ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΙΑΤΡΙΚΟ ΤΜΗΜΑ - ΤΟΜΕΑΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΗΣ ΑΝΑΤΟΜΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΙΣΤΟΛΟΓΙΑΣ - ΕΜΒΡΥΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΗΣ: ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΙ ΠΡΥΤΑΝΗΣ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΜΑΝΘΟΣ ΑΝΑΣΤΑΣΙΟΣ ΠΑΝΕΠ. ΕΤΟΣ 2006-2007 Αριθμός:2135 ΠΟΙΟΤΙΚΗ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΗ ΕΚΤΙΜΗΣΗ ΤΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣ ΕΜΒΡΥΪΚΩΝ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΣΤΟ ΑΙΜΑ ΤΗΣ ΜΗΤΕΡΑΣ ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΩΝ ΚΑΙ ΠΑΘΟΛΟΓΙΚΩΝ ΚΥΗΣΕΩΝ ΔΑΝΙΗΛΙΔΗ Σ. ΑΓΓΕΛΟΥ ΜΑΙΕΥΤΗΡΑ-ΓΥΝΑΙΚΟΛΟΓΟΥ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΥΠΟΒΛΗΘΗΚΕ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΤΟΥ ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟΥ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟΥ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗ 2007
ΤΡΙΜΕΛΗΣ ΣΥΜΒΟΥΛΕΥΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΚΟΥΖΗ ΚΟΛΙΑΚΟΥ ΚΟΚΚΩΝΑ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΑΝΕΛΛΑΚΗ ΚΥΠΑΡΙΣΣΗ ΜΑΡΙΑ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΛΕΑΡΧΟΥ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΕΠΤΑΜΕΛΗΣ ΕΞΕΤΑΣΤΙΚΗ ΕΠΙΤΡΟΠΗ ΜΠΟΝΤΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΔΑΛΑΪΝΑ-ΚΥΡΙΑΖΟΠΟΥΛΟΥ ΒΑΣΙΛΙΚΗ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΚΛΩΝΙΖΑΚΗΣ ΙΩΑΝΝΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΛΕΑΡΧΟΥ ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΟΥΖΗ-ΚΟΛΙΑΚΟΥ ΚΟΚΚΩΝΑ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ ΛΑΜΠΡΟΠΟΥΛΟΣ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΗΣ ΚΑΘΗΓΗΤΗΣ ΚΑΝΕΛΛΑΚΗ-ΚΥΠΑΡΙΣΣΗ ΜΑΡΙΑ ΑΝΑΠΛΗΡΩΤΡΙΑ ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Η έγκρισις της Διδακτορικής διατριβής υπό της Ιατρικής Σχολής του Αριστοτελείου ΠανεπιστημίουΘεσσαλονίκης, δεν υποδηλεί αποδοχήν των γνωμών του συγγραφέως. ( Νόμος 5343/32, άρθρ. 202 2 και ν.1268/82, άρθρο 50 8)
ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΕΙΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΘΕΣΣΑΛΟΝΙΚΗΣ ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ ΠΡΟΕΔΡΟΣ ΤΗΣ ΣΧΟΛΗΣ ΝΤΟΜΠΡΟΣ ΝΙΚΟΛΑΟΣ
Στη Μαρία Στο Σάββα Στη Δήμητρα «Α ΓΑΡ ΔΕΙ ΜΑΘΟΝΤΑΣ ΠΟΙΕΙΝ, ΤΑΥΤΑ ΠΟΙΟΥΝΤΕΣ ΜΑΝΘΑΝΟΜΕΝ» ΑΡΙΣΤΟΤΕΛΗΣ Στους γονείς μου Στον αδελφό μου
ΠΡΟΛΟΓΟΣ Θα ήθελα να εκφράσω τις ιδιαίτερες ευχαριστίες μου στην αναπληρώτρια καθηγήτρια κ.κουζή Κοκκώνα η οποία επέβλεψε τη διατριβή μου και συνέβαλε με την καθοδήγησή της ουσιαστικά στο σχεδιασμό και εκτέλεση του πειραματικού μέρους αλλά και στη συγγραφή της μελέτης μου. Επίσης ευχαριστώ θερμά την αναπληρώτρια καθηγήτρια κ. Κανελλάκη Μαρία για το αμέριστο ενδιαφέρον της και την πολύτιμη βοήθειά της στην ολοκλήρωση της διατριβής αυτής. Στον καθηγητή και δάσκαλό μου κ.κλεάρχου Νικόλαο εκφράζω τις θερμότερες ευχαριστίες μου για την ουσιαστική του συμβολή στο σχεδιασμό και πραγματοποίηση της μελέτης αυτής με τις πολύτιμες συμβουλές του και την τεράστια εμπειρία του όχι μόνο στο συγκεκριμένο θέμα αλλά και στη σύγχρονη μαιευτική και γυναικολογία. Ιδιαιτέρως θα ήθελα να ευχαριστήσω τον αναπληρωτή καθηγητή κ.κολιάκο Γεώργιο για την παραχώρηση του εργαστηρίου του και τη σημαντική του βοήθεια στο πειραματικό μέρος της διατριβής. Τέλος ευχαριστώ πολύ και τον βιολόγο κ.τσάγια Νικόλαο για την ουσιαστική του συνδρομή στον προσδιορισμό συγκεκριμένων παραμέτρων των πειραμάτων.
ΣΥΝTΜHΣΕΙΣ AFP: Άλφα εμβρυϊκή πρωτεΐνη (Alpha fetoprotein) B-hCG: Ανθρώπινη βήτα χοριακή γοναδοτροπίνη (Beta human chorionic gonadotropin) CRL: Κεφαλουραίο μήκος (cephalic rump length) CVS: Λήψη χοριακής λάχνης (Chorionic villus sampling) DNA: Δεσοξυριβονουκλεϊκό οξύ (desoxyribonucleic acid) FACS: Κυτταρικός διαχωρισμός με ενεργοποιημένη φλουοροσκεΐνη (Fluorescence activated cell sorting) FISH: In situ υβριδισμός με φλουοροσκεΐνη (fluorescence in situ hybridization) INH-A: Ινχιμπίνη Α (inhibin A) ISET: Διαχωρισμός των επιθηλιακών καρκινικών κυττάρων με βάση το μέγεθός τους (Ιsolation by size of tumor epithelial cells) MACS: Μαγνητικός κυτταρικός διαχωρισμός (Magnetic activated cell sorting) MCV: Μέσος όγκος ερυθρών (Mean cell volume) MoM: Πολλαπλάσια του μέσου (Multiples of median) PBMCs: Μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (Peripheral blood mononuclear cells) PCR: Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase chain reaction) PAPP-A: Πρωτεΐνη Α του πλάσματος σχετιζόμενη με την κύηση (Pregnancy associated plasma protein A) SD: Σταθερή απόκλιση (Standard deviation) SEM: Σταθερό σφάλμα από το μέσο (Standard error of mean) ue3: Ασύζευκτη οιστριόλη (Unconjugated oestriol) ΠΗΤ: Πιθανή ημερομηνία τοκετού ΤΕΡ: Τελευταία έμμηνος ρύση
ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ 1. ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1 2. ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 5 Ι. Προγεννητική διάγνωση σήμερα 5 α. Το οικογενειακό ιστορικό, η εθνικότητα και η προγεννητική διάγνωση 9 β. Προγεννητικός έλεγχος πρώτου τριμήνου 11 γ. Προγεννητικός έλεγχος δευτέρου τριμήνου 15 δ. Επεμβατικές μέθοδοι προγεννητικής διάγνωσης 21 ΙΙ. Ιστορική αναδρομή ανεύρεσης εμβρυικών κυττάρων στο μητρικό αίμα 24 α. Ο αριθμός και το είδος των κυττάρων στο μητρικό αίμα 26 β. Τροφοβλάστες 30 γ. Λεμφοκύτταρα 33 δ. Κοκκιοκύτταρα 37 ε. Εμβρυϊκά αρχέγονα προγεννητικά κύτταρα 38 στ. Ελεύθερο DNA 41 ζ. Εμπύρηνα εμβρυϊκά ερυθρά κύτταρα και τεχνικές δυσκολίες 47 η. Κυτταρομετρία ροής (FACS) 52 θ. In situ υβριδισμός με φλουοροσκεΐ νη (FISΗ ) 55 ι. Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης(pcr) 57 ια. Μαγνητικός διαχωρισμός(macs) 60 3. ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ 63 Ι. Σκοπός 63 ΙΙ. Μέθοδοι και Υλικά 63 ΙΙΙ.Αποτελέσματα 67 4. ΣΥΖΗΤΗΣΗ 77 5. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 89 6. ΠΕΡΙΛΗΨΗ 93 7. SUMMARY 95 8. ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 97
ΕΙΣΑΓΩΓΗ Ο προγεννητικός έλεγχος με σκοπό την πρώιμη ανίχνευση συγγενών ανωμαλιών του εμβρύου, αποτελεί αναπόσπαστο κομμάτι της σύγχρονης μαιευτικής. Σήμερα, η τάση των ζευγαριών να αποκτήσουν ολιγομελείς οικογένειες, όπως και το γεγονός ότι η τεκνοποίηση γίνεται σε μεγαλύτερες ηλικίες από ότι στο παρελθόν, αποτελούν παράγοντες που καθιστούν την ακριβή προγεννητική διάγνωση, αναγκαιότητα. Συγκεκριμένα, η προγεννητική διάγνωση επιτρέπει στα ζευγάρια να συνεχίσουν με μία εγκυμοσύνη 1 ή να τη διακόψουν εάν υπάρχουν αποδείξεις πως το έμβρυο πάσχει. Είναι γεγονός πως υπάρχει πάντοτε ο κίνδυνος διαγνωστικού λάθους, το οποίο μπορεί να οδηγήσει στην απώλεια μιας φυσιολογικής εγκυμοσύνης, ή από την άλλη στη συνέχιση μιας προβληματικής εγκυμοσύνης η οποία θα μπορούσε να είχε αποφευχθεί 2. Πριν από το 1960, δεν υπήρχε προγεννητική διάγνωση γενετικών διαταραχών και ανωμαλιών κατά τη γέννηση. Η μόνη διαθέσιμη μέθοδος προγεννητικού ελέγχου ήταν το οικογενειακό ιστορικό 3. Για πρώτη φορά περιγράφηκε η συσχέτιση μεταξύ της ηλικίας της μητέρας και του συνδρόμου DOWN από τον Penrose το 1933 4. Όμως η προγεννητική διάγνωση έγινε πρακτικά διαθέσιμη το 1960 5. Με τη ραγδαία ανάπτυξη ασφαλέστερων τεχνολογιών, τις νέες γονιδιακές ανακαλύψεις, τις βελτιώσεις στον κυτταρογενετικό έλεγχο και τoν έλεγχο του DNA για χιλιάδες γενετικές ανωμαλίες, τα νέα ζευγάρια έχουν πιο πολλές επιλογές αναπαραγωγής από ποτέ. Σήμερα η προγεννητική διάγνωση είναι εφικτή με τη 1
χρήση επεμβατικών μεθόδων όπως η αμνιοπαρακέντηση και η λήψη χοριακών λαχνών. Όμως οι μέθοδοι αυτοί ενέχουν κάποιο κίνδυνο για αυτόματη αποβολή. Αυτός είναι και ο λόγος που οι ενδείξεις για τη χρήση αυτών των μεθόδων περιορίζεται μόνο για ομάδες εγκύων υψηλού κινδύνου.οι ομάδες αυτές προκύπτουν μέσα από το γενικό πληθυσμό με το συνδυασμό πολύπλοκων μετρήσεων ορμονών στο αίμα της εγκύου, με την ηλικία των εγκύων αλλά και με υπερηχογραφικές μετρήσεις. Οι διαθέσιμες δοκιμασίες όμως δεν έχουν 100% ευαισθησία ούτε και 100% ειδικότητα, με αποτέλεσμα να υπάρχουν και ψευδώς θετικά αποτελέσματα 6. Το γεγονός αυτό καθιστά επιτακτική την εύρεση και χρήση μιας μη επεμβατικής μεθόδου μέγιστης ακρίβειας. Μία τέτοια επιλογή θα μπορούσε να είναι η ανίχνευση και απομόνωση των σπάνιων εμβρυϊκών κυττάρων που κυκλοφορούν στο μητρικό αίμα, για προγεννητική διάγνωση. Σε αντίθεση με την επικρατούσα έως τώρα άποψη πως ο πλακούντας αποτελεί ένα αδιαπέραστο εμπόδιο που εμποδίζει κάθε είδους επικοινωνία μεταξύ μητρικού και εμβρυϊκού αίματος, πολλαπλές μελέτες έδειξαν πως ολόκληρα εμβρυϊκά κύτταρα και εμβρυϊκά νουκλεϊκά οξέα κυκλοφορούν ελεύθερα στο μητρικό αίμα. Έχουν βρεθεί πέντε διαφορετικοί τύποι εμβρυϊκών κυττάρων στο μητρικό αίμα: τροφοβλάστες, λεμφοκύτταρα, κοκκιοκύτταρα, εμπύρηνα ερυθρά αιμοσφαίρια και αρχέγονα κύτταρα. Εάν η ανάλυση των χρωμοσωμάτων και των γονιδίων γίνει εφικτή χωρίς τη χρήση επεμβατικής μεθόδου, τότε ο προγεννητι- 2
κός έλεγχος θα μπορούσε να πραγματοποιείται σε όλες τις εγκυμοσύνες με ασφάλεια. Η ανάπτυξη μίας αξιόπιστης, εύκολα πραγματοποιήσιμης και προσιτής οικονομικά μη επεμβατικής μεθόδου απομόνωσης εμβρυϊκών κυττάρων από το αίμα της εγκύου θα καταστήσει δυνατή την προγεννητική διάγνωση σε όλο τον πληθυσμό. Παρά την εκτεταμένη έρευνα όμως, έως τώρα δεν έχει προκύψει μία ικανοποιητική και κλινικά αποδεκτή μέθοδος. Γι αυτό το σκοπό έχουν χρησιμοποιηθεί κατά καιρούς διάφοροι τύποι κυττάρων όπως τα εμπύρηνα ερυθρά, τα λευκοκύτταρα, οι τροφοβλάστες, τα αιμοποιητικά προγεννητικά κύτταρα και το ελεύθερο DNA. Παρόλο που έχει πλέον εμπεριστατωμένα αποδειχθεί η παρουσία καθενός από αυτά στο αίμα της εγκύου, υπάρχουν συγκεκριμένα μειονεκτήματα όσον αφορά τη χρήση των κυττάρων αυτών. Έτσι η εφαρμογή της χρήσης τους στην κλινική πράξη καθίσταται ιδιαίτερα δύσκολη. Εξαιτίας της σπανιότητας των εμβρυϊκών κυττάρων στην κυκλοφορία της μητέρας, η ποσοτική ανάλυση της κατανομής τους στην μητρική κυκλοφορία αποτελεί ακρογωνιαίο λίθο στην ανάπτυξη μεθόδων για μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση. Είναι επίσης απαραίτητο να καθορισθεί η καταλληλότερη χρονική στιγμή κατά τη διάρκεια της εγκυμοσύνης για τη λήψη του αίματος από την έγκυο ώστε να μεγιστοποιηθεί η πιθανότητα απομόνωσης των εμβρυϊκών κυττάρων. Θα πρέπει να απομονωθεί ικανός αριθμός ώστε να είναι εφικτή η διάγνωση. Η λήψη αίματος στο πρώτο τρίμηνο είναι σαφώς πιο επιθυμητή ώστε να γίνει η διάγνωση έγκαιρα, μειώνοντας την αγωνία του ζευγαριού αλλά και δίνοντας 3
τη δυνατότητα διακοπής της εγκυμοσύνης στο πρώτο τρίμηνο εάν υπάρχει πρόβλημα. Η έρευνα μας αποσκοπεί στην ακριβή αναγνώριση των εμβρυϊκών εμπύρηνων ερυθρών στην κυκλοφορία της μητέρας στο πρώτο τρίμηνο της εγκυμοσύνης. Προσδιορίζουμε όλα τα εμπόδια που δυσκόλεψαν τις προσπάθειες μας ώστε να ορίσουμε μία αξιόπιστη μέθοδο για μη επεμβατική απομόνωση εμβρυϊκών κυττάρων. Παρά τις δυσκολίες φαίνεται πως, τα πρωτόκολλα μας με το μαγνητικό διαχωρισμό και την κυτταρομετρία ροής και με τον πρωτότυπο συνδυασμό αντισωμάτων διαχωρισμού, συντελούν στην απομόνωση με επιτυχία των λίγων εμπύρηνων εμβρυϊκών ερυθρών από το αίμα των εγκύων στα περισσότερα δείγματα. 4
ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Ι. ΠΡΟΓΕΝNHΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΣΗΜΕΡΑ Ο έλεγχος για χρωμοσωματικές ανωμαλίες στην μαιευτική, προσανατολίζεται κυρίως στον έλεγχο για το σύνδρομο DOWN. Αποτελεί την πιο συχνή αιτία διανοητικής καθυστέρησης σε παιδιά σχολικής ηλικίας. Σήμερα η προγεννητική διάγνωση των χρωμοσωματικών ανωμαλιών είναι δυνατή μόνο με τη λήψη εμβρυϊκών κυττάρων με επεμβατική μέθοδο, όπως είναι η αμνιοπαρακέντηση ή η λήψη χοριακής λάχνης (πίνακας 1). Επειδή και οι δύο αυτές μέθοδοι παρουσιάζουν κίνδυνο αποβολής 7, χρησιμοποιούνται μόνο σε περιπτώσεις γυναικών υψηλού κινδύνου για χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Κατά τη διάρκεια των τελευταίων ετών έχουν αναπτυχθεί διάφορες δοκιμασίες-τεστ ώστε να καταδεικνύεται με όσο το δυνατό μεγαλύτερη ακρίβεια η ομάδα υψηλού κινδύνου. Η επιτυχία των δοκιμασιών ανίχνευσης δεν εξαρτάται μόνο από τον αριθμό των παθολογικών εμβρύων που ανακαλύπτονται. Οι ασθενείς θα πρέπει να συμμετέχουν στις δοκιμασίες ανίχνευσης μόνο μετά από τη χορήγηση από το γιατρό όλων εκείνων των πληροφοριών σχετικά με την ευαισθησία της δοκιμασίας και τα όρια της. Ακόμη οι γονείς θα πρέπει να συνειδητοποιήσουν πως μπορεί να χρειασθεί να πάρουν την απόφαση ακόμη και για διακοπή της εγκυμοσύνης. Ο στόχος των διαθέσιμων σήμερα δοκιμασιών είναι να βρεθούν με την μέγιστη δυνατή 5
ευαισθησία και ειδικότητα οι γυναίκες που βρίσκονται σε αυξημένο κίνδυνο να αποκτήσουν παιδί με κάποια διαταραχή και μόνο σε αυτές να πραγματοποιηθεί η επεμβατική διαγνωστική μέθοδος. Ο κίνδυνος για πολλές χρωμοσωμικές ανωμαλίες αυξάνει ανάλογα με την ηλικία της μητέρας. Επιπλέον, ο κίνδυνος για έμβρυο με χρωμοσωμική ανωμαλία μειώνεται όσο προχωρεί η ηλικία κύησης καθώς τα παθολογικά έμβρυα αποβάλλονται συχνότερα σε σχέση με τα φυσιολογικά. Για διάστημα πάνω από 20 χρόνια, στις ΗΠΑ και την Ευρώπη η ηλικία της μητέρας άνω των 35 ετών αποτελούσε το όριο για να θεωρηθεί μία κύηση υψηλού κινδύνου για χρωμοσωμική ανωμαλία. Στις ημέρες μας ο προγεννητικός έλεγχος γίνεται συνδυάζοντας σε μαθηματικές σχέσεις πληροφορίες, όπως η ηλικία της μητέρας, τα υπερηχογραφικά ευρήματα αλλά και τα επίπεδα κάποιων ορμονών στο μητρικό αίμα. Παρόλο που οι δοκιμασίες αυτές δεν είναι διαγνωστικές, μπορεί αρκετές φορές να αλλάξουν τις πιθανότητες για χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Είναι γεγονός πως ο κίνδυνος για κάθε γυναίκα ηλικίας πάνω από 36 ετών είναι μεγαλύτερος από μία γυναίκα 26 ετών. Είναι όμως γεγονός επίσης πως ο αριθμός κυήσεων για την ομάδα γυναικών ηλικίας 26 ετών είναι πολύ μεγαλύτερος, με αποτέλεσμα οι πιο πολλές εμβρυϊκές ανωμαλίες τελικά (περίπου 70%) να παρουσιάζονται στις κυήσεις χαμηλού κινδύνου. 6
Πίνακας 1 τεχνικές λήψης εμβρυϊκών κυττάρων Τεχνική Αμνιοπαρακέντηση Λήψη χοριακής λάχνης Λήψη εμβρυϊκού αίματος από παρακέντηση ομφαλικού αγγείου Προβλήματα 1. Επέμβαση στο δεύτερο τρίμηνο 2. Ποσοστό αποβολών 1% 3. Μικρή πιθανότητα διαγνωστικού λάθους λόγω παρουσίας μητρικών κυττάρων και χειμερισμού 1. Ποσοστό αποβολών 1έως 2% 2. Μωσαϊκισμοί 0,26% 1. Ποσοστό αποβολών 5% 2. Πρόωρος τοκετός 15% Η πλειοψηφία των χρωμοσωματικών ανωμαλιών που ανευρίσκεται στα προγεννητικά δείγματα είναι κυρίως τρισωμίες 13, 18, 21 και φυλετικές χρωμοσωμικές ανευπλοειδίες. Αυτές οι τρισωμίες αντιστοιχούν φαινοτυπικά στο σύνδρομο Patau, το σύνδρομο Edwards, το σύνδρομο Down αντίστοιχα και τα σύνδρομα Turner (XO) και Klinefelter s (XXY). Το ποσοστό εμφάνισης της τρισωμίας 21 είναι 1:800 γεννήσεις και αποτελεί τον κύριο λόγο για τον οποίο οι γυναίκες ζητούν προγεννητικό έλεγχο και διάγνωση. Η ανάλυση του καρυότυπου με καλλιέργεια δίνει αποτελέσματα σε χρονικό διάστημα μεγαλύτερο της μίας εβδομάδας. Γι αυτό το λόγο έχουν αναπτυχθεί πρόσφατα νέες μέθοδοι οι οποίες δίνουν αποτελέσματα πολύ πιο σύντομα. Η πιο ευρέως διαδεδομένη μέθοδος είναι η FISH (fluorescence in situ hybridization) 5,6. Χρησιμοποιούνται ομάδες από ειδικά χρωματισμένους με φλουοροσκεΐνη δείκτες για τα αντίστοιχα χρωμοσώματα. Ο αριθμός των σημάτων φλουο- 7
ροσκεΐνης σε κάθε πυρήνα αντιπροσωπεύει τον αριθμό των χρωμοσωμάτων. Συνήθως αναλύονται 50 έως 100 κύτταρα με τη FISH 7. Τελευταία, η ποσοτική ΡCR- φλουοροσκεΐνη (polymerase chain reaction) χρησιμοποιείται όλο και πιο συχνά για τη διάγνωση χρωμοσωμικών ανωμαλιών 8,9. Από το 1990, αναπτύχθηκε μία νέα τεχνική για προ εμφυτευτική γεννητική διάγνωση, η οποία έδωσε τη δυνατότητα αποκάλυψης τυχόν γενετικών ανωμαλιών πριν την εμφύτευση. Αυτή η τεχνική χρησιμοποιείται πλέον στην τεχνητή γονιμοποίηση. Συνδυάζει τα νεότερα δεδομένα στη μοριακή γενετική και στην υποβοηθούμενη αναπαραγωγή. Ένα με δύο βλαστομερίδια αφαιρούνται από το έμβρυο (στάδιο 6 με 8 κυττάρων) κατά την τρίτη ημέρα μετά την γονιμοποίηση. Στη συνέχεια το γενετικό υλικό αναλύεται ώστε να αναγνωριστούν οι ανευπλοειδίες, οι μονογονιδιακές βλάβες και οι φυλετικές ανωμαλίες. Πίνακας 2 Κίνδυνος για το σύνδρομο Down και ηλικία της μητέρας κατά την πιθανή ημερομηνία τοκετού(πητ) και κατά την αμνιοπαρακέντηση 2 Ηλικία Κίνδυνος κατά την αμνιοπαρακέντηση Κίνδυνος κατά την ΠΗΤ 35 1:285 1:348 36 1:174 1:276 37 1:146 1:216 38 1:122 1:168 39 1:91 1:130 40 1:80 1:99 41 1:67 1:75 42 1:45 1:57 43 1:30 1:43 44 1:23 1:32 45 1:21 1:24 46 1:11 1:18 8
α. Το οικογενειακό ιστορικό, η εθνικότητα και η προγεννητική διάγνωση Η εκτίμηση του οικογενειακού ιστορικού και των κληρονομικών παθήσεων παίζει πολύ σημαντικό ρόλο στον προγεννητικό έλεγχο. Εάν μία μητέρα έχει γεννήσει παιδί με κάποια ανωμαλία τότε υπάρχει αυξημένος κίνδυνος για μία μελλοντική κύηση. Ο ακριβής κίνδυνος εξαρτάται από το εάν η παθολογική κύηση κατέληξε σε αποβολή ή σε τοκετό ζωντανού εμβρύου, από το εάν το παιδί είχε μετάθεση ή μη διαχωρισμό χρωμοσωμάτων και από το εάν κάποιος από τους γονείς είναι φορέας κάποιας μετάθεσης. Σε περίπτωση που μία τρισωμία 21 φθάσει στο τέλος της κύησης και οι δύο γονείς έχουν φυσιολογικό καρυότυπο, ο κίνδυνος επανεμφάνισης είναι 0,34% πάνω από το σχετικό για την ηλικία κίνδυνο, και 0,75% υψηλότερος από το σχετικό με την ηλικία της μητέρας και την ηλικία κύησης για τρισωμία 21 τη στιγμή της δοκιμασίας. Για τη μετάθεση 14/21 ο κίνδυνος είναι περίπου 10% εάν η μητέρα είναι ο φορέας και περίπου 2% εάν ο πατέρας είναι ο φορέας 2. Επιπλέον, σημαντικό ρόλο στον προγεννητικό έλεγχο παίζει η εθνικότητα των ζευγαριών 10. Υπάρχουν γενετικές ασθένειες που απαντώνται συχνότερα σε συγκεκριμένες εθνικότητες π.χ. αιμοσφαιρινοπάθειες, θαλασσαιμίες, και κυστική ίνωση (πίνακας 3). Στον έλεγχο για θαλασσαιμία, ο οποίος γίνεται ευρύτατα στις Μεσογειακές χώρες, τη Μέση Ανατολή και τη Νοτιοανατολική Ασία 11 ο προσδιορισμός του μέσου όγκου των ερυθρών 9
(MCV) είναι ο κύριος παράγοντας για την απόφαση για ηλεκτροφόρηση. Πίνακας 3 Γενετικές ανωμαλίες και εθνικότητα Εθνικότητα Βλάβη Συχνότητα φορέα Συχνότητα πάθησης Ελληνική Α Θαλασσαιμία 1/25 1/2500 Β Θαλασσαιμία 1/30 1/3600 Ιταλική Β Θαλασσαιμία 1/30 1/3600 ΝΑ Ασία Α Θαλασσαιμία 1/20 1/2500 Ν Κίνα Α Θαλασσαιμία 1/20 1/2500 Η κυστική ίνωση είναι επίσης μία αυτοσωματική υπολειπόμενη νόσος. Ένας στους 22 στο Ηνωμένο Βασίλειο είναι ασυμπτωματικός φορέας και οι πιθανότητα δύο φορείς να αποκτήσουν μαζί παιδί είναι 1 στις 484 12. Σύμφωνα με το Αμερικανικό Κολλέγιο Μαιευτήρων και Γυναικολόγων προγεννητικός έλεγχος για κυστική ίνωση θα πρέπει να γίνεται σε: 1. περιπτώσεις με οικογενειακό ιστορικό κυστικής ίνωσης 2. συντρόφους ατόμων με κυστική ίνωση 3. ζευγάρια όπου ο ένας τουλάχιστον ανήκει στην καυκάσια φυλή 4. ζευγάρια συγκεκριμένων εθνικοτήτων ( πίνακας 4) Πίνακας 4 Συσχέτιση κυστικής ίνωσης και εθνικότητας Εθνική ομάδα Συχνότητα φορέα Συχνότητα Εβραίοι 1/29 1/3300 Καυκάσιοι 1/29 1/3300 Αφρικανοαμερικάνοι 1/65 1/17000 Ο προγεννητικός έλεγχος περιλαμβάνει τις 25 παθήσεις που προκαλούν μεταλλάξεις για κυστική ίνωση και 10
εμφανίζουν συχνότητα πάνω από 0,1% ανάμεσα στους Βορειοαμερικανούς που πάσχουν από κυστική ίνωση 13. β. Προγεννητικός έλεγχος πρώτου τριμήνου Σήμερα ο προγεννητικός έλεγχος και διάγνωση στο πρώτο τρίμηνο είναι πλέον εφικτή παγκοσμίως. Πρόσφατες μελέτες κατέδειξαν πως η ευαισθησία του προγεννητικού ελέγχου στο πρώτο τρίμηνο είναι εξίσου αποτελεσματική με αυτή του δευτέρου τριμήνου. Χρησιμοποιούνται κάποιοι συγκεκριμένοι δείκτες, η σχετιζόμενη με την εγκυμοσύνη πρωτεΐνη Α του πλάσματος PAPP-A (Pregnancy associated plasma protein A) και η β χοριακή γοναδοτροπίνη b-hcg. Βρέθηκε πως η συγκέντρωση της b-hcg στο μητρικό αίμα αυξάνεται κατά το πρώτο και δεύτερο τρίμηνο στις περιπτώσεις με τρισωμία 21 του εμβρύου (1.83 ΜοΜ), ενώ αντίθετα η ΡΑΡΡ-Α μειώνεται (0.38). Χρησιμοποιώντας την ΡΑΡΡ-Α σαν δείκτη ελέγχου σε συνδυασμό με την ηλικία της μητέρας είναι δυνατό να βρεθούν το 50% των περιπτώσεων τρισωμίας 21 στο γενικό πληθυσμό των εγκύων γυναικών 13,14. Χρησιμοποιώντας τη μητρική ηλικία σε συνδυασμό με την συγκέντρωση της β-hcg στο μητρικό αίμα ανευρίσκονται περίπου το 45% των περιπτώσεων συνδρόμου Down 13,14. Η χρήση και των τριών αυτών παραγόντων οδηγεί στην ανίχνευση του 65% των εμβρύων με σύνδρομο Down 13,14. Τα τελευταία χρόνια μία υπερηχογραφική μέτρηση έρχεται να προστεθεί στους δείκτες ανίχνευσης της τρισωμίας 21 15 αλλά και άλλων 11
τρισωμιών όπως 13,18, του συνδρόμου Turner, τριπλοειδιών και καρδιακών ανωμαλιών 16. Ο υπερηχογραφικός αυτός δείκτης είναι η αυχενική διαφάνεια, η οποία είναι για την ακρίβεια η μέτρηση της υποδόριας συλλογής υγρού στον αυχένα του εμβρύου. Η μέτρηση αυτή γίνεται μεταξύ της 11ης εβδομάδας κύησης και 13ης εβδομάδας + 6 ημέρες, και ένα συγκεκριμένο ανώτερο όριο μέτρησης χρησιμοποιείται ανάλογα με την ηλικία κύησης. Αυτό συμβαίνει διότι η αυχενική διαφάνεια φυσιολογικά αυξάνει όσο προχωρεί η κύηση 17. Το ελάχιστο κεφαλοουραίο μήκος του νεογνού (CRL) θα πρέπει να είναι 45mm και το μέγιστο 84mm, το έμβρυο θα πρέπει να είναι σε ουδέτερη θέση σε οβελιαία υπερηχογραφική τομή και η μεγέθυνση θα πρέπει να είναι τέτοια ώστε το έμβρυο να καταλαμβάνει τα τρία τέταρτα της εικόνας και τέλος θα πρέπει να ξεχωρίζουν στην εικόνα το δέρμα του εμβρύου από το άμνιο. H αυχενική διαφάνεια αυξάνει ανάλογα με το κεφαλοουραίο μήκος, και για το λόγο αυτό θα πρέπει πάντα να υπολογίζεται με ακρίβεια η ηλικία κύησης. Μελέτες έδειξαν πως στις 10 έως 14 εβδομάδες κύησης ο αριθμός των εμβρύων με τρισωμίες 21,18,13 με μετρήσεις αυχενικής διαφάνειας 3mm,4mm,5mm και >6mm ήταν 3, 18,28 και 36 φορές μεγαλύτερος σε σύγκριση με τον αντίστοιχο για την ηλικία της μητέρας. Μία μέτρηση αυχενικής διαφάνειας μεγαλύτερη από 6mm οδηγεί στην ανεύρεση του 40% των περιπτώσεων συνδρόμου Down στις ομάδες υψηλού κινδύνου. Σε πολυκεντρική μελέτη του Fetal Medicine Foundation που είχε σαν στόχο τον έλεγχο για τρισωμία 21 χρησιμοποιώντας την μητρική ηλικία και 12
την αυχενική διαφάνεια στις 10 έως 14 εβδομάδες κύησης, βρέθηκαν 325 περιπτώσεις με διάφορες ανωμαλίες εκτός από τρισωμία 21 και το 70,5% αυτών είχαν αυχενική διαφάνεια πάνω από την 95 η εκατοστιαία θέση (πίνακας 5). Οι εμβρυϊκές ανωμαλίες πέρα από το σύνδρομο Down που σχετίζονται με αυξημένη αυχενική διαφάνεια φαίνονται στον πίνακα 6. Καρδιακές ανωμαλίες υπάρχουν στο 1% των ζωντανών νεογνών. Μελέτες δείχνουν πως το 50% των νεογνών με καρδιακές ανωμαλίες ανήκουν στο υποσύνολο των εμβρύων με αυχενική διαφάνεια πάνω από την 95 η εκατοστιαία θέση. Ο συνδυασμός της ηλικίας της μητέρας και της αυχενικής διαφάνειας οδηγεί στην ανεύρεση του 75% των περιπτώσεων με τρισωμία 21, με ψευδώς θετικό αποτέλεσμα στο 5% των περιπτώσεων 18,19,20,21 (πίνακας 7). Πίνακας 5 Αυχενική διαφάνεια πάνω από τη 95 η εκατοστιαία θέση ( εκατοστιαία θέση και ανωμαλίες εκτός από το σύνδρομο Down) Τρισωμία 18 74,8% Τρισωμία 13 71,7% Σύνδρομο Turner 87% Τριπλοειδίες 59,4% Ελλείψεις, μερικές τρισωμίες, μεταθέσεις, 55,4% ανωμαλίες φυλετικών χρωμοσωμάτων Σύνολο 70,5% Πίνακας 6 Παθήσεις που σχετίζονται με αυξημένη αυχενική διαφάνεια Καρδιακές ανωμαλίες Διαφραγματοκήλη Εξόμφαλος Αχονδρογένεση τύπου ΙΙ Αχονδροπλασία Ασφυκτική θωρακική δυστροφία 13
Σίγουρα η προγεννητική διάγνωση του πρώτου τριμήνου έχει κάποια αναμφισβήτητα πλεονεκτήματα σε σχέση με αυτή του δευτέρου τριμήνου, καθώς παρέχει γρηγορότερα διάγνωση και καθησυχάζει συντομότερα την έγκυο 22. Θα πρέπει όμως να τονιστεί πως δεν είναι δυνατό τόσο νωρίς να γίνει προγεννητικός έλεγχος για δισχιδή ράχη. Εικόνα 1: Φυσιολογική αυχενική διαφάνεια 1.3mm Εικόνα 2: Ύποπτη αυχενική διαφάνεια 2.9mm 14
Εικόνα 3: Παθολογική αυχενική διαφάνεια 6 mm γ. Προγεννητικός έλεγχος δευτέρου τριμήνου O υπερηχογραφικός έλεγχος στο δεύτερο τρίμηνο της εγκυμοσύνης είναι απαραίτητο εργαλείο για τον προγεννητικό έλεγχο. Το υπερηχογράφημα του δευτέρου επιπέδου θα πρέπει να πραγματοποιείται μεταξύ των 20 με 23 εβδομάδων κύησης, ώστε να επιτευχθεί η μέγιστη δυνατή ευαισθησία. Η ευαισθησία για διάγνωση της ανεγκεφαλίας είναι 100% και για δισχιδή ράχη 60% με 96%. Πολύ συχνά είναι δυνατό να ανακαλυφθούν με αρκετά καλή ευαισθησία διάφορες ανωμαλίες είτε μεμονωμένες, είτε σαν μέρος κάποιας χρωμοσωμικής ανωμαλίας (π.χ. συγγενείς καρδιακές ανωμαλίες, ομφαλοκήλη, διαφραγματοκήλη). Πρόσφατα χρησιμοποιούνται μία σειρά από υπερηχογραφικές παράμετροι, οι λεγόμενοι δείκτες (markers) για χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Αυτές οι παράμετροι μεμονωμένες δεν είναι διαγνωστικές αλλά βρέθηκε πως απαντώνται συχνότερα σε έμβρυα με χρωμο- 15
σωμικές ανωμαλίες 23,24,25. Αυτοί οι δείκτες για το σύνδρομο Down είναι: το βραχύ μηριαίο, το υπερηχογενές έντερο, η ενδοκαρδιακή υπερηχογενή εστία, η διατεταμένη νεφρική πύελος και η αυξημένη αυχενική διαφάνεια. Μελέτες έδειξαν πως το υπερηχογράφημα δευτέρου επιπέδου ανακαλύπτει το 50% 26 των ανωμαλιών και μόνο το 25% των συνδρόμων Down. Το τελευταίο αυξάνει στο 50% εάν στον υπερηχογραφικό έλεγχο προστεθεί και ο έλεγχος των ειδικών παραμέτρων που προαναφέρθηκαν 23. Φυσικά υπάρχουν περιορισμοί στην υπερηχογραφική εξέταση και σίγουρα η καθημερινή κλινική πράξη αποδεικνύει ότι το υπερηχογράφημα δεν μπορεί να δώσει 100% προγεννητική διάγνωση. Έχουν χρησιμοποιηθεί διάφοροι δείκτες από τον ορό της μητέρας για προγεννητικό έλεγχο για διάφορες χρωμοσωμικές ανωμαλίες και κυρίως για την τρισωμία 21 και τη δισχιδή ράχη. Για πρώτη φορά το 1972 παρατηρήθηκε πως η άλφα εμβρυϊκή πρωτεΐνη (AFP) του μητρικού αίματος βρίσκεται αυξημένη σε περιπτώσεις εμβρύων με δισχιδή ράχη. Από τη στιγμή που θα αποκλεισθούν άλλοι παράγοντες υπεύθυνοι για μια τέτοια αύξηση, όπως η ηλικία κύησης, η πολύδυμη κύηση, ο εμβρυϊκός θάνατος, θα πρέπει να παρέχεται σε κάθε γυναίκα με αυξημένη AFP υπερηχογραφικός έλεγχος για δισχιδή ράχη. Χαμηλή τιμή της AFP σχετίζεται με αυξημένο κίνδυνο για σύνδρομο Down. Η AFP παράγεται από το λεκιθικό ασκό και το ήπαρ του εμβρύου. Χρησιμοποιώντας την AFP του μητρικού αίματος, σαν δείκτη για τη διάγνωση της τρισωμίας 21, επιτυγχάνεται διάγνωση στο 40% των περιπτώσεων του συνδρόμου. 16
Άλλοι δείκτες όπως η b-hcg, μη συζευγμένη οιστριόλη (ue3) και τελευταία η ινχιμπίνη Α (ΙΝΗ-Α) χρησιμοποιούνται επίσης σαν δείκτες προγεννητικής διάγνωσης. Το τριπλό τεστ το οποίο περιλαμβάνει το συνδυασμό της ηλικίας της μητέρας με την b-hcg, ue3 και της MSAFP έχει ποσοστό διάγνωσης 65% με ποσοστό ψευδών θετικών αποτελεσμάτων 5%. Το τετραπλό τεστ περιέχει επιπλέον την ινχιμπίνη Α και έχει ποσοστό ανίχνευσης 75% 27. (πίνακας 7). Τελευταία χρησιμοποιείται ο συνδυασμός των μετρήσεων της ΡΑΡΡ-A και αυχενικής διαφάνειας του πρώτου τριμήνου με τις μετρήσεις της b-hcg, MSAFP, ue3, INH-A του δευτέρου τριμήνου. Το ποσοστό ανίχνευσης είναι 94% και το ποσοστό των ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων είναι 5% 13. Οι ορμονικοί δείκτες υπολογίζονται μεταξύ της 15 ης και 19 ης εβδομάδας και τα αποτελέσματα εκφράζονται σε πολλαπλάσια της μέσης τιμής (ΜοΜ) για τις φυσιολογικές εγκυμοσύνες στην αντίστοιχη ηλικία κύησης. Αυτό γίνεται ώστε ακόμη και τα μικρά εργαστήρια με μικρή εμπειρία να μπορούν να δώσουν σταθερή μέση τιμή σχετικά εύκολα. Στις εγκυμοσύνες με δισχιδή ράχη έχουν κατά προσέγγιση τιμή της ΜSAFP 4 ΜοΜ. Θα πρέπει να προσφέρεται υπερηχογράφημα δευτέρου επιπέδου ή αμνιοπαρακέντηση στις περιπτώσεις με τιμές πάνω από συγκεκριμένο όριο, περίπου 2.0 ή 2.5 ΜοΜ (πίνακας 8). Έχει σχεδιασθεί ένας ειδικός αλγόριθμος ώστε να υπολογίζεται ο σχετικός με την ηλικία της γυναίκας κίνδυνος σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα των ορμονικών μετρήσεων του αίματός της καταλήγοντας έτσι στην τελική τιμή της πιθανότητας 17
χρωμοσωμικής ανωμαλίας για την έγκυο 28. Η τρισωμία 18 σχετίζεται με χαμηλότερα επίπεδα AFP, hcg, και ινχιμπίνης Α 29,30. Όταν ο πιθανός κίνδυνος για τρισωμία 21 υπερβαίνει το 1/250 τότε συνιστάται η αμνιοπαρακέντηση (πίνακας 9). Απαραίτητη προϋπόθεση για ακριβή προσδιορισμό της πιθανότητας για τρισωμία είναι ο υπολογισμός της ηλικίας κυήσεως με τον υπερηγραφικό έλεγχο. Υπάρχουν και κάποιοι άλλοι παράγοντες εκτός από την κύηση που μπορεί να επηρεάζουν τα επίπεδα των ορμονικών δεικτών όπως το κάπνισμα, το βάρος, η εθνικότητα, ο διαβήτης και η πολύδυμη κύηση. Η ένδειξη για τη χρήση επεμβατικής μεθόδου προγεννητικής διάγνωσης είναι πως η πιθανότητα κινδύνου για χρωμοσωμική ανωμαλία είναι τουλάχιστον ίση προς την πιθανότητα αποβολής λόγω της επεμβατικής μεθόδου. Πίνακας 7 Ευαισθησία συνδυασμών δεικτών στο δεύτερο τρίμηνο Συνδυασμός δεικτών Ευαισθησία (%) Ηλικία 30 Ηλικία+AFP 39 Ηλικία+AFP+hCG 59 Ηλικία+AFP+hCG+uE3 69 Ηλικία+AFP+hCG+inhibin A 68 Ηλικία+AFP+hCG+uE3+inhibin A 76 Πίνακας 8 Μέσος όρος της μέσης τιμής για τους δείκτες του δευτέρου τριμήνου σε εγκυμοσύνες με σύνδρομο Down Δείκτης ΜοΜ AFP 0,75 hcg 2,06 Ελεύθερη hcg 2,20 ue3 0,72 Ινχιμπίνη Α 1,92 18
Πίνακας 9 Συνδυασμοί δεικτών πρώτου τριμήνου Συνδυασμός δεικτών Ευαισθησία (%) Ηλικία+ free hcg 38 Ηλικία+PAPP-A 52 Ηλικία+PAPP-A+free hcg 60 Ηλικία+NT* 77 Ηλικία+PAPP-A+free hcg+nt 89 *NT=αυχενική διαφάνεια Εικόνα 4: Πρόσωπο και χέρι Εικόνα 5: Μέτρηση αμφιβρεγματικής διαμέτρου 19
Εικόνα 6: Σύνδρομο Edwards- κύστη χοριοειδούς πλέγματος Εικόνα 7: Τρισδιάστατη εικόνα προσώπου εμβρύου στις 17 εβδομάδες Τη νεότερη μέθοδο υπερηχογραφικού ελέγχου αποτελεί σήμερα η τρισδιάστατη υπερηχογραφία. Ιδιαίτερα την τελευταία δεκαετία η χρήση της έχει πλέον γίνει επιτακτική στην ιατρική αλλά και στον προγεννητικό έλεγχο. Η αρχή χρήσης της είναι ίδια με αυτή της δυσδιάστατης υπερηχογραφίας. Τα πλεονεκτήματα της οφείλονται κατά κύριο λόγο στο ότι δίνει τη δυνατότητα εκτίμησης ενός οργάνου ή σημείου του σώματος σε 20
διαφορετικά επίπεδα. Έτσι η τρισδιάστατη υπερηχογραφία φαίνεται πως μπορεί να βοηθήσει στην επιβεβαίωση μιας βλάβης όταν υπάρχει η υποψία με τη δυσδιάστατη υπερηχογραφία. Είναι ιδιαίτερα χρήσιμη στην εκτίμηση σκελετικών δυσπλασιών, βλαβών στη δομή του προσώπου, της σπονδυλικής στήλης και των χεριών. Επιπλέον βελτιώνει την προγνωστική ικανότητα υπολογισμού του βάρους του εμβρύου και κατά συνέπεια την παρακολούθηση της ενδομήτριας υπολειπόμενης ανάπτυξης. Τέλος η διάγνωση του φύλλου μπορεί να γίνει αρκετά νωρίτερα γεγονός χρήσιμο σε περιπτώσεις φυλετικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών όπως η αιμοφιλία 6. δ. Επεμβατικές μέθοδοι προγεννητικής διάγνωσης (αμνιοπαρακέντηση και λήψη χοριακής λάχνης) Η αμνιοπαρακέντηση άρχισε να χρησιμοποιείται για προγεννητική διάγνωση το 1966 από τους Steele και Breg. Αρχικά χρησιμοποιήθηκε στην κλινική πράξη για την διερεύνηση της Rhesus ευαισθητοποίησης και αργότερα για τον προσδιορισμό της εμβρυϊκής πνευμονικής ωριμότητας με τον προσδιορισμό της σχέσης λεκιθίνης - σφιγγομυελίνης. Πραγματοποιείται μεταξύ της 15 ης και 20 ης εβδομάδας κύησης. Η χρήση της αμνιοπαρακέντησης πριν από τις 14 εβδομάδες οδήγησε σε υψηλά ποσοστά αποβολών (7,6%), αύξηση της ραιβοποδίας (1,3% έναντι 0,1%) και αύξηση της ρήξης εμβρυϊκών υμένων (3,5% έναντι 1,7%) 31,32. Ο στόχος είναι να ληφθούν εμβρυϊκά κύτταρα προερχόμενα από το δέρμα, τις βλεννώδεις 21
μεμβράνες, το άμνιο και τον ομφάλιο λώρο για καρυότυπο ή ανάλυση DNA. Πραγματοποιείται κάτω από συνεχή υπερηχογραφικό έλεγχο προωθώντας μία βελόνη ραχιαίας αναισθησίας 20-22 gause διαμέσου των κοιλιακών τοιχωμάτων και αναρροφώντας δείγμα αμνιακού υγρού. Ο ιατρός πρέπει να προσπαθήσει να αποφύγει τον πλακούντα και θα πρέπει να βρει μία όσο το δυνατό μεγαλύτερη λίμνη αμνιακού υγρού ελεύθερη από το σώμα του εμβρύου. Η καρδιακή λειτουργία θα πρέπει πάντα να ελέγχεται πριν και μετά την επέμβαση. Συνήθως 20ml αμνιακού υγρού είναι αρκετά. Εάν η ασθενής είναι Rh αρνητική τότε θα πρέπει να της χορηγηθούν 250 μονάδες αντι-d ανοσοσφαιρίνης. Ο μεγαλύτερος κίνδυνος από την αμνιοπαρακέντηση είναι η αποβολή που συμβαίνει σε ποσοστό 0,5% με 1% 33,34. Άλλες πιθανές παρενέργειες είναι η λοίμωξη της μητέρας, τραυματισμός του εμβρύου και πρόωρος τοκετός. Η αμνιοπαρακέντηση παραμένει σήμερα η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη επέμβαση προγεννητικού ελέγχου. Η λήψη χοριακής λάχνης (CVS) περιγράφηκε για πρώτη φορά στην Κίνα το 1975 για τον προσδιορισμό του φύλου. Πραγματοποιείται μεταξύ της 9 ης και 14 ης εβδομάδας κύησης. Βελτιώθηκε σαν τεχνική από τον Brambati στην Ιταλία το 1991 κάτω από συνεχή υπερηχογραφικό έλεγχο λαμβάνοντας χοριακή λάχνη είτε διακοιλιακά είτε διακολπικά. Η διακοιλιακή οδός έχει γίνει τελευταία πιο αποδεκτή. Παρόλο που είναι εφικτή η λήψη χοριακής λάχνης πριν από τις 9 εβδομάδες κύησης, δεν 22
πραγματοποιείται λόγω αυξημένων ανωμαλιών των άκρων των εμβρύων 35. Ο πλακούντας ανευρίσκεται εύκολα σε αυτή την ηλικία κύησης και το πάχος του είναι ικανοποιητικό για τη λήψη χοριακής λάχνης με ασφάλεια. Η διακοιλιακή οδός είναι τελευταία η μέθοδος εκλογής παρόλο που η διακολπική είναι απαραίτητη σε πλακούντες με χαμηλή πρόσφυση. Στη διακοιλιακή τεχνική χρησιμοποιείται τοπική αναισθησία και στη συνέχεια γίνεται η αναρρόφηση χοριακής λάχνης με βελόνη ραχιαίας αναισθησίας 20 gause κάτω από συνεχή υπερηχογραφικό έλεγχο. Η βελόνη αναρρόφησης μετακινείται πάνω κάτω περίπου 10 φορές. Αντι-D σφαιρίνη χορηγείται σε Rh αρνητικές γυναίκες. Σε σύγκριση με την αμνιοπαρακέντηση το πλεονέκτημα της CVS είναι πως πραγματοποιείται αρκετά νωρίς στην εγκυμοσύνη μειώνοντας έτσι το άγχος της αναμονής και επιτρέποντας τη διακοπή της κύησης στο πρώτο τρίμηνο εάν είναι απαραίτητη 36. Ο κίνδυνος αποβολής είναι υψηλότερος από την αμνιοπαρακέντηση, περίπου 1% με 2% 33,37,38. Άλλο μειονέκτημα είναι ο μωσαϊκισμός, περίπου 2% 34,39,40. Aντενδείξεις για διακοιλιακή CVS είναι οι συμφύσεις του εντέρου στο πρόσθιο κοιλιακό τοίχωμα και τα ινομυώματα 38, 41, 42. Η κολπίτιδα και η τραχηλίτιδα αποτελούν αντενδείξεις για διακολπική λήψη χοριακής λάχνης. Όπως φαίνεται λοιπόν αφενός μεν οι διαθέσιμοι ορμονικοί δείκτες για προγεννητικό έλεγχο δεν έχουν 100% ευαισθησία και μάλιστα έχουν 5% ψευδώς θετικά αποτελέσματα, αφετέρου οι επεμβατικές διαγνωστικές 23
μέθοδοι έχουν κάποιο κίνδυνο αποβολής 43,44,45,46. Αυτά τα γεγονότα καθιστούν την ανάγκη για την αναζήτηση μη επεμβατικών διαγνωστικών μεθόδων αναγκαία. Μία τέτοια δυνατότητα μη επεμβατικής προγεννητικής διάγνωσης θα μπορούσε να επιτευχθεί με την απομόνωση και χρησιμοποίηση των σπάνιων εμβρυϊκών κυττάρων τα οποία υπάρχουν στο μητρικό αίμα. Εάν γίνει εφικτό αυτό τότε θα είναι δυνατή η ασφαλής προγεννητική διάγνωση μόνο με τη λήψη αίματος από την έγκυο γυναίκα 47. ΙΙ. ΙΣΤΟΡΙΚΗ ΑΝΑΔΡΟΜΗ ΑΝΕΥΡΕΣΗΣ ΕΜΒΡΥΪΚΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΤΟ ΜΗΤΡΙΚΟ ΑΙΜΑ Το 1893 ο Schmorl αναγνώρισε τροφοβλάστες στους πνεύμονες γυναικών που είχαν πεθάνει λόγω εκλαμψίας, αλλά όχι και σε γυναίκες που πέθαναν από άλλα αίτια. Αποδείξεις για την ύπαρξη εμβρυϊκών κυττάρων στην μητρική κυκλοφορία παρουσιάσθηκαν για πρώτη φορά από τον Douglas και συνεργάτες το 1959 48. O Kleihauer βρήκε εμβρυϊκά κύτταρα στην κυκλοφορία της μητέρας, χρησιμοποιώντας χρώση για εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη 49. To 1964 ο Clayton και συνεργάτες χρησιμοποιώντας χρώση για εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη, ανακοίνωσαν την παρουσία ανώριμων ερυθρών αιμοσφαιρίων σε αυξανόμενο αριθμό ανάλογα με την πρόοδο της εγκυμοσύνης. Το 1969 ο Walknowska και συνεργάτες βρήκαν XY μεταφάσεις στο μητρικό αίμα εγκύων με άρρενα έμβρυα και θετικά για Y χρωματίνη κύτταρα στο μητρικό αίμα εγκύων με άρρενα 24
έμβρυα 50,51,52. To 1970 με την ανακάλυψη των τεχνικών διαχωρισμού κυττάρων, έγινε δυνατός ο διαχωρισμός και χαρακτηρισμός των εμβρυϊκών κυττάρων. Η πρώτη ερευνητική ομάδα που χρησιμοποίησε PCR (αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) και απέδειξε ότι τα εμβρυϊκά κύτταρα υπάρχουν πραγματικά στο μητρικό αίμα, ήταν ο Lo και συνεργάτες 53. Το 1990, η Bianchi ήταν η πρώτη που πραγματοποίησε εμπλουτισμό ειδικά για εμβρυϊκά κύτταρα και ανάλυση με PCR 54. Όλες οι έρευνες έως τώρα συμφωνούν πως τα εμβρυϊκά κύτταρα στο μητρικό αίμα είναι σπάνια, συγκεκριμένα υπάρχουν 1 με 6 κύτταρα ανά ml μητρικού αίματος 55. Αυτό το γεγονός αποτελεί πραγματικά πρόκληση για την εύρεση αυτών των κυττάρων. Έχουν αναφερθεί αρκετά πρωτόκολλα έως τώρα για τον εμπλουτισμό και το διαχωρισμό αυτών των κυττάρων. Σε γενικές γραμμές για να επιτευχθεί αυτός ο εμπλουτισμός των εμβρυϊκών κυττάρων στο μητρικό αίμα χρησιμοποιήθηκε φυγοκέντρηση, χωρίς όμως να επιτευχθεί καθαρό δείγμα λόγω της παρουσίας μητρικών κυττάρων. Έχουν χρησιμοποιηθεί κατά καιρούς ειδικοί δείκτες για διαχωρισμό των κυττάρων είτε με κυτταρομετρία ροής (FACS), ή με μαγνητικό διαχωρισμό (MACS) για απομόνωση αυτών των κυττάρων και στη συνέχεια προσθήκη άλλων ειδικών δεικτών ώστε να επιβεβαιωθεί η ταυτότητα αυτών των κυττάρων. Τελευταία άρχισε η χρησιμοποίηση της PCR, FISH και της κυτταρογενετικής ανάλυσης. 25
α. Ο αριθμός και το είδος των εμβρυϊκών κυττάρων στο μητρικό αίμα Σε αντίθεση με τη μέχρι πρότινος αντίληψη ότι ο πλακούντας είναι ένα αδιαπέραστο φράγμα που εμποδίζει κάθε είδους επικοινωνία μεταξύ μητρικού και εμβρυϊκού αίματος, διάφορες μελέτες έχουν αποδείξει ότι εμβρυϊκά κύτταρα και εμβρυϊκό γενετικό υλικό κυκλοφορούν στο μητρικό αίμα. Ερευνητές κατόρθωσαν να επιβεβαιώσουν την παρουσία του Υ χρωμοσώματος στο μητρικό αίμα από την έκτη εβδομάδα κύησης 56,57. Τα δεδομένα ήταν ακριβή όσον αφορά την ηλικία της κύησης αφού οι κυήσεις που χρησιμοποιήθηκαν στην έρευνα ήταν κυήσεις που προέκυψαν με τεχνητή γονιμοποίηση. Έως σήμερα έχουν περιγραφεί / απομονωθεί πέντε τύποι εμβρυϊκών κυττάρων στο μητρικό αίμα: οι τροφοβλάστες, τα λεμφοκύτταρα, τα κοκκιοκύτταρα, τα εμπύρηνα ερυθρά και τα προγεννητικά κύτταρα 58,59. Αυτοί οι τύποι κυττάρων θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν υπό κατάλληλες προϋποθέσεις για προγεννητικό έλεγχο. Πρόσφατα ανακοινώθηκε και η παρουσία ελεύθερου εμβρυϊκού DNA σε ανιχνεύσιμες ποσότητες κάτι το οποίο ίσως θα μπορούσε να δώσει λύσεις στην μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση Είναι πολύ σημαντικό να κατανοήσουμε τον ακριβή αριθμό των εμβρυϊκών κυττάρων στο μητρικό αίμα καθώς είναι πολύ σπάνια. Όλες οι μελέτες καταλήγουν στο συμπέρασμα πως ο αριθμός είναι πολύ μικρός ανά ml μητρικού αίματος 58. Η συχνότητα των εμβρυϊκών εμπύ- 26
ρηνων ερυθρών στο μητρικό αίμα υπολογίζεται να είναι 1 με 10 κύτταρα ανά ml μητρικού αίματος 59,60. Άρα περίπου 20 εμπύρηνα ερυθρά κύτταρα υπολογίζεται να ανευρίσκονται σε 20 ml μητρικού αίματος. Αυτό το γεγονός καθιστά επιτακτική την ανάγκη να καθορισθεί με όσο το δυνατό μεγαλύτερη ακρίβεια 1) ο αριθμός των κυττάρων αυτών, και 2) η ιδανικότερη στιγμή για αιμοληψία. Σαφέστατα η λήψη αίματος στις αρχικές εβδομάδες κύησης είναι πιο επιθυμητή ώστε να επιτευχθεί ταχύτερα η προγεννητική διάγνωση, αλλά είναι επίσης σημαντικό να ανευρεθεί ικανοποιητικός αριθμός κυττάρων. Δεδομένα από μελέτες συμφωνούν πως ο αριθμός των εμβρυϊκών κυττάρων στο μητρικό αίμα αυξάνει όσο προχωρεί η εγκυμοσύνη 55,61. Ένα ακόμη σημαντικό πρόβλημα που αντιμετωπίζουν οι ερευνητές είναι ο καθορισμός ειδικών δεικτών (markers) που θα επιτρέψουν τον διαχωρισμό και απομόνωση των εμβρυϊκών κυττάρων με όσο το δυνατό μεγαλύτερη ακρίβεια. Ένα τρίτο πρόβλημα είναι το γεγονός πως κάποια εμβρυϊκά κύτταρα μπορεί να παραμείνουν στην μητρική κυκλοφορία για αρκετά χρόνια μετά τον τοκετό, έως και 27 χρόνια, κάτι που για πρώτη φορά περιγράφηκε από την Bianchi και συνεργάτες 60. Κάποιες μελέτες δείχνουν ότι ο αριθμός των κυττάρων και του εμβρυϊκού DNA στο μητρικό αίμα δεν μεταβάλλεται μόνο με την εβδομάδα κύησης αλλά είναι διαφορετικός σε διαφορετικές εγκυμοσύνες 61,62. Είναι είδη γνωστό πως ο αριθμός τους αυξάνει σε: 27
Εμβρυϊκές ανευπλοειδίες Προεκλαμψία Πρόωρο τοκετό Στιφρό πλακούντα Υπερέμεση κύησης Υδράμνιο Πιθανά αίτια του αυξημένου αριθμού εμβρυϊκών κυττάρων σε αυτές τις καταστάσεις μπορεί να είναι βλάβες που πλακουντιακού φραγμού, λόγω αγγειακών διαταραχών ή λόγω ανάπτυξης οιδήματος στις χοριακές λάχνες. Ακόμη και η αμφίχειρη εξέταση, πριν από την αιμοληψία μπορεί να προκαλέσει είσοδο εμβρυϊκών κυττάρων στο μητρικό αίμα 63. Σε μία μελέτη ο Al-Mufti και συνεργάτες χρησιμοποίησαν αίμα από γυναίκες που πρόκειται να γίνει προγεννητικός έλεγχος με CVS. Πραγματοποίησε τριπλή φυγοκέντρηση και μεθόδους ΜACS και FISH, χρησιμοποιώντας το μονοκλωνικό αντίσωμα CD71, ώστε να υπολογίσει τον ακριβή αριθμό των εμπύρηνων ερυθρών με πυρήνες που είχαν τρία σήματα. Συγκρίνοντας τα ευρήματά του βρήκε πως πυρήνες με τρία σήματα υπήρχαν στο 5% των εμπλουτισμένων κυττάρων του 60% των περιπτώσεων Down και σε καμία από τις φυσιολογικές εγκυμοσύνες. Τα ευρήματα αυτά ήταν ανάλογα με τα αποτελέσματα του προγεννητικού ορμονικού ελέγχου του δευτέρου τριμήνου. Τοποθετώντας σαν όριο το 3% των πυρήνων με τρία σήματα, η ευαισθησία για Down ήταν 97% και το ψευδώς θετικό ποσοστό ήταν 28
13%. Τα αρνητικά σήματα για την εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη ήταν 3% 42. (πίνακας 10). Πίνακας 10 42 Δείκτης : για το χρωμόσωμα 21 το χρωμόσωμα 18 το χρωμόσωμα 13 Τρισωμία 21 Φυσιολογικό Τρισωμία Φυσιολογικό Τρισωμία Φυσιολογικό 18 13 Όριο N=36 N=142 N=24 N=1342 N=10 N=142 3% 35 (97%) 19 (13%) 23 (96%) 23 (16%) 10 (100%) 32 (22, 5%) 4% 30 (83%) 4 (2, 8%) 20 (83%) 9 (6%) 8 (80%) 7 (5%) 5% 22 (61%) 0 13 (54%) 0 5 (50%) 0 Αυτή η συσχέτιση μεταξύ χρωμοσωμικών ανωμαλιών και αυξημένων αριθμών εμβρυϊκών κυττάρων και DNA στο μητρικό αίμα θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σαν μία ακόμη δοκιμασία προγεννητικού ελέγχου (screening). Φυσικά οι τεχνικές που πρέπει να χρησιμοποιηθούν για το σκοπό αυτό είναι πολυπλοκότερες από αυτές που χρησιμοποιούμε σήμερα για τον ορμονικό προγεννητικό έλεγχο. Ο Νικολαΐδης προτείνει πως ίσως θα μπορούσε να εφαρμοστεί η μέθοδος FISH στο μητρικό αίμα που έχει υποστεί επεξεργασία για ανεύρεση εμβρυϊκών κυττάρων, στις γυναίκες υψηλού κινδύνου για τρισωμίες, αφού πρώτα οι γυναίκες αυτές επιλεγούν από τον γενικό πληθυσμό με τη σημερινή δοκιμασία προγεννητικού ελέγχου (συνδυασμός μητρικής ηλικίας, αυχενικής διαφάνειας, b-hcg και ΡΑΡΡ-Α) 42,47. Ακολουθώντας αυτή την τεχνική θα μπορούσε να μειωθεί στο 1% από το γενικό πληθυσμό το ποσοστό που έχει ένδειξη για CVS (γυναίκες με 3% θετικών σημάτων για τρισωμία και γυναίκες χωρίς θετικά 29
σήματα για εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη) έναντι του 5% που ισχύει με τις σημερινές δοκιμασίες. β. Τροφοβλάστες Η τροφοβλάστη καλύπτει εξωτερικά τις λάχνες και έρχεται σε άμεση επαφή με το μητρικό αίμα της αιμολίμνης, παίζοντας σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του πλακούντα. Οι συγκυτιοτροφοβλάστες αποτελούν την εξωτερική στιβάδα της τροφοβλάστης, είναι πολυπυρηνικά κύτταρα και αποσπώμενα μπορούν να περάσουν στην μητρική κυκλοφορία 64,65. Οι τροφοβλάστες ήταν τα πρώτα κύτταρα που αναγνωρίσθηκαν στην μητρική κυκλοφορία, λόγω του μεγέθους τους, της χαρακτηριστικής μορφολογίας τους και της επαφής τους με το μητρικό αίμα 65. Παίζουν αποφασιστικό ρόλο στην ανάπτυξη του πλακούντα. Οι συγκυτιοτροφοβλάστες είναι πολυπυρηνικά κύτταρα που ανευρίσκονται στις πλακουντιακές λάχνες, και βρίσκονται σε άμεση επαφή με το μητρικό αίμα. Αυτά τα κύτταρα μπορεί να μεταφερθούν μέσω της κάτω κοίλης φλέβας στους πνεύμονες, όπου και παγιδεύονται μέσα στα πνευμονικά τριχοειδή και τελικά καταστρέφονται. Εντούτοις είναι δυνατό μερικά τροφοβλαστικά κύτταρα να διαφύγουν στην περιφερική κυκλοφορία από όπου μπορεί να απομονωθούν και να καλλιεργηθούν 66. Οι κυτταροτροφοβλάστες είναι μονοπύρηνα κύτταρα που εισβάλλουν στην μήτρα και τις σπειροειδείς αρτηρίες και μπορεί να καταλήξουν στην κυκλοφορία της μητέρας. Αυτή η 30
εμβρυομητρική κυκλοφορία μπορεί να είναι ένα γεγονός σε μία φυσιολογική εγκυμοσύνη η οποία επηρεάζεται από παράγοντες που αυξάνουν αυτήν την κυκλοφορία όπως: προεκλαμψία, εκλαμψία, πρόωρος τοκετός, δακτυλική αποκόλληση πλακούντα, προχωρημένη εγκυμοσύνη και λοχεία 66. Το ιδιαίτερο χαρακτηριστικό που διαφοροποιεί τους συγκυτιοτροφοβλάστες είναι η παρουσία των κυτταροκερατινών στο κυτταρόπλασμά τους, ενώ όλα τα έμμορφα στοιχεία του αίματος όπως και τα ενδοθηλιακά κύτταρα των αγγείων είναι αρνητικά για κυτταροκερατίνη. Το 1984 απομονώθηκαν για πρώτη φορά συγκυτιοτροφοβλάστες από το μητρικό αίμα σε διάφορα στάδια της κύησης. Ο διαχωρισμός έγινε με τη χρήση μονοκλωνικού αντισώματος έναντι Η315 67,68. Οι μελέτες κατέληξαν πως πέντε ήταν ειδικά για τον εμβρυϊκό ιστό. Μετά την έκθεση του μητρικού αίματος στα δύο από τα πέντε μονοκλωνικά αντισώματα, έγινε PCR στα απομονωμένα αντισώματα, για την ανίχνευση Y σειρών. Το φύλο του εμβρύου αναγνωρίσθηκε σωστά στα 7 από τα 7 άρρενα και στα 6 από τα 7 θήλεα. Ο Bruch και συνεργάτες χρησιμοποίησαν μονοκλωνικά αντισώματα (GB17, GB21 και GB25) έναντι των συγκυτιοτροφοβλαστών αλλά και έναντι μαζί των συγκυτιοτροφοβλαστών και των τροφοβλαστών (GB25) 69. Μετά από κυτταρομετρία ροής τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε PCR για τις σειρές Y και βρήκαν το Y σήμα σε δύο από τα τρία δείγματα. Χρησιμοποιώντας κύτταρα που προέκυψαν μετά από ανοσομαγνητικό διαχωρισμό και κυτταρομε- 31
τρία ροής ο Cacehux και συνεργάτες 70 ανίχνευσαν 47ΧΧΥ κύτταρα με FISH. Από τους 1387 πυρήνες, οι 14 (1%) έδειξαν δύο ειδικά για Υ σήματα και 45 (3,24%) πυρήνες είχαν ένα ειδικό για το Υ σήμα. Εναλλακτικά τα τροφοβλαστικά κύτταρα μπορεί να αναγνωρισθούν με υβριδισμό με ειδικούς δείκτες προς το HLA-G m-rna, το οποίο είναι ένα μη πολυμορφικό αντιγόνο μέγιστης ιστοσυμβατότητας ειδικό για τον πλακουντιακό ιστό. Πρόσφατα ο Vona και συνεργάτες ανακοίνωσαν μία πρωτοποριακή μέθοδο στηριζόμενη στο διαχωρισμό των κυττάρων με βάση το μέγεθός τους (ISET-isolation of tumor epithelial cells) από μεικτούς πληθυσμούς κυττάρων 71. Αυτή η προσέγγιση φάνηκε να είναι ικανοποιητική για την απομόνωση τροφοβλαστών από το μητρικό αίμα. Οι τροφοβλάστες απομονώνονται μετά από ISET, με διατομή με λέιζερ με βάση τα κυτταρομορφολογικά και ανοσοϊστοχημικά χαρακτηριστικά τους 62. Εντούτοις υπάρχουν κάποια σημαντικά μειονεκτήματα τα οποία καθιστούν δυσχερή την χρήση των τροφοβλαστών στην προγεννητική διάγνωση. Αρχικά πολύ μικρός αριθμός κυττάρων υπάρχουν στο πρώτο τρίμηνο, όταν και θα ήταν ιδανική στιγμή για προγεννητική διάγνωση. Δεύτερον, τα περισσότερα τροφοβλαστικά κύτταρα που απελευθερώνονται στη μητρική κυκλοφορία παγιδεύονται άμεσα και καταστρέφονται στους πνεύμονες και μόνο μικρός αριθμός παραμένει στην περιφερική κυκλοφορία. Τρίτον είναι γνωστό από την εμπειρία με τη CVS ότι στο 1% των συγκυτιοτροφοβλαστών υπάρχει το φαινόμενο του 32
μωσαϊκισμού με αποτέλεσμα ο καρυότυπος του πλακούντα να διαφέρει από αυτόν του εμβρύου. Τέταρτον οι συγκυτιοτροφοβλάστες είναι πολυπύρηνα κύτταρα κάτι που κάνει δύσκολη τη χρήση της FISH. Τέλος για να πραγματοποιηθεί μαγνητικός διαχωρισμός ή κυτταρομετρία ροής με ενδοπυρηνικά αντισώματα, θα πρέπει να επιτευχθεί δίοδος μέσω των κυτταρικών μεμβρανών με μονοκλωνικά αντισώματα. Η ανάπτυξη αυτών των αντισωμάτων για ειδικά αντισώματα της επιφάνειας της τροφοβλάστης δεν είναι ακόμη εφικτή. Κάποιες αρχικές ανακοινώσεις για απομόνωση τροφοβλαστών αποδείχθηκαν τελικά πως ήταν ανακριβείς καθώς μητρικά λεμφοκύτταρα ήταν αυτά που απορρόφησαν τους παράγοντες της τροφοβλάστης. Μερικοί ερευνητές εντούτοις κατόρθωσαν να ανακαλύψουν σειρές του Υ χρωμοσώματος με PCR και FISH σε απομονωμένα τροφοβλαστικά κύτταρα του μητρικού αίματος 72. γ. Λεμφοκύτταρα Aπό τις αρχές του 1970, αρκετές μελέτες ανέφεραν την παρουσία μεταφάσεων ανδρικών κυττάρων σε καλλιέργειες περιφερικού αίματος γυναικών που ήταν έγκυες σε άρρενα έμβρυα. Ούτε η συγκυτιοτροφοβλάστη ούτε η κυτταροτροφοβλάστη εκφράζουν πατρικής προέλευσης HLA-A,B ή DR αντιγόνα. Σε αντίθεση τα εμβρυϊκά λεμφοκύτταρα εκφράζουν πολυμορφικά αντιγόνα HLA κλάσης I και ΙΙ, από τις 12 εβδομάδες κύησης. Κατά την διάρκεια της 33
κύησης, οι πρωτοτόκες μπορεί να αναπτύξουν αντιανθρώπινα αντισώματα έναντι των λεμφοκυτταρικών αντιγόνων HLA τα οποία δρουν έναντι των πατρικών HLA αντιγόνων τα οποία μεταφέρονται από το έμβρυο 66. O Ηerzenberg και οι συνεργάτες χρησιμοποίησαν τεχνικές κυτταρομετρίας ροής για να εμπλουτίσουν την παρουσία κληρονομούμενων ανθρώπινων λεμφοκυτταρικών αντιγόνων του πατέρα 72. Tα ζευγάρια που εξετάσθηκαν ήταν αυτά στα οποία ο πατέρας αλλά όχι η μητέρα, ήταν θετικά HLA-A2. Για να απομονωθούν τα λεμφοκύτταρα από το μητρικό αίμα αρχικά έγινε διαχωρισμός με Ficoll-Hypaque και μετά με φλουροσκεΐνη για τα θετικά για HLA-A2 κύτταρα. Τα θετικά στη φλουροσκεΐνη κύτταρα μετρήθηκαν οπτικά με βάση την παρουσία ή όχι της Υ χρωματίνης. Από τις 12 κυήσεις που οδήγησαν σε άρρενα νεογνά, οι πέντε έδειξαν κύτταρα θετικά για χρωματίνη Υ (εύρος 0,3% έως 1,6% των απομονωμένων κυττάρων). Οι επτά μητέρες γέννησαν νεογνά των οποίων τα λεμφοκύτταρα δεν αντέδρασαν με τον αντιορρό αντί-hla-a2 και κανένα δεν έδειξε κύτταρα θετικά στη Υ χρωματίνη. Αργότερα αποδείχθηκε πως τα λεμφοκύτταρα μπορούν να απομονωθούν με τεχνικές μοριακής βιολογίας 63,73. O Yeoh και συνεργάτες χρησιμοποίησαν κυτταρομετρία στο μητρικό αίμα για να διαχωρίσουν τα κύτταρα που χαρακτηρίζονταν για πατρικά και κατά συνέπεια εμβρυϊκά HLA αντιγόνα. Η PCR έδειξε πατρικά και κατά συνέπεια εμβρυϊκά αλληλόμορφα HLA στο μητρικό αίμα 74,75. Η αναγνώριση των κυττάρων που περιείχαν το Υ 34
χρωμόσωμα ήταν μία μέθοδος κατά την οποία ανδρικά κύτταρα, υποτίθεται εμβρυϊκά, διαχωρίζονταν από το μητρικό αίμα 74. Επίσης χρησιμοποιήθηκε η συμβατική καρυοτυπική ανάλυση και η κινακρίνη για το Υ χρωμόσωμα και η φλουροσκεΐνη για να αναγνωρισθούν εμβολικά εμβρυϊκά λευκοκύτταρα. Στη συμβατική καρυοτυπική ανάλυση, τα λεμφοκύτταρα ενεργοποιούνται προς διαίρεση με ένα μιτογόνο και ο κύκλος διαίρεσης σταματά στην μετάφαση με την προσθήκη κολχικίνης. Τα χρωμοσώματα χρωματίζονται με Giemsa, και εξετάζονται με μεγέθυνση. Ανδρικές μιτώσεις βρέθηκαν στο μητρικό αίμα από την όγδοη εβδομάδα κύησης. Αυτές οι μιτώσεις προφανώς προέρχονται από εμβρυϊκά λεμφοκύτταρα λόγω της μορφολογίας τους και της απάντησής τους στα μιτογόνα. Παρόλο που οι κυτταροτροφοβλάστες μπορεί να διαιρεθούν και να διαφοροποιηθούν, ούτε αυτοί ούτε οι συγκυτιοτροφοβλάστες απαντούν στα μιτογόνα 66. Η κινακρίνη συνδέει την πυρηνική χρωματίνη στη μεσόφαση και μετάφαση δίνοντας σήμα φλουοροσκεΐνης στο μακρύ σκέλος του Υ χρωμοσώματος (Yq12). Σε αντίθεση με τη συμβατική καρυοτυπική ανάλυση, είναι δυνατό να εξετασθούν μεγάλοι αριθμοί κυττάρων. Εντούτοις μόνο ένα ποσοστό (μεταξύ 30% με 50%) των πατρικών λευκοκυττάρων σε μεσόφαση είναι θετικά στη φλουροσκεΐνη 66. Η απομόνωση των εμβρυϊκών λευκοκυττάρων δεν εφαρμόσθηκε ευρέως, επειδή η κυτταρική επιφάνεια των εμβρυϊκών λεμφοκυττάρων δεν διαφέρει από αυτή των 35
μητρικών. Οι στρατηγικές διαχωρισμού που στηρίζονται στις διαφορές των HLA-αντιγόνων δεν μπορούν να λειτουργήσουν όταν συνυπάρχουν πατρικά και μητρικά αντιγόνα HLA. Επιπλέον αυτή η προσέγγιση υστερεί στο γεγονός πως τα λεμφοκύτταρα που απομονώνονται δεν αντιδρούν στα μιτογόνα ώστε να παραχθούν οι κατάλληλες μεσοφάσεις για καρυοτυπική ανάλυση. Τέλος άλλο ένα πιθανό πρόβλημα είναι ότι σε μερικές περιπτώσεις τα εμβρυϊκά λεμφοκύτταρα μπορεί να παραμείνουν στη μητρική κυκλοφορία για χρόνια μετά την εγκυμοσύνη 71,72. H Βianchi και συνεργάτες πραγματοποίησαν κυτταρομετρία ροής με βάση ειδικούς δείκτες (markers) στα αρχέγονα κύτταρα και βρήκαν σχετικές με το Υ χρωμόσωμα σειρές σε έξι από τις οχτώ μη έγκυες γυναίκες που είχαν τεκνοποιήσει άρρεν νεογνά στο παρελθόν, από 6 μήνες έως 27 χρόνια 73. Το γεγονός αυτό επιβεβαίωσε τα ευρήματα του Schroder και συνεργατών, ο οποίος δύο δεκαετίες πριν, παρουσίασε την ύπαρξη λεμφοκυττάρων άρρενος στο μητρικό αίμα τον πρώτο χρόνο μετά τη γέννηση άρρενος. Τα κύτταρα που παρέμειναν ήταν είτε λεμφοειδή ή μυελοειδή αρχέγονα κύτταρα τα οποία εκφράζουν το CD34 ή το CD34 και το CD38 μαζί. Σε μία γυναίκα βρέθηκαν ανδρικά CD+ κύτταρα. Οι γυναίκες που μελετήθηκαν ήταν υγιείς χωρίς ιστορικό μεταγγίσεων. Η μελέτη οδήγησε στην υπόθεση ότι η φυσιολογική εγκυμοσύνη μπορεί να οδηγήσει σε κατάσταση μικροχειμαιρισμού σε μία γυναίκα 76. Ο Nelson το 1996 υπέθεσε πως ο μικροχειμαιρισμός των εμβρυϊκών κυττάρων παίζει κάποιο ρόλο στην αυξημένη συχνότητα των 36
αυτοάνοσων παθήσεων που παρατηρείται στις γυναίκες μετά το πέρας της αναπαραγωγικής ηλικίας. Αυτή η υπόθεση αργότερα εξετάσθηκε σε μία τυφλή μελέτη η οποία έδειξε στατιστικά σημαντικά αυξημένη ποσότητα άρρενος (πιθανώς εμβρυϊκού) DNA στο περιφερικό αίμα γυναικών που έπασχαν από σκληρόδερμα, σε σύγκριση με τις φυσιολογικές αδελφές τους ή το δείγμα ελέγχου 77. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν πως ο εμβρυϊκός μικροχειμαιρισμός που προκύπτει από την κύηση και τον τοκετό παίζει κάποιο ρόλο στην παθογένεση του σκληροδέρματος. Προφανώς κατά τη διάρκεια της εμβρυομητρικής μετάγγισης που συμβαίνει την ώρα του τοκετού μεταφέρονται και κάποια εμβρυϊκά κύτταρα με αναπαραγωγική δυνατότητα. Αυτά τα κύτταρα μπορεί να μεταναστεύσουν στα λεμφοποιητικά όργανα και να αναπαραχθούν όταν υπάρχει αντιγονική ομοιότητα μεταξύ εμβρύου και μητέρας. Η απάντηση του ξενιστή μπορεί να οδηγήσει στην ανάπτυξη αυτοάνοσης νόσου 78. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η παραμονή εμβρυϊκών κυττάρων μετά τον τοκετό μπορεί να σχετίζεται αιτιολογικά με αυτοάνοσες διαταραχές οι οποίες έχουν μεγαλύτερη συχνότητα σε γυναίκες που έχουν περάσει την αναπαραγωγική τους ηλικία. δ. Κοκκιοκύτταρα Από όλα τα κύτταρα που έχουν έως τώρα μελετηθεί, τα κοκκιοκύταρα είναι αυτά τα οποία έχουν μελετηθεί 37