O ΤΠΟΔΟΦΕΑ RPTPβ\ζ ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΣΟΝ ΚΤΣΣΑΡΙΚΟ ΚΤΚΛΟ ΚΑΙ ΣΗΝ ΑΠΟΠΣΨΗ ΚΤΣΣΑΡΨΝ ΚΑΡΚΙΝΟΤ ΣΟΤ ΠΡΟΣΑΣΗ in vitro ΔΙΠΛΩΜΑΣΙΚΗ ΕΡΓΑΙΑ ΜΕΣΑΠΣΤΦΙΑΚΟΤ

Transcript

1 1 ΠΑΝΕΠΙΣΗΜΙΟ ΠΑΣΡΩΝ ΣΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΣΟΜΕΑ ΓΕΝΕΣΙΚΗ, ΒΙΟΛΟΓΙΑ ΚΤΣΣΑΡΟΤ ΚΑΙ ΑΝΑΠΣΤΞΗ O ΤΠΟΔΟΦΕΑ RPTPβ\ζ ΕΠΗΡΕΑΖΕΙ ΣΟΝ ΚΤΣΣΑΡΙΚΟ ΚΤΚΛΟ ΚΑΙ ΣΗΝ ΑΠΟΠΣΨΗ ΚΤΣΣΑΡΨΝ ΚΑΡΚΙΝΟΤ ΣΟΤ ΠΡΟΣΑΣΗ in vitro ΔΙΠΛΩΜΑΣΙΚΗ ΕΡΓΑΙΑ ΜΕΣΑΠΣΤΦΙΑΚΟΤ Υωτϐπουλοσ Μιλτιϊδησ, ΑΜ 529 Πϊτρα, Ιοϑλιοσ 2015

2 2 Ο Επιβλϋπων Καθηγητόσ\Επιςτημονικϐσ Τπεϑθυνοσ Κατςώρησ Παναγιώτησ Καθηγητόσ Σμόματοσ Βιολογύασ Πανεπιςτόμιο Πατρών Σα μϋλη τησ Σριμελοϑσ Εξεταςτικόσ Επιτροπόσ Κατςώρησ Παναγιώτησ Δημητριϊδησ Γεώργιοσ Μαργιωλϊκη Ειρόνη Καθηγητόσ Καθηγητόσ Επικ. Καθηγότρια Σμόματοσ Βιολογύασ Σμόματοσ Βιολογύασ Σμόματοσ Βιολογύασ

3 3 ΠΕΡΙΕΦΟΜΕΝΑ ΠΕΡΙΕΦΟΜΕΝΑ... 3 ΠΕΡΙΛΗΧΗ... 5 ABSTRACT... 6 A. ΕΙΑΓΨΓΗ... 7 A1. Κυτταρικϐσ Κϑκλοσ... 7 A1.1. Υϊςεισ του κυτταρικοϑ κϑκλου... 7 A1.2. Μύτωςη... 7 A1.3. Ϊλεγχοσ του κυτταρικοϑ κϑκλου... 9 A2. ΑΠΟΠΣΨΗ A2.1. Γενικϊ A2.2. Μορφολογύα τησ απϐπτωςησ A2.3. Μηχανιςμού απϐπτωςησ A3. ΚΑΡΚΙΝΟ ΣΟΤ ΠΡΟΣΑΣΗ A3.1 Δομό του ανθρώπινου προςτϊτη A3.2. Λειτουργύα του προςτϊτη A3.3. Ρϑθμιςη τησ αϑξηςησ του προςτϊτη A3.4. Καλοόθησ υπερπλαςύα του προςτϊτη A3.5. Καρκύνοσ του προςτϊτη A3.6. Βιολογικού δεύκτεσ του καρκύνου του προςτϊτη A3.7. Μοντϋλα μελϋτησ του καρκύνου του προςτϊτη A3.8. RPTPβ/ζ (Receptor-like Protein-Tyrosine Phosphatase) B ΤΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β1. Ανακαλλιϋργεια κυττϊρων Β2. Μϋτρηςη κυττϊρων ςε αιμοκυτταρϐμετρο Neubauer Β3. Εκχϑλιςη πρωτεώνών απϐ κϑτταρα ςε καλλιϋργεια B4. SDS ηλεκτροφϐρηςη ςε πόκτωμα πολυακρυλαμιδύου (SDS-PAGE) Β5. Ανοςοςτϑπωμα (Western blot) Β6. Αποδϋςμευςη αντιςωμϊτων και επαναχρηςιμοπούηςη αποτυπωμϊτων Β7. Προςδιοριςμϐσ νεκρών και αποπτωτικών κυττϊρων με κυτταρομετρύα ροόσ Β8 Ανοςοφθοριςμϐσ με BrdU για τον προςδιοριςμϐ του ποςοςτοϑ κυττϊρων ςτη φϊςη S του κυτταρικοϑ κϑκλου... 55

4 Γ. ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ Γ1. Προςδιοριςμϐσ νεκρών και αποπτωτικών κυττϊρων με κυτταρομετρύα ροόσ Γ2. Προςδιοριςμϐσ των ςχετικών επιπϋδων τησ ενεργοποιημϋνησ καςπϊςησ 3 και καςπϊςησ 8 με ανϊλυςη κατϊ Western Γ3.Προςδιοριςμϐσ του ποςοςτοϑ των κυττϊρων ςτη φϊςη S του κυτταρικοϑ κϑκλου με χρόςη ανοςοφθοριςμοϑ Γ4. Προςδιοριςμϐσ των ςχετικών επιπϋδων τησ ενεργοποιημϋνησ με φωςφωρυλύωςη Cdt Δ. ΤΜΠΕΡΑΜΑΣΑ-ΤΖΗΣΗΗ Ε. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΥΙΑ

5 5 ΠΕΡΙΛΗΧΗ Για την εργαςύα αυτό χρηςιμοποιοϑμε ωσ δεύγματα καρκινικϊ κϑτταρα PC3 και DU145, καθώσ και πληθυςμοϑσ των ύδιων κυττϊρων, οι οπούοι ϋχουν διαμολυνθεύ με ϋνα πλαςμύδιο που μειορρυθμύζει την ϋκφραςη ενϐσ υποδοχϋα, του RPTPβ/ζ. Η διαμϐλυνςη ϋγινε απϐ τη Ζωό Διαμαντοποϑλου (μια προηγοϑμενη υποψόφια διδϊκτορα), ωσ μϋροσ τησ διπλωματικόσ τησ εργαςύασ, και εύναι προφανϋσ ϐτι, κατϊ την καλλιϋργειϊ τουσ, πολλαπλαςιϊζονται πολϑ πιο αργϊ απϐ τα αντύςτοιχα φυςιολογικϊ κϑτταρα. Ο ςκοπϐσ αυτόσ τησ εργαςύασ εύναι να διερευνόςει εϊν αυτϐ ςυμβαύνει λϐγω μειωμϋνου ρυθμοϑ εξϋλιξησ του κυτταρικοϑ κϑκλου ό αυξημϋνου ρυθμοϑ απϐπτωςησ, καθώσ επύςησ και να εξετϊςει ϋμμεςα τισ επιπτώςεισ τησ ϋλλεψησ του υποδοχϋα, εφϐςο αυτϐ αποτελεύ και τη μϐνη διαφορϊ μεταξϑ των φυςιολογικών και μεταςχηματιςμϋνων κυττϊρων. Με ςκοπϐ να διερευνόςουμε το ρυθμϐ απϐπτωςησ των τεςςϊρων αυτών πληθυςμών, διενεργόςαμε πειρϊματα κυτταρομετρύασ ροόσ με Αννεξύνη και ΡΙ, ώςτε να υπολογύςουμε των αριθμϐ των βιώςιμων και νεκρωτικών κυττϊρων, καθώσ και τον αριθμϐ των κυττϊρων που βρύςκονται ςε πρώιμη και προχωρημϋνη απϐπτωςη. Επιπλϋον, κϊναμε πειρϊματα με ανϊλυςη κατϊ Western, με ςκοπϐ να εκτιμόςουμε τα επύπεδα των ενεργοποιημϋνων καςπαςών 8 και 3 ςτα διϊφορα κϑτταρα. Προκειμϋνου να μελετόςουμε την ταχϑτητα εξϋλιξησ του κυτταρικοϑ κϑκλου, διενεργόςαμε πειρϊματα ανοςοφθοριςμοϑ με επώαςη με BrdU για 4h και 24h, για να υπολογύςουμε το ποςοςτϐ των κυττϊρων που εύχαν νεοςυντιθϋμενο DNA. Σϋλοσ, χρηςιμοποιώντασ και πϊλι την ανϊλυςη κατϊ Western, μελετόςαμε τα επύπεδα τησ πρωτεϗνησ Cdt1, η οπούα παύζει ςημαντικϐ ρϐλο ςτην αδειοδϐτηςη τησ αντιγραφόσ του DNA.

6 6 ABSTRACT For this essay, we are using as samples, PC3 and DU145 prostate cancer cells, as well as populations of the same cells, which had been permanently transfected with a plasmid that, through RNA interference, drastically downregulates the expression of a receptor, RPTPβ/ζ. The transfected cell lines have been made by Zoe Diamantopoulou (a previous PhD student), as part of her thesis, and it is clear to anyone cultivating them, that they proliferate much more slowly than their normal counterparts. The aim this project is to determine whether this is due to increased rate of apoptosis or decreased speed in cell cycle progression, and is also meant to indirectly test the effects of the absence of the RPTPβ/ζ receptor, since this is the only difference between the normal and transfected cells. To examine the rate of apoptosis in the four cell lines, we conducted flow cytometry experiments with Annexin and PI, to determine the percentage of viable and necrotic cells, as well as cells in early or late stages of apoptosis. We also performed Western blots to assess the levels of activated Caspase 8 and Caspase 3 in the various cell lines. With the aim of examining the speed by which cells progress through the cell cycle, we performed immunofluorescence experiments after incubation with BrdU for 4h and 24h, in order to determine the percentage of cells that had newly-synthesized DNA. Finally, we also did Western blots to determine the relative levels of the Cdt1 protein, a key molecule that licences DNA replication.

7 7 A. ΕΙΑΓΨΓΗ A1. Κυτταρικόσ Κύκλοσ A1.1. Υάςεισ του κυτταρικού κύκλου Ο κυτταρικϐσ κϑκλοσ εύναι η διαδικαςύα που οδηγεύ ςτην κυτταρικό διαύρεςη και αποτελεύται απϐ τϋςςερισ φϊςεισ: 1. Υάςη G1: Υϊςη αϑξηςησ 2. Υάςη S: Κατϊ τη διϊρκεια τησ φϊςησ S λαμβϊνει χώρα ο διπλαςιαςμϐσ του DNA 3. Υάςη G2: Υϊςη αϑξηςησ 4. Υάςη M: Σο τελευταύο ςτϊδιο του κυτταρικοϑ κϑκλου των ςωματικών κυττϊρων εύναι η φϊςη τησ κυτταρικόσ διαύρεςησ, δηλαδό τησ μύτωςησ (M, Mitosis). 5. Υάςη G0: Σα ςωματικϊ κϑτταρα που δεν διαιροϑνται, βρύςκονται ςε ϋνα ςτϊδιο ηρεμύασ, που ονομϊζεται «φϊςη G0». Κϊποια ϋχουν την ικανϐτητα να εκκινόςουν ξανϊ τον κυτταρικϐ κϑκλο αν δεχθοϑν τα κατϊλληλα περιβαλλοντικϊ ερεθύςματα (π.χ. αυξητικού παρϊγοντεσ) και να ειςϋλθουν ξανϊ ςτη φϊςη G1. (Pardee, 1974; Blagosklonny, Pardee, 2002) A1.2. Μίτωςη Η πιςτϐτητα τησ μίτωςησ καθορύζει την ιςϐτιμη κατανομό των διπλαςιαςμϋνων χρωμοςωμϊτων ςτα δϑο θυγατρικϊ κϑτταρα. Η πρώτη φϊςη τησ μύτωςησ εύναι η πυρηνικό διαύρεςη και διαιρεύται ςε τϋςςερισ επιμϋρουσ φϊςεισ: 1. Πρόφαςη: ηματοδοτεύ την ϋναρξη τησ μύτωςησ επιφϋροντασ ςυμπϑκνωςη των χρωμοςωμϊτων, διαχωριςμϐ των διπλαςιαςμϋνων κεντροςωματύων και ςτρατολϐγηςη κϊποιων πρωτεώνών ςημεύων-ελϋγχου ςτουσ κινητοχώρουσ. 2. Μετάφαςη: Η ϋναρξη τησ μετϊφαςησ (προμετάφαςη) ςηματοδοτεύται απϐ αποςυναρμολϐγηςη του πυρηνικοϑ φακϋλου (Nuclear Envelope, NE). τη ςυνϋχεια, η απελευθϋρωςη των χρωμοςωμϊτων ςτο κυτταρϐπλαςμα ενεργοποιεύ το «ςημεύο ελϋγχου ςυναρμολϐγηςησ τησ ατρϊκτου» (Spindle Assembly Checkpoint, SAC) ςε κϊθε ελεϑθερο κινητοχώρο.

8 8 3. Ανάφαςη: Αφοϑ οι μικροςωληνύςκοι προςδεθοϑν ςτουσ κινητοχώρουσ κϊθε χρωματιδικοϑ ζεϑγουσ, αποςιωπϊται το SAC και το κϑτταρο ξεπερνϊ το ςόμα "αναμονόσ τησ ανϊφαςησ". Κατϊ τη διϊρκεια τησ ανϊφαςησ, οι αδελφϋσ χρωματύδεσ αποχωρύζονται πλόρωσ προσ τουσ δϑο πϐλουσ του κυττϊρου και η εγκϐλπωςη τησ πλαςματικόσ μεμβρϊνησ γϑρω απϐ τον ιςημερινϐ τησ ατρϊκτου γύνεται ορατό. 4. Σελόφαςη: Η τελϐφαςη τελειώνει με την αποςυμπϑκνωςη των χρωμοςωμϊτων και την επαναςυναρμολϐγηςη τησ πυρηνικόσ μεμβρϊνησ γϑρω απϐ τα χρωμοςώματα. Πολϑ ςϑντομα μετϊ απϐ αυτϊ ακολουθεύ η κυτταροκύνηςη ό κυτταροπλαςματικό διαύρεςη, η οπούα δύνει γϋνεςη ςε δϑο θυγατρικϊ κϑτταρα. Κϊθε ϋνα απϐ τα ςτϊδια τησ μύτωςησ εύναι ϋτςι οργανωμϋνο, ώςτε να ελαχιςτοποιεύται η πιθανϐτητα λαθών διαχωριςμοϑ. Ελαττωματικό λειτουργύα οποιουδόποτε μιτωτικοϑ γεγονϐτοσ μπορεύ να οδηγόςει ςε χρωμοςωματικό αςτϊθεια, η οπούα προκαλεύ καρκύνο (Jallepalli & Lengauer, 2001; Chi & Jeang, 2007; Holland & Cleveland, 2009; Holland & Cleveland, 2012; Pfau & Amon, 2012) Επομϋνωσ, η ακρύβεια και αποτελεςματικϐτητα τησ μιτωτικόσ κυτταρικόσ διαύρεςησ εξαρτϊται απϐ την κατϊλληλη ρϑθμιςη τησ ϋκφραςησ και τησ λειτουργύασ των πρωτεώνών τησ μύτωςησ. Μϊλιςτα, πολλϋσ απϐ αυτϋσ τισ πρωτεϗνεσ επιδεικνϑουν ειδικό για τη μύτωςη λειτουργύα, η οπούα ρυθμύζεται κυρύωσ απϐ μετα-μεταφραςτικϋσ τροποποιόςεισ, δηλαδό φωςφορυλύωςη, ουβικιτινυλύωςη και κϊποιουσ ακϐμα μηχανιςμοϑσ. (De Castro et al, 2007) Σϋλοσ, εκτϐσ απϐ τισ μετα-μεταφραςτικϋσ τροποποιόςεισ, και η μεταγραφό διαδραματύζει πολϑ ςημαντικϐ ρϐλο ςτη ςυντόρηςη των πρωτεώνών του κυτταρικοϑ κϑκλου. (Whitfield et al, 2002)

9 9 Εικόνα Α1.1. Οι φϊςεισ του κυτταρικοϑ κϑκλου (healthywellbeinginitiative.wordpress.com) A1.3. Έλεγχοσ του κυτταρικού κύκλου A Ρύθμιςη μέςω κυκλινοεξαρτώμενων κιναςών (CDK) Η μετϊβαςη απϐ την μύα φϊςη του κυτταρικοϑ κϑκλου ςτην ϊλλη ςυμβαύνει με καλϊ καθοριςμϋνο τρϐπο και ρυθμύζεται απϐ διϊφορεσ κυτταρικϋσ πρωτεϗνεσ. Βαςικϋσ ρυθμιςτικϋσ πρωτεϗνεσ εύναι οι κυκλινοεξαρτώμενεσ κινϊςεσ, μια οικογϋνεια απϐ κινϊςεσ ςερύνησ/θρεονύνησ, οι οπούεσ ενεργοποιοϑνται ςε ςυγκεκριμϋνα ςημεύα του κυτταρικοϑ κϑκλου. Μϋχρι τώρα ϋχουν ταυτοποιηθεύ εννϋα CDK και απϐ αυτϋσ, πϋντε εύναι ενεργϋσ κατϊ τον κυτταρικϐ κϑκλο [G1 (CDK4, CDK6 και CDK2), S (CDK2), G2 και M (CDK1)]. Όταν ενεργοποιοϑνται, οι CDK επϊγουν καθοδικϋσ διεργαςύεσ με το να φωςφορυλιώνουν επιλεγμϋνεσ πρωτεϗνεσ (Morgan 1995, Pines 1995). Η CDK7 δρα ςε ςυνδυαςμϐ με την κυκλύνη Η και μαζύ ονομϊζονται κινϊςη-ενεργοποιητόσ των CDK (CDK activating kinase, CAK) (Fisher & Morgan 1994). Οι υπϐλοιπεσ CDK δεν ϋχει δειχθεύ ακϐμα να ϋχουν τϐςο κρύςιμο ρϐλο ςτην κανονικό πορεύα του κυτταρικοϑ κϑκλου (Rickert et al 1996). Σα επύπεδα των CDK παραμϋνουν ςταθερϊ κατϊ τη διϊρκεια του κυτταρικοϑ κϑκλου, ςε αντύθεςη με τισ ενεργοποιοϑςεσ πρωτεϗνεσ τουσ, τισ κυκλύνεσ. Σα επύπεδα των κυκλινών αυξομειώνονται κατϊ τη διϊρκεια του κυτταρικοϑ κϑκλου και με αυτϐ τον τρϐπο ενεργοποιοϑν περιοδικϊ τισ CDK (Evans et al 1983; Pines 1991). Διαφορετικϋσ κυκλύνεσ εύναι αναγκαύεσ ςε διαφορετικϋσ φϊςεισ του κυτταρικοϑ κϑκλου. Οι τρεισ τϑποι κυκλινών D (D1, D2, D3) προςδϋνονται ςτισ

10 10 CDK4 και CDK6. Σα ςϑμπλοκα CDK-κυκλύνεσ D εύναι αναγκαύα για την εύςοδο ςτη φϊςη G1 (Sherr 1994). Αντύθετα με ϊλλεσ κυκλύνεσ, η κυκλύνη D δεν εκφρϊζεται περιοδικϊ, αλλϊ ςυντύθεται για ϐςο χρϐνο υπϊρχει ςόμα απϐ αυξητικοϑσ παρϊγοντεσ (Assoian & Zhu 1997). Η κυκλύνη Ε, μύα ϊλλη κυκλύνη τησ G1, αλληλεπιδρϊ με την CDK2 για να ρυθμύςει τη μετϊβαςη απϐ τη φϊςη G1 ςτη φϊςη S (Ohtsubo et al 1995). Η κυκλύνη Α ςυνδϋεται με την CDK2 και το ςϑμπλοκο αυτϐ εύναι αναγκαύο ςτη φϊςη S (Girard et al, 1991, Walker & Maller, 1991). το τϋλοσ τησ G2 και την αρχό τησ M, η κυκλύνη A ςυμπλοκοποιεύται με την CDK1 και προϊγει την εύςοδο ςτην M. Η μύτωςη ρυθμύζεται περαιτϋρω απϐ την κυκλύνη B ςε ςϑμπλοκο με την CDK1 (King et al, 1994, Arellano & Moreno 1997). Δεκαϋξι κυκλύνεσ ϋχουν ταυτοποιηθεύ προσ το παρϐν, αλλϊ ϐπωσ και οι CDK δεν εύναι ϐλεσ τουσ ςχετικϋσ με τον κυτταρικϐ κϑκλο (Peng et al, 1998, Okamoto & Beach 1994; Rickert et al, 1996). Παρϊλληλα με την πρϐςδεςη κυκλινών, η ενεργϐτητα των CDK ρυθμύζεται επύςησ απϐ φωςφορυλύωςη ςε ςυντηρημϋνα κατϊλοιπα θρεονύνησ και τυροςύνησ. Πλόρησ ενεργοπούηςη τησ CDK1 προαπαιτεύ φωςφορυλύωςη ςτη θρεονύνη 161 (172 για τη CDK4 και 160 για τη CDK2), που γύνεται απϐ το ςϑμπλοκο CDK7-κυκλύνησ H, επύςησ γνωςτϐ ωσ CAK. Αυτϋσ οι φωςφορυλιώςεισ επϊγουν αλλαγϋσ ςτη ςτερεοδιϊταξό τουσ και ιςχυροποιοϑν την πρϐςδεςη κυκλινών (Jeffrey et al 1995; Paulovich & Hartwell 1995). Οι κινϊςεσ Wee1 και Myt1 φωςφορυλιώνουν την CDK1 ςτην τυροςύνη-15 και/ό τη θρεονύνη-14, απενεργοποιώντασ την. Η αποφωςφορυλύωςη ςτισ θϋςεισ αυτϋσ απϐ το ϋνζυμο Cdc25 εύναι αναγκαύα για την ενεργοπούηςη τησ CDK1 και την περαιτϋρω εξϋλιξη του κυτταρικοϑ κϑκλου (Lew & Kornbluth, 1996). Εικόνα Α1.2. Η περιοδικό ϋκφραςη των κυκλινών (ibworld.me)

11 11 Η δραςτικϐτητα των CDK μπορεύ να εξουδετερωθεύ απϐ αναςταλτικϋσ πρωτεϗνεσ του κυτταρικοϑ κϑκλου, που ονομϊζονται αναςτολεύσ των CDK (CKI), οι οπούεσ δεςμεϑονται ςε ελεϑθερεσ CDK ό ςε ςϑμπλοκα CDK-κυκλύνησ και ϋτςι ρυθμύζουν τη δραςτηριϐτητα των CDK. Δϑο διακριτϋσ οικογϋνειεσ αναςτολϋων CDK ϋχουν ανακαλυφθεύ, η οικογϋνεια ΙΝΚ4 και η οικογϋνεια Cip/Kip (Sherr & Roberts 1995). Η οικογϋνεια ΙΝΚ4 περιλαμβϊνει τισ p15 (INK4b), p16 (ΙΝΚ4), p18 (INK4c), p19 (INK4d), οι οπούεσ απενεργοποιοϑν ειδικϊ τισ CDK τησ φϊςησ G1 (CDK4 και CDK6). Αυτού οι αναςτολεύσ δημιουργοϑν ςταθερϊ ςϑμπλοκα με το ϋνζυμο CDK πριν τη δϋςμευςη κυκλύνησ, εμποδύζοντασ την αλληλεπύδραςη με την κυκλύνη D (Carnero & Hannon 1998). Η δεϑτερη οικογϋνεια των αναςτολϋων, η οικογϋνεια Cip/Kip, περιλαμβϊνει τισ p21 (WAF1, Cip1), p27 (Cip2), p57 (Kip2). Αυτού οι αναςτολεύσ απενεργοποιοϑν ςϑμπλοκα CDK-κυκλύνησ (Polyak et al 1994, Harper et al, 1995, Lee et al, 1995). Αναςτϋλλουν τα ςϑμπλοκα CDK-κυκλύνη τησ G1, και ςε μικρϐτερο βαθμϐ, τα ςϑμπλοκα CDK1-κυκλύνη Β (Hengst & Reed 1998). Σο p21 αναςτϋλλει επύςησ τη ςϑνθεςη του DNA μϋςω δϋςμευςησ και αναςτολόσ του πυρηνικοϑ αντιγϐνου πολλαπλαςιαζϐμενων κυττϊρων (PCNA) (Pan et al, 1995, Waga et al, 1997). Οι CKI ρυθμύζονται τϐςο απϐ εςωτερικϊ ϐςο και απϐ εξωτερικϊ ςόματα: η ϋκφραςη τησ p21 εύναι υπϐ τον μεταγραφικϐ ϋλεγχο του ογκοκαταςταλτικοϑ γονιδύου p53. O υποκινητόσ του γονιδύου p21 περιϋχει ϋνα τμόμα δϋςμευςησ του p53, που επιτρϋπει ςτο p53 να ενεργοποιόςει μεταγραφικϊ το γονύδιο p21 (el Deiry et al, 1993). Η ϋκφραςη και ενεργοπούηςη των p15 και p27, αυξϊνεται ςε απϐκριςη του αυξητικοϑ παρϊγοντα μεταςχηματιςμοϑ β (ΣGF-β), ςυμβϊλλοντασ ςτην διακοπό τησ ανϊπτυξησ (Hannon & Beach, 1994, Reynisdottir et al, 1995).

12 12 Εικόνα Α1.3. Η περιοδικό ενεργοπούηςη των CDK και ο ϋλεγχϐσ τουσ (cubocube.com) Ο ενδοκυτταρικϐσ εντοπιςμϐσ των διϊφορων ρυθμιςτικών πρωτεώνών ςυμβϊλλει επύςησ ςτη ςωςτό εξϋλιξη του κυτταρικοϑ κϑκλου. Η κυκλύνη Β περιϋχει ϋνα ςόμα πυρηνικοϑ αποκλειςμοϑ και εξϊγεται ενεργϊ απϐ τον πυρόνα μϋχρι την ϋναρξη τησ πρϐφαςησ. Η αδρανοπούηςη των CDK κιναςών Wee1 και Myt1 βρύςκονται, αντύςτοιχα, ςτον πυρόνα και το ςϑμπλεγμα Golgi και προςτατεϑουν το κϑτταρο απϐ την πρϐωρη μύτωςη (Heald et al 1993, Liu et al, 1997). Η ομϊδα των πρωτεώνών ρυθμύζει την ενδοκυτταρικό διακύνηςη διαφορετικών πρωτεώνών. Κατϊ τη διϊρκεια τησ μεςϐφαςησ, η κινϊςη-ενεργοποιητόσ των CDK, Cdc25, διατηρεύται ςτο κυτταρϐπλαςμα μϋςω αλληλεπύδραςησ με πρωτεϗνεσ Παγύδευςη του ςυμπλϐκου CDK1-κυκλύνησ Β ςτο κυτταρϐπλαςμα μετϊ απϐ βλϊβη του DNA διαμεςολαβεύται επύςησ απϐ τισ πρωτεϗνεσ (Peng et al 1997, Yang et al, 1999). A Τποςτρώματα CDK Εφ' ϐςον οι CDK προωθοϑν την κυτταρικό διαύρεςη, το να ταυτοποιόςουμε τα υποςτρώματϊ τουσ εύναι κρύςιμησ ςημαςύασ για την κατανϐηςη τησ μηχανιςτικόσ βϊςησ τησ δρϊςησ τουσ. Παρϊ το γεγονϐσ ϐτι πολλϊ υποςτρώματα CDK ϋχουν περιγραφεύ ςτη βιβλιογραφύα μϋχρι ςόμερα, δεν ϋχει επιτευχθεύ λεπτομερόσ κατανϐηςη για το πώσ η CDKδιαμεςολαβοϑμενη φωςφορυλύωςη ελϋγχει τη λειτουργύα και την εξϋλιξη του κυτταρικοϑ κϑκλου ςε μηχανιςτικϐ επύπεδο μϐνο για μερικϊ απϐ αυτϊ. Ϊνασ κϑριοσ μηχανιςμϐσ για τη ρϑθμιςη τησ εξειδύκευςησ των υποςτρωμϊτων των CDK εύναι μϋςω τησ δεςμευμϋνησ

13 13 υπομονϊδασ κυκλύνησ. Για παρϊδειγμα, οι κυκλύνεσ Ε και Α διαθϋτουν ϋνα υδρϐφοβο τμόμα, Met-Arg-Ala-Ile-Leu (MRAIL), που αναγνωρύζει και αλληλεπιδρϊ με ϋνα Arg-X-Leu (RXL) cy μοτύβο (μοτύβο δϋςμευςησ κυκλύνησ) ςτα υποςτρώματα (Adams et al, 1996, Furstenthal et al, 2001, Shulman et al, 1998). Μετϊλλαξη εύτε του μοτύβου cy ςτο υπϐςτρωμα εύτε του υδρϐφοβου τμόματοσ τησ κυκλύνησ εξαςθενύζει τη διαμεςολαβοϑμενη απϐ CDK2-κυκλύνη E και CDK2-κυκλύνη Α φωςφορυλύωςη ςυγκεκριμϋνων υποςτρωμϊτων (Furstenthal et al, 2001, Shulman et al, 1998, Loog et al, 2005). Αν και τα ςϑμπλοκα CDK2-κυκλύνη E και CDK2-κυκλύνη Α ϋχουν αλληλοεπικαλυπτϐμενα υποςτρώματα, καθϋνα απϐ αυτϊ τα ςϑμπλοκα μπορεύ επύςησ να ςτοχεϑει μοναδικϊ υποςτρώματα, υποδεικνϑοντασ ϐτι και ϊλλα διαφορετικϊ χαρακτηριςτικϊ των κυκλινών E και Α μποροϑν να ελϋγχουν την ειδικϐτητα του υποςτρώματοσ (Sarcevic et al, 1997). Εκτϐσ απϐ τη ρϑθμιςη τησ φωςφορυλύωςησ διαφϐρων υποςτρωμϊτων, διαφορετικϋσ CDK μπορεύ να φωςφορυλιώςουν το ύδιο υπϐςτρωμα ςε διαφορετικϋσ τοποθεςύεσ για να ρυθμύςουν διϊφορεσ πλευρϋσ τησ λειτουργύασ του υποςτρώματοσ. Για παρϊδειγμα, η CDK4-κυκλύνη D1 και CDK2-κυκλύνη Ε φωςφορυλιώνουν διαφορετικϋσ θϋςεισ ςτην prb (πρωτεϗνη του ρετινοβλαςτώματοσ) για τη ρϑθμιςη διαφϐρων πτυχών τησ μεταγραφικόσ αναςταλτικόσ δρϊςησ τησ (Harbour et al, 1999). Ϊνα ϊλλο επύπεδο τησ CDK-διαμεςολαβοϑμενησ εξειδύκευςησ υποςτρώματοσ περιλαμβϊνει τισ διαφορϋσ ςτον ενδοκυτταρικϐ εντοπιςμϐ. Αμφϐτερεσ οι κυκλύνεσ Ε και Α εντοπύζονται και αλληλεπιδροϑν με τισ αντύςτοιχεσ CDK τουσ ςτον πυρόνα (Knoblich et al, 1994, Ohtsubo et al, 1995). Αντιθϋτωσ, η κυκλύνη Β1 παρουςιϊζει δυναμικό ενδοκυτταρικό διακύνηςη μεταξϑ του κυτταροπλϊςματοσ και του πυρόνα κατϊ τη διϊρκεια του κυτταρικοϑ κϑκλου. Η ςϑνθεςη των κυκλινών Β1 και Β2 αρχύζει κατϊ τη διϊρκεια τησ μεςϐφαςησ και ο εντοπιςμϐσ τουσ περιορύζεται ςτο κυτταρϐπλαςμα. Καθώσ τα κϑτταρα προχωροϑν ςτην πρϐφαςη, η κυκλύνη Β1 μετατοπύζεται γρόγορα εντϐσ του πυρόνα, ενώ η κυκλύνη Β2 παραμϋνει ςτο κυτταρϐπλαςμα (Jackman et al, 1995, Pines and Hunter, 1991). Η ικανϐτητα των κυκλινών Β1 και Β2 να διατηροϑν τη θϋςη τουσ κατϊ τη διϊρκεια των φϊςεων εξαρτϊται απϐ την Ν- τερματικό περιοχό 42 υπολειμμϊτων αμινοξϋων, δηλαδό την αλληλουχύα CRS (cellular retention sequence) (Pines and Hunter, 1991). Η δυναμικό μετατϐπιςη τησ κυκλύνησ Β1 ςυνδϋεται με την ποικιλύα των υποςτρωμϊτων-ςτϐχων του ςυμπλϐκου CDK1-κυκλύνησ Β, των οπούων η φωςφορυλύωςη απαιτεύται για τη μεγϊλεσ κυτταροςκελετικϋσ και πυρηνικϋσ μεταβολϋσ που ςυμβαύνουν κατϊ τη διϊρκεια τησ μετϊβαςησ ςτη μύτωςη.

14 14 A Ποιοτικόσ έλεγχοσ του κυτταρικού κύκλου: ςημείο περιοριςμού και ςημεία ελέγχου Σο ςημεύο περιοριςμοϑ (R) ορύζεται ωσ ϋνα ςημεύο χωρύσ επιςτροφό ςτην G1, μετϊ το οπούο το κϑτταρο ϋχει δεςμευθεύ να ειςϋλθει ςτον κυτταρικϐ κϑκλο. Πειρϊματα δεύχνουν ϐτι κϑτταρα που τουσ ςτερεύται ορϐσ πριν απϐ το ςημεύο περιοριςμοϑ ειςϋρχονται ςε μια κατϊςταςη που μοιϊζει με τη φϊςη G0, ενώ τα κϑτταρα που τουσ ςτερεύται ορϐσ μετϊ το ςημεύο R, παραμϋνουν ανεπηρϋαςτα και προχωροϑν ςτη μύτωςη (Pardee, 1974). Τπϊρχουν επιπρϐςθετα ςημεύα ελϋγχου αργϐτερα ςτον κυτταρικϐ κϑκλο, εξαςφαλύζοντασ την ομαλό διαδοχό των γεγονϐτων του κυτταρικοϑ κϑκλου (Hartwell & Weinert, 1989). Μϋχρι τώρα, τα ςημεύα ελϋγχου βλϊβησ του DNA και ςημεύα ελϋγχου τησ ατρϊκτου ϋχουν (εν μϋρει) διευκρινιςτεύ. ε απϐκριςη ςε βλϊβη του DNA, τα ςημεύα ελϋγχου ςταματοϑν τον κυτταρικϐ κϑκλο προκειμϋνου να δοθεύ χρϐνοσ για την επιδιϐρθωςη του DNA. Σα ςημεύα ελϋγχου βλϊβησ του DNA τοποθετοϑνται πριν το κϑτταρο ειςϋλθει ςτη φϊςη S (ςημεύο ελϋγχου G1-S) ό μετϊ απϐ την αντιγραφό του DNA (ςημεύο ελϋγχου G2-M) και φαύνεται να υπϊρχει και ςημεύο ελϋγχου βλϊβησ του DNA κατϊ τη διϊρκεια των S και Μ φϊςεων. το ςημεύο ελϋγχου G1/S, η διακοπό του κυτταρικοϑ κϑκλου που προκαλεύται απϐ βλϊβη του DNA εξαρτϊται απϐ το p53. υνόθωσ, τα κυτταρικϊ επύπεδα του p53 εύναι χαμηλϊ αλλϊ βλϊβη του DNA μπορεύ να οδηγόςει ςε ταχεύα επαγωγό τησ ϋκφραςησ τησ p53 (Levine 1997). Σο p53 διεγεύρει τη μεταγραφό διαφϐρων γονιδύων, ςυμπεριλαμβανομϋνων των p21, Mdm2 και Bax (Agarwal et al 1998). Η επαγωγό του p21, ενϐσ CKI, οδηγεύ ςε αναςτολό των CDK και διακοπό του κυτταρικοϑ κϑκλου, ϋτςι ώςτε να προληφθεύ η αντιγραφό του κατεςτραμμϋνου DNA (Κο & Prives, 1996). Η Mdm2 παύζει ςημαντικϐ ρϐλο ςτη ρϑθμιςη του p53: ςυνδϋεται και αναςτϋλλει τη μεταγραφό του p53, καθώσ και ςυμβϊλλει ςτην πρωτεολυτικό αποικοδϐμηςη του p53 με τη διευκϐλυνςη τησ ουβικιτινυλύωςόσ του, προκαλώντασ ϋνα βρϐχο αρνητικόσ ανϊδραςησ (Oren, 1999). Η δϋςμευςη ρυθμιςτικών πρωτεώνών μπορεύ επύςησ να ρυθμύζει την ουβικιτινυλύωςη του p53: η p19 (ARF) πρωτεϗνη, που κωδικοποιεύται απϐ το γενετικϐ τϐπο ARF-ΙΝΚ4, δεςμεϑει την Mdm2 και αυτϐ εμποδύζει την Mdm2 διαμεςολαβοϑμενη πρωτεϐλυςη του p53 (Zhang et al, 1998). την περιπτώςεισ ςοβαρϊ κατεςτραμμϋνων κυττϊρων, το p53 επϊγει τον κυτταρικϐ θϊνατο με την ενεργοπούηςη γονιδύων (π.χ. Bax, Fas και τα γονύδια που εμπλϋκονται ςτην οδϐ του οξειδωτικοϑ ςτρεσ) που εμπλϋκονται ςτην αποπτωτικό ςηματοδϐτηςη (Owen-Schaub et al, 1995, Polyak et al, 1997, Gottlieb & Oren, 1998). Διαφορετικϋσ πρωτεώνικϋσ κινϊςεσ «αναγνωρύζουν» βλϊβεσ του DNA. Αυτϋσ οι κινϊςεσ φωςφορυλιώνουν το p53 ςε απϐκριςη ςτην βλϊβη του DNA, οδηγώντασ το p21 ςτο να διακϐψει τον κυτταρικϐ κϑκλο, τουλϊχιςτον ςτο ςημεύο ελϋγχου G1/S (1997 Siliciano et al). Η DNA πρωτεώνικό κινϊςη (DNA-PK), ϋνα ϋνζυμο επιδιϐρθωςησ ελλεύψεων ςε δύκλωνο DNA, ςυςχετύζεται με τισ ATM και ATR, αλλϊ δεν εύναι ακϐμη γνωςτϐ αν διαδραματύζει επύςησ ςημαντικϐ ρϐλο ςτο ςημεύο ελϋγχου G1/S (Burma et al, 1999, Durocher & Jackson, 2001).

15 15 Οι μηχανιςμού του ςημεύου ελϋγχου ςτη φϊςησ S λϐγω βλϊβησ του DNA εύναι ανεπαρκώσ κατανοητού, αλλϊ μερικϋσ μελϋτεσ ϋδειξαν καταςτολό τϐςο των φϊςεων ϋναρξησ ϐςο και επιμόκυνςησ τησ αντιγραφόσ του DNA (Painter, 1986, Paulovich & Hartwell, 1995). Τπϊρχουν επύςησ ενδεύξεισ ϐτι η ATM διαμεςολαβοϑμενη φωςφορυλύωςη του ΝΒS1 (Nijmegen breakage syndrome 1) απαιτεύται για να προκαλϋςει τη διακοπό ςτην S φϊςη κατϊ τη διϊρκεια του ςημεύου ελϋγχου S (Lim et al, 2000). Εικόνα Α1.4. ημεύα ελϋγχου του κυτταρικοϑ κϑκλου (hixonparvo.info) Όταν ςημειώνεται βλϊβη του DNA κατϊ τη διϊρκεια τησ G2, τα κϑτταρα εύναι ςε θϋςη να ξεκινόςουν μια διακοπό του κυτταρικοϑ κϑκλου παρουςύα ό απουςύα του p53. Η ϋναρξη τησ μύτωςησ εμποδύζεται διατηρώντασ την CDK1 ςτην ανενεργό μορφό τησ μϋςω αναςταλτικόσ φωςφορυλύωςησ ό με παγύδευςη των ςυςτατικών του ςυμπλϐκου CDK1-κυκλύνησ Β ϋξω απϐ τον πυρόνα. Αυτϐ επιτυγχϊνεται με τισ πρωτεώνικϋσ κινϊςεσ Chk1 και Chk2, οι οπούεσ ενεργοποιοϑνται κατϊ τη διϊρκεια τησ βλϊβησ του DNA με ΑΣΜ-εξαρτώμενο τρϐπο και οι οπούεσ φωςφορυλιώνουν την Cdc25. Η φωςφορυλύωςη τησ Cdc25 αναςτϋλλει τη δρϊςη τησ και προωθεύ την ςϑνδεςό τησ με πρωτεϗνεσ , παγιδεϑοντϊσ την ϋξω απϐ τον πυρόνα και εμποδύζοντασ την ενεργοπούηςη του ςυμπλϐκου CDK1-κυκλύνη Β, και την εύςοδο ςτη μύτωςη (Sanchez et al, 1997, Zeng et al, 1998). Εκτϐσ απϐ την επαγωγό τησ αναςταλτικόσ φωςφορυλύωςησ των CDK, το p53 μπορεύ επύςησ να παύζει ρϐλο ςτη ρϑθμιςη του ςημεύου ελϋγχου G2/M. Η εξαρτώμενη απϐ βλϊβη του DNA αϑξηςη των επιπϋδων του p53 οδηγεύ, ϐπωσ και κατϊ τη διϊρκεια του ςημεύου ελϋγχου G1/S, ςε αυξημϋνη μεταγραφό των p21 και ςύγμα ( s). H αυξημϋνη δϋςμευςη τησ κυκλύνησ Β με την s την αποκλεύει ενεργϊ απϐ τον πυρόνα. Σο p53 διαμεςολαβεύ και τον διαχωριςμϐ των ςυμπλϐκων CDK1-

16 16 κυκλύνησ Β1 με την επαγωγό τησ GADD45 (Growth Arrest and DNA Damage inducible gene) (Hermeking et al, 1997, Taylor & Stark, 2001). To «ςημεύου ελϋγχου τησ ατρϊκτου» επιφϋρει εντοπιςμϐ λανθαςμϋνησ ευθυγρϊμμιςησ των χρωμοςωμϊτων ςτην μιτωτικό ϊτρακτο και ςταματϊ τον κυτταρικϐ κϑκλο ςτη μετϊφαςη. Οι πρωτεϗνεσ Mad (Mitotic Arrest Deficient) και Bub (Budding Uninhibited by Benomyl) ενεργοποιοϑνται ϐταν παρουςιϊζονται ελαττώματα ςτη διϊταξη των μικροςωληνύςκων και αναςτϋλλουν την υπομονϊδα CDC20 του ςυμπλϐκου επαγωγόσ τησ μετϊφαςησ (APC), με αποτϋλεςμα την πρϐληψη τησ μετϊβαςησ απϐ τη μετϊφαςη ςτην ανϊφαςη (Fang et al, 1998, Amon, 1999). Εικόνα Α1.5. Ενεργοπούηςη του p53 (cellsignal.com)

17 17 A Κυτταρικόσ κύκλοσ και καρκίνοσ τον καρκύνο, υπϊρχουν θεμελιώδεισ μεταβολϋσ ςτο γενετικϐ ϋλεγχο τησ κυτταρικόσ διαύρεςησ, με αποτϋλεςμα τον ανεξϋλεγκτο πολλαπλαςιαςμϐ των κυττϊρων. Μεταλλϊξεισ ςυμβαύνουν κυρύωσ ςε δϑο κατηγορύεσ γονιδύων: τα πρωτο-ογκογονύδια και τα ογκοκαταςταλτικϊ γονύδια. τα φυςιολογικϊ κϑτταρα, τα προώϐντα των πρωτοογκογονιδύων δρουν ςε διϊφορα επύπεδα ςτα μονοπϊτια μεταγωγόσ ςόματοσ που διεγεύρουν τον πολλαπλαςιαςμϐ των κυττϊρων. Μεταλλαγμϋνεσ μορφϋσ πρωτο-ογκογονιδύων ό ογκογονιδύων μπορεύ να προωθόςουν την ανϊπτυξη του ϐγκου. Η αδρανοπούηςη ογκοκαταςταλτικών γονιδύων, ϐπωσ τα prb και p53, οδηγοϑν ςε δυςλειτουργύα των πρωτεώνών που κανονικϊ αναςτϋλλουν την πρϐοδο του κυτταρικοϑ κϑκλου. Απορρϑθμιςη του κυτταρικοϑ κϑκλου που ςυνδϋεται με τον καρκύνο ςυμβαύνει μϋςω μετϊλλαξησ των πρωτεώνών που παύζουν ςημαντικϐ ρϐλο ςε διϊφορα επύπεδα του κυτταρικοϑ κϑκλου. τον καρκύνο, οι μεταλλϊξεισ ϋχουν παρατηρηθεύ ςε γονύδια που κωδικοποιοϑν CDK, κυκλύνεs, CDK-ενεργοποιώντα ϋνζυμα, CΚΙ, υποςτρώματα CDK και πρωτεϗνεσ ςημεύων ελϋγχου (review απϐ Sherr 1996, McDonald & el Deiry, 2000). A CDK Ϊχουν αναφερθεύ μεταβολϋσ των CDK μορύων ςτον καρκύνο, αν και με χαμηλό ςυχνϐτητα. Τπερϋκφραςη τησ CDK4, που εμφανύζεται ωσ αποτϋλεςμα ενύςχυςησ, ϋχει ταυτοποιηθεύ ςε κυτταρικϋσ ςειρϋσ. (Wolfel et al. 1995). Μεταλλϊξεισ των CDK4 και CDK6 γονιδύων με αποτϋλεςμα την απώλεια ικανϐτητασ τησ δϋςμευςησ CKI ϋχουν επύςησ παρατηρηθεύ (Easton et al. 1998). A Κυκλίνεσ Η κυκλύνη D δρα ωσ αιςθητόρασ ανϊπτυξησ και παρϋχει μια ςϑνδεςη μεταξϑ των μιτογϐνων ερεθιςμϊτων και του κυτταρικοϑ κϑκλου. Η κυκλύνη D1 ςυνδϋεται με την CDK4 και την CDK6 ςτισ αρχϋσ τησ G1. Παρεκκλύνουςα ϋκφραςη τησ κυκλύνησ D1 ϋχει αναφερθεύ ςε πολλοϑσ ανθρώπινουσ καρκύνουσ. Εύναι πλϋον ςαφϋσ ϐτι η μετϊθεςη του γονιδύου τησ κυκλίνησ D1 ςχετύζεται με κακοόθειεσ Β-λεμφοκυττϊρων, ςυμπεριλαμβανομϋνου του λεμφώματοσ των κυττϊρων του μανδϑα. Η γονιδιακό ενύςχυςη τησ κυκλίνησ D1 εμφανύζεται ςτον καρκύνο του ςτόθοσ, του οιςοφϊγου, τησ ουροδϐχου κϑςτησ και του πνεϑμονα (Hall & Peters, 1996). Η κυκλύνη D2 και η κυκλύνη D3 ϋχουν επύςησ αναφερθεύ ϐτι υπερεκφρϊζονται ςε οριςμϋνουσ ϐγκουσ και η κυκλύνη Ε ϋχει βρεθεύ να ενιςχϑεται, να υπερεκφρϊζεται ό και τα δϑο, ςε οριςμϋνεσ περιπτώςεισ, ςτον καρκύνο του μαςτοϑ, του παχϋοσ εντϋρου και ςτην οξεύα λεμφοβλαςτικό και οξεύα μυελοειδό λευχαιμύα (Leach et al, 1993, Hunter & Pines, 1994, Keyomarsi et al, 1995, Scuderi et al, 1996, Iida et al, 1997). Σϐςο η κυκλύνη Α ϐςο και η κυκλύνη Ε υπερεκφρϊζονται ςε καρκινώματα του πνεϑμονα και η αυξημϋνη ϋκφραςη τησ

18 κυκλύνησ Α, αλλϊ ϐχι τησ κυκλύνησ Ε, ςυςχετύζεται με χαμηλϐτερα ποςοςτϊ επιβύωςησ (Dobashi et al, 1998). 18 A Ένζυμα ενεργοποίηςησ CDK Η ενεργοπούηςη των CDK ρυθμύζεται μϋςω αποφωςφορυλύωςησ απϐ τα μϋλη τησ οικογϋνειασ τησ φωςφατϊςησ Cdc25. Η Cdc25A διαδραματύζει ςημαντικϐ ρϐλο ςτη μετϊβαςη G1/S, ενώ η Cdc25B υφύςταται ενεργοπούηςη κατϊ τη διϊρκεια τησ S φϊςησ και η Cdc25C ενεργοποιεύ το ςϑμπλοκο CDK1-κυκλύνησ Β κατϊ την εύςοδο ςτη μύτωςη. Απορρϑθμιςη ό υπερϋκφραςη των Cdc25 επιτρϋπει απρογραμμϊτιςτη ενεργοπούηςη των ςυμπλϐκων CDKκυκλύνηs και μπορεύ να ςχετύζεται με το ςχηματιςμϐ ϐγκων. Σο Cdc25A και το Cdc25B εύναι πιθανϊ ογκογονύδια ςτον ϊνθρωπο (Nilsson & Hoffmann, 2000). Σο Cdc25B υπερεκφρϊζεται ςτο 32% των πρωτογενών καρκύνων του μαςτοϑ. Η μεταγραφό των γονιδύων Cdc25A και Cdc25B ενεργοποιεύται απϐ το c-myc, ϋνα ογκογονύδιο που βρϋθηκε ςυχνϊ να εύναι μεταλλαγμϋνο ςε ανθρώπινουσ καρκύνουσ (Galaktionov et al, 1996). Η Raf, μια κινϊςη καθοδικϊ του ςυχνϊ μεταλλαγμϋνου ras ογκογονιδύου, εύναι ςε θϋςη να δεςμεϑςει, να ενεργοποιόςει και να απορρυθμύςει τισ πρωτεϗνεσ Cdc25 (Galaktionov et al, 1995). A Cdt1 (Chromatin licensing and DNA replication factor 1) τα ευκαρυωτικϊ κϑτταρα, το γονιδύωμα του DNA εύναι χωριςμϋνο ςε πολλϊ χρωμοςώματα και η αντιγραφό του DNA ξεκινϊ απϐ πολλϊ ςημεύα ϋναρξησ τησ αντιγραφόσ. Ψσ εκ τοϑτου, η ποςϐτητα του DNA που αντιγρϊφεται απϐ κϊθε ςημεύο ϋναρξησ εύναι ςχετικϊ μικρό, επιτρϋποντασ ςτο μϋγεθοσ του γονιδιώματοσ να αυξηθεύ κατϊ τη διϊρκεια τησ εξϋλιξησ των ευκαρυωτικών κυττϊρων. Ψςτϐςο, η αποτελεςματικό λειτουργύα του ςυςτόματοσ αυτών των πολλαπλών ςημεύων ϋναρξησ τησ αντιγραφόσ δημιουργεύ ϋνα ςημαντικϐ πρϐβλημα, δηλαδό το ϐτι κϊθε ϋνα ςημεύο αντιγραφόσ θα πρϋπει να ενεργοποιηθεύ με ακρύβεια μϐνο μύα φορϊ κατϊ τη διϊρκεια κϊθε S φϊςησ. Εύναι πλϋον ςαφϋσ ϐτι αυτϐ επιτυγχϊνεται με την περιοδικό ςυναρμολϐγηςη και αποςυναρμολϐγηςη βαςικών προ-αντιγραφικών ςυμπλϐκων (pre-rc) (Fujita, 1999, Bell & Dutta, 2002, Diffley, 2004). Η αντύδραςη ςυναρμολϐγηςησ των pre-rc, γνωςτό ωσ «αδειοδϐτηςη», περιλαμβϊνει την φϐρτωςη μιασ αντιγραφικόσ ελικϊςησ, τησ MCM2-7, πϊνω ςτη χρωματύνη απϐ το ςϑμπλοκο αναγνώριςη προϋλευςησ (ORC) και δϑο βαςικοϑσ παρϊγοντεσ, την CDC6 και την Cdt1 (Maiorano et al, 2000, Nishitani et al, 2000). H ςυναρμολϐγηςη των pre-rc μπορεύ να γύνει μϐνο κατϊ το χρονικϐ διϊςτημα που παρατηροϑνται τα χαμηλϊ επύπεδα CDK απϐ τα τϋλη μύτωςησ και κατϊ τη διϊρκεια τησ φϊςησ G1. Ϊτςι, η λανθαςμϋνη επαναςυναρμολϐγηςη καταςτϋλλεται κατϊ τη διϊρκεια των S, G2 και Μ φϊςεων. Αρχικϊ εύχε προταθεύ ϐτι η Geminin διαδραματύζει ϋναν κρύςιμο ρϐλο ςτην καταςτολό τησ λειτουργύασ τησ Cdt1 μετϊ τη φϊςη S ςε κϑτταρα ςπονδυλωτών (McGarry & Kirschner, 1998,

19 19 Wohlschlegel et al, 2000, Σada et al, 2001) και ϐτι η υπερλειτουργύα τησ Cdt1 που προκϑπτει απϐ την ανιςορροπύα Cdt1-Geminin προκαλεύ επανα-αντιγραφό του DNA (Vaziri et al, 2003, Melixetian et al, 2004, Zhu et al, 2004, Arias & Walter, 2005, Maiorano et al, 2005, Li & Blow, 2005, Yoshida et al, 2005). Ψςτϐςο, η πρϐςφατη ϋρευνα ϋχει αποκαλϑψει ϐτι η δραςτηριϐτητα τησ Cdt1 εύναι πολϑ αυςτηρϊ ελεγχϐμενη ϐχι μϐνο απϐ την Geminin αλλϊ και απϐ δϑο ϊλλουσ μηχανιςμοϑσ μετϊ τη φϊςη S (Sugimoto et al, 2004, Liu et al, 2004, Arias & Walter, 2006, Senga et al, 2006, Hu & Hiong, 2006, Nishitani et al, 2006). Επιπλϋον, ϋχει δειχθεύ ϐτι η υπερϋκφραςη τησ Cdt1 προκαλεύ χρωμοςωμικϋσ βλϊβεσ, ακϐμη και χωρύσ την πρϐκληςη επανα-αντιγραφόσ (Tatsumi et al, 2006). Ϊχει αναφερθεύ ϐτι η υπερϋκφραςη τησ Cdt1 προκαλεύ κϑτταρα ποντικοϑ ΝΙΗ3Σ3 να ςχηματύζουν ϐγκουσ ςε nude ποντύκια (Arentson et al, 2002). Ψςτϐςο, ςτην Rat-1, μια ϊλλη κυτταρικό ςειρϊ που χρηςιμοποιεύται ςυνόθωσ για την εκτύμηςη τησ δραςτικϐτητασ κλαςικών ογκογονιδύων, δεν παρατηρόθηκε μεταςχηματιςμϋνοσ φαινϐτυποσ, με ςταθερό υπερϋκφραςη του Cdt1 (Tatsumi et al, 2006). Η διαφορϊ αυτό μπορεύ απλώσ να οφεύλεται ςτισ διαφορϋσ των κυττϊρων. Ψςτϐςο, υπϊρχουν ϊφθονα ςτοιχεύα ϐτι η απορρϑθμιςη του Cdt1 επιδρϊ ςτα κϑτταρα επϊγοντασ την επανα-αντιγραφό, η οπούα προκαλεύ χρωμοςωμικϋσ βλϊβεσ και γονιδιωματικό αςτϊθεια (Vaziri et al, 2003, Tatsumi et al, 2006). Μπορεύ οπϐτε να ειπωθεύ ϐτι δεν εύναι η απορρυθμιςμϋνη Cdt1 που οδηγεύ ςε οξϑ ογκογϐνο μεταςχηματιςμϐ, αλλϊ μϊλλον οι χρϐνιεσ χρωμοςωμικϋσ βλϊβεσ και αςτϊθεια του γονιδιώματοσ που τελικϊ καταλόγουν ςε ςχηματιςμϐ ϐγκου. Πρϊγματι, η υπερϋκφραςη τησ Cdt1 ςε διαγονιδιακϊ θυμοκϑτταρα δεν οδηγεύ απϐ μϐνη τησ ςε ςχηματιςμϐ ϐγκου, αλλϊ διαμορφώνει και ενιςχϑει το ςχηματιςμϐ ϐγκου που προκαλεύται απϐ ανεπϊρκεια του p53 (Seo et al, 2005). Θα πρϋπει να ςημειωθεύ ϐτι η πρωτεϗνη Cdt1 ϐντωσ υπερεκφρϊζεται ςε ανθρώπινα καρκινικϊ κϑτταρα (Karakaidos et al, 2004, Xouri et al, 2004, Tatsumi et al, 2006). Η μεταγραφό του Cdt1 προκαλεύται απϐ τον παρϊγοντα μεταγραφόσ E2F (Yoshida & Inoue, 2004), ο οπούοσ εύναι ςυχνϊ απορρυθμιςμϋνοσ ςε καρκινικϊ κϑτταρα. Ϊτςι, η απορρϑθμιςη τησ Cdt1 θα μποροϑςε να εύναι ϋνασ νεοανακαλυφθεύσ μοριακϐσ μηχανιςμϐσ που οδηγεύ τελικϊ ςε καρκινογϋνεςη.

20 20 Εικόνα Α1.6. Η αδειοδϐτηςη τησ αντιγραφόσ απϐ την Cdt1 και η ρϑθμιςη απϐ την geminin (Geminin bans replication licence, Mark Madine& Ron Laskey, Nature Cell Biology) Εικόνα Α1.7. Επιπρϐςθετη ρϑθμιςη τησ Cdt1 απϐ την CDK2-cyclinE. Υωςφωρυλύωςη τησ Cdt1 απϐ το ςϑμπλοκο CDK2- cyclin E, προκαλεύ αναγνώριςό τησ απϐ πρωτεϗνεσ που την ουβικιτινυλιώνουν και την οδηγοϑν ςε αποικοδϐμηςη απϐ το πρωτεϊςωμα. (indiana.edu)

21 21 A2. ΑΠΟΠΣΨΗ A2.1. Γενικά Η απϐπτωςη ςυμβαύνει ςυνόθωσ κατϊ τη διϊρκεια τησ ανϊπτυξησ και τησ γόρανςησ και λειτουργεύ ωσ ομοιοςτατικϐσ μηχανιςμϐσ για τη διατόρηςη των πληθυςμών των κυττϊρων ςτουσ ιςτοϑσ. Παρουςιϊζεται επύςησ ωσ μηχανιςμϐσ ϊμυνασ ςε ανοςολογικϋσ αντιδρϊςεισ ό ϐταν τα κϑτταρα ϋχουν υποςτεύ βλϊβη απϐ αςθϋνεια ό επιβλαβεύσ παρϊγοντεσ (Norbury και Hickson, 2001). Αν και υπϊρχει μια μεγϊλη ποικιλύα ερεθιςμϊτων και ςυνθηκών, τϐςο φυςιολογικών ϐςο και παθολογικών, που μποροϑν να προκαλϋςουν την απϐπτωςη, δεν εύναι αναγκαύο ϐτι ϐλα τα κϑτταρα θα πεθϊνουν ωσ απϊντηςη ςτο ύδιο ερϋθιςμα. Οι ακτινοβολύεσ ό τα φϊρμακα που χρηςιμοποιοϑνται ςτισ χημειοθεραπεύεσ μπορεύ να προκαλϋςουν βλϊβεσ του DNA ςε μερικϊ κϑτταρα, οι οπούεσ μποροϑν να οδηγόςουν ςε αποπτωτικϐ θϊνατο μϋςω ενϐσ ςηματοδοτικοϑ μονοπατιοϑ που εξαρτϊται απϐ το p53. Οριςμϋνεσ ορμϐνεσ, ϐπωσ τα κορτικοςτεροειδό, μπορεύ να οδηγόςουν ςε αποπτωτικϐ θϊνατο οριςμϋνα κϑτταρα (π.χ., θυμοκϑτταρα) αν και ϊλλα κϑτταρα δεν επηρεϊζονται ό ακϐμα και διεγεύρονται ςε πολλαπλαςιαςμϐ. Μερικϊ κϑτταρα εκφρϊζουν Fas ό TNF υποδοχεύσ που μποροϑν να οδηγόςουν ςε απϐπτωςη μϋςω ςϑνδεςησ υποδοχϋων με πρωτεϗνεσ-ςόματα, ενώ ϊλλα κϑτταρα ακολουθοϑν μια προκαθοριςμϋνη πορεύα θανϊτου που θα πρϋπει να αναςταλεύ απϐ ϋναν παρϊγοντα επιβύωςησ, ϐπωσ εύναι οι ορμϐνεσ ό οι αυξητικού παρϊγοντεσ. Τπϊρχει επύςησ το πρϐβλημα τησ διϊκριςησ τησ απϐπτωςησ απϐ τη νϋκρωςη, δϑο διαδικαςιών που μποροϑν να ςυμβοϑν ανεξϊρτητα, διαδοχικϊ, ό ακϐμα και ταυτϐχρονα (Hirsch, 1997, Zeiss, 2003). ε οριςμϋνεσ περιπτώςεισ, εύναι το εύδοσ και η ϋνταςη των ερεθιςμϊτων που καθορύζουν εϊν τα κϑτταρα πεθαύνουν με απϐπτωςη ό νϋκρωςη. ε χαμηλϋσ δϐςεισ, ϋνα επιβλαβϋσ ερϋθιςμα ϐπωσ η θερμϐτητα, η ακτινοβολύα, η υποξύα και κυτταροτοξικϊ αντικαρκινικϊ φϊρμακα μποροϑν να προκαλϋςουν απϐπτωςη αλλϊ αυτϊ τα ύδια ερεθύςματα μπορεύ να οδηγόςουν ςε νϋκρωςη ςε υψηλϐτερεσ δϐςεισ. Σϋλοσ, η απϐπτωςη εύναι μια ςυντονιςμϋνη και ςυχνϊ ενεργειακϊ εξαρτώμενη διαδικαςύα που περιλαμβϊνει την ενεργοπούηςη μιασ ομϊδασ πρωτεαςών κυςτεϗνησ που ονομϊζονται "καςπϊςεσ" και ϋνα ςϑνθετο καταρρϊκτη γεγονϐτων που ςυνδϋουν τα εναρκτόρια ερεθύςματα με την τελικό λϑςη του κυττϊρου.

22 22 A2.2. Μορφολογία τησ απόπτωςησ Ϊχουν εντοπιςτεύ διϊφορεσ μορφολογικϋσ αλλαγϋσ που ςυμβαύνουν κατϊ τη διϊρκεια τησ απϐπτωςησ (Hacker, 2000). Κατϊ την πρώιμη διαδικαςύα τησ απϐπτωςησ, εύναι ορατϊ με οπτικϐ μικροςκϐπιο η ςυρρύκνωςη και πϑκνωςη του κυττϊρου (Kerr et al., 1972). Με τη ςυρρύκνωςη, τα κϑτταρα γύνονται μικρϐτερα ςε μϋγεθοσ, το κυτταρϐπλαςμα πυκνϐ και τα οργανύδια πιο ςφικτϊ τοποθετημϋνα. Η πϑκνωςη εύναι το αποτϋλεςμα τησ ςυμπϑκνωςησ τησ χρωματύνησ, ύςωσ το πιο χαρακτηριςτικϐ γνώριςμα τησ απϐπτωςησ. ε ιςτολογικό εξϋταςη με χρώςη αιματοξυλύνησ και ηωςύνησ, η απϐπτωςη φαύνεται να περιορύζεται ςε μεμονωμϋνα κϑτταρα ό μικρϊ ςυςςωματώματα κυττϊρων. Σο αποπτωτικϐ κϑτταρο εμφανύζεται ωσ μύα ςτρογγυλό ό οβϊλ μϊζα με ςκοϑρο ηωςινοφιλικϐ κυτταρϐπλαςμα και πυκνϊ μωβ θραϑςματα χρωματύνησ. Παρατηρεύται εκτεταμϋνη διϐγκωςη τησ πλαςματικόσ μεμβρϊνησ, ακολουθοϑμενη απϐ ρόξη του πυρόνα και διαχωριςμϐ των θραυςμϊτων του κυττϊρου ςε αποπτωτικϊ ςωμϊτια κατϊ την διϊρκεια μιασ διαδικαςύασ που ονομϊζεται "εκβλϊςτηςη". Η κυτταρικό μεμβρϊνη και τα οργανύδια διατηροϑνται ϊθικτα. Αυτϊ τα ςωμϊτια φαγοκυτταρώνονται ϋπειτα απϐ μακροφϊγα ό παρεγχυματικϊ κϑτταρα και αποικοδομοϑνται εντϐσ φαγολυςοςωμϊτων. Ουςιαςτικϊ δεν υπϊρχει φλεγμονώδησ αντύδραςη που ςχετύζεται με τη διαδικαςύα τησ απϐπτωςησ, οϑτε με την απομϊκρυνςη των αποπτωτικών κυττϊρων, επειδό: (1) τα αποπτωτικϊ κϑτταρα δεν απελευθερώνουν τα κυτταρικϊ ςυςτατικϊ τουσ ςτην εξωκυττϊρια ϑλη (2) φαγοκυτταρώνονται ϊμεςα απϐ τα περιβϊλλοντα κϑτταρα, προλαμβϊνοντασ μια πιθανό δευτερογενό νϋκρωςη, και (3) τα φαγοκϑτταρα δεν παρϊγουν αντιφλεγμονώδεισ κυτοκύνεσ (Savill και Fadok 2000, Kurosaka et al, 2003). A Διάκριςη απόπτωςησ από νέκρωςη Μια ϊλλη μορφό κυτταρικοϑ θανϊτου εύναι η νϋκρωςη, η οπούα θεωρεύται ϐτι εύναι μια τοξικό διαδικαςύα ϐπου το κϑτταρο εύναι παθητικϐ και ακολουθεύ μια ενεργειακϊ ανεξϊρτητη πορεύα θανϊτου. Όμωσ, δεδομϋνου ϐτι η νϋκρωςη αναφϋρεται ςτισ αποικοδομητικϋσ διεργαςύεσ που ςυμβαύνουν μετϊ τον κυτταρικϐ θϊνατο, θεωρεύται απϐ κϊποιουσ ωσ ακατϊλληλοσ ϐροσ για να περιγρϊψει ϋνα μηχανιςμϐ κυτταρικοϑ θανϊτου. Για το λϐγο αυτϐ, ο ϐροσ "ϐγκωςη" ϋχει προταθεύ για να περιγρϊψει μια διαδικαςύα που οδηγεύ ςε νϋκρωςη με λϑςη του πυρόνα και διϐγκωςη των κυττϊρων, ενώ η απϐπτωςη οδηγεύ ςε κυτταρικϐ θϊνατο με ςυρρύκνωςη των κυττϊρων, πϑκνωςη και ρόξη του πυρόνα. Ψσ εκ τοϑτου, οι ϐροι "ογκωτικϐσ κυτταρικϐσ θϊνατοσ" και "ογκωτικό νϋκρωςη» ϋχουν προταθεύ ωσ εναλλακτικϋσ λϑςεισ για να περιγρϊψουν τον θϊνατο των κυττϊρων που ςυνοδεϑεται απϐ διϐγκωςό τουσ, αλλϊ αυτού οι ϐροι δεν χρηςιμοποιοϑνται ευρϋωσ αυτό τη ςτιγμό (Majno και Joris, 1995, Levin et al., 1999).

23 23 Αν και οι μηχανιςμού και οι μορφολογύεσ τησ απϐπτωςησ και τησ νϋκρωςησ διαφϋρουν, υπϊρχει αλληλοεπικϊλυψη μεταξϑ των δϑο αυτών διαδικαςιών. Σο κατϊ πϐςον ϋνα κϑτταρο πεθαύνει απϐ νϋκρωςη ό απϐπτωςη εξαρτϊται εν μϋρει απϐ την φϑςη του ςόματοσ κυτταρικοϑ θανϊτου, τον τϑπο και το αναπτυξιακϐ ςτϊδιο του ιςτοϑ, καθώσ και απϐ το φυςιολογικϐ περιβϊλλον (Fiers et al, 1999, Zeiss, 2003). Φρηςιμοποιώντασ ςυμβατικό ιςτολογύα, δεν εύναι πϊντα εϑκολο να διακρύνει κανεύσ την απϐπτωςη απϐ τη νϋκρωςη, και μποροϑν να εμφανιςτοϑν ταυτϐχρονα, ανϊλογα με παρϊγοντεσ ϐπωσ η ϋνταςη και η διϊρκεια του ερεθύςματοσ, η ϋκταςη τησ εξϊντληςησ του ΑΣΡ και η διαθεςιμϐτητα των καςπαςών (Zeiss, 2003). Η νϋκρωςη εύναι μια ανεξϋλεγκτη και παθητικό διαδικαςύα που επηρεϊζει ςυνόθωσ μεγϊλεσ ομϊδεσ κυττϊρων, ενώ η απϐπτωςη εύναι ελεγχϐμενη, ενεργειακϊ εξαρτώμενη και μπορεύ να επηρεϊςει μεμονωμϋνα κϑτταρα ό ομϊδεσ κυττϊρων. Ο νεκρωτικϐσ κυτταρικϐσ τραυματιςμϐσ προκαλεύται απϐ δϑο κϑριουσ μηχανιςμοϑσ, την παρεμβολό ςτην παροχό ενϋργειασ του κυττϊρου και την ϊμεςη βλϊβη ςτισ κυτταρικϋσ μεμβρϊνεσ. Μερικϋσ απϐ τισ ςημαντικϐτερεσ μορφολογικϋσ αλλαγϋσ που επϋρχονται με την νϋκρωςη περιλαμβϊνουν διϐγκωςη των κυττϊρων, ςχηματιςμϐ κυτταροπλαςματικών κενοτοπύων, διεςταλμϋνο ενδοπλαςματικϐ δύκτυο, διερρηγμϋνα μιτοχϐνδρια, διαχωριςμϐ και διϊςπαςη των ριβοςωμϊτων, διαταραγμϋνεσ οργανιδιακϋσ μεμβρϊνεσ, διερρηγμϋνα λυςοςώματα και τελικϊ διϊςπαςη τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ (Kerr et al, 1972, Majno και Joris, 1995, Trump et al, 1997). Αυτό η απώλεια τησ ακεραιϐτητασ τησ κυτταρικόσ μεμβρϊνησ με αποτϋλεςμα την απελευθϋρωςη των κυτταροπλαςματικών περιεχομϋνων ςτον περιβϊλλοντα ιςτϐ, ςτϋλνει χημειοτακτικϊ ςόματα που προκαλοϑν ςτρατολϐγηςη φλεγμονωδών κυττϊρων. Επειδό τα αποπτωτικϊ κϑτταρα δεν απελευθερώνουν τα κυτταρικϊ ςυςτατικϊ τουσ ςτον περιβϊλλοντα ιςτϐ και φαγοκυτταρώνονται γρόγορα απϐ μακροφϊγα ό γειτονικϊ φυςιολογικϊ κϑτταρα, δεν υπϊρχει ουςιαςτικϊ καμύα φλεγμονώδησ αντύδραςη (Savill και Fadok, 2000, Kurosaka et al., 2003).

24 24 Εικόνα Α2.1. Διαφορϋσ απϐπτωςησ απϐ νϋκρωςη. (drrajivdesaimd.com) A2.3. Μηχανιςμοί απόπτωςησ Οι μηχανιςμού τησ απϐπτωςησ εύναι εξαιρετικϊ ςϑνθετοι και περύπλοκοι, περιλαμβϊνοντασ ϋναν ενεργειακϊ εξαρτώμενο καταρρϊκτη μοριακών ςυμβϊντων. Μϋχρι ςόμερα, η ϋρευνα δεύχνει ϐτι υπϊρχουν δϑο κϑρια αποπτωτικϊ μονοπϊτια: η εξωγενόσ οδϐσ (ό οδϐσ υποδοχϋων θανϊτου) και η ενδογενόσ (ό μιτοχονδριακϐ μονοπϊτι). Ψςτϐςο, υπϊρχουν ενδεύξεισ ϐτι οι δϑο οδού ςυνδϋονται και ϐτι τα μϐρια ςε ϋνα μονοπϊτι μπορεύ να επηρεϊςουν το ϊλλο (Igney και Krammer, 2002). Τπϊρχει μια πρϐςθετη οδϐσ που περιλαμβϊνει κυτταροτοξικϐτητα διαμεςολαβοϑμενη απϐ Σ-κϑτταρα και θανϊτωςη του κυττϊρου εξαρτώμενη απϐ την περφορύνη και τα γκρανϋνζυμα. Η οδϐσ περφορύνησ/γκρανενζϑμων μπορεύ να προκαλϋςει απϐπτωςη μϋςω εύτε του γκρανενζϑμου Β εύτε του γκρανενζϑμου A. Η εξωγενόσ, ενδογενόσ και η οδϐσ του γκρανενζϑμου Β ςυγκλύνουν ςτο ύδιο μονοπϊτι, καλοϑμενο μονοπϊτι εκτϋλεςησ. Αυτό η οδϐσ εκκινεύται απϐ την υδρϐλυςη τησ καςπϊςησ-3 και καταλόγει ςε κατϊτμηςη του DNA,

25 25 υποβϊθμιςη του κυτταροςκελετοϑ και των πυρηνικών πρωτεώνών, ςταυροςϑνδεςη των πρωτεώνών, ςχηματιςμϐ αποπτωτικών ςωμϊτων, ϋκφραςη των ςυνδετών για φαγοκυτταρικοϑσ κυτταρικοϑσ υποδοχεύσ και τελικϊ την πρϐςληψη απϐ φαγοκϑτταρα. Σο μονοπϊτι του γκρανενζϑμου Α ενεργοποιεύ ϋνα παρϊλληλο, ανεξϊρτητο απϐ καςπϊςεσ μονοπϊτι κυτταρικοϑ θανϊτου μϋςω βλαβών μονοκλωνικοϑ DNA (Martinvalet et al., 2005). A Εξωγενήσ οδόσ Οι εξωγενεύσ οδού ςηματοδϐτηςησ που εκκινοϑν την απϐπτωςη περιλαμβϊνουν αλληλεπιδρϊςεισ με τη διαμεςολϊβηςη διαμεμβρανικών υποδοχϋων. Αυτϋσ περιλαμβϊνουν υποδοχεύσ θανϊτου που εύναι μϋλη τησ υπεροικογϋνειασ του υποδοχϋα του παρϊγοντα νϋκρωςησ ϐγκων (TNF) (Locksley et al., 2001). Σα μϋλη αυτόσ τησ οικογϋνειασ ϋχουν παρϐμοιουσ τομεύσ πλοϑςιουσ ςε κυςτεϗνεσ, καθώσ και μια κυτταροπλαςματικό περιοχό περύπου 80 αμινοξϋων που ονομϊζεται "περιοχό θανϊτου" (Ashkenazi και Dixit, 1998). Aυτϐσ o τομϋασ θανϊτου διαδραματύζει κρύςιμο ρϐλο ςτην μετϊδοςη του ςόματοσ θανϊτου απϐ την κυτταρικό επιφϊνεια προσ τα ενδοκυτταρικϊ μονοπϊτια ςηματοδϐτηςησ. Μϋχρι ςόμερα, οι καλϑτερα χαρακτηριςμϋνοι ςυνδϋτεσ και αντύςτοιχοι υποδοχεύσ θανϊτου περιλαμβϊνουν τουσ FasL/FasR, TNF-α/TNFR1, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4 και Apo2L/DR5 (Chicheportiche et al, 1997, Ashkenazi et al, 1998?, Peter και Kramer, 1998, Suliman et al, 2001, Rubio-Moscardo et al, 2005). Η αλληλουχύα των γεγονϐτων που ορύζουν την εξωγενό φϊςη τησ απϐπτωςησ χαρακτηρύζονται καλϑτερα με τα μοντϋλα των FasL/FasR και TNF-α/TNFR1. ε αυτϊ τα μοντϋλα, υπϊρχει ομαδοπούηςη των υποδοχϋων και δϋςμευςη με τον ομϐλογο τριμεριςμϋνο ςυνδϋτη. Κατϊ την πρϐςδεςη, ςτρατολογοϑνται κυτταροπλαςματικϋσ πρωτεϗνεσπροςαρμογεύσ, οι οπούεσ εμφανύζουν αντύςτοιχεσ περιοχϋσ θανϊτου που προςδϋνονται ςτουσ υποδοχεύσ. Η ςϑνδεςη του ςυνδϋτη Fas ςτον υποδοχϋα του προκαλεύ τη ςϑνδεςη του μορύουπροςαρμογϋα FADD, ενώ ςϑνδεςη του TNF ςτον αντύςτοιχο υποδοχϋα του προκαλεύ τη ςϑνδεςη του προςαρμογϋα TRADD, με ςυνακϐλουθη τη ςτρατολϐγηςη του FADD και τησ RIP (Hsu et al, 1995, Grimm et al, 1996, Wajant, 2002). Η FADD ςτη ςυνϋχεια προςδϋνει την προκαςπϊςη-8 μϋςω διμεριςμοϑ του DED (Death Effector Domain). ε αυτϐ το ςημεύο, ςχηματύζεται ϋνα ςηματοδοτικϐ ςϑμπλοκο επαγωγόσ θανϊτου (Death- Inducing Signalling Complex, DISC), με αποτϋλεςμα την αυτο-καταλυϐμενη ενεργοπούηςη τησ προκαςπϊςησ-8 (Kischkel et al., 1995). Μϐλισ ενεργοποιηθεύ η καςπϊςη-8, εκκινεύται η φϊςη εκτϋλεςησ τησ απϐπτωςησ. Η διαμεςολαβοϑμενη απϐ υποδοχεύσ θανϊτου απϐπτωςη μπορεύ να αναςταλεύ με μια πρωτεϗνη που ονομϊζεται c-flip, η οπούα δεςμεϑεται με την FADD και την καςπϊςη-8, καθιςτώντασ τεσ αναποτελεςματικϋσ (Kataoka et al, 1998, Scaffidi, 1999). Ϊνα ϊλλο ςημεύο πιθανόσ ρϑθμιςησ τησ απϐπτωςησ περιλαμβϊνει μια πρωτεϗνη που ονομϊζεται Toso, η οπούα ϋχει δειχθεύ ϐτι

26 εμποδύζει την Fas-επαγϐμεννη απϐπτωςη ςε Σ κϑτταρα μϋςω τησ αναςτολόσ τησ καςπϊςησ-8 (Hitoshi et al., 1998) 26 A Οδόσ περφορίνησ/γκρανενζύμων Η διαμεςολαβοϑμενη απϐ Σ-κϑτταρα κυτταροτοξικϐτητα εύναι μια παραλλαγό τησ υπερευαιςθηςύασ τϑπου IV, ϐπου ευαιςθητοποιημϋνα CD8+ κϑτταρα ςκοτώνουν αντιγονοπαρουςιαςτικϊ κϑτταρα. Αυτϊ τα κυτταροτοξικϊ Σ λεμφοκϑτταρα (CTLs) μποροϑν να ςκοτώςουν τα κϑτταρα ςτϐχουσ μϋςω τησ εξωγενοϑσ οδοϑ και η FasL/FasR αλληλεπύδραςη εύναι η κυρύαρχη μϋθοδοσ CTL-επαγϐμενησ απϐπτωςησ (Brunner et al., 2003). Ψςτϐςο, εύναι επύςησ ςε θϋςη να αςκοϑν κυτταροτοξικϋσ επιδρϊςεισ ςε κϑτταρα ϐγκου και μολυνθϋντα απϐ ιϐ κϑτταρα μϋςω ενϐσ ϊλλου μονοπατιοϑ που περιλαμβϊνει ϋκκριςη τησ διαμεμβρανικόσ πρωτεϗνησ δημιουργύασ πϐρων, τησ περφορύνησ, με την επακϐλουθη απελευθϋρωςη κυτταροπλαςματικών κοκκύων διαμϋςου του πϐρου και μϋςα ςτο κϑτταρο ςτϐχο (Trapani και Smyth, 2002). Σα γκρανϋνζυμα Α και Β, δϑο πρωτεϊςεσ ςερύνησ, εύναι τα πιο ςημαντικϊ ςυςτατικϊ εντϐσ των κοκκύων (Pardo et al., 2004). Σο γκρανϋνζυμο Β διαςπϊ πρωτεϗνεσ ςε υπολεύμματα αςπαρτικοϑ και ωσ εκ τοϑτου θα ενεργοποιόςει την προκαςπϊςη-10 και μπορεύ να υδρολϑςει παρϊγοντεσ ϐπωσ τον ICAD (Αναςτολϋασ τησ ενεργοποιοϑμενησ απϐ καςπϊςεσ DNAϊςησ) (Sakahira et al., 1998). Ϊχει επύςησ δειχθεύ ϐτι το γκρανϋνζυμο Β μπορεύ να χρηςιμοποιόςει το μιτοχονδριακϐ μονοπϊτι για την ενύςχυςη του ςόματοσ θανϊτου με ειδικό διϊςπαςη τησ Bid και επαγωγό τησ απελευθϋρωςησ του κυτοχρώματοσ C (Barry και Bleackley, 2002, Russell και Ley, 2002). Ψςτϐςο, το γκρανϋνζυμο Β μπορεύ επύςησ να ενεργοποιόςει ϊμεςα την καςπϊςη-3. Με τον τρϐπο αυτϐ, τα ανοδικϊ μονοπϊτια ςηματοδϐτηςησ παρακϊμπτονται και υπϊρχει ϊμεςη επαγωγό τησ φϊςησ εκτϋλεςησ τησ απϐπτωςησ. Προτεύνεται ϐτι τϐςο το μιτοχονδριακϐ μονοπϊτι, ϐςο και η ϊμεςη ενεργοπούηςη τησ καςπϊςησ-3 εύναι κρύςιμεσ για την επαγϐμενη απϐ το γκρανϋνζυμο Β θανϊτωςη (Goping et al., 2003). Σο γκρανϋνζυμο Α εύναι επύςησ ςημαντικϐ ςτην επαγϐμεννη απϐ Σ-κυτταροτοξικϊ κϑτταρα απϐπτωςη και ενεργοποιεύ οδοϑσ ανεξϊρτητεσ καςπαςών. Μϐλισ ειςϋλθει ςτο κϑτταρο, το γκρανϋνζυμο Α ενεργοποιεύ την υδρϐλυςη του DNA μϋςω τησ DΝΑϊςησ NM23- Η1, ϋνα προώϐν ογκοκαταςταλτικοϑ γονιδύου (Fan et al., 2003). Αυτό η DΝΑϊςη ϋχει ϋνα ςημαντικϐ ρϐλο ςτην ανοςολογικό επιτόρηςη για την πρϐληψη του καρκύνου μϋςω τησ επαγωγόσ τησ απϐπτωςησ των καρκινικών κυττϊρων. Η πρωτεϗνη ςυναρμολϐγηςησ των νουκλεοςωμϊτων (SET) ςυνόθωσ αναςτϋλλει το γονύδιο ΝΜ23-H1. Σο γκρανϋνζυμο Α διαςπϊ το ςϑμπλοκο SET αύροντασ ϋτςι την αναςτολό τησ ΝΜ23-Η1, με αποτϋλεςμα την αποπτωτικό αποικοδϐμηςη του DNA. Εκτϐσ απϐ την αναςτολό τησ ΝΜ23-H1, το ςυγκρϐτημα SET ϋχει ςημαντικϋσ λειτουργύεσ ςτην δομό τησ χρωματύνησ και την επιδιϐρθωςη του DNA. Οι πρωτεϗνεσ που

27 27 ςυνθϋτουν αυτϐ το ςϑμπλοκο (SET, Ape1, pp32 και HMG2) φαύνονται να εργϊζονται απϐ κοινοϑ για την προςταςύα τησ χρωματύνησ και τησ δομόσ του DNA (Lieberman και Fan, 2003). Ψσ εκ τοϑτου, η απενεργοπούηςη αυτoϑ του ςυμπλϐκου απϐ το γκρανϋνζυμο Α πιθανϐτατα ςυμβϊλλει επύςησ ςτην απϐπτωςη αναςτϋλλοντασ τη διατόρηςη τησ ακεραιϐτητασ τησ δομόσ του DNA και τησ χρωματύνησ. A2.3.3.Ενδογενήσ οδόσ Σα εγγενό μονοπϊτια ςηματοδϐτηςησ που εκκινοϑν την απϐπτωςη περιλαμβϊνουν μύα ποικιλύα απϐ ερεθύςματα χωρύσ διαμεςολϊβηςη υποδοχϋων, τα οπούα παρϊγουν ενδοκυτταρικϊ ςόματα που δρουν απευθεύασ επύ ςτϐχων εντϐσ του κυττϊρου και εύναι ουςιαςτικϊ γεγονϐτα εκκινοϑμενα απϐ μιτοχϐνδρια. Σα ερεθύςματα που εκκινοϑν την ενδογενό οδϐ παρϊγουν ενδοκυτταρικϊ ςόματα τα οπούα μπορεύ να ενεργοϑν εύτε με θετικϐ εύτε με αρνητικϐ τρϐπο. τα αρνητικϊ ςόματα περιλαμβϊνεται η απουςύα οριςμϋνων αυξητικών παραγϐντων, ορμονών και κυτοκινών που μπορεύ να οδηγόςουν ςε αποτυχύα τησ καταςτολόσ των προγραμμϊτων θανϊτου, πυροδοτώντασ ϋτςι την απϐπτωςη. Αντύθετα, τα ερεθύςματα που δρουν με θετικϐ τρϐπο περιλαμβϊνουν ακτινοβολύεσ, τοξύνεσ, υποξύα, υπερθερμύα, ιογενεύσ λοιμώξεισ και ελεϑθερεσ ρύζεσ. Όλα αυτϊ τα ερεθύςματα προκαλοϑν αλλαγϋσ ςτην εςωτερικό μιτοχονδριακό μεμβρϊνη που οδηγεύ ςε ϊνοιγμα του πϐρου μετϊβαςησ μιτοχονδριακόσ διαπερατϐτητασ (ΜΡΣ), απώλεια του μιτοχονδριακοϑ διαμεμβρανικοϑ δυναμικοϑ και απελευθϋρωςη δϑο κϑριων ομϊδων προαποπτωτικών πρωτεώνών, οι οπούεσ εύναι ςυνόθωσ απομονωμϋνεσ, απϐ τον ενδομεμβρανικϐ χώρο ςτο κυτταρϐπλαςμα (Saelens et al., 2004). Η πρώτη ομϊδα αποτελεύται απϐ το κυτϐχρωμα C, τισ Smac/DIABLO, και την πρωτεϊςη ςερύνησ HtrA2/Omi (Cai et al, 1998, Du et al, 2000, Loo et al, 2002, Garrido et al, 2005). Αυτϋσ οι πρωτεϗνεσ ενεργοποιοϑν το ανεξϊρτητο απϐ καςπϊςεσ μιτοχονδριακϐ μονοπϊτι. Σο κυτϐχρωμα C δεςμεϑει και ενεργοποιεύ την Apaf-1, καθώσ και την προκαςπϊςη-9, ςχηματύζοντασ ϋνα "αποπτώςωμα» (Chinnaiyan, 1999, Hill et al., 2004). Η ομαδοπούηςη των προκαςπαςών-9 με αυτϐν τον τρϐπο οδηγεύ ςε ενεργοπούηςη τησ καςπϊςησ-9. Οι SMAC/DIABLO και HtrA2/Omi φαύνεται ϐτι επϊγουν την απϐπτωςη με αναςτολό των αναςτολϋων αποπτωτικών πρωτεώνών (Inhibitors of Apoptotic Proteins, IAP) (Van Loo et al, 2002, Schimmer, 2004). Η δεϑτερη ομϊδα των αποπτωτικών πρωτεώνών, δηλαδό η AIF, η ενδονουκλεϊςη G και η CAD, απελευθερώνονται απϐ τα μιτοχϐνδρια κατϊ τη διϊρκεια τησ απϐπτωςησ, αλλϊ αυτϐ εύναι ϋνα απϐ τα τελευταύα γεγονϐτα που ςυμβαύνουν αφοϑ το κϑτταρο ϋχει όδη δεςμευτεύ να πεθϊνει. Η AIF μετατοπύζεται ςτον πυρόνα και προκαλεύ κατακερματιςμϐ του DNA ςε θραϑςματα ~ kb και ςυμπϑκνωςη τησ περιφερικόσ πυρηνικόσ χρωματύνησ (Joza et al., 2001). Αυτό η πρώιμη μορφό τησ πυρηνικόσ ςυμπϑκνωςησ αναφϋρεται ωσ ςυμπϑκνωςη

28 28 «ςταδύου Ι» (Susin et al., 2000). Η ενδονουκλεϊςη G μετατοπύζεται επύςησ ςτον πυρόνα, ϐπου διαςπϊ την πυρηνικό χρωματύνη και παρϊγει ολιγονουκλεώκϊ θραϑςματα DNA (Li et al., 2001). Η AIF και η ενδονουκλεϊςη G λειτουργοϑν και οι δϑο με τρϐπο ανεξϊρτητο καςπαςών. τη ςυνϋχεια, η CAD απελευθερώνεται απϐ τα μιτοχϐνδρια και μετατοπύζεται ςτον πυρόνα ϐπου, μετϊ απϐ διϊςπαςη απϐ την καςπϊςη-3, οδηγεύ ςε κατακερματιςμϐ του DNA και πιο ϋντονη και προηγμϋνη ςυμπϑκνωςη τησ χρωματύνησ (Enari et al., 1998). Αυτοϑ του εύδουσ η πιο ϋντονη ςυμπϑκνωςη τησ χρωματύνησ αναφϋρεται ωσ ςυμπϑκνωςη «ςταδύου II» (Susin et al., 2000). Ο ϋλεγχοσ και η ρϑθμιςη αυτών των αποπτωτικών μιτοχονδριακών ςυμβϊντων γύνεται μϋςω των πρωτεώνών μελών τησ οικογϋνειασ Bcl-2 (Cory και Adams, 2002). Η p53 ογκοκαταςταλτικό πρωτεϗνη διαδραματύζει ϋναν κρύςιμο ρϐλο ςτη ρϑθμιςη τησ οικογϋνειασ πρωτεώνών Bcl-2, ωςτϐςο οι ακριβεύσ μηχανιςμού δεν ϋχουν ακϐμα διαλευκανθεύ πλόρωσ (Schuler and Green, 2001). Η οικογϋνεια πρωτεώνών Bcl-2 ρυθμύζει τη διαπερατϐτητα τησ μιτοχονδριακόσ μεμβρϊνησ και μπορεύ να ϋχει εύτε αποπτωτικϐ εύτε αντιαποπτωτικϐ ρϐλο. Μϋχρι ςόμερα, 25 ςυνολικϊ γονύδια ϋχουν ταυτοποιηθεύ ςτην οικογϋνεια Bcl-2. Μερικϊ απϐ τα αντιαποπτωτικϊ μϐρια περιλαμβϊνουν τισ Bcl-2, Bcl-x, Bcl-XL, Bcl-XS, Bcl-w, BAG, ενώ ςτισ αποπτωτικϋσ πρωτεϗνεσ ςυμπεριλαμβϊνονται οι Bcl-10, Bax, Bak, Bid, Bad, Bim, Bik, και Blk. Αυτϋσ οι πρωτεϗνεσ ϋχουν ιδιαύτερη ςημαςύα, δεδομϋνου ϐτι μποροϑν να καθορύςουν αν το κϑτταρο θα προχωρόςει με την απϐπτωςη ό αν θα ακυρωθεύ η ϐλη διαδικαςύα. Πιςτεϑεται ϐτι ο κϑριοσ μηχανιςμϐσ δρϊςησ τησ Bcl-2 οικογϋνειασ πρωτεώνών εύναι η ρϑθμιςη τησ απελευθϋρωςησ του κυτοχρώματοσ C απϐ τα μιτοχϐνδρια μϋςω μεταβολόσ τησ διαπερατϐτητασ τησ μιτοχονδριακόσ μεμβρϊνησ. Η μιτοχονδριακό βλϊβη ςτο Fas μονοπϊτι τησ απϐπτωςησ διαμεςολαβεύται απϐ την διϊςπαςη τησ Bid απϐ την καςπϊςη-8 (Li et al, 1998, Esposti, 2002). Αυτϐ εύναι ϋνα παρϊδειγμα τησ αλληλεπύδραςησ μεταξϑ του εξωγενοϑσ και του ενδογενοϑσ μονοπατιοϑ (Igney και Krammer, 2002). Η φωςφορυλύωςη ςε ςερύνεσ τησ Bad ςχετύζεται με την , ϋνα μϋλοσ τησ οικογϋνειασ πολυλειτουργικών μορύων που δεςμεϑουν φωςφοςερύνη. Όταν η Bad φωςφορυλιώνεται, παγιδεϑεται απϐ την και απορροφϊται ςτο κυτταρϐπλαςμα, αλλϊ εϊν η Bad εύναι μη φωςφορυλιωμϋνη, μετατοπύζεται ςτα μιτοχϐνδρια για να απελευθερώςει το κυτϐχρωμα C (Zha, et al., 1996). H Bad μπορεύ επύςησ να ετεροδιμερύζεται με την Bcl-ΦL ό την Bcl-2, εξουδετερώνοντασ την προςτατευτικό τουσ δρϊςη και προωθώντασ τον κυτταρικϐ θϊνατο (Yang et al., 1995). Όταν εύναι απομονωμϋνεσ απϐ την Bad, τϐςο η Bcl-2 ϐςο και η Bcl-XI αναςτϋλλουν την απελευθϋρωςη του κυτοχρώματοσ C απϐ τα μιτοχϐνδρια, αν και ο μηχανιςμϐσ δεν εύναι καλϊ κατανοητϐσ. Υαύνεται ϐτι η Bcl-2 και η Bcl-XL αναςτϋλλουν τον αποπτωτικϐ θϊνατο κυρύωσ με τον ϋλεγχο τησ ενεργοπούηςησ των πρωτεαςών καςπϊςησ (Newmeyer et al., 2000). Μύα επιπλϋον πρωτεϗνη που ονομϊζεται "Aven" εμφανύζεται να δεςμεϑει τϐςο την Bcl-XL ϐςο και την Apaf-1, εμποδύζοντασ ϋτςι την ενεργοπούηςη τησ προκαςπϊςησ-9 (Chau et al., 2000). Τπϊρχουν ενδεύξεισ ϐτι η υπερϋκφραςη εύτε του Bcl-2 εύτε του Bcl- ΦΙ μειορρυθμύζει

29 29 την ϋκφραςη του ϊλλου, δεύχνοντασ μια αμοιβαύα ρϑθμιςη μεταξϑ των δϑο αυτών πρωτεώνών. Οι Puma και Noxa εύναι δϑο ϊλλα μϋλη τησ οικογϋνειασ Bcl-2 που εμπλϋκονται επύςησ ςτην απϐπτωςη. Η Puma παύζει ϋνα ςημαντικϐ ρϐλο ςτην p53-διαμεςολαβοϑμενη απϐπτωςη. Δεύχθηκε ϐτι, in vitro, η υπερϋκφραςη του Puma ςυνοδεϑεται απϐ αυξημϋνη ϋκφραςη τησ ΒΑΦ, αλλαγό ςτη ςτερεοδομό τησ, μετατϐπιςό τησ ςτα μιτοχϐνδρια, απελευθϋρωςη κυτοχρώματοσ C και μεύωςη του δυναμικοϑ τησ μιτοχονδριακόσ μεμβρϊνησ (Liu et al., 2003). Η Noxa εύναι επύςησ ϋνασ υποψόφιοσ μεςολαβητόσ τησ p53-διαμεςολαβοϑμενησ απϐπτωςησ. Οι μελϋτεσ δεύχνουν ϐτι η πρωτεϗνη αυτό μπορεύ να εντοπύζεται ςτα μιτοχϐνδρια και να αλληλεπιδρϊ με αντιαποπτωτικϊ μϋλη τησ οικογϋνειασ Bcl-2, με αποτϋλεςμα την ενεργοπούηςη τησ καςπϊςησ-9 (Oda et al., 2000). Δεδομϋνου ϐτι τϐςο η Puma ϐςο και η Noxa επϊγονται απϐ το p53, μπορεύ να μεςολαβοϑν ςτην απϐπτωςη που προκαλεύται απϐ γονιδιακό βλϊβη ό ενεργοπούηςη ογκογονιδύων. Η Myc ογκοπρωτεϗνη ϋχει επύςησ αναφερθεύ ϐτι ενιςχϑει την απϐπτωςη μϋςω δϑο μηχανιςμών, τϐςο εξαρτώμενα ϐςο και ανεξϊρτητα απϐ το p53 (Meyer et al., 2006). A Μονοπάτι εκτέλεςησ Η εξωγενόσ και η ενδογενόσ οδϐσ καταλόγουν τελικϊ ςτη φϊςη εκτϋλεςησ, που θεωρεύται η τελικό οδϐσ τησ απϐπτωςησ. Περιλαμβϊνει την ενεργοπούηςη των καςπαςών εκτϋλεςησ που ξεκινϊ αυτό τη φϊςη τησ απϐπτωςησ. Καςπϊςεσ τελεςτϋσ ενεργοποιοϑν κυτταροπλαςματικϋσ ενδονουκλεϊςεσ, οι οπούεσ αποικοδομοϑν τα πυρηνικϊ υλικϊ, και πρωτεϊςεσ που αποικοδομοϑν τϐςο πυρηνικϋσ, ϐςο και κυτταροπλαςματικϋσ πρωτεϗνεσ. Η καςπϊςη-3, η καςπϊςη-6 και η καςπϊςη-7 λειτουργοϑν ωσ τελεςτικϋσ καςπϊςεσ, διαςποϑν διϊφορα υποςτρώματα που τελικϊ προκαλοϑν τισ μορφολογικϋσ και βιοχημικϋσ αλλαγϋσ που παρατηροϑνται ςτα αποπτωτικϊ κϑτταρα (Slee et al., 2001). Η καςπϊςη-3 θεωρεύται ϐτι εύναι η πιο ςημαντικό απϐ τισ τελεςτικϋσ καςπϊςεσ και ενεργοποιεύται απϐ οποιαδόποτε απϐ τισ καςπϊςεσ εκκινητϋσ (καςπϊςη-8, καςπϊςη-9, ό καςπϊςη-10). Η καςπϊςη-3 ενεργοποιεύ ειδικϊ την CAD ενδονουκλεϊςη, η οπούα, ςε πολλαπλαςιαζϐμενα κϑτταρα βρύςκεται ςε ςϑμπλοκο με τον αναςτολϋα τησ, ICAD. ε αποπτωτικϊ κϑτταρα ϐμωσ, η ενεργοποιημϋνη καςπϊςη-3 διαςπϊ το ICAD, ώςτε να απελευθερώςει την CAD (Sakahira et al., 1998). Η CAD ςτη ςυνϋχεια αποικοδομεύ το χρωμοςωμικϐ DNA εντϐσ των πυρόνων και προκαλεύ ςυμπϑκνωςη τησ χρωματύνησ. Η καςπϊςη-3 επϊγει επύςησ την αναδιοργϊνωςη του κυτταροςκελετοϑ και την αποςϑνθεςη του κυττϊρου ςε αποπτωτικϊ ςωμϊτια. Η γελςολύνη, μια πρωτεϗνη που δεςμεϑει ακτύνη, ϋχει ταυτοποιηθεύ ωσ ϋνα απϐ τα βαςικϊ υποςτρώματα τησ ενεργοποιημϋνησ καςπϊςησ-3. Η γελςολύνη λειτουργεύ ςυνόθωσ ωσ πυρόνασ για τον πολυμεριςμϐ τησ ακτύνησ, και ςυνδϋεται επύςησ με τη διφωςφορικό φωςφατιδυλοώνοςιτϐλη, ςυνδϋοντασ την οργϊνωςη τησ ακτύνησ με την μεταγωγό ςόματοσ. Η

30 30 καςπϊςη-3 διαςπϊ τη γελςολύνη και τα θραϑςματα τησ γελςολύνησ, με τη ςειρϊ τουσ, κατακερματύζουν τα νημϊτια ακτύνησ με τρϐπο ανεξϊρτητο του αςβεςτύου. Αυτϐ ϋχει ωσ αποτϋλεςμα τη διϊςπαςη του κυτταροςκελετοϑ, την κυτταρικό διϊςπαςη, και την μεταγωγό ςόματοσ (Kothakota et al., 1997). Η φαγοκυτταρικό πρϐςληψη των αποπτωτικών κυττϊρων εύναι το τελευταύο ςτϊδιο τησ απϐπτωςησ. Η αςυμμετρύα των φωςφολιπιδύων και η εξωτερύκευςη τησ φωςφατιδυλοςερύνησ ςτην επιφϊνεια των αποπτωτικών κυττϊρων και των θραυςμϊτων τουσ εύναι το ςόμα κατατεθϋν τησ φϊςησ αυτόσ. Αν και ο μηχανιςμϐσ μετατϐπιςησ τησ φωςφατιδυλοςερύνησ ςτην εξωτερικό ςτιβϊδα του κυττϊρου κατϊ την διϊρκεια τησ απϐπτωςησ δεν εύναι καλϊ κατανοητϐσ, ϋχει ςυςχετιςτεύ με την απώλεια τησ δραςτικϐτητασ τησ αμινοφωςφολιπιδικόσ μεταθετϊςησ και μη ειδικό αναςτροφό φωςφολιπιδύων διαφϐρων κατηγοριών (Bratton et al., 1997). Ϊρευνεσ δεύχνουν ϐτι η Fas, η καςπϊςη-8 και η καςπϊςη-3 ενϋχονται ςτη ρϑθμιςη τησ εξωτερύκευςησ τησ φωςφατιδυλοςερύνησ ςε οξειδωτικϊ καταπονημϋνα ερυθροκϑτταρα, ωςτϐςο ςυμβαύνει και ανεξϊρτητη απϐ καςπϊςεσ ϋκθεςη τησ φωςφατιδυλοςερύνησ κατϊ την απϐπτωςη των πρωτογενών Σ-λεμφοκυττϊρων (Ferraro- Peyret et al, 2002, Mandal et al., 2005). Η εμφϊνιςη τησ φωςφατιδυλοςερύνησ ςτην εξωτερικό επιφϊνεια των αποπτωτικών κυττϊρων, διευκολϑνει ςτη ςυνϋχεια μη φλεγμονώδη φαγοκυτταρικό αναγνώριςη, επιτρϋποντασ την ϋγκαιρη πρϐςληψη και αποικοδϐμηςό τουσ (Fadok et al., 2001). Αυτό η διαδικαςύα τησ ϋγκαιρησ και αποτελεςματικόσ πρϐςληψησ χωρύσ απελευθϋρωςη των κυτταρικών ςυςτατικών, οδηγεύ ςε ουςιαςτικϊ μηδαμινό φλεγμονώδη απϐκριςη.

31 31 Εικόνα Α2.2. Σα μονοπϊτια τησ απϐπτωςησ ελϋγχονται απϐ διϊφορα μϐρια που ενεργοποιοϑν ό απενεργοποιοϑν τισ καςπϊςεσ, οι οπούεσ τελικϊ εύναι υπεϑθυνεσ για την καταςτροφό του κυττϊρου. (Nature Reviews Molecular Cell Biology 12, (July 2011) doi: /nrm3143 Ubiquitylation in apoptosis: a post-translational modification at the edge of life and death, Domagoj Vucic, Vishva M. Dixit & Ingrid E. Wertz)

32 32 A3. ΚΑΡΚΙΝΟ ΣΟΤ ΠΡΟΣΑΣΗ A3.1 Δομή του ανθρώπινου προςτάτη Ο προςτϊτησ εύναι ϋνα αδενομυώδεσ, εςωτερικϐ ϐργανο του ϊνδρα, ο οπούοσ μαζύ με τουσ ουρηθρικοϑσ και βολβοουρηθραύουσ αδϋνεσ αποτελεύ τουσ κϑριουσ αδϋνεσ του ουρογεννητικοϑ ανθρώπινου ςυςτόματοσ. Ο φυςιολογικϐσ προςτϊτησ ϋχει ςχόμα κϊςτανου και βϊροσ περύπου 20 gr. Ανατομικϊ, βρύςκεται πύςω απϐ την ηβικό ςϑμφυςη, μπροςτϊ απϐ το ορθϐ, κϊτω απϐ την ουροδϐχο κϑςτη και περιβϊλλει την οπύςθια προςτατικό ουρόθρα, ςτην οπούα εκβϊλλουν οι εκςπερματικού και οι προςτατικού πϐροι. Εικόνα A3.1. Ανατομική θέςη προςτάτη. Ο προςτϊτησ περιβϊλλεται απϐ μια ινώδη κϊψα η οπούα εύναι πλοϑςια ςε αιμοφϐρα αγγεύα. Εςωτερικϊ αυτόσ βρύςκονται ύνεσ απϐ κολλαγϐνο, καθώσ και κυκλοτερεύσ λεύεσ μυώκϋσ ύνεσ που περιβϊλλουν την ουρόθρα, ςυνιςτώντασ τον ακοϑςιο ςφικτόρα τησ. Βαθϑτερα βρύςκεται το προςτατικϐ ςτρώμα, που αποτελεύται απϐ ςυνεκτικϐ και ελαςτικϐ ιςτϐ με λεύεσ μυώκϋσ ύνεσ. το ςτρώμα αυτϐ εύναι βυθιςμϋνοι ςωληνοκυψελιδωτού αδϋνεσ. Οι αδϋνεσ αυτού εκβϊλλουν ςτουσ μεύζονεσ εκφορητικοϑσ πϐρουσ που με τη ςειρϊ τουσ εκβϊλλουν ςτην οπύςθια ουρόθρα. Ο προςτϊτησ, ςϑμφωνα με την ταξινϐμηςη του Lowsly, διακρύνεται ςε πϋντε λοβοϑσ. Σον πρϐςθιο, τον οπύςθιο, το μϋςο και τουσ δυο πλϊγιουσ. ϑμφωνα με τον McNeal αποτελεύται απϐ πϋντε ζώνεσ: Σην περιφερικό, την κεντρικό, τη μεταβατικό, την προ-προςτατικό και την πρϐςθια. Η περιφερικό ζώνη καταλαμβϊνει το 70% του ϐγκου του προςτϊτη και αποτελεύ το πιο κοινϐ ςημεύο εμφϊνιςησ ενδοεπιθηλιακόσ νεοπλαςύασ και καρκύνου. Οι κυψελύδεσ τησ περιφερικόσ ζώνησ εύναι απλϋσ, κυκλικϋσ προσ ωοειδεύσ και βυθύζονται ςτο ςτρώμα των λεύων μυώκών ινών. Η κεντρικό ζώνη αντιςτοιχεύ ςτο 25% του ϐγκου του προςτϊτη, ϋχει κωνικϐ ςχόμα, περιλαμβϊνει τη βϊςη του αδϋνα και περικλεύει τουσ εκςπερματικοϑσ πϐρουσ. Οι

33 33 κυψελύδεσ εύναι μεγϊλεσ, ςϑνθετεσ με ενδοαυλικϋσ ακρολοφύεσ και θηλώδεισ πτυχϋσ, ενώ οριςμϋνεσ εμφανύζουν διϊτρητη μορφό. την κεντρικό ζώνη παρουςιϊζεται η μεγαλϑτερη αναλογύα επιθηλύου προσ ςτρώμα. Η μεταβατικό ζώνη αντιςτοιχεύ ςτο 5% του ϐγκου του προςτϊτη και ςε περιπτώςεισ καλοόθουσ υπερπλαςύασ μεγεθϑνεται μαζύ με το υπερκεύμενο ινομυώδεσ ςτρώμα. Οι κυψελύδεσ εδώ εύναι απλϋσ, μικρϋσ, κυκλικϋσ και παρϐμοιεσ με αυτόσ τησ περιφερικόσ ζώνησ. Εικόνα A3.2. χηματικό αναπαρϊςταςη τομόσ προςτϊτη. Σο επιθόλιο του προςτϊτη αποτελεύται απϐ τρεισ τϑπουσ κυττϊρων. Σα εκκριτικϊ, τα βαςικϊ μη εκκριτικϊ και τα νευροενδοκρινό (Coffey, 1993). Σα εκκριτικϊ κϑτταρα βρύςκονται ςτο εςωτερικϐ των κυψελύδων, εύναι κυλινδροειδό και ϋχουν διαφανϋσ κυτταρϐπλαςμα. Διαθϋτουν την ικανϐτητα να εκκρύνουν διϊφορα προώϐντα ϐπωσ το Ειδικϐ Προςτατικϐ Αντιγϐνο (PSA), την Όξινη Προςτατικό Υωςφατϊςη (PAP) και την ϐξινη βλϋννα. Ψσ πλόρωσ διαφοροποιημϋνα κϑτταρα, παρουςιϊζουν το μικρϐτερο ρυθμϐ πολλαπλαςιαςμοϑ. Σα βαςικϊ κϑτταρα βρύςκονται ςτην περιφϋρεια των κυψελύδων, κϊτω ακριβώσ απϐ τη βαςικό μεμβρϊνη. Διαθϋτουν τον εντονϐτερο ρυθμϐ πολλαπλαςιαςμοϑ και θεωροϑνται προγονικϊ των εκκριτικών επιθηλιακών κυττϊρων (Bonkhoff et al., 1996). Επύςησ, τα βαςικϊ κϑτταρα ςτεροϑνται υποδοχϋων ανδρογϐνων, καθώσ και προώϐντων των εκκριτικών κυττϊρων, ϐπωσ το PSA, η PAP και η ϐξινη βλϋννα. Σα νευροενδοκρινό κϑτταρα μποροϑν να ελϋγχουν την ανϊπτυξη και τη λειτουργύα των επιθηλιακών κυττϊρων μϋςω νευροπεπτιδύων που διαθϋτουν (Coffey, 1992).

34 34 Εικόνα A3.3. χηματικό αναπαρϊςταςη τησ ςϑςταςησ του επιθηλύου του προςτϊτη. Σο αύμα που τροφοδοτεύ τον προςτϊτη προϋρχεται απϐ τισ κϊτω κυςτικϋσ, ϋςω αιδοιїκϋσ και μϋςο-ορθικϋσ αρτηρύεσ. Η νεϑρωςη του αδϋνα προϋρχεται απϐ τα ςυμπαθητικϊ και παραςυμπαθητικϊ νευρικϊ πλϋγματα (Μπαρμπαλιϊσ, 1995). A3.2. Λειτουργία του προςτάτη Ο προςτϊτησ εύναι ϋνασ εξωκρινόσ αδϋνασ που εκκρύνει ϋνα λεπτϐρρευςτο, γαλακτϐχρωμο, αλκαλικϐ υγρϐ που περιϋχει κιτρικϐ οξϑ, αςβϋςτιο και διϊφορεσ ϊλλεσ ουςύεσ. Κατϊ την εκςπερμϊτιςη, η κϊψα του προςτϊτη ςυςπϊται ταυτϐχρονα με το ςπερματικϐ πϐρο, με αποτϋλεςμα ςτο ςπϋρμα να προςτύθεται το υγρϐ του προςτϊτη. Η αλκαλικό ςϑςταςη του προςτατικοϑ υγροϑ ϋχει μεγϊλη ςημαςύα για την επιτυχύα τησ γονιμοπούηςησ του ωαρύου, επειδό το υγρϐ του ςπερματικοϑ πϐρου εύναι ςχετικϊ ϐξινο, εξαιτύασ τησ παρουςύασ ςε αυτϐ τελικών προώϐντων του μεταβολιςμοϑ των ςπερματοζωαρύων, με αποτϋλεςμα την αναςτολό τησ κινητικϐτητασ και τησ γονιμϐτητϊσ τουσ. Επύςησ ϐξινα εύναι και τα εκκρύματα του κϐλπου τησ γυναύκασ (ph 3,5-4). Σα ςπερματοζωϊρια δεν αποκτοϑν ϊριςτη κινητικϐτητα αν το ph του περιβϊλλοντϐσ τουσ δεν εύναι περύπου 6-6,5. Για το λϐγο αυτϐ, το ςπερματικϐ υγρϐ εξουδετερώνει την οξϑτητα των ϊλλων υγρών μετϊ την εκςπερμϊτιςη και αυξϊνει πολϑ την κινητικϐτητα και τη γονιμϐτητα των ςπερματοζωαρύων (Guyton, 1984).

35 35 A3.3. Ρύθμιςη τησ αύξηςησ του προςτάτη Ο προςτϊτησ εμφανύζεται κατϊ τη διϊρκεια των τριών πρώτων μηνών τησ ενδομότριασ ζωόσ, ωσ επιθηλιακό εγκϐλπωςη τησ ουρόθρασ. Μϋνει ατροφικϐσ κατϊ την παιδικό ηλικύα και αναπτϑςςεται ςτην εφηβεύα με την επύδραςη αυξητικών παραγϐντων, ορμονών και κυρύωσ με την παρουςύα αυξημϋνων επιπϋδων ανδρογϐνων ςτην κυκλοφορύα (Cunha et al., 1983). A Ρύθμιςη μέςω αυξητικών παραγόντων Κατϊ την αϑξηςη του προςτϊτη παρατηροϑνται αλληλεπιδρϊςεισ ανϊμεςα ςτα επιθηλιακϊ κϑτταρα και τα κϑτταρα του ςτρώματοσ. Οι αλληλεπιδρϊςεισ αυτϋσ γύνονται μϋςω παραγωγόσ και ϋκκριςησ -απϐ τα δϑο αυτϊ εύδη κυττϊρων- διαφϐρων αυξητικών παραγϐντων. Οι αυξητικού παρϊγοντεσ δρουν μϋςω παρακρινών ό αυτοκρινών μηχανιςμών και ϋχουν καθοριςτικό ςημαςύα τϐςο για τη διατόρηςη τησ ομοιϐςταςησ του αδϋνα, ϐςο και για παθολογικϋσ καταςτϊςεισ ϐπωσ εύναι ο καρκύνοσ. A Ορμονολογική ρύθμιςη Παρϐλο που τα ανδρογϐνα εύναι οι κϑριοι παρϊγοντεσ για τη φυςιολογικό ανϊπτυξη του προςτϊτη, απαραύτητη εύναι και η ςυμμετοχό μη ανδρογϐνων ορμονών. Μετϊ απϐ ενεργοπούηςη απϐ τον εκλυτικϐ παρϊγοντα τησ προλακτύνησ (Prolactin Releasing Factor, PRF) και απϐ τον εκλυτικϐ παρϊγοντα τησ αυξητικόσ ορμϐνησ (Growth Hormone Releasing Factor, GHRH), που εκκρύνονται απϐ τον υποθϊλαμο, παρατηρεύται ϋκκριςη απϐ την υπϐφυςη τησ προλακτύνησ και τησ αυξητικόσ ορμϐνησ αντύςτοιχα, Οι δϑο αυτϋσ ορμϐνεσ, προςδενϐμενεσ ςτουσ ειδικοϑσ υποδοχεύσ του προςτϊτη, επϊγουν τον πολλαπλαςιαςμϐ και τη διαφοροπούηςη των κυττϊρων. Επιπλϋον, υπϐ τον ϋλεγχο του απελευθερωτικοϑ παρϊγοντα των γοναδοτροπινών (Gonadotropin Releasing Hormone, GnRH) του υποθαλϊμου, βρύςκεται η ϋκκριςη απϐ την υπϐφυςη τησ ωοθηλακιοτρϐπου ορμϐνησ (Follicle Stimulating Hormone, FSH) και τησ ωχρινοτρϐπου ορμϐνησ (Luteinizing Hormone, LH). Οι δϑο αυτϋσ ορμϐνεσ δρουν επύ των ϐρχεων, επϊγοντασ την ςϑνθεςη τησ τεςτοςτερϐνησ.

36 36 A3.3.3 Ανδρογόνα Σα ανδρογϐνα αποτελοϑν τον πιο ςημαντικϐ παρϊγοντα που επιτρϋπει την ανϊπτυξη και τη λειτουργικϐτητα του προςτϊτη. Σα ανδρογϐνα εύναι ςτεροειδεύσ ορμϐνεσ που επϊγουν τη διαφοροπούηςη και την ωρύμανςη των αρςενικών αναπαραγωγικών οργϊνων, καθώσ και την ανϊπτυξη των δευτερογενών χαρακτηριςτικών του φϑλου. τουσ φυςιολογικοϑσ ϊνδρεσ, το 98% των ανδρογϐνων που κυκλοφορεύ ςτο αύμα, εύναι δεςμευμϋνο με πρωτεϗνεσ του πλϊςματοσ, ϐπωσ η αλβουμύνη και κυρύωσ η SHBG (Sex Hormone-Binding Globulin), ενώ το υπϐλοιπο 2% βρύςκεται ςε ελεϑθερη μορφό (Pardridge, 1981). Η τεςτοςτερϐνη, η κυριϐτερη ορμϐνη αυτϐ απϐ τα ανδρογϐνα, ςυντύθεται ςτουσ ϐρχεισ απϐ τα κϑτταρα Leydig, μετϊ απϐ την επύδραςη τησ LH. Η LH εκκρύνεται απϐ την υπϐφυςη και βρύςκεται υπϐ τον ϋλεγχο τησ εκλυτικόσ ορμϐνησ τησ ωχρινοτρϐπου ορμϐνησ (Luteinizing Hormone Releasing Hormone, LHRH) του υποθαλϊμου. Μικρϐτερη πηγό ανδρογϐνων αποτελεύ ο φλοιϐσ των επινεφριδύων. Τπϐ την επύδραςη τησ φλοιοεπινεφριδιοτρϐπου ορμϐνησ (Adrenocorticotropic Hormone, ACTH), που παρϊγεται απϐ την υπϐφυςη, απελευθερώνονται απϐ τα επινεφρύδια ανενεργϊ πρϐδρομα ανδρογϐνων, ϐπωσ η διϒδροεπιανδροςτερϐνη (DHEA) και η ανδροςτενεδιϐνη. Οι ορμϐνεσ αυτϋσ φυςιολογικϊ αςκοϑν μικρό δρϊςη ςτη λειτουργύα των ϐρχεων. ε περιπτώςεισ ϐμωσ φυςικοϑ ό χημικοϑ ευνουχιςμοϑ, ςυμβϊλουν ςτην επιβύωςη οριςμϋνων ανδρογονοεξαρτώμενων καρκινικών κλώνων. Μετϊ την εύςοδϐ τουσ ςτον προςτϊτη, η τεςτοςτερϐνη και τα ανδρογϐνα απϐ τα επινεφρύδια μεταβολύζονται γρόγορα απϐ το ϋνζυμο 5-α-αναγωγϊςη ςε διϒδροτεςτοςτερϐνη (DHT) (Syrigos, 2001). Η DHT αποτελεύ το ανδρογϐνο που εύναι υπεϑθυνο για την ανϊπτυξη του προςτϊτη και εύναι 3-5 φορϋσ πιο δραςτικϐ απϐ την τεςτοςτερϐνη. Η DHT παρϊγεται απϐ τα βαςικϊ κϑτταρα και απϐ τα κϑτταρα του ςτρώματοσ και δρα ςτα παρακεύμενα επιθηλιακϊ κϑτταρα. Μετϊ την εύςοδϐ τησ ςτον πυρόνα, δεςμεϑεται ςε ανδρογονικοϑσ υποδοχεύσ και το ςϑμπλοκο προςδϋνεται ςε ειδικϋσ ρυθμιςτικϋσ ακολουθύεσ των γονιδύων ςτϐχων, επϊγοντασ τη μεταγραφό. Μεταξϑ των γονιδύων που ενεργοποιεύ, εύναι αυτϊ που κωδικοποιοϑν τον επιδερμικϐ αυξητικϐ παρϊγοντα (EGF) και τον αυξητικϐ παρϊγοντα των αιμοπεταλύων (PDGF), που ςυμβϊλλουν ςτην αϑξηςη του αδϋνα (Steers, 2001). Ιδιαύτερα ςημαντικό για τη φυςιολογικό ανϊπτυξη του προςτϊτη εύναι και η παρουςύα οιςτρογϐνων. Σο 75-90% των οιςτρογϐνων που βρύςκονται ςτη κυκλοφορύα προϋρχονται απϐ περιφερειακό κυκλοπούηςη τεςτοςτερϐνησ και ανδροςτενεδιϐνησ. Οι ϐρχεισ ςυνθϋτουν το υπϐλοιπο 10-25%, αλλϊ οιςτρογϐνα ςχηματύζονται και μϋςα ςτον προςτϊτη (Syrigos, 2001).

37 37 A3.4. Καλοήθησ υπερπλαςία του προςτάτη Εύναι μια πϊθηςη που προςβϊλει ϋνα μεγϊλο αριθμϐ ανδρών που ϋχουν περϊςει τα 50 χρϐνια ζωόσ, χωρύσ να αποκλεύεται η εμφϊνιςη τησ παθόςεωσ ςε μικρϐτερη ηλικύα. Παρϐλο που η ζωό των ατϐμων με καλοόθη υπερπλαςύα του προςτϊτη δεν διατρϋχει ϊμεςο κύνδυνο, η ποιϐτητα ζωόσ τουσ μειώνεται. Ο προςτϊτησ, φυςιολογικϊ αναπτϑςςεται κατϊ τη διϊρκεια τησ εφηβεύασ. Ψςτϐςο, εύναι πιθανϐν με τη πϊροδο τησ ηλικύασ, να παρατηρηθεύ και αϑξηςη του ϐγκου του προςτϊτη, κατϊςταςη που ονομϊζεται καλοόθησ υπερπλαςύα του προςτϊτη (Benign Prostate Hyperplasia, BPH). Η αϑξηςη αυτό προκαλεύται απϐ υπερπλαςύα των βαςικών κυττϊρων και των κυττϊρων του ςτρώματοσ. Η υπερπλαςύα των κυττϊρων του ςτρώματοσ οφεύλεται ςε μεύωςη τησ απϐπτωςησ ςε αυτϊ τα κϑτταρα. Επειδό ϐμωσ δεν παρατηρεύται κϊτι ανϊλογο ςτα επιθηλιακϊ κϑτταρα, το τελικϐ αποτϋλεςμα εύναι η αλλαγό τησ αναλογύασ επιθηλύου/ςτρώματοσ (Claus et al., 1997). A3.5. Καρκίνοσ του προςτάτη Ο καρκύνοσ του προςτϊτη εύναι μια ςοβαρό αςθϋνεια, η οπούα ςτισ ΗΠΑ -μετϊ τον καρκύνο του πνεϑμονα- αποτελεύ τη δεϑτερη αιτύα θανϊτου που οφεύλεται ςε καρκύνο. Σα αυξημϋνα κροϑςματα τησ αςθϋνειασ απϐ το 1988 και ϋπειτα εύναι πιθανϐτατα αποτϋλεςμα τησ πληθυςμιακόσ αϑξηςησ του και των βελτιωμϋνων μεθϐδων ανύχνευςησ. Μια απϐ αυτϋσ εύναι το τεςτ PSA, το οπούο ανιχνεϑει την αςθϋνεια ςε πρώιμα ςτϊδια, αυξϊνοντασ τη βιωςιμϐτητα των αςθενών (Moul, 2003). Σο μεγαλϑτερο ποςοςτϐ των καρκύνων του προςτϊτη εύναι αδενοκαρκινώματα που αναπτϑςςονται ςτη περιφερικό ζώνη, ενώ ϋνα μικρϐ ποςοςτϐ προϋρχεται απϐ τη μεταβατικό ζώνη. Ο καρκύνοσ του προςτϊτη αρχύζει απϐ την περιφϋρεια του οργϊνου, εξελύςςεται τοπικϊ και διηθεύ προοδευτικϊ ςτην κϊψα και τισ ςπερματοδϐχουσ κϑςτεισ. Ψςτϐςο εύναι δυνατϐν να διηθόςει και ςτουσ ουρητόρεσ και την ουρόθρα. Επιπλϋον, ϋχει τη δυνατϐτητα μετϊςταςησ ςε λεμφαδϋνεσ, ςτο όπαρ, ςτουσ πνεϑμονεσ, ςτο δϋρμα και ςε οςτϊ του κρανύου, τησ λεκϊνησ και κυρύωσ τησ ςπονδυλικόσ ςτόλησ (Μπαρμπαλιϊσ, 1995). Ιςτολογικϊ, οι κυψελύδεσ ακολουθοϑν ακανϐνιςτη διϊταξη και ςτο ςτρώμα εύναι τυχαύα κατανεμημϋνεσ, μονόρησ ό ςε ςυςτϊδεσ. την κοιλϐτητα των κυψελύδων παρατηροϑνται κρυςταλλοειδόσ ςχηματιςμού που εύναι αποτϋλεςμα ανώμαλου μεταβολιςμοϑ πρωτεώνών ό ανϐργανων ςτοιχεύων. Επύςησ ςτη πλειοψηφύα των καρκινικών κυττϊρων εμφανύζεται διϐγκωςη του πυρόνα και του πυρηνύςκου, καθώσ και ϋλλειψη ςτιβϊδασ βαςικών κυττϊρων.

38 38 A3.6. Βιολογικοί δείκτεσ του καρκίνου του προςτάτη Για τον καρκύνο του προςτϊτη ϋχουν προταθεύ διϊφορα μϐρια ωσ βιολογικού δεύκτεσ, μεταξϑ των οπούων υποδοχεύσ ανδρογϐνων, διϊφοροι αυξητικού παρϊγοντεσ, η ϐξινη προςτατικό φωςφατϊςη (PAP) και η υψηλοϑ μοριακοϑ βϊρουσ κερατύνη 34βΕ12. Ο πιο ευρϋωσ χρηςιμοποιοϑμενοσ ϐμωσ, εύναι το Ειδικϐ Προςτατικϐ Αντιγϐνο (PSA). Σο PSA ςυντύθεται απϐ τα εκκριτικϊ επιθηλιακϊ κϑτταρα και καταλϑει τη ρευςτοπούηςη του ςπερματικοϑ πόγματοσ μετϊ την εκςπερμϊτιςη. Εύναι μια πρωτεϊςη ςερύνησ και ανόκει ςτην οικογϋνεια των καλλικρεώνών. Σο PSA ρυθμύζει τη λειτουργύα του IGF, αφοϑ εμποδύζει την αλληλεπύδραςη με τον υποδοχϋα του (Cohen et al., 1992). Σο PSA εντοπύζεται ςτον ορϐ και τα φυςιολογικϊ επύπεδα κυμαύνονται κϊτω των 4 ng/ml. Η τιμό ϐμωσ αυτό ποικύλει ανϊλογα με την ηλικύα και τη φυλό του εξεταζϐμενου. Αυξημϋνα επύπεδα παρατηροϑνται ςε περιπτώςεισ προςτατύτιδασ και υπερπλαςύασ, αλλϊ η ςημαντικϐτερη αϑξηςη παρατηρεύται ςε περιπτώςεισ καρκύνου. Η ςυγκϋντρωςη του PSA χαρακτηρύζει το κλινικϐ ςτϊδιο και το μϋγεθοσ του καρκινικοϑ ϐγκου. Φρηςιμοποιεύται για την πρϐγνωςη μετϊςταςησ, καθώσ και για τα αποτελϋςματα τησ θεραπεύασ μετϊ την απομϊκρυνςη των ανδρογϐνων. ημαντικϐ επύςησ εύναι το ϐτι ςυμβϊλλει ςτην ϋγκαιρη πρϐγνωςη του καρκύνου ςτα αρχικϊ ςτϊδια και για το λϐγο αυτϐ ςυνύςταται ο ετόςιοσ ϋλεγχοσ ςε ϊνδρεσ ϊνω των 45 ετών. Αποτελεύ μύα γρόγορη μϋθοδο, με υψηλό ευαιςθηςύα και ακρύβεια ενώ ϋχει μικρϐ κϐςτοσ. A3.7. Μοντέλα μελέτησ του καρκίνου του προςτάτη Ο καρκύνοσ του προςτϊτη εμφανύζεται ςπϊνια ςε ϊλλα ζώα εκτϐσ απϐ τον ϊνθρωπο και για το λϐγο αυτϐ δεν υπϊρχει κϊποιο ιδανικϐ μοντϋλο μελϋτησ. Ϊνα τϋτοιο μοντϋλο θα ϋπρεπε να ϋχει μικρό διϊρκεια γενιϊσ, να επηρεϊζεται απϐ τη δρϊςη ανδρογϐνων, να παρϊγει PSA και να δύνει μεταςτϊςεισ ςε λεμφαδϋνεσ και οςτϊ (Coffey et al., 1980). Τπϊρχουν μοντϋλα τρωκτικών των οπούων ο προςτϊτησ εύναι χωριςμϋνοσ ςε λοβοϑσ. Παρϐλο που υπϊρχουν ανατομικϋσ διαφορϋσ με τον προςτϊτη του ανθρώπου, τα τρωκτικϊ αποτελοϑν πολϑτιμα μοντϋλα μελϋτησ, εξαιτύασ τησ ανδρογονο-εξαρτώμενησ πρϐκληςησ καρκύνου, αλλϊ και γιατύ εύναι ςχετικϊ οικονομικϊ και εϑκολα ςτη χρόςη (Lucia et al., 1998). Σϋτοια μοντϋλα εύναι το MPR που επιτρϋπει τη μελϋτη των παρακρινών αλληλεπιδρϊςεων μεταξϑ των κυττϊρων και το Dunning R Σα τελευταύα χρϐνια ϋχει αναπτυχθεύ και η τεχνολογύα των διαγονιδιακών ζώων, που παρϋχουν τη δυνατϐτητα ειςαγωγόσ ξϋνου γενετικοϑ υλικοϑ ςτο γονιδύωμα του πειραματϐζωου. τη ςυγκεκριμϋνη περύπτωςη επιτρϋπεται η παρατόρηςη τησ αλληλεπύδραςησ των γονιδιακών προώϐντων και των κυτταρικών αποκρύςεων, ςε in vivo ςϑςτημα μελϋτησ. Αναφορικϊ με τον προςτϊτη, το TRAMP (Transgenic Adenocarcinoma

39 39 Mouse Prostate) αποτελεύ το μοντϋλο μελϋτησ το οπούο αναπτϑςςει και μεταςτϊςεισ (Gingrich et al., 1996). Επύςησ χρηςιμοποιοϑνται και ανθρώπινεσ καρκινικϋσ κυτταρικϋσ ςειρϋσ, οι περιςςϐτερεσ απϐ τισ οπούεσ ϋχουν απομονωθεύ απϐ μεταςτϊςεισ, με εξαύρεςη τη PC-93 που προϋρχεται απϐ πρωτογενό ϐγκο (Claas et al., 1983). Οι καλϑτερα μελετημϋνεσ και οι πιο γνωςτϋσ εύναι η DU-145, η PC3 και η LNCaP. A DU-145 Η καρκινικό κυτταρικό ςειρϊ DU-145 απομονώθηκε απϐ καρκύνο του προςτϊτη, με μετϊςταςη ςτο κεντρικϐ νευρικϐ ςϑςτημα. Η αρχικό διϊγνωςη όταν ελαφρώσ διαφοροποιημϋνο αδενοκαρκύνωμα, ενώ η μετϊςταςη χαρακτηρύςθηκε ωσ μετρύωσ διαφοροποιημϋνο αδενοκαρκύνωμα, με εςτύεσ ελαφρώσ διαφοροποιημϋνων κυττϊρων. Ο χρϐνοσ διπλαςιαςμοϑ των DU-145 εύναι περύπου 34h (Mickey et al., 1980). Σα κϑτταρα εμφανύζεται να εύναι ευαύςθητα ό και εξαρτημϋνα απϐ ορμϐνεσ. Σα DU-145 παρϊγουν EGF, TGF-α καθώσ και τον υποδοχϋα EGFR ςε υψηλϋσ ςυγκεντρώςεισ, επϊγοντασ αυτοκρινώσ τον κυτταρικϐ πολλαπλαςιαςμϐ (Ching et al., 1993). Επιπλϋον, διαθϋτουν την ικανϐτητα παραγωγόσ bfgf, IGF-1 TGF-β, εκφρϊζουν τουσ αντύςτοιχουσ υποδοχεύσ και διεγεύρονται απϐ εξωγενό bfgf, IGF-1 και TGF-β (Webber et al., 1997). Φαρακτηριςτικϐ επύςησ αποτελεύ η ϋκφραςη υποδοχϋων τρανςφερρύνησ. Η τρανςφερρύνη επϊγει την ανϊπτυξό τουσ και ενιςχϑει την ικανϐτητα μετϊςταςησ ςε οςτϊ. A PC3 Η PC3 εύναι μια καρκινικό κυτταρικό ςειρϊ ανθρώπινου προςτϊτη με μετϊςταςη ςτην οςφυώκό μούρα τησ ςπονδυλικόσ ςτόλησ. Η διϊγνωςη για τον αςθενό απϐ τον οπούο προόλθε η ςυγκεκριμϋνη κυτταρικό ςειρϊ, όταν τϐςο αρχικϊ, ϐςο και ςτη μετϊςταςη, ελαφρώσ διαφοροποιημϋνο αδενοκαρκύνωμα. Σα κϑτταρα χαρακτηρύζονται απϐ απουςύα του Τ χρωμοςώματοσ, αναπτϑςςονται εξύςου καλϊ ςε καλλιϋργειεσ και ςε ϊγαρ και ϋχουν την ικανϐτητα ογκογϋνεςησ ςε αθυμικϊ ποντύκια (Kaighn et al., 1979). Δεν εκφρϊζουν PSA και εύναι ορμονο-ανεξϊρτητα. Ψςτϐςο, πρϐςφατεσ μελϋτεσ ϋδειξαν ϐτι πιθανώσ να εκφρϊζονται πολϑ χαμηλϋσ ςυγκεντρώςεισ PSA (Garde et al., 1983) και υποδοχεύσ ανδρογϐνων (Katsuoka et al., 1986). Σα κϑτταρα PC3 εκφρϊζουν ϋντονα TGF-α, bfgf και τουσ υποδοχεύσ EGFR και FGFR, επϊγοντασ αυτοκρινώσ την ανϊπτυξό τουσ. Αξιοςημεύωτο εύναι ϐμωσ το ϐτι μετϊ απϐ επύδραςη με εξωγενό bfgf δεν παρατηρεύται καμιϊ απϐκριςη, αλλϊ μετϊ απϐ επύδραςη με εξωγενό TGF-β, παρατηρεύται αναςτολό τησ ανϊπτυξησ, η οπούα ϐμωσ επανϋρχεται ςτα φυςιολογικϊ μετϊ απϐ διαρκό επύδραςη 6 ημερών (Webber et al., 1997). Επιπλϋον, το μϐριο κυτταρικό προςκϐλληςησ των επιθηλιακών κυττϊρων C-CAM ρυθμύζεται απϐ τα ανδρογϐνα

40 40 και παρατηρεύται μεύωςη τησ αϑξηςησ και τησ ογκογϋνεςησ που τα PC3 προκαλοϑν, ϐταν μεταςχηματιςτοϑν με το γονύδιο τησ C-CAM (Hsieh et al., 1995). Σϋλοσ, παρϐμοια με τα DU- 145, ϋχουν την ικανϐτητα ϋκφραςησ του υποδοχϋα τησ τρανςφερύνησ (Rossi et al., 1982). A LNCaP Η καρκινικό κυτταρικό ςειρϊ ανθρώπινου προςτϊτη LNCaP απομονώθηκε απϐ μετϊςταςη ςε λεμφικϐ αδϋνα. Η διϊγνωςη όταν μετρύωσ διαφοροποιημϋνοσ καρκύνοσ του προςτϊτη. Ο ρυθμϐσ πολλαπλαςιαςμοϑ των LNCaP κυττϊρων εύναι 60-72h, εξαρτώμενοσ απϐ την ςυγκϋντρωςη του οροϑ και ο χρωμοςωματικϐσ αριθμϐσ τουσ εύναι 76. Διαθϋτουν την ικανϐτητα ϋκφραςησ PSA και ΡΑΡ (Berns et al., 1986), καθώσ και τον ςχηματιςμϐ ϐγκων ςε αθυμικϊ ποντύκια. τα LNCaP ανιχνεϑονται υποδοχεύσ ανδρογϐνων, οι οπούοι ϐμωσ ϋχουν μια μεταλλαγό ςτη θϋςη πρϐςδεςησ, με αποτϋλεςμα να προςδϋνονται ς αυτοϑσ και οιςτρογϐνα. Εκφρϊζουν EGF και TGF-α, ενώ η ϋκφραςη του υποδοχϋα EGFR επϊγεται απϐ τα ανδρογϐνα και τα οιςτρογϐνα. Παρϐλο ϐμωσ που παρϊγουν FGFR, δεν παρϊγουν ςημαντικϋσ ποςϐτητεσ bfgf. Μετϊ απϐ επύδραςη με εξωγενό EGF και bfgf παρατηρεύται ανϊπτυξη των κυττϊρων και ενώ ο εξωγενόσ TGF-β δεν επηρεϊζει τον πολλαπλαςιαςμϐ τουσ, επηρεϊζει τη δρϊςη των EGF και TGF-α (Schuurmans et al., 1991). A3.8. RPTPβ/ζ (Receptor-like Protein-Tyrosine Phosphatase) Η HARP ϋχει υψηλό ςυγγϋνεια με την ηπαρύνη. Εκτϐσ ϐμωσ απϐ την ηπαρύνη, οι αλυςύδεσ τησ θειικόσ ηπαρϊνησ διαφϐρων πρωτεογλυκανών τησ κυτταρικόσ επιφϊνειασ ό του εξωκυττϊριου υλικοϑ, παρουςιϊζουν και αυτϋσ ιςχυρό ικανϐτητα δϋςμευςησ τησ HARP. Επιπλϋον, η θειικό χονροώτύνη και η θειικό δερματϊνη παρουςιϊζουν ςε μικρϐτερο βαθμϐ ςυγγϋνεια με τη HARP, ςε αντύθεςη με τη θειώκό κερατϊνη, η οπούα δεν ϋχει ςυγγϋνεια (Vacherot et al., 1999). Ο RPTPβ/ζ αποτελεύ ϋναν επιπλϋον υποδοχϋα για τη HARP. Η αμινοτελικό περιοχό του RPTPβ/ζ παρουςιϊζει μεγϊλη ομοιϐτητα με το ϋνζυμο καρβονικό ανυδρϊςη (CAH). Ακολουθεύται απϐ την αλληλουχύα τησ ινονεκτύνησ ΙΙΙ (FNIII) και απϐ το καρβοξυτελικϐ ϊκρο που εύναι πλοϑςιο ςε ςερύνεσ και γλυκύνεσ και το οπούο θεωρεύται ϐτι εύναι το ςημεύο πρϐςδεςησ τησ θειικόσ χονδροώτύνησ. Σο τμόμα αυτϐ ςυνδϋεται με τισ δυο καρβοξυτελικϋσ κυτταροπλαςματικϋσ δομϋσ φωςφατϊςησ. Μϋχρι ςόμερα ϋχουν ανιχνευθεύ τρεισ διαφορετικϋσ ιςομορφϋσ του RPTPβ/ζ -δυο διαμεβρανικϋσ μορφϋσ και μια εκκρινϐμενη- οι οπούεσ εύναι αποτϋλεςμα εναλλακτικόσ ωρύμανςησ του μεταγρϊφου. Σϐςο η εκκρινϐμενη μορφό, που αποτελεύται απϐ ολϐκληρη την εξωκυττϊρια περιοχό και η οπούα ονομϊζεται και φωςφακϊνη ό 6Β4 πρωτεογλυκϊνη, ϐςο και η εκτενόσ διαμεμβρανικό ιςομορφό εύναι πρωτεογλυκϊνεσ θειώκόσ χονδροώτύνησ.

41 41 Οι ιςομορφϋσ τησ RPTPβ/ζ ανιχνεϑονται ςτο αναπτυςςϐμενο νευρικϐ ςϑςτημα και θεωρεύται ϐτι παύζουν ρϐλο ςτη μετανϊςτευςη των νευρώνων και ςτον προςανατολιςμϐ των νευριτών. Οι διαμεμβρανικϋσ μορφϋσ του RPTPβ/ζ εντοπύζονται ςε ζώνεσ πολλαπλαςιαςμοϑ, ενώ η φωςφακϊνη κατανϋμεται ς ϐλο τον εγκϋφαλο και μϊλιςτα ςε μεγϊλεσ ποςϐτητεσ (Maeda et al., 1998). Εικόνα Α3.4. Απεικϐνιςη των τριών ιςομορφών με τισ οπούεσ απανταϊται ο RPTPβ/ζ. Η βραχεύα διαμεμβρανικό μορφό του υποδοχϋα δεν περιλαμβϊνει την περιοχό του πρωτεώνικοϑ κορμοϑ Ι, η οπούα εντοπύζεται ςτην εκτενό μορφό του υποδοχϋα, αλλϊ και ςτη φωςφακϊνη. Η βραχεύα μορφό του υποδοχϋα δεν περιλαμβϊνει επύςησ τισ αλυςύδεσ θειικόσ χονδροώτύνησ που απαντώνται ςτην εκτενό μορφό και τη φωςφακϊνη.

42 42 B ΤΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ Β1. Ανακαλλιέργεια κυττάρων Η καλλιϋργεια των κυττϊρων αποςκοπεύ ςτη ςυνεχό παροχό του απαραύτητου προσ μελϋτη βιολογικοϑ υλικοϑ. Σα κϑτταρα, ϐταν καλλιεργοϑνται ςε ςτερεϐ υπϐςτρωμα, αφόνονται κατϊ γενικϐ κανϐνα να αναπτυχθοϑν ϋωσ ϐτου καλϑψουν το 80-90% τησ επιφϊνειασ του τρυβλύου, ϋνα ςημεύο δηλαδό μϋχρι το οπούο η ανϊπτυξό τουσ δεν παρεμποδύζεται απϐ την ϋλλειψη χώρου. ε πολλϊ εύδη κυττϊρων, ϐταν παρατηρεύται ϋλλειψη χώρου, αναςτϋλλεται ο κυτταρικϐσ πολλαπλαςιαςμϐσ και τροποποιοϑνται οι μεταβολικϋσ τουσ διαδικαςύεσ με αδιερεϑνητεσ μϋχρι και ςόμερα ςυνϋπειεσ (contact inhibition). ε κϊποια μϊλιςτα εύδη κυττϊρων, ϐπωσ εύναι τα HUVEC, ϐταν δεν υπϊρχει διαθϋςιμη επιφϊνεια για να προςκολληθοϑν, πεθαύνουν, αποκολλώνται και αιωροϑνται ςτο θρεπτικϐ μϋςο τησ καλλιϋργειασ. Σο φαινϐμενο αυτϐ κατϊ κανϐνα δεν παρατηρεύται ςε καρκινικϊ κϑτταρα τα οπούα ϋχουν απωλϋςει τον ϋλεγχο του κυτταρικοϑ κϑκλου και πολλαπλαςιϊζονται ςυνεχώσ. Επομϋνωσ, ςε καλλιϋργειεσ πρωτογενών φυςιολογικών κυττϊρων, η ανακαλλιϋργεια τουσ θα πρϋπει να πραγματοποιεύται ςε τακτϊ χρονικϊ διαςτόματα, ϋτςι ώςτε να διαςφαλύζεται ο κατϊλληλοσ αριθμϐσ των κυττϊρων για πειρϊματα αλλϊ και η ομαλό τουσ ανϊπτυξη. Η αποκϐλληςη των κυττϊρων απϐ το υπϐςτρωμϊ εύναι δυνατό α) με μηχανικϐ τρϐπο, β) με χημικϊ μϋςα, γ) με ενζυμικό δρϊςη. Κατϊ την τελευταύα περύπτωςη ςυνόθωσ χρηςιμοποιεύται διϊλυμα τρυψύνησ το οπούο διαςπϊ τισ ςυνδϋςεισ των κυττϊρων μεταξϑ τουσ αλλϊ και με το ςτερεϐ τουσ υπϐςτρωμα. Για την ανακαλλιϋργεια των HUVEC χρηςιμοποιοϑνται τρυβλύα Petri που ο πυθμϋνασ τουσ ϋχει επιςτρωθεύ με ζελατύνη, επειδό ϋχει διαπιςτωθεύ ϐτι με αυτϐ τον τρϐπο επιτυγχϊνεται καλϑτερη προςκϐλληςη των κυττϊρων. Τλικϊ και Διαλϑματα Σρυψύνη/EDTA (0.05 %-0.02 % ςε PBS χωρύσ Ca 2+ ). RPMI 1640 Πλόρεσ θρεπτικϐ μϋςο καλλιϋργειασ κυττϊρων Πειραματικό πορεύα 1. Παρατόρηςη του τρυβλύου με τα κϑτταρα ςτο μικροςκϐπιο. Η εικϐνα των κυττϊρων εύναι ενδεικτικό τησ κατϊςταςησ ςτην οπούα βρύςκονται. Κϑτταρα τα οπούα εύναι προςκολλημϋνα ςτο δϊπεδο του τρυβλύου θεωροϑνται υγιό ενώ επιπλϋοντα κϑτταρα ςτο θρεπτικϐ μϋςο εύναι κατϊ πϊςα πιθανϐτητα νεκρϊ. Η ανακαλλιϋργεια γύνεται ϐταν τα κϑτταρα ϋχουν καλϑψει κατϊ 80-90% την επιφϊνεια του τρυβλύου ςτο οπούο καλλιεργοϑνται. 2. Μεταφορϊ του τρυβλύου με τα κϑτταρα ςε θϊλαμο νηματικόσ ροόσ, ϐπου εύναι δυνατό η εργαςύα υπϐ ϊςηπτεσ ςυνθόκεσ.

43 43 3. Αναρρϐφηςη του θρεπτικοϑ μϋςου τησ καλλιϋργειασ με πιπϋτα Pasteur υπϐ κενϐ. 4. Ϊκπλυςη των κυττϊρων δϑο φορϋσ με PBS. Με τη διαδικαςύα αυτό απομακρϑνονται τυχϐν εναπομεύναντα ύχνη οροϑ, τα οπούα περιϋχουν αναςτολεύσ τησ τρυψύνησ. Σα κϑτταρα δεν πρϋπει να μϋνουν για μεγϊλο χρονικϐ διϊςτημα χωρύσ θρεπτικϐ μϋςο ό PBS, αφοϑ εύναι ιδιαύτερα ευπαθό ςε επαφό τουσ με τον αϋρα. Επιπλϋον, και ο χρϐνοσ παραμονόσ των κυττϊρων ςτο PBS (το οπούο δεν περιϋχει ιϐντα Ca 2+ ) δεν πρϋπει να εύναι μεγϊλοσ, γιατύ παρατηρεύται απώλεια τησ επαφόσ τουσ με το υπϐςτρωμα. 5. Προςθόκη 1 ml τρυψύνησ ανϊ τρυβλύο διαμϋτρου 100 mm. 6. Παρατόρηςη τησ αποκϐλληςησ των κυττϊρων ςτο μικροςκϐπιο. Σα κϑτταρα υπϐ την επύδραςη τησ τρυψύνησ χϊνουν το ςχόμα τουσ και αποκτοϑν ςφαιρικό μορφό κατϊ την απώλεια τησ επαφόσ τουσ με το ςτερεϐ υπϐςτρωμα. Σα κϑτταρα δεν πρϋπει να μϋνουν για πολϑ ώρα ςτην τρυψύνη, καθώσ παρατεταμϋνη δρϊςη τησ ςτα κϑτταρα εύναι δυνατϐ να οδηγόςει ςε αυξημϋνη θνητϐτητα. 7. Αμϋςωσ μϐλισ πραγματοποιηθεύ η αποκϐλληςη των κυττϊρων, αναςτϋλλεται η τρυψύνη με την προςθόκη ύςου ϐγκου θρεπτικοϑ μϋςου RPMI που περιϋχει 10% ορϐ. 8. Μεταφορϊ του εναιωρόματοσ των κυττϊρων ςε αποςτειρωμϋνο ςωλόνα των 15 ml. 9. Υυγοκϋντρηςη για 4 min ςε θερμοκραςύα δωματύου ςτα 500 g 10. Αναρρϐφηςη του υπερκεύμενου θρεπτικοϑ μϋςου με πιπϋτα Pasteur. 11. Προςθόκη RPMI μϋχρι τελικοϑ ϐγκου 1 ml. 12. Επαναιώρηςη των κυττϊρων με τη βοόθεια πιπϋτασ, μϋχρισ ϐτου να μην υπϊρχουν ςυςςωματώματα που θα κϊνουν δϑςκολο τον υπολογιςμϐ του αριθμοϑ των κυττϊρων ςτο αιματοκυτταρϐμετρο. 13. Προςθόκη 10 μl απϐ το εναιώρημα των κυττϊρων ςτην ειδικό υποδοχό του αιματοκυτταρϐμετρου. 14. Τπολογιςμϐσ του αριθμοϑ των κυττϊρων ςτο μικροςκϐπιο. 15. Για κϊθε ανακαλλιϋργεια τα κϑτταρα χρηςιμοποιοϑνται ςε ςυγκϋντρωςη 1-1,5Φ10 4 κϑτταρα ανϊ cm 2.

44 44 Β2. Μέτρηςη κυττάρων ςε αιμοκυτταρόμετρο Neubauer Σο αιμοκυτταρϐμετρο εύναι μια τροποποιημϋνη αντικειμενοφϐροσ πλϊκα που ϋχει δυο κατϊλληλα επεξεργαςμϋνεσ, λεύεσ επιφϊνειεσ. Κϊθε μια απϐ αυτϋσ ϋχει ϋνα τετραγωνιςμϋνο πλϋγμα, το οπούο αποτελεύται απϐ 9 κϑρια τετρϊγωνα με μόκοσ πλευρϊσ 1 mm (εμβαδϐν 1 mm 2 ). Κϊθε τετρϊγωνο ορύζεται απϐ παρϊλληλεσ γραμμϋσ, των οπούων η μεταξϑ τουσ απϐςταςη εύναι 2,5 μm, που χρηςιμεϑουν για τον καθοριςμϐ του εϊν τα κϑτταρα βρύςκονται μϋςα ό ϋξω απϐ το πλϋγμα. Επύςησ, κϊθε ϋνα απϐ τα αρχικϊ τετρϊγωνα, ϋχει επιπλϋον διαβαθμύςεισ (χωρύζεται ςε μικρϐτερα τετρϊγωνα) για να διευκολϑνεται η μϋτρηςη των κυττϊρων. Σο επύπεδο του πλϋγματοσ βρύςκεται 0,1 mm χαμηλϐτερα απϐ δυο προεξοχϋσ ςτισ οπούεσ ςτηρύζεται η καλυπτρύδα. Τπϊρχει μια κούλη επιφϊνεια μεταξϑ τησ εξωτερικόσ πλευρϊσ κϊθε τετραγωνιςμϋνησ γυαλιςμϋνησ επιφϊνειασ και των ςημεύων ϐπου ςτηρύζεται η καλυπτρύδα. την κούλη αυτό επιφϊνεια τοποθετεύται το κυτταρικϐ εναιώρημα και με τριχοειδικϊ φαινϐμενα απλώνεται ςτην τετραγωνιςμϋνη επιφϊνεια. Ο ϐγκοσ του κυτταρικοϑ εναιωρόματοσ που θα καλϑπτει το ϋνα απϐ εννϋα τετρϊγωνα εύναι 0,1 mm 3 (1,0 mm 2 * 0,1 mm) ό 1 * 10-4 ml. Ϊτςι, η ςυγκϋντρωςη των κυττϊρων ςτο αρχικϐ εναιώρημα (ςε κϑτταρα / ml) εύναι: Μϋτρηςη ςτο ϋνα απϐ τα κϑρια τετρϊγωνα x 10. Εικόνα Β2.1.: Αιμοκυτταρϐμετρο Neubauer. Παρουςιϊζεται ςχηματικϊ και ο τρϐποσ υπολογιςμοϑ των κυττϊρων.

45 45 Β3. Εκχύλιςη πρωτεΰνών από κύτταρα ςε καλλιέργεια Η ανϊλυςη και μελϋτη των πρωτεώνών ϋγινε ςε ολικϊ εκχυλύςματα απϐ τισ καλλιϋργειεσ των DU145, DU145-RM6, PC3 και PC3-RM4. Κατϊ τη διαδικαςύα αυτό τα κϑτταρα λϑονται με διϊλυμα το οπούο περιϋχει απορρυπαντικϐ, προκειμϋνου να διαλυθοϑν οι μεμβρϊνεσ των κυττϊρων και ςτη ςυνϋχεια μεταφϋρονται ςε πϊγο για να αναςταλεύ η δρϊςη των πρωτεώναςών. Τλικϊ και Διαλϑματα Πλόρεσ υγρϐ θρεπτικϐ μϋςο Διϊλυμα διαλυτοπούηςησ δειγμϊτων για SDS-PAGE (Sample Buffer) Tris-Cl ph: 6,8 10% SDS Γλυκερϐλη DTT Πειραματικό πορεύα 1. Ανακαλλιϋργεια των κυττϊρων ςε τρυβλύα των 60 mm. 2. Καλλιϋργεια των κυττϊρων μϋχρι να καλυφθεύ το 80-90% τησ επιφϊνειασ του τρυβλύου. 3. Απομϊκρυνςη του υπερκεύμενου θρεπτικοϑ μϋςου με πιπϋτα Pasteur. 4. Ξϋπλυμα των κυττϊρων με PBS. 5. Προςθόκη υγροϑ θρεπτικοϑ μϋςου με αντιβιοτικϊ, αλλϊ χωρύσ FBS και επώαςη για 4h, ςε απϐλυτη υγραςύα, ςτουσ 37 ο C και ςε ατμϐςφαιρα 5% CO2 6. Απομϊκρυνςη του υπερκεύμενου υγροϑ θρεπτικοϑ μϋςου με πιπϋτα Pasteur, ξϋπλυμα των κυττϊρων με PBS και προςθόκη του παρϊγοντα. Σο ςτϊδιο αυτϐ πρϋπει να γύνει ϐςο το δυνατϐ γρηγορϐτερα. 7. Επώαςη για 15 min ςε απϐλυτη υγραςύα, ςτουσ 37 ο C και ατμϐςφαιρα CO2 5%. 8. Απομϊκρυνςη του υπερκεύμενου υγροϑ θρεπτικοϑ μϋςου με πιπϋτα Pasteur και ξϋπλυμα των κυττϊρων με PBS (2 φορϋσ). 9. Λϑςη των κυττϊρων με 250 μl ζϋον 2Φ διαλϑματοσ διαλυτοπούηςησ δειγμϊτων για SDS- PAGE. 10. Μεταφορϊ ςε ςωληνϊριο 2 ml. 11. Επώαςη των δειγμϊτων ςτουσ 95 ο C, για 1 min.

46 46 B4. SDS ηλεκτροφόρηςη ςε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) Η ανϊλυςη των πρωτεώνών ϋγινε με ηλεκτροφϐρηςη ςε πόκτωμα πολυακρυλαμιδύου, παρουςύα αποδιατακτικών παραγϐντων (SDS, DTT). Σο SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) εύναι ϋνα ιοντικϐ απορρυπαντικϐ, το οπούο δεςμεϑεται ςτισ πρωτεϗνεσ με ςταθερό αναλογύα βϊρουσ (1,4 gr SDS ανϊ gr πρωτεϗνησ). Η επιπλϋον χρόςη αναγωγικών παραγϐντων, ϐπωσ εύναι η διθειοθρεώτϐλη (DTT) ό η β-μερκαπταιθανϐλη, ϋχει ωσ αποτϋλεςμα την αναγωγό των διςουλφιδικών δεςμών των πρωτεώνών. Η πλόρησ αποδιϊταξη των πρωτεώνών επιτυγχϊνεται με θϋρμανςη των πρωτεώνικών δειγμϊτων για 5 min ςτουσ 100 ο C, παρουςύα ϐλων των παραπϊνω αποδιατακτικών παραγϐντων. Εξαιτύασ του SDS, οι πρωτεϗνεσ που περιϋχονται ςτα δεύγματα ϋχουν φορτιςτεύ αρνητικϊ και εύναι δυνατό η κύνηςό τουσ ϐταν βρεθοϑν εντϐσ ηλεκτρικοϑ πεδύου. Η ηλεκτροφορητικό τουσ κινητικϐτητα εύναι ςυνϊρτηςη του μοριακοϑ τουσ βϊρουσ. Τλικϊ και Διαλϑματα 1,5 M Tris-HCl ph 8,8 Tris-base 45,4 g Απεςταγμϋνο H2O 180 ml Σο διϊλυμα ρυθμύζεται ςε ph=8,8 με τη χρόςη διαλϑματοσ HCl 37% και ςυμπληρώνεται απεςταγμϋνο H2O μϋχρι τελικοϑ ϐγκου 250 ml. 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 Tris-base 6,055 g Απεςταγμϋνο H2O 80 ml Σο διϊλυμα ρυθμύζεται ςε ph=6,8 με τη χρόςη διαλϑματοσ HCl 37% και ςυμπληρώνεται απεςταγμϋνο H2O μϋχρι τελικοϑ ϐγκου 100 ml. Ρυθμιςτικϐ διϊλυμα διαλυτοπούηςησ δειγμϊτων ( 5Φ ) Tris-HCl ph 6,8 0,25 M SDS 4% κ.β. Γλυκερϐλη 40% κ.β. DTT 100 mm Κυανοϑν τησ βρωμοφαινϐλησ 0,05% κ.β. Η DTT προςτύθεται λύγο πριν την χρόςη του ρυθμιςτικοϑ διαλϑματοσ δειγμϊτων. Ρυθμιςτικϐ διϊλυμα ηλεκτροδύων (5Φ) Tris-base 250 mm Γλυκύνη 2 M SDS 0,5%

47 47 Απεςταγμϋνο H2O Μϋχρι τελικοϑ ϐγκου 1 lt Σο διϊλυμα διατηρεύται ςε θερμοκραςύα δωματύου και αραιώνεται 1:5 με απεςταγμϋνο Η2Ο πριν απϐ τη χρόςη του. Διϊλυμα ακρυλαμιδύου / μεθυλεν-δισ-ακρυλαμιδύου 30% (30:1) Ακρυλαμύδιο 150 gr Μεθυλεν-δισ-ακρυλαμιδύου 5 gr Απεςταγμϋνο H2O Μϋχρι τελικοϑ ϐγκου 500 ml Διϊλυμα SDS 10% κ.β. SDS 10 g Απεςταγμϋνο H2O 100 ml Διϊλυμα υπερθεώικοϑ αμμωνύου 20% κ.β. Τπερθεώικϐ αμμώνιο 20 g Απεςταγμϋνο H2O Μϋχρι τελικοϑ ϐγκου 100 ml TEMED Πόκτωμα ςυμπϑκνωςησ επιθυμητόσ πυκνϐτητασ (3,5, 5%) υςτατικό 3,5% 5% ddh2o 3,69 ml 3,4 ml Διϊλυμα ακρυλαμιδύου / 0,581 ml 0,83 ml μεθυλεν-δισ-ακρυλαμιδύου 30% 0,5 M Tris-HCl ph 6,8 0,63 ml 0,63 ml SDS 10% 0,05 ml 0,05 ml AMPS (ammonium 0,05 ml 0,05 ml persulfate) 20% TEMED 0,005 ml 0,005 ml

48 48 Πόκτωμα διαχωριςμοϑ επιθυμητόσ πυκνϐτητασ (5%. 7,5%, 10%) υςτατικό 5% 7,5% 10% ddh2o 8,4ml 7,15 ml 5,9 ml Διϊλυμα 2,5 ml 3,75 ml 5 ml ακρυλαμιδύου /μεθυλεν-δισ-ακρυλαμιδύου 1,5 M Tris-HCl 3,8 ml 3,8 ml 3,8 ml ph 8,8 SDS 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml AMPS (ammonium persulfate) 20% 0,15 ml 0,15 ml 0,15 ml TEMED 0,006 ml 0,006 ml 0,006 ml Πειραματικό πορεύα 1. Διαμορφώνεται ειδικό υϊλινη μότρα, μϋςα ςτην οπούα θα πραγματοποιηθεύ ο πολυμεριςμϐσ των πηκτωμϊτων διαχωριςμοϑ και ςυμπυκνώςεωσ. 2. Πραγματοποιεύται πολϑ καλό και γρόγορη ανϊδευςη των ςυςτατικών που απαρτύζουν το πόκτωμα διαχωριςμοϑ. 3. Απϐχυςη των υγρών ακϐμα ςυςτατικών του πηκτώματοσ διαχωριςμοϑ ςτην υϊλινη μότρα και επικϊλυψη με απεςταγμϋνο νερϐ. Παρατηροϑμε τον πολυμεριςμϐ του πηκτώματοσ ϋτςι ώςτε να βεβαιωθοϑμε ϐτι πραγματοποιεύται φυςιολογικϊ (2-15 min, ανϊλογα με τη ςϑςταςη του πηκτώματοσ ό/και τη θερμοκραςύα του περιβϊλλοντοσ). 4. Απϐχυςη του απεςταγμϋνου νεροϑ απϐ την επιφϊνεια του πηκτώματοσ. 5. Πραγματοποιεύται πολϑ καλό και γρόγορη ανϊδευςη των ςυςτατικών που απαρτύζουν το πόκτωμα ςυμπυκνώςεωσ. 6. Απϐχυςη των υγρών ακϐμα ςυςτατικών του πηκτώματοσ ςυμπυκνώςεωσ ςτην υϊλινη μότρα, πϊνω απϐ την επιφϊνεια του πηκτώματοσ διαχωριςμοϑ. Προςθόκη κατϊλληλησ ελαςτικόσ μότρασ, η οπούα εύναι υπεϑθυνη για τη δημιουργύα των φρεατύων ςτο πόκτωμα ςυμπυκνώςεωσ. Παρατηροϑμε τον πολυμεριςμϐ του πηκτώματοσ για να βεβαιωθοϑμε ϐτι πραγματοποιεύται φυςιολογικϊ (5-15 min ανϊλογα με τη θερμοκραςύα του περιβϊλλοντοσ). 7. Ανϊμιξη των δειγμϊτων που θα ηλεκτροφορηθοϑν με ρυθμιςτικϐ διϊλυμα δειγμϊτων 5Φ ςε αναλογύα 4:1. 8. Θϋρμανςη των δειγμϊτων για 5 min ςτουσ 100 ο C. 9. Υυγοκϋντρηςη των δειγμϊτων για 5 λεπτϊ ςτα g και ςε θερμοκραςύα δωματύου. 10. Προςθόκη των δειγμϊτων ςτισ ειδικϋσ υποδοχϋσ του πηκτώματοσ ςυμπϑκνωςησ.

49 Πραγματοπούηςη τησ ηλεκτροφϐρηςησ ςε θερμοκραςύα δωματύου με την εφαρμογό ηλεκτρικοϑ πεδύου ςταθερόσ ϋνταςησ 12 ma, μϋχρι η χρωςτικό μπλε τησ βρωμοφαινϐλησ να εξαφανιςτεύ απϐ το ϊκρο του πηκτώματοσ τησ ηλεκτροφϐρηςησ.

50 50 Β5. Ανοςοςτύπωμα (Western blot) Η μϋθοδοσ αυτό επιτρϋπει την εκλεκτικό ανύχνευςη μιασ πρωτεϗνησ αντιγϐνου, με τη χρόςη ειδικών αντιςωμϊτων που ϋχουν παραςκευαςτεύ γι αυτϐ. Η μϋθοδοσ περιλαμβϊνει την ηλεκτροφορητικό ανϊλυςη ενϐσ πρωτεώνοϑχου διαλϑματοσ ςε πόκτωμα πολυακρυλαμιδύου, την ηλεκτρομεταφορϊ των πρωτεώνών ςε μεμβρϊνεσ και τϋλοσ τη δϋςμευςη των ειδικών αντιςωμϊτων ςτο αντιγϐνο. Μετϊ απϐ την κϊλυψη των κενών θϋςεων τησ μεμβρϊνησ (blocking) πραγματοποιεύται επώαςη τησ μεμβρϊνησ με ειδικϐ ϋναντι του υπϐ μελϋτη αντιγϐνου αντύςωμα. τη ςυνϋχεια, η μεμβρϊνη επωϊζεται με αντύςωμα που αναγνωρύζει την Fc περιοχό του πρώτου αντιςώματοσ. Σο δεϑτερο αντύςωμα εύναι ςημαςμϋνο εύτε ενζυμικϊ εύτε ραδιενεργϊ, οπϐτε εύναι δυνατό η ανύχνευςη του ςυμπλϐκου αντιγϐνου αντιςώματοσ μετϊ απϐ την προςθόκη κατϊλληλου υποςτρώματοσ. τα πειρϊματα που πραγματοποιόθηκαν ςτην παροϑςα εργαςύα, ϐλα τα δεϑτερα αντιςώματα που χρηςιμοποιόθηκαν όταν ςημαςμϋνα ενζυμικϊ με την horseraddish peroxidase (HRP). Τλικϊ και Διαλϑματα Ρυθμιςτικϐ διϊλυμα για τη ςυςκευό μεταφορϊσ πρωτεώνών (10Φ) Γλυκύνη 400 mm Tris base 500 mm SDS 0,37% κ.β. Σο διϊλυμα διατηρεύται ςε θερμοκραςύα δωματύου και αραιώνεται πριν απϐ τη χρόςη του με αναλογύα ρυθμιςτικοϑ διαλϑματοσ:απεςταγμϋνο Η2Ο:μεθανϐλη ύςη με 1:7:2. Ρυθμιςτικϐ διϊλυμα TBS ph 7,6 (10Φ) Tris base 200 mμ NaCl 1,36 Μ Απεςταγμϋνο Η2Ο 800 ml Ρυθμύζεται το ph του διαλϑματοσ ςε τιμό ύςη με 7,6 με τη χρόςη πυκνοϑ διαλϑματοσ HCl (37%) και ςυμπληρώνεται ο ϐγκοσ του μϋχρι 1lt με απεςταγμϋνο Η2Ο. Σο διϊλυμα διατηρεύται ςε θερμοκραςύα δωματύου και χρηςιμοποιεύται ωσ 1Φ μετϊ απϐ αραύωςη 1:9 με απεςταγμϋνο Η2Ο. Μεμβρϊνη PVDF (polyvinylidene fluoride): Millipore Immobilon-P Transfer Membrane Ωπαχο γϊλα ςε ςκϐνη (Regilait) Ρυθμιςτικϐ διϊλυμα TBS Tween 20 ph 7,6 (ΣΒS-T) ϑςτημα Φημειοφωταϑγειασ:

51 51 Φρηςιμοποιόθηκε το ολοκληρωμϋνο ςϑςτημα χημειοφωταϑγειασ απϐ την εταιρεύα Chemicon (ChemiLucentTM #2600). Πειραματικό πορεύα 1. Μετϊ την ολοκλόρωςη τησ ηλεκτροφορητικόσ ανϊλυςησ, γύνεται τοποθϋτηςη του πηκτώματοσ διαχωριςμοϑ ςε κατϊλληλη ςυςκευό, για μεταφορϊ των πρωτεώνών απϐ το πόκτωμα ςε μεμβρϊνη PVDF. 2. Εφαρμογό ςταθερόσ ϋνταςη ρεϑματοσ 700 ma για min. Σα δεύγματα μεταφϋρονται απϐ τον αρνητικϐ ςτο θετικϐ πϐλο. 3. H μεμβρϊνη υφύςταται κατϊλληλη επεξεργαςύα ανϊλογα με το εύδοσ τησ πρωτεϗνησ που αναλϑεται, προκειμϋνου να πραγματοποιηθεύ ό παρεμποδιςτεύ η μη ειδικό δϋςμευςη των αντιςωμϊτων (5% γϊλα ςε TBS-T για 1 h). 4. Πραγματοποιοϑνται 3 ξεπλϑματα τησ μεμβρϊνησ για 5 min με διϊλυμα TBS T ςε θερμοκραςύα δωματύου. 5. Εμβϊπτιςη τησ μεμβρϊνησ και επώαςη ςε ρυθμιςτικϐ διϊλυμα που περιϋχει το πρώτο αντύςωμα ςε κατϊλληλη αραύωςη. 6. υλλογό του πρώτου αντιςώματοσ. 7. Πραγματοποιοϑνται 3 ξεπλϑματα τησ μεμβρϊνησ για 5 min με διϊλυμα TBS T ςε θερμοκραςύα δωματύου. 8. Επώαςη τησ μεμβρϊνησ ςε ρυθμιςτικϐ διϊλυμα που περιϋχει το δεϑτερο αντύςωμα, ςε θερμοκραςύα δωματύου υπϐ ανακύνηςη. 9. Πραγματοποιοϑνται 3 ξεπλϑματα τησ μεμβρϊνησ για 5 min με διϊλυμα TBS T ςε θερμοκραςύα δωματύου και ϋνα ξϋπλυμα των 5 min με TBS. 10. Εμφϊνιςη του ανοςοςτυπώματοσ τησ πρωτεϗνησ ςτη μεμβρϊνη με ςϑςτημα χημειοφωταϑγειασ.

52 52 Παρατηρόςεισ 1o υγκ/ςη Φρόνοσ 2o υγκ/ςη Φρόνοσ Αντίςωμα επώαςησ Αντίςωμα επώαςησ cleaved 1:1000 overnight Anti-rabbit 1: h ςτουσ Caspase 3 ςε ςτουσ 4 o C ςε TBS-T 37 ο C TBS-T με 5% με 3% BSA ϊπαχο γϊλα cleaved 1:1000 overnight Anti-rabbit 1: h ςτουσ Caspase 8 ςε ςτουσ 4 o C ςε TBS-T 37 o C TBS-T με 5% με 3% BSA ϊπαχο γϊλα Cdt1 ςε TBS- 1:1000 overnight Anti-rabbit 1: h ςτουσ T με 5% BSA ςτουσ 4 o C ςε TBS-T 37 o C με 3% ϊπαχο γϊλα HSC70 1:1000 overnight Anti-rabbit 1: h ςτουσ ςε TBS-T με ςτουσ 4 o C ςε TBS-T 37 o C 5% BSA με 3% ϊπαχο γϊλα

53 53 Β6. Αποδέςμευςη αντιςωμάτων και επαναχρηςιμοποίηςη αποτυπωμάτων Η ανϊπτυξη τεχνικών ανύχνευςησ των αντιγϐνων ςτα ανοςοαποτυπώματα που βαςύζονται ςτη μϋθοδο τησ χημειοφωταϑγειασ, παρϋχει τη δυνατϐτητα επαναχρηςιμοπούηςησ των μεμβρανών με τη χρόςη διαφορετικών αντιςωμϊτων, καθώσ δεν ϋχει πραγματοποιηθεύ αλλούωςη τησ μεμβρϊνησ αλλϊ και των μεταφερομϋνων ςε αυτόν αντιγϐνων. Κατϊ τη διαδικαςύα τησ αποδϋςμευςησ των αντιςωμϊτων (stripping) η μεμβρϊνη επωϊζεται ςε ζϋον ρυθμιςτικϐ διϊλυμα που περιϋχει αποδιατακτικοϑσ παρϊγοντεσ (SDS, β- μερκαπτοαιθανϐλη). Με τον τρϐπο αυτϐ, επιτυγχϊνεται η διϊςπαςη του ςυμπλϐκου αντιγϐνου-αντιςώματοσ και η απελευθϋρωςη των αντιςωμϊτων απϐ την μεμβρϊνη. Οι μοναδικϋσ πρωτεϗνεσ που παραμϋνουν δεςμευμϋνεσ ςτη μεμβρϊνη εύναι εκεύνεσ οι οπούεσ εύναι δεςμευμϋνεσ ιςχυρϊ ςε αυτόν λϐγω των υδρϐφοβων αλληλεπιδρϊςεων κατϊ την ηλεκτρομεταφορϊ τουσ. τη ςυνϋχεια η μεμβρϊνη ξεπλϋνεται εξαντλητικϊ προκειμϋνου να απομακρυνθοϑν οι αποδιατακτικού παρϊγοντεσ και ςτη ςυνϋχεια, πραγματοποιεύται εκ νϋου κορεςμϐσ των θϋςεων δϋςμευςησ τησ μεμβρϊνησ και επώαςη με τα επιθυμητϊ αντιςώματα. Τλικϊ και διαλϑματα Διϊλυμα αποδϋςμευςησ αντιςωμϊτων Tris-HCl ph ,5 mm SDS 2% κ.β. β-μερκαπτοαιθανϐλη 100 mm Πειραματικό πορεύα 1. Μετϊ την ϋκθεςη τησ μεμβρϊνησ ςτο φιλμ, ακολουθεύ ξϋπλυμα τησ μεμβρϊνησ 4 φορϋσ, για 5 min κϊθε φορϊ με ρυθμιςτικϐ διϊλυμα TBS 1Φ - 0,05% Tween Επώαςη τησ μεμβρϊνησ για 30 min ςτουσ 56 ο C, με το διϊλυμα αποδϋςμευςησ του αντιςώματοσ. 3. Βύαιο ξϋπλυμα τησ μεμβρϊνησ 7 φορϋσ με ρυθμιςτικϐ διϊλυμα TBS 1Φ - 0,05% Tween Επώαςη τησ μεμβρϊνησ με ρυθμιςτικϐ διϊλυμα παρεμπϐδιςησ τησ μη ειδικόσ δϋςμευςησ

54 Β7. Προςδιοριςμόσ νεκρών και αποπτωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροήσ Τλικϊ και διαλϑματα 54 Ολοκληρωμϋνο κιτ τησ εταιρεύασ BD Pharmigen Annexin V-FITC Propidium Iodide Staining Solution Annexin V-FITC Binding Buffer, 10x Πειραματικό πορεύα 1. Ϊκπλυςη των κυττϊρων δϑο φορϋσ με κρϑο PBS και επαναιώρηςη ςε 1x Binding Buffer, ςε ςυγκϋντρωςη 1x10 6 κϑτταρα/ml. 2. Μεταφορϊ 100λ (1x10 5 ) ςε ςωληνϊκι eppendorf του 1,5ml. Προςθόκη 5λ Annexin V- FITC. 3. Προςθόκη 10λ Propidium Iodide. 4. Απαλό ανακύνηςη και επώαςη για 15' ςε θερμοκραςύα δωματύου, ςτο ςκοτϊδι. 5. Προςθόκη 400λ 1x Binding Buffer ςε κϊθε ςωληνϊκι και ανϊλυςη ςε κυτταρομετρητό ροόσ ςε διϊςτημα μύασ ώρασ.

55 Β8 Ανοςοφθοριςμόσ με BrdU για τον προςδιοριςμό του ποςοςτού κυττάρων ςτη φάςη S του κυτταρικού κύκλου Τλικϊ και διαλϑματα τρογγυλϋσ καλυπτρύδεσ 10mm PBS PBS-Tween BrdU 20mM stock 2M Hcl 0,1M Tris-Cl ph 8,8 Διϊλυμα δϋςμευςησ (3% ΒSA, 10% FBS ςε PBS) Αντύςωμα rat anti-brdu Αντύςωμα donkey anti-rat Alexa488 Φρωςτικό Hoechst Mowiol Πειραματικό πορεύα 1. Καλλιϋργεια κυττϊρων ςε πλακύδια 6 μικροκυψελύδων με 2 καλυπτρύδεσ ανϊ κυψελύδα μϋχρι κϊλυψησ του 80% τησ επιφϊνειασ. 2. Προςθόκη 20μΜ BrdU και επώαςη για 4h min 100% μεθανϐλη 4. 3 φορϋσ ϋκπλυςη 5min με PBS 5. 1 ϋκπλυςη με UPW 6. Επώαςη 1h ςε 2Μ HCl 7. Ϊκπλυςη 1 φορϊ 5min με 0,1Μ Tris-Cl ph8,8 8. Επώαςη 1h ςε διϊλυμα δϋςμευςησ 9. Επώαςη overnight αντύςωμα anti-brdu, ςτουσ 4 ο C, με αραύωςη 1: Ϊκπλυςη 3 φορϋσ απϐ 5min με PBS-Tween 11. Επώαςη 1h με αντύςωμα donkey anti-rat Alexa488, ςε θερμοκραςύα δωματύου ςτο ςκοτϊδι 12. Ϊκπλυςη 3 φορϋσ 5min με PBS-Tween 13. Επώαςη 5min με Hoechst 1: Ϊκπλυςη 2 φορϋσ 2min με PBS 15. Μονιμοπούηςη με 5λ mowiol 16. Παρατόρηςη ςε μικροςκϐπιο ανοςοφθοριςμοϑ 55

56 56 Γ. ΑΠΟΣΕΛΕΜΑΣΑ Γ1. Προςδιοριςμόσ νεκρών και αποπτωτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροήσ Με ςκοπϐ να μελετόςουμε τα ποςοςτϊ των νεκρών και αποπτωτικών κυττϊρων DU145 και DU145-RM6, καθώσ και των PC3 και των αντύςτοιχων PC3-RM4 κατϊ την κυτταροκαλλιϋργεια, χρηςιμοποιόςαμε την τεχνικό τησ κυτταρομετρύασ ροόσ. Με την κυτταρομετρύα ροόσ προςδιορύζουμε το ποςοςτϐ των κυττϊρων που εύναι αρνητικϊ και για τα δϑο μϐρια (ζωντανϊ κϑτταρα), θετικϊ για χρώςη με αννεξύνη (αποπτωτικϊ ςε αρχικϊ ςτϊδια), διπλϊ θετικϊ για χρώςη με αννεξύνη και ιωδιοϑχο προπύδιο (αποπτωτικϊ ςε τελικϊ ςτϊδια) και θετικϊ μϐνο για ιωδιοϑχο προπύδιο (νεκρϊ). Παρακϊτω παρατύθενται δϑο εικϐνεσ απϐ χαρακτηριςτικϊ πειρϊματα για DU145\RM6 και PC3\RM4. τισ περιοχϋσ Ε1, Ε2, Ε3 και Ε4 φαύνονται αντύςτοιχα τα ποςοςτϊ των κυττϊρων που εύναι θετικϊ για χρώςη με ιωδιοϑχο προπύδιο, διπλϊ θετικϊ και για τισ δϑο χρώςεισ, διπλϊ αρνητικϊ ζωντανϊ κϑτταρα και τϋλοσ, θετικϊ ςε χρώςη με αννεξύνη. Μετϊ τισ εικϐνεσ ακολουθoϑν οι γραφικϋσ παραςτϊςεισ που προκϑπτει απϐ τα αποτελϋςματα.

57 57 Εικόνα Γ1.1. Άνω αριςτερά: Εικϐνα κυτταρομετρύασ ροόσ για τα DU145 και αντύςτοιχα ποςοςτϊ Άνω δεξιά: Εικϐνα κυτταρομετρύασ ροόσ για τα DU145-RM6 και αντύςτοιχα ποςοςτϊ. Κάτω αριςτερά: Εικϐνα κυτταρομετρύασ ροόσ για τα PC3 και αντύςτοιχα ποςοςτϊ Κάτω δεξιά: Εικϐνα κυτταρομετρύασ ροόσ για τα PC3-RM4 και αντύςτοιχα ποςοςτϊ

58 58 Εικόνα Γ2.2. Άνω αριςτερά: Ποςοςτϐ επιβύωςησ των κυττϊρων ςε ςχϋςη με το ςυνολικϐ αριθμϐ κυττϊρων που μετρόθηκαν. **p<0,01 Άνω δεξιά: Ποςοςτϐ αποπτωτικών κυττϊρων ςε αρχικϊ ςτϊδια (θετικϊ μϐνο για αννεξύνη), ςε ςχϋςη με το ςυνολικϐ αριθμϐ κυττϊρων. Δεν παρατηρεύται ςτατιςτιτικώσ ςημαντικό διαφορϊ. Κάτω αριςτερά: Ποςοςτϐ αποπτωτικών κυττϊρων ςε τελικϊ ςτϊδια (διπλϊ θετικϊ για αννεξύνη και ιωδιοϑχο προπύδιο), ςε ςχϋςη με το ςυνολικϐ αριθμϐ κυττϊρων. **p<0,01 Κάτω δεξιά: Ποςοςτϐ νεκρών κυττϊρων (θετικϊ μϐνο για ιωδιοϑχο προπιδιο), ςε ςχϋςη με το ςυνολικϐ αριθμϐ κυττϊρων. **p<0,01 Σα κϑτταρα αφϋθηκαν να πολλαπλαςιαςτοϑν μϋχρι να καλϑψουν το 80% τησ επιφϊνειασ του τρυβλύου. υλλϋχθηκαν, πλϑθηκαν με κρϑο PBS και τοποθετόθηκαν ςε ςωληνϊκια eppendorf, με ςυγκϋντρωςη 10 5 κϑτταρα/ml. τη ςυνϋχεια, προςτϋθηκαν 5λ αννεξύνη και 10λ ιωδιοϑχο προπύδιο και τα κϑτταρα επωϊςτηκαν για 15' ςε θερμοκραςύα δωματύου, ςτο ςκοτϊδι. Ϊπειτα, τα κϑτταρα μετρόθηκαν με κυτταρομετρύα ροόσ, ςτο κατϊλληλο πρϐγραμμα. Σα ποςοςτϊ προκϑπτουν απϐ τρύα διαφορετικϊ μεταξϑ τουσ πειρϊματα και ςτην εικϐνα φαύνονται τα ποςοςτϊ ±SE για κϊθε πεύραμα.

59 59 Εικόνα Γ1.3. Άνω αριςτερά: Ποςοςτϐ επιβύωςησ των κυττϊρων ςε ςχϋςη με το ςυνολικϐ αριθμϐ κυττϊρων που μετρόθηκαν. *p<0,05 Άνω δεξιά: Ποςοςτϐ αποπτωτικών κυττϊρων ςε αρχικϊ ςτϊδια (θετικϊ μϐνο για αννεξύνη), ςε ςχϋςη με το ςυνολικϐ αριθμϐ κυττϊρων. *p<0,05 Κάτω αριςτερά: Ποςοςτϐ αποπτωτικών κυττϊρων ςε τελικϊ ςτϊδια (διπλϊ θετικϊ για αννεξύνη και ιωδιοϑχο προπύδιο), ςε ςχϋςη με το ςυνολικϐ αριθμϐ κυττϊρων. *p<0,05 Κάτω δεξιά: Ποςοςτϐ νεκρών κυττϊρων (θετικϊ μϐνο για ιωδιοϑχο προπιδιο), ςε ςχϋςη με το ςυνολικϐ αριθμϐ κυττϊρων. **p<0,01 Σα κϑτταρα αφϋθηκαν να πολλαπλαςιαςτοϑν μϋχρι να καλϑψουν το 80% τησ επιφϊνειασ του τρυβλύου. υλλϋχθηκαν, πλϑθηκαν με κρϑο PBS και τοποθετόθηκαν ςε ςωληνϊκια eppendorf, με ςυγκϋντρωςη 10 5 κϑτταρα/ml. τη ςυνϋχεια, προςτϋθηκαν 5λ αννεξύνη και 10λ ιωδιοϑχο προπύδιο και τα κϑτταρα επωϊςτηκαν για 15' ςε θερμοκραςύα δωματύου, ςτο ςκοτϊδι. Ϊπειτα, τα κϑτταρα μετρόθηκαν με κυτταρομετρύα ροόσ, ςτο κατϊλληλο πρϐγραμμα. Σα ποςοςτϊ προκϑπτουν απϐ τρύα διαφορετικϊ μεταξϑ τουσ πειρϊματα και ςτην εικϐνα φαύνονται τα ποςοςτϊ ±SE για κϊθε πεύραμα.

60 Γ2. Προςδιοριςμόσ των ςχετικών επιπέδων τησ ενεργοποιημένησ καςπάςησ 3 και καςπάςησ 8 με ανάλυςη κατά Western Παρϊλληλα με τα πειρϊματα κυτταρομετρύασ ροόσ, πραγματοποιόθηκε και ανϊλυςη κατϊ Western, για να πιςτοποιηθεύ η παρουςύα και τα ςχετικϊ επύπεδα των ενεργοποιημϋνων με υδρϐλυςη καςπαςών 3 και 8. Τψηλϐτερα επύπεδα αυτών των μορύων υποδεικνϑουν υψηλϐτερο ποςοςτϐ απϐπτωςησ. 60 Εικόνα Γ2.1.. Φαρακτηριςτικϋσ εικϐνεσ απϐ τισ εμφανύςεισ ςε φωτογραφικϐ φιλμ των πρωτεώνών που μελετόθηκαν, μαζύ με τισ αντύςτοιχεσ τησ HSC70, οι οπούεσ χρηςιμοποιόθηκαν για την ομαλοπούηςη των αποτελεςμϊτων

61 61 Εικόνα 2.2. Αριςτερά: χετικϊ επύπεδα ενεργοποιημϋνησ καςπϊςησ 8, με ςημεύο αναφορϊσ τα επύπεδϊ τησ ςτα DU145. Σα κϑτταρα αφϋθηκαν να πολλαπλαςιαςτοϑν μϋχρι να καλϑψουν το 80% τησ επιφϊνειασ τρυβλύου διαμϋτρου 6mm. Ϊπειτα, λϑθηκαν με ζϋον διϊλυμα διαλυτοπούηςησ για SDS-PAGE και ηλεκτροφορόθηκαν. Ακολοϑθηςε ανοςοςτϑπωμα με ειδικϊ αντιςώματα για την υδρολυμϋνη καςπϊςη 8 και ΗSC70. τη ςυνϋχεια, τα αποτελϋςματα αναλϑθηκαν με λογιςμικϐ ανϊλυςησ εικϐνασ (ImageJ) και ϋγινε ομαλοπούηςη των επιπϋδων τησ καςπϊςησ 8, ςε ςχϋςη με τα επύπεδα τησ πρωτεϗνησ HSC70. Σα ποςοςτϊ προκϑπτουν απϐ τρύα διαφορετικϊ μεταξϑ τουσ πειρϊματα, και παρουςιϊζονται τα ποςοςτϊ ±SE των πειραμϊτων. *p<0,05 Δεξιά: χετικϊ επύπεδα ενεργοποιημϋνησ καςπϊςησ 3, με ςημεύο αναφορϊσ τα επύπεδϊ τησ ςτα DU145. Σα κϑτταρα αφϋθηκαν να πολλαπλαςιαςτοϑν μϋχρι να καλϑψουν το 80% τησ επιφϊνειασ τρυβλύου διαμϋτρου 6mm. Ϊπειτα, λϑθηκαν με ζϋον διϊλυμα διαλυτοπούηςησ για SDS-PAGE και ηλεκτροφορόθηκαν. Ακολοϑθηςε ανοςοςτϑπωμα με ειδικϊ αντιςώματα για την υδρολυμϋνη καςπϊςη 3 και ΗSC70. τη ςυνϋχεια, τα αποτελϋςματα αναλϑθηκαν με λογιςμικϐ ανϊλυςησ εικϐνασ (ImageJ) και ϋγινε ομαλοπούηςη των επιπϋδων τησ καςπϊςησ 3, ςε ςχϋςη με τα επύπεδα τησ πρωτεϗνησ HSC70. Σα ποςοςτϊ προκϑπτουν απϐ τρύα διαφορετικϊ μεταξϑ τουσ πειρϊματα, και παρουςιϊζονται τα ποςοςτϊ ±SE των πειραμϊτων. Σα αποτελϋςματα δεν εύναι ςτατιςτικώσ ςημαντικϊ.

62 62 Εικόνα Γ2.3.. Φαρακτηριςτικϋσ εικϐνεσ απϐ τισ εμφανύςεισ ςε φωτογραφικϐ φιλμ των πρωτεώνών που μελετόθηκαν, μαζύ με τισ αντύςτοιχεσ τησ HSC70, οι οπούεσ χρηςιμοποιόθηκαν για την ομαλοπούηςη των αποτελεςμϊτων

63 63 Εικόνα Γ2.4. Αριςτερά: χετικϊ επύπεδα ενεργοποιημϋνησ καςπϊςησ 8, με ςημεύο αναφορϊσ τα επύπεδϊ τησ ςτα PC3. Σα κϑτταρα αφϋθηκαν να πολλαπλαςιαςτοϑν μϋχρι να καλϑψουν το 80% τησ επιφϊνειασ τρυβλύου διαμϋτρου 6mm. Ϊπειτα, λϑθηκαν με ζϋον διϊλυμα διαλυτοπούηςησ για SDS-PAGE και ηλεκτροφορόθηκαν. Ακολοϑθηςε ανοςοςτϑπωμα με ειδικϊ αντιςώματα για την υδρολυμϋνη καςπϊςη 8 και ΗSC70. τη ςυνϋχεια, τα αποτελϋςματα αναλϑθηκαν με λογιςμικϐ ανϊλυςησ εικϐνασ (ImageJ) και ϋγινε ομαλοπούηςη των επιπϋδων τησ καςπϊςησ 8, ςε ςχϋςη με τα επύπεδα τησ πρωτεϗνησ HSC70. Σα ποςοςτϊ προκϑπτουν απϐ τρύα διαφορετικϊ μεταξϑ τουσ πειρϊματα, και παρουςιϊζονται τα ποςοςτϊ ±SE των πειραμϊτων. *p<0,05 Δεξιά: χετικϊ επύπεδα ενεργοποιημϋνησ καςπϊςησ 3, με ςημεύο αναφορϊσ τα επύπεδϊ τησ ςτα PC3. Σα κϑτταρα αφϋθηκαν να πολλαπλαςιαςτοϑν μϋχρι να καλϑψουν το 80% τησ επιφϊνειασ τρυβλύου διαμϋτρου 6mm. Ϊπειτα, λϑθηκαν με ζϋον διϊλυμα διαλυτοπούηςησ για SDS-PAGE και ηλεκτροφορόθηκαν. Ακολοϑθηςε ανοςοςτϑπωμα με ειδικϊ αντιςώματα για την υδρολυμϋνη καςπϊςη 3 και ΗSC70. τη ςυνϋχεια, τα αποτελϋςματα αναλϑθηκαν με λογιςμικϐ ανϊλυςησ εικϐνασ (ImageJ) και ϋγινε ομαλοπούηςη των επιπϋδων τησ καςπϊςησ 3, ςε ςχϋςη με τα επύπεδα τησ πρωτεϗνησ HSC70. Σα ποςοςτϊ προκϑπτουν απϐ τρύα διαφορετικϊ μεταξϑ τουσ πειρϊματα, και παρουςιϊζονται τα ποςοςτϊ ±SE των πειραμϊτων. Σα αποτελϋςματα δεν εύναι ςτατιςτικώσ ςημαντικϊ.

64 Γ3.Προςδιοριςμόσ του ποςοςτού των κυττάρων ςτη φάςη S του κυτταρικού κύκλου με χρήςη ανοςοφθοριςμού Μασ ενδιϋφερε επύςησ να διερευνόςουμε αν υπϊρχει διαφορϊ ςτο ποςοςτϐ των κυττϊρων ςτη φϊςη S του κυτταρικοϑ κϑκλου, μεταξϑ των φυςιολογικών και των μεταςχηματιςμϋνων κυττϊρων (RPTP - ). Για το πεύραμα αυτϐ, χρηςιμοποιόθηκε η ουςύα BrdU, η οπούα εύναι χημικϐ ανϊλογο τησ θυμύνησ. Σο BrdU προςτύθεται ςτο θρεπτικϐ υλικϐ τησ κυτταροκαλλιϋργειασ και ενςωματώνεται ςτο γενετικϐ υλικϐ των κυττϊρων που ςυνθϋτουν DNA τη ςυγκεκριμϋνη ςτιγμό, ςτη θϋςη τησ θυμύνησ. Ϊτςι, με χρόςη αντιςωμϊτων για την ανύχνευςη του BrdU ςτο DNA των κυττϊρων, μποροϑμε ϋμμεςα να προςδιορύςουμε το ποςοςτϐ των κυττϊρων ςτη φϊςη S του κυτταρικοϑ κϑκλου. τη ςυνϋχεια παρατύθενται μερικϋσ χαρακτηριςτικϋσ εικϐνεσ απϐ τα πειρϊματα, καθώσ και τα διαγρϊμματα που προκϑπτουν απϐ τισ μετρόςεισ. 64 Εικόνα Γ3.1 Άνω αριςτερά. Πυρήνεσ των κυττάρων DU145 βαμμένοι με Hoechst. Άνω δεξιά. Υθοριςμόσ των πυρήνων μετά από 4h επώαςη με BrdU Κάτω κέντρο. ύνθεςη των δύο παραπάνω εικόνων, όπου φαίνεται το ποςοςτό των κυττάρων που φθορίζουν

65 65 Εικόνα Γ4.2 Άνω αριςτερά. Πυρήνεσ των κυττάρων DU145-RM6 βαμμένοι με Hoechst. Άνω δεξιά. Υθοριςμόσ των πυρήνων μετά από 4h επώαςη με BrdU Κάτω κέντρο. ύνθεςη των δύο παραπάνω εικόνων, όπου φαίνεται το ποςοςτό των κυττάρων που φθορίζουν

66 66 Εικόνα Γ5.3 Άνω αριςτερά. Πυρήνεσ των κυττάρων DU145 βαμμένοι με Hoechst. Άνω δεξιά. Υθοριςμόσ των πυρήνων μετά από 24h επώαςη με BrdU Κάτω κέντρο. ύνθεςη των δύο παραπάνω εικόνων, όπου φαίνεται το ποςοςτό των κυττάρων που φθορίζουν

67 67 Εικόνα Γ6.4 Άνω αριςτερά. Πυρήνεσ των κυττάρων DU145-RM6 βαμμένοι με Hoechst. Άνω δεξιά. Υθοριςμόσ των πυρήνων μετά από 24h επώαςη με BrdU Κάτω κέντρο. ύνθεςη των δύο παραπάνω εικόνων, όπου φαίνεται το ποςοςτό των κυττάρων που φθορίζουν

68 68 Εικόνα Γ3.5 Κϑτταρα DU145 και DU145-RM6 καλλιεργόθηκαν ςε πλακύδια 6 μικροκυψελύδων, με 2 ςτρογγυλϋσ καλυπτρύδεσ διαμϋτρου 10mm, ανϊ μικροκυψελύδα. Όταν καλϑφθηκε το 80% τησ επιφϊνειασ κϊθε μικροκυψελύδασ, αναρροφόθηκε το θρεπτικϐ υλικϐ και αντικαταςτϊθηκε με πλόρεσ θρεπτικϐ υλικϐ που περιεύχε επιπλϋον 20μΜ BrdU και αφϋθηκε για 4h και 24h. τη ςυνϋχεια, οι καλυπτρύδεσ αφαιρϋθηκαν και τοποθετόθηκαν ςε πλακύδια 12 μικροκυψελύδων για το υπϐλοιπο τησ διαδικαςύασ. Οι καλυπτρύδεσ εκπλϑθηκαν 2 φορϋσ με PBS, και ςτη ςυνϋχεια αφϋθηκαν ςε καθαρό μεθανϐλη για 10min, για την μονιμοπούηςη των κυττϊρων. Μετϊ απϐ εκπλϑςεισ με PBS, τα κϑτταρα αφϋθηκαν ςε 2Μ HCl για 1h. Ϊπειτα, εκπλϑθηκαν με διϊλυμα Tris-Cl 0,1M ph 8,8 για 5min. Μετϊ απϐ εκπλϑςεισ με PBS, προςτϋθηκε διϊλυμα δϋςμευςησ για 1h. Με την πϊροδο τησ ώρασ, προςτϋθηκε αντύςωμα rat anti-brdu αραύωςησ 1:1000, ςτουσ 4 ο C, για ϐλο το βρϊδυ. Σην επϐμενη μϋρα, μετϊ απϐ εκπλϑςεισ με PBS-Tween, προςτϋθηκε 2ο αντύςωμα donkey anti-rat Alexa488, αραύωςησ 1:500, για 1h, ςε θερμοκραςύα δωματύου, ςτο ςκοτϊδι. Με την πϊροδο τησ μύασ ώρασ, και μετϊ απϐ εκπλϑςεισ με PBS- Tween, προςτϋθηκε χρωςτικό Ηoechst ςε αραύωςη 1:2000 για 5min. Σϋλοσ, οι καλυπτρύδεσ μονιμοποιόθηκαν με 5λ mowiol, παρατηρόθηκαν ςε μικροςκϐπιο ανοςοφθοριςμοϑ, και προςδιορύςτηκε το ποςοςτϐ επύ τοισ εκατϐ των κυττϊρων που όταν ςτη φϊςη S του κυτταρικοϑ κϑκλου (θετικϊ για BrdU). Σα ποςοςτϊ προκϑπτουν απϐ τρύα διαφορετικϊ μεταξϑ τουσ πειρϊματα και ςτην εικϐνα φαύνονται τα ποςοςτϊ ±SE για κϊθε πεύραμα. *p<0,05

69 69 Εικόνα Γ7.6 Άνω αριςτερά. Πυρήνεσ των κυττάρων PC3 βαμμένοι με Hoechst. Άνω δεξιά. Υθοριςμόσ των πυρήνων μετά από 4h επώαςη με BrdU Κάτω κέντρο. ύνθεςη των δύο παραπάνω εικόνων, όπου φαίνεται το ποςοςτό των κυττάρων που φθορίζουν

70 70 Εικόνα Γ8.7 Άνω αριςτερά. Πυρήνεσ των κυττάρων PC3-RM4 βαμμένοι με Hoechst. Άνω δεξιά. Υθοριςμόσ των πυρήνων μετά από 4h επώαςη με BrdU Κάτω κέντρο. ύνθεςη των δύο παραπάνω εικόνων, όπου φαίνεται το ποςοςτό των κυττάρων που φθορίζουν

71 71 Εικόνα Γ9.8 Άνω αριςτερά. Πυρήνεσ των κυττάρων PC3 βαμμένοι με Hoechst. Άνω δεξιά. Υθοριςμόσ των πυρήνων μετά από 24h επώαςη με BrdU Κάτω κέντρο. ύνθεςη των δύο παραπάνω εικόνων, όπου φαίνεται το ποςοςτό των κυττάρων που φθορίζουν

72 72 Εικόνα Γ10.9 Άνω αριςτερά. Πυρήνεσ των κυττάρων PC3-RM4 βαμμένοι με Hoechst. Άνω δεξιά. Υθοριςμόσ των πυρήνων μετά από 4h επώαςη με BrdU Κάτω κέντρο. ύνθεςη των δύο παραπάνω εικόνων, όπου φαίνεται το ποςοςτό των κυττάρων που φθορίζουν

73 73 Εικόνα Γ3.10 Κϑτταρα PC3 και PC3-RM4 καλλιεργόθηκαν ςε πλακύδια 6 μικροκυψελύδων, με 2 ςτρογγυλϋσ καλυπτρύδεσ διαμϋτρου 10mm, ανϊ μικροκυψελύδα. Όταν καλϑφθηκε το 80% τησ επιφϊνειασ κϊθε μικροκυψελύδασ, αναρροφόθηκε το θρεπτικϐ υλικϐ και αντικαταςτϊθηκε με πλόρεσ θρεπτικϐ υλικϐ που περιεύχε επιπλϋον 20μΜ BrdU και αφϋθηκε για 4h και 24h. τη ςυνϋχεια, οι καλυπτρύδεσ αφαιρϋθηκαν και τοποθετόθηκαν ςε πλακύδια 12 μικροκυψελύδων για το υπϐλοιπο τησ διαδικαςύασ. Οι καλυπτρύδεσ εκπλϑθηκαν 2 φορϋσ με PBS, και ςτη ςυνϋχεια αφϋθηκαν ςε καθαρό μεθανϐλη για 10min, για την μονιμοπούηςη των κυττϊρων. Μετϊ απϐ εκπλϑςεισ με PBS, τα κϑτταρα αφϋθηκαν ςε 2Μ HCl για 1h. Ϊπειτα, εκπλϑθηκαν με διϊλυμα Tris-Cl 0,1M ph 8,8 για 5min. Μετϊ απϐ εκπλϑςεισ με PBS, προςτϋθηκε διϊλυμα δϋςμευςησ για 1h. Με την πϊροδο τησ ώρασ, προςτϋθηκε αντύςωμα rat anti-brdu αραύωςησ 1:1000, ςτουσ 4 ο C, για ϐλο το βρϊδυ. Σην επϐμενη μϋρα, μετϊ απϐ εκπλϑςεισ με PBS-Tween, προςτϋθηκε 2ο αντύςωμα donkey anti-rat Alexa488, αραύωςησ 1:500, για 1h, ςε θερμοκραςύα δωματύου, ςτο ςκοτϊδι. Με την πϊροδο τησ μύασ ώρασ, και μετϊ απϐ εκπλϑςεισ με PBS- Tween, προςτϋθηκε χρωςτικό Ηoechst ςε αραύωςη 1:2000 για 5min. Σϋλοσ, οι καλυπτρύδεσ μονιμοποιόθηκαν με 5λ mowiol, παρατηρόθηκαν ςε μικροςκϐπιο ανοςοφθοριςμοϑ, και προςδιορύςτηκε το ποςοςτϐ επύ τοισ εκατϐ των κυττϊρων που όταν ςτη φϊςη S του κυτταρικοϑ κϑκλου (θετικϊ για BrdU). Σα ποςοςτϊ προκϑπτουν απϐ τρύα διαφορετικϊ μεταξϑ τουσ πειρϊματα και ςτην εικϐνα φαύνονται τα ποςοςτϊ ±SE για κϊθε πεύραμα. *p<0,05

74 Γ4. Προςδιοριςμόσ των ςχετικών επιπέδων τησ ενεργοποιημένησ με φωςφωρυλίωςη Cdt1 Με ςκοπϐ να μελετόςουμε περαιτϋρω την ταχϑτητα του κυτταρικοϑ κϑκλου ςε κϑτταρα DU\RM6 και PC3\RM4, μελετόςαμε τα επύπεδα τησ ενεργοποιημϋνησ Cdt1, μιασ πρωτεϗνησ που ςυμμετϋχει ςτην αδειοδϐτηςη τησ αντιγραφόσ του DNA. Τψηλϐτερα επύπεδα υποδηλώνουν ταχϑτερο ρυθμϐ αντιγραφόσ του DNA. 74 Εικόνα Γ4.1.. Φαρακτηριςτικϋσ εικϐνεσ απϐ τισ εμφανύςεισ ςε φωτογραφικϐ φιλμ των πρωτεώνών που μελετόθηκαν, μαζύ με τισ αντύςτοιχεσ τησ HSC70, οι οπούεσ χρηςιμοποιόθηκαν για την ομαλοπούηςη των αποτελεςμϊτων

75 75 Εικόνα Γ4.2. Αριςτερά. χετικϊ επύπεδα ενεργοποιημϋνησ Cdt1, με ςημεύο αναφορϊσ τα επύπεδϊ τησ ςτα PC3. Σα κϑτταρα αφϋθηκαν να πολλαπλαςιαςτοϑν μϋχρι να καλϑψουν το 80% τησ επιφϊνειασ τρυβλύου διαμϋτρου 6mm. Ϊπειτα, λϑθηκαν με ζϋον διϊλυμα διαλυτοπούηςησ για SDS-PAGE και ηλεκτροφορόθηκαν. Ακολοϑθηςε ανοςοςτϑπωμα με ειδικϊ αντιςώματα για την υδρολυμϋνη καςπϊςη 8 και ΗSC70. τη ςυνϋχεια, τα αποτελϋςματα αναλϑθηκαν με λογιςμικϐ ανϊλυςησ εικϐνασ (ImageJ) και ϋγινε ομαλοπούηςη των επιπϋδων τησ καςπϊςησ 8, ςε ςχϋςη με τα επύπεδα τησ πρωτεϗνησ HSC70. Σα ποςοςτϊ προκϑπτουν απϐ τρύα διαφορετικϊ μεταξϑ τουσ πειρϊματα, και παρουςιϊζονται τα ποςοςτϊ ±SE των πειραμϊτων. *p<0,05 Δεξιά χετικϊ επύπεδα ενεργοποιημϋνησ Cdt1, με ςημεύο αναφορϊσ τα επύπεδϊ τησ ςτα PC3. Σα κϑτταρα αφϋθηκαν να πολλαπλαςιαςτοϑν μϋχρι να καλϑψουν το 80% τησ επιφϊνειασ τρυβλύου διαμϋτρου 6mm. Ϊπειτα, λϑθηκαν με ζϋον διϊλυμα διαλυτοπούηςησ για SDS-PAGE και ηλεκτροφορόθηκαν. Ακολοϑθηςε ανοςοςτϑπωμα με ειδικϊ αντιςώματα για την υδρολυμϋνη καςπϊςη 8 και ΗSC70. τη ςυνϋχεια, τα αποτελϋςματα αναλϑθηκαν με λογιςμικϐ ανϊλυςησ εικϐνασ (ImageJ) και ϋγινε ομαλοπούηςη των επιπϋδων τησ καςπϊςησ 8, ςε ςχϋςη με τα επύπεδα τησ πρωτεϗνησ HSC70. Σα ποςοςτϊ προκϑπτουν απϐ τρύα διαφορετικϊ μεταξϑ τουσ πειρϊματα, και παρουςιϊζονται τα ποςοςτϊ ±SE των πειραμϊτων. *p<0,05