Molekulárna biológia a jej využitie v laboratórnej diagnostike na OKM FNsP Skalica a.s. Kos S., Kóňová L., Vašková M.,
Štruktúra OKM FNsP Skalica, a.s. 1993 Bakteriológia Priama diagnostika -kultivácia, mikroskopia, detekcia bakt. Ag Klinika Hemokultúty Infekcie dýchacích ciest Infekcie urogenitálneho traktu Črevné infekcie 2006 Serológia Nepriama diagnostika -detekcia prítomnosti protilátok Baktérie Vírusy Parazity 2011 Molekulárno biolog. metódy (PCR) Priama diagnostika -detekcia nukleovej kyseliny Baktérie (chlamýdie trachomatis) Vírusy (HPV) Parazity
Štruktúra DNA 2 polynukleotidové reťazce tvorené nukleotidmi 5C monosacharid pentóza (deoxy ribóza) Kys. trihydrogénfosforečná H 3 PO 4 Báza -Purínová (A,G) alebo Pyrimidínová (C,T)
Neamplifikačné Hybridizácia Dôkaz nukleových kys. DNA/RNA Metódy: Amplifikačné Kvalitatívne: PCR, microarray sys. Kvantitatívne: RealTime PCR
NEAMPLIFIKAČNÉ Hybridizácia Dôkaz DNA/RNA vo vzorke bez predchádzajúcej amplifikácie cieľovej /target/ nukleovej kys. Využíva značené hybridizačné sondy (DNA/RNA) SONDA = oligonukleotid, komplementárny k špecifickej (hľadanej) sekvencii NK väzba cez H mostíky
AMPLIFIKAČNÉ I. Kvalitatívne (PCR) II. Kvantitatívne (Real-time PCR) I. Kvalitatívne PCR polymerázová reťazová reakcia - amplifikácia špecifickej sekvencie DNA (druhovo špecifický úsek) - vyžaduje predchádzajúcu izoláciu cieľovej DNA zo vzorky 1. Izolácia DNA 2. PCR -Denaturácia - Anelácia primerov - Elongácia 3. Analýza produktu
Izolácia DNA zo vzorky biolog. materiálu Zdrojom templátovej DNA: Krv EDTA, BAL, iné telové tekutiny, tkanivo NEVYHNUTNOSŤ odstrániť porfyrínové zlúč. (hemoglob., hematín) inhibujú PCR Pozor na výtery obsahujúce krv! Cieľ: získať dostatočné množstvo DNA vo vyhovujúcej kvalite Množstvo: od ng po μg
Reakčná zmes Master mix Primery- krátke oligonukleotidy, komplementárne k cieľovej sekvencii ssdna - Špecifita reakcie: 20-30 nukleotidov Nukleotidy- vo forme trifosf. (datp, dttp, dctp, dgtp) Polymeráza- Taq Pufor - obsahujúci Mg 2+ ióny, pre optim.aktivitu Taq poly Optimálna konc. Mg 2+ 1-2 mmol/l
Princíp PCR 1. Denaturácia teplota 90-95 o C /94 o C 1 min., príp. 95 o C 30s/ uvoľnenie H mostíkov ( teplota pri počte G-C párov) oddelenie vlákien templátovej DNA 2 ssdna 2. Anelácia primerov teplota 40-72 o C /~60 o C/ naviazanie primerov ku komplementárnej sekvencii templátovej ssdna 3. Elongácia teplota 60-75 o C /72 o C/ syntéza nového komplementárneho vlákna od 3 OH konca primera pomocou Taq polymerázy podľa templátovej ssdna vznikne dsdna amplikón
1. Denaturácia
2. Anelácia primerov
3. Elongácia
1 východisková ds DNA 35 cyklov 2 36 kópií PCR prebieha v termocykleri umožňuje automaticky naprogramovať teplotný režim a počet cyklov Optimálny počet cyklov závisí od konc. jednotlivých zložiek reakcie, v rozsahu 25-35 cyklov (1-4 hod)
Analýza produktu amplifikácie Detekcia ELFO (ds amplikóny): Separácia fragmentov v jednosmernom elekt. poli od k + podľa ich molekulovej hmotnosti Agarózový gél ( Et-Br, UV) Polyakrylamidový gél (PAGE) jemná separácia, umožňuje detekovať rozdiel dĺžky 1 bp, na separáciu malých fragmentov Fluorescencia Využitie v Real-time PCR
Kontaminácie PCR Separovať priestory pre izoláciu DNA, prípravu PCR a analýzu produktu! Každý úsek má mať sadu pipiet, ktoré sa neprenášajú Priestory dekontaminovať UV žiarením Používať jednorázový spotreb. materiál (rukavice, špičky, mikroskúmavky) Reagencie deliť na alikvóty, na jedno použite
Real-Time PCR II. Kvantitatívne amplifikačné metódy -umožňuje sledovať nárast počtu amplikónov v reálnom čase - využíva fluorogénne farbivá - bez potreby postamplifikačnej analýzy - je možné využiť aj na kvalitatívnu analýzu
OKM FNsP Skalica a.s. - od novembra 2011 zriadenie PCR laboratória Vyšetrujeme: od 1.11. 2011 Ch. trachomatis kvalitatívna detekcia metódou Real-time PCR Ch. trachomatis je intracelulárna baktéria, ktorá vyvoláva infekcie urogenitálneho a reprodukčného systému. Najčastejšie pohlavne prenášané ochorenie vo vyspelých krajinách. Ak sa nelieči môže spôsobiť u žien neplodnosť. Odber výterov suchý dakrónový tampón Z materiálu: - urogenitálne a rektálne výtery - výter hrdla - výtok z oka - moč 1. porcia - sekrét z prostaty
Vyšetrujeme: od 1.1. 2012 HPV vysokorizikové genotypy 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 Ľudský papilomavírus (HPV), jeho niektoré genotypy zvyšujú riziko rakoviny krčka maternice. 1. Z materiálu - cervikálne a uretrálne zoškraby 2. Do transportnej pôdy - dodá laboratórium 3. Simultánna kvalitatívna detekcia metódou Real-time PCR 4. Detekcia produktov reakcie - fluorescenčné farbivá
Princíp: Amplifikácia špecifického úseku DNA s použitím špecifických primerov. Detekcia produktov reakcie fluorescenčné farbivá, ktoré sa naviažu na amplifikovaný produkt. Monitorovanie intenzity fluorescencie počas Real-time PCR umožňuje detekciu akumulovaného produktu bez nutnosti otvárania reakčnej skúmavky, čo výrazne znižuje možnosť kontaminácie.
Diagnostika pôvodcov infekčných ochorení:! Vírusy (HPV, HBV, HCV, CMV, HIV, HSV1/2, a.i.)! Baktérie (Ch. trachomatis, B. burgdorferi, T. pallidum, M. tuberculosis a.i.) Huby (P. jiroveci), Parazity Taxonómia Archeológia: určovanie pohlavia, príbuzenských vzťahov a.i. Aplikácie PCR Dôkaz mikroorganizmov v potravinách Genetika hospodárskych zvierat a rastlín Diagnostika geneticky podmienených ochorení (fenylketonúria, cystická fibróza, kosáčikovitá anémia a.i.) Kriminalistika a súdne lekárstvo(genetické odtlačky, dôkaz paternity)
Výhody: Rýchlosť (cca 3 hodiny) Detekcia ťažko kultivovateľných patogénov (Ch. trachomatis, vírusy...) Rýchla detekcia patogénov s dlhou kultivačnou dobou (M. tubeculosis...) Detekcia patogénov, ktorých vitalita a rastové schopnosti sú obmedzené napr. prebiehajúcou ATB liečbou Detekcia patogénov prítomných vo veľmi malom množstve citlivosť, špecificita, spoľahlivosť, využitá ako konfirmačná metóda
Ďakujeme za pozornosť Tešíme sa na spoluprácu