TOXICOLOGIE ORGANICĂ Sem. II Curs 6. Biotransformarea compușilor organici prin reacții metabolice (continuare). Reacții din faza a II-a

Transcript

1 TOXICOLOGIE ORGANICĂ Sem. II Lector dr. Adriana Urdă Curs 6. Biotransformarea compușilor organici prin reacții metabolice (continuare). Reacții din faza a II-a Reacții din faza a II-a Reacțiile de biotransformare din faza a II-a includ glucuronidarea, sulfonarea (mai cunoscută ca sulfatare), acetilarea, metilarea, conjugarea cu glutation (sinteza acidului mercapturic) și conjugarea cu aminoacizi (cum sunt glicina, taurina și acidul glutamic). Cofactorii (compuși chimici ne-proteinici, necesari pentru desfășurarea reacțiilor enzimatice) pentru aceste reacții, prezentați mai jos, reactionează cu grupele funcționale care sunt prezente în xenobiotic sau care sunt introduse/expuse în timpul fazei I a biotransformării (gruparea funcțională care reacționează cu compusul xenobiotic sau care este transferată acestuia este scrisă cu albastru). Cu excepția metilării și acetilării, reacțiile de biotransformare din faza a II-a conduc la o creștere puternică a hidrofilicității compusului, astfel încât promotează mult excreția compușilor străini. Reacțiile din faza a II-a decurg în general mult mai rapid decât reacțiile din faza I, cum sunt cele catalizate de citocromul P450. De aceea, viteza de eliminare a compușilor xenobiotici a căror excreție depinde de biotransformarea cu citocrom P450 urmată de conjugare în faza a II-a este determinată de prima etapă (reacția cu citocrom P450). Glucuronidare Sulfatare (sulfonare) O Acid uridin-5ʹ-difosfo-α-d-glucuronic (UDP-acid glucuronic) Acetilare 3ʹ-fosfoadenozin-5ʹ-fosfosulfat (PAPS) Metilare Acetil coenzima A S-adenozilmetionină (SAM)

2 Conjugarea cu glutation Conjugarea cu aminoacizi Glicină Acid γ-glutamic Cisteină Glicină Glutation Taurină Glutamină Glucuronidarea Glucuronidarea este o cale majoră de biotransformare a compușilor xenobiotici în speciile de mamifere, cu excepția felinelor. Glucuronidarea necesită prezența cofactorului difosfat de uridină-acid glucuronic (UDP-acid glucuronic), iar reacția este catalizată de o enzimă din grupul tranferazelor, localizată în ficat și în alte țesuturi (rinichi, intestin, piele etc.). Centrul la care se produce glucuronidarea este în general un heteroatom nucleofil bogat în electroni (O, N sau S). De aceea, substraturile pentru glucuronidare conțin grupe funcționale cum sunt alcoolii alifatici și fenolii (care formează esteri O-glucuronide), acizii carboxilici (care formează esteri O-glucuronide), aminele aromatice și alifatice primare și secundare (care formează N-glucuronide), și grupele tiol (care formează S-glucuronide). Pe lângă numeroși compuși xenobiotici, substraturile pentru glucuronidare includ mai mulți compuși endogeni (care au originea în organismele vii) cum sunt bilirubina, hormonii steroidieni și cei tiroidieni. Transferază 4-amino-bifenil N-glucuronidă Compușii conjugați cu glucuronidă ai xenobioticelor și compușilor endogeni sunt polari, solubili în apă și pot fi eliminați din corp în urină sau în bilă. Modul de excreție (urinară sau biliară) depinde de mărimea intermediarului metabolit rezultat în faza I. Gruparea acid carboxilic a acidului glucuronic, care este ionizată la ph fiziologic, ajută excreția deoarece (1) mărește solubilitatea în apă a compusului xenobiotic și (2) este recunoscută de sistemele de transport anionic renale și biliare, ceea ce permite glucoronidelor să fie excretate în urină și bilă. Sulfatarea Mulți dintre compușii xenobiotici și endogeni care suferă O-glucuronidare pot să fie transformați și prin conjugare cu sulfat. Conjugarea cu sulfat produce în general un ester al acidului sulfuric foarte solubil în apă. Reacția este catalizată de enzime numite sulfotransferaze, prezente în general în ficat, rinichi, tractul GI etc. Cofactorul pentru reacție este 3ʹ-fosfoadenozin-5ʹ-fosfosulfat (PAPS), a cărui structură a fost prezentată anterior. Conjugarea cu sulfat a alcoolilor alifatici și a fenolilor, R OH, decurge astfel: 2

3 PA PA Conjugarea cu sulfat implică transferul unei grupe sulfonat (SO 3 ), nu sulfat (SO 4 ), de la PAPS la compusul xenobiotic. Termenii utilizați în mod obișnuit, sulfatare și conjugare cu sulfat vor fi utilizați în continuare, deși sulfonare și conjugare cu sulfonat sunt mai corecți. Sulfatarea nu este limitată la fenoli și alcooli alifatici (care sunt deseori produși în faza I de biotransformare), deși aceștia reprezintă grupul cel mai numeros de substraturi pentru sulfotransferaze. Anumite amine aromatice, cum sunt anilina și 2-aminonaftalina, pot suferi conjugare cu sulfat la sulfamații corespunzători. Exemple de compuși xenobiotici și endogeni care sunt sulfatați fără biotransformare prealabilă de enzimele din faza I: alcooli primari (etanol, polietilen glicoli), alcooli secundari (2-butanol, colesterol), fenoli (fenol, naftol), amine alifatice și aromatice (anilina, 2- aminonaftalina). Un număr și mai mare de compuși xenobiotici sunt sulfatați după ce grupul hidroxil este expus sau introdus în timpul fazei I a biotransformării. Acizii carboxilici pot fi conjugați cu acid glucuronic, dar nu cu sulfat. Totuși, mai mulți acizi carboxilici (cum sunt acidul benzoic, acidul naftilacetic, acidul salicilic etc.) sunt inhibitori pentru sulfotransferaze, deoarece se leagă de enzimă dar nu pot iniția atacul nucleofil asupra PAPS. Compușii rezultați prin conjugarea cu sulfat a xenobioticelor sunt excretați majoritar în urină. Sursa principală de sulfat necesară pentru sinteza PAPS provine din cisteină, printr-o secvență complexă de oxidare. Deoarece concentrația de cisteină liberă este limitată, concentrațiile celulare de PAPS (~ 75 µm) sunt mult mai mici decât cele de UDP-acid glucuronic (~ 350 µm) și glutation (~ 10 mm). Concentrația mică de PAPS limitează capacitatea de sulfatare a compușilor xenobiotici. În general, sulfatarea este o cale cu afinitate mare, dar capacitate mică de conjugare a compușilor xenobiotici, în timp ce glucuronidarea este o cale cu afinitate scăzută, dar capacitate mare. Activitatea ridicată a sulfotransferazelor la feline compensează capacitatea lor scăzută de a conjuga compuși xenobiotici cu acid glucuronic. În general, sulfatarea este o metodă eficientă de micșorare a efectului toxic al compușilor xenobiotici. Există cazuri, însă, în care sulfatarea mărește toxicitatea acestora, deoarece anumiți compuși conjugați cu sulfat sunt instabili chimic și se pot degrada cu formarea unor specii reactive electrofile. Metilarea Metilarea este o cale comună, dar minoră, de biotransformare a compușilor xenobiotici și este catalizată de enzime numite transferaze. Metilarea diferă de cele mai multe dintre reacțiile din faza a II-a, deoarece în general micșorează solubilitatea în apă a compușilor xenobiotici și maschează grupele funcționale care pot fi conjugate de alte enzime din faza a II-a. O excepție de la această regulă este N-metilarea compușilor care produc ioni de amoniu cuaternari, solubili în apă și excretați rapid. Cofactorul pentru metilare este S-adenozilmetionina (SAM), a cărei structură a fost prezentată mai sus. Grupa metil legată de ionul sulfoniu în SAM este transferată compușilor xenobiotici și endogeni prin atacul nucleofil al unui heteroatom bogat în electroni (O, N sau 3

4 S). În consecință, grupele funcționale implicate în reacțiile de metilare sunt fenoli, amine alifatice și aromatice și tioli. Metalele pot fi și ele metilate. Mercurul anorganic și arsenul pot fi ambele dimetilate, iar seleniul poate fi trimetilat. Unele exemple de compuși xenobiotici și endogeni care suferă O-, N- sau S-metilare sunt prezentate în continuare: - O-metilare: - N-metilare: - S-metilare: Acetilarea N-acetilarea este o cale majoră de biotransformare pentru compușii xenobiotici care conțin o amină aromatică (R-NH 2 ) sau o grupare hidrazină (R-NH-NH 2 ), care sunt transformate la amide aromatice (R-NH-COCH 3 ) și hidrazide (R-NH-NH-COCH 3 ). Compușii xenobiotici care conțin amine alifatice primare sunt rareori substraturi pentru N-acetilare. Ca și metilarea, N-acetilarea maschează o amină cu o grupare neionizabilă, astfel încât mulți metaboliți N-acetilați sunt mai puțin solubili în apă decât compușii de la care provin. N-acetilarea compușilor xenobiotici este catalizată de enzime numite transferaze (Nacetiltransferaze) și necesită drept cofactor acetil-coenzima A (acetil-coa), a cărei structură a fost prezentată anterior. Reacția se produce în două etape, conform unui mecanismping-pong. În prima etapă, gruparea acetil de la acetil-coa este transferată unui centru activ (cisteină) din enzima N-acetiltransferază, cu eliberarea coenzimei A: E-SH + CoA-S-COCH 3 E-S-COCH 3 + CoA-SH În a doua etapă, gruparea acetil este transferată de la enzima acetilată la gruparea amină a substratului, cu regenerarea enzimei. Pentru aminele puternic bazice, viteza de N-acetilare este determinată de prima etapă (acetilarea enzimei), în timp ce viteza de acetilare a aminelor slab bazice este determinată de a doua etapă (transferul grupei acetil de la enzima acetilată la amina acceptoare). 4

5 N-acetiltransferazele se găsesc în ficat și în multe alte țesuturi ale celor mai multe mamifere, cu excepția câinilor și vulpilor, care nu pot acetila compuși xenobiotici. Substraturile care sunt N-acetilate preferențial includ acidul p-aminobenzoic și p- aminosalicilic. Acid p-aminobenzoic Acid p-aminosalicilic Conjugarea cu aminoacizi Există două căi principale prin care compușii xenobiotici sunt conjugați cu aminoacizi, așa cum se observă mai jos. Prima cale implică conjugarea compușilor xenobiotici ce conțin o grupare acid carboxilic cu gruparea amină a unor aminoacizi ca glicină, glutamină și taurină (vezi structurile lor mai sus). + Acetil-CoA - CH 3COO + NH 2CH 2COO - CoA-SH Acid benzoic Tioester Acid hipuric Conjugarea acidului benzoic cu glicină pentru a forma acid hipuric a fost observată în 1842, fiind prima reacție de biotransformare descoperită. Reacția decurge printr-un mecanism ping-pong. Prima etapă implică transformarea acidului benzoic într-un tioester acil-coa, cu eliminarea ionului acetat. A doua etapă constă în formarea unei legături amidice cu aminoacidul acceptor, cu regenerarea coenzimei A. Substraturile pentru conjugarea cu aminoacizi sunt limitate la unii acizi alifatici, aromatici și heteroaromatici. A doua cale implică conjugarea compușilor xenobiotici ce conțin o hidroxilamină aromatică (amină N-hidroxi aromatică) cu gruparea acid carboxilic a unor aminoacizi. Această cale implică activarea unui aminoacid cu o enzimă (sintetază) care reacționează apoi cu hidroxilamina aromatică pentru a forma un N-ester reactiv (iar aminoacidul se elimină și se recirculă în reacție). - HO N-oxid metabolit reactiv 5

6 Capacitatea compușilor xenobiotici de a suferi conjugare cu aminoacizi depinde de împiedicarea sterică în jurul grupei acid carboxilic, și de substituenții la inelul aromatic sau la catena laterală alifatică. Compușii obținuți prin conjugarea cu aminoacizi sunt eliminați în special prin urină. Pe lângă glicină, glutamină și taurină există și alți aminoacizi acceptori pentru conjugarea cu compuși xenobiotici. Conjugarea compușilor xenobiotici ce conțin grupare acid carboxilic este o alternativă la glucuronidare. Conjugarea cu aminoacizi este o reacție de detoxifiere, în timp ce glucuronidarea lor produce acilglucuronide potențial toxice (vezi acolo). Spre deosebire de conjugarea cu aminoacizi a compușilor xenobiotici ce conțin grupare acid carboxilic, care este o reacție de detoxifiere, conjugarea cu aminoacizi a aminelor N- hidroxi aromatice (hidroxilamine) este o reacție de activare, deoarece produce N-esteri care se pot degrada pentru a forma ioni electrofili reactivi. Conjugarea cu glutation Este o reacție de conjugare a compușilor xenobiotici cu glutation, o tripeptidă formată din glicină, cisteină și acid glutamic (ultimul fiind legat de cisteină prin gruparea γ-carboxil, și nu prin gruparea obișuintă α-carboxil, vezi mai sus). Acest tip de conjugare este fundamental diferit de conjugarea cu alți aminoacizi, deoarece compușii obținuți sunt tioeteri, care se formează prin atacul nucleofil al anionului tiolat GS al glutationului la un atom de carbon electrofil din compusul xenobiotic. Glutationul poate conjuga și compuși xenobiotici care conțin heteroatomi electrofili. Conjugarea compușilor xenobiotici cu glutation este catalizată de o familie de enzime, glutation S-transferaze, care sunt prezente în aproape toate țesuturile, dar cu concentrații mai mari în ficat, intestin, rinichi etc. Substraturile pentru conjugarea cu glutation au trei caracteristici comune: sunt hidrofobe, conțin un atom electrofil și reacționează ne-enzimatic cu glutationul cu viteză măsurabilă. Enzima mărește viteza de reacție prin deprotonarea GSH la GS. Concentrația de glutation în ficat este foarte mare (~ 10 mm), de aceea conjugarea ne-enzimatică a anumitor compuși xenobiotici poate fi semnificativă. Substraturile pentru conjugarea cu glutation pot fi împărțite în două categorii: cele care sunt suficient de electrofile pentru a fi conjugate direct, și cele care trebuie să fie mai întâi biotransformate într-un metabolit electrofil înainte de a fi conjugate. A doua grupă de substraturi include intermediari reactivi produși în timpul fazelor I sau II de biotransformare, cum sunt oxiranii (oxizii arenelor și epoxizii alchenelor), ioni nitreniu, ioni carboniu și radicali liberi. Reacțiile de conjugare pot, la rândul lor, să fie împărțite în două categorii: reacții de dislocuire, în care glutationul dislocuiește o grupare atrăgătoare de electroni, și reacții de adiție, în care glutationul este adiționat la o dublă legătură activată sau la un sistem de inele tensionat. a.dislocuirea de către glutation a unei grupe atrăgătoare de electroni apare în mod obișnuit atunci când substratul conține o grupare halogen, sulfat, sulfonat, fosfat sau nitro atașate la un carbon alilic sau benzilic. Dislocuirea grupării atrăgătoare de electroni din compușii xenobiotici aromatici este limitată (împiedicată) de prezența altor substituenți donori de electroni la inelul aromatic (-NH 2, -OH, -OR și R). Dimpotrivă, reacțiile de dislocuire sunt intensificate prin prezența altor grupe atrăgătoare de electroni (-F, -Cl, -Br, -I, -NO 2, -CN, - CHO și COOR). 6

7 1,2-dicloro-4-nitrobenzen b. Adiția glutationului la o dublă legătură C=C este facilitată și de prezența în apropiere a unei grupări atrăgătoare de electroni, deci substraturile pentru această reacție conțin în mod obișnuit o legătură dublă lângă CN, -CHO, -COOR sau COR. Dubla lăgătură din dietilmaleat este vecină cu două grupări atrăgătoare de electroni și suferă cu ușurință o reacție de adiție cu glutation: Dietilmaleat Oxizii arenelor și epoxizii alchenelor, care se formează deseori prin oxidarea în prezența citocromului P450 a hidrocarburilor aromatice și alchenelor, sunt exemple de sisteme de inele tensionate, care se deschid prin adiția glutationului: P450 Clorobenzen 3,4-oxid Glutationul poate conjuga și compuși xenobiotici cu un heteroatom electrofil (O, N sau S). Compusul conjugat format inițial între heteroatom și glutation este scindat de o a doua moleculă de glutation, pentru a forma glutation oxidat (GSSG). Scindarea esterilor nitrat ai nitroglicerinei eliberează nitrit, care poate fi transformat într-un vasodilatator puternic, oxidul de azot. 7

8 Compușii conjugați cu glutation formați în ficat pot fi excretați în bilă sau în urină. Conjugarea cu glutation reprezintă o reacție de detoxifiere importantă, deoarece compușii electrofili sunt specii potențial toxice, care se pot lega de specii nucleofile importante cum sunt proteinele și acizii nucleici, producând deteriorarea celulelor și mutații genetice. Toate enzimele implicate în biotransformarea compușilor xenobiotici au potențialul de a genera intermediari reactivi, din care cea mai mare parte sunt detoxifiați într-o oarecare măsură prin conjugare cu glutation. Bibliografie 1. V. A. Voicu Toxicologie clinică, Editura Albatros, București, Casarett and Doullʼs Toxicology: the basic science of poisons, (ed. C. D. Klaassen), McGraw-Hill, 2001, cap. 6 Biotransformation of xenobiotics 8