PRINCIPII DE NUMĂRARE A ELEMENTELOR FIGURATE SANGUINE

Transcript

1 Principii de numărare a elementelor figurate sanguine 33 PRICIPII DE UMĂRARE A ELEMETELOR FIGURATE SAGUIE METODA AUTOMATĂ Hemoleucograma completă poate fi efectuată cu un analizator automat care determină numărul și tipul diferitelor celule din sânge. O probă foarte mică de sânge este aspirată printr un sistem subțire de tuburi. În interiorul acesui sistem există senzori care numără celulele și care pot identifica diferitele tipuri de celule; această metodă se numește citometrie în flux. Pentru detecție sunt folosiți senzori optici și/sau se măsoară impedanțe electrice. Unul dintre criteriile prin care aparatul poate discrimina tipurile de celule este dimensiunea acestora. Alte aparate pot determina diferite caracteristici ale celulelor pentru a le clasifica. METODA MAUALĂ Această metodă utilizează microscopul și o cameră specială de numărare (hemocitometru), determinarea făcându se din sânge diluat. Hemocitometrul este o lamă groasă de sticlă pe care, prin șanțuri, este delimitată o cameră dreptunghiulară. Pe această cameră este gravată o rețea de linii perpendiculare. Dispozitivul este precis gravat astfel încât ariile suprafețelor delimitate de linii și adâncimea camerei sunt cunoscute. Astfel, este posibilă numărarea celulelor sau particulelor dintr un anumit volum de lichid, putându se apoi calcula numărul de celule din volumul întreg. Se folosesc diferite tipuri de hemocitometre; noi vom folosi camera de numărare Türk, gravată cu două șanțuri adânci paralele și unul transversal, în formă de H, care asigură suportul pentru fixarea lamelei de sticlă și separă cele două zone gravate (vezi Figura 5). Fiecare suprafață de numărare are o arie de 9 mm 2. Adâncimea dintre lamelă și suprafața lamei este 1/10 mm. Rețeaua camerei de numărare este formată din linii perpendiculare aflate la o distanță de 1/5 mm, respectiv 1/20 mm (vezi Figura 6). Liniile perpendiculare delimitează pătrate și dreptunghiuri pentru numărarea celulele sanguine: pătrate mici cu aria de 1/400 mm 2 pentru numărarea globulelor roșii (hematii), pătrate mari cu aria de 1/25 mm 2 pentru numărarea globulelor albe (leucocite), dreptunghiuri cu aria de 1/100 mm 2 pentru numărarea trombocitelor.

2 34 Lucrări practice de fiziologie Figura 5. Hemocitometrul vedere laterală și de sus Figura 6. Rețeaua camerei Türk Pipetele de diluție (pipete Potain) sunt pipete capilare (foarte subțiri) care au o cameră de amestecare (omogenizare). În camera de amestecare se găsește o perlă de culoare roșie în cazul pipetei pentru hematii și albă în cazul pipetei pentru leucocite. Pe porțiunea capilară a pipetei se află gradațiile pentru 0,5 și 1 µl, iar deasupra camerei de amestecare se află o gradație pentru 101 µl pe pipeta pentru hematii și 11 µl pe pipeta pentru leucocite (vezi Figura 7). La extremitatea superioară a pipetei este atașat un tub de cauciuc prevăzut cu o piesă bucală.

3 Principii de numărare a elementelor figurate sanguine 35 Figura 7. Pipete de diluție (Potain) pentru hematii (stânga) și leucocite (dreapta)

4

5 umărarea hematiilor 37 UMĂRAREA HEMATIILOR MATERIALE ECESARE hemocitometru, pipetă de diluție pentru hematii, soluție de diluție (soluție Hayem; a 2 SO 4 5 g, acl 1 g, sublimat 0,5 g, apă distilată ad 200 g) microscop optic, pentru recoltarea sângelui: tampoane de vată, alcool, ace sterile, mănuși de unică folosință. METODA DE LUCRU Curățați hemocitometrul și lamela de sticlă cu o bucată de vată îmbibată cu alcool și lăsați să se usuce. Pregătiți hemocitometrul prin așezarea lamelei pe lamă. Pentru a evita riscul de infecție, spălați vă mâinile cu apă și săpun înainte și după efectuarea oricăror teste sanguine. Când manipulați probele de sânge ale altor persoane, folosiți mănuși de unică folosință. Aruncaţi acele folosite în recipientele special destinate acestui scop. Curățați vârful degetului cu vată îmbibată cu alcool. Lăsați degetul să se usuce. Folosind un ac steril, de unică folosință, faceți rapid o singură puncție la vârful degetului curățat (țineți l ferm între police și index), suficient de adâncă încât sângele să curgă liber din rană. Ștergeți cu vată prima picătură de sânge. După ce s a format a doua picătură, se aspiră în pipetă. u aspirați până când nu s a format o picătură suficient de mare deoarece aceste pipete au un lumen foarte îngust și sângele coagulează extrem de repede în interior. u stoarceţi degetul! Așezați vârful pipetei în picătura de sânge. Aspirați, folosind piesa bucală, o coloană continuă de sânge în pipetă până la gradația 0,5 a pipetei. Ștergeți excesul de sânge de pe vârful pipetei. Introduceți vârful pipetei în soluția de diluție pentru hematii (soluția Hayem); menținând pipeta în poziție verticală, aspirați soluție de diluție exact până la gradația 101. Diluția ar trebui făcută foarte repede și exact pentru a evita coagularea sângelui și pentru a asigura precizia. Astfel se obține o diluție de 200 de ori (volumul din camera de amestecare este 101 µl 1 µl=100 μl, conținând 0,5 µl sânge). Acoperiți capetele pipetei cu policele și degetul mijlociu și agitați pipeta timp de 3 minute.

6 38 Lucrări practice de fiziologie Aruncați primele două picături din pipetă (provin din porțiunea capilară a acesteia și conțin doar soluție de diluție) și cu a treia picătură umpleți hemocitometrul: lăsați picătura să cadă în apropierea lamelei și camera de numărare se va umple prin capilaritate. Lichidul în exces va curge în șanțuri. Așezați hemocitometrul la microscopul optic și examinați proba folosind obiectivul cu putere mică (10 x) și luminozitate scăzută. umărați hematiile în 80 de pătrate mici consecutive, luând în considerare celulele aflate în interiorul pătratului și pe două din laturile acestuia. REZULTATE Raportați numărul de hematii ca celule/mm 3. Întâi trebui calculat numărul mediu de hematii într un pătrat mic: (numărul total de hematii numărate)/80 (numărul de pătrate rp). Acesta trebuie raportat la volumul (V) corespunzător unui pătrat mic: aria*înălțimea (A*Î) camerei. În final, rezultatele trebuie corectate cu diluția sângelui (D). r. Hematii rp V D rp A Î D. r Hematii ITERPRETAREA REZULTATELOR Valori normale: bărbați: *10 6 /mm 3 femei: *10 6 /mm 3 nou născuți, copii mici: 5.5 6*10 6 /mm 3 Valori crescute policitemie, poliglobulie: fiziologic: gen, vârstă, altitudine înaltă, efort, etc. patologic: boală cronică cardiacă, pulmonară sau a măduvei osoase Valori scăzute anemie sângerare scădere a producerii de hematii distrugere crescută a hematiilor

7 umărarea leucocitelor 39 UMĂRAREA LEUCOCITELOR MATERIALE ECESARE hemocitometru, pipetă de diluție pentru leucocite (Figura 7), soluție de diluție (soluție Türk: acid acetic glacial 0,5 ml, violet de gențiană 1% 1,5 ml, apă distilată ad 150 ml) microscop optic, pentru recoltarea sângelui: tampoane de vată, alcool, ace sterile, mănuși de unică folosință. METODA DE LUCRU Curățați hemocitometrul și lamela de sticlă cu o bucată de vată îmbibată cu alcool și lăsați să se usuce. Pregătiți hemocitometrul prin așezarea lamelei pe lamă. Pentru a evita riscul de infecție, spălați vă mâinile cu apă și săpun înainte și după efectuarea oricăror teste sanguine. Când manipulați probele de sânge ale altor persoane, folosiți mănuși de unică folosință. Aruncaţi acele folosite în recipientele special destinate acestui scop. Curățați vârful degetului cu vată îmbibată cu alcool. Lăsați degetul să se usuce. Folosind un ac steril, de unică folosință, faceți rapid o singură puncție la vârful degetului curățat (țineți l ferm între police și index), suficient de adâncă încât sângele să curgă liber din rană. Ștergeți cu vată prima picătură de sânge. După ce s a format a doua picătură, se aspiră în pipetă. u aspirați până când nu s a format o picătură suficient de mare deoarece aceste pipete au un lumen foarte îngust și sângele coagulează extrem de repede în interior. u stoarceţi degetul! Așezați vârful pipetei în picătura de sânge. Aspirați, folosind piesa bucală, o coloană continuă de sânge în pipetă până la gradația 0,5 a pipetei. Ștergeți excesul de sânge de pe vârful pipetei. Introduceți vârful pipetei în soluția de diluție pentru leucocite (soluția Türk); menținând pipeta în poziție verticala, aspirați soluție de diluție exact până la gradația 11. Diluția ar trebui făcută foarte repede și exact pentru a evita coagularea sângelui și pentru a asigura precizia. Astfel se obține o diluție de 20 de ori (volumul din camera de amestecare este 11 μl 1 μl=10 μl, conținând 0.5 µl sânge). Acoperiți capetele pipetei cu policele și degetul mijlociu și agitați pipeta timp de 3 minute.

8 40 Lucrări practice de fiziologie Aruncați primele două picături din pipetă (provin din porțiunea capilară a acesteia și conțin doar soluție de diluție) și cu a treia picătură umpleți hemocitometrul: lăsați picătura să cadă în apropierea lamelei și camera de numărare se va umple prin capilaritate. Lichidul în exces va curge în șanțuri. Așezați hemocitometrul la microscopul optic și examinați proba folosind obiectivul cu putere mică (10 x) și luminozitate scăzută. umărați leucocitele în 25 de pătrate mari consecutive, luând în considerare celulele aflate în interiorul pătratului și pe două din laturile acestuia. REZULTATE Raportați numărul de leucocite ca celule/mm 3. Întâi trebuie calculat numărul mediu de leucocite într un pătrat mare: (numărul total de leucocite numărate)/25 (numărul de pătrate rp). Acesta trebuie raportat la volumul (V) corespunzător unui pătrat mare: aria*înălțimea (A*Î) camerei. În final, rezultatele trebuie corectate pentru diluția sângelui (D). r. Leucocite rp V D rp A Î D. r Leucocite ITERPRETAREA REZULTATELOR Valori normale: adulți: /mm 3 nou născuți, copii mici: /mm 3 Valori crescute leucocitoză: fiziologic: după efort, post prandial, femei: menstruație, sarcină, lăuzie patologic: infecție, inflamație, otrăvire Valori scăzute leucopenie: șoc anafilactic, infecții virale, expunere la radiații X, etc.

9 umărarea eozinofilelor 41 UMĂRAREA EOZIOFILELOR MATERIALE ECESARE hemocitometru, pipetă de diluție pentru leucocite (Figura 7), soluție de diluție (soluție de eozină: eozină 2% 5 ml, acetonă 5 ml, apă distilată 90 ml) microscop optic, pentru recoltarea sângelui: tampoane de vată, alcool, ace sterile, mănuși de unică folosință. METODA DE LUCRU Pregătiți hemocitometrul și dezinfectați degetul așa cum a fost descris mai sus. Pentru a evita riscul de infecție, spălați vă mâinile cu apă și săpun înainte și după efectuarea oricăror teste sanguine. Când manipulați probele de sânge ale altor persoane, folosiți mănuși de unică folosință. Aruncaţi acele folosite în recipientele special destinate acestui scop. Faceți o puncție la nivelul degetului și aspirați sângele în pipetă până la gradația 1, așa cum a fost descris mai sus. Umpleți pipeta cu soluție de eozină până la gradația 11, obținând o diluție de 10 ori. Agitați pipeta timp de 3 5 minute, apoi umpleți hemocitometrul cu a treia picătură. Așezați hemocitometrul la microscopul optic și examinați proba folosind obiectivul cu putere mică (10 x) și în luminozitate scăzută. Identificați eozinofilele colorate în roșu aprins. umărați eozinofilele pe toată suprafața zonei gravate (9 mm 2 ). REZULTATE Raportați numărul de eozinofile ca celule/mm 3. umărul total de eozinofile numărate () trebuie raportate la volumul corespunzător zonei gravate: aria*înălțimea camerei (A*Î). În final, rezultatele trebuie corectate pentru diluția sângelui (D). r. Eozinofile V D A Î D

10 42 Lucrări practice de fiziologie. r Eozinofile ITERPRETAREA REZULTATELOR Valori normale: /mm 3 Valori crescute eozinofilie: alergii, infecții parazitare. Valori scăzute eozinopenie: arsuri, șoc, administrare de hormoni steroidieni, etc.

11 umărarea trombocitelor 43 UMĂRAREA TROMBOCITELOR MATERIALE ECESARE hemocitometru, pipetă de diluție pentru leucocite (Figura 7), soluție de diluție (soluție Dameshek: clorhidrat de cocaină 3 g, clorură de sodiu 0,2 g, apă distilată ad 100 ml) microscop optic, pentru recoltarea sângelui: tampoane de vată, alcool, ace sterile, mănuși de unică folosință. METODA DE LUCRU Curățați hemocitometrul și lamela de sticlă cu o bucată de vată îmbibată cu alcool și lăsați să se usuce. Pregătiți hemocitometrul prin așezarea lamelei pe lamă. Pentru a evita riscul de infecție, spălați vă mâinile cu apă și săpun înainte și după efectuarea oricăror teste sanguine. Când manipulați probele de sânge ale altor persoane, folosiți mănuși de unică folosință. Aruncaţi acele folosite în recipientele special destinate acestui scop. Curățați vârful degetului cu vată îmbibată cu alcool. Lăsați degetul să se usuce. Folosind un ac steril, de unică folosință, faceți rapid o singură puncție la vârful degetului curățat (țineți l ferm între police și index), suficient de adâncă încât sângele să curgă liber din rană. Ștergeți cu vată prima picătură de sânge. După ce s a format a doua picătură, se aspiră în pipetă. u aspirați până când nu s a format o picătură suficient de mare deoarece aceste pipete au un lumen foarte îngust și sângele coagulează extrem de repede în interior. u stoarceţi degetul! Așezați vârful pipetei în picătura de sânge. Aspirați, folosind piesa bucală, o coloană continuă de sânge în pipetă până la gradația 0,5 a pipetei. Ștergeți excesul de sânge de pe vârful pipetei. Introduceți vârful pipetei în soluția de diluție pentru hematii (soluția Dameshek); menținând pipeta în poziție verticala, aspirați soluție de diluție exact până la gradația 11. Diluția ar trebui făcută foarte repede și precis pentru a evita coagularea sângelui și pentru a asigura precizia. Astfel se obține o diluție de 20 de ori (volumul din camera de numărare este 11 μl 1 μl=10 μl, conținând 0,5 µl sânge). Acoperiți capetele pipetei cu policele și degetul mijlociu și agitați timp de 5 minute.

12 44 Lucrări practice de fiziologie Aruncați primele două picături din pipetă (provin din porțiunea capilară a pitei și conțin doar soluție de diluție) și cu a treia picătură umpleți hemocitometrul: lăsați picătura să cadă în apropierea lamelei și camera de numărare se va umple prin capilaritate. Lichidul în exces va curge în șanțuri. Așteptați 20 de minut epentru lizarea completă a celorlalte celule sanguine. Așezți hemocitometrul la microscopul optic și examinați proba cu obiectivul cu putere mică (10 x) și în lumină scăzută. umărați trombocitele în 100 de dreptunghiuri consecutive, luând în considerare celulele aflate în interiorul pătratului și pe două din laturile acestuia. REZULTATE Raportați numărul de trombocite ca celule/mm 3. Întâi trebuie calculată media numărului de trombocite într un dreptunghi: (numărul total de trombocite numărate)/100 (numărul de dreptunghiuri rd). Aceasta trebuie raportată la volumul (V) corespunzător unui dreptunghi: aria*înălțimea (A*Î) camerei. În final, rezultatele trebuie corectate pentru diluția sângelui (D). r. Trombocite rd V D rd A Î D. r Trombocite ITERPRETAREA REZULTATELOR Valori normale: /mm 3 Valori crescute trombocitoză: boli ale măduvei osoase Valori scăzute trombocitopenie: boli autoimune, medicație, idiopatică