ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α. ΑΘΑΝΑΣΙΑΔΟΥ

ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΠΑΤΡΩΝ ΣΧΟΛΗ ΕΠΙΣΤΗΜΩΝ ΥΓΕΙΑΣ ΤΜΗΜΑ ΙΑΤΡΙΚΗΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΓΕΝΙΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΔΙΕΥΘΥΝΤΡΙΑ: ΚΑΘΗΓΗΤΡΙΑ Α. ΑΘΑΝΑΣΙΑΔΟΥ «ΣΥΜΒΟΛΗ ΣΤΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΦΥΛΟΥ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΜΕΘΟΔΩΝ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ» ΝΙΚΟΛΑΟΣ ΔΑΒΑΝΟΣ ΜΟΡΙΑΚΟΣ ΒΙΟΛΟΓΟΣ ΔΙΔΑΚΤΟΡΙΚΗ ΔΙΑΤΡΙΒΗ ΠΑΤΡΑ 2007

Τριμελής Συμβουλευτική Επιτροπή Διονύσιος Χ. Σπάθας (Επιβλέπων Καθηγητής) Αν. Καθηγητής Γενικής Βιολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Αγλαΐα Αθανασιάδου Καθηγήτρια Γενικής Βιολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου Επ. Καθηγήτρια Γενικής Βιολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Επταμελής Εξεταστική Επιτροπή Διονύσιος Χ. Σπάθας Αν. Καθηγητής Γενικής Βιολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Αγλαΐα Αθανασιάδου Καθηγήτρια Γενικής Βιολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Αδαμαντία Παπαχατζοπούλου Επ. Καθηγήτρια Γενικής Βιολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Νικόλαος Μοσχονάς Καθηγητής Γενικής Βιολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Ιωάννης Βαράκης Καθηγητής Ανατομίας-Ιστολογίας, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Στέφανος Μανταγός Καθηγητής Παιδιατρικής, Τμήματος Ιατρικής Πανεπιστημίου Πατρών Ιωάννης Γεωργίου Αν. Καθηγητής Ιατρικής Γενετικής και Υποβοηθούμενης Αναπαραγωγής, Τμήμα Μαιευτικής και Γυναικολογίας, Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων

Ευχαριστίες Αισθάνομαι την ανάγκη να ευχαριστήσω θερμά τον επιβλέποντα Αναπληρωτή Καθηγητή κ. Διονύσιο Χ. Σπάθα που μου έδωσε την δυνατότητα να εκπονήσω τη διδακτορική μου διατριβή στο εργαστήριο Γενικής Βιολογίας καθώς και για την συμπαράσταση και την υπομονή του σε όλες τις δυσκολίες που προέκυψαν στη διάρκεια αυτής της εργασίας. Θερμές ευχαριστίες οφείλω και στα έτερα μέλη της Συμβουλευτικής Επιτροπής, την Καθηγήτρια κ. Α. Αθανασιάδου που μου έδωσε την δυνατότητα να αναπτύξω ερευνητική δραστηριότητα και σε άλλους τομείς και την Επίκουρο Καθηγήτρια κ. Α. Παπαχατζοπούλου για τις χρήσιμες συμβουλές της σε τεχνικά θέματα. Επίσης, ευχαριστώ θερμά τα νυν και τα πρώην μέλη του εργαστηρίου Γενικής Βιολογίας οι οποίοι εκτός από στενοί συνεργάτες είναι και πολύ καλοί φίλοι. Ευχαριστώ τον Διευθυντή της Μαιευτικής και Γυναικολογικής Κλινικής του Γενικού Νομαρχιακού Νοσοκομείου Πατρών ο «Άγιος Ανδρέας», κ. Π. Μπάρλα και την Διευθύντρια του Κέντρου Μοριακής Βιολογίας και Κυτταρογενετικής Αθηνών, ALPHA LAB, κ. Λ. Φλωρεντίν που μου παρείχαν τα απαραίτητα δείγματα για την διεξαγωγή της παρούσης ερευνητικής εργασίας. Κλείνοντας, θα ήθελα να αφιερώσω αυτή τη διατριβή στη Μητέρα μου, Ιατρό- Μικροβιολόγο κ. Σ. Δάβανου που χωρίς τη συμβολή της στην παροχή δειγμάτων, η παρούσα ερευνητική εργασία δεν θα έπαιρνε την τελική της μορφή. Τέλος, η εκπόνηση της παρούσας εργασίας στηρίχθηκε από ερευνητικό πρόγραμμα βασικής έρευνας «Κ. Καραθεοδωρής» της Επιτροπής Ερευνών του Πανεπιστημίου Πατρών, προς τον κ. Δ. Χ. Σπάθα

ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ

Περιεχόμενα Σελίδα ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ....1 ΕΙΣΑΓΩΓΗ....1 1. ΓΕΝΙΚΑ...3 2. ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΕΣ 5 2.1. Τρισωμία 21 7 2.2. Τρισωμία 18 8 2.3. Τρισωμία 13 9 2.4. Ανευπλοειδίες των Φυλετικών Χρωμοσωμάτων 9 3. ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΚΑΙ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΩΝ..11 3.1. Μη Επεμβατικός Προγεννητικός Έλεγχος.. 13 3.1.1. Υπερηχογραφικοί και βιοχημικοί δείκτες α τριμήνου κύησης..13 3.1.2. Βιοχημικοί δείκτες β τριμήνου κύησης...13 3.1.3. Υπερηχογραφικοί δείκτες β τριμήνου κύησης..14 3.1.4. Το ανατομικό υπερηχογράφημα..14 3.1.5. Περιορισμοί μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου..15 3.2. Επεμβατικός Προγεννητικός Έλεγχος..16 3.2.1 Τεχνικές επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου..16 3.2.2. Συμβατική κυτταρογενετική ανάλυση..17 4. ΝΕΩΤΕΡΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗΣ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ ΦΥΛΟΥ ΚΑΙ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΩΝ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΩΝ...20 4.1. Φθορίζων Υβριδισμός in situ σε Μεσοφασικούς Πυρήνες..20 4.2. Ποσοτική Φθορίζουσα Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης..23 4.3. Ποσοτική PCR σε Πραγματικό Χρόνο..28 4.4. Πολλαπλή Ενίσχυση Ανιχνευτών Υβριδοποιημένων στο Γονιδίωμα..30 4.5. Νέες Προσεγγίσεις στον Προγεννητικό Έλεγχο Ανευπλοειδιών..33 4.5 Συμπεράσματα..37 5. ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΗ ΓΕΝΕΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΩΝ ΚΑΙ ΦΥΛΟΥ ΜΕ ΜΕΘΟΔΟΥΣ PCR..39 5.1. Τεχνικές Εφαρμογής της PGD..40

Περιεχόμενα Σελίδα 5.2 Προβλήματα Διάγνωσης από το DNA Ενός Μόνο Κυττάρου..42 5.3 Μεθοδολογίες PCR για την Ενίσχυση DNA από Ένα Μόνο Κύτταρο..43 5.4. Διάγνωση Ανευπλοειδιών με PCR από Ένα Μόνο Κύτταρο..45 6. ΜΗ ΕΠΕΜΒΑΤΙΚΗ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ..47 6.1. Εμβρυικά Κύτταρα στη Μητρική Κυκλοφορία..47 6.1.1. Συχνότητα και διάρκεια ζωής των εμβρυϊκών κυττάρων στο μητρικό αίμα..49 6.1.2. Τεχνικές διαχωρισμού εμβρυϊκών κυττάρων..51 6.1.3. Καλλιέργεια εμβρυϊκών αιμοποιητικών κυττάρων..53 6.1.4. Εφαρμογές στην προγεννητική διάγνωση..53 6.2. Ελεύθερο Εμβρυϊκό Γενετικό Υλικό στη Μητρική Κυκλοφορία..54 ΣΚΟΠΟΣ ΤΗΣ ΕΡΓΑΣΙΑΣ..61 ΕΙΔΙΚΟ ΜΕΡΟΣ..63 ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ..63 1. ΔΕΙΓΜΑΤΑ..65 2. ΜΕΘΟΔΟΙ..67 2.1. Τεχνικές Απομόνωσης DNA Γονιδιώματος..67 2.1.1 Απομόνωση DNA γονιδιώματος από περιφερικό αίμα..67 2.1.2. Απομόνωση DNA γονιδιώματος από αμνιακά κύτταρα..68 2.1.3. Απομόνωση ολικού ελεύθερου DNA γονιδιώματος από μητρικό πλάσμα..69 2.1.4. Κλασμάτωση ολικού ελεύθερου DNA γονιδιώματος από μητρικό πλάσμα..70 2.1.5. Απομόνωση ολικού ελεύθερου DNA γονιδιώματος από μητρικά ούρα..71 2.1.6. Απομόνωση DNA γονιδιώματος από μεμονωμένα επιθηλιακά κύτταρα και βλαστομερίδια..71 2.2. Ενίσχυση Γονιδιωματικού DNA με Τεχνικές PCR..72 2.2.1. Ενίσχυση ολικού DNA γονιδιώματος από μεμονωμένα κύτταρα..72 2.2.2. Ενίσχυση γονιδιωματικών δεικτών STR με απλή και πολλαπλή QF-PCR..74

Περιεχόμενα Σελίδα 2.2.3. Ενίσχυση γονιδιωματικών δεικτών STS με συμβατική και πολλαπλή PCR στα φυλετικά χρωμοσώματα..77 2.2.4. Ενίσχυση γονιδιωματικών δεικτών STS με nested PCR στo χρωμόσωμα Υ..79 ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΚΑΙ ΣΥΖΗΤΗΣΗ..83 1. ΤΥΠΟΠΟΙΗΣΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΤΗΣ QF-PCR..85 1.1. Ανάλυση Φυσιολογικών Ευπλοειδικών Δειγμάτων με την Τεχνική της QF-PCR..85 1.2. Ανάλυση Ανευπλοειδικών Δειγμάτων με την Τεχνική της QF-PCR..89 2. ΕΦΑΡΜΟΓΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑΣ ΤΗΣ QF-PCR ΣΤΗΝ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΩΝ....93 3. ΠΡΟΕΜΦΥΤΕΥΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ ΑΥΤΟΣΩΜΙΚΩΝ ΚΑΙ ΦΥΛΕΤΙΚΩΝ ΧΡΩΜΟΣΩΜΑΤΩΝ..98 3.1. Τυποποίηση της Μεθοδολογίας της Συμβατικής και της QF-PCR σε Δείγματα DNA από Ένα Κύτταρο..98 3.2. Εφαρμογή της Μεθοδολογίας της DOP-PCR, της Συμβατικής PCR και της QF-PCR για τον Προεμφυτευτικό Έλεγχο των Αυτοσωμικών και Φυλετικών Χρωμοσωμάτων του Εμβρύου 100 4. ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΩΝ DNA ΕΜΒΡΥΙΚΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ ΣΤΗ ΜΗΤΡΙΚΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ 105 4.1. Ανίχνευση Αλληλουχιών DNA Εμβρυϊκής Προέλευσης στο Μητρικό Πλάσμα σε Διαφορετικά Στάδια της Κύησης 105 4.2. Ανίχνευση Αλληλουχιών DNA Εμβρυϊκής Προέλευσης στα Ούρα Εγκύων Γυναικών σε Διαφορετικά Στάδια της Κύησης 110 5. ΜΕΛΕΤΗ ΚΑΙ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΕΠΙΠΕΔΩΝ ΤΟΥ ΕΛΕΥΘΕΡΟΥ ΕΜΒΡΥΙΚΟΥ DNA ΣΤΗ ΜΗΤΡΙΚΗ ΚΥΚΛΟΦΟΡΙΑ...114 5.1. Χαρακτηρισμός Πληροφοριακών Δεικτών STR για τη Μελέτη του Ελεύθερου Εμβρυϊκού DNA στη Μητρική Κυκλοφορία σε Κυήσεις με Άρρενα και Θήλεα Έμβρυα 114

Περιεχόμενα Σελίδα 5.2. Δημιουργία Πρότυπης Καμπύλης για τον Προσδιορισμό του Ποσοστού του Ελεύθερου Εμβρυϊκού DNA στη Μητρική Κυκλοφορία 116 5.3. Προσδιορισμός του Ποσοστού του Ελεύθερου Εμβρυϊκού DNA στο Μητρικό Πλάσμα 126 5.4. Προσδιορισμός της Αναλογίας των Χρωμοσωμάτων στο Μητρικό Πλάσμα 133 5.5. Εμπλουτισμός του Ελεύθερου Εμβρυϊκού DNA στο Μητρικό Πλάσμα...137 5.6. Προσδιορισμός της Αναλογίας των Χρωμοσωμάτων στο Μητρικό Πλάσμα σε Μοντέλα Προσομοίωσης Ανευπλοειδικών Κυήσεων 143 ΤΕΛΙΚΗ ΣΥΖΗΤΗΣΗ ΚΑΙ ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ 152 1. Γενικά 154 2. Τυποποίηση της Μεθοδολογίας της QF-PCR και της Συμβατικής PCR για την Προγεννητική Διάγνωση Ανευπλοειδιών και Φύλου 156 3. Τυποποίηση της Μεθοδολογίας της QF-PCR και της Συμβατικής PCR για την Προεμφυτευτική Γενετική Διάγνωση Ανευπλοειδιών και Φύλου 159 4. Ανίχνευση, Μελέτη και Χρήση του Ελεύθερου Εμβρυϊκού DNA στο Μητρικό Πλάσμα σε Εφαρμογές μη Επεμβατικού Προγεννητικού Ελέγχου Ανευπλοειδιών και Φύλου 160 5. Αντιμετώπιση Προβλημάτων που Προκύπτουν από την Ανάλυση του DNA με QF-PCR και συμβατική PCR 165 6. Συμπεράσματα 169 ΠΕΡΙΛΗΨΗ 174 SUMMARY 176 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ 178

ΓΕΝΙΚΟ ΜΕΡΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΗ 1

2

1. ΓΕΝΙΚΑ Φυσιολογικά, τα ανθρώπινα κύτταρα, εκτός από τους γαμέτες, έχουν στον πυρήνα τους δύο αντίγραφα από το κάθε ένα από τα 22 αυτοσωμικά χρωμοσώματα και δύο αντίγραφα από το Χ χρωμόσωμα (θήλυ) ή ένα Χ και ένα Υ χρωμόσωμα (άρρεν). Ο συνολικός αριθμός των χρωμοσωμάτων στον άνθρωπο λοιπόν είναι 2n = 46, από τα οποία 23 κληρονομούνται από την μητέρα και 23 από τον πατέρα (το Υ χρωμόσωμα κληρονομείται μόνο από τον πατέρα). Αποκλίσεις από τον φυσιολογικό αριθμό των χρωμοσωμάτων και συγκεκριμένα στις περιπτώσεις όπου σε σωματικά κύτταρα ο αριθμός των χρωμοσωμάτων είναι διαφορετικός από 2n, ορίζονται σαν ανευπλοειδίες και αφορούν συνήθως την απώλεια του ενός αντιγράφου ή την παρουσία ακόμη ενός αντιγράφου συγκεκριμένου χρωμοσώματος, γεγονότα που οδηγούν σε φαινοτυπικές ανωμαλίες ή σύνδρομα. Η παρουσία συγκεκριμένης ανωμαλίας εξαρτάται από το ποιο χρωμόσωμα λείπει ή επαναλαμβάνεται. Μια συνήθης ανευπλοειδία είναι η τρισωμία η οποία συμβαίνει όταν το ανθρώπινο κύτταρο περιέχει στον πυρήνα του ένα επιπλέον αντίγραφο ενός αυτοσωμικού χρωμοσώματος π.χ. τρισωμία 21, σύνδρομο Down. Επίσης, υπάρχουν ανωμαλίες όπου το χρωμόσωμα που λείπει ή επαναλαμβάνεται είναι φυλετικό (Χ ή Υ). Η πιο συνήθης αιτία για τη διεξαγωγή προγεννητικής διάγνωσης είναι ο αυξημένος κίνδυνος παρουσίας εμβρύου με τρισωμίες στα χρωμοσώματα 21, 18 και 13. Ο κίνδυνος αυτός προσδιορίζεται από την ηλικία της μητέρας, το οικογενειακό ιστορικό και από ανιχνευτικές δοκιμασίες μαζικού ελέγχου όπως είναι η ορολογική δοκιμασία και το υπερηχογράφημα του εμβρύου. Μια ακόμη συνήθης αιτία για την διεξαγωγή προγεννητικής διάγνωσης είναι ο προσδιορισμός του φύλου του εμβρύου 3

σε περιπτώσεις όπου το οικογενειακό ιστορικό παρουσιάζει ασθένειες συνδεδεμένες με το Χ χρωμόσωμα. Σε περιπτώσεις αυξημένου κινδύνου πραγματοποιούνται επεμβατικές τεχνικές για την λήψη εμβρυϊκού βιολογικού υλικού. Η συμβατική μέθοδος με την οποία διεξάγεται η προγεννητική διάγνωση των ανευπλοειδιών είναι η χρονοβόρος τεχνική της κυτταρογενετικής ανάλυσης (καρυότυπος), όπου προσδιορίζεται ο αριθμός των αντιγράφων των χρωμοσωμάτων με ανάλυση κυττάρων από αμνιακό υγρό ή χοριακές λάχνες στο μικροσκόπιο. Προσφάτως, έχουν αναπτυχθεί νέες μοριακές τεχνικές, οι οποίες δοκιμάζονται για την αποτελεσματική και ταχύτατη προγεννητική διάγνωση αυτών των ανωμαλιών. Η χρήση αυτών των τεχνικών σε συνδυασμό με νέες προσεγγίσεις δειγματοληψίας εμβρυϊκού βιολογικού υλικού όπως είναι: α) η βιοψία εμβρύων μετά από γονιμοποίηση in vitro, β) η απομόνωση εμβρυϊκών κυττάρων από το μητρικό περιφερικό αίμα και γ) η παρουσία ελεύθερου εμβρυϊκού DNA στο μητρικό πλάσμα, έχουν ως στόχο την ανάπτυξη νέων μεθόδων για την προεμφυτευτική και τη μη επεμβατική προγεννητική διάγνωση ανευπλοειδιών και του φύλου του εμβρύου, κατά τα αρχικά στάδια της κύησης. 4

2. ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΕΣ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΕΣ Πολύ συχνά, οι χρωμοσωμικές ατυπίες οδηγούν σε αποβολή του κυήματος. Περίπου το 70 % των αυτόματα αποβαλλόμενων εμβρύων στο πρώτο τρίμηνο της κύησης οφείλεται σε χρωμοσωμικές ατυπίες (http://www.pregnancyinfo.net/topic_complicationswithbaby.html). Οι πιο συνηθισμένες από αυτές, οι οποίες είναι συμβατές με τη ζωή, είναι οι ανευπλοειδίες (τρισωμίες) στα αυτοσωμικά χρωμοσώματα 21, 18, 13 και οι ανευπλοειδίες (τρισωμίες και μονοσωμίες) στα φυλετικά χρωμοσώματα (Χ και Υ) και αριθμούν το 95% περίπου των χρωμοσωμικών ατυπιών που προκαλούν συγγενείς ανωμαλίες (Adinolfi et al, 1997; Lim et al, 2002). Η ανευπλοειδία είναι συνήθως αποτέλεσμα του μη διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων, δηλαδή της αποτυχίας των χρωμοσωμάτων να διαχωριστούν φυσιολογικά κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης, και συνήθως συμβαίνει κατά τη διάρκεια της μείωσης στους γαμέτες. Ο μειωτικός μη διαχωρισμός μπορεί να συμβεί είτε στην πρώτη είτε στη δεύτερη μειωτική διαίρεση. Έχει βρεθεί ότι ο κίνδυνος να συμβεί αυτό αυξάνει, όσο αυξάνεται η ηλικία της μητέρας. Το αποτέλεσμα του μειωτικού μη διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων είναι η παρουσία μη φυσιολογικού αριθμού χρωμοσωμικών αντιγράφων στους γαμέτες. Η γονιμοποίηση ενός μη φυσιολογικού γαμέτη από έναν φυσιολογικό, οδηγεί στον σχηματισμό ανευπλοειδικού εμβρύου. Ο μη διαχωρισμός μπορεί να συμβεί και μετά τη γονιμοποίηση δύο φυσιολογικών γαμετών, δηλαδή στη μίτωση μεταζυγωτικών κυττάρων από τα οποία θα προκύψουν ανευπλοειδικές κυτταρικές σειρές. Το φαινόμενο αυτό συναντάται στο 5% των περιπτώσεων τρισωμίας 21 και είναι ανεξάρτητο από την ηλικία της μητέρας (Antonarakis et al, 1993). Το αποτέλεσμα 5

του μεταζυγωτικού μη διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων είναι ο μωσαϊκισμός όπου το έμβρυο αποτελείται από ανευπλοειδικά και φυσιολογικά κύτταρα. Τέλος, μπορεί να προκύψει ανευπλοειδία για μέρος ενός ή περισσότερων χρωμοσωμάτων όταν φυσιολογικός γαμέτης γονιμοποιεί έναν άλλο γαμέτη που φέρει χρωμοσωμική δομική ατυπία για ένα ή περισσότερα χρωμοσώματα, αλλά είναι φαινοτυπικά φυσιολογικός. Οι δομικές ατυπίες είναι αποτέλεσμα χρωμοσωμικής θραύσης. Όταν ένα χρωμόσωμα υφίσταται θραύση, δημιουργούνται δύο ασταθή κολλώδη άκρα. Συνήθως, οι μηχανισμοί επιδιόρθωσης του DNA επανασυνδέουν τα δύο άκρα. Ωστόσο, αν συμβούν περισσότερες από μια θραύσεις στο χρωμόσωμα, οι μηχανισμοί επιδιόρθωσης δεν μπορούν να διακρίνουν τα διαφορετικά κολλώδη άκρα με αποτέλεσμα να υπάρχει η πιθανότητα λάθους στην επανασύνδεση. Οι δομικές ανωμαλίες διακρίνονται σε μετατοπίσεις, ελλείμματα, δακτυλιοειδή χρωμοσώματα, διπλασιασμούς, αναστροφές, ισοχρωμοσώματα και ενθέσεις. Από αυτές τις ανωμαλίες ενδιαφέρουν εκείνες των οποίων η παρουσία στον ένα γαμέτη προκαλεί την δημιουργία επιπλέον χρωμοσωμικών αντιγράφων στο έμβρυο. Αυτές συνήθως είναι οι αμοιβαίες μετατοπίσεις και οι μετατοπίσεις κατά Robertson ή συντήξεις των κεντρομεριδίων δύο ακροκεντρικών χρωμοσωμάτων (π.χ. χρωμοσώματα 14 και 21). Και στις δύο αυτές περιπτώσεις, τα άτομα που φέρουν αυτές τις μετατοπίσεις είναι συνήθως γενετικά και φαινοτυπικά φυσιολογικά, έχουν όμως αυξημένο κίνδυνο να έχουν χρωμοσωμικά μη ισορροπημένα τέκνα. Οι παραπάνω μηχανισμοί έχουν ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό ζυγωτών κυττάρων τα οποία είναι τρισωμικά ή μονοσωμικά για ένα ή περισσότερα χρωμοσώματα. Τρισωμία υπάρχει όταν το ζυγωτό κύτταρο έχει τρία αντίγραφα ενός συγκεκριμένου χρωμοσώματος αντί για δύο που είναι το φυσιολογικό. Εάν η τρισωμία είναι αποτέλεσμα μη διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων στην πρώτη 6

μειωτική διαίρεση το ζυγωτό κύτταρο που προκύπτει θα περιέχει 3 διαφορετικά αντίγραφα του συγκεκριμένου χρωμοσώματος (1+1+1) ενώ αν είναι αποτέλεσμα μη διαχωρισμού στην δεύτερη μειωτική διαίρεση, δύο από τα τρία αντίγραφα θα είναι όμοια (2+1) (Tolmie, 2002). Στον άνθρωπο, περίπου το 70% των μη διαχωρισμών συμβαίνει στην πρώτη μειωτική διαίρεση (Roizen and Patterson, 2003). Τέλος, η μονοσωμία αναφέρεται στην παρουσία ενός μονού χρωμοσώματος και το έμβρυο μπορεί να επιβιώσει μόνο όταν το χρωμόσωμα που λείπει είναι ένα από τα δύο Χ χρωμοσώματα. Κάθε χρωμοσωμική ατυπία προκαλεί ένα συγκεκριμένο σύνδρομο στο έμβρυο και η ανωμαλία εξαρτάται από το εάν το χρωμόσωμα επαναλαμβάνεται ή λείπει. Η απώλεια ενός αντιγράφου, η ύπαρξη επιπλέον αντιγράφου ή η παρουσία ενός μη φυσιολογικού αντιγράφου για κάποιο συγκεκριμένο χρωμόσωμα έχει σαν αποτέλεσμα την διαταραχή της φυσιολογικής ανάπτυξης του εμβρύου. Οι επιδράσεις των χρωμοσωμικών ατυπιών στον ανθρώπινο οργανισμό εξαρτώνται από το χρωμόσωμα το οποίο λείπει ή επαναλαμβάνεται με αποτέλεσμα την ύπαρξη διαφορετικών συνδρόμων. Στη συνέχεια περιγράφονται οι πιο συνηθισμένες περιπτώσεις ανευπλοειδίας που είναι συμβατές με τη ζωή. 2.1. Τρισωμία 21 Η τρισωμία 21, που προκαλεί το σύνδρομο Down (Down, 1866), χαρακτηρίζεται από ένα επιπλέον αντίγραφο του χρωμοσώματος 21 που προκύπτει εξαιτίας ενός γεγονότος μη διαχωρισμού κατά τη διάρκεια της μείωσης, και αποτελεί το πλέον γνωστό και χαρακτηριστικό χρωμοσωμικό σύνδρομο. Μελέτες έχουν δείξει ότι το 80% του μη σωστού διαχωρισμού των χρωμοσωμάτων συμβαίνει στην πρώτη μειωτική διαίρεση με το 95% του συνολικού αριθμού να συμβαίνει κατά τη διάρκεια 7

της μητρικής μείωσης (Magenis, 1988). Η πιθανότητα να γεννηθεί ένα παιδί με σύνδρομο Down είναι 1 στα 600 στον γενικό πληθυσμό, με την πιθανότητα γέννησης παιδιού με τρισωμία 21 να αυξάνει με την αύξηση της ηλικίας της μητέρας (Πίνακας 1) (Patterson and Costa, 2005). Πριν από τρεις δεκαετίες περίπου, το προσδόκιμο ζωής ενός ατόμου με σύνδρομο Down ήταν ένας χρόνος. Σήμερα έχει αυξηθεί στα 49 χρόνια (Patterson and Costa, 2005). Τα άτομα με σύνδρομο Down παρουσιάζουν ειδικά μορφολογικά χαρακτηριστικά όπως τα κοντά άκρα, η ρυτίδα κάτω από τα μάτια και το μικρό στόμα. Άλλα χαρακτηριστικά είναι η νοητική καθυστέρηση, η καρδιακή ανεπάρκεια και οι δυσμορφίες του γαστρεντερικού σωλήνα. Επίσης, υπάρχουν ενδείξεις ότι τα άτομα με σύνδρομο Down αντιμετωπίζουν αυξημένο κίνδυνο για ασθένειες όπως η λευχαιμία, η απώλεια ακοής και η πρόωρη εμφάνιση της νόσου Alzheimer (Hu et al, 2004). Πίνακας 1. Πιθανότητα γέννησης παιδιού με τρισωμία 21, 18 ή 13 σε σχέση με την ηλικία της μητέρας. (http://www.pregnancy-info.net/topic_complicationswithbaby.html) ΗΛΙΚΙΑ ΤΡΙΣΩΜΙΑ 21 ΤΡΙΣΩΜΙΑ 18 ΤΡΙΣΩΜΙΑ 13 15-19 1 : 1600 1 : 17000 1 : 33000 20-24 1 : 1400 1 : 14000 1 : 25000 25-29 1 : 1100 1 : 11000 1 : 20000 30-34 1 : 700 1 : 7100 1 : 14000 35-39 1 : 200 1 : 2400 1 : 4800 40-44 1 : 60 1 : 700 1 : 1600 2.2. Τρισωμία 18 Η τρισωμία 18 είναι η αιτία του συνδρόμου Edwards και χαρακτηρίζεται από 8

ένα επιπλέον αντίγραφο του χρωμοσώματος 18. Συνήθως, αυτή η χρωμοσωμική ατυπία έχει σαν αποτέλεσμα την αποβολή του εμβρύου ενώ η πιθανότητα να γεννηθεί παιδί με σύνδρομο Edwards είναι περίπου 1 στις 3000. Επίσης, η πιθανότητα να γεννηθεί παιδί με τρισωμία 18 αυξάνει με την αύξηση της ηλικίας της μητέρας (Πίνακας 1). Πολύ λίγα βρέφη που γεννιούνται με τρισωμία 18 επιβιώνουν παραπάνω από ένα χρόνο. Τα συμπτώματα του συνδρόμου Edwards περιλαμβάνουν νοητική καθυστέρηση, καρδιακή ανεπάρκεια ενώ τα χαρακτηριστικά περιλαμβάνουν χαμηλό βάρος στη γέννηση, μικρό σαγόνι, χαμηλά τοποθετημένα αυτιά, κ.α. (http://www.pregnancy-info.net/topic_complicationswithbaby.html). 2.3. Τρισωμία 13 Η τρισωμία 13 που προκαλεί το σύνδρομο Patau, χαρακτηρίζεται από ένα επιπλέον αντίγραφο του χρωμοσώματος 13. Η πιθανότητα να γεννηθεί ένα παιδί με σύνδρομο Patau είναι περίπου 1 στις 12000, με την πιθανότητα γέννησης παιδιού με τρισωμία 13 να αυξάνει με την αύξηση της ηλικίας της μητέρας (Πίνακας 1). Η πιθανότητα γέννησης ενός παιδιού με σύνδρομο Patau είναι χαμηλή διότι η πλειοψηφία των κυήσεων με αυτή την χρωμοσωμική ατυπία καταλήγουν σε αποβολή. Στις περισσότερες περιπτώσεις τα μωρά που γεννιούνται με τρισωμία 13 δεν επιβιώνουν παραπάνω από μερικές ημέρες. Τα χαρακτηριστικά αυτής της διαταραχής είναι φυσικές ανωμαλίες όπως δυσμορφίες στα πόδια, στα χέρια και στο πρόσωπο που συνήθως είναι αποτέλεσμα της ατελούς ανάπτυξης του εγκεφάλου (http://www.pregnancy-info.net/topic_complicationswithbaby.html). 2.4. Ανευπλοειδίες των Φυλετικών Χρωμοσωμάτων Τα σύνδρομα που προκύπτουν από τις αριθμητικές ατυπίες των φυλετικών 9

χρωμοσωμάτων συμβαίνουν όταν υπάρχει ένα επιπλέον αντίγραφο Χ ή Υ χρωμοσώματος ή όταν υπάρχει έλλειψη Χ ή Υ χρωμοσώματος. Το σύνδρομο Turner προκαλείται όταν το δεύτερο φυλετικό χρωμόσωμα λείπει και η πιθανότητα γέννησης παιδιού με αυτή την ανωμαλία είναι 1 στα 2500. Φαινοτυπικά το άτομο θα είναι θήλυ με μόνο ένα Χ χρωμόσωμα (45, X0). Τα χαρακτηριστικά του συνδρόμου Turner είναι μικροσωμία, ανωμαλίες των δακτύλων, έλλειψη δευτερευόντων χαρακτήρων φύλου κ.α. Ένα θήλυ άτομο με ένα επιπλέον χρωμόσωμα Χ (τριπλό-χ, 47, ΧΧΧ) δεν εμφανίζει αρνητικά χαρακτηριστικά. Τα άτομα είναι ασυνήθιστα ψηλά, έχουν φυσιολογική νοημοσύνη και γονιμότητα με την πιθανότητα να παρουσιάσουν προβλήματα στη μάθηση. Η πιθανότητα να γεννηθεί θήλυ άτομο με τριπλό-χ είναι περίπου 1 στα 1500. Η εμφάνιση ενός επιπλέον X χρωμοσώματος σε άρρενα άτομα αναφέρεται ως σύνδρομο Kleinefelter (47, XXY). Η πιθανότητα γέννησης άρρενος ατόμου με αυτή τη ανωμαλία είναι περίπου 1 στα 700. Τα συμπτώματα περιλαμβάνουν προβλήματα στη μάθηση, χαμηλά επίπεδα τεστοστερόνης, στειρότητα κ.α. (http://www.pregnancy-info.net/topic_complicationswithbaby.html). 10

3. ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ ΚΑΙ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΩΝ Πριν από τρεις δεκαετίες περίπου, ο κίνδυνος παρουσίας ανευπλοειδικού εμβρύου σε μια εγκυμοσύνη ήταν δυνατό να αξιολογηθεί μόνο βάσει του οικογενειακού ιστορικού και την ηλικία της μητέρας. Σήμερα, η αξιολόγηση περιλαμβάνει μαζί με τα παραπάνω και άλλες παραμέτρους οι οποίες συνδέονται με αυτόν τον κίνδυνο. Η πρόοδος που έχει σημειώσει η προγεννητική διάγνωση των ανευπλοειδιών (και συγκεκριμένα των αριθμητικών ατυπιών στα αυτοσωμικά χρωμοσώματα 13, 18, 21 και στα φυλετικά χρωμοσώματα) τα τελευταία χρόνια είναι σημαντική, και οφείλεται κυρίως: α) στην ανάπτυξη και καθιέρωση προγραμμάτων ελέγχου του γενικού πληθυσμού για την διάγνωση ανευπλοειδιών και ιδίως του συνδρόμου Down, β) στη συμβολή της υπερηχογραφίας, γ) στην κυτταρογενετική ανάλυση και δ) στην εισαγωγή νέων μεθόδων Μοριακής Βιολογίας. Ο προγεννητικός έλεγχος που παρέχεται σήμερα για την διάγνωση ανευπλοειδιών διακρίνεται σε μη επεμβατικό έλεγχο ο οποίος αφορά όλες τις κυήσεις, και σε επεμβατικό προγεννητικό έλεγχο που αφορά κυήσεις στις οποίες ο αυξημένος κίνδυνος για παρουσία ανευπλοειδικού εμβρύου απαιτεί την δειγματοληψία εμβρυϊκού βιολογικού υλικού για την διάγνωση των συγκεκριμένων νοσημάτων (Εικόνα 1). 11

Εικόνα 1. Σχεδιάγραμμα της διαδικασίας για τον προγεννητικό έλεγχο του συνδρόμου Down. Επιβεβαίωση εγκυμοσύνης Προσφορά προγεννητικού ελέγχου Αποδοχή ελέγχου Απόρριψη ελέγχου Υπερηχογραφικός και βιοχημικός έλεγχος Αποτέλεσμα υψηλού κινδύνου Αποτέλεσμα χαμηλού κινδύνου Προσφορά επεμβατικής διαδικασίας Αποδοχή επεμβατικής διαδικασίας Απόρριψη επεμβατικής διαδικασίας Αμνιοπαρακέντιση ή λήψη χοριακών λαχνών Επιτυχία της διαδικασίας Αποβολή του εμβρύου Συνεχής παρακολούθηση έως το πέρας της κύησης Καλλιέργεια εμβρυϊκών κυττάρων Αρνητικό αποτέλεσμα Κυτταρογενετική ανάλυση κυττάρων Διάγνωση τρισωμίας 21 12

3.1. Μη Επεμβατικός Προγεννητικός Έλεγχος Συνιστάται σε όλες τις εγκύους γυναίκες και στηρίζεται κυρίως στον υπερηχογραφικό έλεγχο του εμβρύου και στις ανιχνευτικές δοκιμασίες μαζικού ελέγχου για την εκτίμηση της πιθανότητας ανευπλοειδίας του εμβρύου. Αυξημένος κίνδυνος οδηγεί σε περαιτέρω έλεγχο με επεμβατικές τεχνικές. 3.1.1 Υπερηχογραφικοί και βιοχημικοί δείκτες α τριμήνου κύησης Ο σημαντικότερος υπερηχογραφικός δείκτης του πρώτου τριμήνου κύησης είναι η αυχενική διαφάνεια και οφείλεται στην παρουσία λέμφου κάτω από το δέρμα της περιοχής του αυχένα του εμβρύου. Φυσιολογικά έχει εύρος <3χιλιοστά, ενώ μεγαλύτερες τιμές αποτελούν ένδειξη για υποκείμενη εμβρυϊκή ανωμαλία (κυρίως ανευπλοειδία) (Nikolaides et al, 1992; Souka et al, 2005). Ο προσδιορισμός του εύρους της αυχενικής διαφάνειας την 11 η -13 η εβδομάδα κύησης σε συνδυασμό με την ηλικία της μητέρας και τις τιμές της β-χοριακής γοναδοτροπίνης (β-hcg) και της PAPP-a (Pregnancy associated Plasma Protein-a) στο μητρικό πλάσμα, μπορεί να ανιχνεύσει έως και το 92% των κυήσεων με σύνδρομο Down (Spencer et al, 1994; Nicolaides et al, 2005). Με την προσθήκη και άλλων υπερηχογραφικών δεικτών (απουσία / υποπλασία ρινικού οστού, Doppler στο φλεβώδη πόρο και στην τριγλώχινα βαλβίδα, εκτίμηση γωνίας άνω γνάθου και προσώπου) υποστηρίζεται ότι μπορούν να αναγνωρισθούν μέχρι και το 97% των κυήσεων με σύνδρομο Down (Larose et al, 2003; Nicolaides 2004; Falcon et al 2006). 3.1.2. Βιοχημικοί δείκτες β τριμήνου κύησης Ο προσδιορισμός στο μητρικό ορό της β-hcg, της α-εμβρυϊκής πρωτεΐνης και 13

της οιστριόλης μεταξύ 16 ης και 18 ης εβδομάδας της κύησης σε συνδυασμό με την ηλικία της μητέρας μπορεί να αναγνωρίσει το 67% των κυήσεων με σύνδρομο Down καθώς και ένα σημαντικό ποσοστό της τρισωμιών 18 και 13 (τριπλός έλεγχος) (ACOG, 2007). Η προσθήκη της ινχιμπίνης-α μπορεί να βελτιώσει τη διαγνωστική ευαισθησία περίπου κατά 7% (τετραπλός έλεγχος). Έχουν μελετηθεί και άλλοι δείκτες, αλλά μέχρι τώρα δεν έχουν καθιερωθεί. Αναφέρεται ως παράδειγμα η πλακουντιακή αυξητική ορμόνη (human Placental Growth Hormone), η οποία έχει βρεθεί να παράγεται σε αυξημένες συγκεντρώσεις σε κυήσεις με σύνδρομο Down και η οποία πιθανά να αποτελέσει ένα επιπλέον βιοχημικό δείκτη στις ανιχνευτικές δοκιμασίες μαζικού ελέγχου του β τριμήνου (Baviera et al, 2004). 3.1.3. Υπερηχογράφημα β τριμήνου κύησης Το συγκεκριμένο υπερηχογράφημα εκτελείται μεταξύ 16 ης και 20 ης εβδομάδας της κύησης και έχει σαν στόχο την αναγνώριση υπερηχογραφικών δεικτών ή ανωμαλιών που πιθανά σχετίζονται με την ύπαρξη ανευπλοειδίας του εμβρύου (κυρίως τρισωμίας 21, 18 και 13). Η διαγνωστική ευαισθησία του υπερηχογραφήματος υπολογίζεται σε 65-75%, αλλά με υψηλό ποσοστό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων (10-15%) (Nyberg et al, 2003; Benacerraf, 2005). 3.1.4. Το ανατομικό υπερηχογράφημα Ο υπερηχογραφικός ανατομικός έλεγχος του εμβρύου εκτελείται μεταξύ 20 ης και 23 ης εβδομάδας της κύησης και έχει σαν στόχο τον αποκλεισμό των ανωμαλιών του εμβρύου που σχετίζονται με ανευπλοειδία. Με τον έλεγχο αυτό μπορούν να αποκλεισθούν περίπου το 70-80% των συγγενών ανωμαλιών του εμβρύου (Pinto et al, 2003). 14

3.1.5. Περιορισμοί μη επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου Έχουν χρησιμοποιηθεί διάφορα προγράμματα όπου με την αναγνώριση ενός ή περισσοτέρων δεικτών τροποποιείται ο «προϋπάρχων κίνδυνος» για ανευπλοειδία (κυρίως τρισωμίας 21), που συνήθως καθορίζεται από την μητρική ηλικία και το οικογενειακό ιστορικό. Με βάση τον τροποποιημένο κίνδυνο λαμβάνεται η απόφαση για επεμβατικό έλεγχο. Τα κυριότερα αίτια περιορισμού των δυνατοτήτων του προγεννητικού ελέγχου ρουτίνας είναι τα εξής: α) η εφαρμογή των ανιχνευτικών προγραμμάτων για την αναγνώριση των ανευπλοειδικών κυήσεων συνοδεύεται από σχετικά υψηλό ποσοστό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων (~5-15%) (Wald et al, 1999a; Cuckle 2001; Lam et al, 2002) (Πίνακας 2), β) ένα ποσοστό ανευπλοειδικών κυήσεων, που κυμαίνεται από 5-35%, δεν αναγνωρίζεται (ψευδώς καθησυχαστικά) και γ) η de novo εμφάνιση δομικών και αριθμητικών αλλαγών στα χρωμοσώματα (π.χ. μη-ισοζυγισμένες μεταθέσεις). Πίνακας 2. Αποτελεσματικότητα των βασικότερων ανιχνευτικών δοκιμασιών μαζικού προγεννητικού ελέγχου για τρισωμία 21, σε ποσοστό ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων 5% (Cuckle 2001). Ανιχνευτική δοκιμασία μαζικού ελέγχου Ανίχνευση τρισωμίας 21 Μητρική ηλικία 30% Διπλός έλεγχος β τριμήνου (AFP, ß-hCG) 60-65% Τριπλός έλεγχος β τριμήνου (AFP, ß-hCG, ue3) 65-70% Τετραπλός έλεγχος β τριμήνου (AFP, ß-hCG, ue3, ινχιμπίνη-a) 70-75% Βιοχημικοί δείκτες α τριμήνου (PAPP-A, ß-hCG) 60-65% Αυχενική διαφάνεια (ΑΔ) α τριμήνου 70-75% Σύνολο δεικτών α τριμήνου (ΑΔ, PAPP-A, ß-hCG) 80-85% Σύνολο δεικτών α και β τριμήνου (ΑΔ, PAPP-A, AFP, ß-hCG,uE3, ινχιμπίνη-a) 85-90% 15

3.2. Επεμβατικός Προγεννητικός Έλεγχος Μια σειρά από ενδείξεις υπαγορεύουν την ανάγκη για επεμβατικό προγεννητικό έλεγχο, σε αρκετά μεγάλο αριθμό κυήσεων. Οι ενδείξεις αυτές είναι: α) προηγούμενη κύηση με χρωμοσωμική ανωμαλία, β) γονέας φορέας ισοζυγισμένης μετάθεσης και γ) αύξηση του «προϋπάρχοντος κινδύνου» σε εγκύους γυναίκες χωρίς ιστορικό προηγούμενων κυήσεων με χρωμοσωμική ανωμαλία, όπως προκύπτει από τον προγεννητικό έλεγχο ρουτίνας, δηλαδή μετά την εφαρμογή των διαφόρων ανιχνευτικών μεθόδων που παρουσιάστηκαν πρωτύτερα. Σε αυτές τις περιπτώσεις υψηλού κινδύνου, είναι απαραίτητη η ανάλυση του εμβρυικού γενετικού υλικού. Προκειμένου να γίνει αυτή η ανάλυση, πρέπει να προηγηθεί δειγματοληψία εμβρυικού βιολογικού υλικού. 3.2.1 Τεχνικές επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου Οι πιο συνήθεις τεχνικές επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου είναι η λήψη χοριακών λαχνών, η αμνιοπαρακέντιση, και η παρακέντιση ομφάλιου λώρου (Εικόνα 2). Οι δειγματοληπτικές αυτές διαδικασίες είναι επεμβατικές, γίνονται υπό υπερηχογραφική καθοδήγηση και συνδέονται με έναν σχετικά μικρό αλλά καθορισμένο κίνδυνο αποβολής του εμβρύου. Η λήψη χοριακών λαχνών γίνεται περί τη 10 η εβδομάδα κύησης και η πιθανότητα εμβρυικής απώλειας είναι 1-1.5%. Έχει μεγάλη αξία σε περιπτώσεις που είναι απαραίτητη η πολύ πρώιμη διάγνωση χρωμοσωμικών διαταραχών του εμβρύου. Η αμνιοπαρακέντιση εκτελείται συνήθως τη 14 η εβδομάδα κύησης με κίνδυνο εμβρυικής απώλειας 0.5-1%. Η παρακέντιση ομφάλιου λώρου, εκτελείται μετά την 22 η εβδομάδα κύησης και έχει σκοπό τη λήψη εμβρυϊκού αίματος για έλεγχο του εμβρυϊκού καρυότυπου. Ο κίνδυνος εμβρυικής 16

απώλειας είναι 1.5-3.5%. Τελευταία γίνεται για θεραπευτικούς σκοπούς, όπως π.χ. η ενδομήτρια μετάγγιση σε περιπτώσεις αναιμίας του εμβρύου, όπως η Rhesus ασυμβατότητα. Τέλος χρησιμοποιείται ενίοτε και η εμβρυοσκόπηση μέσω της οποίας μπορούν να ληφθούν βιοψίες από το εμβρυικό δέρμα και ήπαρ ή σε ενδομήτριες επεμβάσεις στο έμβρυο. Εικόνα 2. Τεχνικές επεμβατικού προγεννητικού ελέγχου. Α: αμνιοπαρακέντιση, Β και Δ: δειγματοληψία χοριακών λαχνών, Γ: παρακέντηση ομφάλιου λώρου, 1: έμβρυο, 2: αμνιακή κοιλότητα, 3: χοριακή κοιλότητα, 4: μήτρα, 5: χοριακές λάχνες 3.2.2. Συμβατική κυτταρογενετική ανάλυση Τις επεμβατικές τεχνικές που αναφέρθηκαν παραπάνω, ακολουθεί η καλλιέργεια των εμβρυϊκών κυττάρων (από αμνιακό υγρό ή χοριακές λάχνες), τα οποία στη συνέχεια «συλλαμβάνονται» στη μετάφαση του κυτταρικού κύκλου. Η ανάλυση επιστρώσεων μεταφασικών χρωμοσωμάτων με ζώνες οι οποίες προκύπτουν ύστερα από κατάλληλη χρώση, είναι η πιο συνηθισμένη τεχνική που χρησιμοποιείται 17

στην προγεννητική διάγνωση και μπορεί να ανιχνεύσει με υψηλή αξιοπιστία, ένα ευρύ φάσμα παρεκκλίσεων από τον φυσιολογικό καρυότυπο (κυρίως μεγάλης κλίμακας ισοζυγισμένες δομικές αλλαγές, μη-ισοζυγισμένες δομικές αλλαγές και αριθμητικές αλλαγές στα χρωμοσώματα) (Πίνακας 3). Πίνακας 3. Τεχνικές χρώσεων των χρωμοσωμάτων (Brown, 1999) Τεχνική Διαδικασία Μοτίβο Ζωνών G-ζώνες Ήπια πρωτεόλυση Σκούρες ζώνες: πλούσιες σε ΑΤ Χρώση με Giemsa Ωχρές ζώνες: πλούσιες σε GC R-ζώνες Θερμική αποδιάταξη Σκούρες ζώνες: πλούσιες σε GC Χρώση με Giemsa Ωχρές ζώνες: πλούσιες σε ΑΤ Q-ζώνες Χρώση με Κινακρίνη Φθορίζουσες ζώνες: πλούσιες σε GC C-ζώνες Αποδιάταξη με Υπεροξείδιο του Βαρίου Χρώση με Giemsa Σκούρες ζώνες: ετεροχρωματίνη Βασικό πλεονέκτημα της κλασσικής κυτταρογενετικής ανάλυσης αποτελεί η δυνατότητα ταυτόχρονου ελέγχου όλων των χρωμοσωμάτων. Η διακριτική ικανότητα της ανάλυσης είναι σχετικά περιορισμένη (της τάξης των 2 6 εκατομμυρίων νουκλεοτιδικών βάσεων). Η ειδικότητα και η ευαισθησία της μεθόδου στηρίζεται στην ποιότητα της ανάλυσης των ζωνών των χρωμοσωμάτων και στον αριθμό των μεταφάσεων που ελέγχονται. Η διάκριση των ζωνών μπορεί να διαφέρει από κύτταρο σε κύτταρο, εξαιτίας της διαφορετικής συμπύκνωσης των μεταφασικών χρωμοσωμάτων (Langlois et al, 1982). Αυτό το πρόβλημα μπορεί να αντιμετωπισθεί με την ανάλυση επιστρώσεων προμεταφασικών χρωμοσωμάτων, τα οποία είναι λιγότερο συμπυκνωμένα από τα μεταφασικά και επίσης, με τη χρήση πολλαπλών χρώσεων. Τεχνικά προβλήματα όπως η χρονοβόρος καλλιέργεια των εμβρυικών 18

κυττάρων, η πιθανή αποτυχία ή μόλυνση της καλλιέργειας, η επιλεκτική ανάπτυξη μητρικών κυττάρων καθώς και ένα καθορισμένο ποσοστό παρουσίας φαινομένων μωσαϊκισμού και ψευδομωσαϊκισμού έπειτα από την καλλιέργεια, αποτελούν τα βασικά μειονεκτήματα της κλασσικής κυτταρογενετικής ανάλυσης. 19

4. ΝΕΩΤΕΡΕΣ ΜΕΘΟΔΟΙ ΠΡΟΓΕΝΝΗΤΙΚΗΣ ΔΙΑΓΝΩΣΗΣ ΦΥΛΟΥ ΚΑΙ ΧΡΩΜΟΣΩΜΙΚΩΝ ΑΝΕΥΠΛΟΕΙΔΙΩΝ Ο χρόνος που μεσολαβεί από την δειγματοληψία του εμβρυικού βιολογικού υλικού μέχρι το αποτέλεσμα της γενετικής ανάλυσης είναι σημαντικός παράγοντας στην προγεννητική διάγνωση. Η συμβατική κυτταρογενετική ανάλυση είναι αξιόπιστη αλλά χρονοβόρος διαδικασία. Η ανάγκη για μείωση του χρόνου της προγεννητικής διάγνωσης έχει οδηγήσει τα τελευταία χρόνια, στην ανάπτυξη μοριακών τεχνικών οι οποίες προορίζονται αν όχι να αντικαταστήσουν, τουλάχιστον να ενισχύσουν ή να συμπληρώσουν την συμβατική κυτταρογενετική ανάλυση (Adinolfi et al, 1995; Weinans et al, 2000; Leung et al, 2002). Οι τεχνικές αυτές είναι ταχύτερες, διότι βασίζονται στην ανάλυση ελάχιστης ποσότητας DNA γονιδιώματος του εμβρύου χωρίς να χρειάζεται η προηγούμενη καλλιέργεια εμβρυϊκών κυττάρων και παρέχουν μεγαλύτερη διακριτική ικανότητα από την συμβατική κυτταρογενετική ανάλυση. Ένα ευρύ φάσμα μοριακών τεχνικών με την δυνατότητα ανίχνευσης αλλαγών στον αριθμό των χρωμοσωμικών αντιγράφων, όπως είναι οι περιπτώσεις ανευπλοειδίας, είναι πλέον διαθέσιμες. Ορισμένες από αυτές σταδιακά καθιερώνονται στην κλινική πράξη ενώ άλλες βρίσκονται ακόμα σε ερευνητικό στάδιο. Στη συνέχεια περιγράφονται οι πιο συνηθισμένες σύγχρονες μοριακές τεχνικές μαζί με τα μειονεκτήματα και τα πλεονεκτήματά τους στην διάγνωση του φύλου και των χρωμοσωμικών ανευπλοειδιών. 4.1. Φθορίζων υβριδισμός in situ σε μεσοφασικούς πυρήνες Η τεχνική του φθορίζοντος υβριδισμού in situ (Fluorescent In Situ 20

Hybridisation, FISH) σε μεσοφασικούς πυρήνες, είναι η παλαιότερη από τις σύγχρονες μοριακές τεχνικές που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για έλεγχο στους πιο συνήθεις τύπους ανευπλοειδίας. Από τεχνική άποψη, η μέθοδος συνδυάζει την κλασική κυτταρογενετική και τη μοριακή ανάλυση. Στη μεθοδολογία της FISH, γίνεται χρήση φθοριοσημασμένων μονόκλωνων τμημάτων DNA (ανιχνευτές) τα οποία είναι συμπληρωματικά ειδικών περιοχών σε συγκεκριμένα χρωμοσώματα. Οι ανιχνευτές υβριδοποιούνται με τις DNA αλληλουχίες στόχους σε επιστρώσεις μεσοφασικών πυρήνων των κυττάρων του δείγματος (αμνιακό υγρό ή χοριακές λάχνες) και προσδιορίζονται με μικροσκοπία φθορισμού. Στον έλεγχο για ανευπλοειδία, τα σήματα που εκπέμπουν οι ανιχνευτές επιτρέπουν την καταμέτρηση του αριθμού των αντιγράφων των συγκεκριμένων χρωμοσωμάτων που αφορούν τις πιο συνήθεις περιπτώσεις ανευπλοειδίας (Trask et al, 1991) (Εικόνα 3). Εικόνα 3. Παρατήρηση χρωμοσωμάτων σε πυρήνα ανευπλοειδικού κυττάρου με την τεχνική της FISH (Lee et al, 2005). Οι ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται στην προγεννητική διάγνωση ανευπλοειδιών με την τεχνική της FISH αποτελούνται συνήθως από διαδοχικά επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες ανθρώπινου DNA, όπως είναι οι «άλφα» δορυφορικές αλληλουχίες στις περιοχές των κεντρομεριδίων των χρωμοσωμάτων. Αυτές οι αλληλουχίες παρουσιάζουν μεγάλη σταθερότητα στο ανθρώπινο γονιδίωμα 21

και το μέγεθός τους ποικίλει μεταξύ των διαφορετικών χρωμοσωμάτων (από 700 νουκλεοτιδικές βάσεις στο χρωμόσωμα Υ έως 3000 νουκλεοτιδικές βάσεις στο χρωμόσωμα 11) (Wevrick and Willard, 1989). Οι «άλφα» δορυφορικές αλληλουχίες χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση και καταμέτρηση των αντιγράφων συγκεκριμένων χρωμοσωμάτων σε μεσοφασικούς πυρήνες. Άλλοι ανιχνευτές αποτελούνται από μοναδικές αλληλουχίες DNA γονιδιώματος του ανθρώπου, οι οποίες χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ελλείψεων ή διπλασιασμών μικρών τμημάτων του γονιδιώματος. Η περιορισμένη διακριτική ικανότητα της κλασσικής κυτταρογενετικής ανάλυσης δεν επιτρέπει την ανίχνευση χρωμοσωμικών ατυπιών μικρής κλίμακας όπως είναι οι μικροελλείψεις και οι μικροδιπλασιασμοί. Έτσι, η τεχνική της FISH με χρήση τέτοιων ανιχνευτών ενδείκνυται όταν τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά του εμβρύου που παρατηρούνται στο υπερηχογράφημα παραπέμπουν σε γενετικά σύνδρομα με τέτοιες δομικές χρωμοσωμικές ατυπίες (π.χ. σύνδρομα Angelman, Williams-Beuren, DiGeorge κ.α.). Η τεχνική της FISH σε μεσοφασικούς πυρήνες αποφεύγει την χρονοβόρο κυτταρική καλλιέργεια και μειώνει τον χρόνο της προγεννητικής διάγνωσης. Η τεχνική δεν μπορεί να ανιχνεύσει ισορροπημένες χρωμοσωμικές δομικές ατυπίες και μη-ισορροπημένες ατυπίες που αφορούν διαφορετικά χρωμοσωμικά τμήματα από αυτά που είναι συμπληρωματικά με τους ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται. Οι σημαντικότερες ανευπλοειδίες που ανιχνεύονται με την τεχνική της FISH αφορούν τα αυτοσωμικά χρωμοσώματα 21, 18 και 13 καθώς και τα φυλετικά χρωμοσώματα. Τέλος, η ανάλυση με FISH σε μεσοφασικούς πυρήνες όταν εφαρμόζεται σε διαγνωστικά κέντρα αποτελεί ένα αρχικό και γρήγορο έλεγχο για τις πιο σημαντικές ανευπλοειδίες που προηγείται της τελικής αξιολόγησης με την κλασσική κυτταρογενετική ανάλυση. 22

4.2. Ποσοτική Φθορίζουσα Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Η τεχνική της ποσοτικής φθορίζουσας PCR (Quantitative Fluorescent PCR, QF-PCR είναι μια μέθοδος που τα τελευταία χρόνια έχει αρχίσει να χρησιμοποιείται για την προγεννητική διάγνωση ανευπλοειδιών του εμβρύου σε συνδυασμό με την συμβατική κυτταρογενετική ανάλυση. Η πρώτη περιγραφή της τεχνικής έγινε το 1993 (Mansfield, 1993) και βασίζεται στην ενίσχυση συγκεκριμένων πολυμορφικών αλληλουχιών ειδικών για κάθε χρωμόσωμα. Αυτές οι αλληλουχίες είναι γνωστές ως μικροδορυφόροι ή μικρού μήκους διαδοχικές επαναλήψεις (Short Tandem Repeats, STRs) (Εικόνα 4). Εικόνα 4. Σχηματική αναπαράσταση περιοχής STR σε ομόλογο ζεύγος χρωμοσωμάτων. 23

Οι STRs είναι επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες DNA που αποτελούνται από δύο έως έξι νουκλεοτίδια. Οι αλληλουχίες αυτές είναι διάσπαρτες στο ανθρώπινο γονιδίωμα, με συχνότητα εμφάνισης ενός STR κάθε 10 4 νουκλεοτίδια (Strachan and Read 1996). Οι χρωμοσωμικοί δείκτες STR παρουσιάζουν υψηλό βαθμό ετεροζυγωτίας και ακολουθούν τον απλό μενδελικό τρόπο κληρονομικότητας. Η πολυμορφικότητα ενός χρωμοσωμικού δείκτη STR καθορίζεται από το μέγεθος και τον αριθμό των αλληλομόρφων του. Ο συνήθης αριθμός των επαναλήψεων είναι 15 30 και το συνολικό μήκος των αλληλομόρφων τους κυμαίνεται μεταξύ 100 και 400 νουκλεοτίδια. Βρίσκονται κυρίως σε περιοχές που παρεμβάλλονται μεταξύ των γονιδίων ή σε εσωνικά ενδογονιδιακά τμήματα, όμως έχει αναφερθεί η παρουσία τους και σε μεταγραφόμενα εξωνικά τμήματα. Γενικά παρουσιάζουν μια ομοιογενή κατανομή στο γονιδίωμα, αν και τείνουν να υποεκπροσωπούνται σε τελομερικές περιοχές (Koreth et al, 1996). Ο πιο σημαντικός παράγοντας για την αποτελεσματική διάγνωση μιας ανευπλοειδίας με QF-PCR είναι η επιλογή των ειδικών χρωμοσωμικών δεικτών STR. Για τον σχεδιασμό αναλύσεων και πειραμάτων με QF-PCR θεωρείται προτιμότερη η χρήση τετρα- και πεντανουκλοτιδικών STRs (επαναλήψεις τετρα- και πεντανουκλεοτιδικών αλληλουχιών), διότι έχει αποδειχθεί ότι παρουσιάζουν μεγαλύτερη σταθερότητα κατά τη διαδικασία της ενίσχυσης με PCR, σε σχέση με τους δι- και τρινουκλεοτιδικούς STRs (Adinolfi et al, 1997). Η ενίσχυση ενός δείγματος DNA γονιδιώματος με QF-PCR γίνεται με τη χρήση εκκινητών σημασμένων με φθοριόχρωμα για τον εντοπισμό και την ποσοτικοποίηση των προϊόντων. Τα προϊόντα της QF-PCR διαχωρίζονται και ποσοτικοποιούνται σε αυτόματο αναλυτή DNA με τα αποτελέσματα να παρουσιάζονται με τη μορφή ηλεκτροφορητικού διαγράμματος (Εικόνα 5). Κάθε 24

κορυφή στο διάγραμμα αντιστοιχεί σε κάθε αλληλόμορφο STR συγκεκριμένου μεγέθους και ποσότητας στο αρχικό δείγμα. Εικόνα 5. Σχηματική αναπαράσταση της ανάλυσης φυσιολογικών και τρισωμικών δειγμάτων με QF-PCR και χρήση STRs (Adinolfi et al, 1995). Η τεχνολογία της QF-PCR βασίζεται στην υπάρχουσα γνώση ότι κατά την πρώτη εκθετική φάση της PCR, το ποσόν του συγκεκριμένου DNA που παράγεται είναι ανάλογο με την ποσότητα της αρχικής εξεταζόμενης αλληλουχίας. Η εισαγωγή φθοριοχρώματος στα προϊόντα της QF-PCR μέσω του πρόσθιου εκκινητή επιτρέπει 25

την ανάλυσή τους με laser σε κατάλληλο αναλυτή DNA και παρέχει τη δυνατότητα ποσοτικοποίησης των προϊόντων της PCR. Έτσι, η ανάλυση των φθοριζόντων προϊόντων μιας QF-PCR σε δείγματα από ετεροζυγωτικά άτομα, αναμένεται να αποκαλύψει δύο δείκτες STR διαφορετικού μεγέθους με ποσοτική αναλογία 1:1. Εάν το δείγμα DNA ανήκει σε ομοζυγωτικό άτομο, ο πολλαπλασιασμός με QF-PCR και η ανάλυση των φθοριζόντων προϊόντων θα αποκαλύψει μόνο ένα προϊόν. Δείγματα από ασθενείς με τρισωμία ενδέχεται να αποκαλύψουν είτε τρία προϊόντα με ποσοτική αναλογία 1:1:1 (τρισωμικά τριαλληλομορφικά), είτε δύο προϊόντα με ποσοτική αναλογία 2:1 (τρισωμικά διαλληλομορφικά) ή ένα προϊόν (τρισωμικά μονοαλληλομορφικά). Δεδομένου του υψηλού πολυμορφισμού που παρουσιάζουν οι δείκτες STR, ελάχιστα τρισωμικά δείγματα παρουσιάζουν μονοαλληλομορφικό γονότυπο. Υπάρχουν όμως ορισμένες περιπτώσεις όπου οι STRs που χρησιμοποιούνται δεν είναι πληροφοριακοί. Οι πολυμορφικοί STRs παρουσιάζουν διαφορετικές συχνότητες σε διαφορετικούς πληθυσμούς με αποτέλεσμα αυτοί που είναι πληροφοριακοί σε έναν πληθυσμό να μην είναι σε έναν άλλο (Slater et al, 2003). Για αυτό το λόγο θεωρείται απαραίτητη η χρήση 2 ή περισσότερων πολυμορφικών STR σε κάθε χρωμόσωμα για την προγεννητική διάγνωση ανευπλοειδιών με QF-PCR καθώς έτσι μειώνονται οι πιθανότητες να γίνει λάθος διάγνωση. Επίσης, η χρήση πολλών πληροφοριακών STRs και η παράλληλη ανάλυση του μητρικού και πατρικού γονοτύπου επιτρέπει τον προσδιορισμό της γονεϊκής προέλευσης της ανευπλοειδίας του εμβρύου και αν αυτή είναι αποτέλεσμα μη διαχωρισμού στην πρώτη ή στη δεύτερη μειωτική διαίρεση. Με τη χρήση πολυμορφικών δεικτών STR των οποίων τα αλληλόμορφα διαφέρουν σημαντικά στο μέγεθος καθώς και με τη χρήση διαφορετικών φθοριοχρωμάτων για κάθε δείκτη STR, είναι δυνατή η ταυτόχρονη ανάλυση πολλών 26

χρωμοσωμάτων σε μια μόνο αντίδραση (πολλαπλή, multiplex QF-PCR). Διάφορες μελέτες αναφέρουν την εφαρμογή της QF-PCR στη διάγνωση των σημαντικότερων ανευπλοειδιών (τρισωμίες 21, 18, 13) με ελάχιστα ψευδώς αρνητικά ή θετικά αποτελέσματα (Pertl et al, 1999; Cirigliano et al, 2004; Nikolini et al, 2004; Ogilvie et al, 2005). Το βασικό μειονέκτημα της QF-PCR εντοπίζεται στους ελέγχους για ανευπλοειδία στα φυλετικά χρωμοσώματα. Συγκεκριμένα, τα δείγματα από φυσιολογικά ΧΧ θήλεα άτομα που είναι ομοζυγωτικά για συγκεκριμένους STRs στο χρωμόσωμα Χ, παρουσιάζουν μονοαλληλομορφικό γονότυπο (μια κορυφή) ο οποίος είναι πανομοιότυπος με αυτόν που παρουσιάζουν τα δείγματα από άτομα με σύνδρομο Turner (Χ0). Η λύση στο συγκεκριμένο πρόβλημα μπορεί να δοθεί είτε με τη χρήση περισσότερων από έναν δεικτών STR για το χρωμόσωμα Χ είτε με τη χρήση ενός αυτοσωμικού εσωτερικού μάρτυρα βάσει του οποίου θα υπολογισθεί η ποσότητα του χρωμοσώματος Χ στο δείγμα σε σχέση με κάποιο άλλο γνωστό φυσιολογικό δείγμα. Άλλα προβλήματα που παρουσιάζει η ανάλυση δεικτών STR με την τεχνική της QF-PCR είναι: α) η παραγωγή υποπροϊόντων (stutters), η οποία οφείλεται στην εσφαλμένη «ανάγνωση» της αλληλουχίας των αλληλομόρφων από την DNA πολυμεράση που έχει σαν αποτέλεσμα την παρουσία επιπλέον κορυφών μικρότερου μεγέθους και έντασης από αυτές των κανονικών προϊόντων, οι οποίες μπορεί να οδηγήσουν σε λανθασμένη διάγνωση, β) η παραγωγή διαφορετικά αδενυλιωμένων προϊόντων της PCR για το ίδιο αλληλόμορφο, εξαιτίας της προσθήκης ή μηπροσθήκης τελικής αδενίνης από την DNA πολυμεράση και έχει σαν αποτέλεσμα την παρουσία διευρυμένης ή διπλής κορυφής για το αλληλόμορφο (ανάλογα με την διακριτική ικανότητα του συστήματος διαχωρισμού που χρησιμοποιείται), γεγονός που μπορεί να οδηγήσει σε λανθασμένη εκτίμηση του αποτελέσματος, και γ) η 27

επιμόλυνση του δείγματος με μητρικά κύτταρα, που οδηγεί σε παρουσία επιπλέον κορυφών ή αλλοίωση των αναλογιών των κορυφών γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στην εσφαλμένη εντύπωση ότι το δείγμα είναι πολυπλοειδικό ή μωσαϊκό. 4.3. Ποσοτική PCR σε Πραγματικό Χρόνο Η τεχνική της ποσοτικής PCR σε πραγματικό χρόνο (Quantitative Real Time PCR, qpcr είναι μια μέθοδος που επιτρέπει τον προσδιορισμό του αριθμού των αντιγράφων των αλληλουχιών του DNA μέσω της ενίσχυσης και ποσοτικοποίησης γονιδιακών δεικτών STS (sequence tagged sites) ειδικών για κάθε χρωμόσωμα. Η διαφορά της από τις άλλες μεθοδολογίες PCR έγκειται στο γεγονός ότι επιτρέπει την παρακολούθηση της συσσώρευσης του προϊόντος κατά τη διάρκεια της ενίσχυσης αποφεύγοντας έτσι την διαδικασία της μεταενισχυτικής ανάλυσης. Με αυτό τον τρόπο η τεχνική της qpcr μειώνει κατά πολύ το χρόνο της ανάλυσης και ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο εξωτερικής επιμόλυνσης του δείγματος. Η συσσώρευση του προϊόντος μπορεί να μετρηθεί με διάφορες τεχνολογίες. Η μεθοδολογία που χρησιμοποιείται συνήθως για την προγεννητική διάγνωση των ανευπλοειδιών είναι η TaqMan qpcr που βασίζεται στην παραγωγή φθορισμού μέσω της 5 νουκλεολυτικής δράσης της DNA πολυμεράσης (Zimmerman et al, 2002). Συγκεκριμένα, γίνεται χρήση ενός ανιχνευτή (probe), δηλαδή μιας ολιγονουκλεοτιδικής αλληλουχίας DNA συμπληρωματικής για την περιοχή του DNA που ενδιαφέρει, ο οποίος είναι σημασμένος με ένα φθοριόχρωμα στο 5 άκρο του και με μια ουσία-καταστολέα στο 3 άκρο του. Ο ανιχνευτής υβριδοποιείται σε μια θέση που βρίσκεται μεταξύ της θέσης πρόσδεσης των δύο εκκινητών της PCR. Η θερμοκρασία πρόσδεσης του ανιχνευτή είναι μεγαλύτερη από την θερμοκρασία 28

πρόσδεσης των εκκινητών, εξασφαλίζοντας έτσι ότι σε κάθε νέο κύκλο της PCR θα γίνεται υβριδοποίηση του ανιχνευτή πριν την πρόσδεση των εκκινητών στο νέο προϊόν της PCR. Μετά την πρόσδεση των εκκινητών, η Taq DNA πολυμεράση ξεκινάει την επιμήκυνση της νέας αλυσίδας του DNA ενώ παράλληλα μέσω της νουκλεολυτικής της δράσης «κόβει» το 5 άκρο του ανιχνευτή. Με αυτό τον τρόπο συντελείται η αποσύνδεση του φθοριοχρώματος από την ουσία καταστολέα με επακόλουθη φωτονική ενεργοποίηση του φθοριοχρώματος και παραγωγή φθορισμού. Η διαδικασία επαναλαμβάνεται σε κάθε νέο κύκλο της PCR με αποτέλεσμα η ένταση του φθορισμού που παράγεται να είναι ανάλογη του ακριβούς ποσού του προϊόντος PCR που παράγεται. Η χρήση της qpcr στην προγεννητική διάγνωση των ανευπλοειδιών είναι υπό διερεύνηση. Η διάγνωση του συνδρόμου Down με qpcr πραγματοποιείται συγκρίνοντας την ποσότητα ενός γονιδίου στόχου που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 21 (π.χ. το γονίδιο DSCR3 που βρίσκεται στην κρίσιμη περιοχή για το σύνδρομο Down του χρωμοσώματος 21), με την ποσότητα ενός γονίδιου αναφοράς το οποίο βρίσκεται σε κάποιο άλλο αυτοσωμικό χρωμόσωμα (π.χ. το γονίδιο GAPDH που βρίσκεται στο χρωμόσωμα 12). Στη συγκεκριμένη εφαρμογή της τεχνικής της qpcr γίνεται χρήση δύο ανιχνευτών (ένας για την κάθε περιοχή που ενισχύεται) και ο κάθε ανιχνευτής είναι σημασμένος με διαφορετικό φθοριόχρωμα. Εάν η αναλογία μεταξύ των δύο γονιδίων είναι 1:1, τότε το έμβρυο είναι φυσιολογικό. Εάν η αναλογία είναι 3:2, τότε το έμβρυο είναι τρισωμικό (Εικόνα 6). Τα προβλήματα που παρουσιάζει η ανάλυση με qpcr για τον προγεννητικό έλεγχο των ανευπλοειδιών είναι αρκετά. Η σωστή ανάλυση απαιτεί: (α) το σχεδιασμό κατάλληλων ολιγονουκλεοτιδικών εκκινητών για την ενίσχυση συγκεκριμένων αλληλουχιών σε κάθε χρωμόσωμα που ενδιαφέρει, (β) το σχεδιασμό κατάλληλων 29

ανιχνευτών για την αναγνώριση αυτών των αλληλουχιών, και (γ) τη χρήση γνωστών ανευπλοειδικών και φυσιολογικών δειγμάτων σε κάθε ανάλυση. Σε σχέση με την QF- PCR, η τεχνική της qpcr υστερεί στο ότι α) είναι λιγότερο ευαίσθητη στην διάγνωση τρισωμικών μωσαϊκών δειγμάτων και β) δίνει μόνο μια ποσοτική αναλογία φθορισμού 3:2 για τα τρισωμικά δείγματα, ενώ η QF-PCR δίνει είτε μια πιο ξεκάθαρη ποσοτική διαλληλομορφική αναλογία 2:1 είτε ένα τριαλληλομορφικό αποτέλεσμα. Περιπτώσεις τριπλοειδίας και μόλυνσης του δείγματος από μητρικά κύτταρα είναι δύσκολο να ανιχνευθούν με αυτές τις τεχνικές. Εικόνα 6. Οι αναλογίες για τα δείγματα DNA από τρισωμία 21 (DS) και τα φυσιολογικά δείγματα (NL) έπειτα από ανάλυση με qpcr (Hu et al, 2004). 4.4. Πολλαπλή Ενίσχυση Ανιχνευτών Υβριδοποιημένων στο Γονιδίωμα Οι τεχνικές της εξαρτώμενης ή μη από την αντίδραση της λιγάσης, πολλαπλής ενίσχυσης ανιχνευτών υβριδοποιημένων στο γονιδίωμα (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification, MLPA και Multiplex Amplifiable Probe Hybridization, MAPH) είναι ποσοτικές μέθοδοι που βασίζονται στην τεχνολογία της PCR και επιτρέπουν την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση πολλαπλών αλληλουχιών σε ολόκληρο το γονιδίωμα σε μια αντίδραση με τη χρήση ενός μόνο ζεύγους εκκινητών 30

(Gerdes et al, 2004). Με την χρήση των ίδιων εκκινητών η απόδοση της αντίδρασης είναι ίδια για κάθε αλληλουχία στόχο. Στην τεχνική της MLPA (Εικόνα 7), για κάθε αλληλουχία στόχο προς ανάλυση χρησιμοποιούνται δύο μονόκλωνα τμήματα DNA (ανιχνευτές), τα οποία σχεδιάζονται έτσι ώστε να υβριδοποιούνται το ένα δίπλα στο άλλο στην ίδια αλυσίδα της αλληλουχίας στόχου. Και οι δύο ανιχνευτές αποτελούνται από ένα μονόκλωνο τμήμα DNA συμπληρωματικό με την αλληλουχία στόχο, μήκους 22-43 νουκλεοτιδίων και μια ειδική αλληλουχία πρόσδεσης εκκινητή. Επίσης, ένας από τους δύο ανιχνευτές εμπεριέχει μια επιπλέον εσωτερική αλληλουχία μήκους 19-364 νουκλεοτιδίων. Ακολουθεί υβριδοποίηση των συμπληρωματικών ανιχνευτών στις αλληλουχίες στόχους. Στη συνέχεια, οι ανιχνευτές που έχουν υβριδοποιηθεί ο ένας δίπλα στον άλλο στην ίδια αλυσίδα της αλληλουχίας στόχου, ενώνονται μεταξύ τους με αντίδραση της λιγάσης. Ακολουθεί πρόσδεση των εκκινητών στις καθορισμένες αλληλουχίες των υβριδοποιημένων ανιχνευτών και ενίσχυση με PCR του τμήματος DNA που προκύπτει από την ένωση των ανιχνευτών με την αντίδραση της λιγάσης. Ο ένας από τους δύο εκκινητές είναι συνδεδεμένος με φθοριόχρωμα. Στη συνέχεια τα φθοριοσημασμένα προϊόντα της PCR διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση και τα σήματα που εκπέμπουν ανιχνεύονται και ποσοτικοποιούνται σε αναλυτή DNA με το κατάλληλο λογισμικό πρόγραμμα με την μορφή καμπύλων σε γράφημα. Στην τεχνική της MAPH, όπως και στην τεχνική της MLPA, γίνεται ενίσχυση των ανιχνευτών που υβριδοποιούνται στις DNA αλληλουχίες στόχο με τη διαφορά ότι το δείγμα DNA προς ανάλυση αποτυπώνεται σε μεμβράνη όπου στη συνέχεια προστίθεται περίσσεια ανιχνευτών. Έτσι, όλες οι αλληλουχίες προς αναγνώριση στο δείγμα υβριδοποιούνται με ανιχνευτές, με αποτέλεσμα να υπάρχει μια απευθείας σχέση μεταξύ του αριθμού των αντιγράφων των αλληλουχιών στόχων και της 31

ποσότητας του υβριδοποιημένου ανιχνευτή. Η χρήση της μεμβράνης επιτρέπει την εύκολη απομάκρυνση των ανιχνευτών που δεν έχουν υβριδοποιηθεί στις αλληλουχίες στόχους του δείγματος DNA με μια απλή διαδικασία πλυσίματος, αποφεύγοντας έτσι την χρήση της αντίδρασης της λιγάσης. Εικόνα 7. Σχηματική αναπαράσταση της τεχνικής της MLPA Και στις δύο τεχνικές, το σχετικό σήμα για κάθε ανιχνευτή υπολογίζεται διαιρώντας το εμβαδόν της καμπύλης που καταγράφεται για το προϊόν της PCR του συγκεκριμένου ανιχνευτή, με το σύνολο των εμβαδών των καμπύλων που καταγράφονται για όλους τους ανιχνευτές στο δείγμα, και εκφράζεται ως πολλαπλάσιο του σχετικού σήματος του ίδιου ανιχνευτή σε ένα φυσιολογικό δείγμα 32

ελέγχου. Έτσι, η αναμενόμενη τιμή για ένα φυσιολογικό ευπλοειδικό δείγμα είναι περίπου 1, ενώ για ένα τρισωμικό δείγμα είναι περίπου 1.5. Οι τεχνικές MLPA και MAPH έχουν την δυνατότητα ανίχνευσης και ποσοτικοποίησης έως και 40 αλληλουχιών του δείγματος DNA σε μια αντίδραση και μπορούν να χρησιμοποιηθούν στην προγεννητική διάγνωση των πιο σημαντικών ανευπλοειδιών αλλά και συνδρόμων με μικροελλείψεις. Οι μεθοδολογίες είναι αξιόπιστες και παρουσιάζουν υψηλή αυτοματοποίηση και απόδοση (Slater et al, 2003). Σημαντικός παράγοντας για την σωστή ανάλυση ενός δείγματος με τις τεχνικές MLPA και MAPH είναι η ποιότητα του DNA στο δείγμα. Περιπτώσεις τριπλοειδίας και μόλυνσης του δείγματος από μητρικά κύτταρα είναι δύσκολο να ανιχνευθούν με αυτές τις τεχνικές. 4.5. Νέες Προσεγγίσεις στον Προγεννητικό Έλεγχο Ανευπλοειδιών Οι ραγδαίες εξελίξεις στον τομέα της βιοτεχνολογίας τα τελευταία χρόνια σε συνδυασμό με το μέγεθος της πληροφορίας που έχει προκύψει από την γνώση της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος, έχουν οδηγήσει σε μια καλύτερη κατανόηση της ανθρώπινης γενετικής ετερογένειας. Έτσι, εκτός από τις τεχνικές που περιγράφονται παραπάνω, υπάρχουν και νεώτερες προσεγγίσεις οι οποίες συνδυάζουν την υψηλή τεχνολογία με νέα στοιχεία της αλληλουχίας του ανθρώπινου γονιδιώματος και προσφέρουν την δυνατότητα ασφαλούς, ταχύτατης και μαζικής ανάλυσης. Η τεχνική της ποσοτικής ανάλυσης πολυμορφισμών ενός νουκλεοτιδίου (Quantitative Single Nucleotide Polymorhism analysis, Q-SNP) αποτελεί μια σύγχρονη προσέγγιση ποσοτικής ανάλυσης των χρωμοσωμικών αντιγράφων σε ένα 33