ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΝΕΟΤΕΡΩΝ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ

ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΘΕΤΙΚΩΝ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΤΟΜΕΑΣ ΓΕΝΕΤΙΚΗΣ, ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΚΑΙ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΠΛΩΜΑΤΙΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ ΕΛΕΓΧΟΣ ΤΟΞΙΚΟΤΗΤΑΣ ΝΕΟΤΕΡΩΝ ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΩΝ ΦΑΡΜΑΚΩΝ ΣΕ ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΜΑΡΙΑ ΣΑΜΑΛΙΔΟΥ Α.Ε.Μ 4532 Επιβλέποντες Μονάδα Εκτέλεσης : Γιάγκου Μηνάς, Αναπληρωτής Καθηγητής Σωτηρόπουλος Δαμιανός, Αιματολόγος : Εργαστήριο Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας της Αιματολογικής Κλινικής και ΜΜΜΟ του Π.Γ.Ν. Θεσσαλονίκης «Γ. Παπανικολάου» ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΠΡΟΛΟΓΟΣ. 3 ΠΕΡΙΛΗΨΗ.. 4 Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ.. 5 Α1. ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΚΎΤΤΑΡΑ... 5 Α1.1 ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗ. 5 Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (stem cells) 7 Προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα (progenitors).... 8 Κύτταρα που δημιουργούν αποικίες (colony forming cells).. 9 Α1.2 ΑΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ... 11 Stem Cell Factor (SCF).... 12 Ιντερλευκίνη-3 (IL-3)...... 12 Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF)... 13 Ιντερλευκίνη-6 (IL-6)....... 13 Ερυθροποιητίνη (EPO). 14 Α1.3 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ.... 15 Μέθοδοι καλλιέργειας αιμοποιητικών κυττάρων.17 Α2. ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ.... 20 Αμφοτερικίνη Β........ 20 Βορικοναζόλη... 22 Κασποφουνγκίνη..... 23 Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ. 25 Γ. ΥΛΙΚΑ - ΜΕΘΟΔΟΙ.... 26 Υλικά 26 Πειραματόζωα.. 27 Καλλιέργειες ημιστερεάς μορφής 27 Οργάνωση πειραμάτων.... 30 Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ....... 31 Ε. ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑ..... 40 Συζήτηση.. 40 Συμπέρασμα.... 42 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 43 2

ΠΡΟΛΟΓΟΣ Η συγκεκριμένη διπλωματική εργασία εκπονήθηκε στο Εργαστήριο Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας (Πειραματικό) της Αιματολογικής Κλινικής και ΜΜΜΟ του Γ.Π.Ν. Θεσσαλονίκης «Γ. Παπανικολάου». Θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά τον κ. Μηνά Γιάγκου, Αναπληρωτή Καθηγητή του Τμήματος Βιολογίας του Α.Π.Θ και τον κ. Δαμιανό Σωτηρόπουλο, Ιατρό Αιματολόγο της Αιματολογικής Κλινικής και ΜΜΜΟ του Νοσοκομείου «Γ. Παπανικολάου», τόσο για την ευκαιρία που μου έδωσαν να εκπονήσω τη διπλωματική μου εργασία στο Εργαστήριο Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας της Κλινικής όσο και για το ενδιαφέρον, τη βοήθεια, την καθοδήγηση και τις χρήσιμες συμβουλές τους. Ιδιαίτερες ευχαριστίες οφείλω στον κ. Αχιλλέα Αναγνωστόπουλο και τον κ. Αθανάσιο Φάσσα, Διευθυντές της Αιματολογικής Κλινικής και της Μονάδας Μεταμόσχευσης Μυελού των Οστών (ΜΜΜΟ) του Νοσοκομείου «Γ. Παπανικολάου», για την άδεια εκπόνησης της διπλωματικής μου εργασίας στο Εργαστήριο Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας της Κλινικής. Επίσης, θα ήθελα να ευχαριστήσω θερμά την κα Αγγελική Ξαγοράρη για το ενδιαφέρον, τη βοήθεια και την καθοδήγησή της στην εκμάθηση των τεχνικών, καθώς και για τη συμπαράσταση και τις χρήσιμες συμβουλές της. Θερμές ευχαριστίες οφείλω και στην κα Ελένη Σιώτου για τη βοήθειά της σε θέματα που αφορούσαν τα πειραματόζωα, καθώς και για τη συμπαράσταση και τις συμβουλές της. 3

ΠΕΡΙΛΗΨΗ Οι επιμολύνσεις είναι ένα από τα σοβαρότερα προβλήματα στις καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων. Η πενικιλίνη και η στρεπτομυκίνη που χρησιμοποιούνται, δεν προστατεύουν από τις μολύνσεις από μύκητες. Η Αμφοτερικίνη σπάνια χρησιμοποιείται, λόγω της τοξικότητας που προκαλεί. Η λιποσωμική Αμφοτερικίνη και τα νεότερα αντιμυκητιασικά φάρμακα δεν έχουν χρησιμοποιηθεί ακόμη στις κυτταρικές καλλιέργειες για την προφύλαξή τους από τις μολύνσεις από μύκητες. Σκοπός της εργασίας ήταν ο έλεγχος της τοξικότητας της λιποσωμικής Αμφοτερικίνης (Ambisome), της Βορικοναζόλης (VFend) και της Κασποφουνγκίνης (Cancidas) στις καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων μυελού των οστών ποντικών σε σύγκριση με την κλασσική Αμφοτερικίνη (Fungizone). Χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα μυελού των οστών από ποντικούς C57bl/6, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο παρουσία μεθυλκυτταρίνης και αυξητικών παραγόντων (mscf, mil-3, mgm-csf, hil-6, hepo). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις των αντιμυκητιασικών φαρμάκων Ambisome (6-6000 ng/ml), VFend (4-500 ng/ml), Cancidas (0,4-50 ng/ml) και Fungizone (60-6000 ng/ml), ενώ υπήρχε καλλιέργεια-μάρτυρας στην οποία δε χορηγήθηκαν αντιμυκητιασικά φάρμακα. Μετρήθηκαν αποικίες CFU-GM μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας. Η κλασσική Αμφοτερικίνη (Fungizone) εμφάνισε τοξικότητα αυξανόμενη ανάλογα με τη συγκέντρωση με αποτέλεσμα τη μείωση του αριθμού των αποικιών σε σύγκριση με το μάρτυρα. Αντίθετα, η λιποσωμική Αμφοτερικίνη (Ambisome) όχι μόνο δεν παρουσίασε τοξικότητα, αλλά και αύξησε τον αριθμό των αποικιών. Τα VFend και Cancidas δεν παρουσίασαν τοξικότητα, αλλά εμφάνισαν και αυτά αύξηση του αριθμού των αποικιών αντίστοιχη με το Ambisome. Για τους παραπάνω λόγους, θεωρούμε ότι η χρήση της λιποσωμικής Αμφοτερικίνης, της Βορικοναζόλης και της Κασποφουνγκίνης σε κυτταρικές καλλιέργειες θα βοηθούσε στην αντιμετώπιση των μολύνσεων από μύκητες. Περαιτέρω in vivo πειράματα θα μπορούσαν να επιβεβαιώσουν τα ευρήματά μας όσον αφορά στη θετική δράση των αντιμυκητιασικών φαρμάκων στον πολλαπλασιασμό των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, καθώς και να εξηγήσουν την πιθανή επίπτωσή τους. 4

Α. ΕΙΣΑΓΩΓΗ Α1. ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΑ ΚΥΤΤΑΡΑ Α1.1 ΑΙΜΟΠΟΙΗΣΗ Το αίμα του ανθρώπινου σώματος είναι ο «υγρός» ιστός που κυκλοφορεί στο καρδιαγγειακό σύστημα εκτελώντας πλήθος λειτουργιών. Αποτελείται από το πλάσμα (υγρό μέσο) και από κύτταρα που κυκλοφορούν (έμμορφα στοιχεία) και τα οποία επιτελούν διαφορετικές λειτουργίες. Οι κυριότερες λειτουργίες, για κάθε είδος κυττάρου ξεχωριστά, είναι για μεν τα ερυθρά αιμοσφαίρια η μεταφορά οξυγόνου στους ιστούς, για τα λευκά η άμυνα του οργανισμού και για τα αιμοπετάλια η συμβολή στην πήξη του αίματος. Παρά το γεγονός ότι τα κύτταρα του αίματος έχουν περιορισμένη διάρκεια ζωής, εν τούτοις δεν έχουν τη δυνατότητα να πολλαπλασιαστούν. Είναι δηλαδή «τελικώς διαφοροποιημένα». Η αντικατάστασή τους γίνεται από άλλα κύτταρα που βρίσκονται ως επί το πλείστον εκτός της κυκλοφορίας του αίματος και τα οποία αναφέρονται με τη γενική ονομασία: αιμοποιητικά κύτταρα. (1) Τα αιμοποιητικά κύτταρα είναι εγκατεστημένα στα αιμοποιητικά όργανα. Το κατ εξοχήν αιμοποιητικό όργανο για τον ενήλικα άνθρωπο είναι ο μυελός των οστών. Ο μυελός των οστών εδρεύει στο εσωτερικό των οστών και στην ενήλικη ζωή κυρίως στα «πλατέα οστά», όπως είναι τα οστά της λεκάνης και του κρανίου. Η αιμοποίηση είναι το φαινόμενο εκείνο κατά το οποίο ένα και μοναδικό κύτταρο, το αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο [στελεχιαίο κύτταρο (stem cell)], μπορεί να δημιουργήσει όλες τις μορφές κυττάρων που κυκλοφορούν στο αίμα (ερυθρά αιμοσφαίρια, λευκά και αιμοπετάλια), αλλά και τον ίδιο του τον εαυτό (Εικόνα 1). Η αιμοποίηση στον άνθρωπο, όπως και στα υπόλοιπα θηλαστικά, λαμβάνει χώρα εξωαγγειακώς. (2) 5

Μυελικό αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο Λεμφική σειρά Μυελική σειρά Πολυδύναμο αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο Λεμφικό αρχέγονο αιμοποιητικό κύτταρο Ερυθρά σειρά (Θύμος) Μεγακαρυοκυτταρική σειρά Λευκή σειρά Λευκή σειρά Λευκή σειρά Προ-Β λεμφοκύτταρο Προ-Τ λεμφοκύτταρο Προερυθροβλάστης Μεγακαρυοβλάστης Μυελοβλάστης Μονοβλάστης Μυελοβλάστης Β λεμφοβλάστης Τ λεμφοβλάστης Βασεόφιλος Μεγακαρυοκύτταρο Προμυελοκύτταρο Προμονοκύτταρο Προμυελοκύτταρο ερυθροβλάστης Β λεμφοκύτταρο Τ λεμφοκύτταρο Πολυχρωματόφιλος ερυθροβλάστης Αιμοπετάλια Μυελοκύτταρο Μονοκύτταρο Ηωσινόφιλο μυελοκύτταρο Βασεόφιλο Πλασματοκύτταρο μυελοκύτταρο Οξύφιλος ερυθροβλάστης Μεταμυελοκύτταρο Μακροφάγο Ηωσινόφιλο μεταμυελοκύτταρο Βασεόφιλο μεταμυελοκύτταρο Ραβδοπύρηνο Δικτυοερυθροκύτταρο Πολυμορφοπύρηνο ουδετερόφιλο Ηωσινόφιλο ραβδοπύρηνο Βασεόφιλο ραβδοπύρηνο Ηωσινόφιλο Βασεόφιλο Ερυθροκύτταρο Σιτευτικό κύτταρο Εικόνα 1. Διαφοροποίηση των κυττάρων του αιμοποιητικού συστήματος (CFU-GEMM: Colony Forming Unit Granulocyte-Erythroid-Monocyte-Megakaryocyte, BFU-E: Burst Forming Unit Erythroid, CFU-E: Colony Forming Unit Erythroid, CFU-MEG: Colony Forming Unit Megakaryocyte, CFU-GM: Colony Forming Unit Granulocyte/Macrophage, CFU-G: Colony Forming Unit Granulocyte, CFU-M: Colony Forming Unit 6

Monocyte/Macrophage, CFU-EO: Colony Forming Unit Eosinophilic, CFU-BASO: Colony Forming Unit Basophilic). (3) Αρχέγονα αιμοποιητικά κύτταρα (stem cells) Τα αιμοποιητικά στελεχιαία κύτταρα του μυελού των οστών αποτελούν την παρακαταθήκη για το μέλλον των κυττάρων του αίματος. Tα κύτταρα του αίματος, έχοντας καθορισμένη διάρκεια ζωής, χρειάζονται συνεχή αναπλήρωση. Υπάρχουν όμως καταστάσεις στις οποίες ο οργανισμός χρειάζεται να αυξήσει τον αριθμό των κυττάρων μιας συγκεκριμένης κυτταρικής σειράς για να αντιμετωπίσει συγκεκριμένη ανάγκη. Η επιλεκτική αυτή αύξηση πληθυσμού είναι εφικτή χάρη στην ικανότητα των στελεχιαίων κυττάρων να κατευθύνονται προς συγκεκριμένη κατεύθυνση διαφοροποίησης ανάλογα με τα ερεθίσματα που δέχονται. Τα στελεχιαία κύτταρα είναι τα κύτταρα τα οποία είναι ικανά, διαμέσου διαδοχικών μιτώσεων και διαφοροποίησης, να παράγουν τα κύτταρα όλων των κυτταρικών σειρών του μυελού, και κατ επέκταση, όλα τα κύτταρα του αίματος (πολυδύναμα κύτταρα). (4) Τα στελεχιαία κύτταρα μένουν σε εφεδρεία (ανενεργή κατάσταση) μέχρι να τους δοθεί το μήνυμα να αρχίσουν τη διαδικασία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης ανάλογα με τις συγκεκριμένες ανάγκες του οργανισμού. Αντίθετα με τις άλλες κατηγορίες αιμοποιητικών κυττάρων, όπου κατά τη διάρκεια της μίτωσης υφίσταται και διαφοροποίηση κατά την οποία δημιουργούνται δύο όμοια θυγατρικά κύτταρα που είναι περισσότερο διαφοροποιημένα από το μητρικό, ο πολλαπλασιασμός των στελεχιαίων κυττάρων οδηγεί στη δημιουργία δύο διαφορετικών κυττάρων: ενός διαφοροποιημένου, που θα συνεχίσει την κλασσική διαδικασία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης, και ενός κυττάρου το οποίο είναι ίδιο με το μητρικό (δηλαδή ικανότητα αυτοανανέωσης) και θα πάρει τη θέση του στον πληθυσμό των πολυδύναμων αιμοποιητικών κυττάρων. (5,6,7) Η διαδικασία διαφοροποίησης και αυτοανανέωσης των στελεχιαίων κυττάρων ρυθμίζεται από χυμικούς παράγοντες, όπως είναι οι αυξητικοί παράγοντες, και από αλληλεπιδράσεις μεταξύ των στελεχιαίων κυττάρων και των κυττάρων του μικροπεριβάλλοντος του μυελού. Οι αυξητικοί παράγοντες ή κυτοκίνες διαδραματίζουν καθοριστικό ρόλο στη διαδικασία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης όχι μόνο των στελεχιαίων κυττάρων αλλά και όλων των αιμοποιητικών κυττάρων. Μεγάλη σημασία όμως έχει και ο ρόλος των κυττάρων του 7

μικροπεριβάλλοντος του μυελού τα οποία ονομάζονται και συνεργιστικά κύτταρα (accessory cells). (8,9,10) Σήμερα είναι γνωστό, ότι τόσο τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, όσο και αυτά καθ αυτά τα στελεχιαία κύτταρα, δεν παραμένουν ακίνητα εφ όρου ζωής στον μυελό των οστών. Τουλάχιστον ένα μέρος από αυτά μετακινείται και, περνώντας διαμέσου των ενδοθηλιακών κυττάρων, εισέρχεται στην κυκλοφορία του αίματος (κυκλοφορούντα αιμοποιητικά κύτταρα). (11) Η μετάβαση από το αρχικό στελεχιαίο κύτταρο στο λειτουργικό και κυκλοφορούν κύτταρο του αίματος συμβαίνει μέσα από πολλά στάδια και χαρακτηρίζεται από την απώλεια της ικανότητας αυτοανανέωσης και τον σταδιακό προσανατολισμό προς συγκεκριμένη κυτταρική σειρά: λευκή, ερυθρά ή μεγακαρυοκυτταρική. Η διαδικασία αυτή ονομάζεται καθορισμός (commitment) και τα κύτταρα που έχουν ήδη αποκτήσει συγκεκριμένο προσανατολισμό, καθορισμένα. (12) Προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα (progenitors) Τα στελεχιαία κύτταρα διαφοροποιούμενα δημιουργούν είτε κύτταρα καθορισμένα να αποδώσουν με πολλαπλασιασμό και διαφοροποίηση μία γενιά κυττάρων που ανήκουν στην ίδια κυτταρική σειρά, ή κύτταρα που διατηρούν σε κάποιο βαθμό τον πολυδύναμο χαρακτήρα τους, αλλά με δύο ουσιώδεις διαφορές από τα στελεχιαία κύτταρα, αφού: α) δεν μπορούν να παράγουν κύτταρα όλων των σειρών του αίματος και β) δεν έχουν τη δυνατότητα αυτοανανέωσης. (13) Τέτοιου είδους κύτταρο είναι εκείνο που παράγει τα κύτταρα της λευκής, ερυθράς και μεγακαρυοκυτταρικής σειράς (CFU-GEMM), αλλά δεν μπορεί να διαφοροποιηθεί σε κύτταρα της λεμφικής σειράς (αποτελεί την τέταρτη σειρά των κυττάρων του αίματος). Αυτά τα μερικώς πολυδύναμα κύτταρα έχουν τη δυνατότητα να κατευθυνθούν διαφοροποιούμενα προς μία συγκεκριμένη κυτταρική σειρά, εφ όσον το απαιτήσουν οι ανάγκες του οργανισμού. (14,15) Τα κύτταρα αυτά, αν και δεν αποτελούν ενιαίο πληθυσμό, έχουν κοινή ονομασία: προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα. Αυτό, γιατί στην ουσία αποτελούν προγόνους όλων των κυττάρων του αίματος. Οι πλέον άωρες μορφές αυτών των κυττάρων, που αποτελούν την αμέσως επόμενη γενιά μετά τα στελεχιαία κύτταρα, 8

ονομάζονται άωρα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα και αποτελούν κύτταρα που μπορούν να διαφοροποιηθούν και προς τις τρεις σειρές. Διατηρούν δηλαδή μέρος του πολυδύναμου που χαρακτηρίζει τα στελεχιαία κύτταρα (δεν μπορούν να διαφοροποιηθούν προς τη λεμφική σειρά), χωρίς να έχουν τη δυνατότητα αυτοανανεώσης. (16,17) Κύτταρα που δημιουργούν αποικίες (colony forming cells) Όταν κύτταρα του μυελού των οστών καλλιεργηθούν σε ημιστερεό υλικό καλλιέργειας (σε μεθυλκυτταρίνη, άγαρ, θρόμβο πλάσματος), δημιουργούνται συσσωρεύσεις κυττάρων οι οποίες ονομάζονται αποικίες και προέρχονται από τον πολλαπλασιασμό ενός και μοναδικού κυττάρου (κλωνογένεση). Τα κύτταρα αυτά ονομάζονται κύτταρα που δημιουργούν αποικίες (Colony Forming Cells, CFC) και είναι διαφοροποιημένα προγονικά κύτταρα. Τέτοιου είδους κύτταρα υπάρχουν και στις τρεις κυτταρικές σειρές: GM-CFC, BFU-E, Meg-CFC (Εικόνα 2). Σε μερικές περιπτώσεις, έχει διατηρηθεί η παλαιότερη ονομασία, «μονάδες που δημιουργούν αποικίες κυττάρων (Colony Forming Units, CFU)», όπως π.χ. στην περίπτωση της ερυθράς σειράς: BFU-E και CFU-E. Τα CFC αποτελούν ενδιάμεσο στάδιο διαφοροποίησης ανάμεσα στα άωρα προγονικά κύτταρα και τις ώριμες μορφές που κυκλοφορούν στο αίμα, πράγμα που σημαίνει ότι χρειάζονται σαφώς λιγότερο χρόνο για να φτάσουν μέχρι την τελική μορφή του ώριμου κυττάρου. (18,19,20,21,22) Στην περίπτωση της ερυθράς σειράς, παρατηρούνται δύο διαφορετικές μορφές CFC: το Burst Forming Unit Erythroid (BFU-E) και το Colony Forming Unit Erythroid (CFU-E) (Εικόνα 2). Το BFU-E αποτελεί αωρότερη μορφή προγονικού κυττάρου από το CFU-E, επειδή χρειάζεται περισσότερο χρόνο και μεγαλύτερο αριθμό μιτώσεων συγκριτικά με το CFU-E για να αποδώσει αποικία κυττάρων της ερυθράς σειράς. Πράγματι, εάν καλλιεργηθούν κύτταρα μυελού των οστών ποντικού σε μεθυλκυτταρίνη με την παρουσία ερυθροποιητίνης, εμφανίζονται δύο ειδών αποικίες ερυθροκυττάρων σε δύο διαφορετικούς χρόνους: σε διάστημα 2 ημερών εμφανίζονται μικρές αποικίες ερυθροκυττάρων που αποτελούνται συνήθως από πολύ λίγα κύτταρα και προέρχονται από τα CFU-E, ενώ μετά την πάροδο 7 ημερών εμφανίζονται σαφώς μεγαλύτερες αποικίες ερυθροκυττάρων που αποτελούνται συνήθως από εκατοντάδες κύτταρα και προέρχονται από τα ΒFU-E. (23,24,25,26) 9

Οι αποικίες των μεγακαρυοκυττάρων και ιδιαίτερα αυτές που προέρχονται από κύτταρα του μυελού των οστών ποντικών είναι χαρακτηριστικές, καθώς αποτελούνται από λίγα σχετικά κύτταρα που συνήθως κυμαίνονται από 3 έως 100, σε αντίθεση με τις αποικίες της λευκής σειράς που αποτελούνται από εκατοντάδες ή και χιλιάδες κύτταρα (Εικόνα 2). Επίσης, τα μεγακαρυοκύτταρα είναι πολύ μεγάλα και στρόγγυλα με μεγάλη διαφάνεια σαν σταγόνες νερού. Αντίθετα, τα ανθρώπινα μεγακαρυοκύτταρα, δεν είναι ιδιαίτερα μεγάλα, και έτσι δεν είναι πάντα εύκολη η διάκρισή τους από αποικίες μεγάλων κυττάρων της μυελικής σειράς, όπως είναι τα μακροφάγα. (27,28) Υπάρχουν και κύτταρα που αποδίδουν μικτής μορφής αποικίες, δηλαδή αποικίες που αποτελούνται από κύτταρα δύο ή και περισσότερων κυτταρικών σειρών (Mixed-CFC ή CFU-Mixed ή GEMM-CFC ή CFU-GEMM) (Εικόνα 2). Αυτές προέρχονται από αωρότερα κύτταρα σε σύγκριση με τα CFC αποκλειστικής κυτταρικής σειράς τα οποία έχουν τη δυνατότητα διαιρούμενα να αποδώσουν δύο κύτταρα που το καθένα διαφοροποιείται προς διαφορετική σειρά. (29,30) CFU-E BFU-E CFU-G CFU-M CFU-GM CFU-GEMM Εικόνα 2. Κύτταρα που δημιουργούν αποικίες. (31) Τα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα αποτελούν έναν ετερογενή πληθυσμό. Παρ όλα αυτά, δε διαφέρουν μεταξύ τους ως προς τη μορφολογία, ύστερα από χρώση με τις κοινές χρωστικές (Giemsa κλπ.). Μοιάζουν με μικρά λεμφοκύτταρα, γι αυτό και είναι αδύνατη η διάκρισή τους με αυτόν τον τρόπο ανάμεσα στα υπόλοιπα κύτταρα του μυελού. Το ίδιο ισχύει και για τα στελεχιαία κύτταρα. Λόγω όμως του 10

διαφορετικού σταδίου διαφοροποίησης στο οποίο βρίσκονται, εμφανίζουν και διαφορετικές πρωτεΐνες επιφανείας στην κυτταρική τους μεμβράνη, οι οποίες μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως δείκτες διαφοροποίησης. (32) Α1.2 ΑΥΞΗΤΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ Οι αυξητικοί παράγοντες ή κυτοκίνες είναι μια ομάδα γλυκοπρωτεϊνών οι οποίες επιδρούν στα αιμοποιητικά κύτταρα δίνοντας το μήνυμα να ξεκινήσουν τη διαδικασία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης. Η δράση τους πραγματοποιείται μέσω ειδικών υποδοχέων οι οποίοι με τη σειρά τους μεταβιβάζουν το μήνυμα στο DNA του πυρήνα. Παράγονται από ένα ευρύ φάσμα κυττάρων κυρίως του μυελού των οστών, όπως είναι οι ινοβλάστες, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα λεμφοκύτταρα, τα μακροφάγα κλπ. Υπάρχουν και κυτοκίνες που αποτελούν εξαίρεση και παράγονται σε άλλα όργανα, όπως είναι η ερυθροποιητίνη που παράγεται στους νεφρούς και η θρομβοποιητίνη που παράγεται στο ήπαρ. Οι αυξητικοί παράγοντες παίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της αιμοποίησης προάγοντας τον πολλαπλασιασμό συγκεκριμένων σειρών των αιμοποιητικών κυττάρων, ανάλογα με τις ανάγκες του οργανισμού. Η δράση τους ξεκινά από το επίπεδο των στελεχιαίων κυττάρων και φτάνει μέχρι τις ωριμότερες μορφές. (33) Έχουν τη δυνατότητα να δρουν από μόνοι τους ή σε συνδυασμό μεταξύ τους έχοντας συνεργιστική δράση. Η συνέργια αυξητικών παραγόντων φαίνεται ότι είναι περισσότερο απαραίτητη στα στελεχιαία κύτταρα και τις άωρες μορφές των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. (33) Οι αυξητικοί παράγοντες που δρουν στις πλέον άωρες μορφές των προγονικών κυττάρων, έχουν συνήθως ευρεία δράση, επιδρώντας και στις τρεις κυτταρικές σειρές του μυελού (λευκή, ερυθρά και μεγακαρυοκυτταρική). Τέτοιου είδους παράγοντες είναι η ιντερλευκίνη-3 (IL-3) και ο Stem Cell Factor (SCF). Αντίθετα, υπάρχουν κυτοκίνες με δράση σε συγκεκριμένη κυρίως σειρά όπως είναι η ερυθροποιητίνη (ΕΡΟ) που δρα στην ερυθρά σειρά και η θρομβοποιητίνη (ΤΡΟ) που δρα στη μεγακαρυοκυτταρική σειρά. (33) Οι αυξητικοί παράγοντες σήμερα χρησιμοποιούνται τόσο in vitro σε πειράματα για τη μελέτη του φαινομένου της αιμοποίησης, όσο και in vivo στην 11

κλινική πράξη. Η κυριότερη in vitro χρήση τους αφορά στις καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων. Stem Cell Factor (SCF) Ο SCF, όπως και η IL-3, αποτελεί κυτοκίνη που δρα κυρίως στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα. Αντίθετα όμως από την IL-3, ο SCF, όταν δρα μόνος του, έχει μικρού βαθμού μόνο επίδραση και χρειάζεται τη συνέργια άλλων κυτοκινών, όπως είναι η IL-3 και ο GM-CSF. Παράγεται από ινοβλάστες, οι οποίοι αποτελούν κύτταρα του στρώματος, δηλαδή του μικροπεριβάλλοντος του μυελού. (34,35,36) Ο υποδοχέας του SCF είναι μία διαμεμβρανική πρωτεΐνη που παράγεται από το ογκογονίδιο c-kit. Για αυτόν τον λόγο, ο SCF ονομάζεται και c-kit συνδέτης. (36) Σε κυτταρικές καλλιέργειες προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων έχει έντονη συνεργιστική δράση με τον GM-CSF, τον G-CSF, την ερυθροποιητίνη και τη θρομβοποιητίνη (περισσότερο εξειδικευμένοι αυξητικοί παράγοντες που δρουν σε πιο ώριμες μορφές αιμοποιητικών κυττάρων) αυξάνοντας τον αριθμό των αποικιών και των τριών κυτταρικών σειρών. (37) Ιντερλευκίνη-3 (IL-3) Η ΙL-3 αποτελεί κυτοκίνη ευρέως φάσματος με δράση κυρίως στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα. Παράγεται κυρίως από τα ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα, καθώς και από τα ενεργοποιημένα κύτταρα-φυσικούς φονιάδες (Natural Killer cells- NK), τα σιτευτικά κύτταρα, τα ενδοθηλιακά κύτταρα, τα μονοκύτταρα και τα κερατινοκύτταρα. (38) Ο υποδοχέας της, IL-3R, είναι ένα διμερές, όπου η α αλυσίδα αποτελεί τον ειδικό υποδοχέα της IL-3, ενώ η β αλυσίδα είναι πρωτεΐνη που χρησιμοποιείται από κοινού με τον GM-CSF και την IL-5. Ο υποδοχέας της IL-3 ανιχνεύεται στα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα, καθώς επίσης και στα μακροφάγα, ηωσινόφιλα, βασεόφιλα, σιτευτικά κύτταρα και μεγακαρυοκύτταρα. (39,40,41,42) Σε κυτταρικές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων η IL-3 προκαλεί τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των πολυδύναμων αιμοποιητικών κυττάρων, καθώς και των καθορισμένων προγονικών κυττάρων και των τριών σειρών. Η 12

χορήγησή της σε πειραματόζωα (ποντικούς) αυξάνει τον αριθμό των άωρων προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, καθώς και των προγονικών κυττάρων όλων των σειρών, στον μυελό των οστών. (43) Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) Ο GM-CSF αποτελεί κυτοκίνη που δρα κυρίως στα καθορισμένα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα της λευκής σειράς. Παράγεται κυρίως από τα ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα και μακροφάγα, καθώς και από τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τους ινοβλάστες. (44) Ο υποδοχέας του GM-CSF είναι ένα διμερές, όπου η α αλυσίδα αποτελεί τον ειδικό υποδοχέα του, ενώ η β αλυσίδα παρουσιάζει ομολογία με τη β αλυσίδα των IL-3R και IL-5R. Ο υποδοχέας του GM-CSF εκφράζεται στα πολυμορφοπύρηνα ουδετερόφιλα, ηωσινόφιλα, μονοκύτταρα/μακροφάγα και στα προγονικά τους κύτταρα, ενώ έχει περιγραφεί και διαλυτός υποδοχέας. (44) Σε κυτταρικές καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων ο GM-CSF προκαλεί τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των πολυδύναμων προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων, καθώς και των καθορισμένων προγονικών κυττάρων των ουδετερόφιλων, ηωσινόφιλων και μακροφάγων (λευκή σειρά). (44) Ιντερλευκίνη-6 (IL-6) Η ΙL-6 αποτελεί κυτοκίνη η οποία παράγεται κυρίως από τα ενεργοποιημένα μονοκύτταρα, ινοβλάστες και ενδοθηλιακά κύτταρα, καθώς και από τα ενεργοποιημένα μακροφάγα, Τ- και Β-λεμφοκύτταρα, κοκκιοκύτταρα, λεία μυϊκά κύτταρα, ηωσινόφιλα, χονδροκύτταρα, οστεοβλάστες, σιτευτικά κύτταρα, νευρογλοιακά κύτταρα και κερατινοκύτταρα. (45) Ο υποδοχέας της IL-6 είναι ένα διμερές, όπου η α αλυσίδα αποτελεί τον ειδικό υποδοχέα της, ενώ η β αλυσίδα (gp 130) αποτελεί κοινή υπομονάδα και για την IL-11, τον Leukemia Inhibitory Factor (LIF), την Ογκοστατίνη Μ, την Καρδιοτροφίνη-1 (CT-1) και τον Celiary Neurotrophic Factor (CNTF). Η β αλυσίδα (gp 130) αποτελεί και τη δραστική υπομονάδα του υποδοχέα που μεταβιβάζει το σήμα μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης στον πυρήνα του κυττάρου. Ο υποδοχέας της 13

IL-6 εκφράζεται στα ενεργοποιημένα Τ- και Β-λεμφοκύτταρα και στα περιφερικά μονοκύτταρα, ενώ έχει περιγραφεί και διαλυτός υποδοχέας. (45) Σε κυτταρικές καλλιέργειες προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων η IL-6 έχει συνεργιστική δράση με την IL-3 προκαλώντας τον πολλαπλασιασμό των πολυδύναμων προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Η IL-6 προκαλεί επίσης την παραγωγή Β-λεμφοκυττάρων in vivo και in vitro, ενεργοποιεί τα Τ-λεμφοκύτταρα, ενώ προάγει την ωρίμανση των μεγακαρυοκυττάρων in vitro και αυξάνει την παραγωγή αιμοπεταλίων in vivo. Έχει δράση σε κυτταρικές καλλιέργειες κυρίως σε συνδυασμό με άλλες κυτοκίνες, αυξάνοντας τον αριθμό των αποικιών της λευκής και της ερυθράς σειράς. (45) Ερυθροποιητίνη (EPO) Η EPO αποτελεί κυτοκίνη που δρα κυρίως στα καθορισμένα προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα της ερυθράς σειράς. Παράγεται κυρίως στους νεφρούς, ενώ συμπληρωματικές πηγές της είναι το ήπαρ, διάφοροι άλλοι ιστοί και τα μακροφάγα. (46) Ο υποδοχέας της EPO είναι μέλος της υπεροικογένειας υποδοχέων κυτοκινών (ύπαρξη εξωκυττάριου, διαμεμβρανικού και ενδοκυττάριου τμήματος). Ο υποδοχέας της EPO εκφράζεται στα κύτταρα της ερυθράς σειράς, ενώ έχουν επίσης βρεθεί υποδοχείς στα κύτταρα του πλακούντα και σε νευρικά κύτταρα. Έχει περιγραφεί και διαλυτός υποδοχέας. (46) Σε κυτταρικές καλλιέργειες προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων η EPO προκαλεί τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των καθορισμένων προγονικών κυττάρων της ερυθράς σειράς, ενώ μέχρι ενός σημείου προάγει τη διαφοροποίηση των μεγακαρυοκυττάρων, τη χημειοταξία των ενδοθηλιακών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό των Β λεμφοκυττάρων (με την προϋπόθεση ότι υπάρχουν στην επιφάνειά τους λειτουργικοί υποδοχείς EPO). (46) 14

Α1.3 ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ ΑΙΜΟΠΟΙΗΤΙΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ Τα αιμοποιητικά κύτταρα μπορούν να πολλαπλασιάζονται και να διαφοροποιούνται από άωρες σε ώριμες μορφές in vitro. Για την καλλιέργεια των αιμοποιητικών κυττάρων είναι απαραίτητη η παρουσία ορισμένων παραγόντων: α) Θρεπτικά συστατικά Τα θρεπτικά συστατικά είναι απαραίτητα τόσο για τη δημιουργία των νέων κυττάρων κατά τη φάση του πολλαπλασιασμού, όσο και για τη λειτουργία τους. Περιέχουν τις βασικές δομικές ουσίες: πρωτεΐνες, λιπίδια νουκλεοτίδια, υδατάνθρακες, βασικές ορμόνες (π.χ. ινσουλίνη), άλατα και βασικά μέταλλα (π.χ. σίδηρος). Οι ουσίες αυτές μπορεί να προέρχονται από φυσική πηγή, όπως είναι ο ορός από το αίμα ζώων, ή να είναι τεχνητό μίγμα που δημιουργείται από τον συνδυασμό των επιμέρους ουσιών. Η χρήση ορού απλοποιεί τη διαδικασία, αλλά έχει το μειονέκτημα ότι πιθανόν να περιέχει παράγοντες που δεν είναι ακόμη γνωστοί και οι οποίοι μπορεί να αλληλεπιδρούν είτε θετικά ή αρνητικά με τους προς μελέτη παράγοντες. (47,48,49,50) β) Αυξητικοί παράγοντες Οι αυξητικοί παράγοντες είναι απαραίτητοι για τη διαδικασία πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης καθώς και σε πολλές περιπτώσεις και για την ίδια την επιβίωση των κυττάρων. Χορηγούνται στις καλλιέργειες σε συγκεντρώσεις οι οποίες θα πρέπει να αποδίδουν το μέγιστο δυνατό αποτέλεσμα. Για αυτόν τον λόγο, καθορίζεται αρχικά η καταλληλότερη συγκέντρωση η οποία θα φέρει τη μέγιστη απόδοση, μέσα από καλλιέργειες κυττάρων όπου αυξάνεται προοδευτικά η συγκέντρωση του αυξητικού παράγοντα. Στην αρχή, ο αριθμός των αποικιών αυξάνει ανάλογα με την αύξηση της συγκέντρωσης και η αύξηση αυτή είναι γραμμική. Αυτό συμβαίνει επειδή δεν έχουν όλα τα αιμοποιητικά κύτταρα τον ίδιο αριθμό υποδοχέων στην επιφάνειά τους και γι αυτό χρειάζονται διαφορετικά επίπεδα συγκέντρωσης για να διεγερθούν. Όταν θα έχουν διεγερθεί όλα τα κύτταρα που 15

προϋπήρχαν στην καλλιέργεια και έφεραν τον συγκεκριμένο υποδοχέα, τότε ο αριθμός των αποικιών παύει να αυξάνεται, όσο και αν αυξηθεί η συγκέντρωση της κυτοκίνης, και η καμπύλη μπαίνει σε στατική φάση. Η συγκέντρωση που θα χρησιμοποιηθεί τελικά στις καλλιέργειες επιλέγεται από μία από τις αρχικές τιμές που αντιστοιχούν στη στατική φάση. (51,52) Ανάλογα με το αντικείμενο της μελέτης, οι αυξητικοί παράγοντες μπορεί να χορηγηθούν στις καλλιέργειες είτε από μόνοι τους ή σε συνδυασμό δύο ή και περισσότερων. Έτσι, είναι δυνατόν να ελεγχθεί, εάν υπάρχει ή όχι συνεργιστική δράση μεταξύ τους. (53) γ) Αντιβιοτικά Τα θρεπτικά υλικά της καλλιέργειας και ο κλίβανος επώασης προσφέρουν ιδανικές συνθήκες για την ανάπτυξη μικροβίων. Η χρήση αντιβιοτικών είναι απαραίτητη για την αποφυγή ανάπτυξης μικροβίων. Τα αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται συνήθως είναι η Πενικιλίνη και η Στρεπτομυκίνη. (53) δ) Αντιοξειδωτικοί παράγοντες Είναι απαραίτητοι για την εξουδετέρωση των ελευθέρων ριζών που παράγονται κατά τον μεταβολισμό των κυττάρων και οι οποίες σε υψηλές συγκεντρώσεις είναι τοξικές για τα κύτταρα. Ο κυριότερος αντιοξειδωτικός παράγοντας που χρησιμοποιείται είναι η 2-Μερκαπτοαιθανόλη. (54) ε) Υλικό βάσης Το είδος του υλικού βάσης εξαρτάται από τη μορφή της καλλιέργειας. Στις καλλιέργειες ημιστερεάς μορφής χρησιμοποιείται μεθυλκυτταρίνη, άγαρ, ή θρόμβος πλάσματος. Στις καλλιέργειες υγρής μορφής χρησιμοποιείται θρεπτικό υλικό ισότονο και ισοοσμωτικό ως προς τα κύτταρα. Θρεπτικό υλικό χρησιμοποιείται και στις καλλιέργειες ημιστερεάς μορφής, επειδή σε αυτό διαλύονται όλοι οι παράγοντες που έχουν προαναφερθεί, πριν τοποθετηθούν στην καλλιέργεια, καθώς και τα ίδια τα αιμοποιητικά κύτταρα. Το θρεπτικό υλικό που χρησιμοποιείται 16

συνήθως είναι το Iscove s Modified Dulbeco s Medium (IMDM). Χαρακτηριστικό του IMDM είναι ότι περιέχει ουσία η οποία μεταβάλλει το χρώμα του ανάλογα με τις αλλαγές του ph. (55,56,57,58,59) Οι καλλιέργειες των αιμοποιητικών κυττάρων επωάζονται σε επωαστικό κλίβανο σε θερμοκρασία 37 ο C, με παροχή διοξειδίου του άνθρακα σε σταθερά επίπεδα της τάξεως του 5%, με παροχή οξυγόνου και παρουσία υγρασίας (υδρατμοί) για την αποφυγή της αφυδάτωσης των κυττάρων (60,61,62) Μέθοδοι καλλιέργειας αιμοποιητικών κυττάρων Ολόκληρη η διαδικασία της προετοιμασίας της καλλιέργειας και των υλικών που θα χρησιμοποιηθούν θα πρέπει να γίνεται κάτω από άσηπτες συνθήκες, γιατί τα θρεπτικά υλικά που περιέχει και οι συνθήκες επώασης αποτελούν ιδανικές συνθήκες για την ανάπτυξη μικροβίων και μυκήτων. Για αυτόν τον λόγο, όλοι οι χειρισμοί γίνονται σε θάλαμο νηματικής ροής (Laminar flow), ενώ τα υγρά διηθούνται με ειδικούς ηθμούς που κατακρατούν τα μικρόβια. Αφού ετοιμαστούν οι καλλιέργειες, τοποθετούνται πρώτα σε ειδικά τριβλία ή φλάσκες, ανάλογα με το είδος της καλλιέργειας, και κατόπιν στον κλίβανο επώασης που διαθέτει τις ιδανικές συνθήκες για την ανάπτυξη των κυττάρων. Οι κυριότερες μέθοδοι καλλιέργειας αιμοποιητικών κυττάρων είναι τρεις: α) Καλλιέργειες υγρής μορφής Οι καλλιέργειες υγρής μορφής πραγματοποιούνται μέσα σε φλάσκες ή σε τριβλία με υποδοχές (wells). Η βάση της καλλιέργειας είναι buffer-καλλιεργητικό υλικό το οποίο συνήθως είναι IMDM και στο οποίο προστίθενται όλοι οι επιπλέον παράγοντες που χρειάζονται για την ανάπτυξη των κυττάρων, καθώς και οι αυξητικοί παράγοντες. Τα κύτταρα που παράγονται από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του αρχικού πληθυσμού παραμένουν στον πυθμένα ή σε εναιώρημα. Στις καλλιέργειες υγρής μορφής δίνεται η δυνατότητα λήψης δειγμάτων ανά τακτά χρονικά διαστήματα, ούτως ώστε να παρακολουθείται ο ρυθμός αύξησης του αριθμού των κυττάρων καθώς και η βιωσιμότητά τους. Η μέτρηση του αριθμού των 17

κυττάρων γίνεται συνήθως σε πλάκα Neubauer, ενώ η βιωσιμότητα υπολογίζεται με τη χρήση της χρωστικής Trypan-Blue που χρωματίζει επιλεκτικά τα νεκρά κύτταρα. Επίσης, είναι δυνατή η επανακαλλιέργεια μέρους των κυττάρων είτε σε νέες καλλιέργειες υγρής μορφής ή σε καλλιέργειες ημιστερεάς μορφής. (35,63) Οι καλλιέργειες υγρής μορφής αποτελούν την καλύτερη μέθοδο για τον in vitro πολλαπλασιασμό των αιμοποιητικών κυττάρων δίνοντας τη δυνατότητα υψηλών ρυθμών πολλαπλασιασμού. β) Καλλιέργειες ημιστερεάς μορφής Στις καλλιέργειες ημιστερεάς μορφής το βασικό καλλιεργητικό υλικό έχει μεγάλο ιξώδες λόγω της υψηλής συγκέντρωσής του. Αυτό συντελεί στο να μην μπορούν να μετακινηθούν τα κύτταρα και να παραμένουν στο σημείο στο οποίο δημιουργήθηκαν. Όταν επομένως κάποιο προγονικό αιμοποιητικό κύτταρο διεγερθεί από τους αυξητικούς παράγοντες που υπάρχουν στην καλλιέργεια και ξεκινήσει τη διαδικασία πολλαπλασιασμού, τα κύτταρα που θα προέλθουν παραμένουν στην ίδια περιοχή δημιουργώντας την εικόνα αποικίας. Για αυτόν τον λόγο, τα προγονικά αυτά κύτταρα ονομάζονται κύτταρα που δημιουργούν τις αποικίες (Colony Forming Cells, CFC). Επειδή τα κύτταρα που απαρτίζουν την αποικία αποτελούν κλώνους ενός και μοναδικού κυττάρου, οι καλλιέργειες ημιστερεάς μορφής ονομάζονται και κλωνικές καλλιέργειες. Τα κυριότερα βασικά υλικά που χρησιμοποιούνται είναι η μεθυλκυτταρίνη (Methylcellulose, Mtc), το άγαρ, ο θρόμβος πλάσματος και ο θρόμβος ινώδους. (64,65) Οι καλλιέργειες ημιστερεάς μορφής αποτελούν την κατάλληλη μέθοδο για την καταμέτρηση και ταυτοποίηση των προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων μια που τα κύτταρα αυτά δεν παρουσιάζουν ιδιαίτερα μορφολογικά ή αντιγονικά χαρακτηριστικά. Η ταυτοποίησή τους γίνεται ανάλογα με το είδος των κυττάρων που απαρτίζουν την κάθε αποικία. Κάτω από τις συνθήκες καλλιέργειας και με την παρουσία των ανάλογων αυξητικών παραγόντων, τα κύτταρα των αποικιών φτάνουν σε τελικό στάδιο διαφοροποίησης, οπότε είναι εύκολο από το χρώμα, τη μορφή της αποικίας και το μέγεθος των κυττάρων να καθοριστεί σε ποια κυτταρική σειρά ανήκει το κύτταρο που τη δημιούργησε: μυελική (λευκή), ερυθρά ή μεγακαρυοκυτταρική, οπότε λαμβάνει και την αντίστοιχη ονομασία: GM-CFC (ή CFU-GM), BFU-E και 18

Μeg-CFC. Οι αποικίες αναγνωρίζονται με τη βοήθεια ανεστραμμένου μικροσκοπίου, ύστερα από καθορισμένο χρονικό διάστημα παραμονής στον κλίβανο επώασης. Αυτό το χρονικό διάστημα παραμονής για τα ανθρώπινα κύτταρα είναι: για τα GM-CFC και ΒFU-E 14 ημέρες, και για τα Meg-CFC 10 ημέρες, ενώ για τα κύτταρα των ποντικιών είναι: για τα GM-CFC και BFU-E 7 ημέρες, και για τα Meg-CFC 5 ημέρες. Σαν αποικίες αναγνωρίζονται συγκεντρώσεις κυττάρων από 50 κύτταρα και άνω για τα GM-CFC και BFU-E και από 3 κύτταρα και άνω για τα Meg- CFC. (66,67,68,69,70) γ) Καλλιέργειες μακράς διάρκειας Οι καλλιέργειες μακράς διάρκειας χρησιμοποιούνται για την καταμέτρηση και ταυτοποίηση πολύ άωρων προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων που πλησιάζουν πολύ περισσότερο στο επίπεδο του στελεχιαίου κυττάρου. Τα κύτταρα αυτά ονομάζονται κύτταρα που εκκινούν τη διαδικασία της μακροχρόνιας καλλιέργειας (Long Term Culture Initiating Cells, LTC-IC). H μέθοδος βασίζεται στην παρατήρηση, ότι το μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών παίζει καθοριστικό ρόλο στην αιμοποίηση προσφέροντας στα στελεχιαία κύτταρα επιφάνεια στήριξης, παραγωγή αυξητικών παραγόντων και πιθανόν ενεργοποίηση μέσω κυτταρικών υποδοχέων. Κύτταρα του μικροπεριβάλλοντος, όπως είναι τα ενδοθηλιακά κύτταρα, οι ινοβλάστες, τα κύτταρα λίπους και τα μακροφάγα, καλλιεργούνται σε ειδικά τριβλία, όπου λόγω της ιδιότητάς τους να συγκολλούνται, σχηματίζουν στρώμα από στιβάδες κυττάρων που καλύπτει όλη την επιφάνεια του τριβλίου. Η όλη διαδικασία διαρκεί 2 έως 3 εβδομάδες και αποτελεί το κατάλληλο καλλιεργητικό υπόστρωμα για τον πολλαπλασιασμό των LTC-IC. Η χρήση αυξητικών παραγόντων συντελεί στην περαιτέρω ανάπτυξη των αποικιών. (71,72) 19

Α2. ΑΝΤΙΜΥΚΗΤΙΑΣΙΚΑ ΦΑΡΜΑΚΑ Σε σύγκριση με τον αριθμό των αντιβακτηριακών φαρμάκων που είναι διαθέσιμα, υπάρχουν πολύ λιγότερες αντιμυκητιασικές ενώσεις. Τα τελευταία χρόνια, ο αριθμός των αντιμυκητιασικών φαρμάκων αυξάνεται συνεχώς. Υπάρχουν τέσσερις κύριες οικογένειες αντιμυκητιασικών ενώσεων: τα πολυένια, οι αζόλες, οι αλλυλαμίνες και οι εχινοκανδίνες. Επίσης, υπάρχουν διάφορες ενώσεις που δεν ανήκουν σε καμία εκ των τεσσάρων παραπάνω οικογενειών και νέες ομάδες ενώσεων αναπτύσσονται συνεχώς. (73) Στη συγκεκριμένη εργασία χρησιμοποιήθηκαν τέσσερα (4) αντιμυκητιασικά φάρμακα: η κλασσική Αμφοτερικίνη Β (Fungizone), η λιποσωμική Αμφοτερικίνη Β (Ambisome), η Βορικοναζόλη (VFend) και η Κασποφουνγκίνη (Cancidas). Αμφοτερικίνη Β Η Αμφοτερικίνη Β (AmB) είναι μια μακροκυκλική ένωση που ανήκει στα πολυένια και έχει αντιβιοτική δράση, ενώ παράγεται από το βακτήριο Streptomyces nodosus. Υπάρχουν δύο μορφές Αμφοτερικίνης, η Α και η Β, αλλά μόνο η Β χρησιμοποιείται σε κλινικό επίπεδο, επειδή είναι πιο δραστική in vivo. Η Αμφοτερικίνη Β έχει, όπως υποδηλώνει και το όνομά της, αμφοτερική φύση, καθώς αποτελείται από μια μακριά πολυανθρακική υδρόφιλη αλυσίδα και από μια εξίσου μακριά υδρόφοβη (λιπόφιλη) αλυσίδα που τερματίζεται από ένα αμινοσάκχαρο (μυκοζαμίνη). Εξαιτίας της αμφοτερικής της φύσης, η Αμφοτερικίνη Β παρουσιάζει πολύ μικρή διαλυτότητα στο νερό και στους υδατικούς διαλύτες. Για αυτόν τον λόγο, χορηγείται ενδοφλεβικά ως μικυλλιακό εναιώρημα με το απορρυπαντικό deoxycholate [Fungizone (C-AmB ή AmB-DOC), Bristol-Myers Squibb]. (73,74,75,76) Η C-AmB είναι τοξική και γι αυτό περιορίζεται η κλινική της χρησιμότητα, αφού συχνά μόνο μικρές συγκεντρώσεις μπορούν να χορηγηθούν για την αντιμετώπιση της μόλυνσης από μύκητες. Η νεφροτοξικότητα και η μυελοτοξικότητα είναι οι κυριότερες δυσμενείς επιδράσεις του φαρμάκου. Αυτή η τοξικότητα οφείλεται σε μεταβολές της διαπερατότητας των μεμβρανών των νεφρικών κυττάρων και των κυττάρων του μυελού των οστών, εξαιτίας της απελευθέρωσης των μορίων της Αμφοτερικίνης Β από το deoxycholate και της αλληλεπίδρασής τους με 20

τη χοληστερόλη των μεμβρανών αυτών. Επίσης, αυτή η τοξικότητα οφείλεται στη δέσμευση της απελευθερωθείσας από το deoxycholate Αμφοτερικίνης Β στις λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας (LDL), καθώς και στην πρόσληψη αυτών των συμπλόκων από κύτταρα που φέρουν LDL υποδοχείς. Μετά την ενδοκύτωση, η Αμφοτερικίνη Β απελευθερώνεται εύκολα από τις λιποπρωτεΐνες χαμηλής πυκνότητας και προκαλεί κυτταρικές μεταβολές και τοξικότητα. Επιπλέον, η Αμφοτερικίνη Β είναι αιμολυτική και όλες οι τοξικές της επιπτώσεις επιδεινώνονται από την τοξική για τις μεμβράνες δράση του deoxycholate. (75) Εξαιτίας του λιπόφιλου χαρακτήρα της Αμφοτερικίνης Β (έχει υδρόφοβη αλυσίδα) και της συγγένειάς της για τα μεμβρανικά λιπίδια, έχουν αναπτυχθεί τρία λιπιδικά παρασκευάσματα του φαρμάκου με σκοπό τη μείωση της τοξικότητας και την αύξηση της αποτελεσματικότητάς του: α) λιποσωμική Αμφοτερικίνη Β [Ambisome (L-AmB), Gilead Sciences], στην οποία το φάρμακο είναι εγκυστωμένο μέσα σε περιέχοντα φωσφολιπίδια λιποσώματα, β) λιπιδικό σύμπλοκο Αμφοτερικίνης Β [Abelcet (ABLC), Enzon Pharmaceuticals], στο οποίο το φάρμακο είναι σε σύμπλοκο με φωσφολιπίδια σχηματίζοντας δομές με ταινιοειδή όψη, και γ) κολλοειδές διάλυμα Αμφοτερικίνης Β [Amphocil (ABCD), Sequus Pharmaceuticals & Amphotec (ABCD), Intermune Pharmaceuticals], στο οποίο το φάρμακο είναι σε σύμπλοκο με θειική χοληστερόλη σχηματίζοντας μικρούς λιπιδικούς δίσκους. Αυτά τα παρασκευάσματα, λόγω της διαφοροποιημένης φαρμακολογικής κατανομής τους, φαίνεται πως είναι λιγότερο τοξικά από την C-AmB, ενώ, εξαιτίας της διαφορετικής λιπιδικής σύστασης και δομής τους, παρουσιάζουν διαφορές μεταξύ τους ως προς την τοξικότητα, τη φαρμακοκινητική, την κατανομή και την αποτελεσματικότητά τους. (73,75,77,78) 21

Μηχανισμός δράσης Η Αμφοτερικίνη Β δρα στους μύκητες με κάποια επιλεκτικότητα, επειδή έχει υψηλότερη συγγένεια για την εργοστερόλη, την κύρια στερόλη των κυτταρικών μεμβρανών των μυκήτων, παρά για τη χοληστερόλη που επικρατεί στα κύτταρα των θηλαστικών. Οκτώ μόρια Αμφοτερικίνης Β αλληλεπιδρούν άμεσα, μέσω των υδρόφοβων αλυσίδων τους, με οκτώ μόρια εργοστερόλης. Η κυκλική διάταξη αυτών των συμπλόκων στην κυτταρική μεμβράνη έχει ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός πόρου ο οποίος περικλείεται από τις οκτώ υδρόφιλες αλυσίδες των μορίων του φαρμάκου. Η επαγωγή της δημιουργίας των πόρων στις κυτταρικές μεμβράνες των μυκήτων οδηγεί στην αύξηση της διαπερατότητας των μεμβρανών, στην απώλεια κυτταρικών συστατικών και στον κυτταρικό θάνατο. (73,75,79) Βορικοναζόλη Η Βορικοναζόλη (VFend, Pfizer) είναι μια συνθετική ένωση που ανήκει στις αζόλες (τριαζόλη) και έχει αντιμυκητιασική δράση, ενώ παράγεται από τη Φλουκοναζόλη. Η Βορικοναζόλη είναι το αποτέλεσμα μιας συστηματικής προσπάθειας δημιουργίας ενός φαρμάκου με βελτιωμένη δραστικότητα και με ευρύτερο φάσμα δράσης σε σύγκριση με τη Φλουκοναζόλη. Αυτό έγινε δυνατό με την προσθήκη μιας α-μεθυλικής ομάδας (-CH 3 ) και μιας 4-φθοριοπυριμιδίνης στο μόριο της Φλουκοναζόλης. (73,80,81) Μηχανισμός δράσης Η Βορικοναζόλη είναι ένας ισχυρός αναστολέας της βιοσύνθεσης της εργοστερόλης, αφού, μέσω της δράσης της στο εξαρτώμενο από το κυτόχρωμα P-450 ένζυμο λανοστερολ-14-α-απομεθυλάση, οδηγεί στην εξάντληση της εργοστερόλης και στη συσσώρευση μεθυλιωμένων στερολών (τοξικά στεροειδή) με αποτέλεσμα τη διακοπή της δομής και της λειτουργίας των κυτταρικών μεμβρανών των μυκήτων. (73) 22

Κασποφουνγκίνη Η Κασποφουνγκίνη (Cancidas, Merck Sharp & Dohme) είναι μια ημισυνθετική λιποπεπτιδική ένωση (εχινοκανδίνη), παράγωγο της πνευμοκανδίνης Β 0, ενός προϊόντος ζύμωσης του μύκητα Glarea lozoyensis. Η Κασποφουνγκίνη ανταποκρίνεται στις ανάγκες για καλύτερη αντιμυκητιασική θεραπεία, αφού διαθέτει καινοτόμο μηχανισμό δράσης, δραστικότητα συγκρίσιμη με αυτήν της Αμφοτερικίνης Β (παρέχει τη δραστικότητα της Αμφοτερικίνης Β) και δείκτη ασφάλειας συγκρίσιμο με αυτόν της Φλουκοναζόλης (παρέχει την ανεκτικότητα των αζολών). (73,79) Μηχανισμός δράσης Η Κασποφουνγκίνη είναι ο πρώτος εκπρόσωπος μιας νέας κατηγορίας αντιμυκητιασικών ουσιών, γνωστής ως κατηγορία των αναστολέων της σύνθεσης της γλυκάνης. Η Κασποφουνγκίνη αναστέλλει τη σύνθεση της β-(1,3)-d-γλυκάνης, ενός αναπόσπαστου συστατικού του κυτταρικού τοιχώματος πολλών παθογόνων μυκήτων το οποίο δεν υπάρχει στα κύτταρα των θηλαστικών. Η διακοπή της δομής του κυτταρικού τοιχώματος από την Κασποφουνγκίνη οδηγεί σε οσμωτική αστάθεια και τελική λύση του μύκητα (Εικόνα 3). (73,79) Κασποφουνγκίνη Εικόνα 3. Φυσιολογική σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος (αριστερά) και αναστολή της σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος εξαιτίας της αναστολής της σύνθεσης της β-(1,3)-dγλυκάνης από την Κασποφουνγκίνη (δεξιά). (79) 23

Αυτός ο καινοτόμος μηχανισμός δράσης διαφέρει από εκείνον των προαναφερθέντων αντιμυκητιασικών ουσιών (Αμφοτερικίνη Β και Βορικοναζόλη), αφού εντοπίζεται στο κυτταρικό τοίχωμα και όχι στην κυτταρική μεμβράνη, παρέχοντας έτσι ορισμένα πλεονεκτήματα όσον αφορά την αποτελεσματικότητα και την ανεκτικότητα. Πιο συγκεκριμένα, η Κασποφουνγκίνη, δρώντας σε διαφορετικά σημεία-στόχους από την Αμφοτερικίνη Β και τη Βορικοναζόλη, παρέχει τη δυνατότητα 1) για αποτελεσματικότητα σε λοιμώξεις προκαλούμενες από ανθεκτικά σε αυτές τις ουσίες παθογόνα και 2) για αθροιστική δραστικότητα σε περίπτωση που χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με την Αμφοτερικίνη Β ή τη Βορικοναζόλη. Επειδή τόσο η Αμφοτερικίνη Β όσο και η Βορικοναζόλη πρέπει να διαπεράσουν το κυτταρικό τοίχωμα για να φτάσουν στον στόχο τους (κυτταρική μεμβράνη), η αύξηση της δραστικότητάς τους από την Κασποφουνγκίνη αποδίδεται στην αυξημένη πρόσβαση στα σημεία-στόχους των μυκήτων, εξαιτίας της αναστολής της σύνθεσης του κυτταρικού τοιχώματος από την Κασποφουνγκίνη. Επιπλέον, επειδή η Κασποφουνγκίνη παρουσιάζει πολύ μεγάλη εκλεκτικότητα σε στόχο που δεν υπάρχει στα κύτταρα των θηλαστικών [β-(1,3)-d-γλυκάνη του κυτταρικού τοιχώματος των μυκήτων], δεν παρουσιάζει την πιθανότητα εμφάνισης τοξικότητας εξαιτίας του μηχανισμού δράσης, όπως η Αμφοτερικίνη Β (ανεκτικότητα). (79) 24

Β. ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ Οι μολύνσεις από μικρόβια και μύκητες αποτελούν ένα από τα σοβαρότερα προβλήματα στις καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων. Η προφυλακτική χρήση αντιμικροβιακών φαρμάκων βοηθά στο να περιοριστούν οι μολύνσεις από μικρόβια. Ως αντιμικροβιακά φάρμακα στις καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων χρησιμοποιούνται η πενικιλίνη και η στρεπτομυκίνη. Όσον αφορά στην προφυλακτική χρήση αντιμυκητιασικών φαρμάκων, η Αμφοτερικίνη Β που χρησιμοποιούταν παλαιότερα στις καλλιέργειες ως αντιμυκητιασικό, σπάνια χρησιμοποιείται σήμερα, επειδή αποδείχτηκε ότι είναι τοξική για τα αιμοποιητικά κύτταρα. Αυτός είναι και ο λόγος που οι μολύνσεις από μύκητες είναι το σοβαρότερο πρόβλημα στις καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων. Τα νεότερης γενιάς αντιμυκητιασικά φάρμακα δεν έχουν χρησιμοποιηθεί ακόμη στις κυτταρικές καλλιέργειες για την προφύλαξή τους από τις μολύνσεις από μύκητες. Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας είναι ο έλεγχος της τοξικότητας των νεότερων αντιμυκητιασικών φαρμάκων, λιποσωμικής Αμφοτερικίνης Β (Ambisome), Βορικοναζόλης (VFend) και Κασποφουνγκίνης (Cancidas), στις καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων, δηλαδή στην in vitro ανάπτυξη αποικιών αιμοποιητικών κυττάρων από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα μυελού των οστών ποντικών, σε σύγκριση με την κλασσική Αμφοτερικίνη Β (Fungizone). 25

Γ. ΥΛΙΚΑ - ΜΕΘΟΔΟΙ Όλα τα πειράματα που έγιναν στα πλαίσια της συγκεκριμένης εργασίας, πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας (Πειραματικό) της Αιματολογικής Κλινικής και ΜΜΜΟ του Γ.Π.Ν. Θεσσαλονίκης «Γ. Παπανικολάου». Υλικά Παράγοντες επιβίωσης, ανάπτυξης, πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των κυττάρων Για τα συγκεκριμένα πειράματα, χρησιμοποιήθηκε FBS 100% v/v (Fetal Bovine Serum, GIBCO), BSΑ 10% w/v (Bovine Serum Albumin, Stem Cell Technologies), 2-Μερκαπτοαιθανόλη (SIGMA), Πενικιλίνη (GIBCO), Στρεπτομυκίνη (GIBCO), rmscf (recombinant mouse Stem Cell Factor, R&D Systems), rmil-3 (recombinant mouse Interleukin-3, R&D Systems), rmgm-csf (recombinant mouse Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor, R&D Systems), rhil-6 (recombinant human Interleukin-6, R&D Systems), rhepo (recombinant human Erythropoietin, R&D Systems), Μεθυλκυτταρίνη 2,6% w/v (Stem Cell Technologies) και IMDM (GIBCO). Αντιμυκητιασικά φάρμακα Για τα συγκεκριμένα πειράματα, χρησιμοποιήθηκαν τα αντιμυκητιασικά φάρμακα λιποσωμική Αμφοτερικίνη (Gilead Sciences), Βορικοναζόλη (Pfizer), Κασποφουνγκίνη (Merck Sharp & Dohme) και κλασσική Αμφοτερικίνη Β (GIBCO). 26

Πειραματόζωα Για τα συγκεκριμένα πειράματα, χρησιμοποιήθηκαν αιμοποιητικά κύτταρα μυελού των οστών από φυσιολογικά αρσενικά ποντίκια της αιμομικτικής σειράς C57bl/6 ηλικίας 6 έως 13 εβδομάδων. Τα συγκεκριμένα ποντίκια προέρχονται από την αποικία του Εργαστηρίου Γονιδιακής και Κυτταρικής Θεραπείας (Πειραματικό) του Νοσοκομείου «Γ. Παπανικολάου». Καλλιέργειες ημιστερεάς μορφής Η διαδικασία της in vitro ανάπτυξης αποικιών αιμοποιητικών κυττάρων από προγονικά αιμοποιητικά κύτταρα μυελού των οστών ποντικών περιλαμβάνει τα εξής στάδια: 1. Συλλογή κυττάρων Από τις κνήμες ποντικών, οι οποίοι είχαν προηγουμένως θυσιαστεί με έκθεσή τους σε αιθέρα, λαμβάνονται, με τη βοήθεια μιας αποστειρωμένης λαβίδας και σύριγγας, τα κύτταρα του μυελού των οστών σε τριβλίο των 60 mm το οποίο ήδη περιέχει 5 ml IMDM (GIBCO). Αφού διαλυθούν με σύριγγα τα συσσωματώματα των κυττάρων, το περιεχόμενο του τριβλίου διηθείται με φίλτρο των 70 μm και μεταφέρεται σε κωνικό φιαλίδιο των 15 ml. Ακολουθεί φυγοκέντρηση στις 2500 rpm για 10 min στους 4 ο C και επαναιώρηση του ιζήματος (περιέχει τα κύτταρα) σε 1 ml IMDM. 2. Υπολογισμός κυττάρων Σε ένα σωλήνα τύπου eppendorf αναμειγνύονται 100 μl χρωστικής TURKS, 80 μl IMDM και 20 μl του εναιωρήματος των κυττάρων (δηλαδή 1:10 αραίωση) και μετράται ο αριθμός των κυττάρων ανά ml στην πλάκα Neubauer βάσει του τύπου: αριθμός κυττάρων στα 4 μεγάλα τετράγωνα της πλάκας Neubauer /4 x αραίωση x 10 4. Έπειτα, υπολογίζονται τα μl του εναιωρήματος των κυττάρων που θα προστεθούν. Σε κάθε καλλιέργεια υπάρχουν 8x10 4 κύτταρα /ml καλλιέργειας. 27

3. Καλλιέργειες Προσθήκη κυττάρων και παραγόντων επιβίωσης, ανάπτυξης, πολλαπλασιασμού και διαφοροποίησης των κυττάρων Χρησιμοποιούνται κωνικά φιαλίδια των 15 ml καθένα εκ των οποίων θα περιέχει καλλιέργεια κυττάρων τελικού όγκου 2,5 ml. Σε κάθε κωνικό φιαλίδιο προστίθενται τα εξής υλικά (η ποσότητα του κάθε υλικού δίνεται ανά ml καλλιέργειας, οπότε, για να περιέχει κάθε κωνικό φιαλίδιο καλλιέργεια κυττάρων τελικού όγκου 2,5 ml, γίνεται αναγωγή των παρακάτω ποσοτήτων στα 2,5 ml καλλιέργειας): 150 μl/ml FBS, 60 μl/ml BSΑ, 2x10-7 M/ml 2-Μερκαπτοαιθανόλη, 18,778 U/ml Πενικιλίνη, 18,778 μg/ml Στρεπτομυκίνη, 0,4 ng/ml rmscf, 2 ng/ml rmil-3, 0,04 ng/ml rmgm-csf, 40 ng/ml rhil-6, 1,2 U/ml rhepo, 8x10 4 κύτταρα/ml και 400 μl/ml Μεθυλκυτταρίνη. Σε κάθε κωνικό φιαλίδιο συμπληρώνεται τόση ποσότητα IMDM, ώστε η καλλιέργεια κάθε κωνικού φιαλιδίου να έχει τελικό όγκο 2,5 ml (Εικόνα 4). Προσθήκη αντιμυκητιασικών φαρμάκων Σε διαφορετικά κωνικά φιαλίδια των 15 ml, καθένα εκ των οποίων περιέχει καλλιέργεια κυττάρων τελικού όγκου 2,5 ml, προστίθενται διαφορετικές συγκεντρώσεις των αντιμυκητιασικών φαρμάκων: 6, 60, 600 και 6000 ng/ml λιποσωμική Αμφοτερικίνη, 4, 20, 100 και 500 ng/ml Βορικοναζόλη, 0,4, 2, 10 και 50 ng/ml Κασποφουνγκίνη και 60, 600 και 6000 ng/ml κλασσική Αμφοτερικίνη Β, ανάλογα με την ομάδα στην οποία ανήκει η καλλιέργεια κυττάρων του κάθε διαφορετικού φιαλιδίου σύμφωνα με το Σχήμα 1 (βλέπε παρακάτω), ενώ υπάρχει και κωνικό φιαλίδιο με καλλιέργεια-μάρτυρα στο οποίο δεν προστίθεται κανένα αντιμυκητιασικό φάρμακο. Η μικρότερη συγκέντρωση (1 η συγκέντρωση) του κάθε αντιμυκητιασικού φάρμάκου που προστίθεται στις καλλιέργειες κυττάρων, είναι σε αντιστοιχία με τη συγκέντρωση που χορηγείται στον άνθρωπο ανά χιλιόγραμμο (Kg) βάρους σώματος. 28

4. Επίστρωση επώαση καλλιεργειών Με τη βοήθεια σύριγγας με blunt end needle, ανακινείται το περιεχόμενο του κάθε διαφορετικού κωνικού φιαλιδίου καλά και προσεκτικά για την αποφυγή δημιουργίας φυσαλίδων, και στη συνέχεια μεταφέρεται και επιστρώνεται με την ίδια σύριγγα σε δύο τριβλία των 35 mm, καθένα εκ των οποίων θα περιέχει από 1 ml της καλλιέργειας του συγκεκριμένου κωνικού φιαλιδίου (γι αυτό και όλες οι καλλιέργειες σε κάθε πείραμα είναι εις διπλούν). Κατόπιν, τα δύο μικρά τριβλία που λαμβάνονται από το κάθε διαφορετικό κωνικό φιαλίδιο, τοποθετούνται σε τριβλίο των 100 mm μαζί με ένα τρίτο μικρό τριβλίο το οποίο είναι χωρίς καπάκι και περιέχει αποστειρωμένο νερό (Εικόνα 4). Έπειτα, τα τριβλία των 100 mm που λαμβάνονται από τα διαφορετικά κωνικά φιαλίδια, τοποθετούνται σε επωαστικό κλίβανο και επωάζονται σε θερμοκρασία 37 ο C, ατμοσφαιρικό αέρα, υγρασία και 5% CO 2 για 7 ημέρες. 5. Καταμέτρηση αποικιών Μετά από 7 ημέρες καλλιέργειας, καταμετρούνται αποικίες CFU-GM σε ανεστραμμένο μικροσκόπιο με τη βοήθεια ενός τριβλίου το οποίο φέρει γραμμώσεις που διαιρούν τη βάση του σε μικρά τετράγωνα (Εικόνα 4). Ως αποικίες θεωρούνται συγκεντρώσεις 50 ή περισσότερων κυττάρων. τριβλίο με αποστειρωμένο νερό Επίστρωση καλλιέργειας Καταμέτρηση αποικιών κωνικό φιαλίδιο με 2,5 ml καλλιέργειας τριβλία με 1 ml καλλιέργειας το καθένα τριβλίο με γραμμώσεις στη βάση του Εικόνα 4. Σχηματική παράσταση των σταδίων της επίστρωσης του περιεχόμενου του κάθε κωνικού φιαλιδίου και της καταμέτρησης των αποικιών που αναπτύσσονται σε κάθε μικρό τριβλίο. 29

Οργάνωση πειραμάτων Η οργάνωση της πειραματικής διαδικασίας έγινε ως εξής: Καλλιεργήθηκαν αιμοποιητικά κύτταρα μυελού των οστών ποντικών σε ημιστερεές καλλιέργειες μεθυλκυτταρίνης και μετρήθηκε ο αριθμός των αποικιών που αναπτύχθηκαν. Έγιναν 3 ομάδες καλλιεργειών: Στην 1 η ομάδα, οι καλλιέργειες περιείχαν τα νεότερα αντιμυκητιασικά φάρμακα. Συγκεκριμένα, η ομάδα αυτή χωρίστηκε σε 3 υποομάδες, η καθεμιά από τις οποίες περιείχε και από ένα διαφορετικό αντιμυκητιασικό φάρμακο, λιποσωμική Αμφοτερικίνη (Ambisome), Βορικοναζόλη (VFend), Κασποφουνγκίνη (Cancidas). Στη 2 η ομάδα, οι καλλιέργειες περιείχαν κλασσική Αμφοτερικίνη Β (Fungizone). Στην 3 η ομάδα, οι καλλιέργειες δεν περιείχαν κανένα αντιμυκητιασικό φάρμακο (Σχήμα 1). Όλα τα πειράματα έγιναν από 2 φορές και σε κάθε πείραμα οι καλλιέργειες ήταν εις διπλούν. ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΕΣ 1η ΟΜΑΔΑ 2η ΟΜΑΔΑ 3η ΟΜΑΔΑ ΛΙΠΟΣΩΜΙΚΗ ΑΜΦΟΤΕΡΙΚΙΝΗ ΒΟΡΙΚΟΝΑΖΟΛΗ ΚΑΣΠΟΦΟΥΝΓΚΙΝΗ ΚΛΑΣΣΙΚΗ ΑΜΦΟΤΕΡΙΚΙΝΗ Β ΜΑΡΤΥΡΑΣ Σχήμα 1. Σχηματική παράσταση της οργάνωσης των ημιστερεών καλλιεργειών αιμοποιητικών κυττάρων σε ομάδες. 30

Δ. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ Μελέτη της δράσης της κλασσικής Αμφοτερικίνης Β (Fungizone) σε καλλιέργειες αιμοποιητικών κυττάρων Από το παρακάτω διάγραμμα γίνεται εμφανές, πως σε μικρή συγκέντρωση (60 ng/ml), η κλασσική Αμφοτερικίνη Β οδήγησε στην αύξηση του αριθμού των αποικιών κατά 28% σε σύγκριση με το μάρτυρα στο πείραμα 1 (μάρτυρας 1 : 465 αποικίες, 60 ng/ml 1 : 596 αποικίες), και στη μείωση του αριθμού των αποικιών κατά 13% σε σύγκριση με το μάρτυρα στο πείραμα 2 (μάρτυρας 2 : 612 αποικίες, 60 ng/ml 2 : 533 αποικίες). Σε κανονική συγκέντρωση (600 ng/ml), στο πείραμα 1, παρατηρείται μείωση του αριθμού των αποικιών κατά 21% σε σύγκριση με την προηγούμενη συγκέντρωση των 60 ng/ml (60 ng/ml 1 : 596 αποικίες, 600 ng/ml 1 : 472 αποικίες), δηλαδή παρατηρείται μία μικρότερη, σε σύγκριση με την προηγούμενη συγκέντρωση (60 ng/ml 1 : 28%), αύξηση του αριθμού των αποικιών κατά 2% σε σύγκριση με το μάρτυρα (μάρτυρας 1 : 465 αποικίες, 600 ng/ml 1 : 472 αποικίες). Στο πείραμα 2 παρατηρείται μείωση του αριθμού των αποικιών κατά 53% σε σύγκριση με το μάρτυρα (μάρτυρας 2 : 612 αποικίες, 600 ng/ml 2 : 288 αποικίες). Τέλος, σε υψηλή συγκέντρωση (6000 ng/ml), παρατηρείται μείωση του αριθμού των αποικιών κατά 73% σε σύγκριση με το μάρτυρα και στα δύο πειράματα (μάρτυρας 1 : 465 αποικίες, 6000 ng/ml 1 : 126 αποικίες και μάρτυρας 2 : 612 αποικίες, 6000 ng/ml 2 : 164 αποικίες) (Διάγραμμα 1). Φαίνεται λοιπόν, ότι η κλασσική Αμφοτερικίνη Β (Fungizone) είναι τοξική για τα αιμοποιητικά κύτταρα (τοξικότητα αυξανόμενη γραμμικά ως προς τη συγκέντρωση) με αποτέλεσμα τη μείωση του αριθμού των αποικιών σε σύγκριση με το μάρτυρα. 31