Funkcije proteinov. Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen...) Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr.

Transcript

1 Funkcije proteinov Oporna funkcija (strukturni proteini, npr keratini, kolagen...) Transport/skladiščenje določenih molekul (ligandov, npr. Hb, Mb) Uravnavanje procesov (DNA-vezavni proteini) Obramba pred tujki/invazivnimi organizmi (Imunoglobulini) Lipoproteini, potrebni za transport lipidov po telesu Kontraktilni proteini Membranski proteini, vključeni v transport molekul/ionov preko membrane Proteini, vključeni v prenos signala (receptorji, G-proteini, kinaze...) Kataliza biokemijskih reakcij (encimi)

2 Membranski proteini in transport - Sestava in struktura membrane - Dinamika membrane - Transport čez membrano

3 Vsako kraljestvo, vrsta, tkivo, tip celic in organel ima značilen set lipidov in proteinov Plazemska membrana proteini fosfolipidi steroli vrsta sterola Člov. mielin.ovojnica holesterol Mišja jetra holesterol List koruze stigmasterol Kvasovka Ergosterol Paramecij (protist) Sitosterol E. Coli / Večja variabilnost v sestavi proteinov so lahko tudi glikozilirani (glikoforin v eritrocitu)

4 Lipidna sestava različnih membran hepatocitafunkcijska specializacija

5 Biološke membrane imajo skupne lastnosti Model tekočega mozaika, asimetričnost, omogočeno lateralno gibanje lipidov in proteinov, oligosahardine verige lipidov in proteinov na zunanji strani

6 V membranah so lipidi in proteini razporejeni asimetrično

7 Membranski proteini -Integralni (lahko jih odstranimo le z detergenti) -Periferni (pridruženi membrani preko elektrostatksih interakcij) -Amfitropični (so lahko v membrani ali pa v citosolu) oligosaharidna veriga glikoproteina glikolipid zunaj lipidni dvosloj polarne glave fosfolipidov sterol znotraj periferni protein integralni protein periferni protein, kovalentno vezan na lipid Integralni membranski protein Omogočajo komunikacije med celicami: - skozi celično membrano prenašajo organske molekule in ione - receptorji na celični površini zaznajo signale in sprožijo specifične poti v celici - skrbijo za stik med celicami

8 Integralni transmembranski proteini primer glikoforina v membrani eritrocita Polarne AK Nepolarne AK Medcelično prepoznavanje Tetrasaharid: -2 Sialični kislini -Galaktoza -N-acetil galaktozamin Polarne AK

9 Integralni transmembranski proteini primer bakteriorodopsina Bakteriorodopsin izhaja iz bakterije H. Salinarum; soroden človeškemu rodopsinu 7 zelo hidrofobnih alfa-vijačnic; Polipeptidna veriga 7-krat prečka membrano (7 transmembranskih domen)

10 Vrste integralnih membranski proteinov Transmembranske regije so alfa vijačnica ali beta sodček; hidrofobne interakcije z membranskimi lipidi Ena regija čez membrano (glikoforin, tip I) Več regij čez membrano, 1 polipeptid (bakteriorodopsin, transportni proteini) Važna je orientacija! Več regij čez membrano, več polipiptidov, kanalček (transportni protieni) Zasidrani v membrano kovalentna vez z lipidom Transmembranske domene in lipidno sidro Lehninger Principles of Biochemistry

11 Topolgijo membranskega proteina lahko razberemo iz zaporedja AK - Eksperimentalno so bile določene spremembe prostih entalpij pri premikanju stranskih verig AK iz nepolarnega topila v vodo relativna polarnost AK; G pri prehodu se izrazi kot indeks hidrofobnosti -Določanje število predvidenih transmembranskih regij z in silico z diagramom hidrofobnosti. glikoforin G < 0 polarne AK G > 0 nepolarne AK Bakteriorodopsin.

12 Na stiku med lipidi in vodo sta v membranskih proteinih Trp in Tyr znotraj zunaj - Stranske verige Trp in Tyr vstopajo v interakcije tako z lipidi centralnega dela membrane, kot tudi z vodno fazo na obeh straneh membrane. - Pravilo pozitivne notranjosti - na notanji (citoplazemski) strani prevladujejo bazične aminokisline Arg, His, Lys.

13 Porini bakterijski transmembranski proteini s strukturo sodčka Planarnih ploskev NE najdemo v notranjosti membran, saj je še prostor za H-vezi med CO in NH peptidnih vezi ter vodo. sodčki - 20 ali več transmembranskih segmentov z verigami v obliki cilindra vzpostavljeno je maksimalno število vodikovih vezi med CO in NH peptidnih ostankov, prostora za vodikove vezi z vodo ni podobna stabilnost kot vijačnica.

14 Membranski proteini tipa V, VI so preko lipidov zasidrani v membrano Glikozilirani derivati fofatidil inozitola (GPI) na C-term. Palmitinska kislina na notranje Cys, Ser, Miristinska k. na N-term. Gly Izoprenoidi na C-term. Cys

15 Povezave med lipidi in proteini tioestrska vez Amidna vez tioeterska vez znotraj zunaj

16 Membrane so lahko v obliki gela ali tekočega mozaika

17 Premik lipidov z ene strani memebrane na drugo je počasen

18 Flipaza, flopaza in skramblaza omogočajo prehod lipidov z ene strani membrane na drugo ATP ADP + Pi P.F. Devaux et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1778 (2008)

19 Lipidni rafti (splavi) so s proteini bogate mikrodomene membran

20 Kaveole so lipidni rafti s proteinom kaveolinom

21 Sestava in dinamika membran povzetek Membrane organizmov, tkiv, celic, organel, imajo različno sestavo lipidov in proteinov Periferni membranski proteini so z elektrostatskimi silami in H-vezmi šibko povezani z membrano Integralni proteini so močno povezani z membrano prek hidrofobnih interakcij Lipidi v membrani so lahko v tekočem urejenem ali neurejenem stanju (tekoči mozaik) Lipidi in proteini se v membrani lahko premikajo lateralno. Flip-flop difuzija prek membrane je redka in počasna. Pospešijo jo flipaze, flopaze (ob hidrolizi ATP) in skramblaze (brez kemične energije) Lipidni rafti so domene membran, bogate s sfingolipidi, holesterolom in proteini.

22 Transport preko bioloških membran Snovi morajo preko različnih membran, da pridejo na vsa mesta, kjer so potrebne. Mnoge snovi same ne morejo preko membran, zato potrebujejo prenašalce. Da se snovi lahko koncentrirajo, je potrebna energija.

23 Vrste transporta po smeri in energiji Pasivni transport: v smeri koncentracijskega gradienta (od večje k manjši koncentraciji) in brez uporabe energije. Lahko je s prenašalci ali brez. Aktivni transport: proti smeri koncentracijskega gradienta (od manjše k večji koncentraciji) in z uporabo energije - vedno s prenašalci! Vrste transporta po smeri in številu prenešenih molekul kotransport

24 Vrste transporta 2 5 Pasivni transport 1 1. Preprosta difuzija 2. Olajšana difuzija 3. Ionski kanali 4. Ionofori Aktivni transport 5. Primarni aktivni transport 6. Sekundarni aktivni transport 4 6 3

25 Energijske zakonitosti prehoda čez membrano Snovi, ki se pretaknejo čez membrano se morajo pri prehodu znebiti hidratacijskega plašča.to je glavni vir velike aktivacijske energije. Snovi, ki ne morejo čez membrano, potrebujejo prenašalce. Pasivni transport - prenašalci le vežejo molekule, jim olajšajo prenos (povečajo hitrost prenosa, ker zmanjšajo aktivacijsko energijo) in jih izpustijo na drugi strani. To ne voliva na ravnotežje! Podobnost s katalizatorji!

26 Vrste prenašalcev čez membrano Transportni proteini ničti red Prenašalci Kanali prvi red c ali Δc Sekundarni aktivni prenašalci Pasivni prenašalci Primarni aktivni prenašalci Prenašalec ima določeno kapaciteto in se nasiči s prenašano molekulo. Ko so vsi prenašalci nasičeni, je dosežena maksimalna hitrost prenosa in povečanje koncentracijske razlike ve vpliva več (ničti red)!

27 Lastnosti transportnih proteinov: kanalčki in prenašalci Kanalčki Niso stereospecifični Visoka hitrost transporta (10 8 ionov/s) Ne pride do nasičenja Multimerni proteini (pogosto iz ene vrste podenot) Odpiranje kanalčkov je uravnavano - z ligandom - z napetostjo Prenašalci Stereospecifična vezava substrata Visoka hitrost transporta Pride do nasičenja Monomerni proteini

28 Ena of klasifikacij transportnih proteinov 1a) Kanalčki s strukturo -vijačnice (K + kanalček, akvaporini, acetilholinski receptorski kanalček, kanalček, odvisen od napetosti...) b) Porini s strukturo β-sodčka (bakterijski porini) c) Toksini, ki tvorijo pore (toksin difterije) a) Porterji: uniporterji, simporterji, antiporterji (GLUT1 transporter glukoze v eritrocitih, HCO 3- Cl - antiporter) b) Neribosomsko sintetizirani porterji (valinomicin) 3a) Transporterji, ki dobijo energijo s hidrolizo ATP (CFTR Cl - kanalček, F 1,F 0 ATPazna protonska črpalka, ABC (ATP binding cassette) transporterji GLUT1

29 Prenašalci čez membrano Stereospecifična vezava substrata Visoka hitrost transporta Pride do nasičenja Monomerni proteini Prenašalci Transportni proteini Kanali Sekundarni aktivni prenašalci Pasivni prenašalci Primarni aktivni prenašalci

30 Termodinamske zakonitosti transporta čez membrano Prosta entalpija snovi, ki se prenaša čez membrano, je odvisna od koncentacijskega gradienta Snov se premika spontano ( G t < 0) iz predela z višjo koncentracijo na predel z nižjo koncentracijo. Ravnotežje G = 0 je doseženo, ko je C 1 = C 2 Premikanje vzdolž koncentracijskega gradienta je manifestacija 2. zakona termodinamike molekule se spontano razporedijo čimbolj naključno, entropija se poveča.

31 Prenos glukoze v eritrocitu olajšana difuzija čez GLUT1 Transporterji glukoze so prisotni v različnih tkivih (GLUT1, GLUT2, etc.) Pospešijo prenos glukoze (olajšana difzuzija) vzdolž c gradienta do x Eritrociti so odvisni od stalne dobave glukoze iz krvne plazme Erythrocytes depend on constant supply of glucose from blood, kjer je [Glc] = ~4.5-5 mm; glukozo uporabljajo kot vir energije za glikolizo.

32 Predvidena struktura prenašalca GLUT1

33

34 . Shulman G I Physiology 2004;19: by American Physiological Society

35 Insulinski in glukozni receptor Z insulinom posredovani privzem glukoze: insulin se veže na insulinski receptor. To sproži kaskado prenosa signala, ki poveča število GLUT4 receptorjev na membranah in omogoči hiter prenos glukoze v celico. Mladostni diabetes tipa I ni sprožanja insulina, zato ni prenosa glukoze v celico.

36 Prenašalec klorida in bikarbonata- anionski izmenjevalni protein, pasivni transport Elektro-nevtralni prenos. Kotransporter antiport. Milijonkrat poveča hitrost prenosa bikarbonatnih ionov, poveča kapaciteto eritrocita za prenašanje CO 2

37 Aktivni transport topljencev proti koncentracijskemu gradientu Če je razlika v koncentraciji 10-kratna, za prenos 1 mola snovi potrebujemo 5,7 kj Primarni: prenos topljenca je direktno vezan na hidrolizo ATP. Sekundarni: zaradi primarnega aktivnega prenosa je že vzpostavljen gradient X (pogosto natrijevi ioni). X lahko spontano potujejo v smeri elektrokemijskega gradienta. Gibanje X vzdolž gradienta daje dovolj energije, da se skupaj z njimi PROTI elektrokemijskemu gradientu premikajo ioni S.

38 P-vrsta ATPaz skupina aktivnih prenašalcev -70 pri človeku - imajo Asp ostanek, ki se fosforilira -Imajo 8 10 transmembranskih domen -Vse inhibira vanadat, analog fosfata +2 -Ca črpalka je uniporter + + -K /Na ATP-aza je antiporter -Črpalka protonov in K v želodcu + Črpalka kalcijevih ionov sarkoplazemskega retikuluma: SERCA - Vzdržuje nizko koncentracijo kalcija v citoplazmi vseh celic. -Vzdržuje visoko koncentracijo kalcija v lumnu ER v miocitu lumen SER -Sproščanje SER kalcija vzpodbudi krčenje mišic -Velika konformacijska sprememba ob hidrolizi ATP, kar prenese 2 Ca iona

39 + + Na /K ATP-aza -Simport obeh kationov proti elektrokemijskemu gradientu -Vzdržuje znotrajcelično koncentracijo Na in K ionov, vzdržuje membranski potencial -Potencial vzdolž plazemske membrane je nujen za prenos živčnih impulzov -Gradient Na ionov pomaga pri sekundarnem aktivnem transportu številnih snovi

40 -Je reverzibilna, z ATP povezana črpalka FoF1 ATPaza/ATP sintaza -Črpa protone proti koncentracijskemu gradientu -Protonski gradient daje dovolj energije da obrne reakcijo sintetizira se ATP od tod ime ATP sintaza! -Sinteza ATP je osnova oksidativne fosforilacije v notrnaji mitohondrijski membrani. Prenos elektronov v dihalni verigi je sklopljen z oksidativno fosforilacijo izvor kemično vezane energije ATP po presnovi (katabolizmu)

41 ABC prenašalci ABC transporterji (ATP Binding Cassette transporters) velika družina črpalk, črpajo iz celic: aminokisline, peptide, proteine, kovinske ione, lipide, žolčne kisline, sterole, hidrofobne spojine (polutante, droge, zdravila) Znane mutacije v genu za ABC transporterje pri človeku dedne bolezni (anemije, odpoved ledvic, cistična fibroza) Pri človeku najbolj znan MDR1 (multi drug transporter) odgovoren za rezistenco nekaterih tumotjev na kemoterapevtska zdravila (adriamicin...) ABC transporterji v bakterijah (Streptococcus aureus...) odgovorni za rezistenco bakterij ciljano iščejo zdravila za inhbicijo bakterijskih ABC transporterjev faculty.smu.edu/jwise/mdr1.html

42 Ionofori preprečijo aktivni transport, ker porušijo elektrokemijski gradient vzdolž membrane K + Ionofor valinomicin je antibiotik. Prenaša kalijeve ione čez bakterijsko membrano in poruši gradient.

43 Ena of klasifikacij transportnih proteinov 1a) Kanalčki s strukturo -vijačnice (akvaporini, K + kanalček, acetilholinski receptorski kanalček, kanalček, odvisen od napetosti...) - Za ione selektivni kanalčki: (a) kanalčki, odvisni od ligandov; (b) kanalčki, odvisni od napetosti b) Porini s strukturo β-sodčka (bakterijski porini) c) Toksini, ki tvorijo pore (toksin difterije) a) Porterji: uniporterji, simporterji, antiporterji (GLUT1 transporter glukoze v eritrocitih, HCO 3- Cl - antiporter) b) Neribosomsko sintetizirani porterji (valinomicin) 3a) Transporterji, ki dobijo energijo s hidrolizo ATP (CFTR Cl - kanalček, F 1,F 0 ATPazna protonska črpalka, ABC (ATP binding cassette) transporterji GLUT1

44 Toksini, ki tovrijo pore gram pozitivna bakterija Dypthteria Toksin Dyphterie inhibira translacijo Proteoliza po okužbi s toksinom te bakterije

45 Prenos vode z akvaporinom 9-1 Hitrost prenosa do 10 s kar je več kot hitrost encimsko kataliziranih reakcij.

46 Akvaporini pri sesalcih

47 K + kanalček filter selektivnosti filter selektivnosti Radij K + - 1,33A Radij Na + - 0,95 A Prehod K + skozi poro 10 8 ionov/s (10.000x hitrejši kot Na + )

48 Na + kanalček nevrona je uravnavana s transmembransko napetostjo Mehanizem odpiranja kanalčka kot odgovor na znižanje napetosti

49 Nikotinski/acetilholinski receptor ionski kanalček, ki deluje pod vplivom liganda Bistvena komponenta električnega signala od motoričnega nevrona do mišičnega vlakna (v živčno-mišični sinapsi) Ligand acetiholin (ACh) in nikotin Vezava ACh na receptor povzroči konformacijsko spremembo receptorja odpre se ionski kanalček Kationi prehajajo v notranjost celice depolarizacija membrane Ionski kanalček je prepusten za Na +, Ca 2+ in K + Na + prehaja v smeri nižje konc. (2 x 10-7 ionov/s)

50 Acetilholinski receptor

51 Bolezni zaradi napak v kanalčkih

52 Cistična fibroza okvarjen kanalček CFTR za prenos Cl- Cistična fibroza okvarjen kanalček za Cl - ; avtosomna recesivna, 5% belcev je prenašalcev Odkrita mutacija v genu za protein CFRT (Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) Homozigoti dočakajo največ 30 let. Prizadeta predvesm gastrointestinalni in respiratorni trakta; Znanih že 1720 različnih mutacij tega gena!! Kanalček odprt, ko sta vezani molekuli ATP; zaprt, ko 1 ATP hidrolizira v ADP in Pi Zaradi sluzi pogoste bakterijske okužbe dihalnega trakta

53 Naravni strupi, ki delujejo na ionske kanalčke, vplivajo na prenos živčnega impulza Tetrodotoksin (riba), veže se na Na + kanalčke Saksitoksin (dinoflagelati v južnih morjih), veže se na Na + kanalčke Dendrotoksin (mamba afriška kača) inhibira K + kanalčke Tubokurarin, (aktivni strup kurare-ja, s katerim so ob Amazonki zastrupljevali puščice), veže se na ACh receptor Kobratoksin in bungarotoksin (kačja strupa), vežeta se na ACh-receptor z visoko afiniteto (Kd = M) in inhibirata prenos impulza tetrodotoksin

54 Transport čez membrano - povzetek Prenos polarnih molekul in ionov čez membrano potrebuje prenašalne proteine Molekule in ioni se lahko prenašajo vzdolž konc. gradienta ali proti gradientu GLUT prenašalci glukoze so uniporterji, ki prenašajo glukozo vzdolž gradienta Simporterji omogočajo simultani prenos dveh snovi v isto smer (prenos glukoze skupaj z Na+ v prebavnem traktu) Antiporterji prenašajo dve snovi v nasprotno smer (prenos Cl-/HCO3-; Na+K+ATPaza) Na+K+ATPaza plazemske membrane in Ca2+ prenašalci sarkoplazemskega retikuluma (SERCA) so primeri ATPaz tipa P (reverzibilna fosforilacija med katalitičnim ciklom) ATPaze tipa F so protonske črpalke (ATP sintaze), ki so ključne za ohranjanje energije mitohondrijev in kloroplastov. ABC transporterji odnašajo iz celic različne snovi, vključno z zdravili Ionofori so lipidotopne molekule, ki vežejo ione, jih pasivno prenesejo čez membrano in tako porušijo elektrokemijski gradient Voda čez membrane prehaja prek akvaporinov (nekateri prenašajo tudi gliceorl in ureo)

55 Transport čez membrano - povzetek Ionski kanalčki tvorijo hidrofilne pore skozi katere lahko difuncirajo ioni vzdolž električnega ali kemijskega gradienta Ionski kanalčki se večinoma ne morejo nasititi (saturirati), so večinoma specifični za eno vrsto ionov Večina ionskih kanalčkov je uravnavana z napetostjo (Na+ kanalček živčnih celic) ali z ligandom (acetilholinski receptor)