Anti-TPO Cod: C31ER1008 Trusa pentru determinarea cantitativa a anticorpilor anti-tpo in ser sau plasma prin metoda imunoenzimatica (ELISA) Doar pentru diagnosticul in-vitro 1. INTRODUCERE: Peroxidaza tiroidiana (TPO) prezenta in microzomii celul elor tiroidiene are rol catalizator in sinteza hormonilor tiroidieni. TPO oxideaza iodul patruns in tireocite si iodineaza unele reziduuri tirozinice ale tireoglobulinei (TG), conducand catre formarea de monoiodotirozina (MIT) si diiodotirozine (DIT+DIT). Cuplarea unei molecule MIT cu una de DIT rezulta in triiodotironina (T3) si tetra-iodotironina (T4). TPO este un epitop frecvent al anticorpilor in boli tiroidiene autoimune. Anticorpii anti-tpo sunt detectabii la peste 90% dintre pacientii care sufera de tiroidita Hashimoto si la peste 70% dintre pacientii cu boala Graves (hipertiroidism autoimun), indiferent de starea de funct ionare a glandei tiroide. Tiroidita postpartum este o forma speciala a tiroiditei autoimune observata in urma sarcinii si poate include hipertiroidism temporar sau hipotiroidism. Poate afecta aproximativ 5% dintre femei in decursul primului an dupa nastere. Riscurile sunt mai crescute in cazul femeilor cu boli autoimune (precum diabetul de tip 1), anticorpi anti-tiroida pozitivi sau cu antecedente ale disfunctiilor glandei tiroide. Valori moderate ale anticorpilor anti-tpo se intalnesc uneori in cazul pacientilor care nu prezinta ale simptome ale bolilor tiroidiene, in special la varstnici. Semnificatia clinica a anticorpilor anti-tpo cu valoare scazuta, intalnita la pacienti eutiroizi este in continuare necunoscuta. Posibilitatea ca acesti indivizi sa fie considerati sanatosi ramane in dezbatere, pana la finalizarea studiilor pe termen lung, care sa demonstreze faptul ca nu prezinta risc crescut pentru dezvoltarea disfunctiilor tiroidiene. Autoantigen Afectiunea Simptome Peroxidaza tiroidiana (TPO) Tiroidita Hashimoto Initial hipertiroidism : Nervozitate, pierdere in greutate, insomnii, tahicardie, intoleranta la caldura etc. Ulterior tranzitie graduala la hipertiroidism cronic: oboseala, concentratie scazuta, pierdere in greutate, constipare, intoleranta la rece etc. Boala Graves Hipertiroidism: exoftalmie, gusa tiroidiana, tahicardie Prezenta autoanticorpilor anti-tpo poate fi detectata prin metoda cu imunofluorescenta indirecta si prin mai multe imunotestari cantitative, exemplu RID si ELISA. 2. DESTINAȚIE: Acest kit este destinat determinarii cantitative a anticorpilor anti-tpo in ser sau plasma (recoltata pe citrat), prin metoda ELISA. 3. PRINCIPIUL TESTULUI: Trusa este un test imunoenzimatic de tip sandwich. Godeurile sunt pre-tapetate cu anti-tpo recombinat, pentru a lega anticorpii corespunzatori din proba. Materialul necuplat este indepartat printr-o etapa de spalare. Ulterior se adauga cea de-a doua categorie de anticorpi, anticorpi anti- IgG uman marcati enzimatic cu peroxidaza din hrean. Dupa a doua etapa de spalare se adauga substratul TMB formandu-se un produs de reactie de culoare albastra, vizualizandu-se astfel complexul imun fixat la suprafata godeurilor. Intensitatea culorii produsului este direct proportionala cu cantitatea de anticorpi anti-tpo din probe si standarde. Se adauga acid sulfuric pentru stoparea reactiei enzimatice rezultand un produs de reactie de culoare galbena. Absorbanta se va masura la 450nm folosind un cititor de placi ELISA. 4. MATERIALE: 4.1 Reactivi furnizați în trusă: Godeuri tapetate cu TPO (IgG): 12 stripuri a cate 8 godeuri detasabile, tapetate cu anti-tpo intr-un ambalaj de aluminiu. Diluant IgG pentru probe *** : 1 flacon cu 100ml de tampon fosfat; ph 7.2 ± 0.2, de culoare galbena, gata de utilizare. Solutia stop: 1 flacon continand 15ml de acid sulfuric, 0.2 mol/l, gata de utilizare. Solutia concentrata (20x) de spalare * : 1 flacon continand 50ml de tampon fosfat concentrat (20x) pentru spalarea godeurilor, ph 7.2 ± 0.2. Conjugatul TPO anti-igg uman-hrp ** : 1 flacon continand 20ml de solutie de anticorpi anti-igg uman cuplati cu HRP, de culoare albastra, gata de utilizare. Solutia substrat TMB: 1 flacon continand 15ml de 3, 3', 5, 5' - tetrametilbenzidina (TMB) gata de utilizare (a se evita contactul cu pielea). Control nivel scazut *** : un flacon ce contine 2 ml solutie de control, de culoare galbena. Control nivel ridicat *** : un flacon ce contine 2 ml solutie de control, de culoare galbena. 1
Standardele *** : 6 flacoane a cate 2ml fiecare, de culoare galbena, cu urmatoarele concentratii: Standard A: 0 AU/mL Standard B: 5 AU/mL Standard C: 10 AU/mL Standard D: 20 AU/mL Standard E: 80 AU/mL Standard F: 320 AU/mL * contine 0.1 % Bronidox L dupa diluare; ** contine 0.2 % Bronidox L; *** contine 0.1 % Kathon; 4.2. Materiale furnizate în trusă: 1 placa suport pentru godeuri 1 folie protectoare 1 protocol de lucru 1 schema de distribuție si identificare a godeurilor 4.3. Materiale si echipamente necesare, nefurnizate: cititor ELISA echipat cu filtru pentru masurarea absorbantei la 450/620nm incubator echipament pentru spalarea automata sau manuala a godeurilor pipete capabile de a dispensa volume cuprinse intre 10 si 1000μl agitator pentru eprubete (Vortex) apa distilata sau deionizata eprubete de unica folosinta cronometru 5. CONDIȚII DE PĂSTRARE: Reactivii sunt stabili până la data de expirare înscrisă pe etichetă, dacă sunt păstraţi la 2...8 C în recipientul original. 6. PREPARAREA REACTIVILOR: Este foarte important ca toti reactivii sa atinga temperatura camerei (20-25 C) inainte de utilizare! 6.1. Godeurile detasabile Godeurile detasabile tapetate cu TPO sunt gata de utilizare. Se pastreaza la 2-8 C. Imediat dupa selectarea godeurilor necesare testarii, godeurile ramase trebuie resigilate in folia de aluminiu impreuna cu desicantul si pastrate la 2-8 C; pastrate in aceste conditii, godeurile sunt valabile pana la data expirarii. Folia adeziva nu trebuie indepartata de pe godeurile nefolosite. 6.2. Conjugatul TPO anti-igg Flaconul contine 20 ml de solutie de anticorpi anti-igg umani conjugati cu HRP, cu tampon, stabilizatori, conservanti si un colorant inert de culoare albastra. Solutia este gata de utilizare. Depozitati la 2 8 C. Dupa desigilare, sunt stabili pana la data de expirare atunci cand sunt depozitati la 2 8 C. 6.3 Controale Flacoanele etichetate cu Control nivel scazut si Control nivel crescut contin cate 2 ml de solutie de control gata de utilizare. Control nivel scazut: < 25 AU/ml Control nivel ridicat: > 40 AU/ml Contin 0.1% Kathon si se depoziteaza la 2 8 o C. Dupa desigilare, sunt stabili pana la data de expirare atunci cand sunt depozitati la 2 8 C. 6.4 Standarde Flacoanele etichetate cu Standard A, B, C, D, E si F contin solutie standard gata de utilizare. Solutiie standard au urmatoarele concentratii in unitati arbitrare (AU): Standard A: 0 AU/ml Standard B: 5 AU/ml Standard C: 10 AU/ml Standard D: 20 AU/ml Standard E: 80 AU/ml Standard F: 320 AU/ml Solutiile se depoziteaza la 2 8 o C si contin 0.1% Kathon. Dupa desigilare, sunt stabili pana la data de expirare atunci cand sunt depozitati la 2 8 C. 6.5. Diluantul IgG pentru probe Flaconul contine 100ml tampon fosfat, stabilizatori, conservanti si un colorant inert de culoare galbena. Se utilizeaza pentru diluarea probei. Solutia gata de utilizare se depoziteaza la 2 8 o C. Dupa desigilare, solutia este stabila pana la data de expirare inscrisa pe eticheta atunci cand este depozitata la 2 8 C. 6.6. Solutia de spalare concentrata (20x) Flaconul contine 50 ml tampon concentrat cu detergenti, stabilizatori si conservanti. Se dilueaza 1+19 cu apa redistilata. Exemplu: 10 ml solutie de spalare concentrata + 190 ml apa redistilata. Solutia diluata este stabila 5 zile la temperatura camerei. Daca apar cristale in solutie, acestea dispar daca incalziti solutia, inainte de diluare, la 37 C in baie de apa. Dupa prima deschidere, solutia concentratata este stabila pana la data de expirare inscrisa pe ambalaj. 6.7 Solutia substrat TMB Flaconul contine 15 ml amestec Tetrametilbenzidina/peroxid de hidrogen. Reactivul este gata de utilizare si trebuie pastrat la 2-8 C, ferit de lumina. Solutia trebuie sa fie incolora sau sa aiba o usoara tenta albastruie. Daca substratul devine albastru, inseamna ca este contaminat si trebuie inlaturat. Dupa prima deschidere a flaconului este stabil pana la data de expirare daca este pastrat la 2-8 C. 2
6.8. Solutia stop. Flaconul contine 15 ml solutie acid sulfuric 0,2 M (R36/38, S 26). Solutia este gata de utilizare. Se pastreaza la 2-8 C. Dupa prima deschidere a flaconului este stabil pana la data de expirare daca este pastrat la 2-8 C. 7. RECOLTAREA SI PREGĂTIREA PROBELOR: Pentru testare se folosesc probe umane de ser sau plasma (recoltata pe citrat). Probele pot fi pastrate la 2-8 C pentru perioade mai scurte (5 zile). Pentru pastrarea pe perioade mai indelungate, pana la 30 de zile, probele trebuie portionate si congelate la -20 C pana la -70 C. Probele congelate trebuie omogenizate bine dupa dezghetare, inainte de testare. Trebuie evitata spunerea probelor la cicluri repetate inghet-dezghet. 7.1. Diluția probelor: Înainte de testare, probele trebuie diluate 1 + 100 cu diluant pentru probe IgG. Se pipetează 10µl de probă și 1ml de diluant pentru probe IgG în eprubete pentru a obține o diluție de 1+100 și apoi se agită cu un Vortex. In cazul pacientilor cu o concentratie anti-tpo mai mare decat cea a standardului F (320 AU/ml) se va efectua a doua dilutie 1 + 1 la acest ser diluat deja 1 + 100. Exemplu: 100 µl din prima proba diluata + 100µl diluant pentru proba IgG (omogenizati bine). Factor de dilutie: 2.8. PROCEDURA DE LUCRU: 8.1 Pregătirea testului: Instructiunile de lucru trebuie citite cu atentie inainte de inceperea testarii. Acuratetea rezultatelor depinde de respectarea stricta a cerintelor din protocolul de lucru. Aceasta metoda de lucru a fost validata doar pentru procedura manuala. Daca testul ELISA se va efectua cu un aparat automat este necesar ca numarul ciclurilor de spalare sa creasca de la 3 la 5 si volumul solutiei de spalare sa creasca de la 300 l la 350 l. Inainte de inceperea testului, trebuie facut planul de distribuire si identificare a standardelor si probelor pe fisa inclusa in trusa. Se selecteaza doar numarul de godeuri necesare si se plaseaza in placa-suport. Trebuie alocate cel putin: 1 godeu (A1) pentru blank 6 godeuri (B1, C1 etc.) pentru standardele A, B, C, D, E si F 1 godeu (H1) pentru Controlul scazut (Low) 1 godeu (A2) pentru Controlul ridicat (High) Se recomanda testarea in duplicat a standardelor si probelor pacientilor. Etapele testului trebuie urmate in ordinea data, fara pauze prea mari intre etape. Standardele si probele de testat trebuie pipetate cu varfuri de unica folosinta. Setati incubatorul la 37 o C ±1 o C. 1. Se pipeteaza cate 100μl standarde, controale si probe in godeurile destinate cu exceptia blank-ului. 2. Se acopera godeurile cu folia inclusa in kit. 3. Se incubeaza godeurile timp de 30 min, la 37 ± 1 C. 4. Dupa terminarea perioadei de incubare, inlaturati folia, aspirati continutul si spalati godeurile de 3 ori cu cate 300µl solutie de spalare, cu timp de inmuiere > 5 sec intre 2 cicluri consecutive (pentru spalator automat, spalati godeurile de 5 ori cu cate 350µl so lutie de spalare). Evitati curgerea lichidului de spalare dintr-un godeu in altul. Scuturati apoi placa pe hartie absorbanta pentru inlaturarea resturilor de lichid din godeuri. Nota: Etapa de spalare este critica! O spalare insuficienta poate genera valori ridicate ale absorbantei si o precizie mai scazuta. 5. Se pipeteaza in fiecare godeu cate 100μl de conjugat anticorpi TPO-anti-IgG uman, cu exceptia blank-ului. Se acopera cu folie. 6. Se incubeaza godeurile timp de 30 de minute, la temperatura camerei 20-25 C. Nu expuneti la lumina solara directa. 7. Repetati pasul 4. 8. Se pipeteaza 100μl de substrat TMB in toate godeurile. 9. Se incubeaza godeurile pentru exact 15 minute, la temperatura camerei (20-25 C), la intuneric. 10. Se pipeteaza 100μl de solutie stop in toate godeurile, in aceeasi ordine si in acelasi timp in care a fost pipetat substratul TMB. Culoarea albastra dezvoltata de substrat in timpul incubarii vireaza acum in galben. Nota: Probele pacientilor puternic pozitive pot precipita. Acest precipitat au influenta asupra citirii densitatii optice. Se recomanda prediluarea probelor precum este descris la punctul 7.1 Diluarea Probelor. 11. Se masoara absorbanta solutiei din godeuri la 450/620nm, in maxim 30 de minute dupa adaugarea solutiei stop. 8.2. Măsurarea: Se realizează aducerea la zero a cititorului cu ajutorul blank-ului din godeul A1. Dacă - din motive tehnice - cititorul ELISA nu poate fi resetat la zero cu blank-ul de substrat din godeul A1, scădeți valoarea absorbanței godeului A1 din toate celelalte valori ale absorbanței, măsurate, pentru a obține rezultate corecte! Se măsoară absorbanta tuturor godeurilor la 450 nm si se înregistrează valorile pentru fiecare standard si proba pe schema de distribuție si identificare a godeurilor. Se recomanda citirea la 2 lungimi de unda utilizând 620 nm ca lungime de unda de referință. Daca este cazul, se poate calcula media valorilor absorbantei duplicatelor. 9. REZULTATE: 9.1. Criteriile de validare: Pentru validarea unui test, se vor indeplini urmatoarele criterii: Substratul Blank in A1: Absorbanta < 0.100 Standard A in B1: Absorbanta < 0.200 Standard B in C1: Absorbanta > Standard A Standard C in D1: Absorbanta > Standard B Standard D in E1: Absorbanta > 0.100 Standard E in F1: Absorbanta > 0.400 Standard F in G1: Absorbanta > 1.000 Control nivel scazut in H1: Rezultat < 25 AU/mL Control nivel crescut in A2: Rezultat > 40 AU/mL 3
Standard A <Standard B <Standard C <Standard D< Standard E < Standard F Daca nu se indeplinesc aceste valori, testul nu se valideaza iar executia se repeta. 9.2. Calcularea rezultatelor: Pentru a obține rezultate cantitative în AU/ml, se trasează absorbanta medie a standardelor, A F pe hârtie grafică (linear/linear) într-un sistem de coordonate față de concentrațiile corespunzătoare lor și trasează curba standard de calibrare (valorile de absorbanță pe axa verticală y, concentrațiile pe axa orizontală x). Citiți rezultatele de pe această curbă standard folosind valorile de absorbanță (medii) ale fiecărei probe ale pacientului și control. Notă: Citirile probelor pacienților diluate suplimentar (1+1) trebuie înmulțite cu factorul de diluție potrivit pentru a obține rezultate corecte! (Diluție: 1+1 = Factor de diluție: 2). Toate programele de calculator potrivite și disponibile se pot utiliza pentru citirea și calcularea automate ale rezultatelor. 9.3. Curba de calibrare 3,000 2,000 E 1,000 0,000 0,0 0,1 1,0 10,0 100,0 1000,0 9.4. Interpretarea rezultatelor: Fiecare laborator ar trebui sa-si stabileasca propriile intervale de referinta pe aceasta trusa ELISA, in functie de populatia testata. Valori orientative: normal < 30 AU/mL zona gri 30 35 AU/mL crescut > 35 AU/mL Rezultatele pozitive se vor stabili in functie de starea clinica a pacientului. Deasemeni, decizia in stabilirea unui tratament va fi luata individual. 10. CARACTERISTICI DE PERFORMANTĂ: 10.1: Precizia: AU/ml Inter-testare Proba Nr de replici Media (OD) CV% Ser pozitiv 20 1.334 3.8 Ser pozitiv 20 1.265 4.8 Ser Negativ 20 0.209 6.0 Intra-testare Proba Nr de replici Media (AU/ml) CV% Ser pozitiv 12 113.3 7.1 Ser pozitiv 12 176.0 5.7 10.2. Specificitate de diagnostic Arata probabilitatea ca testul sa obtina un rezultat negativ in absenta analitului specific, > 97%. 10.3 Sensibilitae de diagnostic Arata probabilitatea ca testul sa obtina un rezultat pozitiv in prezenta analitului specific, > 97%. 10.4. Sensibilitae analitica Concentratia aparenta de anti-tpo ce poate fi detectata fata de standardul 0 este < 0.5 AU/mL. 10.5 Interferente Nu s-au observat inferferente cu seruri hemolizate, lipemice sau icterice, la concentratii de pana la 10mg/mL hemoglobina, 5 mg/ml trigliceride si 0.5 mg/ml bilirubina. 11. LIMITĂRILE PROCEDURII: Rezultatele pot fi afectate de contaminarea bacteriana sau de congelarea si decongelarea repetate ale probei. Diagnosticul unei boli infecțioase nu trebuie stabilit doar in baza rezultatului testului. Un diagnostic precis trebuie sa tina cont de istoricul clinic, de simptomatologie, precum si de datele serologice. La pacienții cu imunodeficiența si la nou născuți, rezultatele trebuie interpretate cu atenție. 4
12 PRECAUŢII: In conformitate cu articolul 1, paragraful 2b al Directivei Europene 98/79/EC, utilizarea dispozitivelor medicale pentru diagnosticul in-vitro este destinata de către producător sa asigure performanta si siguranța produsului. Procedura de lucru, informațiile, atenționările si precauțiile menționate in instrucțiunile de lucru trebuie urmate cu strictețe. Utilizarea acestor truse de test cu analizoare automate sau echipamente similare trebuie sa fie validata. Nu este autorizata nicio modificare in structura, compoziția reactivilor sau in procedura de lucru si nici utilizarea reactivilor in combinație cu alte produse ce nu sunt aprobate de producător; utilizatorul este strict răspunzător pentru orice astfel de modificare. In cazul nerespectării acestor reguli, producătorul nu este răspunzător pentru generarea de rezultate false. De asemenea, producătorul nu este răspunzător de raportarea rezultatelor in urma unei analize vizuale. Destinata exclusiv diagnosticului in-vitro. Toate componentele de origine umana utilizate pentru producerea reactivilor acestei truse au fost testate si s-au dovedit a fi negative pentru: Anticorpi anti-hiv, anti-hcv cat si pentru antigen HBs. Cu toate acestea, toate materialele trebuie considerate si manevrate ca fiind potențial infectante. Nu se vor combina reactivi sau godeuri din loturi diferite. Nu se vor utiliza reactivi produși de alta firma in combinație cu reactivii acestei truse. Nu se vor utiliza reactivi ce au depășit termenul de valabilitate. Se vor folosi exclusiv instrumentar de laborator, vârfuri si pipete curate. Nu se vor schimba intre ele capacele recipientelor de reactivi pentru a se evita contaminarea încrucișata. Recipientele de reactivi trebuie bine închise după utilizare pentru a se evita evaporarea sau contaminarea microbiana a reactivului. După desigilare si depozitarea ulterioara, conjugatul si controalele trebuie verificate pentru a nu fi contaminate bacterian. Pentru a evita contaminarea încrucișata si obținerea de rezultate false, pipetarea atât a probelor pacienților cat si a reactivilor trebuie realizata cu atenție, fără stropire, exact pe fundul godeului. Evitați expunerea substratului TMB la lumină directă, metal sau oxidanți. Trusa este destinata utilizării doar de către personal specializat si familiarizat cu regulile de buna practica in laboratorul medical. ATENȚIE: Acidul sulfuric irita pielea si ochii. Este interzis accesul copiilor la această substanță. In cazul contactului cu ochii, clătiți din abundenta cu apa si consultați in cel mai scurt timp un medic! 12.1 GESTIONAREA DESEURILOR: Reziduurile de substanțe chimice sunt considerate deșeuri periculoase. Aruncarea acestor deșeuri se face după reglementările naționale. Contactați autoritățile locale pentru sfaturi cu privire la aruncarea acestor deșeuri. 5
SCHEMA DE LUCRU Anti - TPO Pregătirea testului Prepararea reactivilor și probelor se face precum s-a descris. Stabiliti planul de distributie și identificare pentru toate probele și controalele conform prospectului care însoțește trusa. Selectați numărul de godeuri și inserați-le pe placă. Tehnica de lucru Blank Standard A F Control Low Control High Blank - - - - - Standard A - F - 100 µl - - - Control Low - - 100 µl - - Control High - - - 100 µl - Proba (diluata 1+100) - - - - 100 µl Proba (diluata 1+100) Acoperiti godeurile cu folie adeziva. Incubati 30 minute la 37 o C Spalati fiecare godeu de 3 ori cu cate 300 μl tampon de spalare (sau de 5 ori cu cate 350 μl pentru spalator automat) Conjugat - 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Acoperiti godeurile cu folie adeziva. Incubati 30 minute la temperatura camerei 20-25 o C Spalati fiecare godeu de 3 ori cu cate 300 μl tampon de spalare (sau de 5 ori cu cate 350 μl pentru spalator automat) Substrat TMB 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Incubati 15 minute la temperatura camerei in intuneric Solutia Stop 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl Masurarea absorbantei la 450 nm (cu referinta la 620 nm) Tr.Ro: ms 06.2016, rev:ms 22.06.2016 VT EN: rev IUN 2014 SC Tody Laboratories INT. SRL Adresa: Str. Vadul Moldovei, nr 22, Sector 1, Bucuresti, Romania Tel.: +4021 269 00 00 Fax: +4021 269 06 41 www.todylaboratories.com 6