ΓΕΝΙΚΕΣ ΑΡΧΕΣ προετοιμασία του ασθενούς Οι διάφορες δοκιμασίες της αιμόστασης που εκτελούνται στο εργαστήριο προσπαθούν να μιμηθούν όσο το δυνατόν πιστότερα διαδικασίες που συμβαίνουν in vivo στον οργανισμό μας. Για τη μεγαλύτερη πιστότητα και εγκυρότητα των αποτελεσμάτων χρειάζεται να τηρούνται ορισμένοι γενικοί κανόνες. Η φλεβοκέντηση και η αιμοληψία γίνεται από έμπειρο και εκπαιδευμένο προσωπικό. Ο ασθενής πρέπει να είναι ήρεμος και ξεκούραστος, χωρίς άγχος (γιατί αυτό ενεργοποιεί την πήξη αυξάνοντας τους παράγοντες VIII, vwf, ταυτόχρονα αυξάνει και την ινωδολυτική δραστηριότητα. Ο περιβάλλων χώρος σε ευχάριστη θερμοκρασία. Επίσης, θα πρέπει να έχουν περάσει 12 ώρες περίπου από το τελευταίο γεύμα, ώστε να μην επηρεάζεται η δοκιμασία από την παρουσία λιπιδίων στο αίμα. Ο τρόπος αιμοληψίας Η αιμοληψία γίνεται με βελόνα ευρύστομη (προτιμάται πεταλούδα 19g, ή ανάλογα και με το εύρος της φλέβας). Η συλλογή γίνεται με ελεύθερη ροή εντός του βαθμονομημένου ειδικού σωληναρίου και χωρίς να ενεργοποιείται η πήξη από τον πολλαπλό τραυματισμό του τοιχώματος του αγγείου, για την αναζήτηση της φλέβας Εφόσον είναι εφικτό, αποφεύγεται η περίδεση, ή χρησιμοποιείται μόνο για να φανεί η φλέβα και πάντως όχι σφιχτά και όχι για πάνω από 1 λεπτό. Αν η εφαρμογή της περίδεσης διαρκέσει πάνω από 1 λεπτό, τότε αυξάνονται τα επίπεδα των παραγόντων VIII, vwf και του ινωδολυτικού συστήματος. Απορρίπτεται αιμοληψία με σύριγγα και αναρρόφηση! Το αίμα συλλέγεται με αναλογία όγκων 9:1 (αίματος\ αντιπηκτικού) σε πλαστικά ή σιλικονισμένα σωληνάρια που περιέχουν κιτρικό νάτριο ως αντιπηκτικό, 0,109Μ, διαλυμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα της πήξης (buffer Owren Koller, ph 7,4). Κατόπιν φυγοκεντρείται στις 2500g για 20min και διαχωρίζεται το υπερκεί- συλλογή αίματος μενο πλάσμα με προσοχή. Με αυτήν την τεχνική παίρνουμε πλάσμα φτωχό σε αιμοπετάλια (Platelet Poor Plasma- PPP). Η επεξεργασία των δειγμάτων γίνεται αμέσως, ή τοποθετούνται σε aliquots τουλάχιστον στους - 20 ο C (προτιμάται η κατάψυξη στους -80 ο C όπου και διατηρούνται για μεγάλο διάστημα). H απόψυξη των δειγμάτων γίνεται στους 37 ο C (για την αποφυγή σχηματισμού κρυοκαθιζημάτων). Για τη μελέτη της λειτουργίας των αιμοπεταλίων χρησιμοποιούμε πλάσμα που είναι πλούσιο σε αιμοπετάλια, τότε η φυγοκέντρηση γίνεται σε 800-1000 στροφές/min και επί 10 min. περιορισμοί μεθόδων Απορρίπτεται η εξέταση αιμολυμένων ή λιπαιμικών δειγμάτων. Απορρίπτεται επίσης η παρουσία μικροθρόμβων- μαρτυρεί ενεργοποίηση της πήξης γιατί επιφέρει βράχυνση των χρόνων πήξης (αυτοκαταλυτική ενεργοποίηση όλων των παραγόντων), ενώ η εκτεταμένη πήξη επιφέρει επιμήκυνση των χρόνων πήξης εξαιτίας της κατανάλωσης παραγόντων και ινωδογόνου.. 1
ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Η αιμόσταση μελετάται με δοκιμασίες σφαιρικής εμβέλειας και με δοκιμασίες αναλυτικές. Με τις πρώτες παίρνουμε πληροφορίες για τη συνολική εικόνα της αιμόστασης (στην αρχική αιμόσταση, στην πήξη και στην ινωδόλυση), ενώ με τις δεύτερες οι πληροφορίες είναι για τα επίπεδα ενός εκάστου συντελεστή της αιμόστασης. Οι αναλυτικές δοκιμασίες της αιμόστασης χωρίζονται αδρά σε χρονομετρικές (λειτουργικές), χρωμογόνες (που μπορεί να είναι επίσης λειτουργικές ή ανοσολογικές) και ανοσολογικές. Δοκιμασίες αρχικής αιμόστασης Χρόνος ροής προσκόλληση και συσσώρευση Δοκιμασίες σφαιρικής εμβέλειας Οι δοκιμασίες αυτές είναι 1 η Χρόνος ροής: είναι η μοναδική in vivo δοκιμασία γίνεται με τη μέθοδο Ivy που συνίσταται στην εφαρμογή πίεσης με το μανόμετρο 40mmHg και τομή με οξύαιχμο νυστεράκι Νο 11 σε ανάγγειο περιοχή του αντιβραχίου μήκους 1εκ. και βάθος 1 χιλ. μετράται ο χρόνος επίσχεσης της αιμορραγίας (συλλέγεται το περίσσιο αίμα μακριά από την τομή, φυσιολογικές τιμές μέχρι 8min, παθολογικές τιμές που ξεπερνούν τα 12min. 2 η Η προσκόλληση ελέγχεται με ειδικά φίλτρα από γυάλινα σφαιρίδια και μετριέται ο αριθμός των αιμοπεταλίων πριν και μετά τη δίοδο του αίματος από το φίλτρο. Ελάττωση του αριθμού > από το 30% είναι φυσιολογικό εύρημα, ελάττωση < 15% σημαίνει συνήθως αιμορραγική διάθεση (π.χ. νόσος Willebrand). 3 η Η συσσώρευση των αιμοπεταλίων ελέγχεται σε πλάσμα πλούσιο σε αιμοπετάλια ή ολικό αίμα και σε ειδικό όργανο το aggregometer. Καταγράφεται η προοδευτική συσσώρευση των αιμοπεταλίων και εκτιμάται επίσης η ταχύτητα απάντησης. Εκτιμάται η απάντηση στην επίδραση διεγερτών της λειτουργίας των αιμοπεταλίων όπως το ADP, το κολλαγόνο, η επινεφρίνη, το αραχιδονικό οξύ, η ριστοσετίνη. Σημειώνεται ότι οι δοκιμασίες αυτές ελέγχονται πάντα και σε φυσιολογικά αιμοπετάλια. Μεγίστη απάντηση >100% φανερώνει παρουσία ενεργοποιημένων αιμοπεταλίων. Ελαττωμένη απάντηση < 45% φανερώνει αιμορραγική διάθεση. Επιβάλλεται η εφαρμογή της στη διερεύνηση των αιμοπεταλιακών διαταραχών. Αποτελεί μέθοδο εκλογής (gold standard) για την παρακολούθηση της αντιαιμοπεταλιακής αγωγής, Αποκαλύπτει και υπερλειτουργά αιμοπετάλια. α β Στην εικόνα α παρουσιάζεται το aggregometer. Στη β η απάντηση στην ασπιρίνη και στο plavix μετά από διακοπή 5 ημερών! που σημαίνει ότι ακόμη διατηρείται η αναστολή σε κάποιο βαθμό ADP 0,5μΜ γ δ ADP 0,25μΜ Στις εικόνες γ και δ παρουσιάζεται η αυξημένη απάντηση σε πολύ μικρή δόση ADP νεαρού ασθενή με ΟΕΜ. Παράλληλα φαίνεται (με κόκκινο) η αντίστοιχη απάντηση φυσιολογικού ατόμου. Τα τόξα αντιστοιχούν το μπλε στον ασθενή και το μαύρο στο φ.α. 2
δοκιμασίες ελέγχου της πήξης ΧΠ, ΧΚΚ Χ Θρομβίνης Χ Ρεπτιλάσης Ελέγχουν την αιμορραγική διάθεση apcr HAT-test Ελέγχουν την θρομβοφιλική διάθεση Οι δοκιμασίες της συνολικής επάρκειας της πήξης είναι αυτές που ελέγχουν την αιμορραγική διάθεση (Χρόνος Προθρομβίνης, Χρόνος ενεργοποιημένης μερικής θρομβοπλαστίνης, Χρόνος θρομβίνης και χρόνος Ρεπτιλάσης), και αυτές που ελέγχουν θρομβοφιλική διάθεση, όπως αντίσταση στην ενεργοποιημένη Πρωτεΐνη C- activated protein C resistance) και ΗΑΤ-test που φανερώνει αντίσταση στο σύμπλεγμα θρομβίνης /αντιθρομβίνης). Ο ΧΠ πραγματοποιείται σε ΡΡΡ 0,1ml πλάσμα, 0,1ml θρομβοπλαστίνη και 0,1 ml CaCl 2. Με την προσθήκη του ασβεστίου ταυτόχρονα αρχίζει η μέτρηση του χρόνου. Το αποτέλεσμα εκφράζεται σε sec και ως λόγος (Ratio) του χρόνου του ασθενούς/το χρόνο του φυσιολογικού πλάσματος. Η θρομβοπλαστίνη που χρησιμοποιούν τα διάφορα εργαστήρια είναι ποικίλης ποιότητας, ζωικής προέλευσης και τεχνικής οδήγησε για πολλά χρόνια σε μη αποδεκτά αποτελέσματα και αυτό επέβαλλε την εφαρμογή σε κάθε παρασκευή θρομβοπλαστίνης την αναγραφή ενός δείκτη ευαισθησίας (International Sensitivity Index), ο οποίος δεν πρέπει να είναι μεγαλύτερος του 1,1 για σωστά αποτελέσματα. Ο αρχικός λόγος R υψώνεται στη δύναμη του ISI και το αποτέλεσμα αποτελεί τον International Normalized Ratio (INR). Παράταση του ΧΠ σημαίνει αιμορραγική διάθεση και επιβάλλει την ανάλυση και τον προσδιορισμό εκείνων των παραγόντων της πήξης (όπως του ΙΙ του V, VII και X). Στο Χρόνο ΚΚ (Κεφαλίνης Καολίνης) αντί για θρομβοπλαστίνη π.χ εγκεφάλου έχουμε την κεφαλίνη (η οποία παραλαμβάνεται με εκχύλισμα χλωροφορμίου από τη θρομβοπλαστίνη) και προσθέτουμε και καολίνη (ταλκ) ως ενεργοποιητή της πήξης Με την εφαρμογή των αντιδραστηρίων αυτών ο χρόνος πήξης απαιτεί ένα χρονικό διάστημα επώασης για την ενεργοποίηση της και στη συνέχεια προστίθεται το ασβέστιο οπότε και αρχίζει η καταγραφή του χρόνου. (φυσιολογικές τιμές 29-32sec). Παράταση του ΧΚΚ σημαίνει επίσης αιμορραγική διάθεση που επιβάλλει την ανάλυση και τον προσδιορισμό όλων εκείνων των παραγόντων που ελέγχονται από το ΧΚΚ. (όπως είναι ο VIII, IX, XI και ο XII). Ο χρόνος θρομβίνης ελέγχει το χρόνο που χρειάζεται να πήξει το πλάσμα ασθενούς με την προσθήκη αραιωμένης θρομβίνης, η μεγάλη παράταση του χρόνου φανερώνει την έλλειψη ινωδογόνου, (χρησιμοποιείται και για την εκτίμηση της ηπαρινικής θεραπείας, όπως και ο ΧΚΚ), ο χρόνος ρεπτιλάσης εφαρμόζεται με τη χρήση θρομβίνης από το φίδι bothrops jararaca. Ο χρόνος αυτός δεν επηρεάζεται από την ηπαρίνη και αποκαλύπτει συχνά την ηπαριναιμία στις μεγάλες παρατάσεις των χρόνων της πήξης. Για τον έλεγχο της σύγχρονης θρομβοφιλικής διάθεσης χρησιμοποιούνται δυο δοκιμασίες η apcr και το HAT-test (Makris 1997). Η δοκιμασία της αντίστασης στην ενεργοποιημένη πρωτεΐνη C στηρίζεται στην αρχή ότι η προσθήκη ενεργοποιημένης πρωτεΐνης C (μιας αντιπηκτικής ουσίας λογικά παρατείνεται ο ΧΚΚ). Ο Dahlback αποκάλυψε ότι μια μεγάλη ομάδα ασθενών με θρομβοφιλική διάθεση δεν παρατείνουν το ΧΚΚ παρουσιάζουν δηλαδή αντίσταση στην προσθήκη αυτή. Η αντίσταση αυτή αργότερα αποκάλυψε ότι η συχνότερη αιτία της ήταν η μετάλλαξη του παράγοντα V-Leiden. Εξάλλου οι Makris et al (1997,1998) έδειξε ότι αντίστοιχη αντίσταση εμφανίζεται και όταν προστίθεται το σύμπλεγμα αντιθρομβίνης/ηπαρίνης και αυτή η αντίσταση διαπιστώθηκε μεταξύ ατόμων με θρομβοφιλική διάθεση. και τέλος στις δοκιμασίες της ινωδόλυσης χρόνος λύσης αραιωμένου πήγματος ολικού πλάσματος. Dahlback et al. Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 1993; 90:1004-1008. Bertina et al. Mutation in blood coagulation factor V associated with resistance to activated protein C. Nature 1994; 369: 64-67. 3
Αναλυτικές δοκιμασίες Βασίζονται στην επαφή θρομβογόνου ουσίας με το πλάσμα του αρρώστου, καταγραφή του χρόνου που ξεκινά με την προσθήκη CaCl 2 και σταματά όταν σχηματισθούν τα πρώτα ίχνη λειτουργικές μέθοδοι ινικής, τα οποία συνήθως ανιχνεύονται θολωσιμετρικά στους αυτόματους αναλυτές, αλλά και με την επισκόπηση του σχηματιζόμενου θρόμβου (μέθοδος με το χέρι στο υδατόλουτρο 37 ο C, manual). Το αποτέλεσμα συγκρίνεται πάντα με αυτό τυποποιημένου δείγματος γνωστής δραστικότητας. Οι λειτουργικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των παραγόντων της πήξης βασίζονται 1 ον στο χρόνο προθρομβίνης (ΡΤ) Βασικές αρχές και 2 ον στο χρόνο μερικής θρομβοπλαστίνης (ΑΡΤΤ). Στον ΧΠ βασίζονται οι προσδιορισμοί των παραγόντων ΙΙ, VII, V και Χ. Κάνουμε διαδοχικές αραιώσεις (1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160) φυσιολογικού πλάσματος, προσθέτουμε ίση ποσότητα πλάσματος με έλλειψη μόνο του αντίστοιχου παράγοντα, προσθήκη θρομβοπλαστίνης και ίση ποσότητα ασβεστίου. Με τον τρόπο αυτό έχουμε την πρότυπο καμπύλη σε διπλό λογαριθμικό χαρτί (οι αραιώσεις στην οριζόντια και οι χρόνοι στη κάθετο γραμμή). Στη συνέχεια σχηματίζουμε μια αραίωση 1/10 του πλάσματος του αρρώστου με buffer OK, ακολουθεί προσθήκη ίσης ποσότητας πλάσματος με έλλειψη του αντίστοιχου παράγοντα, προσθήκη θρομβοπλαστίνης και ασβεστίου οπότε και μετράται ο ΧΠ. Η ζητούμενη δραστικότητα του παράγοντα αντιστοιχεί στο σημείο που ο χρόνος του τέμνει την πρότυπο καμπύλη. (αφού ο ΧΠ είναι ανάλογος της ποσότητας του παράγοντα που ενυπάρχει στο υπό εξέταση άτομο). Ο προσδιορισμός των παραγόντων που βασίζονται στο ΧΠ είναι ενός σημείου. Στον ΑΡΤΤ βασίζονται οι δοκιμασίες μελέτης των παραγόντων VIII, IX, XI και ΧΙΙ. Ο προσδιορισμός των παραγόντων αυτών είναι πολλών σημείων δηλαδή σχηματίζονται ισάριθμες σειρές από διαδοχικές αραιώσεις φυσιολογικού πλάσματος (standard πλάσματος με buffer OΚ 1/10-1/320) και αντίστοιχες αραιώσεις πλάσματος αρρώστου και εκτελούνται ταυτόχρονα οι προσδιορισμοί. Στις ποσότητες των αραιώσεων προστίθεται ίση ποσότητα πλάσματος με πλήρη έλλειψη του ζητούμενου παράγοντα και τέλος προστίθενται τα ειδικά αντιδραστήρια του ΧΚΚ. Η τεχνική αυτή (των ταυτόχρονων διαδοχικών αραιώσεων) είναι απαραίτητη για την ταυτόχρονη εκτέλεση των χρόνων ΚΚ γιατί με τον τρόπο αυτό ελέγχουμε την ποιότητα των αντιδραστηρίων, την αξιοσύνη του παρασκευαστή μας και την φυσιολογική παρουσία (έστω και μειωμένη ποσοτικά) του ζητούμενου παράγοντα. Ελέγχουμε ακόμη ταυτόχρονα και ποιοτικά την παρουσία ή όχι ανασταλτικής ουσίας που εξουδετερώνει το φυσιολογικό παράγοντα (από το αν οι δυο γραφικές παραστάσεις -του standard και του δείγματοςείναι ευθείες και παράλληλες σε διπλό λογαριθμικό χαρτί). Αν η λήψη τέτοιων γραμμών δεν επιτυγχάνεται σημαίνει ότι κάτι από τα πιο πάνω δεν είναι σωστό. Οι χρόνοι καταγράφονται σε διπλό λογαριθμικό χαρτί και έτσι σχηματίζεται η γραφική παράσταση της πρότυπης καμπύλης, η δραστικότητα του προς μέτρηση παράγοντα εκφράζεται ως ποσοστό επί τοις % του φυσιολογικού πλάσματος. Προσδιορισμός παραγόντων πήξης Προσδιορισμός του παράγοντα ΙΙ (προθρομβίνη). Η ενεργοποίηση της προθρομβίνης επιτυγχάνεται με το σχηματισμό της προθρομβινάσης -ενζυμικό σύμπλεγμα (που αποτελείται από τους παράγοντες Xa, Va, φωσφολιπίδια και Ca ++ ). Η θρομβίνη που παράγεται με την αντίδραση αυτή, πέπτει το ινωδογόνο σε ινική (Samama et al, 1990). Κληρονομική ανεπάρκεια παρατηρείται στην υποπροθρομβιναι- 4
μία (εξαιρετικά σπάνια) και στην δυσπροθρομβιναιμία. Η επίκτητη ανεπάρκεια του παράγοντα ΙΙ παρατηρείται σε διάφορες κλινικές καταστάσεις : όπως στη διάρκεια θεραπείας με αντιπηκτικά από το στόμα (τα οποία επίσης καταστέλλουν και τους άλλους βιταμινο-κ εξαρτώμενους παράγοντες- VII, IX, X, PC και PS), στην ανεπάρκεια βιταμίνης Κ λόγω ανεπαρκούς πρόσληψης ή απορρόφησης, στην ηπατική ανεπάρκεια (κίρρωση ή ηπατίτιδα) και κατά τη διάρκεια της ινωδόλυσης ή της διάχυτης ενδαγγειακής πήξης. Η αύξηση του παράγοντα ΙΙ(> 130%) συνοδεύεται από θρομβωτικές διαταραχές και για τις εκδηλώσεις αυτές έχει ενοχοποιηθεί η μετάλλαξη G20210A. Οι φυσιολογικές τιμές του παράγοντα ΙΙ στο πλάσμα είναι μεταξύ του 70 και 120%. Josso F, Rio Y, Beguin S. Haemostasis 1982; 12: 309-16. Samama M, Conard J, Horellou MH, Lecompte T. Paris : Doin, 119-122, 148-149 1990. Προσδιορισμός του παράγοντα V. Ο παράγοντας V ενεργοποιείται από τη θρομβίνη σε Va, και μαζί με τον Χα συμμετέχει στο σχηματισμό της προθρομβινάσης (Samama et al, 1990). Συγγενής ανεπάρκεια του παράγοντα V παρατηρείται στη νόσο του Owren. Επίκτητη ανεπάρκεια του παράγοντα V συνοδεύεται από ανεπάρκειες των παραγόντων VII, Χ και ΙΙ και βρίσκεται στην ηπατική ανεπάρκεια (κίρρωση ή ηπατίτιδα), κατά τη διάρκεια της ινωδόλυσης ή της διάχυτης ενδαγγειακής πήξης. Η αύξηση του παράγοντα V συνοδεύεται από θρομβωτικές διαταραχές (>150%) Οι φυσιολογικές τιμές του παράγοντα V στο πλάσμα είναι μεταξύ του 70 και 120%. Προσδιορισμός του παράγοντα X. Ο παράγοντας Χ ενεργοποιείται από το ενζυμικό σύμπλεγμα των παραγόντων ΙXa, Ca ++, φωσφολιπιδίων και VIIIa (δεκάση του VIII και ΙΧ) και από τη δεκάση του ιστικού παράγοντα. Οι ανεπάρκειες του παράγοντα Χ μπορεί να είναι συγγενείς (σπάνιες) ή επίκτητες (Fair, Egdington, 1985). Η επίκτητη ανεπάρκεια του παράγοντα X μπορεί να βρεθεί σε διάφορες κλινικές καταστάσεις: Στη διάρκεια θεραπείας με αντιπηκτικά από το στόμα (μαζί με τους άλλους βιταμινο-κ εξαρτώμενους παράγοντες- II, VII, X, PC και PS), στην ανεπάρκεια βιταμίνης Κ λόγω ανεπαρκούς πρόσληψης ή απορρόφησης, στην ηπατική ανεπάρκεια (κίρρωση ή ηπατίτιδα), στη διάρκεια της ινωδόλυσης ή της διάχυτης ενδαγγειακής πήξης. Η αύξηση του παράγοντα Χ συνοδεύεται από θρομβωτικές διαταραχές(>150%). Οι φυσιολογικές τιμές του παράγοντα Χ στο πλάσμα είναι μεταξύ του 70 και 120% Ofosu et al. Thromb Res 1981; 21: 23-33. Fair DS, Egdington TS. Br J Haematol 195; 59: 235-48 Προσδιορισμός του παράγοντα VII O παράγοντας VII μπορεί να ενεργοποιείται από τον ιστικό παράγοντα και μετέχει στη δεκάση του ιστικού παράγοντα (Osterud et al, 1979). In vivo, ίχνη ιστικού παράγοντα είναι ικανά να πυροδοτήσουν την αιμοστατική διαδικασία. Επίσης ο VII ενεργο- ποιείται από τους παράγοντες XIIa, IXa και, ιδίως, τον Xa, παρουσία Ca ++ και φωσφολιπιδίων σε VIIa. Η ανεπάρκεια του παράγοντα VII είναι σπάνια. Η επίκτητη παρατηρείται στη διάρκεια θεραπείας με αντιπηκτικά από το στόμα (μαζί με τους άλλους βιταμινο-κ εξαρτώμενους παράγοντες- II, IX, X, PC και PS), στην ανεπάρκεια βιταμίνης Κ λόγω ανεπαρκούς πρόσληψης ή απορρόφησης, στην ηπατική ανεπάρκεια (κίρρωση ή ηπατίτιδα) στη διάρκεια της ινωδόλυσης ή της διάχυτης ενδαγγειακής πήξης. 5
Η αύξηση του παράγοντα VΙΙ συνοδεύεται από θρομβωτικές διαταραχές έχει ανευρεθεί και συσχετιστεί με οξέα εμφράγματα του μυοκαρδίου (>150%). Οι φυσιολογικές τιμές του παράγοντα VΙΙ στο πλάσμα είναι μεταξύ του 70 και 130%. Mariani G et al: Br J Haematol, 1981; 48: 7-14. Croze M, Brizard CP: Haemostasis, 1983; 11: 185-88. Προσδιορισμός του παράγοντα VIII O παράγοντας VIII μπορεί να ενεργοποιηθεί από την θρομβίνη και τον παράγοντα Χa. Μετέχει στη δεκάση του VIII και ΙΧ και έτσι μεγιστοποιεί την ενεργοποίηση του παράγοντα Χ (Samama et al, 1990). Η αιμορροφιλία Α χαρακτηρίζεται από χαμηλά επίπεδα παράγοντα VIII: C, (σοβαρή διαταραχή όταν τα επίπεδα του παράγοντα VIII:C είναι < 1%, μέτρια διαταραχή όταν είναι 1-5% και ήπια διαταραχή όταν είναι 5-25%) Η αύξηση (και η κληρονομική) του παράγοντα VIII συνοδεύεται από θρομβωτικές διαταραχές (>150%). Οι φυσιολογικές τιμές του παράγοντα VIII στο πλάσμα είναι μεταξύ του 60 και 140% Caen et al, 1975. Soulier J-P, Larrieu MJ. Le Sang, 1953 ; 24 : 205-15. Zacharski LR, Rosenstein R. Am J Clin Pathol, 1978; 70: 280-6. Προσδιορισμός του παράγοντα IX Ο παράγοντας ΙΧ ενεργοποιείται από τον FΧΙa, παρουσία Ca ++ σε ΙΧa και από τη δεκάση του ιστικού παράγοντα. Ο παράγοντας ΙΧa μετέχει μαζί με τον VIIIa στη δεκάση του VIII και του ΙΧ και ενεργοποιεί τον παράγοντα Χ σε Χa. Η αιμορροφιλία B χαρακτηρίζεται από χαμηλά επίπεδα παράγοντα IX, (σοβαρή διαταραχή όταν τα επίπεδα του παράγοντα IX είναι <1%, μέτρια όταν είναι 1-5% και ήπια όταν είναι 5-25%). Η επίκτητη ανεπάρκεια του παράγοντα IX παρατηρείται στη διάρκεια θεραπείας με αντιπηκτικά από το στόμα (μαζί με τους άλλους βιταμινο-κ εξαρτώμενους παράγοντες- II, VII, X, PC και PS), στην ανεπάρκεια βιταμίνης Κ λόγω ανεπαρκούς πρόσληψης ή απορρόφησης, στην ηπατική ανεπάρκεια (κίρρωση ή ηπατίτιδα) κατά τη διάρκεια της ινωδόλυσης ή της διάχυτης ενδαγγειακής πήξης. Η αύξηση του παράγοντα IX συνοδεύεται από θρομβωτικές διαταραχές(>150%). Οι φυσιολογικές τιμές του στο πλάσμα είναι μεταξύ του 60 και 140% Caen J, Larrieu M-J, Samama M. L Hemostase. Mehodes d exploration et diagnostic pratique. Paris : L Expansion Scientifique, 1975. Osterud B, Rapaport SI. Proc Natl Aca Sci. USA, 1977; 74: 5260-4. Προσδιορισμός του παράγοντα XI Ενεργοποιείται από τον αχιιa. H ανεπάρκεια του ΧΙ χαρακτηρίζεται από ήπιες αιμορραγικές εκδηλώσεις, κυρίως από ιστούς με υψηλή ινωδολυτική δραστηριότητα και μετά από χειρουργικές επεμβάσεις ή εξαγωγές δοντιών, ενώ είναι ιδιαίτερα συχνή στους Εβραίους. Η αύξηση (και η κληρονομική) του ΧΙ συνοδεύεται από θρομβωτικές διαταραχές(>150%) Οι φυσιολογικές τιμές κυμαίνονται από 60 έως 140% (Caen et al, 1975). Προσδιορισμός του παράγοντα XIΙ Ο παράγοντας ΧΙΙ εμπλέκεται στις εξής διαδικασίες ως αxiia ενεργοποιεί τον ΧΙ σε ΧΙa, μετέχει στις διαδικασίες φλεγμονής, σε συνεργασία με το σύστημα καλλικρεΐνης. Ο ΧΙΙa ενεργοποιεί την προκαλλικρεΐνη σε καλλικρεΐνη, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί το HMWK του πλάσματος σε κινίνες. Κατόπιν με ένα μηχανισμό θετικής ανάδρασης η σχηματιζόμενη καλλικρεΐνη συνεισφέρει στην περαιτέρω ενεργοποίηση του παράγοντα ΧΙΙ. In vivo, ενεργοποιεί την ινωδόλυση πέπτοντας το πλασμινογόνο σε πλασμίνη. Η καλλικρεΐνη επίσης πυροδοτεί την ινωδόλυση ενεργοποιώντας την προουροκινάση σε ουροκινάση. 6
Ο παράγοντας XIIa αναστέλλεται από την αντιθρομβίνη και τον αναστολεα C1. H ανεπάρκεια του παράγοντα ΧΙI δεν συνοδεύεται από αιμορραγικά σύνδρομα, αντίθετα προδιαθέτει σε θρομβοφιλία εξαιτίας έλλειψης ενεργοποίησης του πλασμινογόνου. Φυσιολογικές τιμές: Οι φυσιολογικές τιμές του παράγοντα XIΙ στο πλάσμα είναι μεταξύ του 60 και 140% (Caen et al, 1975). χρωμογόνες μέθοδοι με τη βοήθεια συνθετικών χρωμογόνων υποστρωμάτων Προσδιορισμός φυσιολογικών ανασταλτών της πήξης Βασίζονται στην εφαρμογή χρωμογόνων υποστρωμάτων, δηλαδή συνθετικών ολιγοπεπτιδίων που μοιάζουν με το φυσιολογικό υπόστρωμα του ενζύμου, του οποίου μετριέται η δραστικότητα. Αποτελούνται, συνήθως, από 3-5 συνθετικά αμινοξέα και προστατεύονται στο Ν-τελικό άκρο από ειδική ομάδα (PGprotecting group). Στο C-τελικό άκρο του πεπτιδίου είναι συνδεδεμένη η χρωμογόνους ουσία (πάρα-νιτροανιλίνη) ή ένα φθοριόχρωμα. Το σημείο αυτό κόπτεται από το ειδικό για κάθε παράγοντα ή ανασταλτή της πήξης ένζυμο, με αποτέλεσμα την παραγωγή χρώματος ή φθορισμού αντίστοιχα. Π.χ. για τον προσδιορισμό της αντιθρομβίνης προστίθεται στο πλάσμα γνωστή ποσότητα θρομβίνης αντιδρούν οι δυο ουσίες και απομένει ποσότητα θρομβίνης η οποία επιδρά στο χρωμογόνο υπόστρωμα. Συνεπώς η παραγωγή χρώματος είναι ανάλογη με την εναπομείνασα ποσότητα θρομβίνης και αντιστοιχεί στην αντιθρομβίνη του ασθενή. Το χρώμα μετράται φασματοφωτομετρικά και ανάγεται σε επί τοις % δραστικότητα του ενζύμου. Η χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων για τον προσδιορισμό της λειτουργικής δραστικότητας εφαρμόζεται στον προσδιορισμό της Αντιθρομβίνης, της Πρωτεΐνης C, της Πρωτεΐνης S, του Πλασμινογόνου, της Α2-Αντιπλασμίνης και του ΡΑΙ-1. Αντιθρομβίνη Η ΑΤ ασκεί μια έντονη και άμεση ανασταλτική δράση στη θρομβίνη παρουσία ηπαρίνης. Η μέθοδος προσδιορισμού της αποτελείται από δύο βήματα. 1 ον το υπό εξέτασιν πλάσμα επωάζεται με γνωστή ποσότητα θρομβίνης σε περίσσεια παρουσία ηπαρίνης. 2 ον η εναπομείνασα δράση θρομβίνης μετριέται από την αμιδολυτική δράση που ασκεί στο συνθετικό χρωμογόνο υπόστρωμα, το CBS 61.50 και από την ικανότητά της να παράγει χρώμα διασπώντας την p-νιτροανιλίνη (μετράται στα 405nm). Η ποσότητα της θρομβίνης που εξουδετερώνεται στο πρώτο βήμα της μεθόδου είναι ευθέως ανάλογη με την ποσότητα της ΑΤ που υπάρχει στο εξεταστέο πλάσμα, τότε η ποσότητα της υπολειπόμενης θρομβίνης στο δεύτερο στάδιο της αντίδρασης είναι αντιστρόφως ανάλογη με το επίπεδο της ΑΤ στο εξεταστέο δείγμα. Η μέθοδος που περιγράφεται δεν επηρεάζεται από την παρουσία θεραπευτικών δόσεων ηπαρίνης. Οι φυσιολογικές τιμές της ΑΤ στο πλάσμα είναι μεταξύ του 80 και 120% (Samama et al, 1990). Παρ όλα αυτά κάθε εργαστήριο πρέπει να ορίζει τις δικές του φυσιολογικές τιμές. Πρωτεΐνη C και S Ανάλογη είναι η μέθοδος προσδιορισμού της Πρωτεΐνης C και της S. Τα επίπεδα τους ελαττώνονται κληρονομικά και σχετίζονται με θρομβοφιλική διάθεση. Ελαττώνονται επίσης στη διάρκεια ηπατικης ανεπάρκειας, κίρρωσης και ΔΕΠ. Ελαττώνονται επίσης στην οξεία φάση της θρόμβωσης. Οι φυσιολογικές τιμές της PC στο πλάσμα είναι μεταξύ του 70 και 130% (Samama et al, 1990). 7
Προσδιορισμός παραγόντων ινωδόλυσης α 2 - αντιπλασμίνη Τα επίπεδά της ελαττώνονται κατά τη διάρκεια ηπατοπαθειών, ενώ η μέτρησή τους είναι χρήσιμη για την ανίχνευση σπάνιων συγγενών ανεπαρκειών (νόσος Miyasato), στον έλεγχο της αποτελεσματικότητας της ινωδολυτικής θεραπείας (ελάττωση των επιπέδων της σχετίζονται με ανταπόκριση στη θεραπεία) και στη διάγνωση της διάχυτης ενδοαγγειακής πήξης (ΔΕΠ). Ειδικά στοιχεία της μεθόδου. Επώαση του πλάσματος με πλασμίνη (αντιδραστήριο 1), αντιπλασμίνη + πλασμίνη πλασμίνη-αντιπλασμίνη + υπολειπόμενη πλασμίνη. Στη συνέχεια μετράται η υπολειπόμενη πλασμίνη από την ικανότητά της να διασπά αμιδολυτικά το συνθετικό υπόστρωμα CBS 10.85 (αντιδραστήριο 2) και την απελευθέρωση p-na. Οι φυσιολογικές τιμές της πλασμίνης κυμαίνονται από 80 έως 120% (Samama et al, 1990). Παρ όλα αυτά κάθε εργαστήριο πρέπει να ορίζει τις δικές του φυσιολογικές τιμές. Aoki et al. Blood, 1980; 55: 483-88. Lassiera et al. Haemostasis, 1981 ; 10 : 51-62. Wohl et al. Thromb Res, 1982; 27: 525-35. πλασμινογόνο Το πλασμινογόνο με την επίδραση ιστικών ενεργοποιητών, μετατρέπεται σε πλασμίνη με διαχωρισμό ενός δεσμού αργινίνης-βαλίνης. Η ενεργοποίηση του πλασμινογόνου σε πλασμίνη προϋποθέτει την αφαίρεση ενός μικρού πεπτιδίου από το Ν-τελικό άκρο του και την μετατροπή του glu-πλασμινογόνου σε lys-πλασμινογόνο. Ο κύριος ρόλος της πλασμίνης είναι η αποδόμηση της ινικής, αλλά και του ινωδογόνου, οδηγώντας στο σχηματισμό προϊόντων αποδόμησής τους. Υπάρχουν δυο τύποι συγγενούς ανεπάρκειας του πλασμινογόνου: Ποσοτική ή τύπου Ι (η περισσότερο συχνή), όπου παρουσιάζεται ταυτόχρονη ελάττωση των λειτουργικών και αντιγονικών επιπέδων του πλασμινογόνου και η ποιοτική ή τύπου ΙΙ, όπου έχουμε μεγαλύτερη ελάττωση στα λειτουργικά επίπεδα του πλασμινογόνου. Ο ρόλος του στη θρόμβωση δεν είναι ξεκάθαρος. Για κάποιους συγγραφείς η έλλειψη πλασμινογόνου συνιστά παράγοντα κινδύνου για θρομβοφιλία, ενώ για άλλους συγγραφείς η ανεπάρκειά του χρειάζεται να συνδυαστεί και με άλλα αίτια θρομβοφιλίας για να συνεισφέρει στο θρομβωτικό κίνδυνο (Samama et al, 1995). Ειδικά στοιχεία της μεθόδου. Γνωστή ποσότητα στρεπτοκινάσης σε περίσσεια (αντιδραστήριο 1) προστίθεται στο εξεταστέο πλάσμα. Η στρεπτοκινάση και το πλασμινογόνο σχηματίζουν ένα σύμπλεγμα το οποίο έχει δραστικότητα πλασμίνης. Η ποσότητα του συμπλέγματος στρεπτοκινάσης-πλασμινογόνου πέπτει το συνθετικό υπόστρωμα CBS 30.41 (αντιδραστήριο 2) και απελευθερώνει pna, το οποίο και μετράται στα 405nm. Η αντίδραση δεν επηρεάζεται από αναστολείς του πλάσματος Οι φυσιολογικές τιμές του πλασμινογόνου κυμαίνονται από 80 έως 120% (Samama et al, 1990). Soria J, Soria C, Samama M. Pathol Biol, 1976; 24: 725-9. Aoki et al. J Clin Invest, 1978; 61: 1186-95. Samama MM. Sang Thromb Vaiss, 1995 ; 7 : 493-8. ανασταλτής του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου (Plasminogen Activator Inhibitor- PAI) Ο ΡΑΙ-1 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ινωδόλυσης. Σχηματίζει ένα αρχικά αναστρέψιμο, που στη συνέχεια μετατρέπεται σε μη αναστρέψιμο σύμπλεγμα με τον t-pa και την ουροκινάση σε στοιχειομετρική αναλογία. Αύξηση στα επίπεδα του ΡΑΙ-1 παρατηρούνται στη θρόμβωση, στον καρκίνο, στις ηπατοπάθειες, στη μετεγχειρητική περίοδο, στο έμφραγμα του μυοκαρδίου, στο σηπτικό shock. 8
Επίσης, παρατηρήθηκε συσχέτιση επιπέδων PAI-1 και παραγόντων κινδύνου για αθηρωμάτωση, όπως είναι η παχυσαρκία, η υπερινσουλιναιμία και η υπερτριγλυκεριδαιμία. Ειδικά στοιχεία της μεθόδου. Ο ΡΑΙ-1 που βρίσκεται στο εξεταστέο σχηματίζει σύμπλεγμα με την εξωγενή ουροκινάση, περιορίζοντας το σχηματισμό πλασμίνης από το πλασμινογόνο. H δοκιμασία εκτελείται σε τρία στάδια: α) Γνωστή ποσότητα ουροκινάσης (αντιδραστήριο 1) προστίθεται στο εξεταστέο πλάσμα και επωάζεται μαζί του. β) Δράση της υπολειπόμενης ουροκινάσης σε εξωγενώς προστιθέμενο πλασμινογόνο (αντιδραστήριο 2), παρουσία α2- αντιπλασμίνης, και επακόλουθο σχηματισμό πλασμίνης. γ) Προσδιορισμός της αμιδολυτικής δραστικότητας της σχηματισθείσας πλασμίνης από τη δράση της στο συνθετικό υπόστρωμα CBS 10.65 (αντιδραστήριο 3) και την συνακόλουθη απελευθέρωση pna, το οποίο και μετράται στα 405nm. Η ποσότητα της σχηματισθείσας πλασμίνης (όπως αυτή μετράται από την απελευθέρωση pna) είναι αντιστρόφως ανάλογη με τα επίπεδα του ΡΑΙ στο εξεταστέο πλάσμα. Οι φυσιολογικές τιμές του ΡΑΙ-1 στο πλάσμα είναι κάτω από 10 AU/ml (Samama et al, 1990). Juhan-Vague et al.thromb Res, 1984 ; 33 : 523-30. Hamsten et al. N Engl J Med, 1985; 313: 1557-63. Sprengers ED, Kluft C. Blood, 1987; 69: 381-7. Nguyen et al. Blood, 1988; 72: 601-5. Tran-Thang et al. Thromb Haemostasis, 1989; 82: 651-3. ανοσολογικές μέθοδοι Στηρίζονται στην αντίδραση αντιγόνου (είναι η προς μέτρηση ουσία)- αντισώματος και περιλαμβάνουν τις ποσοτικές ανοσοενζυμικές μεθόδους (ELISA), καθώς επίσης και τις ποιοτικές που είναι η ανοσοδιάχυση, ανοσοηλεκτροφόρηση, ανοσοθολοσιμετρικές μεθόδους οι οποίες υπό ορισμένες συνθήκες μπορούν να εκφραστούν και ποσοτικά. Προσδιορισμός της ελεύθερης πρωτεΐνης S (free PS) ανοσοενζυμικά (ΕΙΑ). Φυσιολογικές τιμές: Οι φυσιολογικές τιμές της free PS στο πλάσμα είναι μεταξύ του 70 και 130% (Samama et al, 1990). Amiral et al. Blood Coag Fibrinolysis, 1994; 5: 179-85. αντιγόνο του παράγοντα Willebrand (vwf:ag). Ο vwf μετέχει αποφασιστικά στην αρχική αιμόσταση, αλλά και στην πήξη. Παίζει σημαντικό ρόλο στην προσκόλληση των αιμοπεταλίων στο αγγειακό υπο-ενδοθήλιο και στο σχηματισμό του θρόμβου, μέσω των συνδέσεών του με τα συμπλέγματα γλυκοπρωτεϊνών GP Ib/IX και IIb/IIIa. Στην πήξη, ο vwf χρησιμεύει σαν μεταφορέας για τον παράγοντα VIII, προστατεύοντάς τον από πρώιμη αποδόμηση. Η νόσος von Willebrand (vwd): H vwd είναι η πιο κοινή κληρονομική αιμορραγική νόσος. Κλινικά χαρακτηρίζεται από αιμορραγίες στο δέρμα και τους βλεννογόνους. Έχουν περιγραφεί τρεις κύριοι τύποι της νόσου: Ο τύπος 1, που είναι και ο πιο συχνός (70-80% των περιπτώσεων), αντιστοιχεί σε μια ποσοτική ανεπάρκεια του vwf, και η κληρονομικότητά του ακολουθεί τον αυτοσωματικό κυρίαρχο τύπο. Ο τύπος 2 αναφέρεται σε μια ποιοτική διαταραχή του vwf. Η βλάβη συχνά εντοπίζεται στη δομή των πολυμερών, ενώ η κληρονομικότητά του ακολουθεί τον αυτοσωματικό κυρίαρχο ή υπολειπόμενο τύπο. Ο τύπος 3 χαρακτηρίζεται από απουσία του vwf τόσο στο αίμα, όσο και στις ενδοθηλιακές δεξαμενές. Η κληρονομικότητά του ακολουθεί τον αυτοσωματικό, υπολειπόμενο τύπο. Επίκτητη νόσος von Willebrand: Η ανεπάρκεια του vwf μπορεί να συνοδεύει παθήσεις όπως το μυέλωμα, το λέμφωμα, ο συστηματικός ερυθηματώδης λύκος, ο υποθυρεοειδισμός κ. ά. Τα επίπεδα του vwf αυξάνουν όταν υπάρχει βλάβη στο αγγειακό ενδοθήλιο, όπως κατά τη διάρκεια της μετεγχειρητικής περιόδου ή λοίμωξης, στον καρκίνο, σε νεφρικές ή ηπατικές 9
βλάβες. Επιπλέον, υψηλά επίπεδα vwf σχετίζονται με καρδιοαγγειακές βλάβες ή και με έμφραγμα μυοκαρδίου. Ειδικά στοιχεία της μεθόδου. Μια δέσμη μονοχρωματικού φωτός διαπερνά ένα εναιώρημα σωματιδίων μικρολάτεξ στα οποία έχουν ομοιοπολικά συνδεθεί ειδικά αντισώματα έναντι του παράγοντα vwf. Αν το μήκος κύματος του φωτός είναι πολύ μεγαλύτερο από τη διάμετρο των σωματιδίων, το φως απορροφάται πολύ λίγο. Παρουσία του αντιγόνου του vwf τα επενδυμένα με αντίσωμα σωματίδια σχηματίζουν συσσωματώματα μεγαλύτερης διαμέτρου από το μήκος κύματος του φωτός, και όσο μεγαλύτερα είναι αυτά τόσο περισσότερο φως απορροφάται. Αυτή η αύξηση στην απορρόφηση είναι ανάλογη με την ποσότητα του αντιγόνου στο δείγμα. Οι φυσιολογικές τιμές του vwf:ag είναι μεταξύ 50-140%, ενώ τα άτομα ομάδας Ο έχουν ακόμη χαμηλότερες τιμές. Με ανάλογο μέθοδο προσδιορίζεται ο παράγοντας ΧΙΙΙ και η ομοκυστεΐνη. προσδιορισμός της δραστικότητας του παράγοντα Willebrand με τη βοήθεια του συμπαράγοντα της ριστοσετίνης (vwf:ricof). Ειδικά στοιχεία της μεθόδου.: Η δραστικότητα συμπαράγοντα της ριστοσετίνης μετριέται βάσει της ακόλουθης αρχής: Παρουσία ριστοσετίνης, ο vwf (συμπαράγοντας της ριστοσετίνης) του δείγματος προκαλεί συσσώρευση σταθεροποιημένων αιμοπεταλίων που βρίσκονται στο αντιδραστήριο. Η συσσώρευση αυτή προκαλεί ελάττωση της θολερότητας του αντιδραστηρίου και αλλαγή στην οπτική πυκνότητα, η οποία και μετράται. Οι φυσιολογικές τιμές του vwf:ricof είναι μεταξύ 50-140%, ενώ τα άτομα ομάδας Ο έχουν ακόμη χαμηλότερες τιμές. Δοκιμασία Τύπος Ι Τύπος 2Α Τύπος 2Β Τύπος 2Ν Τύπος 3 vwf:ag ± Ν*** 0*** vwf:rco ή Ν 0 Ristocetin-induced aggregation* Υψηλή δόση Ν ή ή 0 Ν Ν 0 Χαμηλή δόση** 0 0 Παρουσία 0 0 VIII Ν ή ± ± Ν ή ± * vwf:rco: δραστικότητα συμπαράγοντα ριστοσετίνης. ** Η αιμοπεταλιακή συσσώρευση που επάγεται από χαμηλές δόσεις ριστοσετίνης είναι απούσα στο φυσιολογικό πληθυσμό. *** 0 σημαίνει απουσία στον πίνακα, ενώ Ν φυσιολογικό. Blann A. Br J Biomed Sci 1993; 50: 125-34. Sadler JE. Thromb Haemostasis 1994; 71: 520-5. Fressinaud E, Meyer D. Hematologie, 1995 ; 3 : 199-208. Lip GYH, Blann AD. Br Heart J, 1995; 74: 580-83. Ribba et al. Hematologie,1995 ; 3 : 191-8. 10