ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΕΤΡΟΣ Π. ΣΦΗΚΑΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗ- ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ

Transcript

1 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΕΤΡΟΣ Π. ΣΦΗΚΑΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗ- ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΤΖΙΟΥΦΑΣ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΟÏΣΤΟΧΗΜΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΩΜΑΤΟΣΤΑΤΙΝΗΣ (sstr1-5) ΜΕ ΔΕΙΚΤΕΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΣΕ ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΟΓΚΟΥΣ ΤΟΥ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ ΕΥΑΝΘΙΑ Α. ΔΙΑΚΑΤΟΥ ΙΑΤΡΟΣ ΠΑΘΟΛΟΓΟΑΝΑΤΟΜΟΣ Επιβλέπων: Αναπληρωτής Καθηγητής Γρηγόριος Καλτσάς MD, PhD, FRCP ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΑΘΗΝΑ

2 ΕΘΝΙΚΟ ΚΑΙ ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΠΕΤΡΟΣ Π. ΣΦΗΚΑΚΗΣ ΚΛΙΝΙΚΗ - ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΠΑΘΟΦΥΣΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΑΘΑΝΑΣΙΟΣ ΤΖΙΟΥΦΑΣ ΣΥΣΧΕΤΙΣΗ ΤΗΣ ΑΝΟΣΟÏΣΤΟΧΗΜΙΚΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΩΝ ΥΠΟΔΟΧΕΩΝ ΣΩΜΑΤΟΣΤΑΤΙΝΗΣ (sstr1-5) ΜΕ ΔΕΙΚΤΕΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ ΣΕ ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΕΙΣ ΟΓΚΟΥΣ ΤΟΥ ΓΑΣΤΡΕΝΤΕΡΙΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή: Καθηγητής Μιχαήλ Τζιβράς Αναπληρωτής Καθηγητής Γρηγόριος Καλτσάς (επιβλέπων Καθηγητής) Αναπληρωτής Καθηγητής Νικόλαος Σύψας Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή: Καθηγητής Μιχαήλ Τζιβράς Καθηγητής Νικόλαος Τσαβαρής Αναπληρωτής Καθηγητής Γρηγόριος Καλτσάς Αναπληρωτής Καθηγητής Νικόλαος Σύψας Αναπληρωτής Καθηγητής Μιχαήλ Βουλγαρέλης Επίκουρος Καθηγητής Σταύρος Σουγιουλτζής Επίκουρος Καθηγήτρια Ευανθία Κασσή 2

3 Ημερομηνίες: Ημερομηνία αίτησης εκπόνησης διδακτορικής διατριβής: 28/05/2008 Ημερομηνία ορισμού τριμελούς συμβουλευτικής επιτροπής: 24/02/2009 Ημερομηνία ορισμού θέματος: 20/05/09 Ημερομηνία κατάθεσης διδακτορικής διατριβής: 16/02/2015 Ημερομηνία υποστήριξης διατριβής:07/09/2015 3

4 ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝA ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ.8 Ι.ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ Το Διάχυτο Νευροενδοκρινές Σύστημα Τα νευροενδοκρινή νεοπλάσματα του Γαστρεντεροπαγκρεατικού συστήματος Εισαγωγή-Ιστορική αναδρομή Επιδημιολογικά δεδομένα Κατηγορίες νευροενδοκρινών νεοπλασμάτων 23 Α) Σποραδικά-Κληρονομούμενα Β) Λειτουργικά-Μη λειτουργικά Ιστοπαθολογία Δείκτες πιστοποίησης νευροενδοκρινούς φύσης Δείκτες βιολογικής συμπεριφοράς Ταξινόμηση νευροενδοκρινών νεοπλασμάτων Χαρακτηριστικά νευροενδοκρινών νεοπλασμάτων ανάλογα με την ανατομική τους εντόπιση Α) Οισοφάγος Β) Στόμαχος Γ) Δωδεκαδάκτυλο και εγγύς νήστιδα Δ) Άπω νήστιδα και Μεκέλειος απόφυση 4

5 Ε) Σκωληκοειδής Απόφυση ΣΤ) Παχύ Εντερο Ζ) Πάγκρεας Βιοχημικοί Διαγνωστικοί Δείκτες Σταδιοποίηση ΝΕΝ πνεύμονα-ταξινόμηση Απεικόνιση νευροενδοκρινών νεοπλασμάτων...40 A) Κοινές απεικονιστικές τεχνικές B) Σπινθηρογράφημα με οκτρεοτίδιο-octreoscan Γ) Positron Emission Tomography- PET SCAN Θεραπεία νευροενδοκρινών νεοπλασμάτων.44 Α) Χειρουργική εξαίρεση Β) Θεραπεία συμπτωμάτων Γ) Συστηματική θεραπεία Δ) Θεραπεία με ραδιοσεσημασμένα ανάλογα Ταχυφύλαξη...52 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Η Σωματοστατίνη Οι υποδοχείς Σωματοστατίνης Η δράση της Σωματοστατίνης Μηχανισμοί δράσης σωματοστατίνης Ανάλογα Σωματοστατίνης Η Ντοπαμίνη και οι υποδοχείς Ντοπαμίνης Ομοδιμερή Ετεροδιμερή μόρια.63 5

6 ΙΙ.ΣΚΟΠΟΣ Σκοπός Πειραματικής μελέτης. 64 ΙΙΙ.ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΚΕΦΑΛΑΙΟ Συλλογή περιστατικών Υλικά Μέθοδοι...69 Α) Ανοσοϊστοχημεία Β) Σπινθηρογράφημα με Οκτρεοτίδιο Γ) Στατιστική ανάλυση 3.4 Αποτελέσματα Συζήτηση Ανίχνευση υποδοχέων σε ΝΕΝ-ΓΕΣ Ποσοτική έκφραση υποδοχέων Ποιοτική έκφραση υποδοχέων Αξιολόγηση μεθόδων ανίχνευσης υποδοχέων σωματοστατίνης Εφαρμογές έκφρασης των υποδοχέων σε θεραπευτικά σχήματα Στόχευση υποδοχέων σωματοστατίνης Στόχευση ετεροδιμερών Συσχέτιση ανοσοϊστοχημείας και Octreoscan Ρόλος του sstr Σύγκριση με παρόμοιες μελέτες Περιορισμοί

7 ΙV. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Συμπεράσματα μελέτης.102 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Περιλήψεις στην Αγγλική και Ελληνική γλώσσα Περιλήψη στην Αγγλική γλώσσα (ABSTRACT 1) Περιλήψη στην Αγγλική γλώσσα (ABSTRACT 2) ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ ΠΑΡΑΡΤΗΜΑ ΣΥΝΤΜΗΣΕΙΣ

8 ΣΥΝΤΟΜΟ ΒΙΟΓΡΑΦΙΚΟ ΣΗΜΕΙΩΜΑ Ονοματεπώνυμο: Ευανθία Α. Διακάτου Επάγγελμα : Ιατρός Παθολογοανατόμος Τόπος / Ημερομηνία γεννήσεως: Αθήνα, 28/10/1974 Οικογενειακή κατάσταση: Έγγαμος, μία θυγατέρα ΠΡΟΠΤΥΧΙΑΚΕΣ ΣΠΟΥΔΕΣ ΤΙΤΛOI ΣΠΟΥΔΩΝ Απόφοιτος 3ου Γενικού Λυκείου Υμηττού (1992). Προπαρασκευαστικό τμήμα Ιατρικής Σχολής Βάρνας Βουλγαρίας ( ). Πτυχίο Ιατρικής Σχολής Βάρνας-Βουλγαρίας με βαθμό Λίαν καλώς (25/08/2000). Αναγνώριση τίτλου σπουδών από το ΔΙ.Κ.Α.Τ.Σ.Α. έπειτα από εξετάσεις (10-376/2001) και απόκτηση άδειας ασκήσεως ιατρικού επαγγέλματος (Αρ. Πρωτ ). Aπόκτηση τίτλου ειδικότητας Παθολογικής Ανατομικής, έπειτα από γραπτές και προφορικές εξετάσεις (20/01/2012, Αρ.Απόφ ). ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΚΠΑΙΔΕΥΣΗ-ΕΡΓΑΣΙΑ Πρακτική άσκηση στην Παθολογία και Χειρουργική στο Γενικό Νοσοκομείο Νίκαιας (6/1998-8/1998). Άσκηση στη Γενική Χειρουργική, στην Παθολογία και στην Καρδιολογία στο Γενικό Νομαρχιακό Νοσοκομείο Βόλου (1/2/2002-1/5/2002). Εκπλήρωση υπηρεσίας υπαίθρου στο Π.Ι Τσαγκαράδας- Κ.Υ Ζαγοράς (1/5/ /4/2003). 8

9 Ιατρικός συνεργάτης στην Α Παθολογική - Ογκολογική Κλινική του Θεραπευτηρίου ΥΓΕΙΑ - Διευθυντής: Πετούνης Ανδρέας (1/5/2003 έως 10/1/2006). Άσκηση στην Παθολογική Ανατομική ως ειδικευόμενη ιατρός στο Παθολογοανατομικό Εργαστήριο του Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών «Γ.ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ»- Διευθυντής: Δρ Γεώργιος Κοντογεώργος (6/2/2006 έως 30/4/2010). Άσκηση στην Κυτταρολογία ως ειδικευόμενη ιατρός στο Κυτταρολογικό Εργαστήριο του Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών «Γ.ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ» - Διευθύντρια κ. Xαραλάμπους Πηνελόπη (5/9/2010 έως 5/12/2011). Επιστημονικός συνεργάτης σε ιδιωτικά διαγνωστικά εργαστήρια 5/2012 έως 5/2013. Παθολογοανατόμος στο Εργαστήριο Παθολογικής Ανατομικής στην Γυναικολογική και Μαιευτική Κλινική «ΡΕΑ» 5/2013 έως σήμερα. Επιστημονικός συνεργάτης διαγνωστικού εργαστηρίου A Prolipsis 6/2014 έως σήμερα. ΒΡΑΒΕΙΑ ΔΙΑΚΡΙΣΕΙΣ Τρίτο βραβείο στο 19 ο Πανελλήνιο Ουρολογικό Συνέδριο της Ελληνικής Ουρολογικής Εταιρίας, Χαλκιδική 10/2008 για την εργασία με τίτλο: Mελέτη της έκφρασης των μορίων Calcitonin και VEGF σε καρκινώματα προστάτη αδένα. Πρώτο βραβείο στο 9 ο Πανελλήνιο Συνέδριο Κλινικής Κυτταρολογίας, Αθήνα 5/2011 για την εργασία με τίτλο «Συγκριτική μελέτη της έκφρασης του ki-67 σε υλικό cell block και ιστολογικών τομών παγκρεατικών ενδοκρινικών νεοπλασμάτων» Κριτής υποβληθέντων εργασιών (reviewer) στο διεθνές περιοδικό Diagnostic Pathology. 9

10 ΔΙΕΘΝΕΙΣ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ (6) - PUBMED (6) 1) Somatostatin and dopamine receptor expression in neuroendocrine neoplasms: correlation of immunohistochemical findings with somatostatin receptor scintigraphy visual scores. Diakatou E, Alexandraki KI, Tsolakis AV, Kontogeorgos G, Chatzellis E, Leonti A, Kaltsas GA. Clin Endocrinol (Oxf) Mar 23. doi: /cen [Epub ahead of print] 2) Diagnostic accuracy and clinical significance of the fine needle aspiration Ki-67 labelling index in pancreatic endocrine tumours. Kaklamanos M, Karoumpalis I, Salla C, Thomas D, Kanakis G, Alexandraki K, Sougioultzis S, Diakatou E, Kontogeorgos G, Kaltsas G. Endocr Relat Cancer Oct 27; 18(6):L1-3. 3) Endoscopic ultrasound staging and guided fine needle aspiration biopsy in patients with resectable pancreatic malignancies: a single-center prospective experience. Karoumpalis I, Sigalas P, Salla C, Diakatou E, Balatsos V, Zografos G, Delis V. Onkologie. 2011; 34(10): Epub 2011 Sep 19. 4) Primary lymphoma of the spermatic cord: a case report and review of the literature. Diakatou E., Haramis G., Kostopoulou A., Kakiopoulos G. Indian J Pathol Microbiol Jul-Sep; 54(3): ) Somatostatin and dopamine receptor profile of gastroenteropancreatic neuroendocrine tumors: an immunohistochemical study. 10

11 Diakatou E, Kaltsas G,Tzivras M, Kanakis G, Papaliodi E, Kontogeorgos G. Endocr Pathol Mar; 22(1): ) Dislodged iris cyst in the vitreous presenting as an intraocular foreign body. Georgalas I, Koutsandrea C, Papaconstantinou D, Diakatou E., Ladas I. Clin Experiment Ophthalmol Aug; 37(6): Erratum in: Clin Experiment Ophthalmol Sep; 37(7):757. ΕΛΛΗΝΙΚΕΣ ΔΗΜΟΣΙΕΥΣΕΙΣ 1) Βασικοκυτταρικό αδένωμα ελασσόνων σιελογόνων αδένων: Παρουσίαση περιστατικού και ανασκόπηση της διεθνούς βιβλιογραφίας. Μουρτζούκου Δ., Βλάχου Β, Τσιτλίδου Α., Διακάτου Ε., Ιωακειμίδου Χ., Νομικός Α., Παπαλιώδη Ε. Παθολογοανατομικό Εργαστήριο του Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών «Γ.ΓΕΝΝΗΜΑΤΑΣ»- Αρχεία Παθολογικής Ανατομικής 2009, 23(2-3): ΟΜΙΛΙΕΣ (8) EΡΓΑΣΙΕΣ ΣΕ ΔΙΕΘΝΗ ΣΥΝΕΔΡΙΑ (19) EΡΓΑΣΙΕΣ ΣΕ ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΣΥΝΕΔΡΙΑ (29) ΣΥΝΕΔΡΙΑ (54) 11

12 ΠΡΟΛΟΓΟΣ - ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Από τη θέση αυτή θα ήθελα να ευχαριστήσω όλους εκείνους που μου συμπαραστάθηκαν, με υποστήριξαν και με συμβούλεψαν κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της παρούσας Διατριβής. Χωρίς την πολύτιμη συμβολή τους δεν θα ήταν εφικτή η ολοκλήρωσή της. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Αναπληρωτή Καθηγητή και επιβλέποντα κατά τη διάρκεια της εκπόνησης της παρούσας μελέτης κ. Καλτσά, ο οποίος με υπομονή και έχοντας βαθειά γνώση του αντικειμένου με κατηύθυνε με τρόπο τέτοιο ώστε να εμβαθύνω σε όλες τις παραμέτρους της μελέτης αυτής και να ολοκληρώσω την παρούσα εργασία. Ευχαριστώ τον Καθηγητή κ. Τζιβρά για την προθυμία με την οποία πάντα με αντιμετώπισε και καθοδήγησε. Τον Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Σύψα για την διακριτική του συμβολή στην παρούσα μελέτη. Ιδιαίτερα θα ήθελα να ευχαριστήσω τον δάσκαλό μου στην Παθολογική Ανατομική Δρ. Γεώργιο Κοντογεώργο για την εμπιστοσύνη που μου έδειξε, παραχωρώντας μου το πολύτιμο αρχειακό υλικό του Εργαστηρίου Παθολογικής Ανατομικής του ΓΝΑ Αθηνών «Γ. Γεννηματάς». Χωρίς την επίβλεψη, τη βοήθεια και την καθοδήγηση του δεν θα ήταν δυνατό να ολοκληρωθεί το έργο αυτό. Θα ήθελα επίσης ιδιαίτερα να ευχαριστήσω τη συνάδελφο Ενδοκρινολόγο κ. Κρυσταλλένια Αλεξανδράκη για την προθυμία με την οποία στάθηκε δίπλα μου, διδάσκοντάς με στατιστική και μεθοδολογία, αφιερώνοντας τον πολύτιμο χρόνο της για συμβουλές, υποδείξεις και διορθώσεις. Τέλος ευχαριστώ το σύζυγο μου Γιώργο Χαραμή και την κόρη μας Κατερίνα, χωρίς την κατανόηση των οποίων δεν θα είχα τη δύναμη να δουλέψω απερίσπαστη. 12

13 Στους γονείς μου Αναστάσιο & Aικατερίνη Διακάτου Στο Γιώργο & την Κατερίνα.. 13

14 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 14

15 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Το διάχυτο νευροενδοκρινές σύστημα Το Διάχυτο Νευροενδοκρινές Σύστημα (ΔΕΣ) αποτελείται από ενδοκρινικά κύτταρα τα οποία είναι διάσπαρτα σε σχεδόν όλους τους ιστούς. Η πρώτη περιγραφή του ΔΕΣ έγινε το 1870, οπότε και περιγράφηκαν από τον Heidenhain χρωμαφινικά και αργενταφινικά κύτταρα στο γαστρεντερικό σύστημα, που θεωρήθηκε ότι πιθανόν είχαν ενδοκρινική λειτουργία. Μερικές δεκαετίες αργότερα, το 1938 ο Feyrter υποστήριξε πως τα διαυγή κύτταρα που υπήρχαν διάσπαρτα στο γαστρεντερικό σύστημα (Ηelle Zelle) αποτελούσαν μέρος του «Διάχυτου Ενδοκρινικού Συστήματος» και ότι κάποια από αυτά τα κύτταρα είχαν παρακρινική ή τοπική ορμονική δράση [1]. Παρόμοια κύτταρα περιγράφηκαν και από τον Frolich στο βρογχικό δένδρο και θεωρήθηκε ότι και αυτά αποτελούν μέρος του «Διάχυτου Ενδοκρινικού Συστήματος» [2]. Επιπλέον, η ανακάλυψη ότι οι νευράξονες του υποθαλάμου ήταν αυτοί οι οποίοι συνέθεταν παράγοντες ικανούς να επάγουν ή να καταστείλουν την παραγωγή των διαφόρων ορμονών, οδήγησε στο συμπέρασμα ότι μπορούν και λειτουργούν σαν ενδοκρινή κύτταρα, μετατρέποντας την ηλεκτρική διέγερση σε χημικά ή ορμονικά σήματα [3,4]. Σε μετέπειτα μελέτες το 1960 διαπιστώθηκε η ενδοκρινής φύση των διαυγών κυττάρων του θυρεοειδούς, τα οποία όπως αποδείχθηκε ήταν υπεύθυνα για την παραγωγή της καλσιτονίνης και έκτοτε ονομάστηκαν c-cells [5,6,7]. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι τα ίδια αυτά κύτταρα είχαν την ικανότητα να συνθέτουν και να αποθηκεύουν κατεχολαμίνες μετά από πρόσληψη και αποκαρβοξυλίωση των πρόδρομων μορφών αυτών των μορίων, όπως 3-4 δεϋδροξυφαινυλαλανίνη (L-Dopa) και 5-υδροξυτρυπτοφάνη (5-ΗΤΡ)], και τα κύτταρα αυτά λόγω της ως άνω ιδιότητας τους ονομάστηκαν APUD (Amine Precursor Uptake and Decarboxylation-APUD) [7]. 15

16 Σε μετέπειτα μελέτες διαπιστώθηκε ότι τα κύτταρα αυτά δεν είχαν μόνο την ικανότητα σύνθεσης αμινών, αλλά είχαν δομικές, λειτουργικές και μεταβολικές ομοιότητες με τα νευρικά κύτταρα (σύνθεση νευρoορμονών και νευροδιαβιβαστών), οπότε ονομάστηκαν νευροενδοκρινή. Στον ανθρώπινο οργανισμό κύτταρα του ΔΕΣ ανευρίσκονται στο δέρμα, στο βρογχικό δένδρο, στο ουροποιητικό σύστημα, στο θύμο αδένα, στο θυρεοειδή, στα χοληφόρα, στο πάγκρεας και στο γαστρεντερικό σωλήνα. Στο γαστρεντεροπαγκρεατικό σύστημα (ΓΕΠΣ) έχει διαπιστωθεί η ύπαρξη τουλάχιστον 16 τύπων κυττάρων με ικανότητα ορμονικής παραγωγής [8,9,10] (Πίνακας 1.1). Πίνακας 1.1: Κυριότεροι τύποι κυττάρων και τα παραγόμενα πεπτίδια. Είδος κυττάρου κύτταρα G κύτταρα D κύτταρα S κύτταρα I κύτταρα K κύτταρα N κύτταρα L κύτταρα EC1 κύτταρα EC2 κύτταρα D1 κύτταρα P Παραγόμενο πεπτίδιο γαστρίνη, φλοιοεπινεφριδιοτρόπος ορμόνη (ACTH) Σωματοστατίνη Σεκρετίνη Χολοκυστοκινίνη Gastric inhibitory polypeptide- (GIP) Νευροτενσίνη Εντερογλυκογόνο 5-HT (σεροτονίνη), πεπτίδιο P 5-HT, motilin-like LEU-ENCEPHALIN Αγγειοδραστικό πολυπεπτίδιο Μπομπεσίνη 16

17 Τα νευροενδοκρινή κύτταρα είναι στην πλειονότητα τους ενδοεπιθηλιακά ρυθμιστικά κύτταρα με επιθηλιακούς και ενδοκρινικούς χαρακτήρες και δενδριτική μορφολογία. Η μελέτη τους με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο έδειξε παρουσία εκκριτικών κοκκίων, που αποτελούν αποθήκες διαφόρων πεπτιδίων και αμινών (Εικόνα 1.1) Εικόνα 1.1: Απεικόνιση νευροενδοκρινούς κύτταρου. Υποδοχείς κυτταρικής μεμβράνης. Εκκριτικά κοκκία. 17

18 1.2 Νευροενδοκρινή νεοπλάσματα του γαστρεντερικού συστήματος Εισαγωγή-Ιστορική αναδρομή Για πρώτη φορά το 1907 περιγράφηκαν όγκοι στο λεπτό έντερο από τον Oberndorfer που ονομάστηκαν «καρκινοειδή», στην προσπάθεια να αποδοθεί η καλύτερη βιολογική συμπεριφορά και πρόγνωση των όγκων αυτών σε σχέση με άλλους κακοήθεις όγκους που προέρχονται από τους ίδιους ιστούς [11]. Τα Νευροενδοκρινή νεοπλάσματα (ΝΕΝ) του Γαστρεντερικού Συστήματος (Gastro-intestinal Neuroendocrine Neoplasms-GI-NENS, ΝΕΝ-ΓΕΣ) είναι όγκοι προερχόμενοι από το ΔΕΣ και μπορεί να εξορμώνται από το πρόσθιο, μέσο και οπίσθιο αρχέγονο έντερο (foregut, midgut, hindgut), και εμφανίζουν διαφοροποιήσεις ως προς την βιολογική τους συμπεριφορά. Το γεγονός ότι πρόκειται για σπάνιους όγκους αλλά και η διαφορετική βιολογική τους συμπεριφορά, καθιστά ιδιαίτερα δύσκολη την ταξινόμηση, κατηγοριοποίηση, πρόγνωση και αντιμετώπισή τους. Η σύγχρονη μέθοδος ταξινόμησης που χρησιμοποιείται από το 2000, βασίζεται στον ιστό προέλευσης του όγκου. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιούνται κριτήρια που εφαρμόζονται ευρέως και που έχουν την πιστοποίηση διεθνών οργανισμών [World Health Organization (WHO), European Neuroendocrine Tumor Society (ENETS), North American Neuroendocrine Tumor Society (NANETS), American Joint Committee on Cancer (AJCC)] (Πίνακας 1.2). Στόχο όλων των συστημάτων κατάταξης αποτελεί η ακριβέστερη διάγνωση, πρόβλεψη της βιολογικής συμπεριφοράς, ταξινόμηση και σταδιοποίηση με απώτερο στόχο την επιλογή σωστού θεραπευτικού σχήματος για τους όγκους αυτούς. Σήμερα χρησιμοποιούνται διάφορες παράμετροι για την καλύτερη αποτύπωση των προγνωστικών στοιχείων των νευροενδοκρινών νεοπλασμάτων και έχει προταθεί η παράθεση συγκεκριμένων δεδομένων για το σκοπό αυτό (minimum pathological data set) [12] (Πίνακας 1.2). 18

19 Πίνακας 1.2: Παράθεση ελάχιστων ιστοπαθολογικών δεδομένων στην ιστολογική έκθεση για τον χαρακτηρισμό των ΝΕΝ Ελάχιστα ιστοπαθολογικά δεδομένα Minimum Pathology Data Set Ανατομική εντόπιση όγκου Διάγνωση Μέγεθος όγκου Νευροενδοκρινείς δείκτες Εκκρινόμενες ορμόνες- λειτουργικά σύνδρομα Βαθμοποίηση (grading) Mιτωτική δραστηριότητα (αριθμός μιτώσεων ανά 10 Οπτικά Πεδία Ισχυρής Μεγέθυνσης ΟΠΙΜ / 2mm 2 ) Παρουσία νεκρώσεως (πηκτικού τύπου-όχι ισχαιμικού τύπου) Παρουσία μη ενδοκρινών συνιστωσών Παρουσία αγγειακών και περινευριδιακών διηθήσεων Παρουσία μεταστάσεων σε επιχώριους ή απομακρυσμένους λεμφαδένες Παρουσία μεταστάσεων σε γειτονικά όργανα Εγχειρητικά όρια (διηθημένα ή ελεύθερα καρκινώματος) Βάθος διηθήσεως στο τοίχωμα ή το παρέγχυμα του οργάνου Τumor Node Metastasis (ΤΝΜ) κατάταξη Επιδημιολογικά δεδομένα Η επιδημιολογική μελέτη των νεοπλασμάτων αυτών αποτελεί μία δύσκολη πρακτική, αφού πρόκειται για πολύ σπάνιανεοπλάσματα, με μακράς διάρκειας πορεία νόσου, όχι πάντα επακριβώς διαγνωσμένα και κατηγοριοποιημένα (κυρίως λόγω της σπανιότητας της εμφάνισής τους) [13]. ΤΑ ΝΕΝ-ΓΕΣ σύμφωνα με μελέτη του 2005 έχουν μία επίπτωση που κυμαίνεται από 2/ πληθυσμού για τους άνδρες, έως 2.4/ πληθυσμού για τις γυναίκες [14]. Τα τελευταία 30 περίπου χρόνια η επίπτωση 19

20 των νεοπλασμάτων αυτών παρουσιάζει μία αυξητική τάση ( %), κυρίως λόγω των καλύτερων απεικονιστικών μεθόδων και των προληπτικών ελέγχων που διενεργούνται. Παρά το δεδομένο αυτό, η αύξηση της συχνότητάς τους δεν συνοδεύεται από καλύτερη κατανόηση και αντιμετώπιση των νεοπλασμάτων αυτών που θα οδηγούσε και σε καλύτερη πρόγνωση. Τα ΝΕΝ εμφανίζουν διαφορετικό επιπολασμό ανάλογα με τον ιστό προέλευσης. Τα ΝΕΝ του οισοφάγου είναι πολύ σπάνια, με μία συχνότητα που υπολογίζεται σε 0.05% του συνόλου των ΝΕN-ΓΕΣ και στο 1% όλων των όγκων του οισοφάγου [15,16]. Τα ΝΕΝ του στομάχου αποτελούν το 2-4% των ΝΕN-ΓΕΣ [16], ενώ υπάρχουν ενδείξεις αύξησης αυτού του ποσοστού στο 11-41% σε προοπτικές μελέτες ως συνέπεια της ευρείας χρησιμοποίησης ενδοσκοπικών μεθόδων [17]. Η συχνότητα των ΝΕΝ του δωδεκαδακτύλου κυμαίνεται σε διάφορες μελέτες από 2-22% [16,18,19], ενώ μεγαλύτερη συχνότητα καταγράφεται στα ΝΕΝ του ειλεού, (25%) [19], και της σκωληκοειδούς αποφύσεως (20%) [16]. Αν και η συχνότητα των ΝΕΝ του παχέος εντέρου είναι χαμηλή, εντούτοις αυτά που εντοπίζονται στο ορθό αφορούν ένα ποσοστό της τάξης του 20% [20] ενώ τα ΝΕΝ του παγκρέατος αποτελούν το 1-2% όλων των όγκων του παγκρέατος (Διάγραμμα 1.1 και 1.2). 20

21 Διάγραμμα 1.1: Τροποποίηση από τη μελέτη Surveillance Epidemiology and End Results (SEER): Σχηματική αναπαράσταση της αύξησης της συχνότητας των Νευροενδοκρινών Nεοπλασμάτων (Neuroendocrine Νeoplasms-NEΝ) την τελευταία 30 ετία. Επίπτωση ανά όλων των κακοήθων νεοπλασμάτων ΕΤΟΣ Επίπτωση όλων των κακοήθων νεοπλασμάτων Επίπτωση των Νευροενδοκρινών νεοπλασμάτων Επίπτωση ανά των Νευροενδοκρινών Yao JC 1, Hassan M, Phan A, Dagohoy C, Leary C, Mares JE, Abdalla EK, Fleming JB, Vauthey JN, Rashid A, Evans DB. One hundred years after "carcinoid": epidemiology of and prognostic factors for neuroendocrine tumors in 35,825 cases in the United States. J Clin Oncol Jun 20;26(18):

22 Διάγραμμα 1.2: Aύξηση της επίπτωσης των νευροενδοκρινών όγκων τα τελευταία 30 χρόνια ανάλογα με τον ιστό προέλευσης. Τροποποίηση από IM Modlin (Lancet Οncol Jan;9(1):61-72). Επίπτωση ανά πληθυσμού Πνεύμονας/Βρόγχοι Λεπτό έντερο Ορθό Δερμα Στόμαχος Σκωλ/δής απόφυση Τυφλό Πάγκρεας Σιγμοειδές Ορθοσιγμοειδές Έτος καταγραφής 22

23 1.2.3 Κατηγορίες Νευροενδοκρινών Νεοπλασμάτων Α) Σποραδικά νεοπλάσματα και νεοπλάσματα σχετιζόμενα με κληρονομούμενα σύνδρομα Τα ΝΕΝ-ΓΕΣ είναι είτε σποραδικοί όγκοι, είτε εμφανίζονται στα πλαίσια γνωστών κληρονομούμενων συνδρόμων, όπως: Σύνδρομο Πολλαπλής Ενδοκρινούς Νεοπλασίας-Multiple Endocrine Neoplasia - ΜΕΝ 1, Von Hippel Lindau (VHL), Νευροϊνωμάτωση τύπου 1, Oζώδης Σκλήρυνση (Τuberus Sclerosis, TSC) και το Σύνδρομο Carney (Carney Complex). Το σύνδρομο Πολλαπλής Ενδοκρινούς Νεοπλασίας 1 (ΜΕΝ 1) είναι ένα αυτοσωμικά κληρονομούμενο νόσημα, που χαρακτηρίζεται από παρουσία ενδοκρινών όγκων σε τρία κύρια όργανα όπως όπως αδενώματα υποφύσεως, ΝΕΝ-ΓΕΣ και αδενώματα παραθυρεοειδών. Το γονίδιο που είναι υπεύθυνο ονομάζεται ΜΕΝ1 και βρίσκεται στο χρωμόσωμα 11q13, είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο και η απώλεια της ετεροζυγωτίας του (Loss οf Heterozygosity-LOH) επηρεάζει τη λειτουργικότητά του. Η πρωτεΐνη που εκκρίνεται ως αποτέλεσμα της λειτουργίας του γονιδίου αυτού λέγεται μενίνη. Το σύνδρομο Von Hippel Lindau είναι ένα αυτοσωμικό επικρατές γενετικό νόσημα στο οποίο ενέχεται συγκεκριμένο γονίδιο (γονίδιο Von Hippel Lindau) που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 3. Ασθενείς με αυτό το σύνδρομο εμφανίζουν αιμαγγειοβλαστώματα, νεφρικές κύστεις, νεφροκυτταρικό καρκίνωμα και φαιοχρωμοκυτώματα. Το Σύνδρομο Carney (Carney Complex) είναι ένα αυτοσωμικά κληρονομούμενο σύνδρομο που χαρακτηρίζεται από την παρουσία καρδιακών μυξωμάτων, κυανών σπίλων του δέρματος και διαφόρων νεοπλασμάτων (ωοθηκών, μαστού, όρχεος, αδενωμάτων υποφύσης και ΝΕΝ κυρίως του ΓΕΣ). 23

24 Η Nευροϊνωμάτωση τύπου 1 (Νόσος von Recklinghausen) είναι μία κληρονομούμενη νόσος που οφείλεται στην μετάλλαξη ενός γονιδίου στο χρωμόσωμα 17 και οι ασθενείς πάσχουν από νευροϊνώματα, κηλίδες του δέρματος (café au lait spots), επιληπτικές κρίσεις, μαθησιακές διαταραχές και ΝΕΝ. Η Οζώδης Σκλήρυνση είναι ένα γενετικό νόσημα για την εμφάνιση του οποίου ευθύνεται μετάλλαξη των γονιδίων Τuberous Sclerosis 1 (TSC1), tuberous sclerosis 2 (TSC2) που κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες hamartin και tuberin αντίστοιχα. Β) Λειτουργικά και μη λειτουργικά Νεοπλάσματα Με βάση την παρουσία κάποιου κλινικού συνδρόμου τα ΝΕΝ διακρίνονται σε λειτουργικούς και σε μη λειτουργικούς όγκους. Το κλινικό σύνδρομο είναι αποτέλεσμα της έκκρισης βιοδραστικών ουσιών από τα κύτταρα των ΝΕΝ. Τα ινσουλινώματα και τα γαστρινώματα αποτελούν τα συχνότερα λειτουργικούς ΝΕΝ κυμαίνεται και η συχνότητα τους κυμαίνεται γύρω στο 20%. Λιγότερο συχνά είναι τα γλυκαγονώματα (5%) και οι όγκοι που παράγουν αγγειοδραστικό πολυπεπτίδιο (Vasointestinal Polypeptide-VIP) (3-8%). Στον πίνακα 1.3 παρατίθενται τα κυριότερα κλινικά σύνδρομα, η ορμόνη που παράγεται και τα συνοδά κλινικά συμπτώματα (Πίνακας 1.3). Η ανοσοϊστοχημική έκφραση κάποιας βιοδραστικής ουσίας αν δεν συνοδεύεται και από το αντίστοιχο σύνδρομο δεν κατατάσσει τον όγκο στην κατηγορία των λειτουργικών όγκων. Στην περίπτωση που πρόκειται για μη λειτουργικούς όγκους, χωρίς την παρουσία κλινικού συνδρόμου, είναι ιδιαίτερα δύσκολο να υποψιαστεί κανείς την παρουσία νευροενδοκρινούς προέλευσης ΝΕΝ προεγχειρητικά. Συνήθως οι μη λειτουργικοί όγκοι διαγιγνώσκονται μετά την παρέλευση μεγάλου χρονικού διαστήματος (5-7 έτη) λόγω παρουσίας κυρίως πιεστικών τοπικών 24

25 φαινομένων και αφού δώσουν μεταστάσεις σε γειτονικά ή απομακρυσμένα όργανα. Πίνακας 1.3 Τα κυριότερα σύνδρομα, το παραγόμενο πεπτίδιο/ορμόνη, συνήθης ανατομική εντόπιση και κλινική εικόνα. Είδος συνδρόμου Ορμόνη/πεπτίδιο Όργανο Κλινική εικόνα Καρκινοειδές Σεροτονίνη Λεπτό Έντερο Ταχυκαρδία, Ισταμίνη, ερυθρότητα, κοιλιακό substance P άλγος, διάρροιες Ινσουλίνωμα Ινσουλίνη Πάγκρεας Τριάδα του Whipple 1)Συμπτώματα υπογλυκαιμίας (τρόμος, θάμποςόρασης, εφίδρωση, σύγχυση, κώμα) 2)Σάκχαρο αίματος <45 mg/dl 3)Υποχώρηση των συμπτωμάτων μετά τη χορήγηση γλυκόζης Γαστρίνωμα Γαστρίνη Δωδεκαδάκτυλο Πεπτικά έλκη, παλινδρόμηση Σύνδρομο / Πάγκρεας γαστρικού Zollinger-Elison περιεχομένου, διάρροιες Γλυκαγόνωμα Γλυκαγόνη Πάγκρεας Νεκρολυτικό μεταναστευτικό ερύθημα, Σακχαρώδης Διαβήτης VIP-ομα Αγγειοδραστικό πολυπεπτίδιο- [VasoIntestinal Peptide (VIP)] Πάγκρεας Σύνδρομο παγκρεατικής χολέρας (διάρροια, αφυδάτωση, υποκαλιαιμία) 25

26 1.2.4: Ιστοπαθολογία Τα ΝΕΝ αποτελούνται από κύτταρα ομοιόμορφα, με μικρό σχετικά ωοειδή πυρήνα, συνήθως χωρίς εμφανές πυρήνιο, με κοκκιώδη χρωματίνη (salt & pepper) και σχετικά άφθονο κυτταρόπλασμα, πολύ συχνά διαυγές. Τα κύτταρα έχουν οργανοειδή διάταξη, σχηματίζοντας δοκίδες, ροζέτες, νησίδια, γιρλάντες, αδενοειδείς ή και συμπαγείς σχηματισμούς (Εικόνες 1.2Α και1.2 Β) Εικόνα1.2Α: Xρώση αιματοξυλλίνης ηωσίνης. Νευροενδοκρινής όγκος στομάχου, αποτελούμενος από συμπαγείς αθροίσεις σχετικά ομοιόμορφων κυττάρων με μικρούς στρόγγυλους πυρήνες και κοκκιώδη χρωματίνη. Εικόνα 1.2Β: Xρώση αιματοξυλλίνης ηωσίνης. Νευροενδοκρινής όγκος δωδεκαδακτύλου. Στον υποβλεννογόνιο χιτώνα παρατηρούνται αθροίσεις κυττάρων που διατάσσονται σε νησίδια και εμφανίζουν νευροενδοκρινείς χαρακτήρες. Α Β 26

27 1.2.5 Ειδικοί δείκτες πιστοποίησης της νευροενδοκρινούς φύσης των νεοπλασμάτων Η πιστοποίηση της ενδοκρινούς φύσης των όγκων αυτών γίνεται με τη χρήση συγκεκριμένων, ειδικών δεκτών που χρησιμεύουν στην ανάδειξη των ειδικών χαρακτηριστικών των κυττάρων αυτών [13,21,22,23]. 1) Χρωμογρανίνη Α (Chromogranin A-CgA) Πρόκειται για ένα δείκτη που ανιχνεύει τις χρωμογρανίνεςδιαλυτές πρωτεΐνες που βρίσκονται στα εκκριτικά κοκκία στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων (Εικόνα 1.3Α). Eικόνα 1.3Α: Κυτταροπλασματική χρώση Χρωμογρανίνης Α. 2) Αντιγόνο CD57 (Leu-7) 3) Συναπτοφυσίνη (Synaptophysin-Syn) Πρόκειται για μία γλυκοπρωτεΐνη της μεμβράνης των κυττάρων, που ανιχνεύεται στα προσυναπτικά κοκκία (Εικόνα 1.3Β). Εικόνα 1.3Β: Χρώση Συναπτοφυσίνης CgA Syn 27

28 4) ΝCAM (Neural Cell Adhesion Molecule)-CD56 Πρόκειται για μία γλυκοπρωτεΐνη που παίζει ρόλο στη σύζευξη των κυττάρων μεταξύ τους. 5) Πρωτεϊνικό προϊόν του γονιδίου 9.5 (PGP 9.5). 6) Ειδική ενολάση των νευρώνων-neuron Specific Enolase (NSE) Η ειδική ενολάση είναι ένα γλυκολυτικό ένζυμο που εκφράζεται όμως και σε άλλους όγκους του παγκρέατος (συμπαγείς ψευδοθηλώδεις όγκοι του παγκρέατος, ορώδη-κυστικά νεοπλάσματα του παγκρέατος). Έχει υψηλή ευαισθησία αλλά χαμηλή ειδικότητα και αυτό το καθιστά μη αξιόπιστο ως δείκτη. 7) Οι κυταροκερατίνες (Cytokeratins CK) αποτελούν τα κύρια διάμεσα ινίδια των ενδοκρινών κυττάρων. Τα ΝΕΝ εκφράζουν κυταροκερατίνες όπως την CAM5.2, πανκερατίνη (ΑΕ1/ΑΕ3) σε ποσοστό 80%, ενώ εκφράζουν σε ποσοστό 40% την κερατίνη 20 (CK20). Θετική χρώση σε παγκρεατικά ΝΕΝ παρατηρείται έναντι της κερατίνης 19 (CK19). Παράλληλα, τα νευροενδοκρινή νεοπλάσματα μπορούν να εκφράζουν και πολλά είδη ορμονικών προϊόντων, όπως γαστρίνη, γλυκαγόνο, χολοκυστοκινίνη, ινσουλίνη, σωματοστατίνη, σεροτονίνη, παγκρεατικό πολυπεπτίδιο (ΡΡ), Η ανάδειξη όμως ανοσοϊστοχημικών δεικτών δεν σηματοδοτεί και την έκκρισή τους στη συστηματική κυκλοφορία και κατά συνέπεια ανάπτυξη ενός κλινικού συνδρόμου. 28

29 1.2.6 Δείκτες βιολογικής συμπεριφοράς Τα ΝΕΝ-ΓΕΣ είναι δυνητικά κακοήθη νεοπλάσματα, που παρουσιάζουν διαφοροποιήσεις σε σχέση με την ικανότητά τους να δίνουν επιχώριες ή απομακρυσμένες μεταστάσεις. Τόσο η διαφορετική ανατομική εντόπιση από όπου μπορεί να προέρχονται όσο και τα διαφορετικά λειτουργικά χαρακτηριστικά των κυττάρων που τα απαρτίζουν δυσκολεύουν την ταξινόμησή τους αλλά και τη σαφή πρόγνωση των νεοπλασμάτων αυτών. Στους δείκτες βιολογικής συμπεριφοράς περιλαμβάνονται το μέγεθος του όγκου, το τοπικό διηθητικό πρότυπο ανάπτυξης, η αγγειακή διήθηση, ο βαθμός κυτταρικού πολλαπλασιασμού, η ιστολογική διαφοροποίηση και η παρουσία μεταστάσεων. Η καταγραφή αυτών των στοιχείων κρίνεται απαραίτητη, έτσι ώστε να χαρακτηριστεί όσο το δυνατόν ακριβέστερα ένα τέτοιο νεόπλασμα (Πίνακας 1.4) Επιπλέον, η παρουσία ή μη κλινικού συνδρόμου, αν και δεν αποτελεί δείκτη βιολογικής συμπεριφοράς, φαίνεται ότι καθορίζει την πρόγνωση, αφού ένα μη λειτουργικό νεόπλασμα αργεί να εντοπισθεί και να διαγνωσθεί. 29

30 Πίνακας 1.4: Παρουσίαση των κλινικομορφολογικών δεικτών βιολογικής συμπεριφοράς ΚΛΙΝΙΚΟΜΟΡΦΟΛΟΓΙΚΟΙ ΔΕΙΚΤΕΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗΣ ΣΥΜΠΕΡΙΦΟΡΑΣ Ανατομική εντόπιση (Ιστός προέλευσης) Μέγεθος όγκου Διηθητικό πρότυπο ανάπτυξης-παρουσία μεταστατικής νόσου Παρουσία αγγειακής/περινευριδιακής διηθήσεως Διαφοροποίηση όγκου (differentiation) Αρχιτεκτονική διάταξη κυττάρων του όγκου Κυτταρολογικά χαρακτηριστικά Βαθμός κακοηθείας (grading) Μιτωτική δραστηριότητα (ΝΕΝ-ΓΕΣ και Πνεύμονα) Δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού Κi-67 (ΝΕΝ-ΓΕΣ) Παρουσία νεκρώσεων Παρουσία ορμονικής παραγωγής/εκδήλωσης κλινικού συνδρόμου Ταξινόμηση Η ταξινόμηση των ΝΕΝ αποτελούσε πάντα πρόκληση για τους επιστήμονες που ασχολούνται με τα νεοπλάσματα αυτά. Αυτό συμβαίνει γιατί οι όγκοι αυτοί προέρχονται από ποικίλες ανατομικές θέσεις, αποτελούνται από κύτταρα με διαφορετικά λειτουργικά χαρακτηριστικά (παραγωγή διαφορετικών ορμονών και πεπτιδίων) και διαφορετική βιολογική συμπεριφορά. Οι Williams και Sandler το 1963 κατέταξαν τους όγκους αυτούς με βάση την εμβρυολογική τους προέλευση, σε όγκους προερχόμενους από το πρόσθιο αρχέγονο έντερο (foregut)-(θύμος αδένας, θυρεοειδής, αρχική μοίρα δωδεκαδακτύλου, στόμαχος, πάγκρεας, πνεύμονας), από το μέσο αρχέγονο έντερο (midgut) (λεπτό έντερο, ειλεός, παχύ έντερο έως μέσο εγκάρσιο κόλον, σκωληκοειδής απόφυση) και το οπίσθιο αρχέγονο έντερο (hindgut) (άπω κόλον και ορθό) [24]. Η ταξινόμηση αυτή εγκαταλείφθηκε αφού δεν αναγνώριζε και 30

31 περιελάμβανε κλινικομορφολογικά χαρακτηριστικά όπως ακριβής ανατομική εντόπιση, παρουσία κλινικού συνδρόμου, διηθητικό πρότυπο ανάπτυξης, παρουσία μεταστάσεων, διαφοροποίηση των όγκων, μιτωτική δραστηριότητα, καρκινωματώδη έμβολα σε αγγειακούς κλάδους, παρουσία νεκρώσεως και δεν απέδιδε την ακριβή βιολογική συμπεριφορά των όγκων αυτών. Στην ταξινόμηση της WHO του 2000, ακολουθήθηκε ένας εντελώς διαφορετικός τρόπος προσέγγισης και τα νεοπλάσματα αυτά ταξινομούνταν με βάση διάφορες κλινικομορφολογικές παραμέτρους. Η ταξινόμηση αυτή περιελάμβανε πολλούς ιστοπαθολογικούς δείκτες (μέγεθος όγκου, αριθμό μιτώσεων, δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού (ki67 labeling index), βάθος διήθησης του όγκου, παρουσία επιχώριων και απομακρυσμένων μεταστάσεων), των οποίων η καταγραφή ήταν απαραίτητη. Η διαδικασία αυτή δεν ήταν πάντα ακριβής και εφικτή σε όλες τις περιπτώσεις εξαιτίας της μη ύπαρξης σαφών κριτηρίων κατάταξης για αυτούς τους σπάνιους όγκους. Στην τελευταία οδηγία της WHO του 2010, για την ταξινόμηση των ΝΕΝ-ΓΕΣ χρησιμοποιείται το ki-67, ή/και ο αριθμός των μιτώσεων που μετρώνται σε 10 Οπτικά Πεδία Ισχυρής Μεγέθυνσης (ΟΠΙΜ). To ki-67 είναι μία πρωτεΐνη που είναι παρούσα σε όλες τις φάσεις του κυτταρικού κύκλου (G1, S, G2), αλλά είναι απούσα στη φάση (G0). Αποτελεί έναν άριστο τρόπο για να προσδιορισθεί ο ρυθμός πολλαπλασιασμού ενός κυτταρικού πληθυσμού. Για τον σωστό υπολογισμό του δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού γίνεται καταμέτρηση τουλάχιστον 2000 κυττάρων στην τομή του όγκου που εξετάζεται. Σε μελέτες φαίνεται πως αυτός ο τρόπος ταξινόμησης σχετίζεται με την πρόγνωση των νευροενδοκρινών νεοπλασμάτων. Στον πίνακα πουακολουθεί φαίνεται ο πρότερος και ο ισχύων τρόπος ταξινόμησης των ΝΕΝ-ΓΕΣ (Πίνακας 1.5). 31

32 Πίνακας 1.5 Ταξινόμηση των Νευροενδοκρινών όγκων του ΓΕΣ σύμφωνα με την WHO του 2000 και η ταξινόμηση που την αντικατέστησε ισχύουσα από το WHO CLASSIFICATION 2000 WHO CLASSIFICATION 2010 Καλής Διαφοροποίησης Νευροενδοκρινείς όγκοι - ΚΔΝΕΟ KΔΝΕΟ με αβέβαιη συμπεριφορά ΚΔΝΕΟ ΑΣ Νευροενδοκρινής όγκος Grade 1 - (NEN G1) < 2μιτώσεις /10 ΟΠΙΜ +/ή < 2% ki-67 Καλής Διαφοροποίησης Νευροενδοκρινή Καρκινώματα - ΚΔΝΕΚ Νευροενδοκρινής όγκος Grade 2 - (NEΝ G2) 2-20 μιτώσεις/10 ΟΠΙΜ +/ ή 3-20% ki-67 Χαμηλής Διαφοροποίησης Νευροενδοκρινή Καρκινώματα - ΧΔΝΕΚ. Νευροενδοκρινές καρκίνωμα Grade3 - (NEC G3) >20 μιτώσεις ανά 10 ΟΠΙΜ +/ή >20% ki-67 Μεικτό Εξωκρινές-Ενδοκρινές Καρκίνωμα (Mixed Endocrine-Exocrine Carcinoma - ΜΕΕC) Mεικτό Αδενο-Νευρο- Ενδοκρινές Καρκίνωμα (Mixed Adeno Neuro Endocrine Carcinoma - ΜΑΝΕC) Παρουσία εξωκρινούς και ενδοκρινούς στοιχείου (καθένα αποτελεί το 30% του κυτταρικού πληθυσμού) 32

33 1.2.8 Χαρακτηριστικά ΝΕΝ του ΓΕΣ ανάλογα με την ανατομική τους θέση Α) Οισοφάγος Συνήθως πρόκειται για μεγάλου μεγέθους και χαμηλής διαφοροποίησης καρκινώματα μεγάλου μεγέθους, που ανευρίσκονται συχνότερα στο κατώτερο τμήμα του οργάνου και που διηθούν σε βάθος το τοίχωμα. Β) Στόμαχος ΝΕΝ στομάχου τύπου 1: Καλής διαφοροποίησης, μικρού μεγέθους όγκοι (1-2 εκ.) που αναπτύσσονται σε έδαφος ατροφικής γαστρίτιδας στο σώμα και στο θόλο. Η αυτοάνοση γαστρίτιδα συνοδεύεται από απώλεια των τοιχωματικών κυττάρων, οδηγεί στην ανεπαρκή παραγωγή του ενδογενούς παράγοντα και του υδροχλωρικού οξέος και ως εκ τούτου στην ενεργοποίηση των G κυττάρων του άντρου ώστε να παράγουν γαστρίνη. Η υπεργαστριναιμία αυτή, οδηγεί σε γραμμοειδή, διάχυτη ή μικροοζώδη υπερπλασία των εντεροχρωμαφινικών κυττάρων (Enterochromaffin Like Cells-ECL) που φέρουν υποδοχείς γαστρίνης και στη συνέχεια ανάπτυξη νευροενδοκρινών όγκων. Κλινικά, τα νεοπλάσματα αυτά δεν σχετίζονται με ορμονικά σύνδρομα και ανευρίσκονται πιο συχνά σε γυναίκες και αποτελούν το 80% των νευροενδοκρινών νεοπλασμάτων του στομάχου. ΝΕΝ στομάχου τύπου 2: Σχετίζονται με σύνδρομο ΜΕΝ1 και εμφανίζονται στα πλαίσια συνδρόμου Ζollinger-Εlisson. Ο μηχανισμός ανάπτυξης του είναι και πάλι η υπεργαστριναιμία όπως και στα τύπου 1 νεοπλάσματα, λόγω λειτουργικού γαστρινώματος συνηθέστερα στο δωδεκαδάκτυλο ή το πάγκρεας. ΝΕΝ στομάχου τύπου 3: Χαρακτηρίζονται τα σποραδικά ΝΕΝ στομάχου. Πρόκειται για μεγάλου μεγέθους μονήρη ΝΕΝ που δεν σχετίζονται με υπεργαστριναιμία και δίνουν συχνά μεταστάσεις και δεν συνοδεύονται από υπερπλασία των εντεροχρωμαφινικών κυττάρων [25,26]. 33

34 ΝΕΝ στομάχου τύπου 4: Χαμηλής διαφοροποίησης ΝΕC που δεν σχετίζονται με κληρονομούμενα σύνδρομα, είναι μεγαλύτερου μεγέθους και έχουν πιο επιθετική συμπεριφορά. Γ) Δωδεκαδάκτυλος και εγγύς νήστιδα Γαστρινώματα με παρουσία πεπτικών ελκών και παλινδρόμησης γαστρικού περιεχομένου (Συνδρόμο Ζollinger-Εlisson). Είναι είτε σποραδικά είτε μέρος συνδρόμου ΜΕΝ-1 (25-33 % στα πλαίσια του συνδρόμου). Συνήθως είναι μικρού μεγέθους (< 2εκ.), πολυποειδούς διαμόρφωσης και καλής διαφοροποίησης νεοπλάσματα. Παρά το μικρό μέγεθος τους, συχνά (σε ποσοστό 60-80%) δίνουν μεταστάσεις κυρίως στους επιχώριους λεμφαδένες και σπανιότερα στο ήπαρ[13]. ΝΕΝ με παραγωγή σωματοστατίνης με ή χωρίς σχέση με Νευρινωμάτωση τύπου 1. Αποτελούν το 20% των ΝΕΝ του δωδεκαδακτύλου. ΝΕΝ με παραγωγή καλσιτονίνης ή σεροτονίνης. Χαμηλής διαφοροποίησης νευροενδοκρινή καρκινώματα εντοπίζονται κυρίως στην περιοχή του φύματος του Vater, προκαλούν ίκτερο και δεν παράγουν κάποια ορμόνη [25,26]. 4) Άπω νήστιδα - Ειλεός- Μεκέλειος απόφυση Πρόκειται για μικρούς, καλής διαφοροποίησης όγκους που το μέγεθος τους κυμαίνεται από 0.5-3εκ. και συχνά εμφανίζουν πολυεστιακότητα (περίπου 20%). Τα ΝΕΝ του ειλεού είναι συνηθέστερα καλά διαφοροποιημένα (ΝΕΝ G1-2). Αποτελούνται κυρίως από κύτταρα ΕC που παράγουν σεροτονίνη. Συνήθως έχουν μέγεθος μεγαλύτερο από 1 εκ., συχνά διηθούν το μυϊκό χιτώνα και έχουν ήδη δώσει μεταστάσεις στους επιχώριους λεμφαδένες κατά τη διάγνωση. Επιπλέον περίπου στο 20% των ασθενών με ΝΕΝ ειλεού παρατηρούνται ηπατικές μεταστάσεις. 34

35 Το ευρύτερα γνωστό «καρκινοειδές σύνδρομο» απαντάται σε ένα ποσοστό 18-20% σε ασθενείς με όγκους της άπω νήστιδας ειλεού και συνήθως εκδηλώνεται μετά την εμφάνιση ηπατικών μεταστάσεων. Με την παρουσία των ηπατικών μεταστάσεων, ταχυκινίνες, σεροτονίνη και άλλες βιοενεργείς αμίνες ανευρίσκονται στην κυκλοφορία και προκαλούν τη συμπτωματολογία του καρκινοειδούς συνδρόμου όπως εφιδρώσεις, βρογχόσπασμο, διάρροιες, κοιλιακά άλγη και ερυθρότητα. Επίσης οι όγκοι αυτοί προερχόμενοι από εντεροχρωμαφφινικά κύτταρα έχουν την ιδιότητα να προκαλούν ίνωση η οποία παρατηρείται κυρίως στο μεσεντέριο, το ενδοκάρδιο και τις καρδιακές βαλβίδες [25,26]. Ε) Σκωληκοειδής απόφυση Τα πιο συχνά ΝΕΝ-ΓΕΣ αποτελούνται από εντεροχρωμαφινικά κύτταρα (enterochromaffin cells) και εκφράζουν σεροτονίνη και ουσία Ρ. Επιχώριοι λεμφαδένες σπάνια διηθούνται. Συνήθως αποτελούν τυχαίο εύρημα, εμφανίζονται στην κορυφή της σκωληκοειδούς αποφύσεως, έχουν μέγεθος <2 εκ. και διηθούν τμήμα του τοιχώματος της σκωληκοειδούς απόφυσης. Το μέγεθος 2 εκ., η εντόπιση στη βάση της σκωληκοειδούς, καθώς και η επέκταση στο μεσεντερίδιο λίπος αποτελούν κριτήρια για δεξιά ημικολεκτομή για εκρίζωση τυχόν υπολειμματικής νόσου. ΣΤ) Παχύ έντερο και ορθό Οι καλής διαφοροποίησης όγκοι βρίσκονται στο ορθό και στο άπω παχύ έντερο και συχνά αποτελούν τυχαίο εύρημα και έχουν καλύτερη πρόγνωση, πιθανώς λόγω της έγκαιρης διάγνωσής τους. Τα χαμηλής διαφοροποίησης καρκινώματα εντοπίζονται συνήθως στο εγγύς παχύ έντερο, έχουν μεγαλύτερο μέγεθος (> 2 εκ.) κατά τη διάγνωση και συνήθως έχουν δώσει μεταστάσεις στο ήπαρ. Τέτοιοι όγκοι έχουν χειρότερη πρόγνωση. 35

36 Ζ) Πάγκρεας Είναι σχετικά περίγραπτοι όγκοι είναι καλά διαφοροποιημένα ΝΕΝ, με ποικίλο μέγεθος (1-5εκ.) και διακρίνονται σε λειτουργικά (ινσουλινώματα, γαστρινώματα, σωματοστατινώματα, γλυκαγονώματα) και μη λειτουργικά (40%). Σπανιότερα εκκριτικά σύνδρομα παρατηρούνται από την έκκριση ορμονών από τους όγκους μη χαρακτηριστικών του ιστού προέλευσης όπως φλοιοεπινεφριδιοτρόπου (ACTH) και αυξητικής ορμόνης. Το 50% των ΝΕΝ του παγκρέατος έχουν δώσει μεταστάσεις στο ήπαρ κατά τη διάγνωση ενώ σε ποσοστό 10-25% μπορούν να σχετίζονται με σύνδρομο ΜΕΝ1 [25, 27] Βιοχημικοί δείκτες Στα πλαίσια ενός ΝΕΝ διάφοροι βιοχημικοί δείκτες ανιχνεύονται στα ούρα και τον ορό. Στα ούρα ανιχνεύεται το υποπροϊόν της σεροτονίνης, 5-υδρόξυινδολοξικό οξύ (5ΗΙΑΑ). Στον ορό ανιχνεύεται η CgA και η NSE και σε περίπτωση παραγωγής τους, διάφορες ορμόνες όπως ινσουλίνη, προ-ινσουλίνη, γαστρίνη, γλυκαγόνο, παγκρεατικό πολυπεπτίδιο (PP) και β-χοριακή γοναδοτροπίνη (βhcg) [8] Σταδιοποίηση Λόγω της διαρκούς ανάγκης να κατηγοριοποιηθούν σαφέστερα οι όγκοι αυτοί και με αυτόν τον τρόπο να καθορίζεται η πρόγνωση και να τυγχάνουν καλύτερων χειρισμών προτάθηκε από την ENETS, η σταδιοποίηση κατά ΤΝΜ. Επίσης, μεγάλες πολυκεντρικές μελέτες απέδειξαν την προγνωστική σημασία της σταδιοποίησης κατά ΤΝΜ. Στους πίνακες που ακολουθούν παρατίθενται οι παράμετροι που κρίνουν την ταξινόμηση των ΝΕΝ-ΓΕΣ, ανάλογα με την ανατομική θέση (Πίνακας 1.6). 36

37 Το Τ ορίζεται σύμφωνα με το μέγεθος του όγκου και το βάθος διηθήσεως του εκάστοτε οργάνου (διαφοροποιήσεις ανάλογα με την ανατομική θέση) Τ ΤΧ Τ0 Τis Όγκος Ο όγκος δεν μπορεί να εκτιμηθεί Δεν ανευρίσκεται πρωτοπαθής εστία IN SITU όγκος (μόνο για πρωτοπαθή εντόπιση στον στόμαχο) Τ1-3 Ανάλογα με το μέγεθος του όγκου και το βάθος διηθήσεως (διαφοροποιήσεις ανάλογα με την ανατομική θέση) Τ4 Επέκταση σε παρακείμενους ιστούς (διαφοροποιήσεις ανάλογα με την ανατομική θέση) Τα Ν & Μ είναι σταθερά ανεξαρτήτως της εντόπισης του πρωτοπαθούς όγκου Ν -ΝX Περιφερικοί λεμφαδένες Οι περιφερικοί λεμφαδένες δεν μπορούν να εκτιμηθούν -Ν0 Δεν υπάρχουν μεταστάσεις στους περιφερικούς λεμφαδένες -Ν1 Υπάρχουν μεταστάσεις στους περιφερικούς λεμφαδένες Μ Απομακρυσμένες μεταστάσεις -ΜX Οι απομακρυσμένες μεταστάσεις δεν μπορούν να εκτιμηθούν -Μ0 Δεν υπάρχουν απομακρυσμένες μεταστάσεις -Μ1 Υπάρχουν απομακρυσμένες μεταστάσεις 37

38 Πίνακας 1.6: Σταδιοποίηση των ΝΕΝ του ΓΕΣ Στάδιο Τumor Νode Μetastasis Στάδιο 0* Τis N0 M0 Στάδιο I T1** N0 M0 Στάδιο IIa T2 N0 M0 IIb T3 N0 M0 Στάδιο IIIa T4 N0 M0 IIIb Οποιοδήποτε Τ Ν1 Μ0 Στάδιο IV Οποιοδήποτε Τ Οποιοδήποτε Ν Μ1 Το στάδιο 0 εφαρμόζεται μόνο στους γαστρικούς όγκους, διότι είναι η μόνη εντόπιση ανατομικά όπου έχουν περιγραφεί in situ ενδοκρινείς όγκοι (Τis) ΝΕΝ του πνεύμονα Τα ΝΕΝ του πνεύμονα αποτελούν μία ξεχωριστή ομάδα νεοπλασμάτων που μοιράζονται μορφολογικά, δομικά ανοσοϊστοχημικά και μοριακά χαρακτηριστικά. Για την ταξινόμησή τους, χρησιμοποιείται αποκλειστικά ο αριθμός των μιτώσεων και όχι ο δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού Κi-67 labeling index [28]. Οι κύριες κατηγορίες στις οποίες διακρίνονται με βάση μορφολογικά χαρακτηριστικά, είναι: 1) Τυπικό καρκινοειδές (typical carcinoid). Πρόκειται για νεόπλασμα με μορφολογικά χαρακτηριστικά καρκινοειδούς, λιγότερες από 2 μιτώσεις ανά 2 mm 2 (10 High Power Fields-HPF), μεγαλύτερο από 0.5 εκ., χωρίς νεκρώσεις. 2) Άτυπο καρκινοειδές (atypical carcinoid). Πρόκειται για νεόπλασμα με μορφολογικά χαρακτηριστικά καρκινοειδούς, 2-10 μιτώσεις ανά 2 mm 2 (10 HPF) ή παρουσία νεκρώσεων. 3) Νευροενδοκρινές καρκίνωμα από μεγάλα κύτταρα (LCNEC) Όγκος με μορφολογικά χαρακτηριστικά νευροενδοκρινούς καρκινώματος (οργανοειδή διαμόρφωση, ρόδακες, δοκίδες, φωλιές, υψηλή μιτωτική 38

39 δραστηριότητα: >11 ανά 2 mm 2 (10 HPF), μέση τιμή 70 ανά 2 mm 2 (10 HPF), κυτταρολογικά χαρακτηριστικά NSCLC, θετικούς νευροενδοκρινείς δείκτες και συχνές νεκρώσεις σε μεγάλη έκταση. 4) Μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα (SCLC). Αποτελείται από κύτταρα με λιγοστό κυτταρόπλασμα, λεπτοκοκκιώδη υφή χρωματίνης απουσία πυρηνίου και υψηλή μιτωτική δραστηριότητα : >11 ανά 2 mm 2 (10 HPF), μέση τιμή 80 ανά 2 mm 2 (10 HPF) (Πίνακας 1.7) Πίνακας 1.7: Κατάταξη ΝΕΝ πνεύμονα Τροποποίηση από Travis et al. (1999, Pathology and Genetics of tumours of the Lung, Pleura, Thymus and Heart. WHO Classification of Tumours. Lyon IARC Press) Κατάταξη νευροενδοκρινών όγκων πνεύμονα Τυπικά καρκινοειδή - Typical carcinoid (TC) Όγκος με μορφολογικά χαρ/κα καρκινοειδούς, < 2 μιτώσεις ανά 2 mm 2 (10 High Power Fields- HPF), >0.5 εκ. χωρίς νεκρώσεις Άτυπα καρκινοειδή - Atypical carcinoid (AC) Όγκος με μορφολογικά χαρακτηριστικά καρκινοειδούς, 2-10 μιτώσεις ανά 2 mm 2 (10 HPF) ή νεκρώσεις Νευροενδοκρινές καρκίνωμα από μεγάλα κύτταρα - Large cell neuroendocrine carcinoma (LCNEC) 1. Όγκος με μορφολογικά χαρακτηριστικά νευροενδοκρινούς καρκινώματος (οργανοειδή διαμόρφωση, ρόδακες, δοκίδες, φωλιές) 2. Υψηλή μιτωτική δραστηριότητα: >11 ανά 2 mm 2 (10 HPF), μέση τιμή 70 ανά 2 mm 2 (10 HPF) 3. Νεκρώσεις 4. Κυτταρολογικά χαρακτηριστικά NSCLC 5. Θετικοί νευροενδοκρινείς δείκτες Μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα - Small cell lung carcinoma (SCLC) 1. Λιγοστό κυτταρόπλασμα 2. Λεπτοκοκκιώδης υφή χρωματίνης απουσία πυρηνίου 3. Υψηλή μιτωτική δραστηριότητα: >11 ανά 2 mm 2 (10 HPF), μέση τιμή 80 ανά 2 mm 2 (10 HPF) 4. Συχνές νεκρώσεις σε μεγάλη έκταση 39

40 Aπεικόνιση ΝΕΝ Α) Κοινές απεικονιστικές τεχνικές Για την ακριβή εντόπιση των ΝΕΝ-ΓΕΣ χρησιμοποιούνται διάφορες απεικονιστικές τεχνικές. Οι συνήθεις τεχνικές όπως το υπερηχογράφημα κοιλίας (Abdominal Ultrasound/US), η αξονική τομογραφία (Computed Tomography-CT) και η μαγνητική τομογραφία (Magnetic Resonance Imaging- MRI) έχουν ποικίλη ευαισθησία στην ακριβή εντόπιση της θέσης των ΝΕΝ με ικανότητα ανίχνευσης: υπερηχογράφημα 22-45%, αξονική τομογραφία 73-94%, και μαγνητική τομογραφία 88-93% [8, 29], ενώ το ενδοσκοπικό υπερηχογράφημα (Endoscopic US) παρουσιάζει μία ευαισθησία που κυμαίνεται από 45-60% για δωδεκαδακτυλικούς όγκους και φθάνει έως % για τους όγκους του παγκρέατος [30] (Πίνακας 1.8). Πίνακας 1.8: Βαθμός εντόπισης ΝΕΝ με τις κοινές απεικονιστικές μεθόδους. Τροποποίηση από Sundin A. et al AΠΕΙΚΟΝΙΣΤΙΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ- ΒΑΘΜΟΣ ΕΝΤΟΠΙΣΗΣ (DETECTION RATE) CT MRI US EUS NEN ΠΑΓΚΡΕΑΤΟΣ 73% 73% 39% 90% ΗΠΑΤΙΚΕΣ ΜΕΤΑΣΤΑΣΕΙΣ ΕΞΩΗΠΑΤΙΚΕΣ ΕΝΤΟΠΙΣΕΙΣ 81% 82-95% 81% 68% (ΜΑΛΑΚΑ ΜΟΡΙΑ) ΝΕΝ ΠΝΕΥΜΟΝΟΣ/ΓΕΣ 76% - 18% 63% 40

41 Β) Σπινθηρογράφημα με ανάλογα σωματοστατίνης - (Somatostatin Receptor Scintigraphy-SRS) To σπινθηρογράφημα με ανάλογα σωματοστατίνης είναι μία μέθοδος για την εντόπιση των ΝΕΝ-ΓΕΣ και την in vivo ανίχνευση υποδοχέων σωματοστατίνης. Βασίζεται στη δέσμευση συνθετικών ραδιοσεσημασμένων αναλόγων σωματοστατίνης (octreotide) από τους υποδοχείς σωματοστατίνης που ενδεχομένως εκφράζουν τα κύτταρα των ΝΕΝ και απεικόνιση των θέσεων πρόσληψης με χρήση γ-κάμερας [31]. Η πρώτη μελέτη που δημοσιεύθηκε ήταν αυτή του Krenning το 1989 και για την ανίχνευση των υποδοχέων είχε χρησιμοποιηθεί οκτρεοτίδιο ραδιοσεσημασμένο με 123 In [32]. Η αυξημένη συγκέντρωση του ραδιοφαρμάκου στο ήπαρ και το έντερο, οδήγησαν τους ερευνητές να δοκιμάσουν και άλλα μόρια με καλύτερα χαρακτηριστικά. Σήμερα, έχει καθιερωθεί η χρήση του [ 111 Ιn-DTPA]-Octreotide-Octreoscan και η χρήση του θεωρείται ως η μέθοδος εκλογής (gold standard) για την απεικόνιση των ΝΕΝ-ΓΕΣ [33]. Δοκιμάζονται και άλλα ραδιοσεσημασμένα ανάλογα σωματοστατίνης ( 99m Τc-EDDA-HYNIC-TOC] octreotide) για την απεικόνιση των νεοπλασμάτων αυτών, αλλά μέχρι σήμερα δεν υπάρχει κάποιο με αποδεδειγμένα καλύτερα χαρακτηριστικά ικανό να αντικαταστήσει το καθιερωμένο Octreoscan (Διάγραμμα 1.3) (Εικόνες 1.4 Α και 1.4Β). To Οctreoscan εμφανίζει υψηλή συνδεσιμότητα για τους υποδοχείς sstr2, sstr5 και sstr3 με αυτή τη σειρά που αναφέρονται. Για την βελτίωση της ανατομικής εντόπισης του όγκου και την αύξηση της ευαισθησίας, χρησιμοποιείται και η τεχνική single photon emission tomography (SPECT) ή και SPECT/CT. Yπάρχουν κατευθυντήριες οδηγίες και τα ενδεδειγμένα πρωτόκολλα για την απεικόνιση των ΝΕΝ δημοσιευμένα από την Society of Nuclear Medicine (SNM) [34] και την ENETS [35]. Αυξημένη πρόσληψη του ραδιοφαρμάκου παρατηρείται και από ανατομικές δομές που φυσιολογικά εκφράζουν υποδοχείς σωματοστατίνης (υπόφυση, θυρεοειδείς, σπλήνας, έντερο, ουροδόχος κύστη), όπως και από τους νεφρούς λόγω επαναρρόφησης [36,37]. 41

42 H συνολική ευαισθησία της μεθόδου αναφέρεται ότι κυμαίνεται από % [33,38,39]. Το Octreoscan έχει αυξημένη ευαισθησία σε σχέση με τις κοινές απεικονιστικές μεθόδους [40], αλλά φαίνεται πως οι νεότερες τεχνικές επιφέρουν βελτίωση των τελευταίων, οπότε αυξάνει η ακρίβεια τους [26]. Τελευταία, χρησιμοποιήθηκαν και ραδιοσεσημασμένα ανάλογα σωματοστατίνης με γάλλιο ( 68 Ga). To 68 Ga είναι ένα ραδιονουκλεοτίδιο που μπορεί μετά τη σύνδεσή του με τον προσδέτη DOTA να σχηματίσει ένα σταθερό μόριο με τα ανάλογα σωματοστατίνης (68Ga-DOTA0 [Tyr3] Οctreotide (68Ga-DOTATOC). Επίσης, εξετάζεται η αποτελεσματικότητα και άλλων μορίων στην κλινική πράξη με σκοπό την αύξηση της ευαισθησίας της μεθόδου, για παράδειγμα το 68 Ga-DOTANOC [ 68 Ga-DOTA0,Tyr3] Οctreotate ( 68 Ga-DOTATATE). Όλες αυτές οι νέες μέθοδοι έχουν εξαιρετικά αποτελέσματα στην απεικόνιση των νεοπλασμάτων αυτών και διενεργούνται μελέτες για την μεταξύ τους σύγκριση [41]. Διάγραμμα 1.3: Σχηματική αναπαράσταση λειτουργίας γ-κάμερας. 42

43 Εικόνα 1.4Α Octreoscan σε ΝΕΝ παγκρέατος grade2 Σημειώνεται με το βέλος η αλλοίωση στην ανατομική θέση του παγκρέατος Εικόνα 1.4Β Octreoscan σε ΝΕΝ παγκρέατος, grade 1.Σημειώνεται με το βέλος η αλλοίωση. Γ) Positron Emission Tomography- PET με ραδιοσεσημασμένο ανάλογο σωματοστατίνης ( 18 F-FDG PET). Η τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων (Positron Εmission Tomography- PET) με τη χρήση φθοριωμένης γλυκόζης (18FDG) είναι μία μέθοδος μεταβολικής απεικόνισης. Η αυξημένη κατανάλωση γλυκόζης από τα καρκινικά κύτταρα είναι η βάση για την αυξημένη πρόσληψη FDG. Τα ραδιοϊσότοπα εισέρχονται στα κύτταρα του όγκου, να λαμβάνουν μέρος σε μεταβολικές διαδικασίες των κυττάρων οπότε και απεικονίζεται η άθροιση τους αυτή (Εικόνα 1.5 Α και 1.5 Β). Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται κυρίως σε χαμηλής διαφοροποίησης νεοπλάσματα και σε νεοπλάσματα που έχουν υψηλό μεταβολικό ρυθμό [41,42]. 43

44 H μέθοδος αυτή δεν αποτελεί διαγνωστικό μέσο πρώτης γραμμής, έχει όμως διαπιστωθεί πως η χρήση της μαζί με το Octreoscan αυξάνουν τη διαγνωστική ακρίβεια στο 96% από το 89% που έχει μόνο του το Octreoscan [42]. Εικόνα 1.5 Α PET 68 Ga-DOTA-TOC Γυναίκα 28 ετών με αλλοίωση παγκρέατος PET 68 Ga-DOTA-TOC (Α) PET KAI CT (FUSION) (B) ΕΛΙΚΟΕΙΔΗΣ ΛΗΨΗ CT (C) SPECT ME 99mTc-HYNIC-TOC (D). Tροποποίηση από Gabriel M. et al JNM Θεραπεία Νευροενδοκρινών όγκων Α. Χειρουργική εξαίρεση Η χειρουργική αντιμετώπιση θεωρείται η πρώτη επιλογή για τα ΝΕΝ, όταν αυτό είναι εφικτό. Με τον τρόπο αυτό επιχειρείται η πλήρης εξαίρεση του όγκου, ή μείωση του φορτίου του όγκου όσον αφορά την πρωτοπαθή εστία αλλά και τις τυχόν μεταστάσεις (λεμφαδενικές, ήπαρ, οστά), τη βελτίωση τοπικών πιεστικών φαινομένων, καθώς και την αντιμετώπιση συμπτωμάτων λόγω της αυξημένης έκκρισης ορμονικών προϊόντων από τον όγκο [26]. Επίσης, σε περιπτώσεις που η χειρουργική εξαίρεση είναι αδύνατη αρχικά, μπορεί να εφαρμοσθεί μετά από θεραπεία εισόδου (neo-adjuvant therapy) που στόχο έχει τον περιορισμό του μεγέθους του όγκου. Σε περιπτώσεις μεταστατικής νόσου στο ήπαρ αυτή μπορεί να αντιμετωπισθεί με καυτηριασμό 44

45 της αλλοίωσης (RadioFrequency (RF) ABLATION) ή με (χημειο)-εμβολισμό μέσω της ηπατικής αρτηρίας. Το διάγραμμα που ακολουθεί παρουσιάζει την αποτελεσματικότητα της χειρουργικής εξαίρεσης σε σχέση με άλλες θεραπευτικές επιλογές (Διάγραμμα 1.4). Διάγραμμα 1.4: Σχηματική απεικόνιση της αποτελεσματικότητας της χειρουργικής εξαίρεσης σε σχέση με άλλες θεραπευτικές επιλογές. ΣΥΝΟΛΙΚΗ ΕΠΙΒΙΩΣΗ Ριζική εκτομή (n= 90) Άλλες θεραπείες (n= 83) ΜΗΝΕΣ Συνοπτικά οι θεραπευτικές επιλογές περιγράφονται στον αλγόριθμο που παρατίθεται πιο κάτω (Διάγραμμα 1.5). 45

46 Διάγραμμα 1.5: Συνοπτικός Θεραπευτικός Αλγόριθμος σε Νευροενδοκρινή Νεοπλάσματα του Γαστρεντερικού Συστήματος. ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΝΕΝ ΧΕΙΡΟΥΡΓΙΚΗ ΕΞΑΙΡΕΣΗ ΜΗ ΡΙΖΙΚΗ ΕΞΑΙΡΕΣΗ ΚΑΘΕΤΗΡΙΑΣΜΟΣ ΕΜΒΟΛΙΣΜΟΣ ΡΙΖΙΚΗ ΕΞΑΙΡΕΣΗ FOLLOW -UP KΔΝΕΝ ΒΙΟΘΕΡΑΠΕΙΑ ΑΝΑΛΟΓΑ ΣΩΜΑΤΟΣΤΑΤΙΝΗΣ ΙΝΤΕΡΦΕΡΟΝΗ α ΧΔΝΕΝ ΧΜΘ Σισπλατίνη και ετοποσίδη Νεότερα θεραπευτικά σχήματα :συνδυασμός τεμοζολομίδης με καπεσιταμπίνη FOLLOW -UP ΜΗ ΑΝΤΑΠΟΚΡΙΣΗ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΘΕΡΑΠΕΙΕΣ ΡΑΔΙΟΠΕΠΤΙΔΙΑ ΕΜΒΟΛΙΣΜΟΣ Tροποποίηση από Θεραπευτική αντιμετώπιση νευροενδοκρινών όγκων, Γεώργιος Κανάκης, Γρηγόριος Καλτσάς ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΙΚΟΙ ΟΓΚΟΙ/e-endocrinology ΚΔΝΕΝ: ΚΑΛΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΗ ΝΕΟΠΛΑΣΜΑΤΑ, ΧΔΝΕΚ: ΧΑΜΗΛΗΣ ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗΣ ΝΕΥΡΟΕΝΔΟΚΡΙΝΗ ΚΑΡΚΙΝΩΜΑΤΑ, *ΧΜΘ : ΧΗΜΕΙΟΘΕΡΑΠΕΙΑ Β. Θεραπεία των συμπτωμάτων. Ανάλογα Σωματοστατίνης Η θεραπεία των συμπτωμάτων επιτυγχάνεται με τη χρήση αναλόγων σωματοστατίνης (ανασταλτική της έκκρισης δράση της σωματοστατίνης) με σκοπό την βελτίωση των εκκριτικών συνδρόμων και την καλύτερη ποιότητα ζωής των ασθενών με τέτοιους όγκους. Παράλληλα αντιμετωπίζονται κατά περίπτωση εκδηλώσεις της νόσου όπως υπογλυκαιμία, υπεργλυκαιμία, καρδιακή ανεπάρκεια, διαρροϊκά σύνδρομα, ταχυκαρδία με συμπτωματική θεραπεία. Τα υπάρχοντα ανάλογα σωματοστατίνης (οκτρεοτίδη και 46

47 λανρεοτίδη) έχουν παρατεταμένο χρόνο δράσης (ημίσεια ζωή) σε σχέση με την ενδογενή σωματοστατίνη (90 έναντι 2 λεπτών) και υψηλή συγγένεια όσον αφορά τους υποδοχείς sstr 2 και 5. Στην κλινική πράξη χρησιμοποιούνται συνήθως ανάλογα με μακρά δράση, τα οποία χορηγούνται ανά 28 ημέρες. Η αντινεοπλασματική τους δράση τεκμηριώθηκε με την μελέτη PROMID (Placebo controlled, double-blind, prospective, Randomized study on the effect of Octreotide LAR in the control of tumor growth in patients with metastatic neuroendocrine MIDgut tumors) (Διάγραμμα 1.6)[43]. Τα αποτελέσματα της έδειξαν ότι η χορήγηση οκτρεοτίδης σε ασθενείς με λειτουργικά ενεργείς όσο και ανενεργείς μεταστατικούς ΝΕΝ που προέρχονταν από το μέσο αρχέγονο έντερο (12λο, σκωληκοειδής και λεπτό έντερο), επιμήκυνε σημαντικά το χρόνο που απαιτείται για να διαπιστωθεί πρόοδος νόσου σε σύγκριση με εικονικό φάρμακο. Διάγραμμα 1.6: Τροποποίηση από Arnold R. (ASCO 2009). Στο γράφημα φαίνεται η παράταση του χρόνου προόδου της νόσου (TTP:Time to Progression ) κατά τη χορήγηση Octreotide LAR 30mg 47

48 Πρόσφατα έχει χρησιμοποιηθεί το πολυδύναμο ανάλογο σωματοστατίνης SOM 230 ή pasireotide που αναστέλλει όλους τους sstrs, εκτός από τον sstr4. Τα πρώτα αποτελέσματα ήταν ιδιαίτερα ενθαρρυντικά, καθώς η χορήγησή του πέτυχε τον έλεγχο των συμπτωμάτων στο 25% ασθενών με καρκινοειδές σύνδρομο, οι οποίοι είχαν αναπτύξει αντοχή στην οκτρεοτίδη. Πρόσφατα, δημοσιεύτηκαν τα αποτελέσματα της μελέτης CLARINET (Controlled study of Lanreotide Antiproliferative Response In Neuro- Endocrine Tumors). Πρόκειται για μία πολυκεντρική διπλή τυφλή μελέτη σε ασθενείς με G1 ΝΕΝ και G2 ΝΕΝ του ΓΕΣ με σταθερή νόσο, ανεξαρτήτως του εύρους των ηπατικών μεταστάσεων. Τα αποτελέσματα της έδειξαν ότι η χορήγηση οκτρεοτίδης σε ασθενείς με ανενεργή μεταστατικά ΝΕΝ που προέρχονταν από το ΓΕΣ, επιμήκυνε σημαντικά το διάστημα ελεύθερο εξέλιξης νόσου σε σύγκριση με εικονικό φάρμακο (Διάγραμμα 1.7) [44]. Διάγραμμα 1.7: Τροποποίηση από τη μελέτη CLARINET των Μartyn E.Caplin et al (NEJM 2014). Στο γράφημα φαίνεται το διάστημα ελεύθερο εξέλιξης νόσου (Progressionfree Survival ) κατά τη χορήγηση Octreotide LAR 120mg. Ασθενείς με διάστημα ελεύθερο εξέλιξης νόσου Μήνες 48

49 Γ. Συστηματική θεραπεία Η συστηματική θεραπεία ΝΕΝ περιλαμβάνει σχήματα με ανάλογα σωματοστατίνης και χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Βιοθεραπεία Χορήγηση αναλόγων σωματοστατίνης με ή χωρίς Ιντερφερόνη-α. Η Ιντερφερόνη-α (ΙΝF-α), έχει χρησιμοποιηθεί σε ΝΕΝ του μέσου αρχέγονου εντέρου με πολύ καλά ποσοστά ανταπόκρισης όσον αφορά τους βιοχημικούς δείκτες και τον έλεγχο των συμπτωμάτων [45]. Χημειοθεραπευτικοί παράγοντες Τα ΝΕΝ είναι όγκοι με βραδεία εξέλιξη, χαμηλό δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού και γενικά δεν είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι στα κλασικά χημειοθεραπευτικά σχήματα εκτός των παγκρεατικών ΝΕΝ που εμφανίζουν ποσοστά απάντησης έως 40%. Σημαντικό κριτήριο για την επιλογή του είδους της χημειοθεραπείας αποτελεί η ταξινόμησή τους (grading). Ασθενείς με ΝEC (grade 3, Ki67 > 20% και ιδιαίτερα >55%) απαντούν στη χημειοθεραπεία με σισπλατίνη και ετοποσίδη αν και εμφανίζουν πρώιμη υποτροπή. Νεότερα θεραπευτικά σχήματα όπως συνδυασμός τεμοζολομίδης με καπεσιταμπίνη αποτελούν νεότερα υποσχόμενα θεραπευτικά σχήματα. Δ. Θεραπεία με ραδιοσεσημασμένα πεπτίδια (Peptide Receptor Radionuclide Therapy-PRRT) Στα μεταστατικά ή τα ανεγχείρητα ΝΕΝ μία θεραπευτική επιλογή είναι η θεραπεία με ραδιοσεσημασμένα πεπτίδια (Peptide Receptor Radionuclide Therapy-PRRT). Η θεραπεία αυτή βασίζεται στη χρήση πηγών β-σωματιδίων υψηλής ενέργειας, τα οποία επιφέρουν βλάβες στο DNA των κυττάρωνστόχων. Ραδιοϊσότοπα [(Ίνδιο 111 ( 111 In), το Ύττριο 90 ( 90 Y) και το Λουτέσιο 49

50 177 ( 177 Lu)], που εκλύουν β-σωματίδια προσδένονται σε ανάλογα σωματοστατίνης μέσω του κατάλληλου προσδέτη. Τα αποτελέσματα αυτών των θεραπειών είναι ενθαρρυντικά, ωστόσο δεν υπάρχουν κοινώς αποδεκτά πρωτόκολλα και οι σειρές των ασθενών είναι ανομοιογενείς ως προς τα χαρακτηριστικά της νόσου. Έχουν ανακοινωθεί ανταποκρίσεις στο 177 Lu, με σμίκρυνση του όγκου σε ποσοστό ως και 30% των ασθενών και με σχετικά λίγες παρενέργειες, κυρίως ανάπτυξη μυελοδυσπλαστικού συνδρόμου και προσωρινή ηπατική δυσπραγία. Σκοπός είναι η χορήγηση στον όγκο δόσης ικανής να επιτύχει θεραπευτικό αποτέλεσμα και συγχρόνως η αποφυγή ακτινοβόλησης παρακείμενων υγιών ιστών. Ένδειξη έχουν ασθενείς που εκφράζουν sstr και έχουν θετικό OctreoScan. Τα β-σωματίδια με υψηλότερη ενέργεια και μεγαλύτερο πεδίο (range) ( 90 Y) είναι καταλληλότερα για μεγάλους όγκους. Τα β-σωματίδια με μεγαλύτερο χρόνο ημίσειας ζωής και μικρότερου πεδίου (range) ( 177 Lu) είναι καταλληλότερα για μικρούς όγκους (Διάγραμμα 1.8) (Πίνακας 1.9). 50

51 Διάγραμμα 1.8: Τα τρία κυριότερα ραδιοπεπτίδια που έχουν χρησιμοποιηθεί θεραπευτικά. Ραδιοϊσότοπο, προσδέτης και ανάλογο σωματοστατίνης. Πίνακας 1.9: Ραδιοπεπτίδια που έχουν χρησιμοποιηθεί θεραπευτικά έως σήμερον Max E (kev) max range half life Medium or high energy emitters 90 Y mm 2.7d 177 Lu 497 1mm 6.7d 131 I mm 8d 186 Re mm 3.8d 32 P mm 14d 161 Tb mm 6.9d Conversion or Auger electron emitters 111 In 245(IC) 550μm 2.8d 25(Au) 10μm 67 Ga 93(IC) 110μm 3.2d 9.5(Au) 2.1μm 125 I 35(IC) 20μm 60d 30(Au) 15μm 51

52 Ταχυφύλαξη Η πλειονότητα των ασθενών με ΝΕΝ που υποβάλλονται σε θεραπεία με ανάλογα σωματοστατίνης εμφανίζουν μία ταχεία και θεαματική βελτίωση των συμπτωμάτων [46,47,48,49]. Αυτή η γρήγορη βελτίωση σε ένα μικρό ποσοστό μπορεί να ακολουθηθεί από αντίσταση στη χορήγηση αναλόγων σωματοστατίνης. Πιθανοί μηχανισμοί της παρατηρούμενης ταχυφύλαξης και ανθεκτικότητας στην θεραπεία είναι οι εξής 1) μείωση της ευαισθησίας των υποδοχέων ή της συγγένειάς τους για τα ανάλογα σωματοστατίνης, 2) απευαισθητοποίηση (μείωση της απάντησης λόγω της μη σύζευξης των υποδοχέων (receptor uncoupling), 3) ετερογενής έκφραση των υποδοχέων σωματοστατίνης στον όγκο, 4) ανάπτυξη κυτταρικών κλώνων στους οποίους δεν ανιχνεύονται οι sstr, 5) απουσία υποδοχέων με υψηλή συγγένεια στο χρησιμοποιούμενο ανάλογο σωματοστατίνης, 6) ταχυφύλαξη που αφορά τον έμμεσο μηχανισμό καταστολής πολλαπλασιασμού, 7) μεταλλάξεις στα γονίδια που οδηγούν στην παρουσία μη λειτουργικών υποδοχέων σωματοστατίνης στη μεμβράνη των κυττάρων στόχων [50,51]. Ως εκ τούτου, κρίνεται σκόπιμη η εισαγωγή νέων θεραπευτικών επιλογών, πιθανώς η σύνθεση και χρήση νέων αναλόγων με στόχο την στόχευση περισσότερων ή άλλων υποδοχέων από αυτούς που μελετώνται. Τέτοιες εναλλακτικές είναι το Som 230 (pasireotide) που στοχεύει όλους τους τύπους υποδοχέων εκτός του sstr4, το somatropim (DG3173) που είναι ένα νέο αργής αποδέσμευσης μόριο που δεσμεύει ειδικώς τους sstr2, sstr4 και sstr5 καθώς και μόρια που στοχεύουν σε ετεροδιμερή που σχηματίζουν οι υποδοχείς sstr2 και D2R (BIM-23A387, BIM-23A779, BIM-23A760 και BIM-23A781[52,53]. Ο σχηματισμός ετεροδιμερών έχει περιγραφεί για διάφορους τύπους συζευγμένων με G-πρωτεΐνη (GPCR) υποδοχείς. Οι Rocheville et al. πρότειναν για πρώτη φορά ότι η σύζευξη των υποδοχέων σωματοστατίνης με το φυσικό προσδέτη ή με το ανάλογο σωματοστατίνης, επάγει τη δημιουργία ομοδιμερών και ετεροδιμερών, γεγονός το οποίο επιφέρει 52

53 αλλαγές στη λειτουργική κατάσταση των εν λόγω υποδοχέων. Σύμφωνα με τη μελέτη τους, το μόριο που προκύπτει από το διμερισμό έχει καλύτερες φαρμακοκινητικές ιδιότητες, αφού αυξάνει τη συγγένεια προς τους αγωνιστές σωματοστατίνης και ντοπαμίνης, σε σχέση με αυτή που έχουν όταν δεν συμμετέχουν στο ετεροδιμερές [54]. 53

54 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Η Σωματοστατίνη Η Σωματοστατίνη είναι ένα νευροπεπτίδιο, το οποίο για πρώτη φορά ανακαλύφθηκε στον υποθάλαμο [55], ως ένα δεκατετραπεπτίδιο που κατέστελλε την έκκριση της σωματοτροπίνης (somatotropin inhibitor releasing factor - SIRF). Η ανακάλυψη αυτή αποτέλεσε την αρχή ερευνών και τον εντοπισμό της και σε πολλές άλλες ανατομικές θέσεις του κεντρικού νευρικού συστήματος. Η παραγωγή και δράση της σωματοστατίνης ανιχνεύεται σε πολλά περιφερικά όργανα του ανθρώπινου σώματος (στην ενδοκρινή μοίρα του παγκρέατος, στο έντερο, στο θυρεοειδή, στα επινεφρίδια, στους νεφρούς, στους σιελογόνους αδένες και σε πολλές άλλες θέσεις) [56]. H παραγωγή της Σωματοστατίνης ελέγχεται από έναν σύνθετο μηχανισμό επαγωγής της έκκρισης της ορμόνης, που περιλαμβάνει αυξητικούς παράγοντες, κυτοκίνες, νευροδιαβιβαστές, ιόντα και πεπτίδια [56,57,58]. Το γονίδιο της σωματοστατίνης στον άνθρωπο, βρίσκεται στο χρωμόσωμα 3q28 και κωδικοποιεί την παραγωγή της πρόδρομης μορφή μιας προ-προ-ορμόνης (pre-prosomatostatin). Ακολουθεί η παραγωγή της προ-σωματοστατίνης (prosomatostatin), ενός μορίου αποτελούμενου από 92 αμινοξέα και μετά από διαδικασία πρωτεόλυσης σε διαφορετικές θέσεις, τα καταληκτικά προϊόντα της σύνθεσης αυτής της είναι οι δύο βιολογικά ενεργείς μορφές της Σωματοστατίνης, αποτελούμενες από 14 και 28 αμινοξέα αντίστοιχα (SST-14 και SSΤ-28) [56] (Εικόνα 2.1). Εικόνα 2.1: Τροποποίηση από Bowen R. Τα μόρια της πρόδρομης μορφής της Σωματοστατίνης και τα τελικά βιολογικά προϊόντα Σωματοστατίνη 14 και

55 Στο μόριο της Σωματοστατίνης υπάρχουν δύο υπολείμματα κυστεΐνης συνδεδεμένα με δισουλφιδικό δεσμό. Ο τελευταίος καθώς και τα αμινοξέα 6,7,8 και 9 (phe, phe, trp, lys) είναι σημαντικά για τη βιολογική δράση της Σωματοστατίνης (Εικόνα 2.2). Εικόνα 2.2: Τα δύο μόρια της Σωματοστατίνη 14 και Σωματοστατίνη 28 Σωματοστατίνη 14 Σωματοστατίνη Οι υποδοχείς Σωματοστατίνης Η δράση της Σωματοστατίνης επιτυγχάνεται μέσω μίας ομάδας υποδοχέων που ανήκουν στη ευρύτερη οικογένεια των συζευγμένων με G-πρωτεΐνη (GPCR) υποδοχέων σωματοστατίνης (somatostatin receptors sstr). Οι sstr κωδικοποιούνται από πέντε διαφορετικά χρωμοσώματα και διακρίνονται σε έξι διακριτούς τύπους, τους sstr1, sstr 2A, sstr2b, sstr3, sstr4 και sstr5. Ο 55

56 υποδοχέας 2 έχει δύο ισομορφές, τους sstr2a και sstr2b, οι οποίοι είναι προϊόντα διαφορετικού ματίσματος (alternative splicing) [59,60]. O sstr2α έχει μακρύτερο καρβοξυτελικό άκρο και απαντάται συχνότερα ενώ ο υποδοχέας sstr2b έχει βραχύτερο καρβοξυτελικό άκρο και αποτελεί πιο σπάνια μορφή του υποδοχέα [61,62] (Πίνακας 2.1). Πίνακας 2.1: Χρωμοσωμική εντόπιση γονιδίων υπεύθυνων για τους υποδοχείς σωματοστατίνης-αριθμός αμινοξέων-ομολογία αμινοξέων sstr1 sstr2 sstr3 sstr4 sstr5 Χρωμοσωμική εντόπιση Μοριακό βάρος (kda) Αριθμός αμινοξέων Mέγεθος mrna (kb) 14q13 17q24 22q p p Oμολογία αμινοξέων sstr1 47% 46% 61% 49% sstr sstr sstr4 51 sstr5 Η χαρτογράφηση των υποδοχέων σωματοστατίνης στους διάφορους ιστούς έχει γίνει με τη χρήση πολλών μεθόδων όπως η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης [reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)], η αυτοραδιογραφία (autoradiography) και ο in situ υβριδισμός [63,64,65,66,67]. Η σύνθεση αντισωμάτων ειδικών για κάθε τύπο υποδοχέα [56,68], οδήγησε στη μελέτη της ακριβούς θέσης τους στα κύτταρα του οργάνου ή του όγκου προς μελέτη με τη χρήση της ανοσοϊστοχημικής μεθόδου. 56

57 2.3 Δράση της Σωματοστατίνης Μέσω των υποδοχέων αυτών η Σωματοστατίνη αλλά και τα ανάλογά της δρουν και επιφέρουν αλλαγές σε διάφορες λειτουργίες του οργανισμού όπως στη νευροδιαβίβαση, στην κινητικότητα και τη σύσπαση των λείων μυϊκών ινών, στην κυτταρική αύξηση, στην πρόσληψη ιόντων και θρεπτικών συστατικών από το λεπτό έντερο, στην αγγειοσύσπαση, την έκκριση Ντοπαμίνης από το μεσεγκέφαλο [57,58]. Στο γαστρεντερικό σύστημα και το πάγκρεας, ελέγχει και καταστέλλει την έκκριση όλων των παραγόμενων ορμονών και πεπτιδίων. Οι πολλές διαφορετικές λειτουργίες της σωματοστατίνης έχουν σαν βάση την επίδρασή της στην έκκριση των κυττάρων στόχων και στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [56,69] (Πίνακας 2.2) Πίνακας 2.2: Επίδραση της σωματοστατίνης σε διάφορα όργανα του ανθρώπινου οργανισμού και λειτουργικές αλλαγές που επιφέρει Όργανο/ανατομική θέση Λειτουργικές αλλαγές Υπόφυση/Κεντρικό Νευρικό Σύστημα Αυξητική Ορμόνη (GH), Θυρεοειδοτρόπο (ΚΝΣ) Ορμόνη (TSH), Φλοιοκορτικοτρόπος Ορμόνη (ACTH), Προλακτίνη (Prl) Θυρεοειδής T3, T4, καλσιτονίνη Γαστρεντερικό σύστημα γαστρίνη, σεκρετίνη, γαστρικό οξύ, κινητικότητα, απορρόφηση ιόντων, θρεπτικών συστατικών Πάγκρεας (ενδοκρινές) ινσουλίνη, γλυκαγόνη, σωματοστατίνη, παγκρεατικό πολυπεπτίδιο (ΡΡ) Πάγκρεας (εξωκρινές) ένζυμα, δικαρβονικά Νεφρός ρενίνη Επινεφρίδια αλδοστερόνη, κατεχολαμίνες 57

58 2.4 Μηχανισμοί δράσης της σωματοστατίνης και των συνθετικών αναλόγων της. Η ικανότητα της σωματοστατίνης και των αναλόγων της να επηρεάζουν την έκκριση των κυττάρων είναι αποτέλεσμα της διακοπής των σηματοδοτικών οδών του κυττάρου μέσω της αναστολής της κυκλικής ΑΜΡ (camp), των διαύλων Κ + και των διαύλων ασβεστίου (Ca +2 ). Mέσω της αναστολής της αδενυλικής κυκλάσης και της ενεργοποίησης φωσφατασών (φωσφατάσης της φωσφοτυροσίνης, φωσφατάση της καλσινευρίνης), διακόπτεται η εξαρτώμενη από τους υποδοχείς με σύζευξη G-πρωτεΐνης, εξωκύττωση [56]. Μετά τη δέσμευση της ορμόνης ή του αναλόγου της στους υποδοχείς σωματοστατίνης, προκαλείται μετατροπή της δομής του υποδοχέα και αυτό επάγει την δέσμευσή του με το σύστημα των G-πρωτεϊνών. Οι G-πρωτεΐνες, είναι ετερο-τριμερή αποτελούμενα από τα α,β,γ πρωτεϊνικά τμήματα. Μετά τη δέσμευση του υποδοχέα με το σύστημα των G-πρωτεϊνών, το α τμήμα του αποδεσμεύεται. Τόσο το α τμήμα όσο και το β/γ τμήμα, αλληλεπιδρούν με εκτελεστικά ενδοκυττάρια συστήματα του κυττάρου (αδενυλική κυκλάση, φωσφολιπάση, δίαυλοι Κ +, Ca +2, τυροσινική φωσφατάση και Mitogenactivated protein kinase (ΜΑΡ - κινάση) [70,71,72,73,74]. Η καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων με την επίδραση της σωματοστατίνης έγινε αργότερα γνωστή, κυρίως με την αυξανόμενη χρήση του οκτρεοτιδίου, οπότε και παρατηρήθηκε η σμίκρυνση ή σταθεροποίηση των όγκων ασθενών, στους οποίους είχαν χορηγηθεί ανάλογα σωματοστατίνης [75]. 2.5 Ανάλογα Σωματοστατίνης Οι δύο τελευταίες λειτουργίες της σωματοστατίνης, η καταστολή της κυτταρικής έκκρισης και του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, ώθησαν την έρευνα στη διερεύνηση της χρησιμότητας της σωματοστατίνης στον έλεγχο και 58

59 την θεραπεία νεοπλασμάτων που χαρακτηριστικά εξέφραζαν τους εν λόγω υποδοχείς. Πλήθος ερευνητικών μελετών για τους υποδοχείς σωματοστατίνης κατέδειξαν την παρουσία τους στα κύτταρα διαφόρων νεοπλασμάτων. Υποδοχείς σωματοστατίνης ανιχνεύονται σε ΝΕΝ του πνεύμονα, σε καρκινώματα μαστού, στο μυελοειδές καρκίνωμα του θυρεοειδούς, τα αδενώματα της υποφύσεως, τα φαιoχρωμοκυττώματα και άλλα [76,77,78, 79]. Μία ομάδα η οποία χαρακτηρίζεται από την υπερέκφραση των εν λόγω υποδοχέων είναι τα ΝΕΝ-ΓΕΣ [76,80]. Η ενδογενής σωματοστατίνη έχει χρόνο ημίσειας ζωής λιγότερο από 2 λεπτά (περίπου 1-3). Η σωματοστατίνη μετά την τοπική παραγωγή και έκλυσή της, αδρανοποιείται τάχιστα από πεπτιδάσες του αίματος και των ιστών. Ως εκ τούτου, για τη διεύρυνση των θεραπευτικών επιλογών σε όγκους που εκφράζουν τους εν λόγω υποδοχείς, κρίθηκε απαραίτητη η σύνθεση εκλεκτικών αναλόγων με παρόμοια χαρακτηριστικά, αλλά με καλύτερες φαρμακοκινητικές ιδιότητες (ανάλογα σωματοστατίνης). Τα ανάλογα σωματοστατίνης είναι κυκλικά οκταπεπτίδια με παρόμοια δομικά χαρακτηριστικά στο μόριο τους με αυτά της σωματοστατίνης αλλά με καλύτερες φαρμακοκινιτικές ιδιότητες όπως απουσία θέσεων διάσπασης. Το πρώτο ανάλογο σωματοστατίνης κατασκευάστηκε από τον Bauer το 1982 και είναι το γνωστό στην κλινική πράξη ως οκτρεοτίδιο [81] (Εικόνα 2.3). Έκτοτε και άλλα ανάλογα έχουν κατασκευασθεί και χρησιμοποιηθεί όπως το λανρεοτίδιο (Somatulin) και το βαπρεοτίδιο (RC 160). Τα συγκεκριμένα συνθετικά ανάλογα έχουν υψηλή συγγένεια για τους υποδοχείς sstr2, sstr5 και sstr3. Ένα άλλο ανάλογο σωματοστατίνης που στοχεύει όλους τους υποδοχείς εκτός του sstr4 είναι το πασιρεοτίδιο (pasireotide) (Εικόνα 2.4), όπως και το somatropim (DG3173) που στοχεύει τους sstr2, sstr4 και sstr5 και καταστέλλει την έκκριση της GH. 59

60 Εικόνα 2.3: Μόριο ενδογενούς Σωματοστατίνης και το συνθετικό ανάλογο Οκτρεοτίδιο. Εικόνα 2.4: Συνθετικά ανάλογα Σωματοστατίνης και οι υποδοχείς μέσω των οποίων δρουν. 2.6 Η Ντοπαμίνη H Ντοπαμίνη μία από τις κατεχολαμίνες, ελέγχει ποικιλία λειτουργιών στο κεντρικό νευρικό σύστημα όπως η αισθητικότητα, η συνέργεια κινήσεων και το αίσθημα πείνας μεταξύ άλλων. Η ντοπαμίμη επίσης επηρεάζει μία σειρά λειτουργιών στην περιφέρεια, όπως την καρδιακή λειτουργία, τη νεφρική λειτουργία, την κινητικότητα του γαστρικού σωλήνα και το ενδοκρινές σύστημα (έλεγχος ορμονικής λειτουργίας) [82]. H σύνθεση της Ντοπαμίνης 60

61 γίνεται από την αμινοξύτυροσίνη, από την οποία με την επίδραση της υδροξυλάσης της τυροσίνης παράγεται το μόριο της 3,4- διυδροξυφαινυλαλανίνης (L-DOPA) και στη συνέχεια με την επίδραση της αποκαρβοξυλάσης των L-αρωματικών αμινοξέων, παράγεται η Ντοπαμίνη (Εικόνα 2.5). Εικόνα 2.5: Υποδοχείς Ντοπαμίνης. Παραγωγή της Ντοπαμίνης (τυροσίνη l-dopa dopamine) στον νευρώνα, εξωκύττωση και σύνδεσή της με τους υποδοχείς ντοπαμίνης στη μεμβράνη των κυττάρων στόχων. Οι υποδοχείς Ντοπαμίνης Η δράση της Ντοπαμίνης επιτυγχάνεται μέσω μίας ομάδας υποδοχέων που ανήκουν στη ευρύτερη οικογένεια των συζευγμένων με G-πρωτεΐνη (GPCR) υποδοχέων (Dopamine Receptors-DR1-5). Οι υποδοχείς αυτοί κωδικοποιούνται από πέντε διαφορετικά γονίδια σε διάφορες χρωμοσωμιακές περιοχές και διακρίνονται σε πέντε διακριτούς τύπους, τους DR1, DR2, DR3, DR4 και DR5 οι οποίοι εμφανίζουν παρόμοια πρωτεϊνική δομή και λειτουργία 61

62 (Πίνακας 2.3). Ο υποδοχέας 2 έχει δύο ισομορφές τους DR2 short και DR2 long, οι οποίες είναι προϊόντα διαφορετικού ματίσματος (alternative splicing) και έχουν παρόμοιες φαρμακολογικές αλλά διαφορετικές λειτουργικές ιδιότητες [82,83,84]. Η ανάλυση της δομής και λειτουργίας των υποδοχέων ντοπαμίνης υπέδειξε ότι αυτοί χωρίζονται σε δύο επιμέρους «λειτουργικές» ομάδες τους DR1- like (DR1, DR5) και τους DR2 like (DR2, DR3,DR4). Πίνακας 2.3: Χρωμοσωμική εντόπιση γονιδίων υπεύθυνων για τους υποδοχείς ντοπαμίνης- Αριθμός αμινοξέων. DR1- like DR2 like DR1 DR5 DR2 DR2 DR3 DR4 Αμινοξέα Αμινοξέα ενδοκυττάριο loop στο Xρωμόσωμα 5q35 4p q q13 11q15 Οι υποδοχείς ντοπαμίνης περιλαμβάνουν στο μόριο τους δύο υπολείμματα κυστεΐνης και μεταξύ τους υπάρχει ένας δισουλφιδικός δεσμός, που χρησιμεύει στην σταθεροποίηση της δομής του υποδοχέα. Οι DR1-like υποδοχείς έχουν ένα βραχύ ενδοκυττάριο προσδέτη τυπικό για υποδοχείς που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες (G-stimulatory) που επάγουν την παραγωγή c-amp, ενώ οι DR2 like υποδοχείς έχουν ένα μακρύτερο προσδέτη τυπικό για υποδοχείς που αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες (G-inhibitory) που καταστέλλουν την παραγωγή c-amp. Αυτές είναι άλλωστε και οι θέσεις που είναι υπεύθυνες για τη σύζευξη των G πρωτεϊνών και για τη μετάδοση του σήματος στο κύτταρο στόχο. Εκτός της ευρείας παρουσίας των υποδοχέων ντοπαμίνης στο ΚΝΣ και κυρίως σε αδενώματα υποφύσεως, έχει διαπιστωθεί η παρουσία τους και στα ΝΕΝ. Σχετικά πρόσφατες μελέτες έδειξαν την παρουσία του υποδοχέα DR2 σε μία 62

63 μεγάλη ομάδα ΝΕΝ-ΓΕΣ κυρίως καλής διαφοροποιήσεως [85,86,87]. Αυτό θα μπορούσε να σημαίνει πως οι αγωνιστές Ντοπαμίνης έχουν θέση στη θεραπευτική αντιμετώπιση των όγκων αυτών. 2.7 Ομοδιμερή Ετεροδιμερή Οι διάφοροι τύποι υποδοχέων σωματοστατίνης έχουν την ιδιότητα να σχηματίζουν ομοδιμερή και ετεροδιμερή με άλλους υποδοχείς της οικογενείας τωνσυζευγμένων με G-πρωτεΐνη υποδοχέων σωματοστατίνης και η ιδιότητα αυτή επάγεται μετά τη σύνδεση του προσδέτη/αγωνιστή σε αυτούς. Τα διμερή τα οποία δημιουργούνται αλλάζουν τις ιδιότητες και τη λειτουργικότητα των υποδοχέων, για παράδειγμα την εκλεκτικότητα/συγγένεια για τον προσδέτη, την επαγόμενη από τον προσδέτη ικανότητα ενδοκύττωσης και την αύξηση (up-regulation) της παρουσίας και λειτουργικότητάς του [54]. Η ίδια μελέτη για πρώτη φορά έδειξε πως όσον αφορά τους υποδοχείς σωματοστατίνης, η δημιουργία διμερών είναι εξειδικευμένη. Ο υποδοχέας sstr5 για παράδειγμα σχηματίζει διμερή με τον υποδοχέα sstr1 αλλά όχι με τον υποδοχέα sstr4. Επίσης οι Rocheville et al. στη μελέτη τους έδειξαν ότι η δημιουργία διμερών είναι δοσο-εξαρτώμενη και έχει ευθέως ανάλογη σχέση με την ποσότητα του αγωνιστή. Η απόδειξη της ικανότητας των υποδοχέων σωματοστατίνης για δημιουργία ετεροδιμερών και με άλλα συγγενικά μέλη υποδοχέων όπως οι υποδοχείς ντοπαμίνης για παράδειγμα, οδηγεί στο συμπέρασμα ότι υπάρχει ένας εξειδικευμένος τρόπος επικοινωνίας-διαλόγου, σε μοριακό επίπεδο (molecular crosstalk), που αποσκοπεί στην δημιουργία διαφορετικών λειτουργικών συστημάτων. 63

64 ΙΙ. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗΣ ΜΕΛΕΤΗΣ Η έκφραση των υποδοχέων σωματοστατίνης και ντοπαμίνης στα ΝΕΝ-ΓΕΣ, έχει ανοίξει νέους δρόμους στην κλινική προσέγγιση και αντιμετώπιση των όγκων αυτών. Η κλινική τους χρησιμότητα για τη σταδιοποίηση, την απεικόνιση και τη θεραπεία είναι αδιαμφισβήτητα αυτή που υπαγορεύει την αναζήτηση τους σε κάθε νεόπλασμα προερχόμενο από το διάχυτο νευροενδοκρινές σύστημα. Η σαφής αποτύπωση του είδους του υποδοχέα που εκφράζεται σε κάθε νεόπλασμα, σε συνδυασμό με τον προσδιορισμό της λειτουργικής του κατάστασης είναι δυνατόν να καθορίσουν τις θεραπευτικές επιλογές, ιδιαίτερα σε νεοπλάσματα όπου άλλες παραδοσιακές μέθοδοι θεραπείας έχουν αποτύχει. Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι: α) Να προσδιορισθεί ποιοτικά και ποσοτικά η έκφραση όλων των υποδοχέων Σωματοστατίνης (sstr1, 2A, 2B, 3, 4, 5) στα λειτουργικά και μη λειτουργικά νευροενδοκρινή νεοπλάσματα του γαστρεντερικού και αναπνευστικού συστήματος. β) Να προσδιορισθεί η πιθανή συνέκφραση του υποδοχέα 2 της Ντοπαμίνης (D2R) με τους ανωτέρω υποδοχείς. γ) Να μελετηθεί η συσχέτιση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης αυτών των υποδοχέων με τα αποτελέσματα του σπινθηρογραφήματος με ραδιοσημασμένα ανάλογα σωματοστατίνης (Octreoscan). δ) Να διερευνηθεί ο ρόλος που μπορεί να διαδραματίζει ο υποδοχέας 2 της Ντοπαμίνης στο αποτέλεσμα του Octreoscan. ε) Να εκτιμηθεί η συσχέτιση της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης των εν λόγω υποδοχέων με το Octreoscan και σε μία ομάδα ΝΕΝ του πνεύμονα, έτσι ώστε να διαπιστωθούν πιθανές συσχετίσεις των αποτελεσμάτων με τα ΝΕΝ του ΓΕΣ. 64

65 στ) Mε βάση την ανάλυση των αποτελεσμάτων να εκτιμηθεί σε ποια νεοπλάσματα η χορήγηση αναλόγων σωματοστατίνης, πιθανώς να έχει καλύτερο θεραπευτικό αποτέλεσμα. 65

66 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 66

67 ΚΕΦΑΛΑΙΟ Συλλογή περιστατικών - αξιολόγηση αρχειακού υλικού 3.2 Υλικά Συνολικά, από τα αρχεία του Παθολογοανατομικού Εργαστηρίου του Γενικού Νοσοκομείου Αθηνών «Γ. Γεννηματάς», ανασύρθηκαν 138 περιπτώσεις ασθενών με ΝΕΝ-ΓΕΣ. Tα περιστατικά είχαν διαγνωσθεί την περίοδο από το 1998 έως και το Μικροσκοπήθηκαν όλες οι περιπτώσεις εξ αρχής, με σκοπό την επιβεβαίωση της διάγνωσης που είχε τεθεί, την επιλογή των τομών προς εξέταση και την εκ νέου ταξινόμηση της βλάβης. Περιστατικά που αφορούσαν βιοπτικά υλικά και πολύ μικρές βλάβες, εκ των ενόντων απορρίφθηκαν λόγω της εξάντλησης του υλικού και της αδυναμίας εφαρμογής όλων των προς ανάλυση χρώσεων. Η ανοσοϊστοχημική μελέτη για τους υποδοχείς σωματοστατίνης (sstr1-5) περιορίστηκε τελικά σε 76 περιστατικά (59 χειρουργικά και 17 βιοπτικά). Επίσης, 46 από αυτά εξετάσθηκαν και για τον υποδοχέα 2 της Ντοπαμίνης (D2R). Από τους εβδομήντα έξι (76) όγκους που ελέγχθηκαν για τους υποδοχείς σωματοστατίνης (sstr), πενήντα δύο (52) αφορούσαν όγκους του γαστρεντερικού σωλήνα, δεκαεννέα (19) όγκους παγκρέατος, τέσσερις (4) μεταστάσεις στο ήπαρ και έναν (1) όγκο αγνώστου πρωτοπαθούς εστίας. Από τους σαράντα έξι (46) όγκους που εξετάσθηκαν για τον υποδοχέα 2 της Ντοπαμίνης (D2R), τριάντα δύο (32) αφορούσαν όγκους του ΓΕΣ, δεκατέσσερις (14) του παγκρέατος, δύο (2) μεταστάσεις στο ήπαρ και έναν (1) όγκο αγνώστου πρωτοπαθούς εστίας (Πίνακας 3.3). Όλα τα περιστατικά μικροσκοπήθηκαν εκ νέου, με σκοπό την ταξινόμηση και βαθμοποίηση τους σύμφωνα με την ισχύουσα ταξινόμηση της WHO καθώς και για την επιλογή των κατάλληλων τομών του όγκου για τη διενέργεια των ανοσοϊστοχημικών χρώσεων. 67

68 Όλοι οι όγκοι ελέγχθηκαν αρχικά για την πιστοποίηση της νευροενδοκρινούς τους φύση με αντισώματα έναντι χρωμογρανίνης Α (CgA) και συναπτοφυσίνης (Syn) καθώς επίσης και για το δείκτη κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Ki-67 labeling index). Επιπλέον, ανεξάρτητα από την παρουσία ή μη κλινικού συνδρόμου, εξετάσθηκαν για τυχόν παραγωγή ορμονών και πεπτιδίων (γαστρίνη, ινσουλίνη, σεροτονίνη, σωματοστατίνη, γλυκαγόνη χολοκυστοκινίνη, παγκρεατικό πολυπεπτίδιο, αγγειοδραστικό εντερικό πεπτίδιο (VIP) και γρελίνη). Στη δεύτερη φάση της μελέτης, συνολικά αναλύθηκαν πενήντα πέντε (55) όγκοι από σαράντα τέσσερις (44) ασθενείς με ΝΕΝ-ΓΕΣ (σαράντα ένα (41) πρωτοπαθή και δεκατέσσερα (14) μεταστατικά) και είκοσι έξι (26) όγκοι από δεκαέξι (16) συνολικά ασθενείς με ΝΕΝ του πνεύμονα (δεκαέξι (16) πρωτοπαθείς όγκοι και δέκα (10) μεταστάσεις). Οι όγκοι ελέγχθηκαν για τους υποδοχείς σωματοστατίνης 2,3,5 (sstr2,3,5) και για τον υποδοχέα 2 της Ντοπαμίνης (D2R). Ακολούθως, συλλέχθηκαν τα προεγχειρητικά σπινθηρογραφήματα με ραδιοσημασμένα ανάλογα σωματοστατίνης (Octreoscan) των όγκων αυτών. Η φάση αυτή της μελέτης ήταν αρκετά δύσκολη, αφού στο Γενικό Κρατικό Αθηνών δεν υπάρχει τμήμα Πυρηνικής Ιατρικής, με συνέπεια οι χειρουργηθέντες ασθενείς να παραπεμφθούν σε άλλα Νοσοκομεία των Αθηνών για να υποβληθούν σε Octreoscan. Δυστυχώς ελάχιστα από τα τμήματα έχουν καλή ηλεκτρονική βάση δεδομένων και ενημερωμένα ηλεκτρονικά αρχεία ασθενών, κάτι το οποίο κατέστησε ιδιαίτερα δύσκολη την εύρεση των αποτελεσμάτων των εξετάσεων των ασθενών. Για να ξεπεραστεί αυτό το εμπόδιο συνεργαστήκαμε με το Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Uppsala εντάσσοντας πενήντα οκτώ (58) περιστατικά με νευροενδοκρινή νεοπλάσματα του ΓΕΣ και του πνεύμονα, με τα προεγχειρητικά Octreoscan από το αρχείο που τηρούσαν, στη μελέτη μας. 68

69 Οι όγκοι βαθμολογήθηκαν για την πρόσληψη των ραδιοσεσημασμένων αναλόγων σωματοστατίνης σύμφωνα με την κλίμακα κατά Krenning (Διάγραμμα 3.2) [88,89]. Όλοι οι όγκοι ελέγχθηκαν αρχικά για την νευροενδοκρινή τους φύση με αντισώματα έναντι της χρωμογρανίνης Α (CgA) και της συναπτοφυσίνης. Για την ταξινόμηση αυτών των όγκων σύμφωνα με τα νεότερα δεδομένα της WHO εκτιμήθηκε ο δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού Ki-67 (κλώνος ΜΙΒ-1) [90]. Επίσης διερευνήθηκετυχόν ύπαρξη συσχετίσεων μεταξύ της έκφρασης των υποδοχέων που μελετήσαμε, των αποτελεσμάτων της απεικόνισης με Octeroscan με διάφορες κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους όπως το μέγεθος του όγκου, αποτελέσματα στις μεταστατικές εντοπίσεις, η ανατομική θέση της πρωτοπαθούς εστίας και ο δείκτης κυτταρικού πολλαπλασιασμού Κi Μέθοδοι Α) Ανοσοϊστοχημική μελέτη Όλοι οι όγκοι ήταν μονιμοποιημένοι σε ουδέτερο διάλυμα φορμαλδεΰδης 10% και εγκλεισμένοι σε κύβους παραφίνης. Ελήφθησαν τομές των όγκων πάχους 5μm σε μικροτόμο και τοποθετήθηκαν σε θετικά φορτισμένα ιστολογικά πλακίδια (Superfrost/Plus Menzel, Braunswig Germany). Ακολούθησε αποπαραφίνωση των τομών σε τρία διαλύματα ξυλόλης και ενυδάτωση των ιστών σε διαλύματα αιθανόλης με κατιούσα συγκέντρωση (100, 90, 70, 50 ). Εν συνεχεία, τα πλακίδια ξεπλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα TBMS (10 mm Tris, 10Mm phosphate buffer, 37 NaCl και 0,05% thimerosal-ph 7,4). Οι τομές επωάσθηκαν σε διάλυμα υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η 2 Ο 2 ) για 30 λεπτά της ώρας. Μετέπειτα τα πλακίδια μεταφέρθηκαν και ξεπλύθηκαν εκ νέου σε ρυθμιστικό διάλυμα TBMS και εμβαπτίστηκαν σε διάλυμα κιτρικού οξέος 10 Μμ (Ph 6). Ακολούθως, τοποθετήθηκαν σε φούρνο μικροκυμάτων 69

70 ισχύος 600W για 20 λεπτά της ώρας, προκειμένου να αναδειχθούν οι θέσεις σύνδεσης. Οι τομές αφέθηκαν να κρυώσουν σε θερμοκρασία δωματίου και ξεπλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα TBMS. Οι τομές επωάσθηκαν στη συνέχεια με αντιορρούς για Χρωμογρανίνη (CgA) σε αραίωση 1:50 (Zymed, San Francisco, CA, USA), Συναπτοφυσίνη σε αραίωση 1:50 (Zymed, San Francisco, CA, USA), ορμόνες και πεπτίδια [γαστρίνη, γρελίνη, ινσουλίνη, σεροτονίνη, γλυκαγόνη, σωματοστατίνη, χολοκυστοκινίνη, παγκρεατικό πολυπεπτίδιο (PP) και αγγειοδραστικό εντερικό πεπτίδιο (VIP)]. Εξετάσθηκαν επίσης για όλους τους τύπους των υποδοχέων Σωματοστατίνης (sstr1, 2A, 2B, 3, 4, 5) σε αραίωση 1:3000 (Gramsch Laboratories Schwabhausen, Germany) και μέρος των όγκων εξετάσθηκε και για τον υποδοχέα 2 της ντοπαμίνης (D2R) σε αραίωση 1:300 (Novus Biologicals, USA). H επώαση είχε διάρκεια 18 ώρες σε θερμοκρασία 4 C. Χρησιμοποιήθηκε η τυπική τεχνική της Αβιδίνης-Βιοτίνης-Συμπλέγματος υπεροξειδάσης (ABC-Vector Laboratories, Inc, Burlingame CA). Ως χρωμογόνο χρησιμοποιήθηκε η διαμινοβενζιδίνη (DAB) με αντίχρωση Αιματοξυλλίνης. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν γνωστά θετικά αδενώματα υποφύσεως και ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε ρυθμιστικό διάλυμα στη θέση του αντισώματος [78, 91]. Στο διάγραμμα που ακολουθεί φαίνονται σχηματικά τα βασικά βήματα της ανοσοϊστοχημικής μεθόδου (Διάγραμμα 3.1). 70

71 Διάγραμμα 3.1: α. Αποπαραφίνωση β. Αντιγονική αποκάλυψη γ. Δέσμευση των μη χρησιμοποιούμενων επιτόπων δ. Εφαρμογή αντισώματος (πρωτοταγή - δευτεροταγή). Αποπαραφίνωση Αντιγονική αποκάλυψη Δέσμευση των μη χρησιμοποιούμενων επιτόπων Προσθήκη πρωτογενούς αντισώματος Προσθήκη δευτερογενούς αντισώματος Η διαβάθμιση της ανοσοθετικότητας των υποδοχέων σωματοστατίνης (sstr1-5) βασίστηκε σε ένα τετραβάθμιο σύστημα που χρησιμοποιήθηκε από τους Volante και συνεργάτες [80] και φαίνεται ότι έχει πολύ καλή συσχέτιση με τα αποτελέσματα της έκφρασης των υποδοχέων με το Octreoscan. Η απουσία χρώσεως ή η κυτταροπλασματική χρώση βαθμολογήθηκε με 0 και 1 71

72 αντίστοιχα και το αποτέλεσμα θεωρήθηκε αρνητικό. Η ήπια-μέτρια ασυνεχής μεμβρανική χρώση βαθμολογήθηκε με 2 (score 2) και η έντονη συνεχής μεμβρανική χρώση βαθμολογήθηκε με 3 (score 3) (Εικόνα 3.1). Οι δύο τελευταίες αντιστοιχούσαν σε θετικό αποτέλεσμα για την έκφραση των εν λόγω υποδοχέων (Πίνακας 3.1). Εικόνα 3.1: Παραδείγματα ανοσοϊστοχημικής χρώσης για sstr και D2R με την βαθμοποίηση τους. 72

73 Πίνακας 3.1: Βαθμοποίηση του ανοσοϊστοχημικού αποτελέσματος για τους υποδοχείς σωματοστατίνης (sstr). Scores Αποτέλεσμα χρώσης Είδος / κατανομή της χρώσης Score 0 Αρνητικό Απουσία χρώσης Score 1 Αρνητικό Κυτταροπλασματική χρώση Score 2 Θετικό Μεμβρανική, ήπια έως μέτρια, μη κυκλοτερής Score 3 Θετικό Μεμβρανική, έντονη, κυκλοτερής Η διαβάθμιση του υποδοχέα D2R έγινε με βάση την ένταση της μεμβρανικής χρώσης από ήπια έως έντονη (score 1-3) αντίστοιχα (Πίνακας 3.2) [92]. Πίνακας 3.2: Βαθμοποίηση του ανοσοϊστοχημικού αποτελέσματος για τον υποδοχέα 2 της Ντοπαμίνης D2R. Score Score 0 Score 1 Score 2 Score 3 Αποτέλεσμα χρώσης Απουσία χρώσης Ήπια χρώση Μέτρια χρώση Έντονη χρώση 73

74 Β) Σπινθηρογράφημα με οκτρεοτίδιο - Octreoscan Πριν τη χορήγηση ραδιοφαρμάκου και τη διενέργεια του σπινθηρογραφήματος με ραδιοσεσημασμένο ανάλογο σωματοστατίνης λήφθηκε λεπτομερές ατομικό ιστορικό έτσι ώστε να αποκλεισθεί πιθανή εγκυμοσύνη σε γυναίκες ασθενείς, να ληφθούν υπόψιν τυχόν προηγηθείσες επεμβάσεις, παρουσία χρόνιας νόσου (φλεγμονώδους, κοκκιωματώδους), να εκτιμηθεί η ηπατική και νεφρική λειτουργία και να προσδιορισθεί ο χρόνος διακοπής τυχόν θεραπείας με ανάλογα σωματοστατίνης. Το ραδιοφάρμακο που χρησιμοποιήθηκε ήταν το 111 ίνδιο-διαιθυλενοτριαμινοπενταοξικό οξύ-d-φαινυλαλανινο-οκτρεοτίδης (111Indium-diethylene-triamine-pentaaceticacid (DTPA) - Octreoscan ) και η χορηγούμενη δόση κυμάνθηκε από 185 έως 222 MBq (5-6 mci). Οι εικόνες λήφθηκαν στις 4 και 24 ώρες από την έγχυση του ραδιοφαρμάκου (Εικόνα 3.2 Α και 3.2 Β). Εικόνα 3.2A: Λήψη στις 4 ώρες Εικόνα 3.2 Β: Λήψη στις 24 ώρες Πρόσθια λήψη Οπίσθια λήψη Πρόσθια λήψη Οπίσθια λήψη 74

75 Χρησιμοποιήθηκε γ-κάμερα με ευρύ πεδίο για τη λήψη των προσθιοπίσθιων εικόνων. Συμμετρικά παράθυρα ενέργειας 20% επικεντρώθηκαν στα σημεία υψηλότερης έκλυσης σωματιδίων (photo-peaks) του 111-In (173 και 247keV) όπως έχει ήδη περιγραφεί στη βιβλιογραφία [31]. Η εκτίμηση και αξιολόγηση των εικόνων φιλμ έγινε από τους πυρηνικούς ιατρούς του εκάστοτε νοσηλευτικού ιδρύματος. Tο πρωτόκολλο που για την αξιολόγηση και τη βαθμοποίηση των Octreoscan έχει ήδη περιγραφεί και προταθεί από τους Kwekkeboom και συνεργάτες [93] (Διάγραμμα 3.2). Η in vivo μέτρηση της πρόσληψης του ραδιοφαρμάκου βαθμοποιήθηκε στις προσθιοπίσθιες εικόνες, σύμφωνα με τετραβάθμια κλίμακα στην οποία: η απουσία πρόσληψης βαθμολογήθηκε με 0 (grade 0), η πρόσληψη με μικρότερη ένταση από αυτή του ήπατος βαθμολογήθηκε με 1 (grade 1), ένταση πρόσληψης ίση με αυτή του ήπατος βαθμολογήθηκε με 2 (grade 2), υψηλότερη από αυτή του ήπατος βαθμολογήθηκε με 3 (grade 3) και τέλος πρόσληψη ίση ή υψηλότερη από αυτή του νεφρού ή του σπληνός βαθμολογήθηκε με (grade 4) [89] (Διάγραμμα 3.2) 75

76 Διάγραμμα 3.2: Βαθμολόγηση (grading) της πρόσληψης του ραδιοφαρμάκου στο Octreoscan. ~ΗΠΑΡ ΗΠΑΡ ΣΠΛΗΝΑ / ΝΕΦΡΟ ΠΡΟΣΛΗΨΗ ΡΑΔΙΟΦΑΡΜΑΚΟΥ ΑΠΟ ΤΟΝ ΟΓΚΟ ΣΤΟ OCTREOSCAN BΑΘΜΟΠΟΙΗΣΗ ΠΡΟΣΛΗΨΗΣ ΡΑΔΙΟΦΑΡΜΑΚΟΥ ΑΠΟ ΤΟΝ ΟΓΚΟ Grade 1 Grade 2 Grade 3 Grade 4 Χαμηλότερη πρόσληψη από αυτή του ήπατος Ίση πρόσληψη από αυτή του ήπατος Υψηλότερη πρόσληψη από αυτή του ήπατος Ίση ή υψηλότερη πρόσληψη από αυτή του νεφρού και του σπληνός 76

77 Γ) Στατιστική ανάλυση Στατιστικώς σημαντικά θεωρήθηκαν τα αποτελέσματα με τιμή p-value<0.05. Οι τιμές παρουσιάστηκαν σαν οι μέσες τιμές ± standard deviation (±SD) όταν ήταν κανονικά ταξινομημένα ή σαν η μέση τιμή και η διάμεση (inter-median) τιμή και η διακύμανση όταν δεν ήταν φυσιολογικά κατανεμημένα. Η κανονική διακύμανση των συνεχών μεγεθών μελετήθηκε με την εφαρμογή του μη παραμετρικού τεστ Kolmogorov-Smirnov. Η σύγκριση των υποομάδων έγινε με ένα ανεξάρτητο απλό t-test. Το Mann Whitney U test διενεργήθη για μεταβλητές που δεν ήταν κανονικά κατανεμημένες. Η συσχέτιση μεταξύ των κατηγοριών των μεταβλητών εκτιμήθηκαν από το chi-square test ή με το Fisher s Exact Test όταν αυτό χρειαζόταν. Οι συσχετίσεις μεταξύ των μεταβλητών εκτιμήθηκαν από το Pearson s coefficient εκτός από τις μεταβλητές εκείνες που δεν ήταν κανονικά κατανεμημένες, οπότε και εκτιμήθηκαν από το Spearman s correlation coefficient. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με τη χρήση του προγράμματος SPSS (version 18.0; PASW SPSS, Inc., Chicago, IL, USA) για τα Windows XP (Microsoft Corp.) 3.4 Αποτελέσματα Η κατανομή των εβδομήντα έξι (76) ΝΕΝ σύμφωνα με την κατάταξη της WHO (2010) και σύμφωνα με το στάδιο της νόσου εμφανίζονται στους πίνακες 3.3 και 3.4 αντίστοιχα. 77

78 Πίνακας 3.3: Παρουσίαση των 76 νεοπλασμάτων σύμφωνα με την κατάταξη της WHO 2010 Γαστρικοί όγκοι Λεπτό έντερο Σκωλη/δ ής απόφυση Παχύ έντερο Πάγκρεας Ηπατικές μεταστάσει ς Όγκος κοιλίας Σύνολο Grade 1 (ki-67 index <2%) 11(57.8%) 7(46.6%) 4(80%) 4(30.7%) 5(26.3%) 0(0%) 1(100%) 32 (42.1%) Grade 2 (ki-67 index 2-20%) 4(21%) 5(33.3%) 1(20%) 2(15.3%) 12(63.1%) 3(75%) 0(0%) 27 (35.5%) Grade 3 (ki-67 index>20) 4(21%) 3(20%) 0(0%) 7(53.8%) 2(10.5%) 1(25%) 0(0%) 17 (22.3%) Πίνακας 3.4: Παρουσίαση των 76 νεοπλασμάτων σύμφωνα με το στάδιο της νόσου - Σταδιοποίηση σύμφωνα με την TNM κατάταξη Γαστρικ οί όγκοι Λεπτό έντερο Σκωλη/δής απόφυση Παχύ έντερο Πάγκρεας Ηπατικές μεταστάσει ς Όγκος κοιλίας Στάδιο I Συνολο Στάδιο IIa Στάδιο IIb Στάδιο IIIa Στάδιο IIIb Στάδιο IV

79 Σαράντα ένας (41) ασθενείς ήταν άνδρες, ενώ η μέση ηλικία της ομάδας μελέτης ήταν 55.2 έτη (διακύμανση από έτη). Πέντε (5) όγκοι ήταν λειτουργικοί (6.57%) και οι υπόλοιποι 71 (93.42%) ήταν μη λειτουργικοί. Τριάντα επτά (37) (48.68%) όγκοι ήταν θετικοί για ένα ή περισσότερα πεπτίδια (17 για σεροτονίνη, 11 για σωματοστατίνη, 7 για γρελίνη, 6 για ινσουλίνη, 6 για χολοκυστοκινίνη, 5 για γλυκαγόνη, 4 για PP, 4 για VIP, 1 για γαστρίνη και 1 για β-ωχρινοτρόπο Ορμόνη (Luteinizing Hormone-β-LH). Το μέγεθος του όγκου κυμαινόταν από 0.5εκ. έως 20 εκ. με μέση τιμή 2.9εκ. Μεταστατική νόσος βρέθηκε σε 21 περιπτώσεις σε περιοχικούς λεμφαδένες, σε 8 περιπτώσεις στο ήπαρ, σε 1 περίπτωση στον πνεύμονα, σε 1 στο πάγκρεας ενώ σε 1 περίπτωση ανευρέθησαν πολλαπλές μεταστατικές εστίες. Η διαβάθμιση της χρώσης κυμαινόταν από ήπια μη κυκλοτερής, μέχρι έντονη και κυκλοτερής. Οι όγκοι παρουσίαζαν ετερογένεια στην έκφραση των υποδοχέων, κάτι το οποίο έχει αναφερθεί επανειλημμένως στη διεθνή βιβλιογραφία. Η κατανομή των υποδοχέων σωματοστατίνης (sstr1-5) και του υποδοχέα 2 της ντοπαμίνης D2R παρουσιάζεται στον πίνακα 3.5. Σε 6 όγκους παρατηρήθηκε έκφραση όλων των υποδοχέων, σε 10 όγκους εκφράζονταν πέντε από τους έξι υποδοχείς και σε 13 όγκους συνεκφράζονταν τρεις ή τέσσερις υποδοχείς. Σε όλους τους λειτουργικούς, όγκους τουλάχιστον ένας sstr υποδοχέας ήταν θετικός. Συνέκφραση οποιουδήποτε υποδοχέα σωματοστατίνης (sstr1-5) με τον υποδοχέα 2 της ντοπαμίνης (D2R) βρέθηκε σε δεκαπέντε (15) από τα δεκαεπτά (17) (88.23%) περιστατικά με θετικό αποτέλεσμα για D2R. Δύο από τους 46 (4.34%) όγκους ήταν θετικοί μόνο για D2R. Η συνέκφραση των sstr2a και D2R και sstr2b και D2R βρέθηκε σε 12 από τους 17 (70.58%), και σε 7 από τους 17 (41.17%) όγκους αντίστοιχα. Τέλος, η συνέκφραση του υποδοχέα sstr5 και D2R βρέθηκε σε 8 από τους 17 (47.05%) όγκους (Πίνακας 3.5). 79

80 Η ένταση της χρώσης κυμαινόταν από ήπια έως μέτρια και έντονη. Όλα τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν είχαν προηγουμένως πιστοποιηθεί στην καθ ημέρα πράξη. Όλες οι χρώσεις έγιναν σε συνεχείς, επάλληλες τομές έτσι ώστε να έχουμε αντίληψη των αποτελεσμάτων σε όλα τα περιστατικά σε παρόμοιες θέσεις των όγκων. Πίνακας 3.5: Κατανομή των υποδοχέων sstr1-5 και D2R στους 76 όγκους του γαστρεντερικού συστήματος σύμφωνα με την κατάτaξη της WHO sstr1 sstr2a sstr2b sstr3 sstr4 sstr5 οποιοσδήπο τε sstr* D2R Grade 1 NET 15/33 (45.4%) 24/33 (72.7%) 15/33 (45.4%) 15/33 (45.4%) 7/33 (21.2%) 14/33 (42.4%) 26/33 (78.7%) 3/13 (23%) Grade 2 NET 8/22 (36.3%) 16/22 (72.7%) 9/22 (40.9%) 6/22 (27.2%) 3/22 (13.6%) 6/22 (27.2%) 17/22 (77.2%) 4/17 (23.5%) Grade 3 NEC 6/21 (28.5%) 10/21 (47.6%) 12/21 (57.1%) 6/21 (28.5%) 2/21 (9.5%) 6/21 (28.5%) 15/21 (71.4%) 10/16 (62.5%) Σύνολο 29/76 (38.1%) 40/76 (52.6%) 36/76 (47.3%) 27/76 (35.5%) 12/76 (15.7%) 26/76 (34.2%) 58/76 (76.3%) 17/46 (36.9%) Είκοσι οκτώ από τους 60 ασθενείς ήταν άνδρες (46.66%) ενώ η μέση ηλικία της ομάδας μελέτης ήταν 56±12 έτη (διακύμανση έτη). Το μέσο μέγεθος των όγκων ήταν παρόμοιο για τους όγκους του γαστρεντερικού και του πνεύμονα (Πίνακας 3.6). 80

81 Πίνακας 3.6: Χαρακτηριστικά των ασθενών και των όγκων που μελετήθηκαν, συσχέτιση ανάμεσα στις ποσοτικές παραμέτρους (ηλικία και διάμετρος όγκων) και του score του Octreoscan και της έντασης του score της ανοσοϊστοχημικής μελέτης για τους υποδοχείς sstr and D2R.Tα περιστατικά εξετάστηκαν με βάση την προέλευσή τους (ΓΕΣ, πνεύμονας) και την πρωτοπαθή ή δευτεροπαθή εντόπισή τους. Παρασκευάσματα /παράμετροι Ηλικία ασθενών (έτη) Μέγεθος όγκου (mm) Σύνολο (81) Πρωτοπαθεις εστίες (54) Μεταστατικές εστίες (27) Μικρού μεγέθους όγκοι (41) Μεγάλου μεγέθους όγκοι (40) Νευροενδοκριν ή νεοπλάσματα Γαστρεντερικού (55) Νευροενδοκρ ινή νεοπλάσματα πνεύμονα(26) 56± ± ± ±13 56± ± ± (18, 3-120) 23.3 (15, 3-75) 35.4 (25, 4-120) 10.9 (10, 3-18) 44.2 (40, ) # 28.1 (18, 6-120) 25.8 (20.5, 3-70) Octreoscan grade 2 (2, 0-4) 1.7 (1.5, 0-4) 2.7 (3, 0-4) 1.5 (1, 0-4) 2.5 (3, 0-4) # 2.4 (3, 0-4) 1.2 (1, 0-4)* Sstr2 score 1.9 (2, 0-3) 1.7 (2, 0-3) 2.3 (3, 1-3) 1.7 (2, 0-3) 2.1 (2, 0-3) ## 2.1 (2, 0-3) 1.5 (1, 0-3)* Sstr3 score 1 (1, 0-3) 0.9 (1, 0-3) 1 (1, 0-3) 0.8 (0, 0-3) 1.2 (1, 0-3) ## 1.1 (1, 0-3) 0.7 (1, 0-3) Sstr5 score 0.8 (0, 0-3) 0.8 (0, 0-3) 0.7 (0, 0-3) 0.8 (0, 0-3) 0.8 (0.5, 0-3) 0.8 (0, 0-3) 0.7 (1, 0-3) Αριθμός ασθενών στις υποομάδες που μελετήθηκαν (23) (22) (1) (15) (8) (23) (0) D2R score 0.7 (0, 0-3) 0.7 (0, 0-3) (0, 0-2) 0.6 (0, 0-3) 0.7 (0, 0-3) (-) Μεταξύ των περιστατικών από το ΓΕΣ περιλαμβάνονταν τρεις λειτουργικοί όγκοι (δύο γαστρινώματα και ένα ινσουλίνωμα). Είκοσι έξι όγκοι ήταν Grade 1 (G1), 27 Grade 2, (G2) και 2 Grade 3(G3) νευροενδοκρινή καρκινώματα. Ανάμεσα στους όγκους του πνεύμονα συμπεριλήφθηκαν 14 τυπικά καρκινοειδή (TC) και 2 άτυπα καρκινοειδή (AC). Στον πίνακα 3.7 η κατανομή των υποδοχέων σωματοστατίνης sstr 2,3,5 καθώς και του υποδοχέα D2R παραθέτονται για τα νεοπλάσματα του ΓΕΣ που εξετάσθηκαν. Ιδιαίτερα υψηλή συσχέτιση των αποτελεσμάτων της ανοσοϊστοχημικής μελέτης και του Octreoscan παρατηρήθηκε στους παγκρεατικούς όγκους, στους όγκους του ορθού και στα TC του πνεύμονα (Πίνακας 3.7). Στον πίνακα 3.8 παρατίθεται η κατανομή των υποδοχέων σωματοστατίνης sstr2,3,5 στους όγκους του πνεύμονα. 81

82 Πίνακας 3.7: Κλινικοπαθολογικά δεδομένα, ανοσοϊστοχημικά ευρήματα και αποτελέσματα του σπινθηρογραφήματος με οκτρεοτίδιο και συσχέτιση όλων αυτών στους ΝΕΝ του ΓΕΣ που μελετήθηκαν. Πρωτοπαθής εντόπιση/ παρασκευάσμα τα Παρασκευάσματα που μελετήθηκαν 25 παγκρέατος 20 πρωτοπαθείς 2 λεμφαδενικές 3 ηπατικές 18 ορθό 6 πρωτοπαθείς 6 λεμφαδενικές 6 ηπατικές Grading του όγκου 13 Grade1 11 Grade 2 1 Grade 3 5 Grade1 13 Grade 2 4 στομάχου 4 πρωτοπαθείς 3 Grade1 1 Grade /λου 4 πρωτοπαθείς 2 Grade1 1 Grade 2 1 Grade 3 3 ειλεός/λεπτού έντερου 3 πρωτοπαθείς 2 Grade 1 1 Grade 2 Octreoscan (%) Sstr2 (%) Sstr3 (%) Sstr5 (%) Συσχέτιση (IHC sstr2/srs) (%) D2R (%) 17 (68) 22 (88) 12 (48) 14 (56) 20/25 (80)* 5/9 (55.6% ) 16 (88.9) 16 (88.9) 9 (50) 1 (5.6%) Συσχέτιση (IHC D2R/SRS) (%) 6/9 (66.7) 18/18 (100)* 0/2 2/2 1 (25) 3 (75) 1 (25) 1 (25) 2/4 (50) 0/4 3/4 (75) 3 (75) 4 (100) 3 (75) 2 (50) 3/4 (75) 3 (75) 2/4 (50) 1 (33.3) /3 (66.7) 0/3 2/3 (66.7) 1 τυφλό 1 πρωτοπαθής 1 Grade 1 1 (100) /1 (100) 0/0 N/A Σύνολο πρωτοπαθείς 17 μεταστάσεις 26 Grade1 27 Grade 2 2 Grade 3 39 (70.9) 45 (81.8) 25 (45.5) 18 (32.7) 45/55 (81.8)* 8/23 (34.8)

83 Πίνακας 3.8: Κλινικοπαθολογικά δεδομένα, ανοσοϊστοχημικά ευρήματα και αποτελέσματα του σπινθηρογραφήματος με οκτρεοτίδιο και συσχέτιση όλων αυτών στους ΝΕΝ του πνεύμονα που μελετήθηκαν. Πρωτοπαθής εντόπιση/ παρασκευάσμ ατα 26 όγκοι πνεύμονα Παρασκευάσματα που μελετήθηκαν 14 πρωτοπαθείς 1 επινεφριδιακή 2 ηπατικές 5 λεμφαδενικές 2 πρωτοπαθείς 1 λεμφαδενικές 1 ηπατικές Grading του όγκου 22 τυπικά καρκινοειδή 4 άτυπα καρκινοειδή Octreoscan (%) Sstr2 (%) 7 (31.8) 6 (27.3) Sstr3 (%) 1 (4.5) Sstr5 (%) 2 (9.1) Συσχέτιση (IHC sstr2/srs) (%) 19/22 (86.4)* D2R (%) n/p 1 (25) 2 (50) 0 0 3/4 (75) n/p 8 (30.8) 8 (30.8) 1(3.8) 2 (7.7) 22/26 (84.6)* Στον πίνακα 3.9 παρουσιάζονται τα συγκεντρωτικά αποτελέσματα για τους 81 συνολικά όγκους που εξετάσθηκαν καθώς και τα αποτελέσματα των είκοσι τριών (23) όγκων όπου ελέγχθηκε και ο D2R. 83

84 Πίνακας 3.9 Κλινικοπαθολογικά δεδομένα, ανοσοϊστοχημικά ευρήματα και αποτελέσματα του σπινθηρογραφήματος με οκτρεοτίδιο και συσχέτιση όλων αυτών συνολικά. Πρωτοπαθής εντόπιση/ παρασκευάσματα Παρασκευάσμ ατα που μελετήθηκαν Octreo scan (%) Sstr2 (%) Sstr3 (%) Sstr5 (%) Συσχέτιση (IHC sstr2 / SRS) (%) D2R (%) Συσχέτιση (IHC D2R / SRS) (%) Σύνολο πρωτοπαθείς 47 (58) 53(65.4) 26(32.1) 20 (24.7) 70/81 (82.7)* 8 (34.8) 8/23 (65.2) 27 μεταστάσεις Ο υποδοχέας sstr2 εκφραζόταν και στα 53 θετικά περιστατικά (65.4%). Επιπλέον, ο sstr3 εκφραζόταν σε 26 (32.1%) και ο sstr5 σε 20 (24.7%) όγκους. Δεν υπήρχε περιστατικό όπου ο sstr2 να είναι αρνητικός και κάποιος από τους άλλους υποδοχείς να είναι θετικός. Από τους 81 όγκους που εξετάσθηκαν, το σπινθηρογράφημα με οκτρεοτίδιο ήταν θετικό σε 47 περιπτώσεις (13 Grade 2, 13 Grade 3 and 21 Grade 4 σύμφωνα με την κλίμακα του Krenning) ενώ ήταν αρνητικό σε 34 (13 Grade 1 and 21 Grade 0) περιστατικά. Επιπλέον, ο βαθμός πρόσληψης (grade) του Octreoscan ήταν υψηλότερος στις μεταστατικές εστίες, στους μεγαλύτερου μεγέθους όγκους (>2εκ.) και στα ΝΕΝ- ΓΕΣ. Η ένταση της χρώσης για τον sstr2 ήταν υψηλότερη στα ΝΕΝ-ΓΕΣ ενώ υπήρχε μία τάση να είναι υψηλότερη στις μεταστατικές εστίες και στους μεγάλου μεγέθους όγκους (>2 εκ.). Ομοίως, για τον υποδοχέα sstr3 η ένταση της χρώσης υπήρχε τάση να είναι υψηλότερη στις μεταστατικές εστίες και στους μεγαλύτερου μεγέθους όγκους (p=0.029 και p= 0.03 αντίστοιχα) (Πίνακες 3.10 και 3.11). Στο 82.7% των περιστατικών που μελετήθηκαν, υπήρχε συσχέτιση του αποτελέσματος των δύο μεθόδων (είτε θετικό, είτε αρνητικό αποτέλεσμα σε αμφότερες τις μεθόδους) ανάμεσα στην έκφραση για τον sstr2 και για το Octreoscan (p<0.001) (Εικόνα 3.2 Α και Β). 84

85 Εικόνα 3.2Α: Octreoscan grade 4 σε νευροενδοκρινές νεόπλασμα παγκρέατος grade 1. Εικόνα 3.2Β: Έκφραση του sstr2 (score2) σε νευροενδοκρινές νεόπλασμα παγκρέατος grade 1(x200 ) Η χρώση είναι μεμβρανική, έντονη αλλά μη κυκλοτερής. Εικ. 3.2Α Εικ. 3.2Β Σε ποσοστό 12.3% θετικών ανοσοϊστοχημικά όγκων, το Octreoscan ήταν αρνητικό (Εικόνα 3.3Α και 3.3Β), ενώ σε ποσοστό 4.9% με θετικό Octreoscan, η ανοσοϊστοχημική μελέτη έδωσε αρνητικό αποτέλεσμα (Εικόνα 3.4 Α και 3.4 Β) Εικόνα3.3Α: Αρνητικό Octreoscan σε νευροενδοκρινές νεόπλασμα δωδεκαδακτύλου grade2 Εικόνα 3.3Β Έκφραση sstr2 σε νευροενδοκρινές νεόπλασμα δωδεκαδακτύλου grade 2, score 3 (x400) Η χρώση είναι μεμβρανική, έντονη και κυκλοτερής. Εικ. 3.3Α Εικ. 3.3Β 85

86 Εικόνα 3.4Α: Θετικό Octreoscan, grade 3, σε νευροενδοκρινές νεόπλασμα παγκρέατος grade 2 Εικόνα 3.4Β: Αρνητική (κυτταροπλασματική) χρώση σε νευροενδοκρινές νεόπλασμα παγκρέατος grade2 Εικ. 3.4Α Εικ. 3.4Β Εκτός αυτού, συσχέτιση μεταξύ του υποδοχέα sstr3 και του Octreoscan παρατηρήθηκε σε 52 από τα 81 περιστατικά (64.2%) (30 αρνητικά και 22 θετικά αποτελέσματα) (p=0.001). Συσχέτιση ανάμεσα στην ανοσοϊστοχημική έκφραση του υποδοχέα sstr5 και του Octreoscan παρατηρήθηκε σε 46 από τους 81 (56.8%) όγκους (30 αρνητικά και 16 θετικά) (p=0.04). Στους ΝΕΝ-ΓΕΣ συσχέτιση ανάμεσα στις δύο μεθόδους παρατηρήθηκε στο 81.8% (p<0.001) των περιστατικών και αντιστοίχως στο 84.6% (p=0.003) των περιστατικών του πνεύμονα (Πίνακας 3.11). H συσχέτιση μεταξύ της ανοσοϊστοχημικής χρώσης του sstr2 και του Octreoscan ήταν 83.3% (p<0.001) σε όγκους από πρωτοπαθείς εστίες και 81.5% στα 27 περιστατικά από μεταστατικές εστίες (p=0.02). Τέλος, μία συνολική συσχέτιση ανάμεσα στις δύο μεθόδους ήταν 87.5% (p<0.001) στα 40 περιστατικά από τους μεγαλύτερου μεγέθους όγκους και 78% (p< 0.001) στα 41 περιστατικά από τους μικρότερου μεγέθους όγκους (Πίνακας 3.11). Όσον αφορά τον υποδοχέα 2 της ντοπαμίνης (D2R), αυτός ελέγχθηκε σε 23 πρωτοπαθείς όγκους του ΓΕΣ, και ανιχνεύτηκε σε 8 από αυτούς (34.8%). Συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του D2R και του Octreoscan βρέθηκε στο 65.2% (15/23), ενώ σε 1 (4.3%) θετικό ανοσοϊστοχημικά περιστατικό, το 86

87 Octreoscan ήταν αρνητικό. Σε 7 (30.4%) θετικά Octreoscan, η ανοσοϊστοχημική χρώση ήταν αρνητική. Παρόλα αυτά στατιστικά σημαντική συσχέτιση 80% (p=0.04) σημειώθηκε ανάμεσα στις δύο μεθόδους σε μικρού μεγέθους όγκους, ενώ σχετικά πτωχή ήταν η συσχέτιση στους μεγάλου μεγέθους όγκους 37.5% (p=0.1). Όταν ελέγχθηκε ο βαθμός συσχέτισης των αποτελεσμάτων για τους δύο υποδοχείς sstr2 και D2R για να διαπιστωθεί η επίδραση στη συσχέτιση που θα μπορούσε να έχει η παρουσία του D2R στους όγκους αυτούς, το αποτέλεσμα άγγιξε το 73.9% (17/23, p=0.07) στους όγκους του γαστρεντερικού όπου και είχε διενεργηθεί ο έλεγχος για το D2R. Επιπλέον, σε 4 (17.4%) θετικούς για D2R όγκους το Octreoscan ήταν αρνητικό και σε 2 (8.7%) θετικά Octreoscan, o υποδοχέας της ντοπαμίνης ήταν αρνητικός. Η συσχέτιση ήταν μικρότερη και εμφάνιζε τάσεις μειώσεως στους μικρού μεγέθους όγκους 66.7% (p=0.28), σε αντίθεση με τα αποτελέσματα στους μεγαλύτερου μεγέθους όγκους όπου ήταν 87.5% (p=0.25). Εντούτοις, δεν παρατηρήθηκε μία στατιστικώς σημαντική διαφορά. Όσον αφορά τις συσχετίσεις μεταξύ του βαθμού πρόσληψης του ραδιοφαρμάκου στο Octreoscan (grade), μία υψηλότερη συσχέτιση του βρέθηκε σε σχέση με την ένταση της χρώσης του sstr2 (r=0.6, p<0.001) και του D2R (r=0.5, p<0.001) παρά με το μέγεθος του όγκου (r=0.4, p<0.001) και /ή της έντασης της χρώσης για τον sstr3 (r=0.4, p<0.001). Οι μεγάλοι σε μέγεθος όγκοι, είχαν μεγαλύτερο Octreoscan grade συγκρινόμενοι με τους όγκους που είχαν μικρό μέγεθος (p<0.001). Οι όγκοι του γαστρεντερικού είχαν υψηλότερα grading (p=0.004) και sstr2 (p<0.001) score συγκρινόμενοι με αυτούς του πνεύμονα. Παράλληλα, οι πρωτοπαθείς εστίες είχαν υψηλότερο grade (p=0.006) και sstr2 (p=0.13) score συγκρινόμενοι με τις μεταστατικές εστίες (Πίνακας 3.11). Πάντως, δεν κατέστη δυνατό να διευκρινισθεί ποιός παράγοντας θα μπορούσε να προβλέψει τη συσχέτιση μεταξύ του ανοσοϊστοχημικού αποτελέσματος του sstr2 και του Octreoscan, ενώ φαίνεται πως μόνο το μέγεθος παίζει κάποιο ρόλο στο να προβλεφθεί η συσχέτιση 87

88 μεταξύ του D2R και των αποτελεσμάτων του Octreoscan (OR: 0.94, 95% C.I ; p=0.049). Πίνακας 3.10: Βαθμός συσχέτισης των δύο μεθόδων στους όγκους που μελετήθηκαν. Α = αριθμός περιστατικών; sstr = υποδοχέας σωματοστατίνης; D2R = υποδοχέας Ντοπαμίνης τύπου 2; IHC = ανοσοϊστοχημεία; SRS = σπινθηρογράφημα με ανάλογο σωματοστατίνης (OCTREOSCAN) Α,% Σύνολο περιστατικών (81) Νεοπλάσματα πνεύμονα (26) Νεοπλάσματα γαστρεντερικού (23) Ομάδα συσχέτισης αποτελεσμάτων Ομάδα μη συσχέτισης αποτελεσμάτων SSTR2 SSTR2 SSTR2 SSTR2 IHC+/SRS+ IHC-/SRS- IHC+/SRS- IHC-/SRS+ 43 (53.1) 24 (29.6) 10 (12.3) 4 (4.9) Πρωτοπαθείς (54) 25 (46.3) 20 (37) 7 (13) 2 (3.7) Μεταστάσεις (27) 18 (66.7) 4 (14.8) 3 (11.1) 2 (7.4) Μεγάλου μεγέθους 26 (65) 9 (22.5) 2 (5) 3 (7.5) (40) Μικρού μεγέθους 17 (41.5) 15 (36.6) 8 (19.5) 1 (2.4) (41) Πρωτοπαθείς (38) 22 (57.9) 8 (21.1) 6 (15.8) 2 (5.3) Μεταστάσεις (17) 15 (88.2) 0 2 (11.8) 0 Μεγάλου μεγέθους 24 (88.9) 2 (7.4) 0 1 (3.7) (27) Μικρού μεγέθους 13 (46.4) 6 (21.4) 8 (28.6) 1 (3.6) (28) 6 (23.1) 16 (61.5) 2 (7.7) 2 (7.7) Πρωτοπαθείς (16) 3 (18.8) 12 (75) 1 (6.3) 0 Μεταστάσεις (10) 3 (30) 4 (40) 1 (10) 2 (20) Μεγάλου μεγέθους 2 (15.4) 7 (53.8) 2 (15.4) 2 (15.4) (13) Μικρού μεγέθους 4 (30.8) 9 (69.2) 0 0 (13) Ομάδα συσχέτισης Ομάδα μη συσχέτισης αποτελεσμάτων αποτελεσμάτων D2R IHC+/SRS+ D2R IHC- D2R IHC+/ SRS- D2R IHC- /SRS- /SRS+ 7 (30.4) 8 (34.8) 1 (4.3) 7 (30.4) Μεγάλου μεγέθους 2 (25) 1 (12.5) 0 5 (62.5) όγκοι (8) Μικρού μεγέθους 5 (33.3) 7 (46.7) 1 (6.7) 2 (13.3) όγκοι (15) 88

89 Πίνακας 3.11: Συσχετίσεις μεταξύ των ποσοτικών παραμέτρων (ηλικία και διάμετρος όγκου) που μελετήθηκαν και της έντασης του Octreoscan και του score για την ανοσοϊστοχημική μελέτη για τους υποδοχείς sstr και D2R. Sstr =υποδοχείς σωματοστατίνης; D2R= υποδοχέας τύπου 2 Ντοπαμίνης SRS=σπινθηρογράφημα με ανάλογο σωματοστατίνης (OCTREOSCAN) Παρασκευάσματα Συνολικός (81) Πρωτοπαθείς (54) αριθμός εστίες Μεταστατικές εστίες (27) Μεγάλου μεγέθους όγκοι (40) Μικρού όγκοι (41) Νευροενδοκρινή νεοπλάσματα γαστρεντερικού συστήματος (55) Νευροενδοκρινή νεοπλάσματα πνεύμονα (26) μεγέθους Correlation coefficient P (r) Octreoscan Μέγεθος όγκου <0.001 score sstr <0.001 sstr3 +0,38 <0.001 D2R sstr2 score sstr <0.001 sstr sstr3 score sstr <0.001 Octreoscan score Μέγεθος όγκου +0, sstr <0.001 sstr3 +0,54 <0.001 sstr D2R sstr2 score sstr <0.001 sstr <0.001 sstr3 score Μέγεθος όγκου sstr sstr2 score sstr Octreoscan sstr <0.001 score sstr3 +0, sstr2 score sstr <0.001 sstr sstr3 score sstr Octreoscan score Μέγεθος όγκου sstr sstr D2R sstr2 score Sstr sstr D2R sstr3 score sstr Octreoscan score Μέγεθος όγκου <0.001 sstr <0.001 sstr D2R sstr2 score Μέγεθος όγκου sstr <0.001 sstr sstr3 score Μέγεθος όγκου sstr Octreoscan sstr score Sstr5 +0, sstr2 score sstr sstr3 score sstr <

90 3.5 Συζήτηση Ανίχνευση υποδοχέων σε ΝΕΝ-ΓΕΣ Αρχικός σκοπός της μελέτης μας ήταν η ανοσοϊστοχημική ανάλυση όλων των υποδοχέων σωματοστατίνης (sstr1,2a,2b,3,4,5) και του υποδοχέα 2 της ντοπαμίνης (D2R) σε ΝΕΝ-ΓΕΣ και η εξαγωγή συμπερασμάτων τόσο για την ποσοτική όσο και για την ποιοτική έκφραση όλων των υποδοχέων. Η σειρά των 138 περιπτώσεων που ανασκοπήθηκαν και των 76 παρασκευασμάτων που τελικά εξετάστηκαν ανοσοϊστοχημικά θεωρείται μία αρκετά μεγάλη σειρά, αν λάβει κανείς υπόψη τη χαμηλή συχνότητα εμφάνισης των ΝΕΝ. Η αποτύπωση της έκφρασης των υποδοχέων αλλά και η εντόπισή τους στο κύτταρο είναι στοιχεία πολύ χρήσιμα για τη σταδιοποίηση, την πρόγνωση και το θεραπευτικό πλάνο που θα ακολουθηθεί στους όγκους αυτούς. Το διάστημα κατά το οποίο διενεργήθηκε η πρώτη φάση της μελέτης, δεν υπήρχαν πολλά δεδομένα όσον αφορά την έκφραση όλων των τύπων υποδοχέων σωματοστατίνης καθώς και τις τυχόν συσχετίσεις τους με κλινικοεργαστηριακές παραμέτρους. Όσον αφορά τον D2R, υπήρχε μόνο μία αντίστοιχη μελέτη στη διεθνή βιβλιογραφία [92]. Η ανίχνευση των υποδοχέων στη μελέτη μας, έγινε με τη χρήση πιστοποιημένων, εμπορικών αντισωμάτων, που είχαν προηγουμένως εφαρμοσθεί και εξετασθεί στην καθ ημέρα πράξη Ποσοτική έκφραση των υποδοχέων Τα αποτελέσματά μας είναι συγκρίσιμα με αυτά αντίστοιχων μελετών στη διεθνή βιβλιογραφία καθότι διαπιστώθηκε ότι οι υποδοχείς σωματοστατίνης εκφράζονται σε υψηλά ποσοστά στους NEN-ΓΕΣ. Οι υποδοχείς που εκφράζονταν συχνότερα ήταν οι sstr2a, sstr2b, sstr1 και sstr5 [63,80,92,94]. Στη μελέτη μας, τα ποσοστά έκφρασης των υποδοχέων με φθίνουσα σειρά είχαν ως εξής: sstr2a 61.8%, sstr2b 48.6%, sstr1 39.4%, sstr3 38%, sstr5 90

91 37.8% και sstr4 15.4%. H παρουσία τουλάχιστον ενός οποιουδήποτε υποδοχέα έφθανε το 76.3%. Αν και η έκφραση του D2R που διαπιστώσαμε ήταν μέτρια (36.95%), όταν ο υποδοχέας ανιχνευόταν, συχνά συνεκφραζόταν με τους υποδοχείς sstr2a (70.58%), sstr2b (41.17%) και sstr5 (47.05%). Τα μεγαλύτερα ποσοστά έκφρασης του υποδοχέα D2R βρέθηκαν στα χαμηλής διαφοροποίησης νευροενδοκρινή καρκινώματα (G3-NEC) και ακολούθως στα καλής και μέσης διαφοροποίησης ΝΕΝ, (G1 και G2 αντίστοιχα). Το γεγονός ότι η έκφραση του D2R ήταν μεγαλύτερη σε όγκους χαμηλής διαφοροποίησης, αν και παράδοξο καθότι επιφανειακοί υποδοχείς συνήθως ανευρίσκονται σε όγκους καλής διαφοροποίησης θα μπορούσε να έχει κλινικό ενδιαφέρον. Ενδεχομένως θα μπορούσαν να σχεδιαστούν μελέτες που θα εξετάζουν τον υποδοχέα D2R σε μεγαλύτερες σειρές και τα αποτελέσματα πιθανόν να δώσουν πιο αξιόπιστες πληροφορίες με απώτερο σκοπό την διερεύνηση θεραπευτικών εναλλακτικών με μόρια που στοχεύουν σε ετεροδιμερή που δημιουργούνται από τη σύζευξη των sstr και D2R. Ένα άλλο ενδιαφέρον εύρημα της παρούσης μελέτης, ήταν η μεγάλη ετερογένεια που παρουσίαζαν κάποιοι όγκοι, όσον αφορά την έκφραση των sstrs. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει πως ένα ποσοστό 20 30% των όγκων παρουσιάζουν ετερογένεια στην έκφραση των υποδοχέων σωματοστατίνης και συχνά η ανίχνευσή τους είναι μόνο εστιακή [63]. Αυτό σημαίνει πως σε βιοπτικά υλικά αλλά και σε κάποιες περιπτώσεις ιστολογικών παρασκευασμάτων όγκων, το αρνητικό ανοσοϊστοχημικό αποτέλεσμα δεν αποκλείει την έκφραση των υποδοχέων στον όγκο και πιθανώς σε μία άλλη περιοχή του αυτοί να ανιχνεύονται. Αντιθέτως, ένα θετικό μεμβρανικό αποτέλεσμα δεν μπορεί να αμφισβητηθεί [63]. Σε περιπτώσεις όγκων χαμηλής διαφοροποίησης, παρατηρήθηκε εστιακή έκφραση των υποδοχέων και η ετερογένεια της έκφρασης των υποδοχέων σημειώθηκε με την παρουσία της 91

92 χρώσης σε μικρές βλάστες ή ακόμη και σε μεμονωμένα διάσπαρτα νεοπλασματικά κύτταρα Ποιοτική έκφραση των υποδοχέων Όπως αναφέρθηκε και προηγούμενα, η κυτταροπλασματική χρώση για τους υποδοχείς σωματοστατίνης ισοδυναμούσε με αρνητικό αποτέλεσμα και μόνο η μεμβρανική χρώση θεωρήθηκε ως θετική. Σε προηγούμενες μελέτες έχει αποδειχθεί η υψηλή συσχέτιση των αποτελεσμάτων της ανοσοϊστοχημείας με αυτά του Octreoscan μόνο όταν καταγράφεται μεμβρανική χρώση. Αντίθετα η κυτταροπλασματική χρώση δεν δίνει καλά ποσοστά συσχέτισης με το Octreoscan. Η κυτταροπλασματική χρώση δεν αποτελεί τεχνικό σφάλμα, αλλά οφείλεται στην παρατηρούμενη ενδοκύττωση του υποδοχέα μετά τη σύνδεσή του με την ενδογενή σωματοστατίνη ή το συνθετικό ανάλογο της [63,67,79, 80]. Στη μελέτη του Volante το 2007 φάνηκε πως μόνο όταν η χρώση είναι μεμβρανική παρατηρείται υψηλή συσχέτιση με το Octreoscan, κάτι που δεν συμβαίνει όταν η χρώση είναι κυτταροπλασματική. Αυτό αποδεικνύει ότι οι υποδοχείς είναι λειτουργικοί όταν η θέση ανίχνευσής τους είναι η κυτταρική μεμβράνη, γεγονός το οποίο ήταν η βάση στο σχεδιασμό της μελέτης μας. Αντίστοιχη μελέτη των Papotti και συνεργατών το 2001 κατέληξε στο ίδιο συμπέρασμα και κατέληξε πως η μεμβρανική κατανομή της χρώσης πρέπει να θεωρείται ως σημείο αναφοράς (gold standard) και να αναζητείται με στόχο την αποσαφήνιση της λειτουργικότητας των υποδοχέων [76, 80]. Η ετερογένεια που σημειώθηκε στα ποιοτικά χαρακτηριστικά της χρώσης αφορούσε την κατανομή, την ένταση ή και τη συνέχεια της μεμβρανικής χρώσης. Μία από τις δυσκολίες στην εκτίμηση της χρώσης στην παρούσα μελέτη ήταν η κυτταροπλασματική χρώση που εμφάνιζε μικροκοκκιώδεις χαρακτήρες. Διαπιστώθηκε πως ήταν αρκετά δύσκολο να καταλήξουμε για τη φύση της 92

93 ανοσοχρώσης (μεμβρανική εντόπιση ή μη), με αποτέλεσμα την υποεκτίμηση της χρώσης σε κάποιες περιπτώσεις και τον χαρακτηρισμό της ως αρνητικής. Επιπλέον, σε κάποιες περιπτώσεις με έντονη αλλά όχι κυκλοτερή κατανομή της μεμβρανικής χρώσης, αναγκαστήκαμε να τη βαθμολογήσουμε με 2+, αν και η ένταση της ανοσοαντίδρασης ήταν παρόμοια με αυτή που παρατηρούνταν σε περιπτώσεις που βαθμολογήθηκαν με 3+. Συμπερασματικά, για να καταλήξουμε στην έκφραση των υποδοχέων πρέπει πάντα να λαμβάνεται υπόψιν πως ένα αρνητικό αποτέλεσμα θα μπορούσε να οφείλεται σε μη ικανοποιητική διατήρηση των αντιγονικών θέσεων (λόγω κακής μονιμοποίησης του παρασκευάσματος συνήθως) ή στη χαμηλή συγκέντρωση της πρωτεΐνης του υποδοχέα (κάτω από το όριο για την ανίχνευσή του) [63,92] Αξιολόγηση μεθόδων ανίχνευσης υποδοχέων σωματοστατίνης Για την ανίχνευση των υποδοχέων έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορες μέθοδοι όπως (Αυτοραδιογραφία, Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction RT-PCR, Octreoscan, Fluorescence In Situ Hybridisation - FISH, Chromogen In Situ Hybridisation-CISH) οι οποίες έχουν συγκρίσιμα αποτελέσματα. Η μέθοδος RT-PCR αν και έχει υψηλή ευαισθησία, δίνει πιο αξιόπιστα αποτελέσματα σε μη μονιμοποιημένο ιστό σε σχέση με ιστούς αρχειακού υλικού, ενώ δεν προσδιορίζει τη ακριβή θέση του υποδοχέα στο κύτταρο. Οι FISH και CISH είναι μέθοδοι με χαμηλότερη ευαισθησία. Το Octreoscan έχει ευαισθησία μόνο για τους υποδοχείς sstr2, sstr3, sstr5 ενώ δεν προσδιορίζει ποιος από τους τρεις τύπους υποδοχέα εκφράζεται και βέβαια μπορεί να δώσει ψευδώς θετικά αποτελέσματα σε περιπτώσεις ίνωσης, παλαιάς ουλής, φλεγμονής και νέκρωσης. Η ανοσοϊστοχημεία έχει το πλεονέκτημα ότι εφαρμόζεται σε μικρά βιοπτικά υλικά αλλά και σε κύβους παραφίνης από αρχειακό υλικό. 93

94 Εάν θεωρήσουμε ότι η παρουσία του εκάστοτε υποδοχέα στην κυτταρική μεμβράνη εκφράζει και τη λειτουργική του κατάσταση, η εκτίμηση των υποδοχέων ανοσοϊστοχημικά φαίνεται ότι υπερτερεί [63,64,65,76,78,80]. Η κλινική σημασία της υψηλής συγκέντρωσης των υποδοχέων sstr2a και sstr5 στα ΝΕΝ του ΓΕΣ πιθανώς να μπορεί να προβλέψει την απάντηση των όγκων σε στοχευμένη θεραπεία με ανάλογα σωματοστατίνης [63,64,80,92,96]. Η αποτελεσματικότητα της εξαρτάται από την πυκνότητα των υποδοχέων στα κύτταρα που εκφράζουν τους αντίστοιχους υποδοχείς και η απάντηση είναι ευθέως ανάλογη της λειτουργικής κατάστασης του υποδοχέα [64,65,79,95]. Το γεγονός αυτό εξηγεί και την αναγκαιότητα των in vitro τεχνικών για την ανίχνευση των υποδοχέων στη κλινική πράξη Εφαρμογές της έκφρασης των υποδοχέων στα θεραπευτικά σχήματα Στόχευση υποδοχέων σωματοστατίνης Προσφάτως, δημιουργήθηκαν ανάλογα σωματοστατίνης με ευαισθησία και στόχευση σε περισσότερους του ενός υποδοχέων, και κυρίως των υποδοχέων sstr2 και 5. Το μόριο SΟΜ230 (pasireotide) στοχεύει όλους τους τύπους υποδοχέων εκτός από τον sstr4- που άλλωστε σπανίως εκφράζεται- και θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη εναλλακτική για τις περιπτώσεις που εκφράζουν τους υποδοχείς sstr1, sstr3 και λιγότερο τους sstr2a και sstr5. Η κλινική σημασία του νέου σκευάσματος βέβαια θα πρέπει να πιστοποιηθεί σε μελέτες μεγάλων σειρών [88]. Η χορήγηση αναλόγων σωματοστατίνης έχει συνήθως γρήγορη ανταπόκριση με ύφεση των συμπτωμάτων και βελτίωση της κλινικής εικόνας και των συνδρόμων που οφείλονται στην υπερέκκριση ορμονών από τα κύτταρα του όγκου. Ένα αρνητικό στοιχείο στην πορεία της νόσου όσον αφορά τους ΝΕΝ-ΓΕΣ, είναι η συχνά παρατηρούμενη ταχυφύλαξη. Πρόκειται για την ανεπιθύμητη ανάπτυξη αντίστασης στη θεραπεία και οφείλεται στον κορεσμό, την 94

95 απευαισθητοποίηση ή την ανάπτυξη μη λειτουργικών, μεταλλαγμένων κυτταρικών κλώνων Στόχευση σχηματιζόμενων ετεροδιμερών Ο σχηματισμός ετεροδιμερών έχει περιγραφεί για διάφορους τύπους συζευγμένων με G-πρωτεΐνη (GPCR) υποδοχέων. Οι Rocheville et al. πρότειναν για πρώτη φορά ότι η σύζευξη των υποδοχέων σωματοστατίνης με τον φυσικό προσδέτη ή με το ανάλογο σωματοστατίνης, επάγει τη δημιουργία ομοδιμερών και ετεροδιμερών, γεγονός το οποίο επιφέρει αλλαγές στη λειτουργική κατάσταση των εν λόγω υποδοχέων. Σύμφωνα με τη μελέτη τους, ο υποδοχέας sstr5 και ο D2R είναι ικανοί να σχηματίζουν ετεροδιμερή που έχουν καλύτερη συνδεσιμότητα έναντι των αναλόγων ντοπαμίνης και σωματοστατίνης από αυτήν που θα είχαν ο κάθε ένας ξεχωριστά [54]. Για το λόγο αυτό αποφασίσαμε να διερευνήσουμε την έκφραση του υποδοχέα D2R και το ρόλο που μπορεί να διαδραματίζει η παρουσία του στα ΝΕΝ του ΓΕΣ. Αν και διαπιστώθηκε μία μέτρια έκφραση του D2R (36.95%), το υψηλό ποσοστό συνέκφρασης των D2R και sstrs (88.23%), ειδικά με τον sstr2α έχει εξαιρετικά μεγάλο ενδιαφέρον για την πιθανότητα χρήσης μορίων που στοχεύουν σε ετεροδιμερή στη θεραπεία των ΝΕΝ-ΓΕΣ. Νέα μόρια που στοχεύουν στους sstr και D2R, όπως το BIM23A387 και το BIM-23A781, που στοχεύουν τους sstr2 και D2R αλλά και το BIM23A760 που στοχεύει τους sstr2, sstr5, D2R, μπορούν πιθανώς να αποτελέσουν πολύτιμες εναλλακτικές στη θεραπευτική αντιμετώπιση, τόσο για τον έλεγχο της έκκρισης όσο και του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου (52,53). Η αξία τους είναι κάτι που πρέπει να διερευνηθεί με νέες κλινικές μελέτες. 95

96 3.5.4 Συσχέτιση της ανοσοϊστοχημικής μεθόδου με το Octreoscan Η ανοσοϊστοχημεία όπως αναφέρθηκε ήδη, είναι μία εύκολα προσβάσιμη, αξιόπιστη και αναπαραγώγιμη μέθοδος που μπορεί να εφαρμοσθεί τόσο σε νωπό ιστό όσο και σε αρχειακό υλικό, που πληροφορεί για το είδος του υποδοχέα και τη λειτουργική του κατάσταση και μπορεί να δώσει προοπτική στην επιλογή θεραπευτικών επιλογών. Επιπλέον, η γνώση της λειτουργικής κατάστασης των υποδοχέων sstr2 και sstr5 θα μπορούσε να αυξήσει την αξιοπιστία στην εκτίμηση του Octreoscan, ξεπερνώντας τα ψευδώς θετικά και αρνητικά αποτελέσματα [88]. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης, αναλύσαμε την ανοσοϊστοχημική έκφραση των υποδοχέων sstr2, sstr3 και sstr5 και διαπιστώσαμε μία υψηλή συσχέτιση (87.3%) των αποτελεσμάτων με τα αποτελέσματα που είχαν τα αντίστοιχα νεοπλάσματα στο Octreoscan σε ΝΕΝ τόσο του ΓΕΣ όσο και σε ΝΕΝ του πνεύμονα. Αυτή η υψηλή συσχέτιση σημειώθηκε και στις υποομάδες των πρωτοπαθών και μεταστατικών όγκων, καθώς και στις υποομάδες των μικρού και μεγάλου μεγέθους όγκων. Στην παρούσα μελέτη, ο βαθμός πρόσληψης του ραδιοφαρμάκου στο Octreoscan συσχετιζόταν θετικά με την έκφραση του sstr2 σε όλες τις υποομάδες που μελετήσαμε εκτός από αυτές των μεταστατικών εστιών. Επιπλέον, τα δεδομένα που είχαμε σε ένα μικρό μέρος πρωτοπαθών ΝΕΝ-ΓΕΣ της ομάδας που μελετήθηκε, έδειξαν ότι υπήρξε μία υψηλή συσχέτιση μεταξύ του υποδοχέα D2R και του Octreoscan και η συσχέτιση αυτή ήταν πιο εμφανής σε μικρού μεγέθους όγκους. Έτσι, μπορεί να συμπεράνει κανείς πως ο D2R φαίνεται να παίζει ένα σημαντικό ρόλο στους μικρού μεγέθους όγκους, αφού αυτοί εμφανίζουν τον υψηλότερο βαθμό συσχέτισης με το Octreoscan και τον sstr2, υποδηλώνοντας ότι αυτοί οι όγκοι μπορεί να είναι υποψήφιοι για θεραπεία με τα νεοεμφανιζόμενα μόρια που στοχεύουν και τους δύο τύπους υποδοχέων [87,97,98,99]. 96

97 Τέλος, το γεγονός ότι οι sstrs είναι σχετιζόμενοι μεταξύ τους θα μπορούσε να προβλέψει τη συνέκφραση περισσοτέρων του ενός τύπων υποδοχέων στους ΝΕΝ και πιθανότατα να προβλέπει τη δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί ως θεραπευτική επιλογή ένα πολλαπλής στόχευσης μόριο, όπως το pasireotide [97]. Αξιοσημείωτο είναι πως στα ΝΕΝ-ΓΕΣ, η συσχέτιση αφορούσε κυρίως θετικά αποτελέσματα στην ανοσοϊστοχημική μελέτη και το Octreoscan ενώ στα ΝΕΝ του πνεύμονα η συσχέτιση παρατηρήθηκε κυρίως λόγω των αρνητικών αποτελεσμάτων της ανοσοϊστοχημείας και του Octreoscan. Όσον αφορά τα ΝΕΝ που μελετήθηκαν, είναι αξιοσημείωτο το γεγονός ότι η υψηλή συσχέτιση μεταξύ του Octreoscan και του sstr2 στους όγκους του ορθού άγγιξε το 100% (Πίνακας 3.7) Σε προηγούμενη μελέτη, είχε περιγραφεί συσχέτιση σε ποσοστό 89% σε όγκους του γαστρεντερικού, αλλά χωρίς να διευκρινίζεται η ακριβής πρωτοπαθής εστία του όγκου [80]. Η υψηλή συσχέτιση στα ΝΕΝ του παγκρέατος, είχε διαπιστωθεί και προηγουμένως σε αντίστοιχη μελέτη [80]. Τέλος, τα τυπικά ΝΕΝ του πνεύμονα, εμφάνιζαν υψηλά ποσοστά συσχέτισης μεταξύ του sstr2 και του Octreoscan στη σειρά μας, σε απόλυτη συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που είχαν διαπιστώσει καλύτερα ποσοστά συσχέτισης σε χαμηλού βαθμού κακοηθείας όγκους σε σχέση με όγκους με υψηλό βαθμό κακοήθειας [94]. Αντίθετα, δεν παρατηρήθηκε συσχέτιση στο 17.2% των περιστατικών που μελετήσαμε. Ειδικότερα, σε ένα ποσοστό 12.3% των περιστατικών, η ανοσοϊστοχημική μελέτη ήταν θετική ενώ το Octreoscan ήταν αρνητικό (Εικόνα 3.3). Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στη χαμηλή συγκέντρωση του υποδοχέα στα κύτταρα του όγκου, κάτω από το όριο για την ανίχνευσή τους, ή ακόμη και στο μικρό μέγεθος του όγκου [31,100]. Παράλληλα, σε ποσοστό 4.9% των περιπτώσεων το Octreoscan ήταν θετικό με την ανοσοϊστοχημική μελέτη να δίνει αρνητικά αποτελέσματα (Εικόνα 3.4). Το 97

98 τελευταίο θα μπορούσε να οφείλεται στην ετερογένεια των όγκων και η απουσία της χρώσης πιθανόν να οφείλεται στην επιλογή τομής με απουσία έκφρασης των υποδοχέων. Ένα αρνητικό ανοσοϊστοχημικό αποτέλεσμα μπορεί να αποτελεί τεχνικό σφάλμα αλλά ένα θετικό αποτέλεσμα δεν επιδέχεται αμφισβήτησης. Αν και παραδοσιακά η θεραπεία με ραδιοπεπτίδια εφαρμόζεται σε ασθενείς με θετικό Octreoscan, θα μπορούσε να εξετασθεί το ενδεχόμενο θεραπείας ασθενών με αρνητικό Octreoscan, αλλά με υψηλά ποσοστά συγκέντρωσης των υποδοχέων ανοσοϊστοχημικά, ειδικά όταν άλλες εναλλακτικές θεραπείας έχουν εξαντληθεί. Συμπερασματικά, η υψηλή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του υποδοχέα sstr2 με τα ευρήματα του Octreoscan τόσο στους όγκους του ΓΕΣ όσο και στους ΝΕΝ του πνεύμονα, υπογραμμίζει τη σπουδαιότητα της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης του sstr2 όταν το Octreoscan δεν είναι διαθέσιμο για τη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων. Επιπλέον, η ανοσοϊστοχημική έκφραση του D2R φαίνεται να παίζει έναν επιπρόσθετο ρόλο που θα ήταν θεραπευτικά σημαντικός, αλλά για την απόδειξη αυτής της θεωρίας χρειάζεται να γίνουν και άλλες μελέτες σε μεγαλύτερες σειρές από τη δική μας Ο ρόλος του Sstr2 Επιπλέον, στην παρούσα φάση της μελέτης η ανοσοϊστοχημική έκφραση των sstrs 3 και 5 δεν πρόσθεσε περισσότερες πληροφορίες σε σχέση με τον υποδοχέα sstr2. Σε όλες τις περιπτώσεις που αυτοί εκφράζονταν, παρατηρήθηκε συνέκφραση και του sstr2. Αυτό σημαίνει πως η χρήση μόνο του sstr2 θα μπορούσε να είναι αρκετή για την εξαγωγή συμπερασμάτων για την εν γένει παρουσία των υποδοχέων στα κύτταρα του όγκου και μάλιστα αυτό θα ήταν εφικτό με μικρότερο κόστος. Επίσης το στοιχείο αυτό δείχνει πως σε περιπτώσεις που δεν είναι διαθέσιμο το Octreoscan, η ανοσοϊστοχημική 98

99 ανίχνευση του υποδοχέα ενδεχομένως να αρκεί για την εξαγωγή συμπερασμάτων και για τη λήψη θεραπευτικών αποφάσεων. Η ανοσοϊστοχημική ανίχνευση του D2R σε μία υποομάδα πρωτοπαθών ΝΕΝ- ΓΕΣ που μελετήθηκε, έδειξε μία υψηλή συσχέτιση με τον sstr2, στους μικρού μεγέθους όγκους από αυτή την ομάδα (p=0.03). Τέλος, ο συνδυασμός των δύο αυτών τύπων υποδοχέων δεν έδωσε καλύτερα αποτελέσματα όσον αφορά τη συσχέτιση των δύο μεθόδων (ανοσοϊστοχημείας και Octreoscan) (Πίνακας 3.11) Σύγκριση με παρόμοιες μελέτες Σε προηγούμενες αντίστοιχες μελέτες είχε επιχειρηθεί η εξαγωγή συμπερασμάτων για το επίπεδο συσχέτισης των δύο χρησιμοποιούμενων μεθόδων (Πίνακας 3.12)-(Διάγραμμα 3.3) [80,76,101,102]. Οι Volante et al. διαπίστωσαν πως υπήρχε ένα ποσοστό συσχέτισης των δύο μεθόδων σε ποσοστό 77%, σε μία ομάδα μελέτης που περιελάμβανε 107 δείγματα ΝΕΝ με 100 προεγχειρητικά Octreoscan. Η μελέτη αυτή περιελάμβανε 30 ΝΕΝ του πνεύμονα, 47 ΝΕΝ-ΓΕΣ, 11 ΝΕΝ αγνώστου πρωτοπαθούς εστίας και 19 ΝΕΝ από διάφορες πρωτοπαθείς εστίες [80]. Σε αυτή τη μελέτη οι ερευνητές διαπίστωσαν πως η ανοσοϊστοχημική έκφραση των sstr3 και sstr 5 δε βελτίωσε τη συσχέτιση με τα ευρήματα του Octreoscan σε σχέση με αυτά που διαπιστώθηκαν με την έκφραση μόνο του sstr2 (Πίνακας 3.13) [80] και αυτό βρέθηκε και από την ομάδα των Papotti M. et al [76]. Οι τελευταίοι, έδειξαν πως υπήρχε μία εξαιρετικά υψηλή συσχέτιση μεταξύ των δύο μεθόδων, σε ποσοστό που έφθανε το 92.9% σε μία πολύ μικρή ομάδα μελέτης που περιελάμβανε 11 τυπικά και 3 άτυπα ΝΕΝ του πνεύμονα [76]. Σε μία άλλη σειρά που περιελάμβανε 218 ΝΕΝ του πνεύμονα, οι ίδιοι συγγραφείς διαπίστωσαν ότι στους 28 όγκους με διαθέσιμα προεγχειρητικά Octreoscan, υπήρχε συσχέτιση σε ποσοστό 71% των υποδοχέων sstr2 και sstr 3, αν και ο ακριβής τύπος των όγκων (τυπικά και άτυπα ΝΕΝ, νευροενδοκρινή 99

100 καρκινώματα πνεύμονα από μεγάλα κύτταρα μικροκυτταρικό καρκίνωμα πνεύμονα) δεν διευκρινιζόταν και τα περισσότερα Octreoscan ήταν μετεγχειρητικά [101]. Τέλος, σε μία σειρά 81 περιπτώσεων καλά διαφοροποιημένων ΝΕΝ, διαπιστώθηκε συσχέτιση στο 79% των περιπτώσεων και ένα υψηλό ποσοστό έκφρασης του sstr2 έφτανε στο 62.9% [102]. Πίνακας 3.12: Σύγκριση των αποτελεσμάτων της μελέτης μας με τα αποτελέσματα αντίστοιχων μελετών της διεθνούς βιβλιογραφίας Somatostatin receptors (Sstr) υποδοχείς σωματοστατίνης D2R Υποδοχέας 2 Ντοπαμίνης IHC Immunohistochemistry OCTREOSCAN (SRS) = σπινθηρογράφημα με ανάλογο σωματοστατίνης Ερευνητές Είδη όγκων Sstr2 (%) Sstr3 (%) Sstr5 (%) Οποισδήποτε sstr (%) Συσχέτιση (IHC SSTR2- octreoscan) D2R έκφραση (%) Συσχέτιση (IHC DR2- octreoscan ) (%) (%) Papotti 14 όγκοι % N/P N/P 2001 πνεύμονα Volante N/P N/P 2007 νευροενδοκρινή νεοπλάσματα Righi όγκοι N/P N/P πνεύμονα Asnacios 2008 Παρούσα μελέτη 81 νευροενδοκρινή νεοπλάσματα 81 νευροενδοκρινή νεοπλάσματα Ν/P N/P

101 Διάγραμμα 3.3: Κατανομή των περιστατικών που μελετήθηκαν σε 4 ομάδες, ανάλογα με την ανοσοϊστοχημική έκφραση του υποδοχέα σωματοστατίνης 2 (sstr2) και των ευρημάτων του σπινθηρογραφήματος με οκτρεοτίδιο (octreoscan). Αριθμός περιστατικών που εξετάσθηκαν Ομάδα 1: sstr2 θετικό/ Octreoscan θετικό Ομάδα 2: sstr2 αρνητικό/ Octreoscan αρνητικό Ομάδα 3: sstr2 θετικό/ Octreoscan αρνητικό Ομάδα 4: sstr2 αρνητικό/octreoscan θετικό Ομάδα 1 Ομάδα2 Ομάδα 3 Ομάδα Περιορισμοί Η μελέτη μας παρουσιάζει και αρκετούς περιορισμούς με έναν εξ αυτών να είναι ο μικρός αριθμός των όγκων ειδικά στην ομάδα που μελετήθηκε ο D2R. Αντιθέτως, όλοι οι ασθενείς που μελετήσαμε είχαν προεγχειρητικά Octreoscan, επιτρέποντάς μας να κάνουμε πολλές και χρήσιμες συσχετίσεις και να εξάγουμε αξιόπιστα συμπεράσματα. 101