. Masuratori cu microscopul optic
Tehnici de microscopie de transmisie Microscopie de baleiaj utilizand lasere Microscopie confocala Microscopie in camp apropiat Microscopie electronica Microscopie Microscopie electronica electronica de transmisie de baleiaj Microscopie de forta atomica
Componentele unui microscop Ocularul (1) contine lentilele ocular; valori tipice ale maririi: 5x, 10x si 2x Obiectivul (2); valori tipice ale maririi: 4x, 5x, 10x, 20x, 40x, 50x si 100x; interschimbabile Masa (3) sustine proba de examinat Sursa de lumina (4) situata sub masa Condensorul (5) sistem de lentile si diafragme care controleaza cantitatea de lumina prin proba si focalizarea luminii Macroviza (6) si microviza (7)
de transmisie Lumina traverseaza proba microscopica; Lumina este absorbita diferentiat de diferite componente ale probei Este nevoie frecvent de colorarea artificiala a probei pentru a vizualiza mai bine anumite componente celulare etc. Imaginea finala este virtuala, marita si rasturnata Formarea imaginii intr-un microscop optic AB obiect Ob A B imagine intermediara A B imagine finala B Ob lentila obiectiv Oc lentila ocular Oc A A F1 F1 F2 A B F1, F1 focare obiectiv F2, F2 focare ocular f1 distanta focala obiectiv f2 distanta focala ocular F2 B e e distanta intre F1 si F2
Parametrii unui microscop optic Putere P = tga2/ab Grosisment G = P/4 = e/4f1f2 G = tga2/tga1 G = A B /AB G = GobGoc Putere separatorie η=1/d Rezolutie d = 1,22λ/(2nsinu) λ - lungimea de unda a luminii folosite n indicele de refractie al mediului dintre obiectiv si preparat u unghiul de apertura al obiectivului nsinu = NA (apertura numerica a obiectivului)
Activitate experimentala Caracterizarea dimensiunii intr-o populatie de celule eritrocitare Obiective: Calibrarea microscopului (determinarea factorului de conversie CF) Masurarea diametrului a 20-30 hematii seleactate aleator de pe un frotiu de sange Calculul mediei si deviatiei standard Prezentarea grafica a rezultatelor
Activitate experimentala Calibrarea microscopului Micrometrul ocular = reticul Micrometru obiectiv diviziuni de 10 µ M / 20 µ M (dupa cum este indicat pe micrometru) Prin suprapunerea imaginii celor doua micrometre se poate determina factorul de conversie (CF) al microscopului (µ M/div) Micrometrul obiectiv este apoi inlocuit cu un frotiu de sange Φ celula (µ M) = Ndiv x CF x Obcalibrare/Obmasurare (Φcelula = diametrul unei celule; Ndiv = numarul corespunzator de diviziuni de pe reticul (diametrului celulei); Obmasurare = obiectivul cu care s-a realizat masurarea diametrelor; Obcalibrare = marirea obiectivului cu care s-a realizat calibrarea (determinarea CF)) Micrometru ocular (reticul) Micrometru obiectiv http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/measuring.html
Activitate experimentala Reticul (micrometru ocular) Determinarea CF si masurarea diametrului eritrocitar
Activitate experimentala Analiza datelor Rezultate experimentale (n celule) n X1 d2 X2 d3 X3........ dn Xn i Diametrul mediu: X= Deviatia standard: 1 n 2 σ= ( X X ) i n 1 Measured diameter d1 X 1 n
Materiale suplimentare http://www.olympusmicro.com/primer/anatomy/anatomy.htm http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/index.htm http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/mea http://www.bioteach.ubc.ca/cellbiology/confocal/index.htm
Apendix Diferite tipuri de microscopie Imagini
Microscoape optice speciale Ultramicroscopul Preparatul este iluminat lateral, imaginea finala se formeaza pe baza luminii difuzate Microscopia in contrast de faza Pentru obiecte transparente; imaginea este formata pe baza diferentei de faza indusa luminii care travereseaza medii optice diferite, din preparatul microscopic Microscopia de fluorescenta Necesita markeri speciali (fluorescenti); preparatul este iluminat in UV si emite lumina in domeniul vizibil
Imagini de microscopie optica http://www.ptei.org
Microscopie de fluorescenta Neuron hipocampic marcat cu YFP (yellow fluorescent protein) http://neuroscience.nih.gov
Microscopie in contrast de faza http://www.wallawalla.edu/academics/departments/biology/rosario/inverts/porifera/mycale_adhaerens.html
folosind lasere Microscopie confocala Raza laser este focalizata succesiv in sectiuni diferite ale preparatului. Este posibila reconstructia 3D ulterioara, pe baza imaginilor seriate Microscopie in camp apropiat Distanta dintre preparat si obiectiv este mai mica decat lungimea de unda a radiatiei laser utilizate Nu mai apar artefacte de difractie Permite rezolutii la nivel molecular
Microscopie confocala Imagine de fluorescenta a unei celule endoteliale, folosind trei markeri: rosu pentru mitocondrii, verde pentru citoschelet si albastru pentru nucleu http://www.meade.com/dsi/gallery/molecular_probes.html
Microscopia electronica de transmisie Utilizeaza lentile electromagnetice Imagine a jonctiunii neuromusculare
Microscopie electronica de baleiaj www.bacteria-world.com Vizualizarea suprafetelor