Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Θετικών Επιστημών Τμήμα Βιολογίας Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών στην «Βιολογική Τεχνολογία» & Τμήμα Ιατρικής Εργαστήριο

Πανεπιστήμιο Πατρών Σχολή Θετικών Επιστημών Τμήμα Βιολογίας Μεταπτυχιακό Πρόγραμμα Σπουδών στην «Βιολογική Τεχνολογία» & Τμήμα Ιατρικής Εργαστήριο Αιματολογίας-Αιμοδοσίας «Η έκφραση του ογκογονιδίου ets-2 σε υποπληθυσµούς Τ λεµφοκυττάρων και ο ρόλος του στην µεταγραφή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 και του ιού HIV-1» Παναγούλιας Ιωάννης Α.Μ. 361 Πάτρα,Οκτώβριος 2007 1

2 Αφιερωμένο στον Αλέξανδρο

Η παρούσα ερευνητική εργασία εκπονήθηκε στο εργαστήριο Αιματολογίας-Αιμοδοσίας του τμήματος Ιατρικής υπό την επίβλεψη της Αναπληρώτριας Καθηγήτριας κα. Αθανασίας Μουζάκη. Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερµά την επιβλέπουσα καθηγήτριά µου κ. Μουζάκη για τη δυνατότητα που µου έδωσε να ενταχθώ στην ερευνητική της οµάδα τα τρία τελευταία χρόνια, για το χρόνο που µου αφιέρωσε και την ουσιαστική βοήθεια που µου παρείχε κάθε φορά που τη χρειάστηκα. Επίσης, την ευχαριστώ για την κατανόηση που έδειξε σε όλες τις δυσκολίες µου, τη συµπαράστασή της, την αισιοδοξία µε την οποία πάντα αντιµετώπιζε τα προβλήµατα του εργαστηρίου και την προτροπή και ενθάρρυνσή της για τη µελλοντική µου πορεία. εν θα µπορούσα ασφαλώς να παραλείψω την ουσιαστική βοήθεια της φίλης µου, συναδέλφου και συνεργάτη µου Παναγιώτας Σακελλαράκη η οποία µε στήριξε επιστηµονικά και ψυχολογικά τα δύο τελευταία χρόνια. Την ευχαριστώ θερµά για τις ζωηρές µας συζητήσεις. Θα πρέπει να εκφράσω τις θερµές ευχαριστίες µου και στα υπόλοιπα µέλη του εργαστηρίου για την άψογη συνεργασία που έχουµε και για το όµορφο κλίµα που δηµιουργούν. Θα ήθελα να ευχαριστήσω επίσης τα δύο υπόλοιπα µέλη της τριµελής µου επιτροπής, τον κ. Γώγο και την κα. Μ.Κεφαλιακού για την στήριξή τους σε αυτή την εργασία. Ιδιαίτερες ευχαριστίες στην κα. Μ.Κεφαλιακού, για το ενδιαφέρον της και που για αρκετά χρόνια τώρα µε στηρίζει ψυχολογικά και επιστηµονικά. Τέλος θέλω να ευχαριστήσω τους γονείς µου και την αδερφή µου που έξι χρόνια τώρα που βρίσκοµαι στην Πάτρα µε στήριξαν ηθικά, ψυχολογικά και οικονοµικά. Χωρίς την βοήθειά τους δεν θα έφτανα σήµερα στο επίπεδο που βρίσκοµαι. Σας ευχαριστώ! 3

4

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Εισαγωγή 7 Ανοσοποιητικό Σύστηµα... 7 Α. Λεµφοκύτταρα... 12 i. Βοηθητικά Τ λεµφοκύτταρα (CD4 + )... 14 ii. Παρθένα (naïve) Τ λεµφοκύτταρα... 15 iii.μνηµονικά (memory) T λεµφοκύτταρα... 16 Β. Μηχανισµοί ενεργοποίησης των Τ λεµφοκυττάρα... 16 Κυτταροκίνες... 17 Ιντερλευκίνες... 19 Μεταγραφική ρύθµιση της ιντερλευκίνης-2 (IL-2)... 19 Γ. Ο ρόλος της Κυκλοσπορίνης Α (CsA) στην µεταγραφή του γονιδίου ιντερλευκίνης-2... 25. Human Immunodeficiency Virus type 1 (HIV-1)... 27 Κοινός τρόπος ρύθµισης της µεταγραφής του ιού HIV-1 και του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2... 32 E. Οικογένεια µεταγραφικών Παραγόντων ETS... 36 οµικά χαρακτηριστικά της οικογένειας... 37 Το ογκογονίδιο ets-2... 38 Υλικά και Μέθοδοι 43 Κύτταρα... 43 Αποµόνωση εµπύρηνων κυττάρων από αίµα... 45 Κατασκευή κλώνων CD4 + CD45 RO + κυττάρων... 45 ιαδικασία πλήρους ανοσοφαινοτύπησης επιφάνειας... 46 Αποµόνωση RNA από κύτταρα... 49 Κατασκευή cdna, RT-PCR... 50 Αποµόνωση πρωτεϊνών από τα κύτταρα... 51 Western blot... 52 Πλασµίδια... 54 Ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα αγαρόζης... 55 ιαµόλυνση (transfenction) Jurkat κυττάρων... 56 CAT assays... 57 Μέθοδος ανοσοκατακρίµνησης χρωµατίνης... 59 Αποτελέσµατα 66 Παρουσία IL-2 και ets-2 σε ενεργοποιηµένα και µη ενεργοποιηµένα κύτταρα... 66 Έκφραση του παράγοντα ets-2 και της ιντερλευκίνης 2 σε υποκατηγορίες Τ λεµφοκυττάρων... 68 Ποσοτικοποίηση της σχέσης ιντερλευκίνης-2 και ets-2 σε φυσιολογικά Τ λεµφοκύτταρα... 70 Western blot για την έκφραση της πρωτεΐνης ets-2... 71 5

Έκφραση του παράγοντα ets-2 σε παρθένα Τ λεµφοκύτταρα και σταθεροποίηση του παράγοντα µέσω της κυκλοσπορίνης Α (CsA)... 72 Έκφραση του παράγοντα ets-2 στην κυτταρική σειρά Jurkat και σταθεροποίηση του παράγοντα µέσω της κυκλοσπορίνης Α (CsA)... 74 Πείραµα ανοσοκατακρίµνησης χρωµατίνης (ChIP)... 76 Κατασταλτική δράση του παράγοντα ets-2 µέσω των πειραµάτων CAT assay... 77 Συζήτηση 83 Βιβλιογραφία 85 6

ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΑΝΟΣΟΠΟΙΗΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ 1,2 Το ανοσοποιητικό σύστηµα είναι από τα πιο πολύπλοκα συστήµατα του ανθρώπινου οργανισµού. Η φυσιολογική λειτουργία του ανοσοποιητικού συστήµατος έγκειται στην άµυνα του οργανισµού ενάντια στους παθογόνους µικροοργανισµούς. Οι περιπτώσεις αυτοάνοσων νοσηµάτων και αλλεργιών οφείλονται στην ενεργοποίηση του συστήµατος έναντι συστατικών του ίδιου του οργανισµού καθώς και ενάντια σε µη παθογόνους εξωτερικούς παράγοντες. Η ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήµατος, φυσιολογικά, συµβαίνει σε περιπτώσεις όπου ο οργανισµός εκτίθεται σε ξένα σώµατα όπως είναι τα µικρόβια και τα µακροµόρια, όπως πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες. Η άµυνα ενάντια στα µικρόβια επιτυγχάνεται αρχικά µέσω της έµφυτης ανοσίας (innate immunity) και αργότερα µέσω της προσαρµοζόµενης ανοσίας (adaptive immunity). Βασικά συστατικά της έµφυτης ανοσίας, που αποτελεί την πρώτη γραµµή άµυνας του οργανισµού, είναι: 1) φυσικά και χηµικά εµπόδια που αποτρέπουν την είσοδο του µολυσµατικού παράγοντα στον οργανισµό, όπως το επιθήλιο και οι αντιµικροβιακές ουσίες που εκκρίνονται από αυτό, 2) τα φαγοκυτταρικά κύτταρα, όπως ουδετερόφιλα και µακροφάγα, καθώς και τα κύτταρα φυσικοί δολοφόνοι (Natural killers-νκ cells), που επιτήθονται στους µολυσµατικούς παράγοντες που εισέρχονται, τελικά στον οργανισµό (χωρίς να παρουσιάζουν κάποια ειδικότητα ως προς το είδος του αντιγόνου) 3) πρωτεΐνες του αίµατος, εδώ περιλαµβάνονται τα µέλη του συµπλόκου του συµπληρώµατος και άλλοι παράγοντες που συµµετέχουν στο σχηµατισµό της φλεγµονής, 4) πρωτεΐνες που καλούνται κυτταροκίνες, οι οποίες ρυθµίζουν και συντονίζουν πολλές δραστηριότητες των κυττάρων που συµµετέχουν στην έµφυτη και στην προσαρµοζόµενη ανοσία. Οι µηχανισµοί της έµφυτης ανοσίας είναι ειδικοί για κοινές δοµές µεταξύ µικροοργανισµών και άλλων παθογόνων παραγόντων καθώς στην έµφυτη ανοσία δεν υπάρχει εξειδίκευση στην αναγνώριση µεταξύ των διαφόρων αντιγόνων. 7

Σε αντίθεση µε την έµφυτη ανοσία, υπάρχουν και άλλα είδη ανοσοαπόκρισης που διεγείρονται από την έκθεση του οργανισµού σε παθογόνους παράγοντες αυξάνοντας παράλληλα την αποτελεσµατικότητα της απόκρισης σε κάθε επιτυχηµένη έκθεση του οργανισµού στο ίδιο µικρόβιο. Αυτού του είδους οι ανοσοαποκρίσεις αποτελούν την προσαρµοζόµενη ανοσία. Τα βασικά χαρακτηριστικά αυτής είναι, η ικανότητα διάκρισης και εξειδίκευσης σε κάθε µικρόβιο καθώς και η ικανότητα να «θυµάται» και να ανταποκρίνεται έντονα σε επαναλαµβανόµενες µολύνσεις από τον ίδιο παθογόνο παράγοντα. Άλλο χαρακτηριστικό της προσαρµοζόµενης ανοσίας είναι η ικανότητα αντίδρασης µε µεγάλο αριθµό παθογόνων αλλά και µη παθογόνων ουσιών. Η προσαρµοζόµενη ανοσία χαρακτηρίζεται συχνά και ως ειδική ανοσία καθώς παρουσιάζει την ιδιότητα της πλήρης διάκρισης µεταξύ µορίων και µικροβίων ακόµα και όταν αυτά παρουσιάζουν πολλές οµοιότητες µεταξύ τους. Τα «όργανα δράσης» αυτού του είδους της ανοσοαπόκρισης, είναι τα λεµφοκύτταρα (T και Β λεµφοκύτταρα) και τα διάφορα προϊόντα τους. Εικόνα 1: ράση έµφυτης και προσαρµοζόµενης ανοσίας. Οι µηχανισµοί της έµφυτης ανοσίας εξυπηρετούν την πρώτη γραµµή άµυνας ενάντια στην µόλυνση. Η ενεργοποίηση της προσαρµοζόµενης ανοσίας οδηγεί στην παραγωγή αντισωµάτων, ειδικά για το συγκεκριµένο αντιγόνο. Η διάρκεια που είναι ενεργό το σύστηµα της έµφυτης ανοσίας εξαρτάται από το είδος της µόλυνσης 1. 8

Το ανοσοποιητικό σύστηµα των σπονδυλωτών αποτελείται από µια σειρά οργάνων, ιστών και κυττάρων που απλώνονται σε διάφορες περιοχές του σώµατος. Όλα τα κύτταρα τα οποία σχετίζονται µε το ανοσοποιητικό σύστηµα προέρχονται από πολυδύναµα πρόδροµα κύτταρα (stem cells), που διαφοροποιούνται µέσω δύο κύριων κλάδων διαφοροποίησης : Του λεµφοκυτταρικού κλάδου, από τον οποίο προέρχονται τα λεµφοκύτταρα και, Του µυελωµατικού κλάδου από όπου παράγονται τα φαγοκύτταρα και τα λοιπά κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήµατος. Εικόνα 2: Λεµφοκυτταρικός και µυελοκυτταρικός κλάδος διαφοροποίησης Τα κύτταρα τα οποία σχετίζονται µε την ανοσοαπόκριση είναι τα λεµφοκύτταρα (T και Β), τα µονοκύτταρα, τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα (APC) και τα πολυµορφοπύρηνα κοκκιοκύτταρα (ουδετερόφιλα, βασεόφιλα και ηωζινόφιλα). 9

Τα κύτταρα που εµπλέκονται στην ανοσολογική απόκριση είναι οργανωµένα σε ιστούς και όργανα ώστε να ασκούν τις λειτουργίες τους αποτελεσµατικότερα. Αυτό το σύνολο ιστών και οργάνων αναφέρεται ως λεµφικό σύστηµα το οποίο διακρίνεται σε πρωτογενείς και δευτερογενείς λεµφικούς ιστούς και όργανα. Στα πρωτογενή λεµφικά όργανα ανήκουν τα όργανα τα οποία σχετίζονται µε την ανάπτυξη των λεµφοκυττάρων. Εδώ ανήκει ο δίλοβος θύµος αδένας, στον οποίο τα αρχέγονα κύτταρα (stem cells) της λεµφοειδούς σειράς, πολλαπλασιάζονται και διαφοροποιούνται σε λειτουργικά T λεµφοκύτταρα, ενώ τα Β λεµφοκύτταρα διαφοροποιούνται στο ήπαρ του εµβρύου και στον µυελό των οστών των µεταεµβρυικών ατόµων. Σε αυτά τα λεµφικά όργανα τα λεµφοκύτταρα αποκτούν τους ειδικούς αντιγονικούς τους υποδοχείς που θα τα κάνουν ικανά να αντεπεξέλθουν σε ένα µεγάλο αριθµό αντιγόνων κατά την διάρκεια ζωής του ατόµου. Επίσης σε αυτά τα όργανα τα λεµφοκύτταρα υφίστανται διαδικασίες επιλογής ώστε να αποκτήσουν ανοχή στα αυτοαντιγόνα, δηλαδή στα διάφορα συστατικά (πρωτεΐνες κ.α) του ίδιου του οργανισµού. Στα δευτερογενή λεµφικά όργανα ανήκουν ο σπλήνας, ο οποίος είναι υπεύθυνος για τα αντιγόνα που µεταφέρονται µε την ροή του αίµατος, τα λεµφογάγγλια, που προστατεύουν τον οργανισµό από αντιγόνα τα οποία µεταφέρονται από το δέρµα ή από εσωτερικές επιφάνειες, και τέλος ιστοί που σχετίζονται µε βλεννογόνες επιφάνειες (MALT, Mucosa Associated Lymphoid Tissue). Στους τελευταίους ανήκουν οι αµυγδαλές και οι πλάκες του Peyer στον ειλεό. Τα λεµφοκύτταρα µεταναστεύουν από τα πρωτογενή λεµφικά όργανα στα δευτερογενή, τα οποία παρέχουν το κατάλληλο περιβάλλον για την αλληλεπίδραση των λεµφοκυττάρων µε διάφορα αντιγόνα και άλλα κύτταρα. Έτσι τα λεµφοκύτταρα µπορούν και έρχονται σε επαφή µε τα διάφορα αντιγόνα µε αποτέλεσµα να ενεργοποιούνται και να εκκρίνουν αντισώµατα στην κυκλοφορία. Στην εικόνα 3 παρουσιάζεται η θέση των πρωτογενών και δευτερογενών λεµφικών οργάνων και ιστών στο ανθρώπινο σώµα. 10

Εικόνα 3: Πρωτογενή και δευτερογενή λεµφικά όργανα και ιστοί 11

Α. ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΑ 1,2 Όπως αναφέραµε και πιο πάνω τα Β και T λεµφοκύτταρα προέρχονται από τον λεµφοκυτταρικό κλάδο διαφοροποίησης, από τα αρχέγονα stem cells. Τα λεµφοκύτταρα είναι τα κύτταρα τα οποία αναγνωρίζουν ειδικά τα αντιγόνα και ανταποκρίνονται ενάντια σε αυτά και για αυτό το λόγο αποτελούν τους διαµεσολαβητές της χυµικής και κυτταρικής ανοσίας. Ως χυµική ανοσία αναφέρεται ο σχηµατισµός αντισωµάτων που κυκλοφορούν στο αίµα και είναι ικανά να προσβάλλουν έναν παράγοντα ο οποίος εισβάλλει στο σώµα. Ο τύπος αυτός ανοσίας σχετίζεται µε την δραστηριότητα των Β λεµφοκυττάρων. Η κυτταρική ανοσία, από την άλλη, επιτυγχάνεται µε το σχηµατισµό µεγάλων αριθµών εξειδικευµένων κυττάρων, και συγκεκριµένα Τ λεµφοκυττάρων, που ευαισθητοποιούνται ειδικά προς τον ξένο παράγοντα. Αναγνωρίζουµε δύο τύπους λεµφοκυττάρων οι οποίοι διαφέρουν ως προς τον τρόπο που αναγνωρίζουν τα αντιγόνα καθώς και ως προς την λειτουργία τους. Έτσι έχουµε τα Β λεµφοκύτταρα, (το Β προέρχεται από τo θύλακα-βursa του Fabricius όργανο των πτηνών στο οποίο βρέθηκαν ώριµα τέτοια κύτταρα, τα οποία έχουν την ικανότητα να παράγουν αντισώµατα) τα οποία αναγνωρίζουν µεµβρανικά και εξωκυτταρικά αντιγόνα και διαφοροποιούνται σε πλασµοκύτταρα λειτουργώντας σαν διαµεσολαβητές της χυµικής ανοσίας. Από την άλλη, τα T λεµφοκύτταρα (το T προέρχεται από την λέξη Τhymusθύµος αδένας) αναγνωρίζουν τα ενδοκυτταρικά αντιγόνα των µικροβίων και ο ρόλος τους είναι η καταστροφή των µικροβίων ή και ολόκληρων των µολυσµένων κυττάρων. Οι αντιγονικοί υποδοχείς τους είναι µεµβρανικά µόρια που µοιάζουν δοµικά µε τα αντισώµατα που παράγονται από τα Β λεµφοκύτταρα. Τα Τ λεµφοκύτταρα παρουσιάζουν µια περιοριστική ειδικότητα καθώς αναγνωρίζουν µόνο πεπτίδια τα οποία βρίσκονται προσκολληµένα σε πρωτεΐνες-ξενιστές οι οποίες κωδικοποιούνται από γονίδια του κύριου συµπλόκου ιστοσυµβατότητας (MHC- Major Hystocompability Complex) και είναι τοποθετηµένες στις επιφάνειες άλλων κυττάρων. Αυτό έχει ως αποτέλεσµα τα Τ λεµφοκύτταρα να αναγνωρίζουν και να ανταποκρίνονται σε αντιγόνα τα οποία σχετίζονται µε την κυτταρική επιφάνεια και όχι µε διαλυτά αντιγόνα. 12

Στην παρούσα ερευνητική εργασία θα ασχοληθούµε µε γεγονότα τα οποία σχετίζονται µε την λειτουργία και συµπεριφορά των Τ λεµφοκυττάρων και για αυτό το λόγω θα επεκτείνουµε στον τρόπο δράσης τους. Έτσι, αναγνωρίζονται δύο κατηγορίες T λεµφοκυττάρων, τα T βοηθητικά ή CD4 λεµφοκύτταρα (χαρακτηρίζονται από την έκφραση του συγκεκριµένου υποδοχέα µε βάση τον οποίο αναγνωρίζονται) και τα T κυτταροτοξικά ή CD8 λεµφοκύτταρα (εκφράζουν τον συγκεκριµένο υποδοχέα). O διαχωρισµός αυτός οφείλεται σε λειτουργικές διαφορές µεταξύ των δύο αυτών οµάδων που θα αναλύσουµε παρακάτω. Εικόνα 4 : Υποδοχέας CD4 των βοηθητικών Τ λεµφοκυττάρων (του MHC II) και υποδοχέας CD8 των κυτταροτοξικών T λεµφοκυττάρων (του MHC I) 1 Τα βοηθητικά T λεµφοκύτταρα, σε απόκριση στην αντιγονική διέγερση, εκκρίνουν κυτταροκίνες, ο ρόλος των οποίων είναι η διέγερση του πολλαπλασιασµού και της διαφοροποίησης των T κυττάρων καθώς και άλλων κυττάρων που συµµετέχουν στην διαδικασία της ανοσοαπόκρισης, όπως των Β λεµφοκυττάρων, των µακροφάγων και άλλων λευκοκυττάρων. Ο ρόλος των κυτταροτοξικών Τ κυττάρων είναι η θανάτωση µολυσµένων κυττάρων που παράγουν αντιγόνα. Πρόσφατα έχει αναγνωριστεί άλλη µία οµάδα T κυττάρων τα οποία καλούνται ρυθµιστικά T λεµφοκύτταρα (Τ regulatory cells) ο ρόλος των οποίων δεν έχει ακόµα διευκρινιστεί πλήρως αλλά σχετίζεται µε την αναστολή των ανοσοαποκρίσεων. Τα κύτταρα αυτά χαρακτηρίζονται µε βάση τον επιφανειακό δείκτη CD25 και του ενδοκυτταρικού µορίου FoxP3. Τόσο τα Β όσο και τα T λεµφοκύτταρα φέρουν αντιγονικούς υποδοχείς οι οποίοι είναι διαφορετικοί για κάθε κλώνο λεµφοκυττάρων και έτσι αναγνωρίζουν διαφορετικά αντιγόνα. Κάθε µέλος ενός κλώνου παράγει τους ίδιους αντιγονικούς 13

υποδοχείς οι οποίοι διαφέρουν από τους υποδοχείς µελών που ανήκουν σε διαφορετικούς κλώνους. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τους υποδοχείς αυτούς προέρχονται από τον ανασυνδυασµό του DNA κατά την διάρκεια του σχηµατισµού των κυττάρων αυτών. i.βοηθητικά Τ λεµφοκύτταρα (CD4 + ) 1,2 Τα βοηθητικά T λεµφοκύτταρα (T H -T helper cells) διακρίνονται σε δύο κατηγορίες ανάλογα µε τον τύπο των κυτταροκινών που εκκρίνουν. Τα T H1 λεµφοκύτταρα εκκρίνουν τις κυτταροκίνες ιντρφερόνη-γ (INF-γ), τον παράγοντα νέκρωσης όγκων β (Tumor necrosis factor-tnf-β) και την ιντερλευκίνη-2 (IL-2) 3. Τα κύτταρα αυτά εµπλέκονται κυρίως στις αντιδράσεις φλεγµονής. Τα T H2 λεµφοκύτταρα παράγουν τις κυτταροκίνες IL-4 και IL-5 ενώ συχνά εκκρίνουν και τις IL-6, IL-9, IL-10 και IL-13 3. Οι κυτταροκίνες αυτές σχετίζονται µε την ρύθµιση της παραγωγής αντισωµάτων ενώ συµµετέχουν και στις αλλεργικές αποκρίσεις. Τα T H2 λεµφοκύτταρα ενθαρρύνουν την παραγωγή αντισωµάτων και κυρίως των IgE. Οι δύο αυτές κατηγορίες των βοηθητικών T λεµφοκυττάρων παρουσιάζουν µία ανταγωνιστική δράση καθώς οι κυτταροκίνες που εκκρίνει η µία κατηγορία των T H κυττάρων δρουν ανασταλτικά στην έκκριση των κυτταροκινών της άλλης κατηγορίας κυττάρων. Τα CD4 + T-κύτταρα παίζουν σηµαντικό ρόλο στην υγιή ανοσοαπόκριση και ο ρόλος τους είναι κεντρικός στην παθογένεση των αυτοάνοσων νοσηµάτων. 14

Εικόνα 5: Παραγωγή κυτταροκινών από τα βοηθητικά Τ λεµφοκύτταρα ii. Παρθένα (naïve) T λεµφοκύτταρα 1,2 Τα παρθένα (naïve) T λεµφοκύτταρα είναι λεµφοκύτταρα τα οποία έχουν περάσει την διαδικασία ωρίµανσης στο θύµο αδένα, εξέρχονται από αυτόν στην κυκλοφορία αλλά δεν έχουν ενεργοποιηθεί καθώς δεν έχουν «συναντήσει» κάποιο αντιγόνο. Όταν τα παρθένα T λεµφοκύτταρα ενεργοποιηθούν από κάποιο αντιγόνο τότε διαφοροποιούνται σε λειτουργικά T βοηθητικά λεµφοκύτταρα. Το είδος αυτό των κυττάρων φέρει συγκεκριµένους δείκτες επιφανείας καθώς και διαφορετικό πρότυπο επανακυκλοφορίας από αυτό των ενεργοποιηµένων κυττάρων. Τα περισσότερα ανθρώπινα παρθένα T λεµφοκύτταρα εκφράζουν µία ισοµορφή ενός επιφανειακού µορίου 200kD το οποίο ονοµάζεται CD45, που περιέχει ένα τµήµα που κωδικοποιείται από ένα εξόνιο που έχει χαρακτηριστεί µε το γράµµα Α. Επειδή αυτά τα κύτταρα µπορούν να αναγνωριστούν αφού αντιδρούν µε αντισώµατα ειδικά για αυτό το τµήµα που κωδικοποιείται από το εξόνιο Α καλούνται CD45RA (RA-restricted A) κύτταρα. Η αναγνώριση των κυττάρων αυτών γίνεται µε βάση αυτόν τον δείκτη. 15

iii.μνηµονικά (memory) Τ λεµφοκύτταρα 1,2 Τα µνηµονικά (memory) T λεµφοκύτταρα είναι ενεργοποιηµένα λεµφοκύτταρα τα οποία έχουν αναγνωρίσει ένα αντιγόνο και έχουν ενεργοποιηθεί και παραµένουν στον οργανισµό και µετά το πέρας της µόλυνσης. Όταν ο οργανισµός συναντήσει το ίδιο αντιγόνο τότε τα µνηµονικά κύτταρα δρουν πιο γρήγορα εναντίον του, από ότι τα παρθένα T λεµφοκύτταρα 4. Η κυτταρική βάση της «µνήµης» στηρίζεται στη συλλεκτική εξάπλωση στον οργανισµό κλώνων αντιγονοειδικών λεµφοκυττάρων 5. Όσον αφορά τους υποδοχείς τους, σε σύγκριση µε τα παρθένα T λεµφοκύτταρα, τα µνηµονικά (memory), εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα µορίων τα οποία σχετίζονται µε την προσκόλληση, όπως ιντεγκρίνες και το µόριο CD44, τα οποία προωθούν την µετανάστευση των µνηµονικών προς την περιοχή που έχει εµφανιστεί κάποια µόλυνση. Σε αντίθεση µε τα παρθένα, τα µνηµονικά T λεµφοκύτταρα εκφράζουν µία ισοµορφή του CD45 µορίου 180kD αφού το m-rna του εξονίου Α έχει υποστεί διαφορετική ωρίµανση. Αυτά καλούνται CD45RO κύτταρα και µε βάση τον δείκτη αυτόν αναγνωρίζονται. Β. ΜΗΧΑΝΙΣΜΟΙ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗΣ ΤΩΝ Τ ΛΕΜΦΟΚΥΤΤΑΡΩΝ 1,2 Τα Τ λεµφοκύτταρα ωριµάζουν, αποκτούν τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τους και µαθαίνουν την έννοια του «ιδίου» στον θύµο αδένα. Εκεί γίνεται η επιλογή των ώριµων λεµφοκυττάρων τα οποία θα επιτραπεί να κυκλοφορήσουν στην περιφέρεια και στους ιστούς των λεµφικών οργάνων τα οποία αναφέραµε παραπάνω. Η λειτουργική σηµασία των Τ λεµφοκυττάρων γίνεται εµφανής µετά την ενεργοποίησή τους που συνοδεύεται από την επαγωγή έκφρασης µίας σειράς γονιδίων, µε πιο χαρακτηριστικά τα γονίδια των κυτταροκινών και των υποδοχέων τους. Μία σηµαντική κυτταροκίνη η οποία έχει αποτελέσει αντικείµενο έντονης έρευνας, είναι η λεµφοτροπική κυτταροκίνη ιντερλευκίνη-2 (IL-2), στην οπoία θα αναφερθούµε στην συνέχεια. 16

ΚΥΤΤΑΡΟΚΙΝΕΣ 1,2 Οι κυτταροκίνες (cytokines) είναι µικρού µοριακού βάρους διαλυτές πρωτεΐνες ή γλυκοπρωτεΐνες που παράγονται από ποικιλία κυττάρων και µπορούν να αλλάξουν την συµπεριφορά του ίδιου του κυττάρου που τις εκκρίνει, καθώς και άλλων κυττάρων. Η ουσιαστική λειτουργία των κυτταροκινών είναι ο συντονισµός τις λειτουργίας πολλών διαφορετικών κυττάρων που συµµετέχουν στην ανοσολογική αντίδραση. Εµπλέκονται στην επικοινωνία µεταξύ των κυττάρων κατά την διάρκεια της ανοσοαπόκρισης. Κάποιες από τις πιο κοινές κυτταροκίνες είναι οι ιντερλευκίνες, οι ιντερφερόνες, οι παράγοντες νέκρωσης των όγκων (TNF-Tumor Necrosis Factor), οι αυξητικοί παράγοντες (GF-Growth Factor), οι παράγοντες διέγερσης αποικιών (CSF- Colony Stimulation Factor) και οι χηµειοκίνες. Τα µονοκύτταρα/φαγοκύτταρα και τα T λεµφοκύτταρα, ειδικότερα τα βοηθητικά T λεµφοκύτταρα, αποτελούν τις κύριες κατηγορίες κυττάρων που παράγουν κυτταροκίνες. Ο τρόπος δράσης των κυτταροκινών διακρίνεται σε αυτοκρινή κατά τον οποίο οι κυτταροκίνες προσδένονται σε υποδοχείς του ίδιου του κυττάρου που τις εκκρίνει, σε παρακρινείς όπου προσδένονται σε υποδοχείς κυττάρων-στόχων που βρίσκονται κοντά στο κύτταρο το οποίο τις εκκρίνει, και τέλος ο ενδοκρινής στον οποίο οι κυτταροκίνες προσδένονται σε υποδοχείς κυττάρων τα οποία βρίσκονται µακριά από το κύτταρο το οποίο τις εκκρίνει. Οι κυτταροκίνες προσδένονται σε ειδικούς υποδοχείς οι οποίοι βρίσκονται προσδεδεµένοι στην επιφάνεια των κυττάρων. Οι κυτταροπλασµατικές περιοχές των υποµονάδων από τις οποίες αποτελούνται αυτοί οι υποδοχείς αλληλεπιδρούν κατά τέτοιο τρόπο που οδηγεί σε µία σειρά µεταβίβασης µηνυµάτων στο εσωτερικό του κυττάρου. Στην πιο απλή περίπτωση ένας υποδοχέας σχηµατίζει ένα οµοδιµερές όταν ενωθεί µε µία κυτταροκίνη. Αυτοί οι υποδοχείς στην συνέχεια συνεργάζονται µε µία οµάδα µορίων που ονοµάζονται Jak κινάσες. Με την πρόσδεση της κυτταροκίνης στον υποδοχέας της προκαλείται ενεργοποίηση αυτού. Ο ενεργοποιηµένος υποδοχέας µε την σειρά του φωσφορυλιώνει την Jak κινάση µε αποτέλεσµα την ενεργοποίησή της. Με αυτό τον τρόπο οι κινάσες συµβάλλουν στην σύνδεση του σήµατος που φέρουν οι κυτταροκίνες µε την µεταµεταφραστική τροποποίηση (φωσφωρυλίωση) µιας σειράς µορίων-πρωτεϊνών του κυττάρου που συµβάλλουν στην µεταφορά του 17

σήµατος της κυτταροκίνης στον πυρήνα. Η διαδικασία αυτή είναι γνωστή ως µεταγωγή σήµατος (εικόνα 6). Τέτοιες πρωτεΐνες µπορούν να δρουν απ ευθείας στο DNA του κυττάρου, κάτι που µπορεί να οδηγήσει σε µία σειρά αλλαγών στην συµπεριφορά του (πολλαπλασιασµός, διαφοροποίηση, κυτταρική απόπτωση κ.α). Η έκκριση και δράση των κυτταροκινών ελέγχεται από διάφορους ρυθµιστικούς παράγοντες που δρουν είτε στο επίπεδο του DNA είτε στο επίπεδο της πρωτεΐνης. Εικόνα 6 : Εδώ εκτίθεται ένα απλό µοντέλο ενεργοποίησης ενός κυττάρου από µία κυτταροκίνη. Με την πρόσδεση της κυτταροκίνης στον υποδοχέα της στο κύτταρο επάγει διµερισµό ή πολυµερισµό των πολυπεπτιδίων του υποδοχέα, στην επιφάνεια του κυττάρου, µε αποτέλεσµα την ενεργοποίηση των ενδοκυτταρικών οδών σηµατοδότησης και ως επακόλουθο την παραγωγή ενεργών µεταγραφικών παραγόντων που εισέρχονται στον πυρήνα και συνδέονται σε συγκεκριµένες αλληλουχίες επηρεάζοντας την έκφραση ενός γονιδίου 2. 18

Ιντερλευκίνες 1 Όπως έχουµε είδη αναφέρει µία κατηγορία κυτταροκινών είναι οι ιντερλευκίνες. Οι ιντερλευκίνες συµβάλλουν στην επικοινωνία µεταξύ των λευκοκυττάρων. Μέχρι σήµερα έχουν αναγνωριστεί 18 ιντερλευκίνες από τις οποίες οι IL-1, IL-2, IL-4, IL-6 και IL-10 συµµετέχουν στην ρύθµιση της ανοσολογικής απάντησης. Μεταγραφική ρύθµιση της Ιντερλευκίνης-2 (IL-2) Η ιντερλευκίνη-2 είναι µια κυτταροκίνη η οποία εκκρίνεται κυρίως από τα µνηµονικά Τ λεµφοκύτταρα, και είναι η µοναδική κυτταροκίνη που εκφράζουν τα παρθενικά Τ λεµφοκύτταρα όταν αυτά ενεργοποιηθούν 6. Όταν τα παρθένα T λεµφοκύτταρα ενεργοποιηθούν, αφού συναντήσουν ένα αντιγόνο, τότε παρατηρείται έκφραση της ιντερλευκίνης-2 καθώς και του µεµβρανικού της υποδοχέα (IL-2 receptor, IL-2R). Τον υποδοχέα της ιντερλευκίνης-2 (IL-2R) εκφράζουν και άλλα κύτταρα εκτός από τα CD4 + όπως τα κυτταροτοξικά (CD8 + ) Τ-λεµφοκύτταρα, τα Β- λεµφοκύτταρα και τα κύτταρα φυσικοί δολοφόνοι (Natural Killer cells-νκ cells). Η έκφραση της ιντερλευκίνης-2 έχει σαν αποτέλεσµα την έναρξη της διαφοροποίησης και πολλαπλασιασµού του T λεµφοκυττάρου που τον εκφράζει (αυτοκρινής τρόπος δράσης) καθώς και των άλλων κυττάρων που φέρουν τον υποδοχέα IL-2R (παρακρινής και ενδοκρινείς τρόπος δράσης). Όταν η IL-2 δεθεί στον υποδοχέα της στα Β λεµφοκύτταρα τότε αυτά επάγονται για παραγωγή αντισωµάτων. Ένα µοντέλο ενεργοποίησης της µεταγραφής του γονιδίου της IL-2 µετά από ενεργοποίηση των Τ λεµφοκυττάρων δίνεται στην εικονα 8. Εικόνα 7 :Τριτοταγής δοµή της IL-2 Η έκφραση της ιντερλευκίνης-2 ελέγχεται κυρίως στο µεταγραφικό επίπεδο. Ο υποκινητής του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 φέρει πολλές θέσεις πρόσδεσης για διάφορους µεταγραφικούς παράγοντες οι οποίοι δένουν σε cis στοιχεία του 19

υποκινητή (ΑΡ-1, NF-kβ, Oct-1, NFAT καθώς και cyclosporin A-CsA) 7-23. Οι µεταγραφικοί παράγοντες είναι πρωτεΐνες που δένουν στο DNA και έχουν δράση επαγωγική ή κατασταλτική στην διαδικασία της µεταγραφής. Κοµβικό ρόλο στην µεταγωγή των σηµάτων από την επιφάνεια του κυττάρου στον πυρήνα 24 παίζει η ενδοκυτταρική αύξηση των ιόντων ασβεστίου (Ca +2 ), που οδηγεί στην αύξηση της ενεργότητας της φωσφατάσης καλσινευρίνης 25. Η καλσινευρίνη αποφωσφορυλιώνει αµινοξικά κατάλοιπα σερίνης/θρεονίνης σε ένα µεγάλο αριθµό µεταγραφικών παραγόντων, όπως ο NFAT (Nuclear Factor of Activated T cells), που παίζει σηµαντικό ρόλο στην ενεργοποίηση του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2. Ο NFAT παίζει ρόλο και στον µεταγραφικό έλεγχο άλλων γονιδίων κυτταροκινών όπως των ιντερλευκινών 3,4,12, φλεγµονωδών διαµεσολαβητών (TNF-alpha) και αυξητικών παραγόντων (GMCSF). Εικόνα 8: Η µεταγωγή σήµατος µέσω του TCR ενεργοποιεί (a) το µονοπάτι ασβέστιο/calcineurin/nfat και (b) το µονοπάτι MARK που µε την σειρά του ενεργοποιεί τις κινάσες ERK JNK. Η ενεργοποίηση του TCR αυξάνει την ενεργότητα 20

των Scr πρωτεϊνικών κινασών Lck και Fyn, που µε την σειρά τους ενεργοποιούν την Syk πρωτεϊνική κινάση ZAP-70. Η ZAP-70 απενεργοποιεί την φωσφολιπάση C-g (PLCg) µέσω της οποίας διαµεσολαβείται η αύξηση του ενδοκυττάριου ασβεστίου ([Ca+ 2 ]i). Η αύξηση αυτή µέσω της καλµοδουλίνης ωθεί την καλσινευρίνη (πρωτεΐνη µε ενεργότητα φωσφατάσης) να αποφωσφορυλιώσει τον µεταγραφικό παράγοντα NFAT, µεταβολή που οδηγεί στη µετακίνησή του στο πυρήνα. Εκεί, ο NFAT δεσµεύεται στον υποκινητή της ιντερλευκίνης-2 και επάγει την µεταγραφή του γονιδίου. Η ZAP-70 φωσφορυλιώνει επίσης την Shc που σχηµατίζει ένα µεµβρανικό σύµπλοκο µε την Grb-2 και τον παράγοντα ανταλλαγής νουκλεοτιδίων γουανίνης SOS. Η SOS καταλύει την ανταλλαγή GDP για GTP στην p21ras που οδηγεί στην ενεργοποίηση του κλασσικού µονοπατιού MAPK που µέσω των κινασών Raf, MEK-1/2 και ERK-1/2 αυξάνει τη µεταγραφική δραστηριότητα των γονιδίων c-fos και jun-b, τα προϊόντα των οποίων ετεροδιµερίζονται για να φτιάξουν το σύµπλοκο AP-1 που διεγείρει την µεταγραφή της ιντερλευκίνης-2. Η εναλλακτική οδός της MAPK ενεργοποιείται επίσης κατά την διέγερση των Τ κυττάρων. Κατά την οδό αυτή ο TCR ενεργοποιεί την Grb-2 που µε τη σειρά της αυξάνει την ενεργότητα της p95vav, µία πρωτεΐνη ανταλλαγής νουκλεοτιδίων για την Rac. Η ενεργοποιηµένη Rac-GTP ευοδώνει την σηµατοδότηση µέσω MEKK-1, SEK-1/2 και JNK-1/2. Η JNK-1/2 φωσφορυλιώνει τους µεταγραφικούς παράγοντες c- jun και ATF-2 αυξάνοντας έτσι την µεταγραφική τους δραστηριότητα και οδηγώντας σε µεταγραφή του c-jun µέσω του υποκινητή του γονιδίου c-jun. Ο υποκινητής του γονιδίου της IL-2 καλύπτει µία περιοχή 275bp στο 5 άκρο από τη θέση έναρξης της µεταγραφής. Στην περιοχή αυτή υπάρχουν πιθανές θέσεις δέσµευσης για ποικιλία µεταγραφικών παραγόντων µε πλειοτροπικές δράσεις πάνω στην ενεργότητα του υποκινητή 26. Χαρακτηριστικές είναι δύο περιοχές (-130 και - 276bp) πλούσιες σε πουρίνες (Pu elements). Αυτές οι περιοχές παίζουν σηµαντικό ρόλο στην διαδικασία της µεταγραφής του γονιδίου όπως θα δούµε παρακάτω Ο κύριος θετικός µεταγραφικός παράγοντας του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 κατά την ενεργοποίηση των Τ λεµφοκυττάρων είναι ο NFAT 27,28. Ο παράγοντας αυτός βρίσκεται σε ανενεργή µορφή στο κυτταρόπλασµα των παρθένων Τ λεµφοκυττάρων. Η µετα-µεταφραστική τροποποίηση του µορίου έχει σαν αποτέλεσµα την µετατόπισή του στον πυρήνα των Τ λεµφοκυττάρων όπου σε συνεργασία µε άλλους µεταγραφικούς παράγοντες ενεργοποιεί τα γονίδια στόχους 29. Η δράση του NFAT διαµεσολαβείται µέσω της δέσµευσής του σε δύο στοιχεία του υποκινητή της ιντερλευκίνης-2 γνωστά σαν ARRE-1/ARRE-2 (Antigen Receptor Response Element 1,2) που περιέχουν την βασική αλληλουχία GGAAAA και αλληλεπικαλύπτονται µε τα Pu-b p, Pu-b d (proximal and distal Purine Box ή PRRE : Purine Rich Response Element) 26. Η δέσµευση αυτή σε συνεργασία µε τους παράγοντες fos/jun και Octamer οδηγεί στην µεταγραφή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 κατά την ενεργοποίηση των Τ λεµφοκυττάρων. 21

Έχουν µέχρι σήµερα κλωνοποιηθεί τα cdna τεσσάρων παραγόντων NFAT 28,29 από τα οποία µόνο δύο (NFATp και NFATc) φαίνεται να έχουν λειτουργικό ρόλο στην επαγωγή της µεταγραφής γονιδίων κυτταροκινών κατά την ενεργοποίηση των Τ λεµφοκυττάρων 30. Εικόνα 9: Σχηµατική αναπαράσταση των πιθανών θέσεων δέσµευσης µεταγραφικών παραγόντων στον υποκινητή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2. Pu-b p, Pu-b d : proximal and distal Purine Box, UPS : Upstream Promoter Site, TRE: TPA Response Element, TCE p TCE d : proximal, distal T Cell response Element, US1, US2/3: Upstream Site 1,2/3, ARRE-1/2: Antigen Receptor Response Element 1,2, Oct-1/2: Octamer-1/2, CD28RE: CD28 Response Element, NF-AT: Nuclear Factor of Activated T cells Πειράµατα έγιναν σε σύστηµα ωοκυττάρων βατράχου (Xenopus leavis) µε σκοπό την εξέταση trans-ενεργών στοιχείων που σχετίζονται µε την µεταγραφική ρύθµιση του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 ποντικών. Η πειραµατική διαδικασία περιελάµβανε την έγχυση πλασµιδίου που έφερε την αλληλουχία του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 (IL-2) σε ωοκύτταρα Xenopus, χωρίς την παρουσία επιπλέον πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων. Αυτό που παρατηρήθηκε ήταν ένας βασικός ρυθµός µεταγραφής του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 στο ωοκύτταρο που ήταν ανεξάρτητος της ποσότητας του γονιδίου που είχε εισαχθεί σε αυτό. Το επόµενο βήµα ήταν η αποµόνωση πρωτεϊνικών εκχυλισµάτων από παρθένα Τ λεµφοκύτταρα (εν ηρεµία) από σπληνοκύτταρα ποντικών. Ουσιαστικά πρόκειται για µη ενεργοποιηµένα T λεµφοκύτταρα. Το πρωτεϊνικό αυτό εκχύλισµα εισήχθη στα µετασχηµατισµένα ωοκύτταρα. Παρατήρησαν, τότε, ότι η παρουσία αυτού του εκχυλίσµατος στα ωοκύτταρα προκάλεσε την µείωση του βασικού ρυθµού µεταγραφής του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2, που είχε παρατηρηθεί προηγουµένως. Τα επόµενα πειράµατα που ακολούθησαν περιελάµβαναν την εισαγωγή στα ωοκύτταρα πρωτεϊνικού εκχυλίσµατος που είχε αποµονωθεί από T λεµφοκύτταρα τα οποία είχαν προηγουµένως ενεργοποιηθεί. Η αποµόνωση του εκχυλίσµατος από τα κύτταρα έγινε 8h µετά την ενεργοποίησή τους. Σε αυτή την περίπτωση οι πρωτεΐνες 22

που προέρχονταν από τα ενεργοποιηµένα T λεµφοκύτταρα δεν προκαλούσαν την µείωση του βασικού ρυθµού µεταγραφής του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 αλλά αντίθετα την αύξηση της µεταγραφικής του δραστηριότητας. Τα αποτελέσµατα αυτά οδήγησαν τους επιστήµονες στο συµπέρασµα ότι παράγοντες που βρίσκονται σε T λεµφοκύτταρα (εν ηρεµία), τα οποία δεν έχουν ενεργοποιηθεί, προκαλούν την καταστολή ή την µείωση του βασικού ρυθµού µεταγραφής του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2. Οι παράγοντες αυτοί δένονται σε κάποιες αλληλουχίες του υποκινητή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 επάγοντας την µεταγραφική καταστολή του γονιδίου. Με δεδοµένο την παρουσία παραγόντων καταστολής του γονιδίου της IL-2 στα παρθένα (εν ηρεµία) T λεµφοκύτταρα, οι επιστήµονες εστίασαν την προσοχή τους στην εύρεση της αλληλουχίας του υποκινητή της ιντερλευκίνης-2 στην οποία «δένουν» οι παράγοντες αυτοί. Για το σκοπό αυτό χρησιµοποίησαν γονίδιαανταποκριτές η έκφραση των οποίων ελέγχεται από υποκινητές (φυσικούς ή µε µεταλλάξεις), και τα εισήγαγαν σε ωοκύτταρα Xenopus. Ένα από αυτά τα πειράµατα περιλάµβανε την εισαγωγή, στα ωοκύτταρα Xenopus, της περιοχής Pu (Purine rich region) του υποκινητή. Αυτό που παρατήρησαν ήταν ότι, όταν εισάγουν σε ωοκύτταρα την περιοχή Pu και παρουσία πρωτεϊνικού εκχυλίσµατος από εν ηρεµία, µη ενεργοποιηµένα T λεµφοκύτταρα προκαλείται, όπως είδαµε και στα πειράµατα που αναφέραµε παραπάνω, µείωση της µεταγραφικής δραστηριότητας του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2. Έτσι κατέληξαν στο συµπέρασµα ότι η περιοχή αυτή του υποκινητή παίζει σηµαντικό ρόλο στην ρύθµιση της µεταγραφής του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 καθώς επίσης και ότι κάποιος ή κάποιοι παράγοντες που εκφράζονται στα µη ενεργοποιηµένα T λεµφοκύτταρα δένουν σε αυτή την περιοχή και επάγουν την καταστολή του γονιδίου 31. Αργότερα, το 1993, δηµοσιεύτηκε µία ερευνητική εργασία που περιείχε περισσότερες πληροφορίες σχετικά µε την δράση του καταστολέα ή καταστολέων καθώς επίσης και για την δράση του ενεργοποιητή ή ενεργοποιητών του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2. Τα πειράµατα που έγιναν επικεντρώθηκαν στην συµπεριφορά των παρθένων και µνηµονικών T λεµφοκυττάρων όσων αφορά την έκφραση του καταστολέα ή των καταστολέων. Τα µνηµονικά T λεµφοκύτταρα είναι γνωστό ότι ενεργοποιούνται σαφώς πιο εύκολα από τα παρθένα T λεµφοκύτταρα. Άλλες διαφορές ανάµεσα σε αυτές τις δύο 23

κατηγορίες κυττάρων σχετίζονται µε τα µόρια επιφανείας τους καθώς και µε το εύρος των κυτταροκινών που εκφράζουν. Στα πειράµατα που έγιναν στο σύστηµα των ωοκυττάρων Xenopus αναφέραµε ότι ο καταστολέας ή οι καταστολείς που επάγουν την καταστολή της µεταγραφής του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 στα Τ παρθένα λεµφοκύτταρα, δένουν στα Pu στοιχεία του υποκινητή του γονιδίου που εµφανίζεται δύο φορές στον υποκινητή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 (IL-2) του ανθρώπου στις θέσεις 130 και 276pb. Στην συνέχεια µετά από ενεργοποίηση των κυττάρων ένας θετικός µεταγραφικός παράγοντας δένει στα ίδια στοιχεία και προκαλεί την άρση της καταστολής. Στην νέα αυτή ερευνητική εργασία αυτό που θέλησαν να αποδείξουν είναι ότι η ενεργοποίηση και καταστολή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 ελέγχεται διαφορετικά στα µνηµονικά και παρθένα Τ λεµφοκύτταρα. Αυτό που βρήκανε λοιπόν, είναι ότι στα παρθένα Τ λεµφοκύτταρα η έκφραση του γονιδίου της IL-2 ελέγχεται από έναν καταστολέα ο οποίος δένει στα Pu στοιχεία του υποκινητή εµποδίζοντας την µεταγραφή. 8 ώρες περίπου µετά την πρώτη ενεργοποίηση των κυττάρων δύο ανεξάρτητα γεγονότα συµβαίνουν, πρώτον, ο καταστολέας εξαφανίζεται και δεύτερο ένας ενεργοποιητής σχηµατίζεται µέσω ενεργοποίησης πρωτεϊνικής κινάσης C και de novo σύνθεση πρωτεΐνης, που επάγει την µεταγραφή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 µε την πρόσδεση της πρωτεΐνης στο ίδιο στοιχείο. Όταν τα ενεργοποιηµένα κύτταρα µεταπέσουν σε µνηµονικά και εξετασθούν για την παρουσία του καταστολέα, τότε αυτός δεν αναδεικνύεται. Αντίθετα ο ενεργοποιητής, βρίσκεται σε µία λιγότερο ενεργή µορφή στο κυτταρόπλασµα των µνηµονικών κυττάρων και µετά την ενεργοποίησή τους µετατοπίζεται στον πυρήνα όπου και ενεργοποιεί την µεταγραφή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2. Μια σειρά πειραµάτων EMSA µε αντισώµατα εναντίων διαφόρων µεταγραφικών παραγόντων έδειξε ότι το σύµπλοκο του ενεργοποιητή περιέχει τους µεταγραφικούς παράγοντες FRA-2/JUN-D ενώ αντίθετα κανένας από αυτούς τους παράγοντες δεν συµµετείχε στο σύµπλοκο του καταστολέα. Τα πειράµατα τελικώς κατέληξαν στο γεγονός ότι ο καταστολέας που έχει την ικανότητα να δένει στα Pu στοιχεία του υποκινητή της ιντερλευκίνης-2, εµφανίζεται αποκλειστικά στα παρθένα Τ λεµφοκύτταρα και έχει µέγεθος 30-50kDa (µε βάση πειράµατα cross-linking) 32. 24

Εικόνα 10: Σχηµατική αναπαράσταση του προτεινόµενου τρόπου ρύθµισης της µεταγραφής του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 (IL-2) στα Τ βοηθητικά λεµφοκύτταρα 8. Ο καταστολέας υπάρχει στα παρθένα Τ λεµφοκύτταρα και δεν επιτρέπει την µεταγραφή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2. Μετά από ενεργοποίηση των κυττάρων (10h αργότερα) ο καταστολέας εξαφανίζεται και την θέση του παίρνει ο ενεργοποιητής που επάγει την έκφραση της ιντερλευκίνης-2. Όταν τα κύτταρα στην συνέχεια γίνουν rested και δεν παράγουν ιντερλευκίνη-2 ο ενεργοποιητής παρουσιάζεται στο κυτταρόπλασµα σε ανενεργή µορφή και µετά από επαναενεργοποίηση των κυττάρων µε µιτογόνα (PHA/PMA) ο ενεργοποιητής εισέρχεται στον πυρήνα στην ενεργή του µορφή και επάγει την µεταγραφή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 Γ. Ο ρόλος της Κυκλοσπορίνης Α (CsA) στη µεταγραφή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 Η κυκλοσπορίνη Α (CsA) είναι ένας µεταβολίτης των µυκήτων και έχει γίνει εδώ και χρόνια ένα χρήσιµο φάρµακο στη µεταµόσχευση οργάνων στον άνθρωπο κυρίως λόγω της ικανότητας του φαρµάκου να αποτρέπει την απόρριψη µη συµβατών αλλογράφων του HLA 33-35. Παρόλο που η κυκλοσπορίνη Α δεν παρουσιάζει πολλά πλεονεκτήµατα σε σχέση µε άλλα ανοσοκατασταλτικά φάρµακα µε βάση την συχνότητα των ιικών µολύνσεων πριν την µεταµόσχευση. Τα πλεονεκτήµατα που παρουσιάζει είναι ότι είναι µη τοξικό για τα αρχέγονα κύτταρα του µυελού των οστών και παρουσιάζει λιγότερες βακτηριακές µολύνσεις 33,36. Η ανοσοκατασταλτική δράση της κυκλοσπορίνης Α πραγµατοποιείται µέσω της αναστολής της έκκρισης των κυτταροκινών από τα Τ λεµφοκύτταρα. Έτσι είναι γνωστό ότι η CsA προκαλεί την καταστολή της έκφρασης της ιντερλευκίνης -2 37 και συγκεκριµένα στο επίπεδο της µεταγραφής 38. 25

Η κυκλοσπορίνη όταν βρεθεί στο κυτταρόπλασµα του κυττάρου προσδένεται στην κυκλοφιλίνη (cyclophylin-cpn) σχηµατίζοντας ένα σύµπλεγµα. Το σύµπλεγµα αυτό προσδένεται και εµποδίζει την δράση του ενζύµου καλσινευρίνης (calcineurin - CaN), που όπως αναφέραµε ήδη έχει δράση φωσφατάσης σερίνης/θρεονίνης και συµµετέχει στην ενεργοποίηση του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2. Το σύµπλεγµα αυτό εµποδίζει την καλσινευρίνη να αποφωσφορυλιώσει την κυτταροπλασµατική µορφή του παράγοντα NFAT (NFATc), που έχει σαν αποτέλεσµα να µην είναι δυνατή η µεταφορά του στον πυρήνα και την σύνδεσή του µε την πυρηνική µορφή του παράγοντα NFAT (NFATn). Όπως αναφέραµε ήδη το σύµπλεγµα NFATc-NFATn προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 και επάγει την µεταγραφή του, καθώς ο παράγοντας NFAT είναι ο κύριος µεταγραφικός παράγοντας που συµµετέχει στην µεταγραφή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2, όπως έχουµε ήδη αναφέρει. Έτσι λοιπόν τα Τ λεµφοκύτταρα δεν παράγουν ιντερλευκίνη-2 που είναι απαραίτητη για την πλήρη ενεργοποίηση των κυττάρων αυτών. Η διαδικασία στην οποία αναφερθήκαµε παρουσιάζεται σχηµατικά στην εικόνα 11. Εικόνα 11: Στην εικόνα παρουσιάζεται η δράση της κυκλοσπορίνης Α στην έκφραση του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 26

. Human Immunodeficiency Virus Type-1 (HIV-1) 1,2 Ο HIV είναι ο ιός ο οποίος είναι υπεύθυνος για την ασθένεια του AIDS (Acquired Immunodeficiency Syndrom). Έχουν αναγνωριστεί δύο τύποι του ιού (HIV type 1 and 2) οι οποίοι διαφέρουν µεταξύ τους ως προς την δοµή του γονιδιώµατος καθώς και στην αντιγονικότητα. Ο HIV τύπου 1 εµφανίζεται µε µεγαλύτερη συχνότητα από αυτόν του τύπου 2. Τα είδη του ιού που έχουν αποµονωθεί χαρακτηρίζονται µε ένα γράµµα. Το κύριο είδος του ιού χαρακτηρίζεται µε το γράµµα Μ από το πρώτο γράµµα της λέξης Μajor. Οι οµάδες του ιού που χαρακτηρίζονται µε τα γράµµατα Ο και Ν αναφέρονται στα είδη του ιού που η εξάπλωσή τους περιορίζεται στις περιοχές της Αφρικής (HIV τύπου 2). Το είδος του ιού της οµάδας Μ έχει διαχωριστεί σε διάφορες υποκατηγορίες λόγω των µεταλλάξεων που εµφανίζονται στον ιό κατά την παγκόσµια µετάδοση του. Τα υποείδη αυτά του ιού χαρακτηρίζονται µε τα γράµµατα του αγγλικού αλφαβήτου Α- J 39. Οι διάφορες υποκατηγορίες του ιού περιορίζονται γεωγραφικά, έτσι ο υπότυπος Β εµφανίζεται µε µεγαλύτερη συχνότητα στην βόρεια Ευρώπη και Αµερική ενώ ο υπότυπος Ε στην Ασία 40. Χαρακτηριστικό είναι επίσης ότι κάποιοι υπότυποι µολύνουν πιο αποτελεσµατικά σε σχέση µε κάποιους άλλους, όπως οι C, E και Α σε σχέση µε τον υπότυπο Β. Όσων αφορά την δοµή του, είναι ένας τυπικός δίκλωνος RNA ιός (ρετροϊός) µε διάµετρο 100-120nm. Αποτελείται από µία πρωτεϊνική κάψουλα που στο εσωτερικό φέρει το γονιδίωµα (9,2 kb) του ιού, που συνίσταται από 9 γονίδια (εικόνα 12). Τα πιο χαρακτηριστικά γονίδια του ιού είναι το γονίδιο gag (κωδικοποιεί µια κεντρική πρωτεΐνη), το γονίδιο pol κωδικοποιεί την αντίστροφη µεταγραφάση, την intergrase και τα ένζυµα (viral protease enzymes) που είναι απαραίτητα για την αντιγραφή του γονιδιώµατος του ιού. Σηµαντικό είναι και το γονίδιο env που κωδικοποιεί τις γλυκοπρωτεΐνες του φακέλου gp120 και gp40, που απαιτούνται για την µόλυνση των κυττάρων. Το ιικό γονιδίωµα περιλαµβάνει ακόµα 6 ρυθµιστικά γονίδια (tat, rev, vif, nef, vpr, vpu) των οποίων τα προϊόντα ρυθµίζουν την αναπαραγωγή του ιού µε διάφορους τρόπους 41. Η δράση των γονιδίων αυτών αναγράφονται στην εικόνα 12. 27

Εικόνα 12 : Γονίδια του ιού HIV-1 και ρόλος των προϊόντων τους Στα άκρα του γονιδιώµατος υπάρχουν επαναλαµβανόµενες αλληλουχίες LTRs (Long Terminal Repeats) που απαιτούνται για την εισαγωγή του ιικού γονιδιώµατος στο γονιδίωµα του ξενιστή. Οι περιοχές αυτές ρυθµίζουν επίσης την έκφραση των γονιδίων του ιού, καθώς αποτελούν θέσεις πρόσδεσης πολλών µεταγραφικών παραγόντων του ξενιστή, ενώ παίζει ρόλο και στον πολλαπλασιασµό του. Ανάµεσα στους µεταγραφικούς παράγοντες του ξενιστή που προσδένονται στις αλληλουχίες αυτές είναι ο NF-kβ (Nuclear Factor-κβ) (προσδένεται και στον υποκινητή της IL-2) 42,43 και ο SP1 44. Ο υποδοχέας του ιού είναι το αντιγόνο CD4 που υπάρχει στα CD4 T λεµφοκύτταρα καθώς και στα µονοκύτταρα/µακροφάγα. Σηµαντικό γεγονός που αξίζει να αναφέρουµε σχετικά µε την LTR αλληλουχία του ιού είναι ότι έχουν αποµονωθεί από Μ στελέχη ιοί µε ποικιλία στην νουκλεοτιδική αλληλουχία της LTR. Αυτή η ποικιλότητα στην LTR αλληλουχία µπορεί να είναι αποτέλεσµα προσαρµογής σε συγκεκριµένο κυτταρικό υπόβαθρο για την βελτιστοποίηση της µεταγραφής του ιού HIV. Οι περισσότερες από αυτές τις µεταλλάξεις στην LTR εµφανίζονται σε συντηρηµένες περιοχές πρόσδεσης για κυτταρικούς ή ιικούς µεταγραφικούς παράγοντες. Είναι ενδιαφέρον ότι παρόλλες τις µεταλλάξεις και τις αλλαγές στις αλληλουχίες πρόσδεσης στον LTR όλη αυτή η ποικιλία των µεταλλαγµένων LTR είναι ικανά να επάγουν την µεταγραφική διαδικασία του ιού σε συγκεκριµένους τύπους κυττάρων-ξενιστών κάτι που 28

αναδεικνύει την µεγάλη ελαστικότητα και προσαρµοστικότητα της κυτταρικής µεταγραφικής µηχανής 45-49. Κύτταρα στόχοι για τον ιό είναι αυτά τα οποία φέρουν τον υποδοχέα CD4 ( T λεµφοκύτταρα, µακροφάγα, δενδριτικά και θυµοκύτταρα) καθώς και έναν ή και τους δύο συνυποδοχείς CXCR4 και CCR5. Ο ιός προσβάλλει επίσης και κύτταρα της µικρογλοίας του κεντρικού νευρικού συστήµατος 50. Η πορεία της ασθένειας σχετίζεται µε την µείωση των CD4 + κυττάρων σε συνδυασµό µε την αύξηση του φορτίου του ιού στον οργανισµό 51,52. Η µόλυνση των κυττάρων από τον ιό ξεκινά µε την πρόσδεση της γλυκοπρωτεΐνης του φακέλου (env-gp41/gp120) που προσδένεται ταυτόχρονα στον CD4 υποδοχέα και σε έναν συνυποδοχέα της οικογένειας των χηµειοκινών (CXCR4 και CCR5) 51. Η σύνδεση της γλυκοπρωτεΐνης gp120 στον υποδοχέα CD4 προκαλεί αλλαγή στην διαµόρφωσή της που επάγει την gp120 να συνδεθεί και µε τον συνυποδοχέα των χηµειοκινών. Το γεγονός αυτό µε την σειρά του προκαλεί την αλλαγή της διαµόρφωσης της γλυκοπρωτεΐνης gp41 η οποία εκβάλλει µία υδρόφοβη περιοχή (fusion peptide) η οποία εισέρχεται στην κυτταρική µεµβράνη του κυττάρου στόχου και τελικά οδηγεί στην σύντηξη των µεµβρανών του κυττάρου και του ιού (εικόνα 13). Από εκεί και πέρα ξεκινά ο κύκλος του ιού ενδοκυτταρικά. Εικόνα 13: Πρόσδεση του ιού HIV-1 σε Τ λεµφοκύτταρο µέσω της σύνδεσης της γλυκοπρωτεΐνης gp120 του ιού µε τον υποδοχέα CD4 και των συνυποδοχέων CXCR4 και CCR5 του κυττάρου ξενιστή 29

Με την είσοδο του ιικού γονιδιώµατος στο κύτταρο ενεργοποιούνται τα ένζυµα του νουκλεοπρωτεϊνικού συµπλόκου και ξεκινά ο πολλαπλασιασµός του ιικού γονιδιώµατος. Το πρώτο βήµα είναι η αντίστροφη µεταγραφή του ιικού γονιδιώµατος από δίκλωνο RNA σε δίκλωνο DNA. Η διαδικασία αυτή συµβαίνει στο κυτταρόπλασµα. Στη συνέχεια το δίκλωνο ιικό DNA εισέρχεται στον πυρήνα του κυττάρου. Μαζί µε το δίκλωνο DNA στον πυρήνα εισέρχεται και η intergrase η οποία καταλύει την ενσωµάτωση του ιικού γονιδιώµατος στο γονιδίωµα του κυττάρου ξενιστή. Σε αυτή την φάση το ενσωµατωµένο DNA του HIV καλείται προϊός. Ο προϊός µπορεί να παραµείνει µεταγραφικά ανενεργός για µεγάλο χρονικό διάστηµα. Μια πλήρης εικόνα της δράσης του ιού από την εισαγωγή του στο λεµφοκύτταρο µέχρι την ενσωµάτωση του γονιδιώµατος του στο γονιδίωµα του κυττάρου ξενιστή παρουσιάζεται στην εικόνα 15. Εικόνα 14: Αλληλεπιδράσεις ενδογενών κυτταρικών µεταγραφικών παραγόντων µε την LTR αλληλουχία του HIV. Οι κύριες περιοχές πρόσδεσης µεταγραφικών παραγόντων βρίσκονται στις θέσεις -356 έως +27. Κυτταρικοί παράγοντες που επηρεάζουν την µεταγραφή µε απ ευθείας πρόσδεση στην LTR αλληλουχία φαίνονται µε µαύρα γράµµατα ενώ πρωτεΐνες που δρούν έµεσα µέσω αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης φαίνονται µε άσπρα. Πρωτεΐνες που απεικονίζονται στο επάνω µέρος της αλληλουχίας δρουν ως ενεργοποιητές της µεταγραφής ενώ στο κάτω µέρος δρουν ως αναστολείς 50. Η ρύθµιση της µεταγραφής των γονιδίων του HIV-1 ελέγχεται όπως έχουµε ήδη αναφέρει από την LTR περιοχή. Η 5 LTR αλληλουχία δρα για την επαγωγή της µεταγραφής του προϊικού γονιδιώµατος ενώ η 3 LTR απαιτείται για την πολυαδενυλύωση των µεταγράφων που προκύπτουν 41. Η 5 LTR αλληλουχία χωρίζεται σε λειτουργικές περιοχές, την περιοχή TAR (transactivation response element), την περιοχή του πυρήνα, τον ενισχυτή και τα ρυθµιστικά στοιχεία. Στην ΤΑR περιοχή προσδένεται ο ιικός trans-ενεργοποιητής tat και η περιοχή του πυρήνα 30

περιλαµβάνει τον initiator (Inr), την TATA αλληλουχία (TATA box promoter sequence) και τρεις περιοχές πρόσδεσης του µεταγραφικού παράγοντα Sp1. Στην περιοχή του ενισχυτή προσδένονται ο NF-κΒ και ο NFAT ενώ η ρυθµιστική περιοχή φέρει θέσεις για την πρόσδεση µιας σειράς κυτταρικών µεταγραφικών παραγόντων όπως του NF-IL-6 (Nuclear Factor-Interleukin-6), ο µεταγραφικός παράγοντας CREB (camp response element binding protein), µεταγραφικοί παράγοντες της οικογένειας ets και πυρινικοί υποδοχείς ορµονών 53-55 (εικόνα 14). Η έναρξη της µεταγραφικής δραστηριότητας των γονιδίων του HIV σχετίζονται µε την φυσιολογική ενεργοποίηση των T λεµφοκυττάρων από κάποιο αντιγόνο ή από κυτοκίνες. Η συνάντηση του µολυσµένου Τ λεµφοκυττάρου µε κάποιο αντιγόνο προκαλεί την έξοδο του ιού από την φάση καταστολής και την έναρξη της παραγωγής των ιοειδών. Με τον πολλαπλασιασµό του ιικού DNA και την µεταγραφή του σε m-rna ξεκινά η παραγωγή των δοµικών πρωτεϊνών της κάψας του ιού και ο σχηµατισµός των λειτουργικών HIV ρετροϊών που θα απελευθερωθούν από το κύτταρο-ξενιστή και θα µολύνουν υγιή κύτταρα. Εικόνα 15: Σύνδεση του ιού HIV-1 µέσω υποδοχέων της κυτταρικής επιφάνειας των CD4 λεµφοκυττάρων και ο κύκλος του µέσα σε αυτά. 31

Κοινός τρόπος ρύθµισης της µεταγραφής του ιού HIV-1 και του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 Παρατηρήθηκε ότι η έναρξη της µεταγραφής των γονιδίων του ιού συµβαίνει µόνο όταν τα T λεµφοκύτταρα του ξενιστή έχουν ενεργοποιηθεί πιο πριν παρουσία κάποιου αντιγόνου. Αντίθετα στα ώριµα αλλά µη ενεργοποιηµένα T λεµφοκύτταρα (παρθένα) δεν παρατηρείται έναρξη της λειτουργίας της µεταγραφικής διαδικασίας του ιού 42,56,57. Η µεταγραφή των γονιδίων του ιού ελέγχεται από την αλληλεπίδραση ιικών και κυτταρικών µεταγραφικών παραγόντων που δένουν στην περιοχή LTR του ιικού γονιδιώµατος, όπως έχουµε ήδη αναφέρει. Το 5 LTR περιέχει πολλές περιοχές που παρουσιάζουν οµολογία µε τα στοιχεία του υποκινητή της ιντερλευκίνης-2 (IL-2) καθώς και µε στοιχεία του υποκινητή άλλων γονιδίων όπως της ιντερφερόνης-γ (INFγ) και του υποδοχέα της ιντερλευκίνης-2 (IL2R). Στην περιοχή αυτή έχουν ταυτοποιηθεί και θέσεις δέσµευσης για αρκετούς µεταγραφικούς παράγοντες (COUP, USF, TCF-1α, SP-1, UBP-1/LBP-2, CTF/NF1) και επιπλέον έχουν ταυτοποιηθεί αλληλουχίες όπου δεσµεύονται µεταγραφικοί παράγοντες οι οποίοι είναι ειδικοί των λεµφοκυττάρων, όπως NF-κβ, AP1 και αυτοί της οµάδας NFAT 7,41,58. Μία περιοχή του LTR επονοµαζόµενη NRE (Negative Regulatory Enhancer) µεταξύ των θέσεων - 340 έως -185 59 εµπεριέχει µία περιοχή (-279 έως -250) που βρέθηκε ότι παρουσιάζει οµολογία µε την αλληλουχία PRRE του υποκινητή της ιντερλευκίνης-2 (IL-2) 60. Εικόνα 16: Σχηµατική αναπαράσταση του υποκινητή του ιού HIV που δείχνει την θέση των ρυθµιστικών στοιχείων σε σχέση µε την θέση έναρξης της µεταγραφής, RATS: Repressor Activator Target Sequence (αντιστοιχεί στο HIV-PRRE) Σε πειράµατα που έγιναν σε λευχαιµική σειρά T λεµφοκυττάρων (Jurkat) έδειξαν ότι η απόκριση του ιού στην ενεργοποίηση των T λεµφοκυττάρων του ξενιστή µοιάζει σε µεγάλο βαθµό µε αυτή του γονιδίου της IL-2, όσον αφορά την περιοχή PRRE καθώς ελέγχεται από τον NFAT 24,30,61,62. Προσπάθειες που έγιναν για να αποδειχθεί η συµµετοχή των περιοχών PRRE και NFAT στην ενεργοποίηση του 32

ιού HIV-1, έδωσε συγκρίσιµα αποτελέσµατα. Σε σταθερές κυτταρικές σειρές που έχουν διαµολυνθεί η περιοχή LTR του HIV-1 ανταποκρίνεται όπως η περιοχή PRRE της ιντερλευκίνης-2 σε µία ποικιλία σηµάτων ενεργοποίησης των Τ λεµφοκυττάρων που περιλαµβάνουν αύξηση καλίου και σηµάτων κινάσης C 63. Έλλειµµα της PRRE περιοχής από τον LTR έχει ως αποτέλεσµα την αύξηση της µεταγραφής του HIV1 στην Jurkat κυτταρική σειρά 64, ενώ ένθεση ενός αντιγράφου του PRRE στο πλαίσιο ενός υβριδικού υποκινητή είχε ως αποτέλεσµα την αύξηση του ρυθµού µεταγραφής δείχνοντας έτσι ότι το στοιχείο PRRE έχει διττό ρόλο τόσο θετικό όσο και αρνητικό 60. Παρόλα αυτά κάποια άλλα πειράµατα έδειξαν ότι οι περιοχή PRRE και NFAT δεν παίζει κανένα ή έχει µικρό ρόλο στην ενεργοποίηση της µεταγραφικής διαδικασίας του ιού µετά από µιτογονική ενεργοποίηση των κυττάρων του ξενιστή 42,65,66. Πιο πρόσφατα εξετάσθηκε η ρύθµιση του HIV-1LTR στο σύστηµα των ωοκυττάρων Xenopus leavis και τα πειράµατα έδειξαν ότι ο HIV 1-LTR ρυθµίζεται µε τρόπο παρόµοιο µε αυτόν του υποκινητή της IL-2, καθώς πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα που είχαν αποµονωθεί από παρθένα T λεµφοκύτταρα (περιλαµβάνει τους µεταγραφικούς παράγοντες που υπάρχουν στα παρθένα T λεµφοκύτταρα) µπορούσαν να καταστείλουν ουσιαστικά την µεταγραφική δραστηριότητα της LTR περιοχής του ιού (χρησιµοποιήθηκαν πλασµίδια µε ολόκληρη την αλληλουχία LTR, καθώς και διάφοροι υβριδικοί υποκινητές µε ενσωµατωµένα τα µοτίβα δέσµευσης PRRE, NFAT, NFκΒ), ενώ πρωτεϊνικά εκχυλίσµατα που είχαν αποµονωθεί από ενεργοποιηµένα, µε µιτογόνα, T λεµφοκύτταρα προκαλούσαν την επανέναρξη της µεταγραφικής δραστηριότητας. Το στοιχείο PRRE, αντίστοιχο µε αυτό της Pu περιοχής του υποκινητή της IL-2, δρα σε αυτή την περίπτωση ως στόχος παραγόντων που δρουν ως καταστολείς ή ενεργοποιητές, όπως συµβαίνει και στην περίπτωση του υποκινητή της IL-2. Η καταστολή του HIV-1-LTR από έναν κυτταρικό καταστολέα του ξενιστή έχει ως αποτέλεσµα την ύπαρξη χαµηλής µεταγραφικής δραστηριότητας και αντιγραφής του HIV 1 στα παρθένα T λεµφοκύτταρα. Η παρουσία του καταστολέα αυτού στα παρθένα Τ λεµφοκύτταρα µπορεί να είναι και ένας από τους λόγους που εξηγεί την λανθάνουσα κατάσταση στην οποία βρίσκεται ο ιός καθώς και την διατήρηση µεγάλου ιικού αποθέµατος παρά την µεγάλης διαρκείας θεραπεία. Μέσω αυτών µπορούµε να αντιληφθούµε ότι η έναρξη της µεταγραφής του ιικού 33

γονιδιώµατος προϋποθέτει την ενεργοποίηση του T λεµφοκυττάρου µέσω ειδικού ενεργοποιητή/µεταγραφικού παράγοντα. Αντίθετα στα παρθένα T λεµφοκύτταρα ο ρυθµός της µεταγραφικής δραστηριότητας είναι χαµηλή λόγο ενός καταστολέα που δένει στην PRRE περιοχή έτσι ώστε να µην επιτρέπεται η πρόσδεση των απαραίτητων για την έναρξη της µεταγραφής στοιχείων. Ο µηχανισµός δράσης του καταστολέα είναι παρόµοιος µε αυτόν που σχετίζεται µε την καταστολή έκφρασης του γονιδίου της ιντερλευκίνης-2 67. Προς αποφυγή σύγχυσης πρέπει εδώ να αναφέρουµε ότι η περιοχή του LTR που µοιάζει µε την αντίστοιχη περιοχή PRRE του υποκινητή της ιντερλευκίνης-2 έδρασε σαν ενεργοποιητής και καταστολέας και µετονοµάστηκε σε RATS (Repressor-Activator Target Sequence). Εικόνα 17 :Έκφραση του ιού του HIV- 1 στα µνηµονικά T λεµφοκύτταρα (CD45RO), τα βελάκια δείχνουν τα ιοειδή. Αντίθετα στα παρθένα T λεµφοκύτταρα (CD45RA) δεν έχουµε την έκφραση του γονιδιώµατος του ιού ο οποίος βρίσκεται σε λανθάνουσα κατάσταση σε αυτά τα κύτταρα. (Robichaud, G. A. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:23733-2374 34