatografie în fază inversată cuprindea proteine structurale cum ar fi colagenul sau proteine din sânge 4, enzime 5, hormoni 6, proteine de importanţă farmaceutică 7, etc. Cromatografia în fază 1 Rubinstein, M., Levy, W.P., Moschera, J.a., Lay, C.Y., Hershberg, R., Barlett, R., Pestka, S., Arch. Biochem. Biopys., 210 (1980) Mahoney, W.C., Hermodson, M.A., J. Biol. Chem., 255 (1980) Smolenski, K.A., Fallon, A., Light, N.D., Bailey, A.J., Biosci. Rep., 3 (1983) Kato, Y., Komiya, K., Hashimoto, T., J. Chromatogr., 246 (1982) Ui, N., J. Chromatogr., 215 (1981) Voelter, W., in "HPLC in Biochemistry", VCH, Weinheim, Germany, 1985, pp Nice, E.C:, O'Hare, M.J., Anal. Biochem., 129 (1979)

90 .. P ROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI inversată a fost folosită pentru studiul modificărilor conformaţionale ale proteinelor 1, identificarea proteinelor ce conţin Cys în hidrolizatele proteice 2, sau pentru studiul diferenţelor în comportarea cromatografică a proteinelor mici şi mari 3. Mecanismul retenţiei proteinelor în cromatografia în fază inversată nu este clar definit, dar deoarece folosirea coloanelor scurte nu duce la scăderea rezoluţiei s-a sugerat că procesul nu este controlat doar de simpla partiţie a solutului între cele două faze 4. C ROMATOGRAFIA ÎN FAZA NORMALA Cromatografia în fază normală a fost puţin folosită pentru separarea proteinelor, deoarece majoritatea proteinelor nu sunt solubile în faze mobile ce conţin un procent mare de solvent organic, condiţie cerută de acest tip de cromatografie. Există şi excepţii 5, cum ar fi unele proteine din membranele biologice, care sunt solubile în hexan sau dimetil sulfoxid. C ROMATOGRAFIA DE AFINITATE Deşi cromatografia de afinitate are o foarte mare eficienţă ea este folosită destul de rar 6. Cele mai cunoscute faze staţionare utilizate pentru acest tip de cromatografie sunt fazele staţionare de la Beckman ("Fast Affinity"), Pharmacia, LKB, BioRad şi Pierce. Sunt date exemple de parteneri afini în care ligandul şi solutul şi-au schimbat rolurile. De exemplu, lactat dehidrogenaza a fost purificată în prezenţa piruvatului (0,1 M) pe o coloană având AMP imobilizat. Eluarea enzimei s-a realizat folosind 1 Luiken, J., Van der Zee, R., Welling, G.W., J. Chromatogr., 284 (1984) Fullmer, C.S., Anal. Biochem., 142 (1984) Ekstrom, B., Jackobson, G., Anal. Biochem., 142 (1981) O'Hare, M.J., Nice, E.C., Chromatogr. Sci., 16 (1982) Froescheis, O., Moalli, S., Liechti, H., Bausch, J., J. Chromatogr. B., 739 (2000) Garcia,M.C., Marina, M.L., Torre, M., J. Chromatogr. A., 880 (2000)

91 ... V ASILE O STAFE..... NAD şi 0,1 μm pirazol 1. Într-alt exemplu, alcool dehidrogenaza a fost imobilizată pe o matrice de silicagel, coloana fiind utilizată pentru separarea unor cofactori nucleotidici 2. C ROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE MOLECULARA Cele mai multe aplicaţii ale cromatografiei de excludere moleculară sunt desalifierea soluţiilor proteice şi determinarea maselor moleculare ale proteinelor 3. Fazele mobile folosite în gel-filtrare trebuie să conţină anumiţi aditivi (detergenţi neionici, propilen glicol sau săruri caotropice slabe) care să prevină interacţia chimică a proteinelor cu faza staţionară, dar care să nu interfere cu structurile de ordin superior ale proteinelor 4. Purificarea proteinelor prin gel-filtrare Coloana Bio-Sil TSK-250 (300 x 7.5mm) Faza mobilă 0,02 M fosfat de soidu, ph 6,5; 5,0 M guanidină HCl. Gradient Nu Viteza 1 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@280 nm Proba Separarea IgG uman (redusă şi alchilată) în subunităţi: 1. Lanţul greu (51 kda); 2. Lanţul uşor (26 kda); 3. Reactivul de alchilare (iodacetamida). 1 Lowe, C.R., Glad, M., Larsson, P.-O., Ohlson, S., Small, D.A.P., atkinson, A., Mossbach, K., J. Chromatogr., 215 (1981) Nilsson, K., Larsson, P.O., Anal. Biochem., 134 (1983) Oliva, M.L.V., Souza-Pinto, J.C., Batista, I.F.C., Araujo, M.S., Silveira, V.F., Auerswald, E.A., Mentele, R., Eckerskorn, C., Sampaio, M.U., Sampaio,,C.A.M., Biochim. Biophys. Acta- Protein Struct. Molec. Enzym., 1477 (2000) Wenk, S.O., Kruip, J., J. Chromatogr. B. 737(2000)

92 .. P ROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI I NTRODUCERE HPLC a fost folosită pentru analiza şi purificarea peptidelor atât pentru producerea de peptide sintetice cât şi pentru izolarea peptidelor naturale. În domeniul cromatografierii peptidelor există o bogată literatură ştiinţifică, exemplele din prezentul capitol având rolul doar de a ilustra anumite aplicaţii specifice. C ROMATOGRAFIA DE SCHIMB IONIC Aplicaţiile cromatografiei de schimb ionic pentru peptide sunt similare cu cele pentru proteine. Având mase moleculare mai mici, pori matricelor nu trebuie să fie foarte mari şi prin urmare rezistenţa mecanică şi presiunile ce pot fi aplicate asupra coloanei sunt mai mari decât în cazul coloanelor folosite pentru purificarea proteinelor. În plus, în cazul peptidelor, există şi aplicaţii specifice, cum ar fi cartarea peptidelor. Purificarea peptidelor prin cromatografie de schimb ionic Coloana ProtEx-SP (50 x 4.6mm) PEEK Faza mobilă A: 20mM Bis-Tris HCl, ph 7.0 B: "A" + 0.5M NaCl Gradient 24-69% B timp de 20 min. Viteza 0,5 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@280 nm Proba Separarea citocromului c din diferite surse biologice: 1. Bovin; 2. Cal; 3. Iepure. 90

93 ... V ASILE O STAFE..... C ROMATOGRAFIA ÎN FAZA INVERSATA Folosirea foarte largă a cromatografiei în fază inversată pentru separarea peptidelor a permis dezvoltarea unei metode de previziune a timpilor de retenţie a peptidelor de interes a căror structură primară este cunoscută 1. Metoda se bazează pe studiul retenţiilor unei serii de peptide şi aminoacizi, la care s-au atribuit anumiţi coeficienţii de retenţie în funcţie de aminoacizii individuali care la rândul lor au fost corelaţi cu anumiţi coeficienţi de hidrofobicitate. Suma coeficienţilor de retenţie a aminoacizilor din peptida necunoscută poate fi folosită pentru a prezice timpul ei de eluare 2. Valoarea absolută a coeficienţilor de retenţie depinde de compoziţia fazei mobile. Totuşi, peptidele mai mari de 10 kda au o comportare anormală probabil datorită schimbărilor conformaţionale cauzate de solventul organic şi de ph. Datorită caracteristicilor bune UV şi a faptului că ajută la solubilizarea multor peptide, acidul trifluoroacetic este mult folosit în compoziţia fazelor mobile. Purificarea peptidelor prin cromatografie în fază inversată Coloana Peptica C18 (50 x 4,5 mm) Faza mobilă A: 0.1% TFA in 5% MeCN B: 0.1% TFA in 50% MeCN. Gradient 0-30% B în 10 min., apoi 30-50% B în 10 min. Viteza 1,5 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@220 nm Proba Separarea 1. Gly-Tyr 2. Val-Tyr-Val 3. Enkephalin-Lys 4. Enkephalin-Met 5. Angiotensin II 6. Enkephalin-Leu 7. Eledoisin. Selectivitatea diferită a fost obţinută prin schimbarea tipului de coloană, folosind aceeaşi fază mobilă. 1 Voelter, W., în "Biochemistry", VCH, Weinheim, Germany, 1985, pp Meek, J.C., Rosetti, Z.L., J. Chromatogr., 211 (1985)

94 .. P ROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI Pentru determinarea secvenţei primare a proteinelor, cromatografia în fază inversată este exhaustiv folosită pentru izolarea fragmentelor peptidice după digestia enzimatică a proteinelor. Fiecare peptidă izolată poate fi apoi supusă reacţiei Edman şi resturile peptidice cât şi derivaţii PTH ai aminoacizilor sunt apoi separaţi tot prin cromatografie în fază inversată 1. Cartarea peptidelor triptice prin cromatografie în fază inversată Coloana Peptica C18 (50 x 4,5 mm) Faza mobilă A: 0.1% TFA in 5% MeCN B: 0.1% TFA in 50% MeCN. Gradient 0-35% B în 100 min., apoi 100% B. Viteza 1,5 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@220 nm Proba Fragmente după digestia triptică a albuminei serice bovine Linia de bază a unei "cromatografieri" fără injectarea probei, indică faptul că peak-urile mici din cromatogramă nu sunt artefacte. Separarea peptidelor prin cromatografie de excludere moleculară Coloana TSK 2000SW (60 x 7,5 mm) Faza mobilă 0,05 M fosfat de potasiu, 0,1 M sulfat de amoniu, ph 7,0. Gradient Nu Viteza 0,8 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie Proba UV@280 nm Fragmente după digestia triptică a albuminei serice bovine Coloana a fost iniţial calibrată cu markeri cu mase moleculare cunoscute, indicate prin săgeţi. 1 Tempst, P., Hunkapiller, M.W., Hood, L.E., Anal. Biochem., 137 (1984)

95 ... V ASILE O STAFE..... C ROMATOGRAFIA DE EXCLUDERE MOLECULARA Rezoluţia peptidelor mai mici de 10 kda nu se poate realiza prin acest mod de cromatografiere. Gel-filtrarea se utilizează fie la separarea moleculelor mari, fie pentru o separare grosieră a proteinelor şi peptidelor în grupuri ce au un domeniu destul de larg al maselor moleculare 1, fie pentru regăsirea peptidelor după modificarea chimică, cum ar fi îndepărtarea agentului de alchilare după alchilare. Determinarea precisă a maselor moleculare a peptidelor, chiar folosind standarde pe un domeniu îngust al maselor moleculare nu se poate realiza, deşi folosirea unor denaturanţi puternici aduce unele îmbunătăţiri ale metodei. C ROMATOGRAFIA ÎN FAZA NORMALA Cromatografia în fază normală a fost mult mai mult folosită pentru separarea peptidelor decât pentru separarea proteinelor sau a aminoacizilor, în special din cauza slabei solubilităţi a proteinelor în soluţii ce conţineau concentraţii ridicate de solvenţi organici şi a relativei bune solubilităţi a majorităţii aminoacizilor în soluţii apoase. Din contra, majoritatea peptidelor sunt mai solubile în faze organice decât în faze apoase. Prin această metodă s-au pus în evidenţă multe interacţii subtile. De exemplu în figura alăturată se prezintă separarea unor peptide ce diferă prin poziţia unui singur rest de Gly. Separarea peptidelor prin cromatografie în fază normală Coloana μporasil (300 x 3,9 mm) Faza mobilă Ciclohexan-izopropanolmetanol (92:6:2) Gradient Nu. Viteza 1,0 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@220 nm Proba 1. Boc-Met 3 -Gly-Met 2 -OMe; 2. Boc- Met 2 -Gly-Met 3 -OMe; 3. Boc-Met 5 - Gly-OMe; 4. Boc-Gly-Met 5 -OMe; 5. Boc-Met 4 -Gly-Met-OMe. 1 Sullivan, R.C., Shing, V.W., D'Amore, P.A., Klagsbrun, M., J. Chromatogr., 266 (1983)

96 .. P ROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI O problemă care apare adesea în timpul sintezei şi secvenţionării proteinelor este apariţia unui intermediar care nu este solubil în soluţii apoase; problema se rezolvă prin folosirea unei soluţii apoase de dimetilsulfoxid şi folosirea cromatografiei în fază normală 1. I NTRODUCERE Dezvoltarea fazelor staţionare de mare performanţă pentru analiza aminoacizilor a fost un proces continuu de la prima apariţie a analizorului automat de aminoacizi 2. Valoarea mică a coeficienţilor de extincţie a majorităţii aminoacizilor a dus la dezvoltarea unor metode de detecţie prin derivatizarea 3 grupărilor amino cu un derivat colorat 4 sau fluorescent. Cei mai des utilizaţi reactivi de derivatizare a aminoacizilor sunt prezentaţi în tabelul alăturat. Ninhidrina Ortoftalaldehida (OPA) Flurescamina (fluram) Fenil izotiocianatul Reactivi utilizaţi pentru derivatizarea aminoacizilor Clorura de dansil Clorura de dabsil Diaminoazoben izo-tiocianatul Detecţie la 200 nm Deşi sporadic sunt semnalaţi şi alţi reactivi şi metode de derivatizare ale aminoacizilor, ei nu sunt larg folosiţi. 1 Naider, F., Huchital, M., Becker, J.M., Biopolymers, 22 (1983) Spackman, D.H., Stein, W.H., Moore, S., Anal. Chem., 30 (1950) Fernandes, J.O., Ferreira, M.A., J. Chromatogr. A., 886 (2000) Strong, R.A., Liu, H.J., Krull, I.S., Cho, B.Y., Cohen, S.A., J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol., 23 (2000)

97 ... V ASILE O STAFE..... C ROMATOGRAFIA DE SCHIMB IONIC Majoritatea analizoarelor automate de aminoacizi folosesc răşini schimbătoare de ioni pentru separarea aminoacizilor derivatizaţi pre-coloană 1 cu ninhidrină 2. OPA 3, fenilizocianatul 4 sau fluram-ul 5 pot fi folosiţi în egală măsură, alături de agenţi de derivatizare mai puţin folosiţi 6. Analiza aminoacizilor prin cromatografie de schimb ionic Coloana Dionex DC-6A (300 x 4,6 mm) Faza mobilă Tampon citrat Gradient Program de schimbare a 3 tampoane Viteza 1,0 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie Derivatizare post-coloană cu ninhidrină Proba 1. Cys-Cys, 2. Asp, 3. Met sulfonată, 4. Thr, 5. Ser, 6. Glu, 7. Pro, 8. Gly, 9. Ala, 10. Cys, 11. Val, 12. Met, 13. Ile, 14. Leu, 15. N-Leu, 16. Tyr, 17. Phe, 18. Amoniu, 19. Lys, 20. His, 21. Arg. 1 Kubec, R., Svobodova, M., Velisek, J., J. Chromatogr. A., 862 (1999) Zdebska, E., Koscielak, J., Anal. Biochem., 275 (1999) Husted, S., Hebbern, C.A., Mattsson, M., Schjoerring, J.K., Physiol. Plant., 109 (2000) Albin, D.M,. Wubben, J.E., Gabert, V.M., J. Agric. Food Chem., 48 (2000) Kelly, MT., Fabre, H., Perrett, D., Electrophoresis., 21 (2000) Wang, F., Chen, X., Chen, Q., Qin, X.C., Li, Z.X., J. Chromatogr. A., 883(2000)

98 .. P ROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI Analiza aminoacizilor prin cromatografie de schimb ionic Coloana Polyspher AA NA (120 x 4,6 mm) Faza mobilă Buffelute (Pierce Cehmicals) Gradient Gradient în trepte Viteza 0,5 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie Derivatizare post-coloană cu OPA, fluorescenţă; ex nm; em nm Proba 1. Asp, 2. Thr, 3. Ser, 4. Glu, 5. Gly, 6. Ala, 7. Val, 8. Met, 9. Ile, 10. Leu, 11. Tyr, 12. Phe, 13. His, 14. Lys, 15. Amoniu, 16. Arg. C ROMATOGRAFIA ÎN FAZA INVERSATA Tot mai multe firme comercializează analizoare automate de aminoacizi ce folosesc cromatografia în fază inversată. Viteza de analiză este mărită datorită faptului că acest tip de cromatografie nu necesită reechilibrarea coloanei între analize 1. Pentru detecţia aminoacizilor s-au propus metode de derivatizare pre- şi postcoloană. Derivatizarea pre-coloană Orto-ftalaldehida (OPA). Simplitatea acestei metode de derivatizare a făcut ca metoda să devină foarte populară 2. Timpul de separare a OPA-aminoacizilor a fost mult redus prin scăderea lungimi coloanei şi creşterea vitezei volumetrice a 1 Vacchina, V., Chassaigne, H., Oven, M., Zenk, M.H., Lobinski, R., Analyst., 124 (1999) Husted, S., Hebbern, C.A., Mattsson, M., Schjoerring, J.K., Physiol. Plant., 109 (2000)

99 ... V ASILE O STAFE..... fazei mobile. Principalele dezavantaje ale metodei sunt timpul de viaţă relativ scurt al derivaţilor OPA în comparaţie cu derivaţii de dansil sau furam şi slaba reactivitate faţă de aminele secundare (deşi adăugarea de hipoclorit poate să înlăture această din ultimă problemă). Analiza aminoacizilor prin cromatografie de în fază inversată Coloana NovaPak C18, 4 μm (150 x 3,9 mm) Faza mobilă A: 60 mm KH 2 PO 4, ph 6,65; B: tampon A: acetonitril: metanol:2-propanol (46:18:18:18) Gradient min. ml/min %A %B 0 0,0 0,5 0,5 2,5 1,0 15 1,0 27 1,0 Temperatura Camerei Detecţie Proba Derivatizare pre-coloană cu OPA, fluorescenţă; ex nm; em nm 1. Asp, 2. Glu, 3. Ser, 4. His, 5. Arg, 6. Gly, 7. Thr, 8. Ala, 9. Tyr, 10. Met, 11. Val, 12. Phe, 13. Ile, 14. Leu, 15. Lys. 97

100 .. P ROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI Derivatizarea post-coloană Orto-ftalaldehida (OPA). Pentru a realiza o derivatizare post-coloană cu OPA se foloseşte o spiră de reacţie (4 x 0,3 mm) inserată între punctul de amestecare cu agentul fluorescent şi detector 1. Deoarece volumul spirei de reacţie influenţează dispersia peak-urilor, derivatizarea post-coloană nu este la fel de bună ca cea pre-coloană. În plus se impune folosirea unei viteze volumetrice mici, ceea ce duce la creşterea timpului total de analiză. Totuşi, principalul avantaj al derivatizării post-coloană este reproductibilitatea. Faţă de metoda cu ninhidrină, derivatizarea cu OPA nu necesită un dispozitiv de încălzire. Analiza aminoacizilor prin cromatografie de schimb ionic, detecţie cu florescamină Coloana Durrum DC-4A (500 x 4,6 mm) Faza mobilă A: 0,175 N citrat de sodiu, ph 3,5; B: 0,175 N citrat de sodiu, ph 3,45; C: 0,2 N citrat de sodiu, 0,05% tiodiglicol, ph 4,1; D. 0,52 N citrat de sodiu, 1 N NaCl, 0,05 % tiodiglicol. Gradient în trepte min. %A %B %C %D 18 ml/h Temperatura 57ºC Detecţie Derivatizare cu Fluram Proba 1. Asp, 2. Thr, 3. Ser, 4. Glu, 5. Cys, 6. Pro, 7. Gly, 8. Ala, 10. Val, 11. Met, 12. Ile, 13. Leu, 14. nor-leu, 15. Tyr, 16. Phe, 17. His, 18. Lys, 19. Amoniu, 20. Arg. 1 Vasanits, A., Kutlan, D., Sass, P., Molnar-Perl, I., J. Chromatogr. A., 870 (2000)

101 ... V ASILE O STAFE..... Fluorescamina (Fluoram). Pentru realizarea derivatizării cu fluorescamină sunt necesare 2 pompe separate, una pentru pomparea fazei mobile şi alta pentru reactiv 1, motiv pentru care metoda este mai puţin comodă decât cea cu OPA. Nivelul sensibilităţilor este similar pentru ambii reactivi şi de 10 ori mai bun decât în cazul ninhidrinei. Fluramul reacţionează, de asemenea, slab cu aminele secundare (cum ar fi prolina), dar neajunsul poate fi îndepărtat prin adăugare de anhidridă succinică 2. Analiza aminoacizilor prin cromatografie în fază inversată Coloana Ultrasphere ODS (150 x 3,9 mm) Faza mobilă 0,01 M acetat de sodiu (ph 4,9) - acetonitril (62:38) Gradient Nu Temperatura Camerei Detecţie Derivatizare post-coloană cu fenilizotiocianat Proba 100 μl plasmă a fost diluată cu standard intern (metionil sulfona), deproteinizată prin ultrafiltrare centrifugală şi derivatizată. Fenilizotiocianat (PITC). Folosirea fenilizotiocianatului 3 (reactivul Edman) pentru a forma derivaţi tiohidantoinici (PTH) ai aminoacizilor este bine cunoscută 1 Udenfriend, S., Stein, S., Bohlen, P., Dairman, W., Leimgruber, W., Weigle, W., Science, 178 (1972) Stein, S. Brink, L., Methods Enzymol., 29 (1981) Miller, M.L., Johnson, G.V.W., J. Chromatogr. B., 732 (1999)

102 .. P ROTEINE, PEPTIDE, AMINOACIZI fiind folosită la secvenţionarea peptidelor 1. Metoda a fost folosită şi pentru analiza amestecurilor de aminoacizi prin cromatografia în fată inversată 2, iar firma Waters comercializează un kit bazat pe această metodă (Waters, Pico-Tag). Clorura de dansil (DNS-Cl) (clorura de 1-dimetilaminonaftalen-5- sulfonil) 3. Iniţial reactivul a fost introdus în chimia proteinelor pentru analiza capetelor amino-terminale 4 şi a fost mult folosit datorită simplităţii metodei şi capacităţii de a reacţiona atât cu aminele primare cât şi cu cele secundare (spre deosebire de metodele cu o-ftaladehidă şi furam). Mai mult, în contrast cu alţi reactivi fluorescenţi, derivaţii de dansil sunt stabil la hidroliza acidă şi prin urmare pot fi utilizaţi pentru marcarea grupărilor amino înainte de hidroliză. Prin folosirea acestei metode de derivatizare la separărilor prin cromatografia în fază inversată sensibilitatea ajunge în domeniul picomolilor, fiind limitată datorită reacţiilor secundare care pot avea loc cu lizina şi într-o măsură mai mică cu histidina şi tirozina. Clorura de dabsil (DBS-Cl) (4-N,N-dimetilaminoazobenzen-4-izotiocianatul) 5. Reacţia aminoacizilor cu clorura de dabsil produce compuşi care pot fi detectaţi în UV (436 nn) în cantităţi de câţiva picomoli. Produsul este stabil la temperatura camerei 6. Totuşi metoda nu este la fel de populară ca cele cu o- ftalaldehidă şi clorura de dansil. Diaminoazobenzenizotiocianatul (DABITC) (4-N,N-dimetilaminoazoben- 1 Zahou, E., Jornvall, H., Bergman, T., Anal. Biochem., 281 (2000) Heinrikson, R.I., Meredith, S.C., Anal. Biochem., 136 (1984) Abe, Y., Fukui, S., Koshiji, Y., Kobayashi, M., Shoji, T., Sugata, S., Nishizawa,H., Suzuki, H., Iwata, I., Biochim. Biophys. Acta-Protein Struct. Molec. Enzym., 1433 (1999) Gray, W.R., Hartley, B.S., Biochem. J., 89 (1963) Schauer-Vukasinovic, V., Bur, D., Kitas, E., Schlatter, D., Rosse, G., Lahm, H.W., Giller, T., Eur. J. Biochem., 267 (2000) Lin, CRC Handbook for the Separation of Amino Acids, Peptides and Proteins, vol. 1, 1984, pp

103 ... V ASILE O STAFE..... zen-4-izotiocianatul). Acest reactiv a fost folosit cu succes pentru secvenţionalizarea proteinelor şi peptidelor 1. Detecţia derivaţilor de tiohidantoină se poate face la 436 nm cu o sensibilitate în jur de 5 picomoli 2. Analiza aminoacizilor prin cromatografie în fază normală Coloana Zorbax NH 2 (250 x 4,6 mm) Faza mobilă A: 10 mm KH 2 PO 4, ph 4,3; B: acetonitril-apă 50:7 (v/v) Gradient Gradient conform schemei Viteza 2,0 ml min 1 volumetrică Temperatura 35ºC Detecţie Proba Derivatizare post-coloană cu OPA, fluorescenţă; ex nm; em nm 1. Phe, 2. Leu, 3. Ile, 4. Met, 5. Tyr, 6. Val, 7. Pro, 8. ALa, 9. HyPro, 10. Thr, 11. Gly, 12. Ser, 13. His, 14. Cys, 15. Arg, 16. Lys, 18. Glu, 19. Asp. Selectivitatea diferită a aminoacizilor în faza normală comparată cu faza inversată a permis realizarea unor separări dificile 3,4. De exemplu, prin acest tip de cromatografia au fost rezolvaţi toţi aminoacizii prezenţi într-un hidrolizat de colagen şi, ceea ce este mai important, hidroxi-lizil-norleucina şi dehidroxi-lizilnorleucina au fost separate 5. 1 Chang, J.Y., Brauer, D., Wittmann, J., Leibold, B., FEBS Lett., 93 (1980) Lehmann, A., Wittmann, J., Leibold, B., FEBS Lett., 176 (1984) Charlwood, J., Birrell, H., Camilleri, P., J. Chromatogr., B., 734 (1999) Yoshida, T., J. Chromatogr. A., 852 (1999) Smolenski, K.A., Fallon, A., Light, N.D., Bailey, A.J., Biosci. Rep. J., 3 (1983)

104 G L U C II D E Glucidele, zaharurile sau carbohidraţii sunt polihidroxialdehide sau polihidroxicetone sau un compus care poate hidrolizat la o astfel de structură. Cea mai mică unitate care nu mai poate fi hidrolizată la astfel de structuri se numeşte monozaharidă. Glucoza este pe departe cel mai abundent membru al acestei clase de compuşi. În funcţie de numărul de atomi de carbon din moleculă există trioze, tetroze, pentoze, hexoze, etc., formula generală pentru monozaharide fiind (CH 2 O) n cu n 3, motiv pentru care aceste substanţe se numesc carbohidraţi 1. În funcţie dacă monozaharida este o aldehidă sau o cetonă molecula este clasificată ca fiind aldoză sau cetoză. Monozaharidele cu 5 sau mai mulţi atomi de carbon pot adopta conformaţii ciclice, cele mai comune fiind ciclurile de 5 sau de 6 atomi de carbon. În acest caz structurile se numesc furanozice, respectiv piranozice. Structurile monozaharidelor se pot scrie cu lanţul atomilor de carbon linear sau 1 Ostafe, V., Să Învăţăm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptivă, Ed. Brumar, Timişoara, 1999

105 ... V ASILE O STAFE..... formule de proiecţie Haworth (care sunt cele mai folosite), deşi cele mai corecte reprezentări sunt conformaţiile tip baie sau scaun. Diferite moduri de scriere monozaharidelor: Formule lineare, Proiecţii Haworth Conformaţii tip baie sau scaun H HO H H HC C C C C C H 2 O OH H OH OH OH H 2 C HO OH H H Două monozaharide unite printr-o legătură glicozidică formează un diglucid (dizaharid). Cel mai comun dizaharid este zaharoza (zahărul de bucătărie). Oligozaharidele (până la unităţi monozaharidice) au denumiri specifice 1. Dintre polizaharide cele mai cunoscute sunt celuloza, amidonul şi glicogenul. Carbohidraţii sunt una din cele patru categorii majore de substanţe (alături de proteine, lipide şi acizi nucleici) ce se găsesc în toate organismele vii. Zaharurile sunt o parte constituentă importantă a diferitelor tipuri de hrană, fiind prezente în cantităţi mari în seminţe şi vegetale. Hainele pot fi fabricate din produse bogate în carbohidraţi: celuloza, bumbacul, iar lemnul, bogat în celuloză, are foarte multe aplicaţii. Biosinteza carbohidraţilor începe cu producerea glucozei din dioxid de carbon şi apă în timpul fotosintezei planatelor. Glucoza poate apoi să fie convertită fie în celuloză - un polizaharid de structură, fie în amidon - un polizaharid de C C C C C H 2 O H OH OH OH HO H HO H H C C C C C H OH H OH CH 2 OH H 2 C OH C O HO CH 2 H 2 C OH OH O C C H O OH C OH C C C HO C C OH OH HO HOH 2 C OH HO C C H H C OH O H C CH 2 OH H 2 C OH C O C C C C C C C H 2 C C C O OH O 1 Ostafe, V., Să Învăţăm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptivă, Ed. Brumar, Timişoara,

106 G LUCIDE rezervă. Când amidonul (şi la unele specii chiar şi celuloza) sunt digerate de animale, glucoza rezultată este fie folosită ca sursă directă de energie (glicoliza), fie stocată sub formă de glicogen (polizaharidul de rezervă major din animale). Anumite cantităţi din glucoză pot fi convertite în lipide sau sunt utilizate pentru formarea glicoproteinelor. Glicoproteinele sunt componente ale membranelor şi pereţilor celulari şi funcţionează ca receptori şi markeri celulari. Având o răspândire ubicventă şi formând structuri de mare importanţă biologică analiza glucidelor s-a bucurat de mare atenţie din partea cercetătorilor. Printre metodele utilizate de timpuriu în analiza glucidelor se numără şi cromatografia pe hârtie şi cromatografia de gaze. Prima are dezavantajul de a fi o metodă calitativă. Varianta modernă, cromatografia în strat subţire, chiar dacă este de mare performanţă, în cel mai bun caz poate fi considerată semicantitativă. În ce priveşte cromatografia de gaze, cerinţa de a se folosi produşi volatili impunea folosirea de metode de derivatizare pre-coloană. Printre reactivii utilizaţi se numără esterii de trimetilsilan 1, acidul butil boronic 2, derivaţi de acid benzen boronic 3, etc. Cu toate că uneori s-au obţinut rezultate spectaculoase, tehnica gaz-cromatografică nu este prea populară datorită timpului prea mare dedicat pregătirii probelor, instabilităţii produşilor şi posibilităţii reacţionării incomplete. HPLC a fost folosită foarte mult pentru separarea mono- şi oligozaharidelor încă din anii '70 4 Această tehnică oferă o cuantificare precisă şi timpul de analiză este foarte scurt 5. Principalul "dezavantaj" al folosirii HPLC pentru analiza glucidelor este faptul că zaharidele nu conţin grupări cromofore şi detecţia cu sisteme UV standard necesită derivatizarea pre- sau post-coloană. Deoarece încă 1 Wood, P.J., Sidiqui, I.R., Carbohydr. Res., 19 (1971) Eisenberg, F., Jr., Carbohydr., Res., 19 (1971) Crowell, E:P., Burnett, B.B., Anal. Chem., 39 (1967) Thiem, J., Schwenter, J., Karl, H., Sievers, A., Reimer, J., J. Chromatogr., 155 (1978) Krull, I.S., Sebag, A., Stevenson, R., J. Chromatogr. A., 887 (2000)

107 ... V ASILE O STAFE..... din anii '70 s-au comercializat detectoare indice de refracţie 1, detecţia glucidelor nu mai constituie o "problemă" pentru analizele HPLC. Silicagelul nemodificat este prea polar pentru a fi eficient pentru rezolvarea amestecurilor de glucide. Problema poate fi rezolvată prin derivatizare precoloană 2. Separările zaharidelor prin HPLC s-au realizat pe o mare varietate de tipuri de coloane, printre care amintim: Suporturi amino sau nitril 3 Silicagel modificat in situ cu amine 4 Răşini schimbătoare de ioni 5 Suporturi în fază inversată. În marea majoritate a cazurilor simpla extracţie apoasă la temperaturi ridicate este suficientă pentru a extrage zaharidele cu masă moleculară mică din produsele alimentare. În situaţii mai dificile se poate recurge la extracţia cu solvenţi organici şi triturarea omogenizarea probei 6. Adesea, aceste extracte sunt acide şi se recomandă tratarea cu carbonat de calciu (cu urme de octanol pentru se reduce spumarea) pentru a le neutraliza. Extractele pot fi clarificate cu acetat neutru de 1 Palmer, J.K., Anal. Lett., 8 (1975) Wannet, W.J.B., Hermans, J.H.M., van der Drift, C., den Camp, H.J.M.O., J. Agric. Food Chem., 48 (2000) D'Amboise, M., Noel, D., Hanai, T., Carbohydr. Res., 79 (1980) Aitzetmuller, K., J. Chromatogr., 156 (1978) Verhaar, L.A.Th., Kuster, B.F.M., J. Chromatogr., 220 (1981) Wilson, C.W., Shaw, P.E., Campbell, C.W., J. Sci. Food Agric., 33 (1982)

108 G LUCIDE plumb după care sunt filtrate (şi deionizate). Diluarea cu acetonitril şi filtrarea sau centrifugarea probei sunt, de obicei ultimile etape înaintea analizei HPLC. Se recomandă utilizarea unei coloane de protecţie (guard) pentru a se proteja coloana analitică de potenţialii contaminanţi, cum ar fi proteinele. Solubilitatea oligozaharidelor în acetonitril scade odată cu creşterea masei moleculare. Monozaharidele suportă până la 75% acetonitril, dar în cazul oligozaharidelor cu până la 15 unităţi glucidice concentraţia acetonitrilului nu trebuie să depăşească 55%. În general, băuturile nealcoolice, vinurile şi sucurile de fructe pot fi injectate direct, după etapa de filtrare. Polizaharidele necelulozice din pereţii celulari pot fi eliberate din celule prin hidroliza acidă (acid trifluoracetic 2M, timp de 1 oră, la 120ºC) urmată de deionizare (pe un schimbător de ioni sau pe un cartuş de extracţie în fază solidă - SPE) 1. Oligozaharidele complexe din urină pot fi separate de săruri şi metaboliţi prin adsorpţie pe cărbune activ 2 şi eluarea ulterioară cu o soluţie apoasă de etanol. Glicoproteinele conţin oligozaharide complexe legate covalent de partea proteică. Analiza HPLC a acestor oligozaharide poate fi realizată după eliberarea oligozaharidelor prin hidrazinoliză controlată. Procedeele moderne de pregătire a probelor de glucide recomandă utilizarea cartuşelor de extracţie în fază solidă (SPE), cum ar fi Sep-Pak C18 sau Oasis (Waters). Prin această operaţie se îndepărtează contaminanţii, cum ar fi lipidele şi se măreşte timpul de viaţă (folosire) al coloanei analitice. În cazul folosirii cromatografiei de schimb ionic pentru analiza glucidelor, probele trebuie deionizate pentru a se evita interacţiile şi eluările aleatorii. Dificultăţile legate de deionizare pot fi rezolvate uşor dacă se foloseşte ionul format care poate fi îndepărtat prin liofilizare 3. 1 Barton, F.E., Windham, W.R., Himmelsbach, D.S., J. Agric. Food Chem., 30 (1982) Warren, C.D., Schmidt, A.S., Jeanloz, R.W., Carbohydr. Res., 116 (1983) Baust, J.G., Lee, R.E., James, H., J. Liq. Chromatogr., 5 (1982)

109 ... V ASILE O STAFE..... Una dintre principalele probleme ale analizei zaharidelor este lipsa de grupări cromofore care să absoarbă la lungimi de undă mai mari de 200 nm. Cel mai uşor glucidele sunt monitorizate cu detectorul indice de refracţie. Totuşi, în unele situaţii sensibilitatea limitată a acestui tip de detector face ca analiza să nu fie practică şi pentru a se evita operaţiile de concentrare a probei, operaţii consumatoare de timp şi bogate în surse de erori se recomandă derivatizarea pre-coloană 1. Derivatizarea pre-coloană a glucidelor are ca scop obţinerea unui derivat care Se obţine uşor, reproductibil şi cu randament mare; Are un coeficient de absorbţie ridicat la o lungime de undă convenabilă; Este compatibil cu sistemul de solvenţi ales pentru cromatografiere; Permite recuperarea uşoară a precursorului; Este potrivit pentru eventualele analize ulterioare, cum ar fi RMN sau MS 2. Literatura de specialitate menţionează mai multe tipuri de derivaţi ai zaharidelor, printre care amintim acetaţii 3, benzoaţii, 4-nitrobenzoaţii 4, benziloxim perbenzoaţii 5, derivaţii de fenildimetilsilan 6 şi derivaţii alchilaţi 7 Pentru analiza oligozaharidelor complexe care, cel mai adesea, sunt prezente în probe în concentraţii mici, marcarea radioactivă cu borohidrura de sodiu tritiată este o metodă ce trebuie luată în considerare datorită sensibilităţii şi preciziei în cuantificare 8. 1 Kratschmar, D., Wallner, S., Florenski, M., Schmid, D., Kuhn, R., Chromatographia., 50 (1999) White, C.A., Vass, S.W., Kennedz, J.F., Large, D.G., J. Chromatogr., 264 (1983) Wells, G.B., Lester, R.L., Anal Biochem., 97 (1979) Nachtmann, F., Budna, K.W., J. Chromatogr., 136 (1978) Thompson, R.M., J. Chromatogr., 166 (1978) White, C.A., Vass, S.W., Kennedz, J.F., Large, D.G., J. Chromatogr., 264 (1983) McGinnis, G.D., Fang, P., J. Chromatogr., 153 (1978) Warner, T.G., Robertson, A.D., O'Brien, J.S., Clin. Chim. Acta, 127 (1983)

110 G LUCIDE În general, procedurile de derivatizare reduc polaritatea compuşilor şi uşurează separarea lor pe silicagel nederivatizat folosind faze mobile organice 1. Formele anomerice pot fi separate după acetilare sau benzoilare cu toate că mărirea numărului de peak-uri datorită acestor forme anomerice necesită timpi mai lungi de eluare şi duce la obţinerea de cromatograme mai complexe. Peak-uri unice se obţin când derivatizarea duce la deschiderea ciclurilor, cum ar fi în cazul reactivilor oximă 2. O alternativă la detecţia glucidelor cu detectorul indice de refracţie, a cărui sensibilitate este redusă (în domeniul μg) şi la derivatizarea pre-coloană, este derivatizarea post-coloană 3. Cea mai populară metodă de acest tip este tratarea cu tatrazolium blue care permite detecţia la 530 nm 4. Reacţia poate avea loc numai cu zaharidele reducătoare, fiind astfel excluse zaharoza şi inulina. În aceste cazuri tratarea probei cu β-fructozidază va duce la conversia zaharozei în glucoză şi fructoză. Pentru inulină se recomandă hidroliza acidă blândă 5. Alte metode de derivatizare post-coloană sunt producerea de complex glucid-cupruamoniu care poate fi detectat la 295 nm 6, reacţia cu periodatul şi detecţia prin dispariţia absorbanţei la 260 nm 7, reacţia cu 2-terţ-butilantrachinona şi detecţie de fluorescenţă 8 şi reacţia cu ceriu (IV) şi detecţie de fluorescenţă 1. 1 White, C.A., Vass, S.W., Kennedz, J.F., Large, D.G., J. Chromatogr., 264 (1983) Thompson, R.M., J. Chromatogr., 166 (1978) Kratschmar, D., Wallner, S., Florenski, M., Schmid, D., Kuhn, R., Chromatographia., 50 (1999) D'Amboise, M., Noel, D., Hanai, T., Carbohydr. Res., 79 (1980) Wight, A.W., van Niekerk, P.J., Food. Chem., 10 (1983) Grimble, G.K., Barker, H.M., Taylor, R.H., Anal. Biochem., 128 (1983) Nordin, P., Anal. Biochem., 131 (1983) Gandelman, M.S., Birks, J.W., Anal. Chim. Acta, 155 (1983)

111 ... V ASILE O STAFE..... Termenul de zaharide simple este folosit în prezentul context pentru moleculele formate din 1-6 unităţi monozaharidice, incluzând compuşi ca fructoza, glucoza, lactoza, maltoza, zaharoza, galactoza şi arabinoza. C OLOANE ALCHIL- AMINO MODIFICATE CHIMIC Coloanele alchil-amino modificate chimic sunt fazele staţionare cele mai folosite pentru separarea zaharidelor şi sunt, în general eluate cu faze mobile constând din amestecuri de acetonitril - apă. Această compoziţie s-a dovedit a fi mult superioară altor amestecuri, cum ar fi de exemplu metanol - apă 2, sau acetat de etil - etanol - apă 3. S-a constatat că pe măsură ce conţinutul de apă al fazei mobile creşte, retenţia glucidelor scade. Analiza oligozaharidelor folosind coloane amino Coloana Spherisorb S5 NH 2 (250 x 4.6mm) Faza mobilă Acetonitril - apă (60:40) Gradient Nu Viteza 2,0 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie Indice de refracţie Proba Analiza unui extract din rădăcină de cicoare. Numărul de lângă peak-uri se referă la lungimea lanţului oligozaharidelor eluate. 1 Mrochek, J.E., Dinsmore, S.R., Waalkes, T.P., Clin. Chem., 21 (1975) Rabel, F.M., Caputo, A.G., Butts, E.T., J. Chromatogr., 126 (1976) Binder, H., J. Chromatogr. 189 (1980)

112 G LUCIDE Coloanele tip amino pot fi folosite atât ca schimbători slabi de anioni, fie ca faze staţionare pentru cromatografia în fază inversată sau în fază normală. În ultimile două cazuri este greu de apreciat dacă separarea se încadrează în fază normală sau inversată. Totuşi, pentru că retenţia glucidelor scade, de obicei, odată cu creşterea conţinutului de apă al fazei mobile, putem considera că este vorba de cromatografie în fază normală. Analiza oligozaharidelor folosind coloane amino Coloana Spheri-5 amino (100 x 4.6mm) Faza mobilă Acetonitril - apă (75:25) Gradient Nu Viteza 2,0 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie Indice de refracţie Proba 1. Glucoză, 2. Zaharoză, 3. Maltoză, 4. Lactoză, 5. Melibioză, 6. Maltotrioză. C OLOANE AMINO MODIFICATE FIZIC În această tehnică o mică cantitate dintr-o alchil-amină este adăugată la faza mobilă astfel încât perlele de silicagel se vor acoperi prin adsorpţie 1. Printre aminele folosite pentru acoperirea silicagelului amintim amine polifuncţionale 2, diamine şi monoamine 3 şi tetraetilenpentamina, care este şi cea mai folosită. Concentraţia tipică a tetraetilenpentaminei folosită în faza mobilă este 0,01%, cu 1 White, C.A., Corran, P.H., Kennedy, J.F., Carbohydr. Res., 87 (1981) Aitzetmuller, K. Koch, J., J. Chromatogr., 145 (1978) Wheals, B.B., White, P.C., J. Chromatogr., 176 (1979)

113 ... V ASILE O STAFE..... toate că pre-echilibrarea se poate realiza la 0,1% 1. Deoarece ph-ul rezultat este 9,2 pentru a se evita dizolvarea silicagelului se recomandă folosirea unei coloane de protecţie sau saturarea fazei mobile cu silicagel. Optimizarea unor astfel de sisteme implică studiul compoziţiei fazei mobile 2, influenţei ph-ului 3, a concentraţiei modificatorului aminic, a viteze volumetrice, etc. 4 Figura alăturată prezintă un exemplu de separare a oligozaharidelor dintr-un extract de plante. În condiţiile experimentale reacţiile chimice nedorite dintre modificatorul aminic şi componentele probei au fost neglijabile 5. Analiza oligozaharidelor folosind coloane amino modificate fizic Coloana LiChrosorb Si 60 5 μm (250 x 4.0 mm) Faza mobilă Acetonitril - apă (75:25) ce conţinea 0,01% modificator aminic Gradient Nu Viteza 3,0 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie Indice de refracţie Proba Ri - riboză, X - xiloză, F - fructoză, G - glucoză, S - zaharoză, Ma - maltoză, L - lactoză, Mb - melibioză, Mt - maltotrioză. 1 Aitzetmuller, K., Chromatografia., 13 (1980) Krull, I.S., Sebag, A., Stevenson, R., J. Chromatogr. A., 887 (2000) Vendrell-Pascuas, S., Castellote-Bargallo, A.I., Lopez-Sabater, M.C., J. Chromatogr. A., 881 (2000) Hendrix, D.L., Lee, R.E., Baust, J.G., James, H., J. Chromatogr., 210 (1981) Wight, A.W., van Niekerk, P.J., Food. Chem., 10 (1983)

114 G LUCIDE C OLOANE SCHIMBATOARE DE CATIONI Multe firme de specialitate comercializează kit-uri ce conţin coloane şi faze mobile "speciale" pentru separarea glucidelor. Aceste coloane sunt de fapt polimeri micşti reticulaţi stiren-divinilbenzen la care s-au ataşat grupări acide ce funcţionează ca schimbători puternici de cationi (cel mai adesea sulfo-propil). Coloanele pot opera pe un domeniu larg de ph şi la temperaturi de până la 85ºC. Contraionul cel mai des folosit este Ca 2+. Coloanele sunt mai întâi echilibrate cu faza mobilă ce conţine 1 mm acetat de calciu (timp de echilibrare de aproximativ 12 ore), după care se trece la o concentraţie de numai 0,1 mm acetat de calciu. În unele cazuri faza mobilă conţine diferite concentraţii de acetonitril (ajungând chiar şi la 80%). Schimbarea contra-ionului oferă o selectivitate diferită care poate fi benefică pentru anumite tipuri de probe 1. Analiza oligozaharidelor folosind coloane schimbătoare de ioni Coloana Polypore CA (220 x 4.6 mm) Faza mobilă apă Gradient Nu Viteza 0,3 ml min 1 volumetrică Temperatura 85ºC Detecţie Indice de refracţie Proba 1. Maltotrioză, 2. Maltoză, 3. Glucoză, 4. Fructoză, 5. Manitol, 6. Riboză. Acest tip de cromatografie, numit uneori şi cromatografie de schimb de ligand, are largi aplicaţii în special în analiza băuturilor răcoritoare şi a produselor dietetice. Furanozele şi piranozele sunt legate de ionii metalici prin intermediul unor complecşi de coordinare. Stabilitatea complecşilor de coordinare este 1 Kawamoto, T., Okata, E., J. Chromatogr., 258 (1983)

115 ... V ASILE O STAFE..... determinată de aranjamentul steric al grupărilor hidroxi ale carbohidraţilor şi de cationul metalic. Afinitatea pentru carbohidraţi creşte în ordinea Na + < Ca 2+ < Pb 2+. Pentru separarea carbohidraţilor şi a polialcoolilor eluarea se face cu apă, în sistem presurizat, la temperaturi de 80-90ºC. Pentru separarea mono- şi dizaharidelor, cât şi a polialcoolilor se utilizează în special forma "calciu" (cum ar fi Polyspher CH CA) sau "plumb" (Polyspher, CH PB). Faza "sodiu" (Polyspher CH NA) are o selectivitate specială pentru separarea oligozaharidelor până la 8 unităţi monoglucidice. Oligozaharidele sunt separate printr-un mecanism de excludere moleculară. Dacă contraionul este OH (ca în Polyspher CH OH), suportul de polistiren - divinilbenzen sulfonat trebuie eluat cu o soluţie de NaOH. Pentru detecţia monozaharidelor, amino-glucidelor şi a derivaţilor amino ai polialcoolilor, pe lângă detectorul refractometric se poate folosi şi detectorul electrochimic cu puls amperometric. Acesta are o sensibilitate mult mai bună decât detectorul indice de refracţie şi astfel, principalul inconvenient al detecţiei directe a glucidelor este în bună parte eliminat. Analiza oligozaharidelor folosind coloane schimbătoare de ioni Coloana Polyspher CH CA ( ) Faza mobilă Apă Gradient Nu Viteza 0,5 ml min 1 volumetrică Temperatura 90ºC Detecţie Indice de refracţie Proba 1. Maltotrioză, 2. Zaharoză, 3. Glucoză, 4. Galactoză, 5. Fructoză, 6. Manitol, 7 Arabinol, 8.Sorbitol. 113

116 G LUCIDE Analiza oligozaharidelor folosind coloane schimbătoare de ioni Coloana Polyspher CH PB ( ) Faza mobilă Apă Gradient Nu Viteza 0,4 ml min 1 volumetrică Temperatura 90ºC Detecţie Indice de refracţie Proba 1. Zaharoză, 2. Maltoză 3. Glucoză, 4. Xiloză, 5. Galactoză, 6. Arabinoză, 7. Manoză. Analiza oligozaharidelor folosind coloane schimbătoare de ioni Coloana Polyspher CH NA ( ) Faza mobilă Apă Gradient Nu Viteza 0,3 ml min 1 volumetrică Temperatura 75ºC Detecţie Indice de refracţie Proba Determinarea oligozaharidelor din sirop de porumb 114

117 ... V ASILE O STAFE..... Analiza oligozaharidelor folosind coloane schimbătoare de ioni Coloana Polyspher CH OH ( ) Faza mobilă 0,01 N NaOH Gradient Nu Viteza 0,5 ml min 1 volumetrică Temperatura 85ºC Detecţie Puls amperometrică Proba 1. Zaharoză, 2. Glucoză, 3. Arabinoză, C OLOANE ÎN FAZ INVERSAT HPLC în fază inversată este doar ocazional folosită pentru cromatografierea zaharidelor 1,2. Deoarece coloanele în fază inversată fiind cel mai des folosite este de presupus că există în oricare laborator ce deţine un sistem HPLC. Dacă analiza de glucide nu este o analiză de rutină, atunci nu se justifică achiziţionarea unei coloane speciale pentru glucide şi se poate folosi coloana în fază inversată. HPLC în fază inversată a fost folosită în special pentru separare oligozaharidelor şi separarea est dependentă de gradul de polimerizare 3. Pentru a creşte capacitatea şi selectivitatea pentru zaharide se pot folosi modificatori organici, cum ar fi n-alchilaminele 4. 1 Tian, Q.G., Ding, X.L., J. Chromatogr. A., 874 (2000) Kratschmar, D., Wallner, S., Florenski, M., Schmid, D., Kuhn, R., Chromatographia., 50 (1999) Cheethan, N.W.H., Sirimanne, P., Day, W.R., J. Chromatogr., 207 (1981) Lochmuller, C.H., Hill, W.B.Jr., J. Chromatogr., 264 (1983)

118 G LUCIDE Analizele HPLC ale oligozaharidelor din ţesuturile animale sau din fluidele biologice au fost folosite pentru determinarea distribuţiei masei lor moleculare 1. Majoritatea separărilor oligozaharidelor complexe au fost realizate folosind atât coloane amino care separă moleculele pe baza lungimii lanţului (ca cele menţionate mai sus sau Aminex 87C, 7 μm, 200 x 7,8 mm, forma calciu) cât şi coloane în fază inversată. Sistemele în fază inversată sunt în special utile deoarece sunt sensibile la diferenţele stereochimice ale moleculelor 2. Multe oligozaharide care sunt prezente ca părţi ale glicoproteinelor sunt încărcate negativ datorită prezenţei resturilor de acid sialic, fosfat sau sulfat. În acest caz se poate utiliza cu succes HPLC de schimb anionic. În cazul coloanelor amino, eluarea se face cu amestec apă - acetonitril ce conţine 3% acetat de trietilamoniu (ph 5,5). În acest caz glicoproteinele sunt separate în funcţie de conţinutul net de carbohidraţi. Adăugarea de sare duce la supresia ionică 3. Printre aplicaţiile care au beneficiat de analize HPLC ale glucidelor se numără separarea oligozaharidelor izomerice din glicoproteine 4, cuantificarea acidului hialuronic 5, diagnosticul unor boli ereditare lizozomale prin evidenţierea în urină a unor cantităţi mari de manoză 6, sau de galactozil oligozaharide 1, etc. 1 Urashima, T., Kawai, Y., Nakamura, T., Arai, I., Saito, T., Namiki, M., Yamaoka, K., Kawahawa, K., Messer, M., Comp. Biochem. Physiol. C-Pharmacol. Toxicol. Endocrinol., 124 (1999) Arbatsky, N.P., Likhosherstov, L.M., Serebryakova, M.V., Brusov, O.S., Shibaev, V.N., Derevitskaya, V.A., Kochetkov, N.K., Bioorg. Khim., 26 (2000) Mellis, S.J., Baenziger, J.U:, Anal., Biochem., 114 (1983) Bergh, M.L.E., Koppen, P.L., Van den Eijnden, J., Anarp, J., Lonngren, J., Carbohydr. Res., 117 (1983) Nebinger, P., Koel, M., Franz, A., Werries, E., J. Chromatogr., 265 (1983) Warren, C.D., Schmidt, A.S., Jeanloz, R.W., Carbohydr. Res., 116 (1983)

119 ... V ASILE O STAFE..... Multe proteine sunt modificate post-translaţional prin adăugarea de oligozaharide cu structuri complicate. Aceste oligozaharide pot avea efecte drastice asupra proprietăţilor chimice şi biologice ale proteidei. Analiza părţii glucidice este destul de dificil de realizat, fiind necesare analize speciale şi personal de înaltă calificare. Multe firme comercializează kit-uri speciale pentru analiza carbohidraţilor glicoproteinelor. Acest kit-uri sunt concepute pentru a putea fi folosite cu aparatura comună din laboratoarele de cercetare biochimică. O primă etapă în analiză părţii glucidice a glicoproteinelor este eliberarea enzimatică a oligozaharidelor. În majoritate cazurilor glucidele sunt legate de proteină printr-o legătură amidică de azotul unei asparagine. Hidroliza se realizează cu o peptid-n-glicozidază (cum ar fi peptid-n-glicozidaza F, notată PNG-aza F). Această reacţie converteşte Asn în Asp. Oligozaharidele libere sunt marcate cu 2 molecule de 1-fenil-3- metil-5-pirazolona (PMP) la poziţia reducătoare anomerică. PMP este un cromofor permiţând detecţia uşoară a glucidelor astfel marcate. În contrast cu condiţiile dificile cerute de ataşarea 2- aminopiridinei şi a altor reactivi de derivatizare a carbohidraţilor, condiţiile blânde cerute de derivatizarea cu PMP reţin activitatea biologică a resturilor de acid sialic. Derivaţii PMP pot fi separaţi şi analizaţi prin HPLC. 1 Warner, T.G., Robertson, A.D., O'Brien, J.S., Clin. Chim. Acta, 127 (1983)

120 a) Separarea HPLC a α-1,4-poliglucozei derivatizată cu fenilmetil pirazolonă G LUCIDE b) Separarea HPLC a oligozaharidelor marcate cu fenil-metilpirazolonă din ribonucleaza B. Separările s-au realizat pe coloană CHO C-18, 5 μm (220 x 2,1 mm) a) b) 118

121 N U C L E OT II D E Una dintre primele aplicaţii ale cromatografiei de lichide a fost separarea nucleozidelor 1 şi aceste rezultate au ajutat mult rapida dezvoltare şi înţelegere a biochimiei acizilor nucleici. Analizele HPLC ale componentelor acizilor nucleici pot fi împărţite în mai multe secţiuni în funcţie de natura chimică a acestor componente. Nucleotidele sunt structurile chimice de bază ce formează acizii nucleici 2. O nucleotidă este formată din trei elemente principale: o bază azotată (purinică - adenină, guanină, sau pirimidinică - citozină, timină, uracil), ataşată printr-o covalenţă pornind de la unul din atomii de azot, direct de atomul de carbon 1' al unei pentoze (riboza sau dezoxiriboza) care la rândul său formează prin intermediul hidroxilului din poziţia 5' (uneori şi în alte poziţii, cum ar fi 3' sau 2') esteri fosforici. Nucleozidele conţin doar baza azotată şi pentoza (nu şi grupările fosfat). Acizii nucleici sunt formaţi din înşiruirea nucleotidelor legate prin legături 1 Cohn, W.E., Science, 109 (1949) Ostafe, V., Să Învăţăm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptivă, Ed. Brumar, Timişoara, 1999

122 N UCLEOTIDE fosfodiesterice 5' - 3'. Timina, sau 5-metiluracilul, se găseşte în ADN, dar de obicei nu şi în ARN, în timp ce uracilul este prezent în ARN, dar foarte rar în ADN. Celelalte baze azotate se găsesc în ambele tipuri de acizi nucleici. O altă diferenţă între ADN şi ARN este dată de pentoza din structura nucleotidelor: 2-dezoxi-D-riboza şi respectiv D-riboza. Există un număr destul de mare de derivaţi modificaţi chimic ai nucleotidelor. Ei au importante funcţii biologice, iar unii dintre aceşti compuşi sunt folosiţi în tratamentul infecţiilor virale şi al cancerului. Pentru separarea bazelor azotate, nucleozidelor, nucleotidelor (şi chiar a acizilor nucleici) s-au folosit în special trei dintre cele mai comune tehnici HPLC: cromatografia de schimb ionic, cromatografia în fază inversată şi cea perechiionice. Valorile pk' ale bazelor nucleozidelor joacă un rol important în alegerea tipului de cromatografie şi a condiţiilor de lucru. Adenina NH 2 Dezoxiriboza N C C N O HC C CH HO P O CH 2 N N O OH HC CH CH CH 2 OH Acid dezoxidenozin monofosforic Citozina NH 2 C HC N O HC C HO P O CH 2 N O O OH HC CH CH CH Riboza OH OH Acid citozin monofosforic 120 N C HC C NH O Guanina C NH C N NH 2 O Timina H 3 C C C NH HC C NH O O C HC NH HC C NH O Uracil Valorile pk' pentru baze azotate şi nucleotide pk a pk b Baze Adenina Guanina Hipoxantina Xantina Citozina Uracil Timina Nucleozide Adenozina Guanozina Inozina Xantozina Citidina Uridina Timidina 4,15 3,20 2,00 0,80 4,45 3,40-3,50 1,60 1,20 <2,50 4, ,8 9,6 8,9 7,5 12,2 9,5 9,9 12,5 9,2 8,8 5,7 12,5 9,2 9,8

123 ... V ASILE O STAFE..... Extracţia nucleotidelor şi nucleozidelor din probele biologice este, în mod convenţional, realizată prin omogenizare în acid percloric, la temperatura de 0ºC. Deşi mai puţin folosit, acidul tricloracetic este adesea menţionat 1. Aceşti acizi au avantajul că precipită proteinele din probele biologice, lăsând nucleotidele nealterate în supernatant, de unde pot fi separate prin centrifugare. Supernatantul poate fi apoi neutralizat cu o soluţie alcalină. Alternativ, proteinele pot fi îndepărtate prin tratarea probei cu acetonitril la 0ºC. Proteinele pot fi îndepărtate şi prin ultrafiltrare, eliminând şi mai mult riscul de a altera nucleotidele sau nucleozidele de interes. Dezoxiribonucleozidele pot fi separate de ribonucleozide folosindu-ne de faptul că au părţi glucidice diferite. Acidul periodic reacţionează cu grupările hidroxil vicinale (cis-diol) ale ribonucleozidelor asigurând îndepărtarea lor 2. Alternativ, ribonucleozidele pot fi adsorbite pe o coloană boronată (ex. Affi-Gel 601) la ph bazic şi eluate cu acid formic 0,1 M 3. Metoda clasică pentru identificarea peak-urilor eluate ale nucleozidelor este de a folosi timpii de retenţie şi de a suplimenta (spiking) proba cu compuşi standard de referinţă. În plus, tratamentul chimic cu periodat poate fi folosit pentru identificarea ribonucleozidelor prin observarea peak-urilor care nu mai apar pe o a doua cromatogramă 4. 1 Maybaum, J., Klein. F.K., Sadee, W., J. Chromatogr., 188 (1980) Garrett, C., Santi, D.V., Anal. Biochem., 99 (1979) Colonna, A., Russo, T., Esposito, F., Salvator, F., Cimino, F., Anal. Biochem., 130 (1983) Hartwick, R.A., Krstulovic, A.M., Brown, P.R., J. Chromatogr., 186 (1979)

124 N UCLEOTIDE Similar, modificarea enzimatică poate fi de ajutor într-un număr de cazuri specifice 1. Dispariţia unui peak, sau scăderea ariei peak-ului corespunzător substratului sau creşterea ariei peak-ului corespunzător produsului pot ajuta la identificarea compuşilor. Rapoarte spectrale Compus A 254 /A 280 Adenozina 4,71 1-metiladenozina 4,33 Citidina 0,92 3-Metilcitidina 0,33 5-Metilcitidina 0,51 Guanozina 1,60 1-Metilguanozina 1,84 2-Metilguanozina 1,80 7-Metilguanozina 1,36 Inozina 5,89 1-Metilinozina 3,66 Pseudouridina 2,17 4-Tiouridina 1,736 Uridina 2,55 1 Zakaria, M., Brown, P.R., J. Chromatogr., 226 (1981) Folosirea modificării enzimatice Enzima Substrat Produs 5'-Nucleotidaza Nucleozid monofosfatul Nucleozid Fosfataza alcalină Nucleotid Nucleozid Fosfataza acidă Nucleotid Nucleozid Xantin oxidaza Hipoxantina Xantina Xantin oxidaza Xantina Acid uric Adenozin deaminaza Adenozina Inozina Guanaza Guanina Xantina Adenozin kinaza Adenozina AMP Raportul spectral - raportul valorilor absorbanţelor la 2 lungimi de undă este o modalitate alternativă mult folosită pentru identificarea compuşilor. În cazul nucleotidelor şi nucleozidelor se foloseşte raportul spectral A 254 /A 280. Câteva valori caracteristice ale celor mai des întâlnite nucleotide sunt prezentate în tabelul alăturat. Derivaţii nucleozidelor obţinuţi din probe biologice sunt, cel mai adesea, în concentraţii foarte mici, ceea ce ridică probleme atât la identificarea cât şi la cuantificarea lor. Pentru a creşte sensibilitatea metodei se folosesc diferite metode de derivatizare. Cloroacetaldehida reacţionează specific cu adenina şi compuşii înrudiţi, iar produsul de reacţie - 1,N 6 - etenoadenina emite o puternică fluorescenţă la 410 nm.

125 ... V ASILE O STAFE..... Bazele azotate din structura acizilor nucleici sunt adesea analizate în prezenţa nucleozidelor corespunzătoare, deoarece metodele cromatografice pot discrimina între cele două categorii de substanţe. Deşi iniţial separarea acestor substanţe se făcea prin cromatografie de schimb ionic datorită grupărilor ionizabile 1 actualmente cromatografia în fază inversată este tot mai des folosită 2. Analiza unor baze azotate purinice şi pirimidinice prin cromatografie în fază inversată Coloana Inertsil 5µ ODS-2, 150 x 4.6mm Faza 0,1 M H 3 PO 4 + 0,2 M NaClO 4, ph 2.0 mobilă Gradient Nu Viteza 1 ml min 1 volumetrică Temperatura 40ºC Detecţie UV@260 nm Proba 1. citozină 2. uracil 3. Guanină 4. adenină 5. citidină 6. Uridină 7. timină 8. Adenozină 9. Guanozină 10. Timidină Investigaţii exhaustive privind comportamentul cromatografic al bazelor azotate din acizi nucleici cât şi a altor compuşi ce absorb în domeniul ultraviolet au indicat separarea a 86 de compuşi 3. Folosind o coloană ODS şi un gradient tampon 1 Floridi, A., Palmerini, C.A., Fini, C., J. Chromatogr., 138 (1977) Ichishima, E., Biosci. Biotechnol. Biochem., 64 (2000) Hartwick, R.A., Krstulovic, A.M., Brown, P.R., J. Chromatogr., 186 (1979)

126 N UCLEOTIDE fosfat - metanol s-au separat 28 de compuşi şi s-au stabilit relaţii între structurile chimice şi timpii de retenţie ai derivaţilor din seriile purinică şi pirimidinică ceea ce a permis prezicerea timpilor de retenţie din structura chimică. Determinarea exactă a concentraţiilor metaboliţilor purinici şi pirimidinici într-o mare varietate de lichide biologice a permis studierea unui mare număr de boli şi sugerarea unor abordări terapeutice. Probele de urină a fost filtrate şi analizate direct. Serul şi plasma au fost deproteinizate prin precipitare cu acid percloric şi neutralizate înainte de injectare. S-au folosit diferite tipuri de coloane ODS-2 şi eluţii cu tampoane fosfat (0,05M, ph 5,6) în amestec cu metanol, sau sulfat de amoniu (ph 3,5) cu metanol sau acetonitril. În separarea bazelor azotate tampoanele acetat dau eficienţe mai scăzute decât cele fosfat. Analiza unor baze azotate purinice şi pirimidinice prin cromatografie în fază inversată perechi ionice Coloana μbondapak C18, 300 x 4mm Faza 0,1N Formiat de amoniu: acetonitril 100:1 mobilă Gradient 0-30 min min Viteza volumetrică Temperatura Detecţie 124 Tampon A: 0,1 mm tetrabutilamonium hidrogen sulfat (C16), 2,5 mm tetraetilamoniu bromură (C8) şi 2% metanol în 2 mm acetat de sodiu, 1,5 mm tampon fosfat, ph 6,0. Tampon A + 30 mm fosfat 1 ml min 1 Camerei UV@254 nm FU - fluorouracil, FUR - fluorouracil ribozidă, FUdR - Fluorouracil dezoxiribozidă, FUMP - fluorouridină 5'-monofosfat, 5'dFUR - 5'-dezoxifluorouracil ribozidă, FdUMP - dezoxifluorouridină monofosfat, UDPG - uridină difosfoglucoză, UDP - uridină difosfat, dudp - dezoxiuridină monofosfat, UTP - uridină trifosfat.

127 ... V ASILE O STAFE..... Cromatografia în fază inversată este adecvată pentru majoritatea separărilor bazelor azotate, dar în cazul unor baze modificate chimice rezoluţia faţă frontul solventului poate deveni o problemă. Aceasta este rezolvată prin folosirea cromatografiei în fază inversată perechi-ionice. Astfel, folosind o fază mobilă ce conţinea 5 mm acid heptan-sulfonic (ph 5,6) s-a rezolvat separarea citozinei şi 5- metilcitozinei. Separarea nucleozidelor şi a bazelor azotate corespunzătoare a fost realizată şi pe coloane de silicagel nemodificat, folosind amestecuri de diclormetan, metanol şi tampoane în mediu apos. Solubilitatea scăzută a nucleozidelor în astfel de sisteme a redus aplicabilitatea la probe foarte diluate. Analiza unor baze azotate purinice şi pirimidinice prin cromatografie în fază inversată Coloana PHRP Polymer Reverse Phase Column, 150 x 4.6mm Faza mobilă 0,1N Formiat de amoniu: acetonitril 100:1 Gradient Nu Viteza 1 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@254 nm Proba 1. citozină 2. uracil 3. hipoxantină, guanină, xantină 4. adenină 5. timină 125

128 N UCLEOTIDE Nucleozidele joacă un rol vital un majoritatea sistemelor biologice, nu numai ca precursori ai ADN şi ARN dar şi ca regulatori metabolici. Prin urmare, cuantificarea şi analiza HPLC a nucleozidelor în fluidele biologice pot să furnizeze informaţii preţioase asupra funcţiei lor. Analiza componentelor majore şi minore ale ADN şi ARN este cel mai convenabil realizată la nivelul nucleozidelor 1. În trecut, separările HPLC ale nucleozidelor se realizau în diferite moduri, inclusiv cromatografia schimbătoare de anioni 2 sau de cationi 1. Totuşi, în ultima vreme se foloseşte tot mai mult cromatografia în fază inversată. Condiţiile cromatografice tipice pentru separarea nucleozidelor includ folosirea de tampoane fosfat diluate, cu modificatori organici ca metanolul sau acetonitrilul pe faze staţionare ODS. Analiza unor nucleozide prin cromatografie în fază inversată Coloana phrp Polymer Reverse Phase Column, 150 x 4.6mm Faza mobilă 0,1N Formiat de amoniu: acetonitril 100:1 Gradient Nu Viteza 1 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@254 nm Proba: 1. citidină 2. uridină 3. inozină 4. (10 μl) guanozină 5. xantozină 6. timidină 7. adenozină 1 Davis, G.E., Gehrike, C.W., Kuo, K.C., Agris, P.F., J. Chromatogr., 173 (1979) Floridi, A., Palmerini, C.A., Fini, C.,. J. Chromatogr., 138 (1977)

129 ... V ASILE O STAFE..... Efectul ph-ului Variaţia ph-ului între 4 şi 8 nu influenţează major timpii de retenţie ai nucleotidelor. Există o uşoară tendinţă de mărire a timpilor de retenţie pe măsură ce ph-ul creşte, dar efectele sunt mai vizibile la nucleozidele al căror pk' se află în acest domeniu de ph 2. De exemplu, 3-metilcitidina, 5-metilcitidina, 1- metiladenozina, adenozina şi 7-metilguanozina au următoarele valori de pk' a 8,7; 4,3; 7,6; 3,5 şi respectiv 7,1 şi prin urmare timpii lor de retenţie se vor schimba disproporţional, pe măsură ce câştigă sau pierd sarcina lor. Deci, ph-ul poate fi folosit pentru a se modifica selectivitatea sistemului cromatografic. Efectul modificatorului organic Creşterea concentraţiei solventului organic în faza mobilă de la 0 la 100% scade retenţia nucleotidelor comune într-o manieră logaritmică. Nucleotidele au fost împărţite în patru grupe în funcţie de răspunsul lor faţă de creşterea concentraţiei metanolului; în interiorul fiecărei grupe există o mică variaţie a selectivităţii 3. Efectul Temperaturii Timpii de retenţie ai nucleozidelor scad ca o funcţie liniară odată cu creşterea temperaturii pe domeniul 25-55ºC. Eficienţa coloanei creşte odată cu creşterea temperaturii. Folosirea cromatografiei de afinitate cu acid boronic s-a dovedit a fi utilă pentru separarea ribonucleozidelor şi ribonucleotidelor, care conţin grupări 2',3'-cisdiol de moleculele ce nu conţin hidroxili vicinali cum sunt dezoxiribonucleozide şi nucleozidele 2',3'-ciclic-fosfaţi. La ph alcalin moleculele ce conţin grupări hidroxil 1 Breter, H.J., Seibert, G., Zahn, R.K., J. Chromatogr., 140 (1977) Ostafe, V., Chiriac., A., Jastorff, B., Annals of Western University of Timisoara, ser.chim. 4 (1995) Gehrke, C.W., Kuo, K.C., Zumwalt, R.W., J. Chromatogr., 188 (1980)

130 N UCLEOTIDE vicinale vor forma un complex cu grupările boronat de pe faza staţionară 1. Prin scădere ph-ului fracţiile adsorbite pot fi eluate iar tampoanele volatile sunt apoi îndepărtate pentru a se permite liofilizarea probelor 2. Tehnica a fost adaptată pentru folosirea coloanelor HPLC prin ataşarea de grupări benzen-boronice prin intermediul unor braţe spaţiatoare 3. Există şi suporturi comerciale gata preparate, cum ar fi Bio-Rad Affi-Gel 601. Separarea de Nucleozide din probe biologice Relativ puţine articole au raportat estimări ale nucleozidelor în celulele animale folosind HPLC. Totuşi, starea metabolică a celulelor poate fi determinată în acest fel şi monitorizată evoluţia unor boli. În prezenţa unor cantităţi mari de nucleotide (ca în cazul celulelor inimii) determinarea nucleozidelor poate fi realizată după o purificare pe un schimbător de anioni. Separarea nucleotidelor poate fi apoi realizată prin cromatografie în fază inversată. Majoritatea moleculelor de ADN, atât de origine procariotă sau eucariotă, conţin unele baze minore metilate ca produşi ai unor procese post-replicaţionale. 5- Metilcitozina şi N 6 -metiladenina apar adesea în procariote, pe când în eucariotele superioare apare doar primul dintre ele 4. Conţinutul acestor baze minore variază între 0,05% şi 7% în funcţie de organism. Metilarea ADN prin diferiţi agenţi este suspectată a fi implicată în formarea tumorilor şi prin urmare determinarea nucleozidelor metilate în probele de ADN este foarte importantă. Metodele bazate 1 Hageman, J.H., Kuehn, G.D., Anal. Biochem., 80 (1977) Buck, M., Connick, M., Ames, B.N., Anal. Biochem., 129 (1983) Glad, M., Ohlsen, S., Hansson, L., Mansson, M.-O, Mosbach, K., J. Chromatogr., 200 (1980) Hall, R.H., in "The Modified Nucleosides in Nucleic Acids", Columbia University Press, New York, NY, 1971, p

131 ... V ASILE O STAFE..... pe cromatografia pe hârtie şi strat subţire au fost treptat înlocuite cu cromatografia de schimb ionice şi HPLC în fază inversată. Analiza unor nucleozide prin cromatografie în fază inversată Coloana Zorbax TMS (6 μm, 250 x 4,6 mm) Faza 2% metanol în 4 mm fosfat de mobilă amoniu monoacid şi 4 mm fosfat de amoniu diacid, ph 4,0 Gradient Nu Viteza 1 ml min 1 volumetrică Temperatura 35ºC Detecţie UV@254 nm Proba: 1. Citidină, 2. Dezoxicitidină, 3. Inozină, 4. Guanozină 5. 5-Metildezoxicitidină, 6. Dezoxiinozină, 7. Dezoxiguanozină, Metilguanozină, 9. Timidină, 10. Adenozină, Metilguanozină, Metildezoxiguanozină, Metiladenozină, Metildezoxiguanozină, 15. 2,2-dimetilguanozină, Metiladenozină, 17. 2,2-Dimetildezoxiguanozină, Metildezoxiadenozină. Componentele majore şi minore ale ADN pot fi separate prin eluare izocratică pe o coloană de trimetilsilan (Zorbax TMS). Practic în 14 minute marea majoritate a componentelor sunt eluate. 129

132 N UCLEOTIDE Baze modificate apar în mod natural în multe tipuri de ARN şi în mod particular în ARNt, unde pot reprezenta 25% din numărul total al nucleozidelor. Bazele minore apar în ARNt prin modificări post-transcripţionale, dar funcţia lor nu este clară. Deoarece nucleozidele modificate nu sunt salvate prin procesele naturale, cuantificarea lor în probele biologice poate fi considerată o modalitate de monitorizare a anomaliilor metabolice ale acizilor nucleici. Eliberarea componentelor nucleozidelor din ARNt se poate realiza prin hidroliză cu nucleaza P1 şi fosfatază alcalină. Nucleotidele sintetice şi-au găsit interesante aplicaţii în tratamentul diferitelor boli. De exemplu, nucleozidele pirimidinice 5-substituite sunt folosite ca agenţi antivirali, iar arabinocitidina este folosită în terapia cancerului. Cuantificarea acestor compuşi şi a metaboliţilor lor în probele biologice este esenţială pentru optimizarea tratamentelor. Separarea amestecurilor de ribozil, dezoxiribozil şi arabinozil-purine se poate realiza fără folosirea acidului periodic sau a acidului boric. Nucleotidele joacă un rol central în reglare căilor metabolice şi cuantificarea lor în probele biologice are o foarte mare importanţă practică. Există o mare varietate de nucleotide (de exemplu cele patru nucleozide majore şi derivaţii lor mono-, di-, tri- tetra- sau ciclic-fosfaţi) şi separarea, identificarea şi cuantificarea lor este dificilă deoarece ele sunt foarte similare din punct de vedere fizico-chimic. Influenţa chimică dominantă provine din prezenţa grupărilor fosfat care sunt ionizate pe un domeniu larg de ph, motiv pentru care multe separări de nucleotide s-au realizat prin cromatografie de schimb ionic. Totuşi, actualmente există o tendinţă tot mai mare de a se folosi cromatografia în fază inversată pentru separarea nucleotidelor datorită mai marii flexibilităţi şi a opţiunilor în alegerea fazei mobile în acest tip de cromatografie 1. 1 Brockstedt, U., Pfau, W., Chromatographia., 50 (1999)

133 ... V ASILE O STAFE..... HPLC schimb ionic Tipic, nucleotidele pot fi separate pe un schimbător puternic de anioni, cum este Partisil 10-SAX, folosind ca fază mobilă un tampon ce conţine acid fosforic. De exemplu, pe o coloană Partixil 10-SAX folosind un gradient de la 0,007 M KH 2 PO 4 (ph 4,0) la 0,25 M KH 2 PO 4 (ph 4,5) pe o perioadă de 80 minute s-au separat mono-, di-, şi trifosfaţii adenozinei, citozinei, guanozinei, inozinei, uridinei şi timidinei 1. Selectivitatea cromatografiei de schimb-ionic pentru separările de nucleotide este puternic influenţată de modificările de ph ale fazei mobile şi prin urmare acesta poate fi modificat pentru a se asigura separarea corespunzătore a amestecului analizat 2. Cea mai bună selectivitate se obţine la valori de ph între 3,5 şi 5,5 3. În cazul separărilor preparative se recomandă folosirea unui tampon volatil cum ar fi carbonatul de amoniu sau acetatul de amoniu 4. Analiza unor nucleotide prin cromatografie de schimb ionic Coloana Partisil 10-SAX (250 x 4,6 mm) Faza mobilă Gradient Tampon A: 7 mm fosfat monosodic, ph 3,8; tampon B: 250 mm fosfat monosodic, ph 4,5 A pentru 6 min; gradient linear pentru 30 min; B pentru 10 min. 3 ml min 1 Viteza volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@254 nm Proba: 1. CMP, 2. AMP 3. UMP, 4. GMP; 5. 5-UDP, 6. CDP, 7. ADP, 8. GDP, 9. UTP, 10. CTP, 11. ATP, 12. GTP 1 Hartwick, R.A., Brown, P.R., J. Chromatogr., 112 (1975) Kmiec, Z., Smolenski, R.T., Zych, M., Mysliwski, A., Acta Biochim. Pol., 47 (2000) Ericson, A., Niklasson, F., De Verdier, C.-H., Clin. Chim. Acta, 127 (1983) Linz, U, J. Chromatogr., 260 (1983)

134 N UCLEOTIDE HPLC în fază inversată La valori de ph folosite în mod uzual în cromatografia în fază inversată nucleotidele sunt încărcate negativ şi acest mod de cromatografie este folosit mai ales pentru "separări de grup" în care proba conţine componente ce diferă mult între ele în ce priveşte proprietăţile lor fizico-chimice. Nucleotidele individuale nu sunt reţinute pe fazele staţionare în cromatografia în fază inversată 1. Folosirea apei ca fază mobilă face ca nucleotidele monofosforilate în poziţiile 2' sau 3' să fie eluate în void, iar nucleotidele ciclice (AMPc) sunt slab reţinute. Creşterea tăriei ionice a fazei mobile (adăugare de acid fosforic la tamponul de eluare) duce la creşterea reţinerii nucleotidelor individuale şi rezolvarea lor. Prin adăugarea de modificator organic (metanol, acetonitril) în concentraţii mici (5 10%) la tamponul fosfat (ph 5) se creşte rezoluţia separării, cu menţinerea unei linii de bază stabilă 2. Analiza unor nucleotide prin cromatografie în fază inversată Coloana Ultrasphere 5μm ODS (250 x 4,6 mm) Faza mobilă 0,05 M fosfat diacid de amoniu, ph 5,0 în metano-apă (10:90) Gradient Nu Viteza 1,9 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@254 nm Proba: 1. 5'-ATP şi 5'-ADP, 2. 5'-AMP 3. 2'-AMP, 4. 2',3'-AMPc, 5. 3'- AMP, 6. 3',5'-AMPc, 7. Adenoziă 1 Brockstedt, U., Pfau, W., Chromatographia., 50 (1999) Debetto P., Bianchi, V., J. High Res. Chromatogr. Commun., 6 (1983)

135 ... V ASILE O STAFE..... HPLC în fază inversată perechi-ionice HPLC în fază inversată 1 are în mod evident multe limitări (retenţie redusă şi rezoluţie slabă) în cazul separării nucleotidelor, datorită faptului că majoritatea nucleotidelor prezintă sarcini negative la valorile de ph folosite în mod normal în acest tip de cromatografie. Aceste probleme pot fi eliminate prin adăugarea unui reactiv ce formează perechi-ionice cu nucleotidele 2. Astfel, folosirea unui gradient de fază mobilă ce conţinea sulfat monoacid de tetra-n-burtilamoniu s-a reuşit separarea a 12 nucleotide 3. O comparaţie între cromatografia de schimb ionic şi cea în fază inversată perechi-ionice indică faptul că nucleotidele sunt mai bine separate prin ce-a de-a doua metodă. În cazul analizei nucleotidelor din celulele bacteriene rezoluţia obţinută a permis analiza efectelor condiţiilor de creştere asupra nivelului intracelular a nucleotidelor 4. Condiţiile optime pentru separarea nucleotidelor folosind cromatografia în fază inversată perechi ionice folosesc ca fază mobilă tamponul fosfat ( mm) ce conţine fosfat de tetrabutilamoniu (0,5 2,0 mm). Concentraţii mai mari de 2,0 mm a contra-ionului duce la creşterea pronunţată a timpilor de retenţie fără a se îmbunătăţi rezoluţia. Prin adăugarea unui solvent organic (în special acetonitril) se reduce timpii de retenţie fără a se afecta semnificativ rezoluţia. Variaţia ph-ului fazei mobile poate duce la modificarea selectivităţii nucleotidelor înrudite structural. 1 Su, Y., Hen, Y.Y., Chu, Y.Q., Van de Poll, M.E.C., Relling, M.V., J. Chromatogr. B., 732 (1999) Monkkonen, H., Moilanen, P., Monkkonen, J., Frith, J.C., Rogers, M.J., Auriola, S., J. Chromatogr. B. 738 (2000) Hoffman, N.E., Liao, J.C., Anal. Chem., 49 (1977) Payne, S.M., Ames, B.N., anal Biochem., 123 (1982)

136 N UCLEOTIDE Analiza unor nucleotide prin HPLC în fază inversată perechi-ionice Coloana Ultrasphere 5μm ODS (250 x 4,6 mm) Faza mobilă Tampon A: 5 mm fosfat de tetrabutilamoniu, 4% acetonitril şi 50 mm fosfat diacid de potasiu, ph 6,0 Gradient 0 40% B pe o perioadă de 60 min. Viteza 1,5 ml min 1 volumetrică Temperatura Detecţie Proba: Camerei UV@254 nm 1. 5'-ATP şi 5'-ADP, 2. 5'-AMP 3. 2'-AMP, 4. 2',3'-AMPc, 5. 3'- AMP, 6. 3',5'-AMPc, 7. Adenoziă HPLC fază normală Nucleotidele naturale sunt prea polare pentru a putea fi separate corespunzător prin cromatografia în fază normală, dar nucleotidele modificate chimic, care sunt folosite ca precursori pentru sinteza ADN, sunt mult mai puţin polare. În aceste molecule sintetice situsurile reactive sunt blocate şi per ansamblu moleculele sunt neutre, cu un caracter hidrofob destul de pronunţat. În aceste cazuri se poate folosi şi cromatografia în fază normală 1, dar datorită avantajelor legate de uşurinţa dezvoltării metodei, cromatografia în fază inversată este de preferat. În plus, faţă de cromatografia în fază normală, ea are o serie de avantajele cum ar fi selectivitatea şi rezoluţia foarte bună 2. 1 Seliger, H., Bach, T.C., Gortz, H.H., Harpp, E., Holluirek, M., Seemann-Preising, B., Schiebel, H.M., Schulten, H.R., J. Chromatogr., 253 (1982) Wei, Y.N., Marino, M., Thompson, B., Girard, J.E., J. Chromatogr. A., 864 (1999)

137 ... V ASILE O STAFE..... Purificarea atât a materialelor genetice naturale cât şi cele sintetice este de importanţă fundamentală pentru cercetarea ADN recombinant 1. De exemplu, generarea fragmentelor de ADN de restricţie prin digestia enzimatică iniţială şi purificarea ulterioară permite analiza secvenţelor sau a produsului de recombinare genetică ce urmează a fi obţinut 2. În plus, separarea preparativă a fracţiilor de ARNm este foarte importantă pentru producerea şi clonarea secvenţelor complementare de ADN 3. De asemenea, de mare importanţă practică este separarea oligonucleotidelor de produşii secundari în procesul de sinteză chimică a acizilor nucleici. Caracteristica predominantă a acizilor nucleici în soluţii apoase este natura lor ionică datorită grupărilor fosfat, făcând din aceste molecule candidaţi ideali pentru separarea prin cromatografie de schimb ionic. Se folosesc şi separările în fază inversată, care se bazează pe natura slab hidrofobă a bazelor azotate din structura acizilor nucleici. Deoarece acizii nucleici naturali apar în clase distincte din punctul de vedere al maselor moleculare (între ARN ribozomal şi ARN de transfer) în multe situaţii se poate aplica cu succes cromatografia de cernere moleculară. HPLC DE SCHIMB IONIC Separarea acizilor nucleici folosind schimbători anionici puternici ca faze staţionare este o metodă mult folosită 1. Separările depind de încărcarea moleculelor şi de interacţia lor cu grupările amoniu terţiare ataşate de suportul de silicagel. Metoda este îndeosebi utilă pentru separarea moleculelor relativ mici 1 Shaw-Bruha, C.M., Lamb, K.A., Biotechniques., 28 (2000) Jiang, P.H., Chany-Fournier, F., Chany, C., Biochimie., 81 (1999) Topp, H., Schoch, G., Pediatr. Res., 47 (2000)

138 N UCLEOTIDE (oligonucleotide ce conţin mai puţin de 25 nucleotide) 2, deoarece rezoluţia relativă a între termenii n şi n+1 descreşte cu creşterea lungimii lanţului (n). forţele hidrofobe dintre solut şi gruparea terţiară de amoniu a fazei staţionare pot să influenţeze separarea dar pot fi minimizate prin adăugarea unui solvent organic la faza mobilă apoasă. Trebuie avut în vedere şi faptul că recuperarea moleculelor lungi de pe coloanele schimbătoare de anioni este relativ redusă datorită legărilor ireversibile cu faza staţionară. Deşi tampoanele fosfat dau bune rezultate, în separările preparative ale oligodezoxiribonucleotidelor, unde se impune eliminarea sărurilor, trebuie avut în vedere folosirea unor săruri volatile pentru obţinerea fazelor mobile. Mai mult, în cazul tampoanelor fosfat pot apărea probleme asociate interacţiilor intra şi intermoleculare (legături de hidrogen). Eliminarea acestora poate fi realizată prin adăugarea în faza mobilă a formamidei 3 sau a acetatului de trietilamoniu care poate fi eliminat prin liofilizare şi în care aceste interacţii moleculare sunt limitate. Modificarea in situ a silicagelului cu polietilenimină a indicat o creştere a rezoluţiei ce a permis separarea oligonucleotidelor lungi de până la 35 nucleotide 4. Introducerea schimbătorilor de ioni sub formă de microparticule cu pori mari a extins utilizarea HPLC schimb ionic pentru molecule de până la 500 nucleotide, cum sunt fragmentele de ADN 5. O comparaţie a cromatografiilor de schimb ionic, fază inversată şi fază inversată perechi-ionice pentru separarea fragmentelor mici de oligonucleotide a indicat că cea mai bună rezoluţie se obţine în cazul schimbului ionic, deşi timpul de viaţă al coloanelor pare să fie destul de redus 6. 1 McLaughlin, V.L:, Romanuik, E., Anal. Biochem., 124 (1982) Sato, H., Akama, K., Kojima, S., Miura, K., Sekine, A., Nakano, M., Protein Expr. Purif., 16 (1999) Newton, C.R., Greene, A.R., Heathcliffe, G.R., Atkinson, T.C., Holland, D., Markham, A.F., Edge, M.D., Anal. Biochem., 129 (1983) Pearson, J.D., Regnier, F.E., J. Chromatogr., 255 (1983) Kato, Z., Nakamura, K., Hashimoto, T., J. Chromatogr., 266 (1983) Haupt, W., Pingoud, A., J. Chromatogr., 260 (1983)

139 ... V ASILE O STAFE..... Analiza unor oligonucleotide prin HPLC schimb ionic Coloana Partisil 10 SAX (500 x 9,4 mm) Faza mobilă Tampon A: 1 M acetat de trietilamoniu, ph 4,9; tampon B: 4 M tampon A. Gradient 0 100% B pe o perioadă de 30 min. Viteza 3,0 ml min 1 volumetrică Temperatura 50ºC Detecţie UV@254 nm Proba: Un amestec de oligonucleotide rezultat în urma unei sinteze chimice. Peak-ul X corespunde unei oligonucleotide ce conţine 19 nucleotide. HPLC ÎN FAZĂ INVERSATĂ Retenţia oligonucleotidelor în cromatografia în fază inversată este dependentă de interacţiile hidrofobe dintre bazele azotate şi faza staţionară. Deoarece aceste interacţii independente de natura bazelor, retenţia este determinată de sarcina relativă a moleculelor 1. Cu cât această încărcare este mai mare cu atât eluarea are lot mai rapid. Separarea ribo- şi dezoxiribonucleotidelor se poate realiza folosind un gradient linear de acetonitril sau metanol e la 5% la 30% într-un tampon diluat de acetat de trietilamoniu, la ph 7,5 2 Cromatografia în fază inversată poate fi utilizată la separarea oligonucleotidelor sintetizate chimic, lăsând în mod deliberat o grupare protectoare hidrofobă pe oligonucleotida de interes, care în acest fel va fi reţinută puternic şi va 1 Huber, C.G., Krajete, A., Anal. Chem., 71 (1999) Schott, H., Mezer, H.D., Bazer, E., J. Chromatogr., 280 (1983)

140 N UCLEOTIDE putea fi separată de ceilalţi produşi de reacţie, mult mai polari. Ulterior, structura naturalăpoate fi regenerată prin îndepărtarea chimică a grupării hidrofobe protectoare 1. HPLC ÎN FAZĂ INVERSATĂ PERECHI-IONICE În cromatografia în fază inversată perechi-ionice sarcinile negative ale grupărilor fosfat ale oligonucleotidelor sunt neutralizate prin adăugarea ionilor încărcaţi pozitiv de alchilamoniu 2. Cromatografierea se realizează pe o fază staţionară tip ODS. Metoda a fost aplicată şi pentru determinarea lungimii oligonucleotidelor după digestia enzimatică iniţială cu o fosfodiesterază 3. HPLC DE EXCLUDERE MOLECULARĂ În general, HPLC de excludere moleculară nu este folosită pentru separarea oligonucleotidelor ce conţin mai puţin de 100 de baze datorită rezoluţiei scăzute în comparaţie cu cromatografia de schimb ionic sau cea în fază inversată 4. Totuşi, cromatografia de excludere moleculară a fost utilizată pentru separarea moleculelor mari 5, cum ar fi ARNt, ARNr şi fragmente de ADN, cu toate că electroforeza în gel de poliacriamidă este preferată pentru astfel de separări. 1 Ike, Z., Ikuta, S., Sato, M., Huang, T., Itakura, K., Nucleic Acids Res., 11 (1983) Huber, C.G., Krajete, A., Anal. Chem., 71 (1999) Crwother, J.B., Caronia, J.P., Hartwick, R.A., Anal.Biochem., 124 (1982) Bijsterbosch, M.K., Rump, E.T., De Vrueh, R.L.A., Dorland, R., van Veghel, R., Tivel, K.L., Biessen, E.A.L., van Berkel, T.J.C., Manoharan, M., Nucleic Acids Res., 28 (2000) Graeve, L, Goemann, W., Foldi, P., Kruppa, J., Biochem. Biophys., Res. Commun., 107 (1982)

141 L II P II D E Lipidele sunt biomolecule insolubile în apă, ce se pot extrage din celule cu ajutorul solvenţilor nepolari (cloroform, benzen, eter, etc.). Există mai multe clase şi subclase care cuprind o mare varietate de compuşi, numiţi generic lipide. Deşi diferite structural, toate îşi datoresc proprietăţile lor caracteristice naturii de hidrocarbură pe care o are cea mai mare parte din structura lor. Lipidele au câteva funcţii biologice importante printre care includem 1 : Componente structurale ale membranelor biologice; Forme de depozitare şi transport al combustibilului metabolic; Înveliş protector al suprafeţei multor organisme şi al pereţilor celulari ai unor bacterii; Componente ale suprafeţei celulare implicate în recunoaşterea celulară, specificitatea de specie şi imunitatea tisulară; Coenzime în reacţii enzimatice. 1 Ostafe, V., Să Învăţăm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptivă, Ed. Brumar, Timişoara, 1999

142 L IPIDE Deşi există şi ca molecule libere, lipidele pot fi combinate, fie covalent, fie prin legături slabe, cu compuşi din alte clase de biomolecule, formând molecule hibride, cum ar fi glicolipidele şi lipoproteinele. Fiind o clasă foarte eterogenă, nici un tip de clasificare nu este perfect. Simplist, putem clasifica lipidele în lipide complexe (care în urma hidrolizei alcaline eliberează săruri ale acizilor graşi, operaţie numită şi saponificare) şi lipide simple care nu conţin acizi graşi (şi deci nu sunt saponificabile). Până de curând gaz cromatografia a fost cea mai folosită metodă pentru identificarea şi cuantificarea acizilor graşi. Datorită apariţiei unor metode de derivatizare simple şi sigure şi mai ales a unor detectoare HPLC foarte sensibile (PDA, MS 1 ), tehnicile HPLC sunt tot mai mult folosite pentru determinarea acizilor graşi din probe complexe. Metoda cea mai folosită este cromatografia în fază inversată cu sau fără derivatizare pre-coloană. Alternativ s-e foloseşte şi tehnica argintării, în special pentru separarea izomerilor geometrici şi de poziţie a acizilor graşi polinesaturaţi. În cazul cromatografiei în fază inversată 2 se folosesc suporturile fenil sau C18 (ODS), cu excepţia unor cazuri izolate când se utilizează suporturi cu braţe alchil mai scurte. Faza mobilă cel mai des folosită este fie amestec metanol - apă fie acetonitril - apă. Uneori se adaugă şi tetrahidrofuran. Mai jos se prezintă separarea unui amestec complex de acizi graşi pe o coloană cu grupări fenil legate covalent de matrice. Separarea se realizează în ordinea creşterii numărului atomilor de carbon. Acizii graşi nesaturaţi eluează înaintea analogilor saturaţi. Pentru un anumit număr de atomi de carbon şi o 1 Giuffrida, A., de Fonseca, F.R., Piomelli, D., Anal. Biochem., 280 (2000) Browne, R.W., Armstrong, D., Clin. Chem., 46(2000)

143 ... V ASILE O STAFE..... configuraţie a catenei, cu cât nesaturarea este mai mare cu atât eluarea se face mai repede. Separarea acizilor graşi prin cromatografie în fază inversată Coloana Free Fatty Acid HP (fenil) (4 μm, 150 x 3.9) Faza mobilă CN 3 CN:THF:H 2 O 45:20:55 Gradient Nu Viteza 0,5 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie Indice de refracţie Proba 1. Acid capric, 2. Acid lauric, 3. Acid miristic, 4. Acid palmitic, 5. Acid stearic, 6. Acid nonadecanoic, 7. Acid arahidic, 8. Acid heneicosanoic, 9. Acid behenic. Separarea acizilor graşi prin cromatografie în fază inversată Coloana Radial Pak C18 (5 μm, 100 x 8) Faza mobilă CN 3 CN:H 2 O: AcOH 89:11:0,2 Gradient Nu Viteza 1,0 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@214 nm Proba 1. acid eicosapentaenoic 20:5,Δ 5,8,11,14,17, 2. acid arahidonic 20:4,Δ 5,8,11,14, 3. acid eicosatrienoic 20:3,Δ 8,11,14, 4. acid eicosatrienoic 20:3,Δ 11,14,17, 5. acid eicosadienoic 20:2,Δ 11,17, 6. acid eicosaenoic 20:1,Δ

144 L IPIDE În figura de mai sus se prezintă separarea a 6 acizi graşi cu 20 atomi de carbon, ce diferă prin numărul şi poziţia dublelor legături, pe o coloană ODS. După cum se constată, peak-urile 3 şi 4 nu sunt separate. Prin modificarea fazei mobile şi a vitezei volumetrice, se pot separa şi cei doi acizi eicosatrienoici. Separarea acizilor graşi prin cromatografie în fază inversată Coloana Radial Pak C18 (5 μm, 100 x 8) Faza mobilă CN 3 CN:H 2 O: AcOH 80:20:0,2 Gradient Nu Viteza 2,0 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@214 nm Proba 3. acid eicosatrienoic 20:3,Δ 8,11,14, 4. acid eicosatrienoic 20:3,Δ 11,14,17 Similar cu coloana fenil şi în cazul coloanei ODS separarea acizilor graşi se realizează în ordinea inversă a saturării. Cu cât gradul de nesaturare a acizilor graşi a fost mai mare cu atât timpul de retenţie a fost mai mic. Prin variaţia polarităţii fazei mobile s-au putut separa şi izomerii de poziţie 1. Detectoarele cele mai frecvent folosite pentru monitorizarea acizilor graşi nederivatizaţi eluaţi sunt detectorul indice de refracţie 2 şi detectoarele UV la lungimi de undă mici 3. Când natura probei cere o sensibilitate mărită se recurge la derivatizarea pre- şi post-coloană 1. 1 Batta, A.K., Dayal, V., Colman, R.W., Sinha, A.K., Shefa, S., Salen, G., J. Chromatogr., 284 (1984) Bailie, A.G., Wilson, T.D., O'Brien, R.K., Beebe, J.M., McCosh-Lilie, E.J., Hill, D.W., J. Chromatogr. Sci., 20 (1982) Van Rollins, M., Aveldano, M.I., Sprecher, H.W., Horrocks, L.A., Methods, Enzymol., 86 (1982)

145 ... V ASILE O STAFE..... Printre reactivii cel mai des folosiţi pentru derivatizare pre-coloană a acizilor graşi menţionăm: derivaţii benzil 2, de 2-naftacil 3, de o- şi p-nitrobenzil 4, de fenacil 5, de p-bromofenacil 6, de metoxifenacil 7, de 1-naftilamidă 8, etc. Derivaţii de nitrobenzil, fenacil, p-bromofenacil, metoxifenacil, 1-naftilamida pot fi monitorizaţi cu detectoarele UV la 254 nm, cu sensibilităţi până la 4 ng acid gras. Derivaţii de 2- naftacil pot fi detectaţi prin fluorescenţă, cu lungimea de undă de excitare la 290 nm şi emisie la 450 nm 9. Cromatografierea derivaţilor acizilor graşi se realizează, de obicei, tot pe coloane ODS cu faza mobilă metanol - apă sau acetonitril - apă. În acest caz concentraţia modificatorului organic este mai mare decât în cazul cromatografiei acizilor graşi nederivatizaţi. Ordinea de eluarea a acizilor graşi derivatizaţi este aceeaşi cu cea observată la speciile nederivatizate, adică timpul de retenţie creşte odată cu lungimea lanţului atomilor de carbon şi descreşte odată cu creşterea gradului de nesaturare. Deşi mult mai puţin folosite şi alte tehnici HPLC sunt uneori utilizate. De exemplu, pentru separarea p-bromofenacil esterilor acizilor graşi cu catenă scurtă din artropode s-a folosit cromatografia în fază normală, cu silicagel ca fază staţionară şi eluare cu un gradient de amestec de cloroform - hexan 10. Cromatografia de argintare a fost utilizată pentru separarea izomerilor geometrici ai 1 Akasaka, K., Ohrui, H., Biosci. Biotechnol. Biochem., 63 (1999) Polizer, I.R., Griffin, G.W., Dowty, B.J., Laseter, L., Anal. Lett., 6 (1983) Cooper, M.J., Anders, M.W., Anal. Chem., 46 (1974) Knapp, D.R., Krueger, S., Anal. Lett., 8 (1985) Borch, R.F., Anal. Chem., 47 (1975) Durst, H.D., Milano,H., Kikta, E.J., Connelllz, S.A., Grushka, E., Anal. Chem., 47 (1975) Miller, R.A., Bussell, N.E., Riketts, C., J. Liq. Chromatogr., 1 (1978) Ikeda, M., Shimada, K., Sakaguchi, T., J. Chromatogr., 272 (1983) Distler, W., J. Chromatogr., 192 (1980) Weatherston, J., MacDonald, L.M., Blake, T., Benn, M.H., Yuang, Y.Y., J. Chromatogr., 161 (1978)

146 L IPIDE esterilor metil ai acizilor graşi 1. În acest caz faza staţionară a fost o coloană de silicagel echilibrată cu soluţie diluată de azotat de argint. Faza mobilă a fost haxanul, la care s-a adăugat o mică cantitate dintr-un modificator organic mai polar şi anume acetonitrilul. Această clasă de compuşi include mono-, di- şi triacilglicerolii, compuşi la care grupările hidroxil ale moleculei de glicerină au fost esterificate cu una, două, respectiv trei molecule de acid gras. Tehnica cromatografică cel mai des folosită pentru separarea speciilor individuale de acilgliceroli este cromatografia în fază inversată 2, deşi iniţial s-a folosit cromatografia în fază normală. Un exemplu interesant de separare prin HPLC fază normală, utilizând silicagelul ca fază staţionară, a unui amestec complex de lipide neutre este prezentat în figura următoare. Toate speciile de acilgliceroli au fost separate de steroli, esteri steroidici, esteri triterpenici şi acizi graşi liberi. Faza mobilă pentru separare a fost un gradient, care la momentul iniţial conţinea toluen - hexan (1:1) şi în final se ajungea la toluen - acetat de etil (3:1) plus 1,2% acid formic. Peak-urile eluate au fost analizate cu un detector de ionizare în flacără cu fir colector 3. Detecţia se poate realiza şi cu detector indice de refracţie, dar limita de detecţie este în domeniul 0,5-1 Scholfield, C.R., J. Am. Oil Chem. Soc., 56 (1979) Blaha, V., Solichova, D., Cernohorsky, D., Bratova, M., Vyroubal, P., Zadak, Z., J. Pharm. Biomed. Anal., 22 (2000) Hammond, E.W.,J. Chromatogr., 203 (1981)

147 ... V ASILE O STAFE ,0 μg per peak. S-au raportat separări prin faza normală a lipidelor serice 1, din uleiul de soia sau linte 2 sau a unor amestecuri complexe de acilgliceroli 3 şi acizi graşi 4. În ultimul caz faza mobilă a fost 2,2,4-trimetilpentan - tetrahidrofuran - acid formic (90:10:0,5). Separarea acilglicerolilor prin cromatografie în fază normală Coloana Lichrosorb Si60 (5 μm, 100 x 4 mm) Faza mobilă A: toluen - hexan (1:1) B: toluen - acetat de etil (3:1) plus 1,2% acid formic Gradient Conform schemei Viteza 1,5 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie Proba Ionizare în flacără cu fir transportor MG - mongliceride, DG - digliceride, FFA - acid gras liber, TG - trigliceride În figura următoare se prezintă un exemplu de HPLC cu argintare. Sistemul a permis separarea unor izomeri de poziţie ai triacilglicerolilor. Faza staţionară, silicagel perlat, a fost echilibrată cu azotat de argint 10%. Faza mobilă a fost benzenul sau toluenul. Rezoluţia coloanei pare să se îmbunătăţească pe măsură ce 1 Aitzetmuller, K., Koch, J., J. Chromatogr., 145 (1978) Plattner, R.D., Payne-Wahl, K., Lipids, 14 (1979) Retterstol, K., Haugen, T.B., Christophersen, B.O., BBA-Mol. Cell. Biol. Lipids., 1483 (2000) Greenspan, M.D., Schroeder, E.A., Anal. Biochem, 127 (1982)

148 L IPIDE temperatura scade, motiv pentru care experimentele s-au realizat la temperatura de 6ºC. Separarea triacilglicerolilor prin cromatografie în fază normală Coloana Partisil (10 μm, 250 x 4 mm) saturată cu 10% AgNO 3. Faza mobilă Toluen Gradient Nu Viteza 1,0 ml min 1 volumetrică Temperatura 6ºC Detecţie Indice de refracţie Proba SSS - trisaturaţi, SES - 2-elaido- 1,3-distearina, SOS - 2-mononesaturat, SSO - 3-mononesaturat, PLP - 2-linoleoil-1,3-dipalmitoilglicerol, -SOO - 2,3-dinesaturat. În cazul folosirii cromatografiei în fază inversată eluarea se realizează, de obicei cu amestecuri de acetonă-acetonitril 1. Ocazional s-au raportat şi folosirea amestecurilor acetonitril - tetrahidrofuran - hexan (224:123,2:29,6; m/m/m) 2, clorură de metilen - acetonitril (40:60), tetrahidrofuran - acetonitril (40:60) 3, proprionitril - acetonitril 4 (proprionitrilul trebuie distilat pe pentaoxid de fosfor pentru a se îndepărta impurităţile alcaline), metanol - 2-propanol (3:1) plus 0,05 N clorură de argint 5, etc. În aceste sisteme, separarea trigliceridelor individuale s-a realizat în funcţie de lungimea acizilor graşi esterificaţi şi a gradului de nesaturare. Cu cât lungimea acizilor graşi este mai mare cu atât şi timpii de retenţie sunt mai 1 Tsimidou, M., Macrae, R., J. Chromatogr., 285 (1984) Jensen, P., J. Chromatogr., 204 (1981) Parris, N.A., J. Chromatogr., 157 (1978) Marai, L., Myher, J.J., Kuksis, A., Can. J. Biochem. Cell Biol., 61 (1983) Vonach, B., Schomburg, G., J. Chromatogr., 149 (1978)

149 ... V ASILE O STAFE..... mari. În schimb introducerea unei duble legături duce la scurtarea retenţiei echivalentă cu aproximativ 2 unităţi metilenice. Mai exact, o legătură dublă echivalează cu 2,2 atomi de carbon când faza mobilă este amestec metanol - acetonă şi 2,4 când se eluează cu amestec acetonitril - acetonă. Trigliceridele ce conţin acizi graşi hidroxilaţi, cum ar fi acidul ricinoleic sunt eluate doar cu puţin înainte de trigliceridele normale 1, iar prezenţa grupărilor epoxi în acizii graşi duce la scăderea drastică a retenţiei 2. Caracteristicile fazei staţionare s-au dovedit a influenţa şi ele rezoluţia, aceasta crescând odată cu încărcarea cu carbon a matricei şi cu scăderea dimensiunilor particulelor. O atenţie deosebită trebuie acordată alegerii solventului de extracţie în etapa de pregătire a probelor, deoarece urmele de alţi solvenţi pot afecta grav rezoluţia. Cel mai bine ar fi ca extracţia să se realizeze în acetonă, sau în cel mai rău caz, înainte de injectare ceilalţi solvenţi trebuie evaporaţi şi proba reluată în acetonă. Cloroformul, eterul etilic şi tetrahidrofuranul trebuie evitaţi cu stricteţe deoarece au efecte negative asupra eficienţei coloanei 3. Separarea trigliceridelor prin cromatografie în fază inversată Coloana Pecosphere C18 (83 x 4.6) 2 coloane legate în serie Faza mobilă Acetonă - acetonitril (70:30) Gradient Nu Viteza 0,5 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie Indice de refracţie Proba OOO - trioleină. 1 Plattner, R.D., Spencer, G.E., Kleiman, R., J. Am. Oil. Chem., Soc., 54 (1977) Plattner, R.D., Wade, K., Kleiman, R., J. Am. Oil. Chem., Soc., 55 (1978) Tsimidou, M., Macrae, R., J. Chromatogr., 285 (1984)

150 L IPIDE Separarea trigliceridelor prin cromatografie în fază inversată Coloana Pecosphere C18 (83 x 4.6) 2 coloane legate în serie Faza mobilă Acetonă - acetonitril (70:30) Gradient Nu Viteza 0,5 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie Indice de refracţie Proba OOO - trioleină, L - acid linoleic, P - acid palmitic, S - acid stearic. De la introducerea HPLC pentru izolarea şi cuantificarea fosfolipidelor, vasta majoritate a separărilor au fost realizate prin cromatografie în fază normală pe coloane de silicagel folosind diferite faze mobile 1. Încă din anii '70 s-au raportat separări ale derivaţilor difenilcarbonil ai fosfoatidiletanolaminei, fosfatidilserinei, lizofosfatidiletanolaminei şi etanolaminei folosind o coloană de silicagel având ca fază mobilă amestecul diclormetan - metanol - 15 M soluţie apoasă de amoniac (92:8:1 sau 80:15:3) 2, sau a sfingomielinelor şi fosfatidilcolinei nederivatizate pe o fază staţionară de silicagel în combinaţie cu o fază mobilă conţinând acetontril - metanol - apă (65:21:14) 3. Observaţia că includerea fie a unui acid sau a unei baze 1 Ramstedt, B., Slotte, J.P., Anal. Biochem., 282 (2000) Jungalwala, F.B., Turel, R.J., Evans, J.F., McCluer, R.H., Biochem. J., 145 (1975) Jungalwala, F.B., Evans, J.E., McCluer, R.H., Biochem.J., 155 (1976)

151 ... V ASILE O STAFE..... în faza mobilă duce la îmbunătăţirea separării fosfolipidelor în cromatografia în strat subţire pe silicagel a dus la folosirea acestor faze mobile şi în HPLC. În figura următoare se prezintă un exemplu de separare a fosfolipidelor prin cromatografie în fază normală. Rezoluţia tuturor componentelor fosfolipidice majore dintr-un extract tisular s-a realizat într-o singură cromatografiere pe o coloană de silicagel cu eluare izocratică cu acetonitril - metanol - acid fosforic 85% (130:5:1,5; v/v) 1. Separarea fosfolipidelor prin cromatografie în fază normală Coloana Micro-Pak SI-10 (300 x 4.0) Faza mobilă Acetonitril - metanol - 85% acid fosforic (130:5:1,5; v/v/v) Gradient Nu Viteza 1,0 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@203 nm Proba LPC - lizofosfatidilcolina, LPE - lizofosfatidiletanolamina, LPS - lizofosfatidilserina, PA - acid fosfatidic, PE - fosfatidiletanolamina, PG - fosfatidilglicerol, PI - fosfatidilinozitol, PMME - fosfatidilmonometiletanolamina, PS - fosfatidilserina, SF - frontul de solvent, SPH - sfingomielina. Pentru a nu interfera eluarea cardiolipinei cu lipidele neutre sau cu fosfatidilinozitolul, în special în cazul deteriorării coloanei, se recomandă ca aceasta să fie spălată zilnic cu 30 ml din următoarele soluţii: (a) metanol - apă (1:1), (b) metanol, (c) dicloretan şi păstrare peste noapte în (d) hexan. Deoarece includerea de acid fosforic în faza mobilă ar putea creşte probabilitatea de eroare în cuantificarea fosfolipidelor prin conţinutul de fosfor s-a propus următoarea fază 1 Chen, S.S.-H., Kou, A.Y., J. Chromatogr., 227 (1982)

152 L IPIDE mobilă: acetonitril - metanol - acid sulfuric (100: 3: 0,05). În acest fel s-a reuşit separarea fosfatidilinozitolului, fosfatidilcolinei, lizofosfatidilserinei, fosfatidiletanolaminei, fosfatidilcolinei, lizofosfatidilcolinei şi sfingomielinei 1. Reducerea conţinutului de acid fosforic duce la creşterea retenţiei fosfatidilserinei, fosfatidiletanolaminei şi fosfatidilcolinei, iar omiterea acidului sulfuric face ca aceste componente să nu mai elueze deloc. Creşterea conţinutul de metanol a dus la scăderea retenţiei fosfolipidelor, motiv pentru care probele au fost pregătite în cloroform - dietileter (1:1) pentru a se evita modificarea concentraţiei metanolului în faza mobilă. Alte combinaţii de soluţii folosite pentru faza mobilă sunt: hexan - propanol - apă 2, cloroform - propanol - acid acetic - apă (50:55:2,5-5: 5-10) 3, cloroform - metanol (95:5) 4. Folosind eluarea în gradient, pornind de la 96% 2-propanol - hexan (1:1) - 4% apă şi ajungând în 15 minute la 8% apă s-au separat fosfatidilglicerolul, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinozitolul, acidul fosfatidic, fosfatidilserina, lizofosfatidilcolina. Folosirea pentru perioade lungi de timp a unor faze mobile ce conţin cantităţi mari de apă sau de metanol poate duce la instabilitatea fazei staţionare de silicagel. Aceasta poate fi evitată prin folosirea unor faze staţionare schimbătoare de ioni. Cum ar fi μbodnapak-nh 2 ca fază normală şi eluare cu gradient pornind de la cloroform până la metanol - apă (25:1 sau 25:4) 5. În acest caz ordinea de eluare a fost acid fosfatidic, fosfatidilglicerol, fosfatidilserina, fosfatidilcolina. Pe o coloană Ultrasil-NH 2 cu eluare în gradient de hexan - 2-propanol (11:16) şi hexan Kaduce, T.L., Norton, K.C., Spector, A.A., J. Lipid Res., 24 (1983) Geurts van Kessel, W.S.M., Hax, W.M.A:, Bemel, R.A., de Gier, J., Biochim. Biophys. Acta, 486 (1977) Blom, C.P., Deierkauf, F.A., Riemersma, J.C., J. Chromatogr., 171 (1979) Paton, R.D., McGillivray, A.I., Speir, T.F., Whittle, M.J., Whitfield, C.R., Logan, R.W., Clin. Chim. Acta, 113 (1983) Kiuchi, K., Ohata, T., Ebine, H., J. Chromatogr., 133 (1977)

153 ... V ASILE O STAFE..... propanol - metanol - apă (11:16:2:3) ordinea de eluare a fost colesterol, cerebrozida, fosfatidilcolina, lizofosfatidiletanolamina 1. Deoarece ordinea de eluare a fosfatidilcolinei şi fosfatidiletanolaminei sunt inverse pe coloanele de silicagel şi respectiv amino, rezultă că mecanismele de absorbţie sunt diferite pe cele două tipuri de faze staţionare. La ph neutru majoritatea lipidelor membranare conţin o sarcină pozitivă sau o amină cuaternară şi deci separarea lor se poate realiza folosind coloane schimbătoare de cationii. Pe o astfel de coloană, Whatman PXS 10/25 SCX, folosind ca fază mobilă acetonitril - metanol - apă (400:100:34) s-au separat fosfatidiletanolamina, lizofosfatidiletanolamina, fosfatidilcolina, sfingomielina şi lizofosfatidilcolina 2. Limitarea acestui sistem provine din faptul că fosfolipidele polare care nu conţin o grupare amino sunt eluate în void datorită polarităţii solventului folosit. Cromatografia în fază inversată a fost şi ea utilizată pentru separarea fosfolipidelor. Pe coloane ODS cu faze mobile incluzând metanol - 1 mm tampon fosfat, ph 7,4 (95:5) 3, cloroform - apă - metanol (10:10:100) 4 sau 20 mm clorhidrat de colină în metanol - apă - acetonitril (181:14:5) 5 s-au separat fosfolipidele în funcţie de numărul atomilor de carbon din moleculă şi de gradul de nesaturare a acizilor graşi. În ce priveşte detecţia, cea mai populară metodă este monitorizarea absorbanţei la nm. Absorbanţa lipidelor la aceste lungimi de undă se datorează în special prezenţei dublelor legături carbon-carbon, deşi şi alte grupări pot contribui într-o măsură mai mică. Sensibilitatea detecţiei UV este în jur de 1 nmol de fosfatidilcolină, dacă molecula conţine cel puţin o dubă legătură 6. 1 Hanson, V.L., Park, J.Y., Osborn, T.W., Kiral, R.M., J. Chromatogr., 205 (1981) Gross, R.W., Sobel, B.E., J. Chromatogr., 197 (1980) Smith, M., Jungalwala, F.B., J. Lipid Res., 22 (1981) Porter, N.A., Wolf, R.A., Nixon, J.R., Lipids, 14 (1979) Patton, G.M., Fasulo, J.M., Robins, S.J., J. Lipid Res., 23 (1982) Jungalwala, F.B., Evans, J.E., McCluer, R.H., Biochem.J., 155 (1976)

154 L IPIDE Detecţia în UV, deşi în general sensibilă şi precisă, în cazul lipidelor ridică probleme datorită gradului diferit de nesaturare a acestora şi deci a coeficienţilor lor de extincţie foarte diferiţi. Aceste probleme pot fi rezolvate întrucâtva printr-una din următoarele căi: Peak-urile eluate pot fi colectate şi analizate prin metode chimice (dozare de fosfor); Folosirea de standarde externe specifice şi realizarea de curbe de etalonare pentru fiecare fosfolipidă în parte. Realizarea de derivatizări pre-coloană. Folosirea altor tipuri de detectoare: MS 1, chemiluminiscenţă 2, PDA 3, etc. Fosfolipidele ce conţin grupări amino primare pot forma derivaţi bifenilcarbonil. Metoda a fost aplicată pentru detecţia fosfatidilserinei, fosfatidiletanolaminei şi lizofosfatidiletanolaminei, unde limita de detecţie a fost de pmoli 4. Similar, fosfolipidele ce conţin o grupare amino primară pot fi derivatizate cu clorura de 1-dimetilaminonaftalen-5-sulfonil (DNS-Cl). Derivaţii DNS sunt puternic fluorescenţii şi folosind o lungime de undă de excitaţie de 342 nm şi emisie la 500 nm, limita de detecţie este în jur de 20 pmoli 5. Destul de des fosfolipidele sunt detectate cu detector indice de refracţie 6, limita de detecţie fiind în jur de 0,5 μmoli/l pentru fosfatidiletanolamina şi 55 μmoli/l pentru lizolecitină. 1 Hansen, H.H., Hansen, S.H., Schousboe, A., Hansen, H.S., J. Neurochem., 75 (2000) Kinoshita, M., Oikawa, S., Ayasaka, K., Sekikawa, A., Nagashima, T., Toyota, T., Miyazawa, T., Clin. Chem., 46 (2000) Pfefferle, C.M., Breinholt, J., Olsen, C.E., Kroppenstedt, R.M., Wellington, E.M.H., Gurtler, H., Fiedler, H.P., J. Nat. Prod., 63 (2000) Jungalwala, F.B., Turel, R.J., Evans, J.E., McCluer, R.H., Biochem.J., 145 (1975) Chen, S.S.-H., Kou, A.Y., Chen, H.-H.Y., J. Chromatogr., 208 (1981) Paton, R.D., McGillivray, A.I., Speir, T.F., Whittle, M.J., Whitfield, C.R., Logan, R.W., Clin. Chim. 152 Acta, 133 (1983)

155 ... V ASILE O STAFE..... Compusul de bază caracteristic pentru toate sfingolipidele este ceramida, compus cu două catene lungi nepolare. Toate sfingolipidele conţin trei unităţi constituente caracteristice: o moleculă de acid gras, o moleculă de sfingozină sau un derivat al acesteia şi o grupare polară care formează capul polar 1. Sfingozina (4- sfingenina) este cel mai comun din cei peste 30 de aminoalcooli cu lanţ lung care au fost identificaţi în sfingolipidele izolate din diferite specii. Aminoalcoolul poate fi eliberat prin hidroliză şi derivatizat pentru a forma specii care pot fi separate prin HPLC în fază normală 2, fază inversată 3 şi detectate UV, prin fluorescenţă 4 sau MS 5. S-a raportat dozarea sfingolipidelor prin derivatizare pre-coloană cu clorura de dabsil (clorura de 4-dimetilaminoazobenzen-4-sulfonil) 6 şi separate pe o coloană Zorbax CN şi fază mobilă un gradient de acetonitril - 17,5 mm acetat de sodiu (90:60), ph 6, ce a fost crescut la 90% acetonitril. Folosind monitorizarea la 430 nm limita de detecţie a fost de 5 pmoli. Derivatizarea cu derivaţi de bifenilcarbonil a bazelor sfingoidice după hidroliza sfingolipidelor urmată de separarea pe Ultrasphere ODS cu o fază mobilă de tetrahidrofuran - metanol - apă (25:40:20) sau metanol - apă (94:6) şi detecţie la 1 Ostafe, V., Să Învăţăm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptivă, Ed. Brumar, Timişoara, Sugawara, T., Miyazawa, T., Lipids., 34 (1999) Gerdt, S., Dennis, R.D., Borgonie, G., Schnabel, R., Geyer, R., Eur. J. Biochem., 266 (1999) Zhou, J.Y., Chaminade, P., Gaudin, K., Prognon, P., Baillet, A., Ferrier, D., J. Chromatogr. A., 859 (1999) Kalhorn, T., Zager, R.A., Am. J. Physiol.-Renal Fluid Electrolyte Physiol., 277 (1999) F723-F Rosenfelder, G., Chang, J.-N, Braun, D.G., J. Chromatogr., 272 (1983)

156 L IPIDE 280 nm limita de detecţie a fost mai mică de 1 nmol 1. Derivaţii de p-nitrobenzoil şi benzoil au fost separaţi pe coloane ODS în combinaţie cu o fază mobilă conţinând cloroform - metanol şi monitorizaţi la 260 nm, cu o limită de detecţie de 50 pmoli 2. Separarea unor glicozilceramide prin cromatografie în fază normală Coloana Silicagel Faza mobilă Acetat de etil în apă Gradient 2-17% acetat de etil în apă în 10 min. Viteza 2 ml min 1 volumetrică Temperatura Camerei Detecţie UV@280 nm Proba 1. Glc-Cer, 2. Lac-Cer, 3. Gal-Lac-Cer, 4. Globozida. Glicosfingolipidele conţin ca grupare polară de cap una sau mai multe glucide şi deci nu au încărcare electrică, motiv pentru care se mai numesc glicosfingolipide neutre. Cele mai simple dintre ele sunt cerebrozidele care au capul polar format dintr-un monozaharid legat β-glicozidic de gruparea hidroxil a ceramidei. În creier se găsesc şi esterii sulfat ai galactocerebrozidelor care se numesc sulfatide. Cea mai comună tehnică HPLC pentru separarea şi detecţia 1 Kadowaki, H., Bremer, E.G., Evans, J.E., Jungalwala, F.B., McCluer, R.H., J. Lipid Res., 24 (1983) Do, U.H., Per, P.T., Miinard, R.D., Lipids, 16 (1983)

157 ... V ASILE O STAFE..... glicozilceramidelor implică derivatizarea pre-coloană 1, de obicei cu derivaţi O- aceilbenzoici, separare prin cromatografie în fază normală pe silicagel şi detecţie UV la 230 nm. Prima derivatizare raportată a fost cu clorura de benzoil 2, dar şi alţi derivaţi de benzoil au fost folosiţi. Faza mobilă constă, de obicei, din: gradiente cu creşterea concentraţiei de dioxan în hexan 3, sau din acetat de etil în hexan 4. Sistemul a permis separarea mono-, di-, tri- şi tetraglicozilceramidelor. Glicozil şi galactozilceramidele au fost separate pe coloană Micropak NH 2-10, cu gradient de fază mobilă ciclopentan - 2-propanol (98/5:1,5) 5. Fără derivatizare, clicosfingolipidele neutre au fost detectate atât prin UV la 230 nm cât şi radioactiv, după eluare de pe silicagel cu gradient conţinând diferite proporţii de metanol şi apă în cloroform 6. Gangliozidele sunt glicospingolipide ce conţin în capul lor polar, unul sau mai mulţi radicali de acid sialic, ceea ce conferă grupării polare a gangliozidelor o sarcină negativă netă la ph 7,0 7. Tehnica HPLC folosită încă de timpuriu pentru separarea şi cuantificarea gangliozidelor utilizează derivatizarea pre-coloană pentru formarea de perbenzoil gangliozide şi separare prin cromatografie în fază normală 8. Gradientul de 7-23% 1 Zhou, J.Y., Chaminade, P., Gaudin, K., Prognon, P., Baillet, A., Ferrier, D., J. Chromatogr. A., 859 (1999) Evans, J.E., McCluer R.H., Biochim. Biophys. Acta, 270 (1972) Lee, D.P., J. Chromatogr., 20 (1982) Ullman, M.D., McCluer, R.H., J. Lipid Res., 18 (1977) McCluer, R.H., Evans, J.E., J. Lipid Res., 17 (1976) Kniep, B., Hunig, T.G., Fitch, F.W., Heurer, J., Kolsch, E., Muhlradt, P.F., Biochemistry, 22 (1983) Ostafe, V., Să Învăţăm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptivă, Ed. Brumar, Timişoara, Bremer, E.G., Gross, S.K., McLuer, R.H., J. Lipid Res., 20 (1979)

158 L IPIDE dioxan în hexan permite separarea monosialogangliozidelor majore GM 1, GM 2, GM 3, GM 4 cât şi a polisialogangliozidelor GD 3, GD 1a şi GD 1B. Limita de detecţie a fost de 50 pmoli la 230 nm. Folosirea cromatografiei în fază inversată a permis separarea gangliozidelor prin realizarea de derivaţi de p-nitrobenzoilamină. Eluarea s-a făcut cu gradienţi cloroform - metanol - apă sau numai metanol - apă (50:50-70:30). Detecţia s-a făcut fie la 254 nm, fie prin fluorescenţă la 525 nm. Limita de detecţie în ultimul caz a fost de 100 ng gangliozidă 1. În ultima vreme analiza gangliozidelor se realizează prin derivatizare precoloană, separare prin cromatografie în fază inversată şi detecţie în fluorescenţă 2. 1 Traylor, T.D., Koontz, D.A., Hogan, E.L., J. Chromatogr., 272 (1983) Hikita, T., Tadano-Aritomi, K., Iida-Tanaka, N., Toyoda, H., Suzuki, A., Toida, T., Imanari, T., Abe, 156 T., Yanagawa, Y., Ishizuka, I., Anal. Biochem., 281 (2000)

159 S T E R O II Z II În clasa compuşilor steroizi sunt cuprinşi o mare varietate de substanţe a căror proprietăţi chimice diferă foarte mult. Până în C D anii 80 tehnicile folosite pentru analiza steroizilor erau dominate de cromatografia în strat subţire (TLC thin layer A B chromatography) şi cromatografia în fază 4 6 gazoasă 1. Steroizii sunt derivaţi ai hidrocarburii saturate tetraciclice perhidrociclopentanofenantren (v. structura în figura alăturată). Ei se deosebesc prin numărul şi poziţia dublelor legături, prin tipul, locul de legare şi numărul grupărilor funcţionale substituite, prin configuraţia (α sau β) a legăturilor dintre grupările substituite şi nucleu şi prin configuraţia ciclurilor unul faţă de altul, întrucât 1 Heftman, E., Lin, J.-T., J. Liq., Chromatogr., 5 (Suppl. I) (1982)

160 S TEROIZI hidrocarbura de bază are 6 centre de asimetrie 1. Punctele principale de substituţie sunt carbonul 3 din ciclul A, carbonul 11 din ciclul C şi carbonul 17 din ciclul D. Toţi steroizii provin din triterpena lineară squalen, care se ciclizează uşor. Primul produs steroidic important al acestei ciclizări este lanosterolul, care în ţesuturile animale este precursorul colesterolului, steroidul cel mai abundent la animale. Ambii sunt membri ai unei subgrupe mari de steroizi numită steroli 2. Sterolii sunt alcooli steroidici care conţin o grupare hidroxil la carbonul 3 din ciclul A şi un braţ alifatic ramificat de cel puţin 8 atomi de carbon la C17 din ciclul D. Ei se găsesc fie ca alcooli liberi, fie sub formă de esteri ai grupării hidroxil de la carbonul 3 cu acizi graşi cu catenă lungă. Pentru analiza sterolilor s-au folosit tehnicile HPLC în fază inversată 3, în fază normală 4, argintarea 5 şi combinaţii ale acestora. Majoritatea separărilor în fază inversată au fost realizate cu faze staţionare de tip ODS iar ca fază mobilă s-au folosit amestecuri apoase de diferiţi solvenţi organici. Avantajul major al folosirii tehnicilor în fază inversată constă în faptul că separarea depinde de numărului atomilor de carbon cât şi de numărul legăturilor duble carbon-carbon ale sterolilor supuşi separării. Majoritatea separărilor în fază inversată au fost realizate pe faze staţionare ODS, eluarea realizându-se cu faze mobile apoase ce conţineau un modificator organic. Avantajul major al tehnicii în fază inversată este că rezoluţia sterolilor 1 Ostafe, V., Să Învăţăm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptivă, Ed. Brumar, Timişoara, Evrard D.A., Harrison B.L., Annual Reports in Medicinal Chemistry, 34. (1999) Sicard, F., Vaudry, H., Braun, B., Chartrel, N., Leprince, J., Conlon, J.M., Delarue, C., Endocrinology., 141 (2000) Grizard, G., Sion, B., Bauchart, D., Boucher, D., J. Chromatogr. B., 740 (2000) Ruan, B.F., Wilson, W.K., Pang, J.H., Schroepfer, G.J., Steroids., 65 (2000)

161 ... V ASILE O STAFE..... depinde atât de numărul atomilor de carbon din moleculă cât şi de prezenţa şi numărul dublelor legături. Folosind un amestec acetonitril - apă (88:12) s-a reuşit separarea sterolilor în funcţie de prezenţa sau absenţa unei legături duble Δ 24 în catena laterală. De exemplu, Δ 5 -colesterolul a fost separat de Δ 5,24 -colestadienol. Similar, o grupare metil la C4, cum ar fi în 4-metil-Δ 8 -colesterol permite separarea de Δ 8 -colesterol. Totuşi, condiţiile menţionate nu au dus la separarea compuşilor ce aveau o grupare în C14 de sterolii fără grupare în C14, sau a izomerilor sterolilor cu o dublă legătură la C27, deşi astfel de separări s-au făcut folosind faza normală 1. Pentru multe separări de substanţe amfipatice care nu sunt satisfăcătoare în fază inversată pot fi rezolvate în fază normală. De exemplu, folosind o fază mobilă cu 2,2,4-trimetilpentan - ciclohexan - toluen (5:3:2) s-au separat izomerii de poziţie ai legăturii duble din C27 a sterol-acetaţilor sau a celor ce aveau sau nu o grupare metil în C14. Condiţii cromatografice similare, cu două coloane de silicagel în tandem şi eluare cu sisteme binare, cum ar fi: hexan 2-propanol (99:1; 24:1 sau 9:1), hexan - butanol (99:1) sau 2,2,4-trimetilpentan 2-propanol (499:1) au permis separarea unui număr de produşi de auto-oxidare ai colesterolului 2. Folosirea cromatografiei în fază inversată în absenţa apei (NARP - nonaqueous reversed phase) permite separarea şi cuantificarea colesterolului total din ser. Ca fază mobilă se poate folosi amestecul 2-propanol acetonitril 3, cu toate că şi fazele mobile cu conţinut de apă dau rezultate bune, mai ales când se doreşte şi cuantificarea colesterolului esterificat 4. În general, separarea în fază inversată depinde atât de umărul atomilor de carbon cât şi de numărul dublelor legături; astfel cu cât numărul atomilor de carbon este mai mare cu atât esterii steroidici eluează mai târziu, în timp ce la număr egal de atomi de carbon, compuşii cu mai multe duble legături eluează mai devreme. 1 Hansbury, E., Scallen, T.J., Chromatogr. Sci., 16 (1982) Ansari, G.A.S., Smith, L.L., J. Chromatogr., 175 (1979) Perkins, E.G:, Hendren, D.J., Bauer, J.E., El-Hamdy, A.H., Lipids, 16 (1981) Duncan, I.W., Culbreth, P.H., Burtis, C.A., J. Chromatogr., 162 (1979)

162 S TEROIZI Izomerii cis eluează înaintea celor trans. Cromatografia în fază inversată pe coloane ODS, cu fază mobilă 0,5% 2- propanol în hexan permite separarea sterolilor cu substituenţi în C27, C28 şi C29, inclusiv ergocalciferolul, sitosterolul, stigmasterolul, colesterolul şi ergosterolul. Cu fază mobilă metanol acetonitril (25:75) s-au separat ergocalciferolul şi colecalciferolul de alte substanţe cu caracter hidrofob şi rol vitaminic. Separarea unor steroli şi a altor compuşi hidrofobi cu rol vitaminic, prin cromatografie în fază inversată Coloana Inertisil 5μ ODS-2 (150 x 4.6) Faza mobilă MeOH:MeCN (25:75) Gradient Nu Viteza 1,5 ml min 1 volumetrică Temperatura 40ºC Detecţie UV@280 nm Proba 1. Menadiona, 2. Retinol, 3. Ergocalciferol, 4. Colecalciferol, 5. Tocoferol, 6. Tocoferolacetat, 7. Filochinona. Cromatografia cu argintare a fost folosită pentru obţinerea unei separări eficiente a unei serii de precursori ai colesterolului ce conţineau un număr diferite de legături duble şi aflate în poziţii diferite 1. În acest caz faza staţionară a fost o coloană de alumină care a fost echilibrată cu azotat de argint. Eluarea s-a făcut cu gradient pornind de la hexan toluen (9:1) şi ajungând la (6:4). Cromatografia cu argintare folosită cu coloane de silicagel a permis separarea izomerilor cis şi trans a sterol-acetaţilor 2. În concluzie, pentru separarea cromatografică a sterolilor se recomandă utilizarea iniţială a cromatografiei în fază inversată şi în cazul co-eluării se 1 Pascal, R.A., Faris, C.L., Schroepfer, G.J., Anal. Biochem., 101 (1980) Colin, H., Guichon, G., Siouffi, A. Anal. Chem., 51 (1979)

163 ... V ASILE O STAFE..... utilizează cromatografia în fază normală 1. Pentru separări foarte specifice, când utilizarea tehnicilor mai sus amintite nu dau rezultatele dorite, se poate folosi fie cromatografia în fază inversată în absenţa apei, fie cromatografia cu argintare. Sterolii sunt de obicei monitorizaţi atât cu detectoare indice de refracţie cât şi cu detectoare UV. Deoarece detectoarele indice de refracţie au o sensibilitate redusă, detectoarele UV, şi în special varianta arie de diode sunt de preferat. Limitele de detecţie la 254 nm pentru lanosterol, β-stigmasterol şi colesterol sunt de aproximativ 600 nm şi pentru egosterol de 40 ng. La 282 nm limitele de detecţie pot fi reduse până la 700 pg, ajungând la aceeaşi limită de detecţie ca cea din gazcromatografia cu ionizare în flacără. În această clasă sunt incluse mai multe grupe de substanţe printre care cortocosteroizii, hormonii gestrogeni, androgeni şi estrogeni. Încă de timpuriu au fost publicate ample articole consacrate acestui subiect 2,3. Concentraţia corticosterozilor în plasmă şi urină este un indicator al funcţiei glandelor adrenocorticoide şi prin urmare, cuantificarea acestor hormoni este de mare importanţă clinică. În ultimii 20 de ani aceste analize se realizează aproape exclusiv prin HPLC, cele mai populare tehnici fiind cromatografia în fază normală 4 şi în fază inversată 5,6. 1 Yaku, K., Morishita, F., J. Biochem. Biophys. Methods., 43(1-3), (2000) Nice, E.C., O Hare, M.J., J. Chromatogr., 162 (1982) Alvarez-Coque, M.C.G., Broch, S.C., J. Chromatogr. B. 736(1-2) (1999) Bodor, N., Drustrup, J., Wu, W., Pharmazie., 55 (2000) Marquet, P., Lachatre, G., J. Chromatogr. B. 733(1-2) (1999) Sicard, F., Vaudry, H., Braun, B., Chartrel, N., Leprince, J., Conlon, J.M., Delarue, C., Endocrinology., 141 (2000)

164 S TEROIZI Prima separare a corticosteroizilor a fost realizată pe o coloană de silicagel, eluarea făcându-se cu cloroform dioxan (100:5) când s-au separat cortizolul, cortizona şi 11-deoxicortizolul 1. Majoritatea separărilor folosind faze staţionare silicagel utilizează ca faze mobile amestecuri de: Diclormetan etanol apă (93,6:4,7:1,7) 2, cu care s-au separat prednisolonul, cortizolul, prednisona, cortizona, corticosteronul, deoxicortizolul şi 17-αhidroxi-progesteronul; hexan clorură de metilen etanol acid acetic (63,8:30:6:0,2) 3 ; 1,5% metanol şi 0,2% apă în cloroform, pentru determinarea cortizolului în urină 4 ; diclormetan hexan etanol acid acetic (69:26:3,4:1) 5 pentru separarea cortizolului de metilprednisolon; diclormetan metanol (97:3) 5 pentru separarea corticosteronului, cortizonului şi cortizonei. Alte tipuri de HPLC folosite în separarea corticosteroizilor sunt: cromatografia în fază normală folosind faze staţionare nitril, cu faze mobile diclormetan 2-propanol apă (97,5:2,3:0,2) 6 utilizată pentru determinarea cortizolului în plasmă; cromatografia de afinitate folosită pentru purificarea şi cuantificarea cortizolului din plasmă sau urină unde faza staţionară a constat din anticorpi anti-cortizol legaţi covalent de o matrice de silicagel 7. 1 Touchstone, J.C., Wortmann, W., J. Chromatogr., 76 (1973) Trefz, F.K., Byrd, D.J., Kochen, W., J. Chromatogr., 272 (1975) Loo, J.C.K., Butterfield, A.G., Moffatt, J., Jordan, N., J. Chromatogr., 143 (1977) Schwedt, G., Bussemas, H., J. Chromatogr., 285 (1977) Ebling, W.F., Szefler, S.J., Jusko, W.J., J. Chromatogr., 305 (1984) Van den Berg, J.H.M., Mol, C.R., Deeldr, R.S., Thijssen, J.H., Clin. Chim. Acta, 78 (1977) Nilsson, B., J. Chromatogr., 276 (1983)

165 ... V ASILE O STAFE..... Există, de asemenea, multe variante de separare folosind cromatografia în fază inversată. În acest caz, cele mai comune faze mobile sunt: metanol apă (45:55 sau 60:40) 1, folosite pentru separarea cortizolului şi 11- deoxicortizolului; acetonitril apă (30:70) 2 pentru separarea 20α şi 20β- sau 5α- şi 5βhidrocortizolii; apă acetonitril tetrahidrofuran 1 M tampon fosfat, ph 4,4 (63:28:8:1) gradient acid formic acetonitril, ph 3, pentru analiza corticoizilor folosiţi ilegal de sportivi 3. Detecţia corticosteroizilor este uşurată de absorbanţa puternică a structurii de rezonanţă 4-enă-3-onă, care are un maxim de absorbţie în jur de 240 nm 4. La această lungime de undă, limita inferioară de detecţie a corticosteroizilor este de aproximativ 2-5 ng. La 254 nm limita de detecţie este de aproximativ 10 ng. Fluorescenţa indusă de acizi a corticosteroizilor a fost folosită pentru a mări sensibilitatea de detecţie. Folosind o fază mobilă tamponată la ph 4,4 şi incubarea steroizilor în amestec acid sulfuric - etanol înainte de cromatografiere aduce limita de detecţie la 500 pg (excitaţie la 366 nm, absorbţie la 488 nm) 5. S-au raportat şi procedee de derivatizare a corticosteroizilor pentru a se mări limita de detecţie în fluorescenţă. Printre procedeele de derivatizare folosite amintim folosirea dansilhidrazinei 6, glicinamidei 7 şi a benzamidinei 8. 1 Reardon, G.E., Caldarella, A.M., Canalis, E., Clin. Chem., 25 (1979) Ulrick, S., Ramirez, L.C., New, M.I., J. Clin. Endocrinol., 44 (1977) Bevalot, F., Gaillard, Y., Lhermitte, M.A., Pepin, G., J. Chromatogr. B., 740 (2000) Engel, L.L. (ed.) The Physical Properties of Steroid Hormones, Pergamon Press, Oxford, Gotelli, G.R., Wall, J.H., Kabra, P.M., Marton, L.J., Clin. Chem., 27 (1981) Kawasaki, T., Maeda, M., Tsuji, A., J. Chromatogr., 163 (1979) Seki, T., Yamaguchi, Y., J. Liq. Chromatogr., 6 (1983) Seki, T., Yamaguchi, Y., J. Chromatogr., 305 (1983)

166 S TEROIZI Separarea unor hormoni steroidici prin cromatografie în fază inversată Coloana Inertisil 5μ ODS-3V (150 x 4.6 mm) Faza mobilă MeCN:THF:H 2 O (35:8:57) Gradient Nu Viteza 1,0 ml min 1 volumetrică Temperatura 40ºC Detecţie UV@230 nm Proba 1. β-trenbolona 2. α-trenbolona 3. β-zeararenol 4. testosteron 5. zeranol 6. α-zeararenol 7. α- estradiol 8. Zeararenona 9. dietilstilbestrol Acest grup de hormoni steroidici este caracterizat de aceeaşi grupare Δ 4-3ceto care se găseşte în corticosteroizi şi în general metodele de detecţie descrise pentru această din urmă clasă de compuşi se aplică şi la progestine. Majoritatea separărilor cromatografie folosite pentru separarea progestinelor (progesteronilor) au utilizat fie cromatografia în fază normală fie cea în fază inversată. În cazul cromatografiei în fază normală se poate folosi ca fază staţionară silicagelul, iar ca fază mobilă amestecul etanol diclormetan (0,25:99,75). În acest fel s-a reuşit separarea 3-dionelor (inclusiv a progesteronei) şi 6-monohidroximonoketonelor (inclusiv a pregnenolonei) din seria preganului 1. Tot pe coloane de silicagel, dar cu fază mobilă formată din n-hexan metanol etanol (96:3:1) două perechi de derivaţi ai preganului, care erau epimeri la C20 au fost separaţi. 1 Lin, J.-T., Heftmann, E., Hunter, I.R., J. Chromatogr., 190 (1980)

167 ... V ASILE O STAFE..... Perechile separate includeau 20α- şi 20β-hidroxi-4-pregan-3-ona şi 3-pregan-3β, 20α--diol şi 5-pregnan-3β-20β-dil. Pe coloane ODS cu fază mobilă etanol apă (55:45) 1 s-au separat 4 perechi de epimeri ai pregnandiolilor 2. Ambele tipuri de HPLC, în fază normală şi în fază inversată au fost folosite pentru separarea androgenilor. În general cromatografia în fază normală folosind silicagelul ca fază staţionară este modul preferat de separare deoarece rezoluţia este mai bună pentru toţi epimerii steroidici cu excepţia 17-epimerilor 3. Separarea epimerilor monohidroxi ai testosteronului şi androstandionei s-a r ealizat folosind o fază mobilă formată din hexan tetrahidrofuran 2-propanol (80:15:5) şi ca fază staţionară slilicagelul 4. Capacitatea HPLC în fază inversată de a separa androstanii este într-u câtva limitată şi se impune fie folosirea mai multor faze mobile izocratice sau a eluării în gradient. De exemplu, folosind coloane ODS pentru separarea principalilor metaboliţilor hidroxilaţi ai testosteronului s-a pornit iniţial cu o fază mobilă formată din metanol apă (55:45) când s-au separat 2β-, 6β-, 7α- şi 16α-hidroxitestosterona şi apoi s-a aplicat o a doua fază mobilă, formată din metanol apă acetonitril (55:35:10) pentru a se elua testosterona şi androstendiona 5. Tot prin cromatografie în fază inversată, pe coloane ODS, s-au separat patru Δ 4-3-cetosteroizi testiculari, incluzând testosteronul, androstendione, 17α-hidroxiprogesterona şi progesterona, faza mobilă fiind fie amestec tetrahidrofuran 1 Purdy, R.H., Durocher, C.K., Moore, P.H., Rao, P.N., Chromatogr. Sci., 234 (1982) Liere, P., Akwa, Y., Weill-Engerer, S., Eychenne, B., Pianos, A., Robel, P., Sjovall, J., Schumacher, M., Baulieu, E.E., J. Chromatogr. B., 739 (2000) Hunter, I.R., Walden, M.K., Heftman, E., J. Chromatogr., 176 (1979) Kawalek, J.C., Hawang, K.K., Kelsey, M.I., Chromatographia, 14 (1981) Van der Hoeven, J., J. Chromatogr., 196 (1980)

168 S TEROIZI metanol apă (16:28:56), fie metanol acetonitril apă (9:36:55) 1. Cea mai convenabilă metodă de detecţie a androstanilor este absorbţia în UV. Δ 4-3-cetonele (inclusiv androstendiona şi testosterona) au o puternică absorbţie în jur de 254 nm astfel că limta de detecţie este de 30 ng pentru testosteron. 17- cetosteroizii (inclusiv androsterona şi etiocolanona) pot fi monitorizate la 280 nm, ar sensibilitatea este de 5 ori mai scăzută decât pentru Δ 4-3-cetone 2. Petru a se îmbunătăţi limita de detecţie se folosesc diferite metode de derivatizare, cum ar fi folosirea 2,4-dinitrofenilhidrazinei pentru a forma hidrazone ai steroizilor 3 şi clorura de p-nitrobenzoil 4. În timp ce prin aceste metode se creşte sensibilitatea metodei, specificitatea ei scade datorită apariţiei produşilor secundari 5. Determinarea cantitativă cu mare exactitate a estrogenilor este foarte importantă în chimia clinică pentru a furniza informaţii despre dezvoltarea sarcinii. În ultimile luni de sarcină nivelul urinal al estriolului creşte în mod normal, iar o scădere ar indica o stare patologică. Estrogenii sunt în mod normal excretaţi în urină ca şi conjugaţi şi în majoritatea analizelor se face o hidroliză înainte de cromatografiere. Cele mai folosite metode pentru hidroliză sunt hidroliza acidă şi cea enzimatică. În primul caz, proba este încălzită la 110ºC timp de 30 minute. Hidroliza enzimatică foloseşte de obicei o β-glucuronidază (din E. coli) şi incubarea are loc la 60ºC, timp de 30 minute, în mediu tamponat Darney, K.J., Wing, T.-Y, Ewing, L.I., J. Chromatogr., 257 (1983) Hunter, I.R., Walden, M.K., Heftman, E., J. Chromatogr., 176 (1979) Fitzpatrick, F.A., Siggia, S., Dingman, J., Anal. Chem., 44 (1972) Fitzpatrick, F.A., Siggia, S., Anal. Chem., 45 (1973) O Hare, M.J., Nice, E.C., Chromatogr. Sci., 14 (1982) Gotelli, G.R., Kabra, P.M., Marton, L.J., Clin. Chem., 23 (1977)

169 ... V ASILE O STAFE..... Cele mai populare tehnici HPLC folosite pentru separarea estrogenilor sunt cromatografia în fază inversată 1,2 şi cea în fază inversată perechi ionice 3. Mult mai puţin folosite sunt cromatografia în fază normală şi cea de schimb ionic. În cazul cromatografiei în fază inversată, faza staţionară cea mai folosită a fost ODS, iar faza mobilă amestecuri apoase de metanol şi acetonitril. De exemplu, când faza mobilă a fost metanol 0,1% carbonat de amoniu (în apă) estriolul şi estradiolul au fost eluaţi succesiv. Când faza staţionară a fost silicagelul şi eluţia s-a făcut cu etanol n-heptan (5:95), ordinea de eluţie a fost estrona, estradiolul şi estriolul. Importanţa modificatorului organic în determinarea ordini de eluţie în cazul cromatografiei în fază inversată a fost demonstrată folosind o fază staţionară ODS şi o fază mobilă formată din acetonitril - 0,5% fosfat monoacid de amoniu, ph 3,0 (1:2) pentru separarea 17-ceto şi 17-hidroxi estrogenilor. Când metanolul a fost substituit cu acetonitril s-a schimbat ordinea de eluare 4. În cromatografia în fază normală s-au folosit atât faze staţionare cu silicagel cât şi diol. Faza mobilă a fost hexan etanol (9:1) pentru separarea estrogenilor polari (estradiol, 6-cetoestradiol, 16-epiestriol, estriol, 16,17-estirol, 2-hidroxiestriol), iar pentru estrogenii mai puţin polari s-a folosit hexan etanol (97:3) 5. Separarea epimerilor se realizează mai bine prin cromatografie în fază normală, dar când compuşii ce urmează a fi separaţi diferă prin prezenţa unei grupări ceto, hidroxi sau a unei duble legături, se recomandă cromatografia în fază inversată. Deşi mult mai puţin folosită, cromatografia de schimb ionic poate da rezultate bune. S-au folosit schimbători de anioni şi faze mobile formate din 0,01 M 1 Hauptmann, H., Paulus, B., Kaiser, T., Luppa, P.B., Bioconjugate Chem., 11 (2000) Wolfling, J., Schneider, G., Peter, A., J. Chromatogr. A., 852 (1999) Johnsen, H.K., Tveiten, H., Willassen, N.P., Arnesen, A.M., Comp. Biochem. Physiol. B-Biochem. Mol. Biol., 124 (1999) Shimada, K., Tanaka, M., Nambara, T., J. Chromatogr., 178 (1979) Lin, J.-T, Heftmann, E., J. Chromatogr., 312 (1981)

170 S TEROIZI fosfat monopotasic, ph 4,2, sau 0,1 M clorură de sodiu, ph 5,0, sau 0,01 M tampon fosfat ph 6,8 cu diferite concentraţii de perclorat. Ordinea de eluţie este estrioli, estrani, estradiol, 17α-hidroechilina, echilenina şi dihidroechilenina. Conjugaţii inelului A sunt eluaţi înaintea conjugaţilor inelului D. Conjugaţii glucuronici sunt eluaţi înaintea fosfaţilor şi sulfaţilor 1. În cromatografia în fază inversată perechi ionice s-au folosit coloane C2 şi C8, echilibrate cu 1-pentanol şi folosind ca agent pentru formarea perechilor ionice hidroxidul de tetrapropilamoniu 2. Separarea unor hormoni estrogeni, prin cromatografie în fază inversată Coloana MetaSil AQ 5μ (250 x 4.6) Faza mobilă MeOH:H 2 O (85:15) Gradient Nu Viteza 1,0 ml min 1 volumetrică Temperatura 40ºC Detecţie UV@200 nm Proba 1. etilestradiol, 2. estrona. Coloane ODS au fost folosite în cromatografia cu argintare, cu fază mobilă metanol 5% azotat de argint (60:40) pentru separarea estriolului, echilinei, estronei şi estradiolului. Detecţia estrogenilor se face atât în UV cât şi în fluorescenţă (nativă sau prin derivatizare), dar şi cu detectoare electrochimice. Detecţia în UV se datorează aromaticităţii inelului A care absoarbe la 280 nm. Limita de detecţie este de 10 ng, dar poate fi îmbunătăţită dacă se lucrează la 200 nm. 1 Van der Wal, Sj., Huber, J.F.K., J. Chromatogr., 135 (1977) Hermansson, J., J. Chromatogr., 152 (1978)

171 ... V ASILE O STAFE..... Derivatizarea cu 2,4-dinitrofenilhidrazonă (DNPH) duce la formarea unei grupări carbonil cu o puternică absorbanţă la 254 nm şi la 365 nm. Folosirea esterior p-iodobenzensulfonil duce la creşterea sensibilităţii detecţiei la 254 nm 1. Monitorizarea fluorescenţei naturale duce la o creştere considerabilă a sensibilităţii. Astfel prin excitarea la 220 nm se obţine o emisie primară la 310 nm şi una secundară la 608 nm. Măsurarea la 310 nm duce la o limită de detecţie de 100 pg 2. Detecţia prin fluorescenţă a estrogenilor poate fi îmbunătăţită prin derivatizare cu grupări puternic fluorescente, cum ar fi clorura de dansil 3 (excitare la 350 nm, emisie la 540 nm), cu limita de detecţie de 50 pg 4. Detecţia electrochimică aplicată la estrogeni cu un potenţial de electrod în domeniul 0,7 0,86 V faţă de un electrod de referinţă de Ag/AgCl 5 a dus la o limită de detecţie de 5 ng pentru estriol şi de 1 ng pentru 2-hidroxiestradiol. Separarea unor hormoni estrogeni, prin cromatografie în fază inversată Coloana Inertisil 5μ ODS-3 (150 x 4.6) Faza mobilă MeOH:H 2 O (45:55) Gradient Nu Viteza 1,0 ml min 1 volumetrică Temperatura 40ºC Detecţie UV@280 nm Proba 1. β-trembolon, 2. β-estradiol, 3. dietilstilbestrol. 1 Roos, R.W., J. Chromatogr. Sci, 14 (1978) Taylor, J.T:, Knotts, J.G., Schmidt, G.J., Clin. Chem., 26 (1980) Fishman, S., J. Pharm. Sci., 64 (1975) Roos, R.W., J. Chromatogr. Sci, 14 (1978) Prescott, W.R., Boyd, B.K., Seaton, J.F., J. Chromatogr., 234 (1982)

172 S TEROIZI Separarea unor hormoni estrogeni, prin cromatografie în fază inversată Coloana Inertisil 5μ ODS-3V (150 x 4.6) Faza mobilă MeOH:H 2 O (49:51) Gradient Nu Viteza 1,0 ml min 1 volumetrică Temperatura 25ºC Detecţie UV@280 nm Proba 1. estradiol, 2.n-butil paraben. Separarea unor hormoni estrogeni, prin cromatografie în fază inversată Coloana Inertisil 5μ ODS-2 (250 x 4.6) Faza mobilă MeCN:1% CH2ClOOH, ph 3, (60:40) Gradient Nu Viteza 1,0 ml min 1 volumetrică Temperatura 40ºC Detecţie UV@254 nm Proba 1. estriol, 2. estradiol, 3. estrona. 170

173 V II TA M II N E Vitaminele sunt o clasă de substanţe foarte eterogenă din punct de vedere chimic, a căror nume, însemnând "amina vieţii", a fost dat iniţial unor substanţe ce conţineau grupări aminice care adăugate în mici cantităţi în dieta animalelor de laborator sau a oamenilor duceau la eliminarea efectelor novice datorate lipsei acestor substanţe. Deşi denumirea s-a păstrat, în grupul vitaminelor intră şi substanţe care nu sunt amine. Vitaminele sunt substanţe ce nu sunt sintetizate de majoritatea mamiferelor, dar sunt esenţiale pentru procese biochimice vitale pentru speciile respective şi prin urmare trebuie obţinute din surse exogene. Convenţional, vitaminele sunt împărţite în două grupe mari, hidrosolubile şi liposolubile. Cu excepţia vitaminei C, celelalte vitamine hidrosolubile au funcţii de coenzime 1. În ce priveşte vitaminele liposolubile, acestea sunt necesare în special pentru animalele superioare. La microorganisme şi plante nu s-a stabilit încă exact 1 Ostafe, V., Să Învăţăm Biochimia prin Teste: vol I, Biochimie Descriptivă, Ed. Brumar, Timişoara, 1999