Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων Ερευνητικό Κέντρο Αθηροθρόμβωσης Σ. Παπαδάκη 1, Σ. Σιδηροπούλου 1, Β. Χαντζηχρήστος 1, Μ. Πασχόπουλος 2, Α. Τσελέπης 1 1 Ερευνητικό Κέντρο Αθηροθρόμβωσης/Εργαστήριο Βιοχημείας, Τμήμα Χημείας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Ιωάννινα 2 Τμήμα Μαιευτικής και Γυναικολογίας, Ιατρική Σχολή, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Ιωάννινα
ΡΟΛΟΣ ΤΟΥ FXA ΚΑΙ ΤΗΣ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΣΤΗ ΘΡΟΜΒΩΣΗ Ενδογενές μονοπάτι Εξωγενές μονοπάτι FXa Προθρομβίνη Θρομβίνη Ινωδογόνο Ινώδες
ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ ΑΙΜΟΠΕΤΑΛΙΩΝ ΑΠΟ ΤΗ ΘΡΟΜΒΙΝΗ Kalantzi KI et al, Expert Rev Clin Pharmacol. 212; 5: 319-336
ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ ΤΩΝ PARS ΑΠΟ ΤΟΝ FXA ΚΑΙ ΤΗ ΘΡΟΜΒΙΝΗ ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΤΟΥ PAR-1 ΑΠΟ ΤΟ VORAPAXAR FXa Θρομβίνη PAR-1 PARs Vorapaxar
ΜΗ ΑΙΜΟΣΤΑΤΙΚΕΣ ΚΥΤΤΑΡΡΙΚΕΣ ΔΡΑΣΕΙΣ ΤΟΥ FXA ΚΑΙ ΤΗΣ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΔΙΑΜΕΣΟΥ ΤΩΝ PARS FXa Κυτταρική υπερτροφία Ενδοθηλιακή δυσλειτουργία Στρατολόγηση μονοκυττάρων Οξειδωτικό στρες Αγγειογένεση Φλεγμονή Απόπτωση Θρομβίνη Ενδοθηλιακή δυσλειτουργία Ενδοθηλιακή διαπερατότητα Στρατολόγηση μονοκυττάρων Οξειδωτικό στρες Απόπτωση Spronk HM et al, Cardiovasc Research. 214, 11: 344 351 Σ.Παπαδάκη, Α.Δ. Τσελέπης, Ελληνική Επιθεώρηση Αθηροσκλήρωσης, 215, 6: 168-179
ΑΝΘΡΩΠΙΝΑ ΕΝΔΟΘΗΛΙΑΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΚΑΙ PARS?? PAR-1 PAR-2 PAR-3 PAR-4 Ενδοθηλιακός φαινότυπος Επιδιόρθωση αγγειακού τοιχώματος Αναγέννηση ενδοθηλίου Rezaie AR, Throm Haemost. 214, 112: 876-82 Alberelli Μ, De Candia, Vascul Pharmacol. 214, 62: 72-81 O Brien PJ et al. J Biol Chem. 2, 275: 1352-9 De la Puente P et al, Clin Cancer Res. 213, 19: 336-8 Rabeling TJ et al,nat Rev Nephrol. 21, 6: 44-14
ΣΚΟΠΟΣ 1. Διερεύνηση της δράσης του FXa και της θρομβίνης στην ενεργοποίηση πρόδρομων ενδοθηλιακών κυττάρων από ομφάλιο λώρο (late-outgrowth Endothelial Cells, OECs), χρησιμοποιώντας ως δείκτη ενεργοποίησης το μόριο προσκόλλησης ICAM-1 (Intercellular Adhesion Molecule-1). 2. Διερεύνηση της πιθανής ανασταλτικής δράσης του vorapaxar στην μεμβρανική έκφραση του ICAM-1.
ΔΙΑΦΟΡΟΠΟΙΗΣΗ CD34 + ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΠΡΟΣ OECS Μονοπύρηνα κύτταρα από ομφάλιο λώρο ανθρώπου Απομόνωση CD34 + κυττάρων (CD34 Microbead Kit) Καλλιέργεια για 3 μέρες Διαφοροποίηση προς OECs (1 η γενιά) Επώαση OECs 4 ης γενιάς με 5 nm FXa ή 8 U/mL θρομβίνης για 24 h απουσία ή παρουσία vorapaxar (1 h επώαση)
ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Μελέτη της επίδρασης του FΧa και της θρομβίνης στην έκφραση του μορίου ICAM-1. MFI % gated CD31 + /CD54 + 1.cells Anti-CD31-FITC: Δείκτης ενδοθηλιακού φαινοτύπου Anti-CD54-PE: ICAM-1
ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ
Έκφραση ICAM-1 (% gated CD31 + /CD54 + ) Έκφραση ICAM-1 (MFI) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ FXA ΣΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ICAM-1 ΑΠΟ ΤΑ OECS ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕ HUVECS 6 p =.46 p =.39 ** *p =.9 **p =.19 Σύγκριση με Resting 4 HUVECs OECs 2 * Resting Activated 1 8 p =.7 p =.6 ** *p =.18 **p =.32 Σύγκριση με Resting 6 * HUVECs 4 OECs 2 Resting Activated
Έκφραση ICAM-1 Έκφραση ICAM-1 (MFI) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΘΡΟΜΒΙΝΗΣ ΣΤΗΝ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ICAM-1 ΑΠΟ ΤΑ OECS ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕ HUVECS 12 1 p =.1 ** *p =.1 **p =.1 Σύγκριση με Resting 8 6 4 p =.1 * HUVECs OECs 2 Resting Activated % gated CD31 + /CD54 + 1 8 6 4 2 p =.1 p =.2 * ** *p =.1 **p =.1 Σύγκριση με Resting HUVECs OECs Resting Activated
% Αύξηση της έκφρασης του ICAM-1 % Αύξηση της έκφρασης του ICAM-1 % ΑΥΞΗΣΗ ΤΗΣ ΕΚΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ICAM-1 ΣΤΑ OECS ΑΠΟ ΤΟΝ FXA ΚΑΙ ΤΗ ΘΡΟΜΒΙΝΗ ΣΥΓΚΡΙΣΗ ΜΕ HUVECS 1 FXa NS 8 6 NS 4 HUVECs OECs 2 CD31+/CD54+ MFI 8 Thr p =.1 6 4 2 p =.1 HUVECs OECs CD31+/CD54+ MFI
% Αναστολή της έκφρασης του ICAM-1 (MFI) % Αναστολή της έκφρασης του ICAM-1 (MFI) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ VORAPAXAR ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΟΜΕΝΗ ΑΠΟ ΤΟΝ FXA ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ICAM-1 1 8 IC 5 :.3 nm OECs 6 1 8 6 4 HUVECs IC 5 :.8 nm 4 2,1,1 1 2,5 5 Vorapaxar (nm) 2,5,1 1 5 1 Vorapaxar (nm)
% Αναστολή της έκφρασης του ICAM-1 (MFI) % Αναστολή της έκφρασης του ICAM-1 (MFI) ΕΠΙΔΡΑΣΗ ΤΟΥ VORAPAXAR ΣΤΗΝ ΕΠΑΓΟΜΕΝΗ ΑΠΟ ΤΗ ΘΡΟΜΒΙΝΗ ΕΚΦΡΑΣΗ ΤΟΥ ICAM-1 OECs 1 8 IC 5 : 2.9 nm 6 1 8 6 4 HUVECs IC 5 : 1 nm 4 2 1 1,75 2,5 5 1 Vorapaxar (nm) 2,1,5 1 2,5 5 Vorapaxar (nm)
ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Τα επίπεδα του ICAM-1 σε μη ενεργοποιημένα OECs ήταν σημαντικά πιο αυξημένα σε σχέση με εκείνα των HUVECs. Ο FXa και η θρομβίνη οδήγησαν σε αύξηση της έκφρασης του ICAM-1 στα OECs, η οποία αναστέλλεται από το vorapaxar. Η % αύξηση της έκφρασης του ICAM-1 μεταξύ των ενεργοποιημένων με FXa OECs και HUVECs δεν ήταν στατιστικά σημαντική, ενώ των ενεργοποιημένων με θρομβίνη OECs ήταν στατιστικά σημαντικά χαμηλότερη σε σχέση με εκείνη των HUVECs. Ο FXa και η θρομβίνη αποτελούν διαμεσολαβητές της έκφρασης του ICAM-1 στα OECs, κυρίως διαμέσου του PAR-1. Τα αυξημένα επίπεδα του ICAM-1 σε μη ενεργοποιημένα κύτταρα μπορεί να αποτελούν δείκτη πρόδρομου φαινοτύπου.
Οι συγγραφείς ευχαριστούν το Ερευνητικό Κέντρο Αθηροθρόμβωσης του Πανεπιστημίου Ιωαννίνων για την πρόσβαση στις υπηρεσίες του Κέντρου Η παρούσα μελέτη υποστηρίχθηκε από την Ελληνική Εταιρεία Αθηροσκλήρωσης με υποτροφία προς την κυρία Παπαδάκη Στυλιανή για την εκπόνηση της Διδακτορικής της Διατριβής