ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΟ ΤΜΗΜΑ Μελέτη της έκφρασης του CD154 (CD40L) στα Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με ψωριασική αρθρίτιδα ΔΗΜΗΤΡΙΟΣ ΔΑΟΥΣΗΣ ΙΑΤΡΟΣ ΡΕΥΜΑΤΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2006
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ Eισαγωγή...5 ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ο ρόλος του Τ λεμφοκυττάρου στην παθογένεια της ΨΑ...11 Η βιολογική σημασία της συνδιέγερσης και ο ρόλος της στην ενεργοποίηση του Τ λεμφοκυττάρου...14 Ο βιολογικός ρόλος του CD40L...16 Ρύθμιση της έκφρασης του CD40L...18 ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ CD40-CD40L ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ I. Μη ρευματικά νοσήματα Μεταμοσχεύσεις...20 Αθηροσκλήρηνση...21 Ψωρίαση...22 II. Ρευματικά νοσήματα Συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (ΣΕΛ) i. Έκφραση του CD40L στους ασθενείς με ΣΕΛ...24 ii. Χρήση του αντί-cd40l ΜΑb σε πειραματικά μοντέλα λύκου και στον ΣΕΛ...28 Ρευματοειδής αρθρίτιδα i. Έκφραση του CD40L στην ΡΑ...31 2
ii. Χρήση του αντι-cd40l MAb σε πειραματικά μοντέλα ΡΑ...34 Δερματομυοσίτιδα-Πολυμυοασίτιδα...34 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Σκοπός μελέτης...36 ΑΣΘΕΝΕΙΣ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ...39 Κριτήρια επιλογής των συμμετεχόντων στην μελέτη...40 Γενικός έλεγχος ασθενών...42 Μεθολογία απομόνωσης ΜΚΠΑ...44 Προσδιορισμός της έκφρασης του CD40L στη επιφάνεια Τ λεμφοκυττάρων με χρήση κυτταρομετρίας ροής...45 Προσδιορισμός του χρονικού σημείου μέγιστης έκφρασης του CD40L...46 Προσδιορισμός της συγκέντρωσης κυκλοσπορίνης που προκαλεί την βέλτιστη αναστολή έκφρασης του CD40L...47 Προσδιορισμός της έκφρασης του CD40L στην επιφάνεια Τ λεμφοκυττάρων μετά από διέγερση...49 Στατιστική ανάλυση...49 Δημογραφικά στοιχεία-κλινικές παράμετροι...50 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Έκφραση του CD40L στα Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με ΨΑ σε κατάσταση ηρεμίας...54 3
Έκφραση του CD40L στα Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με ΨΑ μετά από διέγερση...59 Αναστολή της επαγόμενης έκφρασης του CD40L από την κυκλοσπορίνη...64 Έκφραση του CD40L στα CD8 + Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με ΨΑ...68 Επίδραση της αντί-tnfα θεραπείας στην έκφραση του CD40L...70 Μελέτη της επίδρασης της από του στόματος χορηγηθείσας θεραπείας με κυκλοσπορίνη στην έκφραση του CD40L...72 ΣΥΖΗΤΗΣΗ...73 ΠΕΡΙΛΗΨΗ...76 SUMMARY..77 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ...78. 4
ΕΙΣΑΓΩΓΗ Η ψωριασική αρθρίτιδα (ΨΑ) είναι ένα συστηματικό ρευματικό νόσημα. Ανήκει σε μια ευρύτερη, ετερογενή ομάδα νοσημάτων, τις φλεγμονώδεις σπονδυλοαρθροπάθειες. Πρόκειται για φλεγμονώδη αρθρίτιδα σχετιζόμενη με ψωρίαση. Στον ορό των πασχόντων από ΨΑ τυπικά δεν ανιχνεύεται ρευματοειδής παράγοντας (RF). Αφορά στο 5-17% των ασθενών με ψωρίαση, μιας κοινής δερματικής νόσου που προσβάλει το 2% περίπου του γενικού πληθυσμού. Η ΨΑ θεωρείται γενικώς ότι έχει μελετηθεί λιγότερο εκτενώς σε σχέση με άλλα συστηματικά ρευματικά νοσήματα ενώ εικάζεται ότι οι επιδημιολογικές μελέτες που δίνουν ποσοστά 0,04-0,1% επί του γενικού πληθυσμού πιθανώς υποεκτιμούν τον πραγματικό επιπολασμό της νόσου. Αν και στο παρελθόν είχε αμφισβητηθεί ακόμα και η ύπαρξη της ΨΑ ως ξεχωριστής νόσου, θεωρώντας ότι πρόκειται για τυχαία συνύπαρξη δύο συχνών παθήσεων όπως η ψωρίαση και η αρθρίτιδα, σήμερα είναι πλέον σαφές ότι η ΨΑ έχει ιδιαίτερα κλινικά, επιδημιολογικά, γενετικά και ακτινομορφολογικά χαρακτηριστικά που την διαχωρίζουν σαφώς από άλλα νοσήματα και την επιβεβαιώνουν ως ανεξάρτητη νόσο. Η κλινική εικόνα της νόσου χαρακτηρίζεται από μεγάλη ετερογένεια καθώς μπορεί να προσβάλλει τόσο τις περιφερικές αρθρώσεις όσο και τον αξονικό σκελετό. Η ετερογένεια αυτή αναδεικνύεται στην κλασική κατάταξη των Moll και Wright που αναγνώρισαν 5 κύριες υποκατηγορίες ( ασύμμετρη ολιγοαρθρίτιδα, αρθρίτιδα με προσβολή των άπω φαλαγγοφαλαγγικών αρθρώσεων, συμμετρική πολυαρθρίτιδα, 5
ακρωτηριαστική αρθρίτιδα και σπονδυλίτιδα). H αναλογία ανδρών/γυναικών ασθενών είναι περίπου 1/1. (1) Η παθογένεια της νόσου φαίνεται να είναι πολυπαραγοντική και να συμμετέχουν τόσο γενετικοί οσο και περιβαλλοντικοί παράγοντες. Στους γενετικούς παράγοντες αξίζει να αναφερθεί η συχνή οικογενής κατανομή της νόσου ενώ πρόσφατα έχει περιγραφεί μεγαλύτερη πιθανότητα μετάδοσης από τον πατέρα παρά από τη μητέρα. Η ΨΑ έχει συσχετισθεί με αντιγόνα του συστήματος μείζονος ιστοσυμβατότητας τάξης Ι όπως το B13, B17 και Cw6, ενώ το αντιγόνο B27 σχετίζεται ειδικότερα με την μορφή της ΨΑ που προσβάλλει τον αξονικό σκελετό. Η πιό πρόσφατη γενετική συσχέτιση είναι με τον πολυμορφισμό MICA-A9 (MHC chain related gene A). Αναφέρεται οτι ο πολυμορφισμός αυτός συσχετίζεται ειδικά με την ΨΑ και όχι με την ψωρίαση μόνο. Από τους περιβαλλοντικούς παράγοντες αναφέρουμε τον πιθανό ρόλο λοιμώξεων, τραυματισμού ή stress. Τα τελευταία χρόνια αθροίζονται ολοένα και περισσότερα δεδομένα που συνηγορούν για πιθανό κεντρικό ρόλο των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων στην παθογένεια της νόσου. Πρόσφατες μελέτες έχουν αναδείξει την παρουσία ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων στον αρθρικό υμένα όσο και στις δερματικές βλάβες ασθενών με ΨΑ. Τα παραπάνω δεδομένα ενισχύονται επίσης από την ανάδειξη της κλινικής αποτελεσματικότητας στην ΨΑ (αλλά και στην ψωρίαση) νεώτερων βιολογικών ή μή θεραπειών που στοχεύουν εκλεκτικά τα Τ λεμφοκύτταρα. Οι παραπάνω παρατηρήσεις, στις οποίες θα αναφερθούμε αναλυτικότερα στη συνέχεια, αποτέλεσαν και το βασικό ερέθισμα για τον σχεδιασμό της παρούσας μελέτης. Επιλέξαμε να μελετήσουμε την έκφραση του CD40L, ενός μορίου που εκφράζεται στη επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων μόνο μετά απο ενεργοποίησή τους. 6
Το μόριο αυτό αποτελεί πρώιμο δείκτη ενεργοποίησης των Τ λεμφοκυττάρων και κατέχει έναν καλά τεκμηριωμένο και ιδιαίτερα σημαντικό βιολογικό ρόλο. Με δεδομένο ότι η παθογένεια της ΨΑ παραμένει σε μεγάλο ποσοστό άγνωστη και η θεραπεία της εξακολουθεί να είναι κατά βάση εμπειρική στηριζόμενη στην μη ειδική ανοσοκαταστολή, θεωρούμε ότι η περαιτέρω μελέτη της βιολογικής συμπεριφοράς των Τ λεμφοκυττάρων στην ΨΑ πιθανότατα θα συνεισφέρει στην καλύτερη κατανόηση της παθογένειας της νόσου. Ειδικότερα η μελέτη της φυσιολογίας της έκφρασης του προαναφερόμενου μορίου CD40L στα Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με ΨΑ, για την οποία δεν υπάρχουν έως τώρα δεδομένα στην διεθνή βιβλιογραφία, θα μπορούσε να αποφέρει νέα στοιχεία για την βιολογική συμπεριφορά των Τ λεμφοκυττάρων στην ΨΑ. Τα δεδομένα αυτά θα μπορούσαν να βοηθήσουν προς την κατεύθυνση ανάπτυξης νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων. Είναι γνωστό ότι τα τελευταία χρόνια αποτελεί πεδίο έντονου ερευνητικού ενδιαφέροντος η μελέτη των συνδιεγερτικών μορίων (π.χ. CD40-CD40L) και δοκιμάζονται συνεχώς τρόποι εκλεκτικής θεραπευτικής παρέμβασης στο επίπεδο αυτό, καθώς θεωρείται σαφώς πιο «έξυπνος» τρόπος ανοσοπαρέμβασης στο επίπεδο του Τ λεμφοκυττάρου, σε σχέση με τις κλασικές θεραπείες που προκαλούν σοβαρότερη ανοσοκαταστολή. Στο γενικό μέρος που ακολουθεί θα αναφερθούν συνοπτικά τα νεώτερα κυρίως δεδομένα που αναδεικνύουν τον πιθανό κεντρικό ρόλο των Τ λεμφοκυττάρων στην παθογένεια της ΨΑ. Στην συνέχεια θα παρατεθούν συνοπτικά τα έως τώρα γνωστά στοιχεία για την βιολογική σημασία του CD40L καθώς και για την φυσιολογία της έκφρασής του στα Τ λεμφοκύτταρα, τόσο στο υγιές ανοσολογικό σύστημα όσο και στα πλαίσια κάποιων νοσημάτων, με ιδιαίτερη έμφαση στα συστηματικά ρευματικά νοσήματα. Θα γίνει επίσης αναφορά στην δράση της 7
κυκλοσπορίνης, ενός αναστολέα της καλσινευρίνης, που χρησιμοποιείται ήδη ευρέως στην θεραπεία πολλών Τ-εξαρτώμενων νοσημάτων, ανάμεσα στα οποία είναι τόσο η ψωρίαση όσο και η ΨΑ. Η δράση της κυκλοσπορίνης στα Τ λεμφοκύτταρα ασθενών με ΨΑ αναλύθηκε στη μελέτη μας, επειδή αποτελεί γνωστό αναστολέα της επαγωγής του επιφανειακού μορίου CD40L. Μετά το γενικό μέρος ακολουθεί η παρουσίαση των πειραματικών δεδομένων που προέκυψαν από την ανάλυση των τριών ομάδων ατόμων που συμμετείχαν στην μελέτη μας. Αναλύσαμε δεδομένα απο ασθενείς με ΨΑ, ασθενείς-μάρτυρες και υγιείς εθελοντές. Μελετήσαμε την έκφραση του CD40L στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων ex vivo σε κατάσταση ηρεμίας αλλά και μετά από διέγερσή τους in vitro με ή χωρίς την παρουσία κυκλοσπορίνης. Μετά την ανάλυση των αποτελεσμάτων ακολουθεί συζήτησή τους. Η μελέτη αυτή πραγματοποιήθηκε υπό την επίβλεψη του καθηγητή κ. Α. Αντωνόπουλου και την καθοδήγηση του καθηγητή κ. Ν. Ζούμπου και του λέκτορα κ. Σ.Ν. Λιόση. Εκπονήθηκε εξ ολοκλήρου στο ερευνητικό εργαστήριο του Αιματολογικού Τμήματος του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Πατρών. Οφείλω να ευχαριστήσω θερμά τον διευθυντή του ανωτέρω τμήματος, καθηγητή κ. Ζούμπο αλλά και τις υπεύθυνες του εργαστηρίου κ. Γαλάνη και κ. Θανοπούλου για την βοήθειά τους καθ όλη την δειάρκεια της μελέτης. Ο κ. Λιόσης και η κ. Θανοπούλου αφιέρωσαν πολύ από τον χρόνο τους για να με εισαγάγουν σε όλες τις τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν στην εκπόνηση της παρούσας μελέτης. Ιδιαίτερα οφείλω να ευχαριστήσω τον καθηγητή μου κ. Αντωνόπουλο και τον κ. Λιόση για την αμέριστη συμπαράσταση, καθοδήγηση και βοήθεια που μου παρείχαν κατά την πραγματοποίηση της παρούσας μελέτης. 8
Το Γενικό μέρος της παρούσας διδακτορικής διατριβής δημοσιεύθηκε υπό την μορφή άρθρου ανασκόπησης στο περιοδικό Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology ως: Daoussis D, Andonopoulos AP, Liossis SN. Targeting CD40L: a promising therapeutic approach. Clin Diagn Lab Immunol. 2004 Jul; 11(4): 635-41. Το ερευνητικό τμήμα έγινε αποδεκτό προς δημοσίευση στο περιοδικό Rheumatology ως: Daoussis D, Antonopoulos I, Andonopoulos AP, Liossis SN. Increased expression of CD40L (CD154) on stimulated T cells from patients with psoriatic arthritis. (in press) 9
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 10
Ο ρόλος του Τ λεμφοκυττάρου στην παθογένεια της ΨΑ Ο ρόλος των Τ λεμφοκυττάρων θεωρείται ιδιαίτερα σημαντικός στην παθογένεια της δερματικής ψωρίασης. Η παρουσία αυξημένου αριθμού Τ λεμφοκυττάρων είναι σταθερό εύρημα στις βιοψίες ψωριασικών δερματικών βλαβών, όπου στην επιδερμίδα απαντώνται κυρίως CD8 + T λεμφοκύτταρα ενώ το χόριο διηθείται από ένα μείγμα CD4 + αλλά και CD8 + Τ λεμφοκυττάρων. Τα περισσότερα από τα κύτταρα αυτά είναι ενεργοποιημένα κύτταρα μνήμης CD45RO + (2). Για να αναδειχθεί το πόσο εντυπωσιακός είναι ο βαθμός διήθησης του ψωριασικού δέρματος από τα Τ λεμφοκύτταρα, αναφέρεται χαρακτηριστικά ότι ένας ασθενής με ψωρίαση στο 20% του δέρματός του, υπολογίζεται να έχει περίπου 20 δισεκατομμύρια Τ λεμφοκύτταρα στις ψωριασικές βλάβες ενώ στο περιφερικό του αίμα κυκλοφορούν μόλις 8 δισεκατομμύρια Τ λεμφοκύτταρα. Ο πιθανός κεντρικός ρόλος των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων αναδεικνύεται επίσης ολοένα και περισσότερο όσον αφορά στην παθογένεια της ΨΑ, με βάση νεώτερα δεδομένα, καθώς αναγνωρίζονται σε ικανό αριθμό τόσο στον αρθρικό υμένα όσο και στο αρθρικό υγρό ασθενών με ΨΑ. Ειδικότερα στον αρθρικό υμένα ασθενών με ΨΑ υπερτερούν τα CD4 + Τ λεμφοκύτταρα σε αντιδιαστολή με το αρθρικό υγρό και τις ενθέσεις όπου φαίνεται να υπερτερούν τα CD8 + Τ λεμφοκύτταρα. Πρόσφατα αναδείχθηκε ότι κλώνοι Τ λεμφοκυττάρων, κυρίως CD8 +, από αρθρικό υγρό ασθενών με ΨΑ, εκπτύσσονται με τρόπο τέτοιο, που πιθανώς υποδηλώνει ότι καθοδηγούνται από την παρουσία κάποιου αυτοαντιγόνου (3). Υπάρχουν επίσης στοιχεία που αναδεικνύουν ομοιότητες μεταξύ Τ κυτταρικών 11
κλώνων που επάγονται πειραματικά από Τ λεμφοκύτταρα δερματικών βλαβών και από Τ λεμφοκύτταρα από το αρθρικό υγρό ασθενών με ΨΑ (4). Ακόμα περισσότερα δεδομένα για τον πιθανό παθογενετικό ρόλο των Τ λεμφοκυττάρων προκύπτουν από την κλινική αποτελεσματικότητα νεώτερων βιολογικών θεραπειών που στοχεύουν εκλεκτικά το Τ λεμφοκύτταρο στην ψωρίαση και την ΨΑ. 1) Το μονοκλωνικό αντίσωμα efalizumab αναστέλλει την αλληλεπίδραση του επιφανειακού μορίου LFA-1, που εκφράζεται στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων, με τους συνδέτες του (ICAM-1, 2, 3), και έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στην ψωρίαση. Η αποτελεσματικότητά του πιθανά οφείλεται στην αναστολή της σύνδεσης των Τ λεμφοκυττάρων με τα ενδοθηλιακά κύτταρα, την παρεμπόδιση της εισόδου των Τ λεμφοκυττάρων από το περιφερικό αίμα στο δέρμα και στην αναστολή της ενεργοποίησής τους (5). 2) Η χιμαιρική πρωτείνη alefacept συνδέεται με το μόριο CD2 στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων και κινητοποιεί την διαδικασία απόπτωσης για το Τ λεμφοκύτταρο. Το μόριο αυτό φαίνεται να είναι δραστικό στην θεραπεία τόσο της ψωρίασης όσο και της ΨΑ (6). 3) Στην ψωρίαση έχει αναδειχθεί και η αποτελεσματικότητα της χιμαιρικής πρωτείνης CTLA4Ig, που αναστέλλει την αλληλεπίδραση των CD28-B7. Τα τελευταία συνιστούν ένα από τα σημαντικότερα συνδιεγερτικά μονοπάτια, απαραίτητα για την πλήρη ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων (7). Το γεγονός ότι ειδικότερα τα CD8 + T λεμφοκύτταρα πιθανά παίζουν σημαντικό ρόλο στην παθογένεια της ΨΑ υποδηλώνεται και από δύο επιπλέον στοιχεία. Το πρώτο αφορά στη συσχέτιση της ΨΑ με αντιγόνα του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας τάξης Ι. Το δεύτερο αφορά στην ενδιαφέρουσα 12
κλινική συσχέτιση με την λοίμωξη από HIV. Έχει αναφερθεί ότι οι ασθενείς με HIV λοίμωξη εμφανίζουν σε μεγαλύτερο ποσοστό και με βαρύτερη κλινική εικόνα, τόσο ψωρίαση όσο και ΨΑ. Εικάζεται οτι η δραματική μείωση των CD4 + Τ λεμφοκυττάρων στα πλαίσια της λοίμωξης από HIV οδηγεί σε υπεροχή των CD8 + Τ λεμφοκυττάρων, γεγονός που πιθανά ευοδώνει την ανάπτυξη των προαναφερόμενων νόσων (8). Όσον αφορά την παθογένεια της δερματικής ψωρίασης τα στοιχεία που υποδηλώνουν την πιθανή συμμετοχή των Τ λεμφοκυττάρων είναι ακόμα ισχυρότερα. Σε μελέτη που έγινε με την χρήση SCID (Severe Combined Immunodefficiency) ποντικιών, στα οποία είχε εμφυτευθεί ανθρώπινο φυσιολογικό δέρμα, διαπιστώθηκε εμφάνιση ψωριασικών βλαβών στο μόσχευμα και το παρακείμενο δέρμα, μετά από έγχυση στα ποντίκια ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων που ελήφθησαν από ασθενείς με ψωρίαση (9). 13
Η βιολογική σημασία της συνδιέγερσης και ο ρόλος της στην ενεργοποίηση του Τ λεμφοκυττάρου H ενεργοποίηση των λεμφοκυττάρων αποτελεί κεντρικό γεγονός της επίκτητης ανοσολογικής απάντησης. Φυσιολογικά, η ενεργοποίηση αυτή είναι μια αυστηρά ελεγχόμενη διεργασία. Η ενεργοποίηση των Τ λεμφοκυττάρων είναι αναγκαία για όλες τις θυμοεξαρτώμενες ανοσολογικές αποκρίσεις και προϋποθέτει την συμμετοχή δύο διαφορετικών ενδοκυττάριων μηνυμάτων. Το πρώτο μήνυμα είναι αντιγονοειδικό. Μεταφέρεται μέσω του αντιγονικού υποδοχέα επιφανείας του Τ λεμφοκυττάρου (TCR), όταν το αντιγόνο παρουσιάζεται κατάλληλα στο Τ λεμφοκύτταρο σε συνδυασμό με τα μόρια του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας, που βρίσκονται πάνω στην κυτταρική μεμβράνη των αντιγονοπαρουσιαστικών κυττάρων (APC). Τα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα δεν παρουσιάζουν απλά παθητικά το αντιγόνο, αλλά είναι υπεύθυνα και για την παροχή του δεύτερου μηνύματος. Το δεύτερο αυτό μήνυμα είναι απαραίτητο για την πλήρη και παραγωγική ενεργοποίηση του Τ λεμφοκυττάρου μέσω μιας διαδικασίας που καλείται συνδιέγερση. Η σύνδεση του αντιγόνου με τον TCR χωρίς συνδιεγερτικό μήνυμα δεν οδηγεί σε παραγωγική ενεργοποίηση του Τ λεμφοκυττάρου. Τέτοια Τ λεμφοκύτταρα είναι ανίκανα να πολλαπλασιαστούν και συχνά αποπίπτουν, δεν μπορούν να παράγουν κυτοκίνες και δεν απαντούν σε άλλη ενεργοποίηση, μπαίνοντας σε μια κατάσταση που καλείται ανεργία. Η αρχική άποψη ήταν ότι διαλυτοί παράγοντες, όπως π.χ. οι κυτοκίνες, ήταν οι καίριοι μεσολαβητές των συνδιεγερτικών μηνυμάτων. Αργότερα έγινε φανερό ότι η συνδιέγερση είναι μια διαδικασία που απαιτεί άμεση κυτταρική επαφή. Τα συνδιεγερτικά μηνύματα μεταφέρονται μέσω της αλληλεπίδρασης διαφόρων ζευγών υποδοχέων-αποδοχέων 14
των κυτταρικών επιφανειών του Τ λεμφοκυττάρου και του αντιγονοπαρουσιαστικού κυττάρου (10) H διαδικασία της συνδιέγερσης είναι παράλληλα και μια «ασφαλιστική δικλείδα» του ανοσολογικού συστήματος, προκειμένου να αποτραπεί η υπερβολική διέγερση των λεμφοκυττάρων, και δρα σε πολλαπλά επίπεδα. Επιτρέπει την πλήρη ενεργοποίηση, αναστέλει την ανεργία ή την απόπτωση, προωθεί την διαφοροποίηση προς κατάσταση λειτουργικότητας ή προς τη δημιουργία κυττάρου μνήμης, διατηρεί τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και επιτρέπει την διακυτταρική επικοινωνία και συνεργασία. Το πρώτο ζευγάρι υποδοχέα-αποδοχέα που αποδείχθηκε ότι έχει συνδιεγερτική δράση ήταν το CD28-B7. Άλλα παρόμοια ζεύγη μορίων επιφανείας όπως το CD40-CD40 ligand (CD40L), CD2-CD58, CD11-CD18/ICAM-1 και VLA4- VCAM περιγράφηκαν αργότερα (11). 15
Ο βιολογικός ρόλος του CD40L To μόριο CD40L είναι μέλος της ευρύτερης οικογένειας επιφανειακών μορίων που ονομάζεται «υπερ-οικογένεια των υποδοχέων του παράγοντα νέκρωσης των όγκων (TNF)» (TNF receptor superfamily of molecules). Πρόκειται για μια τύπου ΙΙ μεμβρανική γλυκοπρωτεΐνη με 261 αμινονοξέα, η έκφραση της οποίας περιορίζεται κυρίως στην υποομάδα των CD4 + T λεμφοκυττάρων. Το μόριο CD40L φυσιολογικά δεν εκφράζεται στην επιφάνεια των Τ λεμφοκυττάρων στην κατάσταση της ηρεμίας. Η έκφραση του CD40L επάγεται άμεσα μετά την ενεργοποίηση του Τ λεμφοκυττάρου και για το λόγο αυτό αποτελεί έναν πρώιμο δείκτη της ενεργοποίησής του. Ο αποδοχέας του, το επιφανειακό μόριο CD40, εκφράζεται συνεχώς στην επιφάνεια των Β λεμφοκυττάρων, μακροφάγων και δενδριτικών κυττάρων (12). Η αλληλεπίδραση των CD40-CD40L έχει μελετηθεί εκτενώς και έχει δειχθεί ότι παίζει πολλαπλό λειτουργικό ρόλο στο υγιές ανοσολογικό σύστημα. Ενισχύει την αντιγονοειδική απόκριση του Τ λεμφοκυττάρου, μέσω της ενεργοποίησης των δενδριτικών κυττάρων και της επαγωγής της έκκρισης της ιντερλευκίνης 12 (IL-12) από αυτά τα κύτταρα, ώστε να εστιασθεί η ανοσολογική απάντηση στο αντιγόνο που έχει συνδεθεί με τον TCR (13, 14, 15, 16,17). Διατηρεί την απάντηση αυτή για όσο διάστημα το αντιγόνο παραμένει δεσμευμένο και επάγει την κινητοποίηση συγκεκριμένων λειτουργιών στα διαντιδρώντα CD40 + κύτταρα στόχους. Για παράδειγμα, η δέσμευση του CD40 που εκφράζεται στην επιφάνεια των ενδοθηλιακών κυττάρων από το CD40L της επιφάνειας ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων οδηγεί στην αύξηση της έκφρασης προσκολλητικών μορίων, όπως ICAM-1, VCAM-1 και E-selectin, που οδηγεί σε αυξημένη διαπίδυση των λευκοκυττάρων (18, 19). Η ενεργοποίηση των APC από την αλληλεπίδραση του CD40-CD40L οδηγεί στην επαγωγή της παραγωγής προφλεγμονωδών κυτοκινών, 16
χημειοκινών, ΝΟ, και μεταλλοπρωτεϊνασών. Η αλληλεπίδραση των CD4 + CD40L + T λεμφοκυττάρων με το CD40 των Β λεμφοκυττάρων οδηγεί στη διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, την αλλαγή τάξης της παραγόμενης/εκκρινόμενης ανοσοσφαιρίνης και την δημιουργία Β λεμφοκυττάρων μνήμης. Η φυσιολογική λειτουργία του CD40L αναδεικνύεται στους ασθενείς με συγγενή ανεπάρκεια του CD40L. Αυτή η φυλοσύνδετα κληρονομούμενη ανοσοανεπάρκεια, το σύνδρομο hyper-igm, χαρακτηρίζεται από την απουσία ώριμων ισοτύπων αντισωμάτων και την επιμονή υψηλών τίτλων IgM, επιβεβαιώνοντας ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ του CD40 στα Β λεμφοκύτταρα και του CD40L στα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα είναι κρίσιμη για την αλλαγή τάξης των ανοσοσφαιρινών (20). 17
Ρύθμιση της έκφρασης του CD40L Η έκφραση του CD40L φυσιολογικά ευρίσκεται κάτω από αυστηρό έλεγχο. Η δέσμευση του TCR κινητοποιεί την επαγωγή της έκφρασης του CD40L στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων. Επιπλέον, συνδιεγερτικά μηνύματα ή κυτοκίνες ενισχύουν την παραπάνω έκφραση. Η μέγιστη έκφραση του mrna του CD40L γίνεται 1-2 ώρες μετά τη διέγερση του Τ λεμφοκυττάρου, ενώ έκφραση της πρωτεϊνης CD40L μεγιστοποιείται στις 4-6 ώρες. Ακολουθεί ταχεία κάθαρση του μορίου από την κυτταρική επιφάνεια, έτσι ώστε να είναι μόλις ανιχνεύσιμο στις 16 ώρες (21). Αυτή η παροδική έκφραση του CD40L δίνει στο ενεργοποιημένο Τ λεμφοκύτταρο μια σύντομη ευκαιρία να μεταφέρει βοηθητικά μηνύματα στα αλληλεπιδρώντα Β λεμφοκύτταρα, μακροφάγα ή δενδριτικά κύτταρα. Άλλα επικουρικά μόρια επιφανείας έχουν επίσης βρεθεί ότι βοηθούν την έκφραση του CD40L, όπως το CD28, LFA-3 και ICOS (22, 23, 24). Συγκεκριμένες κυτοκίνες όπως η IL-2, IL-12 και IL-15 επάγουν την έκφραση του CD40L, ενώ άλλες, όπως η IL-4 και IL-10 την αναστέλλουν (25, 26, 27). Υπάρχουν ισχυρές ενδείξεις ότι το ελεύθερο ενδοκυττάριο ιονισμένο ασβέστιο (Ca +2 ) είναι ο κατ εξοχήν δεύτερος μεσολαβητής που οδηγεί τελικά στην μεταγραφή του γονιδίου του CD40L. Η αποφωσφορυλίωση του μεταγραφικού παράγοντα NFAT (nuclear factor of activated T cells) από την καλσινευρίνη, που είναι μια Ca +2 -εξαρτώμενη φωσφατάση, οδηγεί στην ενεργοποίηση του NFAT και την μεταφορά του στον πυρήνα. Ο ενεργοποιημένος ΝFΑΤ, με την συνεργασία ενός άλλου μεταγραφικού παράγοντα, του AP-1 (activating protein-1), παίζει καθοριστικό ρόλο στην μεταγραφική ρύθμιση της επαγωγής του CD40L. Η κυκλοσπορίνη Α (CsA), ένας ισχυρός αναστολέας της καλσινευρίνης, έχει δειχθεί ότι ελαχιστοποιεί την έκφραση του CD40L στα φυσιολογικά Τ λεμφοκύτταρα. Ειδικότερα, μόνο το 4% 18
των Τ λεμφοκυττάρων από υγιείς δότες εκφράζουν το CD40L μετά από in vitro διέγερση παρουσία CsA, σε αντιδιαστολή με 62% σε απουσία της CsA (21). Η έκφραση του CD40L ελέγχεται επίσης και σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Οι ενεργοποιημένες απο stress κινάσες ΜΑΡ (mitogen activated protein) θεωρούνται ότι συνεισφέρουν στην σταθερότητα του CD40L mrna. Τελικώς, η ρύθμιση επιτυγχάνεται και σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο, είτε με ενδοκυττάρωση είτε με ενζυμική αποδόμηση του επιφανειακού μορίου CD40L από μεταλλοπρωτεϊνάσες, οδηγώντας στο σχηματισμό διαλυτού CD40L (scd40l) ( 12). 19
ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ ΤΟΥ ΡΟΛΟΥ ΤΗΣ ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΗΣ CD40-CD40L ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΑ ΝΟΣΗΜΑΤΑ I. Μη ρευματικά νοσήματα Μεταμοσχεύσεις Η χειρουργική των μεταμοσχεύσεων δε θα εξελισσόταν τόσο εντυπωσιακά τις τελευταίες δεκαετίες χωρίς την ανάπτυξη ικανών ανοσοκατασταλτικών παραγόντων που θα ελαχιστοποιούσαν την πιθανότητα της απόρριψης του μοσχεύματος. Μονοκλωνικά αντισώματα (MAb) έναντι του CD40L έχουν χρησιμοποιηθεί ως ανοσοκατασταλτική θεραπεία σε πολλά μοντέλα μεταμόσχευσης σε ζώα. Σε πρωτεύοντα θηλαστικά, η χορήγηση αντί-cd40l ΜAb καθυστερεί την απόρριψη αλλομοσχεύματος, ενώ ο συνδυασμός με το CTLA4Ig, μια χιμαιρική πρωτεΐνη αποτελούμενη από το εξωκυττάριο τμήμα του επιφανειακού μορίου CTLA4 και το Fc τμήμα της ανθρώπινης IgG1, που μπλοκάρει το μονοπάτι CD28-B7, έχει αθροιστική και συνεργική δράση. Αυτή η συνδυασμένη θεραπεία διατηρεί τη βιωσιμότητα νεφρικού αλλομοσχεύματος σε πρωτεύοντα θηλαστικά και αυξάνει την επιβίωση δερματικού μοσχεύματος σε ποντίκια (28, 29). Η χορήγηση αντί-cd40l ΜAb μετά από 60 ημέρες συμβατικής ανοσοκαταστολής με CsA ήταν αποτελεσματική θεραπεία σε μοντέλο νεφρικού αλλομοσχεύματος σε πιθήκους, αν και είναι γνωστό ότι η CsA καταστέλλει την έκφραση του CD40L στα Τ λεμφοκύτταρα (30). Η έκφραση του γονιδίου του CD40L έχει βρεθεί ότι αυξάνει 4 φορές σε περιπτώσεις οξείας απόρριψης. Αυτό θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μη επεμβατική μέθοδος παρακολούθησης της λειτουργίας του αλλομοσχεύματος και επίσης για τον 20
προσδιορισμό της βιολογικής αποτελεσματικότητας κλασικών ανοσοκατασταλτικών παραγόντων, όπως η CsA και το tacrolimus που αναστέλλουν την έκφραση του CD40L (31). Σε μοντέλα μεταμόσχευσης σε ζώα, οι αναστολείς καλσινευρίνης καταστέλλουν την έκφραση του CD40L στα Τ λεμφοκύτταρα in vitro, αλλά όχι στο λεμφικό ιστό, υποδηλώνοντας ότι το μονοπάτι του CD40-CD40L παραμένει λειτουργικό κατά τη θεραπεία με αυτούς τους παράγοντες, γεγονός που μπορεί να συμβάλλει στην απόρριψη του αλλομοσχεύματος σε κλινικό επίπεδο (32). Αθηροσκλήρυνση Η τρέχουσα άποψη για την αθηροσκλήρηνση, την πιο θανατηφόρο νόσο στον δυτικό κόσμο σήμερα, είναι ότι πρόκειται για μια χρόνια, εκφυλιστική, φλεγμονώδη διεργασία στην οποία το ανοσολογικό σύστημα πιθανώς παίζει σημαντικό ρόλο. Το CD40 και το CD40L υπερεκφράζονται σε αθηρωματικές βλάβες σε ανθρώπους και πειραματόζωα. Η σύνδεση του CD40 με κύτταρα που σχετίζονται με την αθηρωματική πλάκα, όπως τα ενθοθηλιακά κύτταρα, λεία μυικά κύτταρα, και μακροφάγα, οδηγεί σε αυξημένη έκφραση των μεσολαβητών που προάγουν την αθηρογένεση, όπως κυτταροκίνες, χημειοκίνες, αυξητικοί παράγοντες και μεταλλοπρωτεϊνάσες. Η αναστολή της αλληλεπίδρασης του CD40-CD40L με αντί- CD40L MAb σε ποντίκια οδηγεί σε μειωμένο σχηματισμό και εξέλιξη της αθηρωματικής βλάβης και επίσης, προωθεί τέτοιες αλλαγές στην δομή της αθηρωματικής βλάβης, που μπορεί να είναι σημαντικές στην σταθεροποίηση της αθηρωματικής πλάκας στον ανθρωπο (33). Τα αιμοπετάλια επίσης εκφράζουν CD40L και θεωρείται ότι συμβάλλουν σημαντικά στην προσέλκυση φλεγμονωδών κυττάρων στο κατεστραμένο ενδοθήλιο in vivo (34). Eνεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα που εκφράζουν CD40L εντοπίζονται 21
στην αθηρωματική πλάκα, γεγονός που ενισχύει την υπόθεση ότι τα ενεργοποιημένα CD4 + T λεμφοκύτταρα είναι οι ενορχηστρωτές της αθηρωματικής διαδικασίας (35). Ψωρίαση Σε μελέτη των Denfeld και συν. αναφέρεται αυξημένη έκφραση του CD40 στα κερατινοκύτταρα που ελήφθησαν από ψωριασικές βλάβες, έπειτα από καλλιέργεια in vitro. Στη μελέτη αυτή διατυπώνεται για πρώτη φορά η υπόθεση ότι, η αλληλεπίδραση του CD40 στα κερατινοκύτταρα με το CD40L στην επιφάνεια των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων πιθανά να έχει κάποιο ρόλο στην παθογένεια της ψωρίασης (36). Οι Pasch και συν. μελέτησαν εκτενέστερα την έκφραση του CD40 λαμβάνοντας βιοψίες από 10 ασθενείς με ψωρίαση τόσο από προσβεβλημένο όσο και από υγιές δέρμα. Επιβεβαίωσαν την αυξημένη έκφραση του CD40 στην κυτταρική μεμβράνη των κερατινοκυττάρων από ασθενείς με ψωρίαση ενώ διαπίστωσαν οτι μικρός αριθμός από τα άφθονα Τ λεμφοκύτταρα που διηθούν το ψωριασικό δέρμα εκφράζουν CD40L. Ειδικότερα, διαπίστωσαν την παρουσία CD40L + Τ λεμφοκυττάρων στο προσβεβλημένο δέρμα 7 εκ των 10 ασθενών με ψωρίαση. Σημειώνεται ότι στους 6 από τους 7 τα προαναφερόμενα λεμφοκύτταρα βρίσκονταν σε άμεση γειτνίαση με CD40 + κύτταρα. Σε μη προσβεβλημένο δέρμα, μόνο 2 από τους 10 ασθενείς εμφάνιζαν CD40L + Τ λεμφοκύτταρα και μόνο σε έναν τα λεμφοκύτταρα αυτά βρίσκονταν σε γειτνίαση με CD40 + κύτταρα. Οι ερευνητές αυτοί απέδειξαν επίσης ότι η σύνδεση του CD40 στην επιφάνεια των κερατινοκυττάρων με το CD40L in vitro, οδηγεί σε αυξημένη παραγωγή των IL-8, RANTES και MCP-1, κυτοκινών που βρίσκονται σε αφθονία στο ψωριασικό δέρμα. Τα παραπάνω δεδομένα υποστηρίζουν τον πιθανό παθογενετικό ρόλο του άξονα CD40-CD40L στην ψωρίαση (37). 22
Αλλα μη ρευματικά νοσήματα όπου το ζεύγος CD40-CD40L πιθανά παίζει ρόλο αναφέρονται συνοπτικά στον Πίνακα 1. Πίνακας 1. Μη ρευματικές παθήσεις στις οποίες ο άξονας CD40-CD40L πιθανά παίζει ρόλο. AIDS Καρκίνος Χρόνια λεμφογενής λευχαιμία Νόσος Hodgkin Πνευμονική ίνωση Alzheimer Το CD40L είναι απαραίτητο για την ανοσολογική άμυνα απέναντι στον ιό της ανθρώπινης επίκτητης ανοσοανεπάρκειας και τις ευκαιριακές λοιμώξεις (38,39). Αυτό μπορεί να εξηγεί τις ομοιότητες των κλινικών εκδηλώσεων του AIDS με αυτές της συγγενούς ανεπάρκειας CD40L (hyper-igm syndrome). Έχουν γίνει προσπάθειες να ενισχυθεί η ανοσία έναντι των όγκων. Γονιδιακή θεραπεία με από του στόματος χορήγηση CD40L δοκιμάστηκε πρόσφατα στο λέμφωμα (40). Τα κακοήθη κύτταρα εκφράζουν CD40 και CD40L και η αλληλεπίδρασή τους μπορεί να συμβάλλει στην αύξηση του όγκου, καθιστώντας το CD40L έναν πιθανό στόχο (41). Το σχετικό με το CD40L μονοπάτι επιβίωσης είναι ενισχυμένο σε ασθενείς με κακοήθειες Β κυτταρικής αρχής (42). Η αλληλεπίδραση των CD40-CD40L οδηγεί σε ενεργοποίηση των ινοβλαστών και παραγωγή της προϊνωτικής κυτοκίνης TGF-β. Ινοβλάστες από υγιή και ινωτικό πνεύμονα εκφράζουν CD40L. Η έκφραση αυτή ενισχύεται από την προϊνωτική κυτοκίνη IL-13 και μειώνεται από την IFN-γ, μια κυτοκίνη με αντι-ινωτικές ιδιότητες. Ινοβλάστες από πνεύμονα ασθενών με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση εκφράζουν υψηλά επίπεδα CD40L, σε σύγκριση με ινοβλάστες από υγιή πνεύμονα (43). Το CD40-CD40L ενισχύει σημαντικά την ενεργοποίηση των μικρογλοιακών κυττάρων (44). 23
II. Ρευματικά νοσήματα Συστηματικός ερυθηματώδης λύκος (ΣΕΛ) Εκφραση του CD40L στους ασθενείς με ΣΕΛ Οι Desai-Mehta και συν. έχουν αναφέρει ότι μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMC) από ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ εμφανίζουν αύξηση κατά 21 φορές του ποσοστού των CD4 + CD40L + κυττάρων σε σύγκριση με υγιείς δότες. Σε περαιτέρω διέγερση των PBMC με αντί-cd3 MAb, το ποσοστό των CD4 + CD40L + κυττάρων αυξήθηκε 5 φορές στούς υγιείς δότες αλλά μόνο 1.4 φορές στους ασθενείς με ενεργό λύκο. Πάντως το ποσοστό των CD40L + T λεμφοκυττάρων εξακολουθούσε να παραμένει υψηλότερο στην ομάδα ασθενών με ενεργό λύκο. Τα PBMC των ασθενών με ΣΕΛ σε ύφεση συμπεριφέρονταν παρόμοια με αυτά της ομάδας ελέγχου. Παρόμοιες παρατηρήσεις έγιναν και όσον αφορά την έκφραση του CD40L από τα CD8 + T λεμφοκύτταρα που απομονώθηκαν από ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ (22 φορές υψηλότερη έκφραση από την ομάδα ελέγχου). Τα Β λεμφοκύτταρα επίσης υπερεκφράζουν CD40L στους ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ σε παρόμοια επίπεδα με αυτά που παρατηρούνται στα ενεργοποιημένα Τ λεμφοκύτταρα. Τα φυσιολογικά Β λεμφοκύτταρα στον άνθρωπο εκφράζουν πολύ χαμηλά επίπεδα CD40L και μόνο μετά από κατάλληλη επεξεργασία, σε αντιδιαστολή με τα Β λεμφοκύτταρα ασθενών με ενεργό ΣΕΛ που εκφράζουν CD40L αυτόματα (45). Σε άλλη μελέτη των Koshy και συν. ενεργοποιημένα in vitro PBMC από υγιείς δότες ή μάρτυρες με άλλα νοσήματα παρουσίασαν υψηλή έκφραση του CD40L με προοδευτική μείωση στα βασικά επίπεδα στις 48 ώρες, ενώ τα PBMC ασθενών με ΣΕΛ συνέχισαν να εκφράζουν υψηλά επίπεδα CD40L στο ίδιο χρονικό σημείο. Στην 24
μελέτη αυτή δεν αναδείχθηκε κάποια συσχέτιση της έκφρασης του CD40L με την ενεργότητα του νοσήματος (46). Οι Higuchi και συνεργάτες επιβεβαίωσαν αυτά τα αποτελέσματα τόσο στον ΣΕΛ όσο και σε πειραματικά μοντέλα λύκου σε ποντίκια, υποθέτοντας ότι η έκτοπη έκφραση του CD40L στα Β λεμφοκύτταρα του ΣΕΛ πιθανά να παίζει κρίσιμο ρόλο στην εμφάνιση της νόσου. Διαγονιδιακά ποντίκια επιρρεπή σε λύκο, που εκφράζουν CD40L στα Β λεμφοκύτταρα, παράγουν αυτόματα αυτοαντισώματα, και επιπλέον, τα μισά από αυτά αναπτύσσουν σπειραματονεφρίτιδα με εναπόθεση ανοσοσυμπλεγμάτων (47). Οι Devi και συν. επίσης επιβεβαίωσαν την υψηλή έκφραση του CD40L στα Τ και Β λεμφοκύτταρα του ΣΕΛ. Ειδικώτερα, 45% των Τ λεμφοκυττάρων ασθενών με ΣΕΛ εκφράζουν CD40L σε σύγκριση με μόνο 8-18% των Τ λεμφοκυττάρων από υγιείς δότες ή ασθενείς με ΡΑ. Επιπλέον, 30% από τους ασθενείς με ΣΕΛ που εξετάσθηκαν είχαν υψηλή έκφραση του CD40L και στα Β λεμφοκύτταρα (48). Πάντως, σε αντίθεση με τα παραπάνω αποτελέσματα, υπάρχει μια αναφορά στην οποία δεν διαπιστώθηκαν αλλαγές στην έκφραση του CD40L στα λεμφοκύτταρα του ΣΕΛ. Οι ερευνητές αυτοί βρήκαν υψηλή έκφραση του CD86 στα Β λεμφοκύτταρα του ΣΕΛ, το οποίο είναι ένα άλλο σημαντικό συνδιεγερτικό μόριο (49). Σε μια άλλη μελέτη βρέθηκε διαταραχή της έκφρασης του CD40L στα μονοκύτταρα ασθενών με ενεργό ΣΕΛ. Eξετάστηκαν 23 ασθενείς με ενεργό ΣΕΛ σε σύγκριση με 16 υγιή άτομα. Τα αποτελέσματα έδειξαν αύξηση κατά 7 φορές του ποσοστού των μονοκυττάρων που εξέφραζαν CD40L στους ασθενείς με ΣΕΛ σε σχέση με τους υγιείς. Η έκφραση του CD40L επιβεβαιώθηκε σε επίπεδο mrna και πρωτεΐνης και είχε σημαντική συσχέτιση με την ενεργότητα του νοσήματος (50). Το CD40L αποκόπτεται από την κυτταρική επιφάνεια των ενεργοποιημένων Τ λεμφοκυττάρων από μια μεταλλοπρωτεϊνάση, απελευθερώνοντας scd40l, ένα μόριο 25